Структурно-функциональная организация фотосинтезирующего аппарата фототрофных микроорганизмов как показатель состояния окружающей среды

Харченко, Сергей Григорьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональная организация фотосинтезирующего аппарата фототрофных микроорганизмов как показатель состояния окружающей среды
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация фотосинтезирующего аппарата фототрофных микроорганизмов как показатель состояния окружающей среды"

МЕЖДУНАРОДНАЯ НЕПРАВИТЕЛЬСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ "ФОРУМ УЧЕНЫХ И СПЕЦИАЛИСТОВ"

АГЕНТСТВО БИОИНФОРМАГШШ И ЭКОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

На правах; рукописи

Харченко Сергей Григорьевич

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Ф0Т0СИНТЕЗИРУЮЩЕГ0 АППАРАТА ФОТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ КАК ПОКАЗАТЕЛЬ СОСТОЯНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЬ!

03.00.02 - биофизика 03.00.16 - ЭКОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва,1995

Работа выполнена в Российском научном центре "Курчатовский i статут", в Российской Академии Государственной Службы i Президенте РФ и в Международном фонде безопасного развития i вилизации им. академика В.А.Легасова.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор физико-математических наук И.И.Кузьмин доктор химических наук Г.Г.Комиссаров доктор биологических наук В.Н.Морозов

Ведущая организация:

Научно-исследовательский ипытагельный центр радиационз безопасности космических объектов

Защита состоится г. в 22. час. 30м

на заседании специализированного совета Д 170.01.oi при Are; стве биоинформатики и экологии человека Международной непра; тельственной организации "Форум ученых и специалистов" по ; ресу: И7Э77, г.Москва, ул. Косыгина, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Агенте биоинформатики и экологии человека (адрес: 117807, г.Моек: ГСП-7, проспект бо-легия Октября, 7/1).

Автореферат разослан " / " 995 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат физико-математических наук

Э.М.Ше

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

На конференции ЭКО-92 в Рио был поставлен вопрос о необходимости устойчивого экономического развития, безопасного для окружающей среда, и сформулированы принципы такого развития. В частности, было отмечено, что: "Правительства должны содействовать разработке законодательства по устойчивому развитию, основанного на разумных экономических, социальных и природоохранных принципах, а также соответствующей оценке рисков". То есть проблемы оценки, анализа и управления экологическим риском признаны главным теоретическим основанием концепции экологической безопасности и их решение абсолютно необходимо для определил условий устойчивого экологически безопасного развития. В настоящее время одной из важнейших задач России стало обеспечение экологической безопасности как составной части национальной безопасности страны. Стержнем концепции экологической безопасности признана теория экологического риска. Существенной частью этой теории является определение уровня приемлемого риска. А для определения этого уровня необходимо в первую очередь выявить опасности и условия их преодоления. Именно эта цель и стоит перед новым научным направлением - анализом экологического риска.

Анализ экологического риска состоит из трех основных частей:

1)Оценка экологического риска (risk assessment).

2)Управление экологическим риском (risk management).

3)Информационное обеспечение анализа риска (risk communication) .

4)Прогноз развития ситуации и возможных последствий.

В процессе оценки экологического риска необходимо ответить на следующую триаду вопросов [Kharchenko, 1994]:

1)что может быть нарушено в человеке и природе, и по каким показателям можно достоверно судить о таких нарушениях;

2)какова вероятность того, что "это" может быть нарушено и какова возможная степень такого нарушения,-

з)каковы последствия такого нарушения.

Ответы на эти вопросы дают возможность идентифицировать, определить класс опасности, определить и измерить степень риска, оценить различные риски, их воздействия и последствия.

Методологически при оценке состояния окружающей среды проводится определение трех главных компонентов анализа экологического риска, то есть осуществляется так называемый "триадный анализ экологического риска11, в который входят:

1)оценка воздействия на окружающую среду и оценка соответствующих рисков, исходя из количества и концентрации химических; веществ в выбросах, выхлопах, стоках и накопления их в природных средах - воде, воздухе и почве;

2)оценка состояния здоровья человека по интегральным показателям здоровья;

3)оценка состояния биоты по биологическим интегральным показателям. И только собрав воедино информацию об этих трех главных компонентах, можно проводить как комплексную оценку текущего состояния окружающей среды, так и делать прогнозы в отношении будущего развития всей системы.

Оценка состояния биоты должна включать также три основных компонента [КЬягсИепко, Ы^эку, 1994; Главку, КЬагсПепко,1994]:

1)оценку состояния фотосинтезирующих организмов;

2)оценку биоразнообразия как генетического фонда планеты,-

3)оценку состояния сельско-хозяйственных животных и птиц, как источника питания человека.

При оценке состояния биогы оценка состояния фэтосингези-рующих организмов имеет определяющее значение, так как они являются первым и самым чувствительным звеном пищевой цепи и основным источником биомассы, энергии и кислорода для всех других организмов. От состояния фотосинтезирующих организмов зависит состояние всей экосистемы, поскольку они определяют пищевые условия (Одум, 1986) для всех остальных звеньев экосистемы, а также в значительной степени определяют состав атмосферного воздуха (Вернадский, 1926; Заварзин, 1984), то есть именно они определяют все условия жизнедеятельности для всегс

живого на Земле. Поэтому точно оценив состояние фототрофных бактерий, можно с высокой степенью уверенности судить о состоянии всей экосистемы.

Поэтому исследования методов оценки состояния экосистем по таким биологическим интегральным индикаторам, как фототроф-ные бактерии, имеют большое значение для развития всей системы оценок в анализе экологического риска. Это научное направление развивается автором в рамках ГНТП "Экологическая безопасность России" (тема N 5.2.1.4.) и ГНТП "Безопасность" (тема б.ю).

Основной целью работы была разработка концепции, основных принципов и подходов к оценке состояния окружающей среды на основе оценки состояния фотосинтезирующих организмов как определяющего звена всей экосистемы.

Основные задачи:

1.Сформулировать концепцию применения фотрофных бактерий в качестве интегральных индикаторов состояния окружающей среды.

2.На основе концепции биологических интегральных индикаторов сформулировать методологию использования фотосинтетичес-хой пигментной системы фототрофных бактерий в качестве интегрального индикатора состояния окружающей среды.

3.Разработать метода оценки состояния структурно-функциональной организации фотосинтезирумцего аппарата фототрофных бактерий.

4.Выявить основные направления и показатели изменения ротосинтезирующего аппарата бактерий под влиянием изменения жружагацей среды.

Научная новизна определяется основными результатами:

Сформулированы основные принципы и характерные черты сис-■емного подхода при оценке состояния окружающей среды. Обосно-¡ано применение интегральных индикаторов как наиболее адекват-юго инструмента для оценки состояния экосистемы. Сформулиро-(эно представление о структурно-функциональном состоянии сис-■емы и проанализированы факторы определяющие это состояние, босновывается, что состояние пигментного аппарата может отра-

- б -

жать энергетическое и структурно-функциональное состояние фототрофных бактерий. Сформулированы аргументы в доказательства того, что спектры поглощения и флуоресценции могут служить индикаторами состояния пигментной системы фототрофных бактериальных клеток, как и интегральным индикатором состояния популяции и окружающей среды.

Впервые в структуре фотосинтезирующего аппарата зеленых фототрофных бактерий обнаружена почти идеальная ориентация векторов дипольных моментов молекул Бхл с основной светосоОи-рающей антенны (ССА) вдоль длинной оси хлоросомы. Было найдено, что Qy-переходы молекул Бхл с ориентированы параллельно друг другу и плоскости мембраны, а угол между длинной осью ХМК и дипольныш моментами оу-переходов молекул Бхл с равен 0° 7°. Эта ориентация нарушается при загрязнении окружающей среды.

Разработан универсальный фазово-флуорометрический метод измерения времени жизни флуоресценции фотосинтезирующих пигментов in vivo в пикосекундном диапазоне. Определено время переноса энергии возбуждения от основной ССА зеленых бактерий к минорной - перенос энергии от Бхл с к Бхл а происходит 20-60 пксек с эффективностью большей 97%. При повреждении пигментной системы (в частности, в результате загрязнения окружающей среды) эффективность переноса энергии резко нарушается, что ведет к умиранию популяции.

Впервые обнаружены характерные особенности изменения спектров поглощения зеленых бактерий, по которым можно оценить стадию роста культуры бактерий. Эта характеристика может иметь практическое значение при проведении оценки окружающей среды по состоянию биологических интегральных индикаторов.

Впервые показана значительная вариабельность основной полосы поглощения Бхл с ССА зеленых бактерий в зависимости от состояния окружающей среды. Максимум поглощения длинноволновой полосы поглощения в зависимости от условий может сдвигаться от 725 до 752 нм, ширина полосы поглощения на полувысоте изменяется от 50 до 70 нм, коэффициент асимметричности полосы поглощения изменяется от 0,65 до 1,18. Это дает возможность по

спектрам поглощения зелешх бактерий оценивать состояние окружающей среды.

Впервые проведены прямые измерения времени переноса энергии от ССА на активные РЦ у пурпурных бактерий методом селективной пикосекундной абсорбционной спектроскопии, которое оказалось равным во 15 пксек. При повреждении пигментной системы, как ССА, так и РЦ (в частности, в результате загрязнения окружающей среды) перенос энергии нарушается, что ведет к отмиранию культуры бактерий.

С помощью пикосекундаого флуоресцентного спектрохроногра-фа измерено время разделения зарядов в фотоактивных реакционных центрах пурпурных бактерий Rhodospiriiium rubrum, которое оказалось равным 6 I пксек и не зависело от температуры. При повреждении реакционных центров (в частности, в результате загрязнения окружающей среды, например пестицидами) разделение зарядов в фотохимических реакционных центрах резко нарушается, что ведет к гибели клеток. Это делает реакционные центры фото-трофных бактерий одним из самых чувствительных биосенсоров на широкий спектр загрязняющих окружающую среду веществ.

Практическая значимость. Результаты исследований, включенные в данную работу, были использованы в практической деятельности для следующих целей:

1.Разработка практического пособия по определению состояния окружающей среды по состоянию фотосинтезирующих организмов (в рамках ГНТП "Экологическая безопасного России").

2.Результаты работы использовались при подготовке студентов в Международном университете.

3.Резул! гаты работы использовались в учебном процессе Академии Генерального Штаба МО России.

4.Результаты работы использовались в учебном процессе Российской Академии Государственной Службы при Президенте РФ.

Личный вклад автора вразработку проблемы. Автор осуществлял выбор направления исследований, постановку и решение всех рассматривавшихся задач. Результаты, изложенные в диссертации, получены либо самим автором, либо под его руководством при не-

посредственном участии в разработке методик исследований, проведении экспериментов, обработке и обсуждении результатов, их интерпретация, обобщение и систематизация, а также построение теоретических моделей. Все препараты, использованные в экспериментах, получены руками автора, значительное большинство всех измерений также проведено лично автором. Вклад других соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Автор выражает глубокую благодарность всем коллегам, принявшим участие в совместных работах и в обсуждении полученных результатов.

Апробация работы и публикации. Основные результаты и отдельные положения работы докладывались на Всесоюзной конференции по фотоэнергетике растений (Львов, 1980), ху-ом Международном Семинаре по переносу энергии в конденсированных средах (Прага, Чехословакия, 1981), 1-ом Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), Всесоюзной конференции "Контроль и управление Сиотехнологическими процессами" (Горький, 1985), 1У-ой Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1985), у-ом Международном Семинаре по переносу энергии в конденсированных средах (Прага, Чехословакия, 1985), 1-ой Всесоюзной конференции "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии" (Москва, 1985), хг-ом Международном симпозиуме шрас по фотохимии (Лиссабон, Португалия, 1986), уи-ом Международном конгрессе по фотосинтезу (Провиденс, США, 198б), Всесоюзной конференции "Структурно-функциональная ор'^тяация клеток микроорганизмов" (Пущино, 1987), Всесоюзно]: оренции "Физико-химическая биология и биотехнология фоте , лшх микроорганизмов" (Москва, 1987), Всесоюзной конференции "Микробиологические мето; •• бы с загрязнением окружающей среды (Пущино, 1988), т дународ-ном семинаре "Структура исвойства модельных и:,, .логических мембран" (Дубна, 1989), Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях" (Пущино, 1989), уш-ом Международном конгрессе по фотосинтезу (Стокгольм, Швеция, 1989), Всесоюзная конференция по биоорганической химии (Алушта, 1989), Международной конференции

"Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пущино, 1991), и-ом Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991), 1У-ом Международном семинаре "Изучение биологических и липидных мембран, амфифилов методом нейтронного рассеяния (Дубна, 1992), 1х-ом Международном конгрессе по фотосинтезу (Нагойя, Япония, 1992), у-ом Российско-Шведском сишозиуме по физико-химической биологии биомембран, биоэнергетике, фотосинтезу (Пущино, 1992), Международном семинаре ЮНЕСКО/ЮНЕЛ "Промышленные токсичные отходы" (Москва,

1992), Международной конференции стран СНГ "Структурно-функциональная организация фотосинтетических мембран и их моделей" (Пущино, 1993), Международной конференции "Моделирование первичных стадий фотосинтеза" (Пущино, 1993), школе-конференции по биоорганической химии "Фоторецепторы и фитогормоны (Пущино,

1993), Международной конференции "Экология города" (Москва,

1994), Межведомственном научно-методическом семинаре "Загрязнение окружающей среды и здоровье населения экологически неблагополучных территорий" (Москва, 1994), 1-ом Международном Сишозиуме ееко "Оценка химического риска" (Москва, 1994), на семинарах в Институте физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского МГУ, Института почвоведения и фотосинтеза РАН и на заседании Всесоюзного микробиологического общества.

Основные результаты диссертации представлены в 42 публикациях .

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация содержит Г60 страниц основного текста, 31 рисунка, 2 таблиц и списка цитируемой литературы из 469 наименований.

- 10 -СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение.

Во введении обосновывается актуальность работы, сформулированы цель исследований и основные задачи, указана новизна и практическая ценность работы, приведены сведения о ее апробации. Определяется место данного направления исследований в анализе экологического риска, обосновывается важность этого направления для всего анализа риска, аргументируется определяющее значение оценки состояния фотосинтезирующих организмов, как наиболее адекватный и надежный интегральный показатель состояния экосистемы, показывается что, структурнофункциональ-ная организация фотосинтезирующего аппарата фототрофных организмов является надежным показателем их состояния и, соответственно, состояния всей экосистемы, в которую за счет функционирования этого фотосинтезирующего аппарата поступают энергия, биомасса и кислород, то есть основа всего живого на Земле.

ГЛАВА I. Методы и объекты исследования.

I.1.Лазерная селективная дифференциальная абсорбционная пикосекундная спектроскопия.

Абсорбцонные спектроскопические исследования фотосинтезирующих объектов в пикосекундном диапазоне проводили на лазерном спектрометре, разработанном в Вильнюсском университете, совместно с А.П.Разживиным. Пикосекундный лазерный дифференциальный спектрометр имел следующие основные блоки: задающий лазер, источник возбуждающего излучения, источник зондирующего излучения, спектрофотометрическая система, система регистрации и управления, система отображения информации.

В качестве задающего генератора использовался лазер на АИГ:ш3+ с пассивной синхронизацией мод. Выделенный из цуга одиночный импульс усиливается в двухкаскадном усилителе, после чего с помощью светоделительных пластинок формируются три пучка. Первый пучок после удвоения частоты накачивает параметрический генератор света (ПГС) на кристалах кэр, второй пучок накачивает ПГС на кристалле ь1№о3. ПГС на кор обеспечивает

перестройку в диапазоне 0,8-1,5 мкм при энергии в сигнальном импульсе 1-2 мДж, ПГС на глиьо соответственно 0,7-2 мкм и 0,05-0,1 мДж. Первый канал использовался для возбуждения образца, второй - для измерения индуцируемых возбуждающим импульсом абсорбционных изменений (канал зондирования). В канале возбуждения находился электромеханический затвор для измерения нулевого уровня и управляемый ослабитель, представляющий собой жидкостной фильтр переменной толщины. Однородность засветки по сечению зондирующего пучка достигалась введением в возбуждающий пучок рассеивателя и фокусирующей системы, обеспечивающей диаметр пятна возбуждения в з-4 раза больше диаметра пучка зондирования. Калибровка канала возбуждения по абсолютным значениям интенсивности производилась с помощью фотодиода с известной спектральной характеристикой, предварительно отградуированного на длине волны 0,53 мкм по прибору ИМО-2. В канале зондирования при измерении дифференциального спектра в широком диапазоне применялся пикосекундный континуум, генерируемый в о2о третьим пучком основного излучения. ПГС применялся при измерении зависимости абсорбционных изменений от интенсивности возбуждения или задержки зондирующего импульса относительно возбуждающего. Применение для зондирования относительно мощного узкополосного излучения позволило отказаться от спектрального прибора в канале регистрации и применить в качестве фотоприемников фотодиоды. Это в совокупности с накоплением за юо-120 измерений позволило обеспечить чувствительность -ю-4 опт.ед. при фоновом поглощении -1 опт.ед. Относительная погрешность измерений при эффекте более 5 ю опт.ед. достигала 2-з%. При зондировании континуумом типичная ошибка измерений составляла 2-5 ю-3 опт.ед. Временное разрешение спектрометра достигало -ю пс при регистрации моноэкспоненциального процесса; при более сложной релаксации требуется учет формы возбуждающего и зондирующего импульсов и моделирования на ЭВМ. Накопление, первичная обработка информации и управление спектрометром осуществлялось на ЭВМ через индивидуальный интерфейс.

1.2.Фазово-модуляционная флуорометрия.

Фазово-флуорометрические исследования времени жизни и относительного квантового выхода флуоресценции проводили на фа-зово-модуляционном флуорометре, сконструированном в МГУ (Борисов А.Ю., Ларионов В.И.). Основные параметры флуорометра были: частота модуляции возбуждающего света - 12,3 МГц, спектральный диапазон - видимая и ближняя инфракрасная область, временное разрешение - зо пс, чувствительность - 105 фотонов/ см2. Для измерения времени жизни флуоресценции использовал! метод (Фетисова, Харченко, Благовещенский, Борисов, 1984).

1.3.Кинетическая флуоресцентная спектроскопия пикосекунд-ного временного разрешения.

Флуоресцентные спектроскопические исследования фотосинте-зирующих объектов в пикосекундном диапазоне проводили на лазерном пикосекундном спектрохронографе, разработанном в Тар-тусском Институте физики, совместно с В.И.Годик. Пикосекундны! лазерный импульсный флуорометр использовал квазинепрерывное возбувдение от синхронно накачиваемых лазеров на красителях i систему регистрации на основе электронно-оптической камерв (ЭОК), работающей в режиме непрерывной гармонической развертки, синхронизированной с импульсами лазера. Источником пикосе-кундных возбуждающих импульсов в диапазоне 680-800 нм служи, лазер на красителе Оксазин-i фирмы "spectra-Physics", с длительностью импульсов з пс, синхронно накачиваемый с частото] 82 МГц криптоновым ионным лазером с активной синхронизацие! мод оптико-акустическим модулятором. Использованная интенсивность возбуждения (0,2 В/см2) исключала процессы аннигиляци экситонов. Флуоресценция объектов регистрировалась год прямы! углом к направлению возбуждающего луча (в режиме отражения через монохроматор с помощью промышленной ЭОК типа УМИ-эзМ ЭОК сопряжена с блоком синхронной развертки, что позволяет ре гистрировагь и накапливать сигналы флуоресценции, возбуждаемы каждым лазерным импульсом. Свечение экрана ЭОК регистрируете суперкремниконом sit-soo, сопряженным с оптическим многока

нальным анализатором osa 500 и ЭВМ. Это позволяет автоматизировать процессы регистрации и обработки данных. Основные параметры прибора: спектральная область регистрации 350-1100 нм,-спектральная область возбуждения - б85-в5о нм (340-420 нм при использовании второй гармоники); спектральное разрешение - 7 см-1; ширина аппаратной функции на полувысоте - ю-is пс,- временное разрешение з-5 псек,- чувствительность 102 фотона в секунду на элемент разрешения; динамический диапазон - з ю3.

1.4.Оптическая абсорбционная спектроскопия линейного дихроизма .

Измерение спектров линейного дихроизма проводили методом (Харченко, Абдурахманов, Фетисова, 1987), путем ориентации объектов в полиакриламидном геле при осесимметричной деформации геля. Степень деформации образца (n) определяли отношением конечной к исходной длине геля. Спектры поглощения линейнопо-ляризованного света измеряли на спектрофотометре "Спекорд М-40, Karl Zeiss". Плоскополяризованный свет обеспечивали поляризационными светофильтрами или призмой Глана. Спектры а и а соответствовали поглощению света, поляризованного параллельно и перпендикулярно оси ориентации образца. В качестве меры линейного дихроизма брали величину дихроичного отношения d = а /а . Для определения ориентации векторов дипольных моментов оу-переходов основной ССА зеленых фотосинтезирующих бактерий была использована модель ориентации с одним параметром (Смирнов, 1952; Tanizaki, 1965; Абдурахманов и др., 1978). Расчет угла а, образуемого векторами дипольных моментов <2у-переходов Бхл с с длинной осью хлоросомом (Хлс), проводили, используя аналитическую зависимость d(а,n) для одноосно-ориентированных частиц [Kuhn, Grun, 1942; Tanizaki,1965; Гана-го и др., 1980]:

a il 1 - т + (зт - l)cos2a

D = - = 2 -

Ах 1 + Т - (ЗТ - 1) COS2OÍ

где т - параметр ориентации, равный:

arctg

(1 -

d - дихроичное отношение;

ау и - оптическая плотность образца для света, поляризс ванного параллельно и перпендикулярно оси деформации образщ a - угол мезду вектором момента электронного пере хода i длинной осью ориен тированной частицы; n - параметр деформации полимера, равный отношению конечной длины к исходной.

1.4.Объекты исследования

Исследования проводили на препаратах хроматофоров (ХФ) реаКЦИОННЫХ Центров (РЦ) ПУРПУРНЫХ бактерий Rhodospirill rubrum, Rhodopseudomonas sphaeroides (содержащих баКТериОХЛ! рофилл a - Бхл а) И Rhodopseudomonas viridis (Содержащих Б. Ь), на клетках, препаратах хлоросомо-мембранных комплексо хлоросом и обогащенных РЦ зеленых серных бактерий chiorobi limicola forma thiosulfatophilum ШТЭММЫ С И L, Зеленых терм фильных бактерий Chloroflexus aurantiacus ШТаММЫ A, Bill И из коллекции чистых культур кафедры микробиологии МГУ. Все п лученные препараты характеризовались на гомогенность и целое ность изучаемых структур на электронном микроскопе н7оо и hi Структурно-функциональная организация препаратов характериг валась по спектрам поглощения (на спектрофотометрах: Спекс

М-40, Karl Zeiss, Jena; H-557, Hitachi; UV-2100, Shimadzu),

спектрам флуоресценции (на спектрофлуориметрах Aminco-Bowmc

И MPF-4, Hitachi), ПО СПеКГрЗМ КРУГОВОГО ДИХрОИЗМЭ (НЭ ДИХРС рафе Mark-3, joben-ivon), по спектрам линейного дихроизма времени жизни флуоресценции.

Для выделения РЦ использовали культуру пурпурных Hecepi бактерий R. rubrum ДИКИЙ ТИП. Клетки R.rubrum выращивали

модифицированной среде Ормерода с малатом натрия и дрожжевым экстрактом в анаэробных условиях в го-литровых бутылях в люми-ностате при интенсивности освещения около юоо ж и температуре 28-32°С в течение 4-5 суток. Биомассу клеток отделяли на проточной центрифуге и дважды промывали дистиллированной водой. Клетки хранили в темноте при температуре - 7о°С.

Для выделения ХФ клетки размораживали при температуре +5°С. Размороженные клетки суспендировали в буфере при рн = 8,о, гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком и разрушали ультразвуком. Полученную суспензию подвергали центрифугированию при 40 ооо g в течение is минут на центрифуге j2-21 (Бекман, США) в роторе ja-2o для осаждения неразрушенных клеток и осколков клеточных мембран. Осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость подвергали ультрацентрифугированию при 105 ооо g в течение эо минут на центрифуге L5-70 (Бекман, США) в угловом роторе зо при температуре 4°с для осаждения ХФ. После окончания центрифугирования надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок ХФ суспендировли в 0,05 М натрий фосфатном буфере при рн = 7,0, гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком и вновь подвергали переосаждению в ультрацентрифуге в том же режиме в течение эо минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, а в осадке получли промытые ХФ. Осадок суспендировали в том же буфере при рн = 7,0 и хранили в темноте при температуре +4°С.

Полученные ХФ r.rubrum являются исходным материалом для выделения РЦ. Для отделения РЦ от CCA из ХФ, последние разводятся до оптической плотности А^" = 75 оптических единиц 0,05 М натрий фосфатным буфером при рн = 7,0 с добавлением восстанавливающего агента и инкубируются в 0,25% растворе детергента лаурилдиметил амин оксида (ЛДАО) в течение одного часа при температуре +4°С. РЦ, перешедшие в раствор под дейтвием ЛДАО, отделяли от интактных и разрушенных ХФ и от CCA ультрацентрифугированием при los ооо g на центрифуге L5-70 (Бекман, США) на угловом роторе зо в течение эо минут. Осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость, содержащую РЦ, осторожно собирали стек-

лянным шприцом с длинной иглой, а затем концентрировали не ультрафильтрационной ячейке до объема го-зо мл. Из полученногс объема осаждали РЦ с помощью высаливания сульфатом аммония дс 25% насыщения. Осадок РЦ отделяли центрифугированием при <н ооо д в течение 15 минут. Надосадочную жидкость, содержаще остатки ССА, отбрасывали, а осадок суспендировали стеклянно! палочкой в том же объеме о,о5 М натрий фосфатного буфера щн рн = 7,о с добавлением восстанавливающего агента, гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком и затем переосаждали высаливанием сульфатом аммония до 20% насыщения. Осадок РЦ отделяли центрифугированием при 40 ооо д в течение 15 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадо] суспендировали в минимальном объеме о,о5 М натрий фосфатноп буфера при рн = 7,о и диализовали против 0,05 М натрий фосфатного буфера с рн = 7,8 при температуре +4°с. Полученный препарат РЦ концентрировали на ультрафильтрационной ячейке и сохра няли в темноте при температуре -м°С.

ГЛАВА 2. Определение структурно-функционального состояни. популяции фототрофных микроорганизмов - ключ к адекватной оценке экологического риска.

В разделе 2.1. формулируется, почему при анализе состоя ния культуры или популяции микроорганизмов необходим системны анализ.

В разделе 2.2. определяется, каковы же основные принцип и характерные черты системного подхода.

В разделе 2.з. обосновывается, что интегральные индикато ры являются наиболее адекватный инструментом для оценки состс яния экосистемы.

В разделе 2.4. дается представление о структурно-функцис нальном состоянии системы. Отмечается, что от состояния бакте риальной популяции зависят многие важнейшие структурные и фуг кциональные параметры клеток - состав и функциональное состо? ние клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, соста! внутренняя структура, стабильность и функциональная активное!

клеточных органелл и ряда других клеточных образований, функциональная активность бактериальных ферментов и многие другие свойства клеток, включая морфологию как отдельных клеток, так и клеточных колоний.

В разделе 2.5. обосновывается, что состояние пигментного аппарата может отражать энергетическое и структурно-функциональное состояние фоготрофных бактерий; формулируется понимание автором стадии роста культуры (популяции) микроорганизмов.

В разделе 2.6. доказывается, что спектры поглощения и флуоресценции являются индикаторами состояния пигментной системы бактериальных клеток, описываются преимущества спектральных методов, позволяющих изучать живую систему in vivo и "интактно".

В разделе 2.7. дается характеристика спектру поглощения культуры фототрофных организмов как интегральному индикатору состояния популяции и окружающей среды.

ГЛАВА 3. Структурная организация фотосинтезирующего аппарата зеленых бактерий.

Взаимная ориентация векторов дипольных моментов переходов молекул ССА в значительной степени определяет эффективность первичных стадий фотосинтеза (Фетисова, Фок,1984). Теоретически было показано, что максимальная эффективность переноса энергии достигается, когда эти векторы параллельны направлению, лимитирующему перенос энергии от ССА к РЦ (Фетисова и др., 1985). Экспериментальную проверку этого предположения о возможности существования строгой ориентационной упорядоченности этих векторов in vivo проводили узеленых бактерий, антенна ФСЕ которых на порядок больше, чем в фотосинтезирующих органах других видов, и требует для эффективности функционирования более упорядоченной структуры. В зеленых серных бактерий на один РЦ приходится около юоо молекул Бхл с и около 8о молекул Бхл а, обуславливающих пики поглощения в областях 730-750 и ею нм соответственно. Весь Бхл с содержится в стержнеобразных структурах, так называемых хлоросомах, соединенных с цитоплазмати-

ческой мембранной, в которой находятся РЦ и БХл a (oison, 1980). Исследование ориентации векторов моментов Бхл с в хло-росоме зеленых бактерий и было целью настоящей работы.

Исследования проводили на фотоактивных комплексах, выделенных из клеток зеленых серных бактерий c.iimicoia. Эти комплексы, названные нами хлоросомо-мембранными комплексами (ХМК), по структурно-функциональному критерию аналогичны хрома тофорам пурпурных бактерий, т.е. содержат весь фотосинтезирующий аппарат клеток. Для их выделения суспензию клеток, разрушенную ультразвуковой обработкой ценгрифуговали при 12000g в течение ю минут и из супернатанта выделяли ХМК центрифугованием в градиенте плотности сахарозы при isoooog в течение 18 часов. Контроль размеров и формы ХМК с помощью электронного микроскопа Н—12 ("Хитачи",Япония) показал, что ХМК имеют стержнеобраз-ную форму с максимальным размером около îeo нм и соотношение длин короткой и длинной осей i:(4-6). Ориентацию дашольных моментов переходов Бхл с в ХМК изучали методом линейного дихроизма, как было описано в разделе 1.3.

На рис. 1 приведены спектры поглощения ап и ах, а также рассчитанный спектр d(a) = A||(x)/Aj.U) в диапазоне от воо до 9оо нм при м = 1,98. Как видно из рис. 1, в области поглощения Ехл с от 7ю до 770 нм величина d практически не изменяется, в то время как при а>7ю нм и а>77о нм она значительно варьирует. Таким образом, точное значение угла а может быть вычислений только для Бхл с, поглощающего в диапазоне 710-770 нм. Для проверки адекватности применяемой теории величину d измеряли при трех параметрах деформации n: i,ie; i,6o и 1,98. На рис. 2 при ведено семейство теоретических зависимостей d(N) при разных значениях угла а, вычисленных по вышеприведенной формуле, а также экспериментальные значения d(N). Как видно из рис.2, модель ориентирования стержнеобразных частиц с достаточной точностью описывает экспериментальные данные. Значения d(n) усреднены по измерениям четырех спектров для каждого значения n. Угол, образуемый векторами моментов ау-первходов Бхл с с длинной осью хлоросомы, оказался равным а = о°. Точность изме-

600

650

5* -

Ч 3

1 о

700

"Г

750 800 Хнм

г о

13 1-10* см'*

гс. I. Спектры поглощения А„и Ах(1 и 2 соответственно) и ди-гаичного отношения ориентированных в полиакрлламшшом геле юросомо-мембранных комплексов (3) зеленых серных бактерий 11ш1со1а штат С при степени деформации образца N = 1.98.

Рис. 2. Теоретические зависимости дихроичного отношени: от параметра деформации N при разных значениях угла а (показ справа от кривых). Экспериментальные точки соответствуют зна ниям , вычисленным для трех значений параметра деформации № 1,16; 1,60 и 1,98. Экспериментальное значение 0(Ы) при N = т.е. для неориентированного образца, о(1) = I.

рения соответствует отклонению этого значения в пределах 7°.

Таким образом, все векторы моментов <эу-переходов Бхл с, параллельны и ориентированы практически идеально вдоль длинной стороны хромосомы.

ГЛАВА 4.Определение основных функциональных характеристик пигментной системы зеленых бактерий - скорости иэффективности переноса энергии.

В этом разделе описываются результаты определения скорости переноса энергии возбуждения в ССА зеленых серных бактерий. Как было показано Борисовым, скорость переноса энергии в ССА и скорость преобразования энергии возбуждения фотохимическими РЦ в химическую энергию является важнейшей характеристикой фото-синтезирущего аппарата, определяющей его эффективность и, в конечном счете, его жизнеспособность. Для решения этой задачи был разработан и апробирован в модельном эксперименте универсальный фазово-флуорометрический метод измерения времени жизни флуоресценции фотосинтетических пигментов in vivo в пюсосекун-дном диапазоне. Метод основан на смешивании двух световых потоков флуоресценции. Фотокатод фазового флуорометра регистрирует суперпозицию двух световых компонентов: искомого коротко-живущего (с квантовым выходом <pv и временем жизни и долго-живущего компонента того же объекта в подходящем растворителе (с квантовым выходом <рс и временем жизни т ). и определяются сравнением двух экспериментальных величин: отношений *Vrm и тш ~ измеряемые параметры двухкомпонентной флуоресценции) и Существует определенная аналитическая зависимость между измеряемыми параметрами двухкомпонентной флуоресценции <рш и -г , измеренными на фазовом флуорометре, и величинами. <ру, tv, рс И Tc(Borisov, Godic, 1972 ; Borisov et al. 1977). Определим соотношение (р) двух экспериментално измеряемых величин:

f>c'xc

V /Ъ rm' ro

Введем обозначения: х = ту/тс и а = С /Сс, где Ск и Сс -относительные концентрации соответствующих фракций флуоресцирующих молекул. Тогда для двух измеряемых величин хвир можно составить систему двух уравнений с двумя неизвестными «их:

I + аХ2

тш = тс --(1):

т с I + аХ

(I + а)(I + «X2) (3 = --(2).

(Г + аХ)2

Этот метод был модифицирован специально для измерения в пикосекундном диапазоне времени жизни флуоресценции фотосинтетических пигментов in vivo. Измеряемая флуоресценция гетеро-генна, т.е. представляет собой результат суперпозиции двух компонентов: постоянного, долгоживущего, с постоянными величинами <рс и тс и вариабельного, короткоживущего, с изменяющимися величинами <р и т , зависящими от окислительновосстановитель-

НОГО СОСТОЯНИЯ РЦ (Borisov, Godic, 1972). ТОГДЭ ДЛЯ ДВУХ РЭЗ-

личных условий, при которых имеет разные значения, следует определить две пары величин ^ир. В этом случае решается система четырех уравнений с четырьмя неизвестными. Для Этого общего случая проводили модельный эксперимент с раствором флуоресцеина натрия, флуоресценция которого тушилась иодистым калием. Использовали флуоресцеин натрия фирмы serva (Швейцария) и иодистый калий ("х.ч."), дважды перекристаллизованный. Для измерения времени жизни флуоресценции использовали фазовый флуорометр, работающий при частоте v = 12,3 МГц (см. Методы и объекты исследования). Двухкомпонентное излучение получали путем смешивания двух световых потоков флуоресценции

двух растворов флуоресцеина натрия в 0,01 М ратворе едкого натра, находящихся в двух смежных кюветах, в одну из которых добавляли в качестве тушителя иодистый калий. Фотокатод ФЭУ фазового флуориметра регистрировал суперпозицию двух световых компонентов: искомого корогкоживущего (флуоресценцию 5 10~6 М раствора флуоресцеина натрия в 0,01 М едком натре, потушенную 0,3 М или I М иодистым калием, т.е. вариабельного компонента с параметрами <р и г ) и долгоживущего (флуоресценцию Ю-6 М раствора флуоресцеина натрия в 0,01 М едком натре, т.е. постоянного компонента с параметрами <рс и тс). Таким образом, Сг = 5-Ю"6 М, Сс = Ю-6 М и а = 5.

Для первой пары растворов, т.е. первой пары смежных кювет (а именно: I)I0-6 М раствор флуоресцеина натрия; 2)5 Ю-6 М раствор флуоресцеина натрия + 0,3 М калий иодистый), измеренные величины суммарного двухкомпонентного свечения тга и <р оказались следующими: -^=2,78+0,01 нсек, »^=43,8+0,1 отн. ед.

Для второй пары растворов, т.е. второй пары смежных кювет (а именно: 1)10_6 М раствор флуоресцеина натрия; 2)5 Ю-6 М раствор флуоресцеина натрия + I М калий иодистый), измеренные величины суммарного двухкомпонентного свечения гт и <р оказались следующими: = 3,37+0,01 нсек, р1 = 32,7+0,1 отн. ед.

Для раствора флуоресцеина натрия той же оптической плотности, что и общая оптическая плотность двух смежных кювет, были измерены величины xs и <ps: rs=3,89±0,0I нсек и i>s=I35±0,5 отн.ед.

ps/xs

Тогда (3. = - = 2,20±0,02;

V-i

И (3 = - = 3,5510,03.

V2/V2

Для четырех экспериментально определяемых величин (т1, т2, рt и р2) можно составить систему четырех уравнений с четырьмя неизвестными (а, т , хг и х2), подобную вышеприведенной системе двух уравнений (I) и (2):

I +

I + аХ2

I + ах2

(4);

(5);

(I + «)(1 + ах2) ^ =- ;

(I + "V2

(I + а)(I + аХ2) (32 =- ; (6);

(I + *х2)2

Решая эту систему уравнений, получим вьфажения для неизвестных:

« =-— ; (7);

(Р2т1\//Гз1 - 1 - р1х2\//р2 - 1 )

-/91а + у//32а2 + а (/3^ - а - 1) (а + 1 - Э1)

х1= - ; (8) ;

а(рха - а - 1)

-Р2сс + у $2га2 + <х(/32а - а - 1) (а + 1 - 02)

Х2= - ; (9);

а(Рг<х - а - 1)

1 + схХ1

г = г - ; (10);

1 + аХ^

ИЛИ

1 + аХ„

тс = V

1 + аХГ

(II) ;

Вычислим значения величин а, тс и т^ для нашего конкретного эксперимента: с

а = 4 - 7 (по условию эксперимента а = - = 5),

Сс

тс = 4,0-4,9 нсек (измеренное тс равно 3,95±0,05 нсек), ту = 560-730 пксек (измеренное т равно 640±100 пксек), г

УХ 2

200-390 пксек (измеренное г равно 280±100 пксек).

Разработанный метод использовали для определения скорости переноса энергии возбуждения в ССА зеленых бактерий. ССА зеленых бактерий содержит небольшое количество (5% всех светособи-рающих пигментов) Бхл а, который служит промежуточным переносчиком энергии возбуждения от Бхл с или (Бхл d), основного све-тособиранцего пигмента (-95%), к фотохимическим РЦ Р84о. Определяли скорость гетерогенной миграции энергии от Бхл с к Бхл а в фотохимически активных пигмент-белковых комплексах (ПЕК) из зеленых бактерий chiorobium limicoia, обогащенных РЦ Р840. ПЕК получали ультразвуковой обработкой клеток с последующим цент-рифугованием в градиенте плотности сахарозы.

Вышеуказанным методом было показано, что около ю% молекул Бхл с ССА не активны для фотосинтеза и являются источником постоянного компонента флуоресценции; остальные эо% молекул Бхл с принимают участие в переносе энергии возбуждения к Бхл а и служат источником вариабельного компонента флуоресценции, квантовый выход {<pv) и время жизни {ту) которого зависят от окислительно-восстановительного состояния РЦ Р84о. С помощью этого метода было показано, что около эо% молекул Бхл с ССА исследованных ПБК зеленых бактерий принимают участие в переносе энергии возбуждения к Бхл а и осуществляют это в условиях не насыщенного по свету фотосинтеза за время го-бо пксек с эф-

фективностью большей 97%.

Тагам образом, при повревдении ССА в результате воздействия вредных факторов окружающей среды, фототрофные бактерии способны поддерживать эффективность фотосинтеза за счет неповрежденной ССА. Это один из путей адаптации фототрофных бактерий к повреждающим факторам окружающей среды. Процесс адаптации носит компенсаторный характер только в определенном диапазоне воздействия, пока количество неповрежденных пигмент-белковых комплексов ССА достаточно для обеспечения эффективной работы фотохимических РЦ. Скорость роста культуры бактерий при этом пропорционально снижается, пока не происходит их отмирание. Следовательно, наблюдая за состоянием пигментной системы фотосинтезирующего аппарата фототрофных бактерий, можно судить о степени загрязненности окружающей среды веществами, отрицательно влияющими на процессы жизнедеятельности фототрофов.

ГЛАВА 5. Изменение структурно-функциональной организации фотосинтезирующего аппарата зеленых бактерий при изменении условий окружающей их среды.

Раздел 5.1. Характерные особенности изменения спектров поглощения фототрофных зеленых бактерий в процессе роста культуры.

Цель настоящей работы - исследование особенностей изменений спектров поглощения клеток фототрофных бактерий в процессе роста периодической культуры. Наибольшее внимание уделялось изменениям, происходящим в период от конца лаг-фазы до начала стационарной фазы роста.

Исследование проводились на зеленой термофильной бактерии ch. aurantiacus штаммы а, вш и uz и зеленой серной бактерии с. limicoia, штаммы с и l. Спектры поглощения измерялись на спектрофотометре "Hitachi н557"(Япония) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 2 мм в диапазоне от 300 до 900 нм.

В процессе роста культуры через определенные промежутки времени (3,6,9,12,25,30,36,49,54,60,76,96,120,144 И 175 часов) проводились измерения спектров поглощения культуры, определе-

ние концентрации Бхл с и белка.

На всех стадиях роста культуры у всех штаммов ch.auranti-acus (рис.3) можно обнаружить следующие основные полосы поглощения, проявляющиеся в виде пиков или плечей (в зависимости от стадии роста культуры): 402 нм (обусловлена поглощением предшественников биосинтеза Бхл); 461 нм (обусловлена полосой Соре Бхл cg); 739 нм (обусловлена оу-переходом Бхл cg); 801 и 865 нм (обусловлены поглощением Бхл а минорной ССА и РЦ). Для с.limicoia шт.С можно наблюдать следующие основные полосы поглощения: 402 нм (обусловлена поглощением предшественников Бхл); 425 и 450 нм (обусловлены полосой Соре Бхл с); 740 нм (обусловлена <2у-переходом Бхл с) и 810 нм (обусловлена Бхл а минорной ССА и РЦ). При этом у с.limicoia шт.С положение полос 450 и 740 нм может значительно изменяться в зависимости от условий культивирования.

В процессе роста исследованных культур зеленых бактерий происходит как увеличение поглощения по абсолютной величине всех основных полос поглощения, так и существенные изменения соотношения пиков отдельных полос поглощения.

В процессе роста культур в период от начала экспоненциальной до начала стационарной фаз роста происходили характерные изменения в соотношении пиков полос поглощения. У ch.aura-ntiacus, шт.uz (рис.3,а и в) наблюдались наибольшие изменения: соотношение ¿461/^402 изменялось от 0,42 до 1,57; а461/а?39 -от 1,6 до 1,0; а739/л801 - °т 15 Д° 22. Самым характерным для всех изученных штаммов было изменение соотношения полос поглощения, обусловленных полосой Соре и поглощением предшественников биосинтеза Бхл. У ch.aurantiacus - это соотношение

а461/л402' у c-limicola< - д444/л402' 3 у c-iimic°la

- а450/а400- Это соотношение имело наиболее широкий диапазон изменения у всех штаммов: от 0,40 до 2,00, и по величине этого соотношения можно было определить, в каком месте экспоненциальной кривой роста находится в данный момент культура. Данный факт дает ценный практический инструмент для работы с зелеными фотосинтезируюищми бактериями. Найденный нами критерий позво-

Ряс. 3. Изменение спектров поглощения клеток зеленых термофильных бактерий Chloroflexus aurantlacus штамм UZ (а-в) и штамм Bill (г-е) в процессе роста. По оси абсцисс - длина волны в нм; по оси ординат - поглощение в относительных единицах, абсолютные значения зависят от выбранной шкалы измерения: а)0,47; 6)1,ТО; в)3,00; г)0,5б; д)0,7б; е)1,4 опт. ед.

ляет не определять по точкам всю кривую роста периодической культуры (а это часто очень дорого и требует больших затрат времени и сил), а по спектру поглощения (по величине соотношения л4б1/л402, а450/а400 или ¿444/^402,5). быстро оценивать в каком состоянии находится культура.

Раздел 5.2. Изменение спектральныых характеристик культуры зеленых фототрофных бактерий при изменении рН среда и концентрации восстанавливающего субстрата.

При изучении пурпурных бактерий было показано, что Бхл а in vivo образуют несколько хорошо изученных спектральных форм [Thornber, Trosper, 1978; Thornber, 1986]. Незначительно изменяясь от вида к виду (в пределах нескольких нм), эти формы в пределах одного вида бактерий имеют постоянные характерные спектральные свойства, такие как: положение максимумов полос поглощения, их ширина на полувысоте максимума и асимметричность полос поглощения. До последнего времени было много сообщений о спектральных изменениях различных видов фотосинтези-рующих бактерий при изменении условий их культивирования, но все они касались относительной величины пиков поглощения, или отсутствия у мутантных штаммов некоторых пиков поглощения, характерных ДЛЯ ДИКИХ штаммов [Thornber et al., 1978; Thornber, 1986]. На основании этих данных предполагали (Pfennig, 1989), что спектральные особенности фотосинтезирующих бактерий являются в значительной степени генетически наследуемыми свойствами, таким образом, характеризуют данного представителя фотосинтезирующих бактерий. Однако наши исследования на зеленых бактериях показали, что для гетерогенных основных пигментов зеленых бактерий (Бхл с, d или е) это предположение неверно.

Нами исследовались спектральные характеристики клеток зеленых бактерий при изменении условий их культивирования. В результате было найдено, что на спектральные свойства клеток зеленых бактерий могут влиять очень многие факторы, такие как общее состояние культуры, скорость роста, состав и рН среды,

остаточная концентрация кислорода, освещенность, температура, возраст культуры, загрязнение среды и многие другие. Значение некоторых ЭТИХ факторов Сыло изучено ранее [Van Gemerden, Bee-ftink, 1983 ; Pfennig,1978,1989] . ВЛИЯНИе МНОГИХ фЭКТОрОВ НвОД-

нозначно и может зависеть от других факторов. Как Сыло найдено в результате наших экспериментов, наибольшее влияние на спектральные характеристики имеет рН среды культивирования.

При исследовании влияния изменений рН среды культивирования на положение максимума длинноволновой полосы поглощения клеток зеленых серных бактерий c.iimicoia шт. С в качестве донора электронов использовали сульфид натрия в концентрации о,5 г/л или 1,5 г/л. Опыты ставили на серии кульгуральных флаконов, емкостью so мл, по несколько флаконов при каждом значении рН, после чего каждый из флаконов помещался в одинаковые условия освещения в люминостат при температуре около 2в°С и освещенности около 5оо люкс. На рис.4 показано изменение оптической плотности максимума длинноволновой полосы поглощения как функция времени культивирования. Как видно на рисунке, максимальные значения оптической плотности достигалось при рН 6.7 и 6.9, а минимальные при рН б.з и 6.5. Было показано, что при одном и том же рН в процессе роста не происходит изменение положения максимума длинноволновой полосы поглощения. В то время как при изменении рН наблюдается соответствующее изменение положения максимума длинноволновой полосы поглощения: наиболее длинноволновый сдвиг полосы поглощения наблюдается при рН 6.66.7 (до 752 нм), тогда как наиболее коротковолновый сдвиг -при рН 7.з (до 725 нм). Более длинноволновый сдвиг происходит при более низких концентрациях сульфида, в то время как более коротковолновый сдвиг - при более высоких. При рН меньше 6,1 и больше 7,5 происходит значительное торможение роста культуры, и частичная феофитинизация Бхл с. Наибольшее количество биомассы накапливается при рН 7,0.

Из спектров поглощения определяли ширину полосы на полувысоте максимума длинноволновой полосы поглощения клеток зеленых бактерий. На рис.5 показана зависимость изменения ширины

Ен

° 2.00

<4 Н О О

И 1.00 ь

о «

: о.оо

о *

д -Ъ.з

□ -Б.5

0 О -6.7

9 а + А о 0 -6.9

* А -7.1

к * -7.3

л о

-1—I—I—I—I—I—I—г

"Г 50

-1—г—I—I—I—г

-1-г—1-1—I—г

1 ¿о'

время культивирования (в часах)

100

-I—I—1—I—I—г

200

Рис. 4. Изменение величины чвхсящна длинноволновой вола си поглощения культуры зеленых бактерий СМогоЬшгл Пгти"со1а шт.С в процессе культивирования при разных значениях рН среды культивирования (концентрация сернистого натрия 1.5 г/л)

:70

<8 a

1 40

□

0 о

-i—|—i—I—i—i—i I I—I—i—r—

50 100

I I I I I—r~i—r-r

время культивирования (в часах)

Т—I—I—г

рЕ -5.1 -6.3 —6.5 -6.7 -6.9 -7.1 -7.3 -7.5

Рис. 5. Изменение ширины на полувыесте длинноволновой полосы поглощения культуры зеленых бактерий Chlorobium limicda шт,С в процессе хультивпрования при разных значениях pti среди »ульгивяроваки« (коицевграция сернистого натрия 1.5 г/л)

на полувысоте длинноволновой полосы поглощения культуры зеленых бактерий с.11писо1а шт.С в процессе культивирования от ве-линины рН среды культивирования и концентрации сульфида. Более узкие полосы соответствуют более низким значениям рН (до 50 нм) и по мере увеличения рН ширина полосы увеличивается, причем самые широкие полосы наблюдаются в области значений рН 6,9 - 7,з, достигая максимума ширины при рН 7,5 (до 70 нм) при концентрации сульфида о,5 г/л, и при рН 7,1 при концентрации сульфида 1,5 г/л. Диапазон изменений значения ширины полосы на полувысоте максимума, варьировал от 48 нм до 68 нм (от

0,86 103 ДО 1,28 103 СМ-1).

Одним из спектральных параметров, на который влияет рН среды культивирования, является коэффициент асимметричности полосы поглощения. Коэффициент асимметричности использовали в работе [РЬШрБоп, эаиег, 1972] для описания асимметричных га-уссиан при моделировании спектров поглощения и КД Бхл а - белкового комплекса. В нашей работе мы использовали коэффициент асимметричности реальной полосы поглощения, который определили следующим образом: если на ширину на полувысоте максимума полосы поглощения опустить перпендикуляр из максимума этой полосы поглощения, то он разделит эту ширину на две части - длинноволновую и коротковолновую, тогда коэффициент асимметричности реальной полосы поглощения можно определить как отношение длинноволновой части ширины на полувысоте максимума поглощения к коротковолновой части этой ширины. Изучали зависимость изменения коэффициента асимметричности (Кас) длинноволновой полосы поглощения культуры зеленых бактерий с.Ит1со1а шт.С в процессе культивирования от величины рН при разных концентрациях сульфида (рис.6). Как видно на рисунке, наибольший диапазон изменений коэффициента асимметричности происходит в конце экс-тоненциальной и в начале стационарной фазы роста, при этом наибольших значений Кас достигает при рН 7,1. При низких значе-шях рН среда культивирования полоса поглощения имеет меньший коэффициент асимметричности, то есть более крутую длинноволновую сторону и более пологую коротковолновую сторону. Диапазон

Кас

оо

4 <г

□

■

<г ♦

□

-1-1-1 Ч I—I-Г—1—I I I

—7—I-1—I—1—I—1-1150

время культивирования (в часах)

100

-Й

-6.3 -6.5 —Б.7 -5.9 -7.1 -7.3 -7.5

"2З0

Рис. 6. Изменение коэффициента астдеетриивоств (Нас) длинноволновой полосы поглощены культуры зеленых бактерий ШогоЫит Нт'гсаа шт.С в процессе культивирования при р&аних значениях рН среды культивирования {концентрации сернистого натрия 1.5 г/л)

изменения коэффициента ассиметричности в наших опытах составлял от о,б1 до 1,25. При увеличении значения коэффициента асимметричности приблизительно параллельно увеличивается ширина полосы поглощения и смещение полосы поглощения в коротковолновую сторону.

До наших работ изменение формы и положения полосы поглощения Бхл в пределах одного штамма не наблюдали, а отмечали только изменение относительного вклада различных полос поглощения. Хотя в настоящее время известно достаточно много различных спектральных форм Бхл, но удовлетворительной модели, идентифицирующей взаимодействия, ответственные за те или иные спектральные сдвиги, до сих пор не выдвинуто. Ясно,, что некоторые компоненты непосредственного окружения молекулы пигмента имеют глубокое влияние на ее спектр поглощения, и что спектр, таким образом, служит индикатором молекулярной организации фотосинтетического аппарата. Среди взаимодействий, которые могут влиять на спектр, находятся следующие взаимодействия:Бхл-Бхл, Бхл-каротиноиды, Бхл-липиды и Ехл-белки. И хотя есть мнение, что определяющим взаимодействием является взаимодействие Ехл-белок [геппа et а1., 1974], но определить какой вклад каждое из этих взаимодействий дает в спектральный сдвиг, в случае, когда все эти взаимодействия могут иметь место, является очень трудным. Тем не менее, если удается идентифицировать преобладающее взаимодействие, то возможно получение из спектра поглощения более детальной информации о непосредственном окружении пигмента [тиотЬег, 1986]. Однако, наблюдаемые в данном исследовании изменения спектральных характеристик полосы поглощения Бхл с, по-видимому, могут быть объяснены только сложным биохимический состав основной светособиращей антенны зеленых серобактерий. рН среды культивирования может в разной степени влиять на скорость биосинтеза и, следовательно, приводить к заметно различающейся относительной величине этих компонент. В результате суммарная полоса поглощения будет изменяться в зависимости от вклада каждой из составляющих компонент, приводя к существенному изменению всех основных спект-

ральных характеристик.

На предыдущих рисунках показан, что зависимость исследс ванных спектральных параметров от рН среды культивирована проявляется в разной степени при разных значениях восстанавли вашего субстрата - сульфида натрия. Показано, что к момент окончания экспоненциальной фазы роста, когда достигается мак симальная оптическая плотность, при концентрации сульфида i, г/л величина оптической плотности культуры почти в з,5 раэ больше, чем - 0,5 г/л, а продолжительность стационарной фаз роста короче: при о,5 г/л - 175 часов, а при 1,5 г/л - 72 че сов. Кроме того, в фазе экспоненциального роста при меньше концентрации сульфида ширина полосы почти на 20 нм больше, то время как в стационарной фазе роста она на ю нм меньше чем при концентрации сульфида 1,5 г/л. Похожая зависимость не Олюдается и в случае коэффициента асимметричности, в экспонеЕ циальной фазе роста при концентрации сульфида 1,5 г/л полос поглощения является почти симметричной (Кас = о,65), тогда кг при 0,5 r/л коэффициент асимметричности больше почти на 50%.

Таким образом, ССА фототрофных бактерий может служи1] важным интегральным показателем состояния окружающей среды.

ГЛАВА 6. Оценка скорости переноса энергии как важнейше функциональной характеристики фотосинтезирующего аппарата nyj пурных бактерий по данным селективной пикосекундной спектрс скопии.

Первичные физические процессы фотосинтеза можно подразде лить: а) на поцессы переноса энергии электронного возбувдею по молекулам ССА на РЦ и б) на процессы преобразования этс энергии в энергию разделенных зарядов в РЦ. Часть энергии тс ряется по пути к РЦ в виде флуоресценции (выход o.i-o.oi) Временная зависимость затухания флуоресценции должна отражач кинетику переноса энергии из ССА на РЦ и, следовательно, киш тику окисления РЦ. [Van Grondelle et al., 1978; Godic, Borj

sov, 1977]. Однако, некоторые спектральные формы Бхл флуоресцируют с пренебрежимо малым квантовым выходом и временем жизни флуоресценции. Поэтому для наблюдения за переносом возбуждений по пигментам ССА желательно использовать абсорбционные лазерные методы высокого временного разрешения. Это заставило нас проводить прямые измерения кинетики исчезновения возбуждений из ССА и последующего окисления РЦ в нативных ХФ из пурпурной бактерии R.ruburum.

Измерения выполнялись на дифференциальном пикосекундном абсорбционном спектрометре, построенном в Вильнюсском государственном университете [Borisov et al., 1982]. Это был первый спектрометр, позволяющий измерять абсорбционные изменения до ю-4 опт. ед. с временным разрешением около ю пксек. Длины волн возбуждающего и зондирующего пучков плавно перестраиваются в диапазоне от 400 до isoo нм. Энерги возбуждающего импуль-

11 18 2 са может меняться от ю до ю фотонов/см за импульс.

Фотоокисление РЦ в нативных ХФ регистрировали по сдвигу полосы поглощения Psoo РЦ. Однако кинетика абсорбционных изменений в ХФ при ею нм (в полосе Psoo), вызванных пикосекундны-и эоо-нанометровыми лазерными импульсами, состояла из двух компонентов (рис.7, кривая i). Первый компонент (короткоживу-щее увеличение оптического поглощения) обусловлен появлением и затем быстрым исчезновением возбужденных состояний молекул ССА. Второй компонент (долгоживущее просветление препарата) связан с коротковолновым сдвигом полосы Psoo при разделении зарядов РЦ. При окислении части или всех РЦ в ХФ постоянной подсветкой или феррицианидом наблюдается пропорциональное уменьшение амплитуда или полное исчезновение второго компонента. В отличие от него, первый компонент не чувствителен к переходу РЦ в ХФ из восстановленного в окисленное состояние. С увеличением энергии возбуждающих импульсов увеличивается амплитуда первого компонента и ускоряется его релаксация.

Выделение чистой кинетики окисления РЦ в ХФ выполнялось следующим образом. В спектрах ХФ Rh. rubrum около 802 нм существует точка, где оптическое поглощение исходной и сдвинутой

ЛА

о о

—о_

ÍÜÜ

ZÜÜ

-W

■ ++к

О' ^ °о

++ ч

+V4

+л

9- s¡>

о/ • Р. Л .7

С*

t.ric

of- ob си- of-

Рис.. 7. Кинетики абсорбционных изменений хроматофоров

R.rubrum, индуцированных 900-нанометровыми возбуждающими пико

секундными импульсами. Кривая I снята при 810 нм; кривая 2 по

лучена около 802 нм в изобестической точке для сдвига полос:

Р800 реакционного центра; кривая 3 вычислена вычитанием криво

2 из кривой I точка за точкой. Энергия возбуждающих импульсо 1 я —р

была около 5-Ю J фотонов-см за'импульс, что соответствуе окислению примерно 1/3 РЦ в хроматофорах(см. рис.27, кривая 3

под воздействием разделения зарядов полосы Рвоо совпадает по величине. При измерениях в этой точке регистрируются лишь фо-тоиндуцированные изменения, обусловленные возбуждением молекул ССА. Дополнительно было показано, что амплитуда этих изменений почти не меняется (в пределах ю%) в диапазоне soo-sio нм [во-

risov et al.,1982]. ПОЭТОМУ ДЛЯ ПОЛуЧвНИЯ ЧИСТОЙ КИНвТИКИ ОКИсления РЦ(кривая з на рис. 7) из кривой i, записанной при ею нм по точкам вычитали кривую 2, зарегистрированную при 802 нм.

Мы показали, что ССА ХФ Rh. ruburum содержит минорную спектральную форму Вэо5, молекулы которой, по-видимому, образуют один пигмент-белковый комплекс. На рис. 8 представлены световые кривые для минорной формы Вэоб (кривая i), основной формы антенны Beso (кривая 2) и для фотоокисления РЦ в ХФ. Световая кривая для РЦ совпадает со световой кривой для Вэоб, что указывает на перенос энергии возбуждения из ССА на РЦ практически полностью через минорную форму Вэо5.

Кинетики исчезновения возбуждений из ССА и окисления РЦ при умеренных энергиях возбуждающих импульсов (менее ю15 фотонов/см2 показаны на рис. 7 (кривая i и з соответственно). Время исчезновения возбуждений из ССА(т09О5) и время окисления (грцокисл определенные по этим кривым, равны (при аппроксимации кинетик одноэкспоненциальными зависимостями): Т.„.с = Т_1т = 60 £ 15 пксек.

B905 РЦокисл.

Приведенные выше экспериментальные данные позволяют сделать следующие выводы, i.Комплексы Вэо5 располагаются в непосредственной близости от РЦ. Совпадение времени жизни затухания возбуждений в Вэо5 со временем нарастания фотоокисления РЦ показывает, что ловушки РЦ захватывают экситоны из Вэоб. Другими словами, форма Вэо5 действует как эффективное сопрягающее звено мевду основным антенным пигментом и РЦ. 2.Энергетический зазор мезду формами Beso и Вэоз составляет зэ мэВ, что соответствует скоростям переноса энергии вверх и вниз в соотношении 1:5. Но, учитывая, ЧТО У Rh. ruburum На 3-5 молекул Вэо5 приходится примерно 50 молекул Beso, мы приходим к выводу, что квазистационарное соотношение возбуждений в формах

Рис. 8. Зависимости абсорбционных изменений хроматофоро Н.гиЬгиш от энергии 900-нанометровых возбуждающих импульса (световые кривые). Кривая I измерена при 880 нм; кривая 2 при 905 нм; в обоих случаях зондирующий импульс совпадал возбуждающим импульсом во времени. Кривая 3, показываюца сдвиг полосы.Р800 реакционного центра из-за окисления РД, за регистрирована при 810 нм с временной задержкой зондирущег импульса относительно возбуждающего на 450 пксек.

Сдетособ'ира-

fOHli/Я

аитвма

Рсал-щ/оннш центр

Рис. 9. Энергетическая схема сопряжения светасобиранцэй антенны с реакционным центром в хроматофорах Р.. rubrum. (Описание приведено в тексте).

Bsso и Вэо5 должно быть пропорционально 3:1 (это в случае избытка Beso) в предположении, что эти формы могут свободно обмениваться возбуждениями посредством индуктивно-резонансного механизма. Но это не соответствует экспериментальным данным. Основная часть возбуждений локализуется в Вэо5, как видно из соответствующих световых кривых на рис.8. Чтобы устранить это противоречие, мы предположили, что сильное электронное обменное взаимодействие в комплексах Вэоз приводит к образованию в них смешанных синглетных возбужденных состояний с комплексами с переносом заряда (как в ассоциатах молекул красителей). Это явление препятствует обратному переносу возбуждений к основному пигменту формы Bseo. Энергетическая схема первичных процессов показана на рис. 9. Непрерывной стрелкой показана очень быстрая миграция энергии возбуждения из формы Bsso к форме В905, приводящая к образованию смешанного состояния В905/В905+В905~. Штриховые стрелки представляют перенос энергии возбуждения от формы Вэо5 назад к Bsso и димеру хлорофилла РЦ(Р870)2 посредством индуктивно-резонансного механизма. Штрих-пунктирными стрелками показаны обратный перенос возбуждения с (Р870) на Вэо5 и разделение зарядов в РЦ с образова-¿ р

нием состояния Р . Видно, что энергетический зазор между Вэо5 и (Р870)2 (около so мэВ) должен уменьшать константу скорости прямого переноса примерно в ю раз при комнатной температуре и значительно сильнее при низких температурах. Однако мы не считаем, что данный механизм играет определяющую роль при переносе энергии от ССА к РЦ. Мы предполагаем перенос энергии по ту-нельному механизму (толстая стрелка на рис. 9) от Вэо5 к РЦ.

ГЛАВА 7. Функционирование фотосинтезирующего аппарата пурпурных бактерий по данным кинетической флуоресцентной спектроскопии пикосекундного временного разрешения.

Пикосекундные абсорбционные исследования первичного разделения зарядов в РЦ фотосинтезирующих бактерий показали, что образование промежуточного состояния ион-радикальной пары

[p+87o i") (где р+87о - это окисленный Бхл специальной пары, а i~ - восстановленный бактериофеофитин (И) или комплекс БФ и Р800) происходит за время 4-9 пксек [Dutton et al., 1975; Holten et al., 1980; Kirraaier et al., 1983; Klevanik et al.,

1981]. Через 150-250 пксек электрон переходит от i~ на первичный акцептор непорфириновой природы, Q [Dutton et al., 1975; Kaufmann et al., 1976]. ЕСЛИ Q ЭКСТраГИрОВЭН ИЛИ ХИМИЧвСКИ

восстановлен, разделение зарядов происходит менее, чем за ю пксек [Kaufmann et al., 1976], ОДНЭКО время ЖИЗНИ СОСТОЯНИЯ [Р+870 1~] удлинняегся ДО 10 нсек [Kaufmann et al., 1976]. Как только произошло разделение зарядов из синглетно возбужденного состояния Р870, возникает возможность независимого подхода к изучению кинетики и энергетики промежуточных стадий стабилизации энергии возбуждения на РЦ с помощью измерения пикосекунд-ных кинетик затухания флуоресценции изолированных РЦ.

В данной главе описываются результаты измерения пикосе-кундной флуоресценции РЦ из Rhodospiriiium rubrum, показавшие существование даже для наиболее чистых препаратов РЦ двух компонентов флуоресценции: короткоживущего компонента с временем жизни 6+1 пксек (независимого от температуры) и долгоживущего компонента с временем жизни 100-200 пксек. Короткоживущиая флуоресценция наблюдалась только когда Р870 был способен к фотоокислению, тогда как долгоживущий компонент проявлялся и в окисленном, и в восстановленном состоянии.

Перед пикосекундными экспериментам выделенные препараты РЦ характеризовались по их оптическим свойствам. Спектры поглощения и флуоресценции препаратов РЦ при комнатной температуре показаны на рис. 10. Препарат восстановленных РЦ имел максимумы поглощения ОКОЛО 365, 450-550, 596, 685, 755, 800 И 870

нм, что соответствует виду спектра и положению пиков для РЦ R.rubrum, известным из литературы [Olson, Thornber, 1979].

Чистота препарта РЦ оценивалась по соотношению оптических плотностей при 87о нм у окисленного и восстановленного препра-тов (фотоокисление или химическое окисление феррицианидом, восстановление - аскорбатом натрия). Препарат РЦ считался дос-

Wavelenglh nm

Рис. 10. (А) Спектры поглощения препарата РЦ R.rubrum

восстановленном (-) и окисленном (-----) состояниях.

(В) Спектры флуоресценции препаратов РЦ (- ) и хроматофс

ров (-----) R.rubrum в присутствии IG-3 М Na2So04. Возбужден!

проводили постоянным светом 365 нм интенсивностью Ю--' фоте нов/см"^ в сек. Спектральна ширина щели монохроматора 10 нм.

таточно хорошо очищенным от хлорофилл-белковых комплексов ССА, если при 870 нм поглощение окисленных РД не превышает 25% от поглощения восстановленных РЦ. По литературным данным предельная степень очистки соответствует этому отношению в пределах около o,i2 - о,15. Соотношение пиков поглощения препарата РЦ:

а280/а800=1'15-1'25 и а764/а802/а865=1'0/2'3/1'0; ЭТ0 Г0В0РИТ

о том, что оптические характеристики препарата РЦ соответствуют наиболее чистым препаратам РЦ, известным в мировой литерту-ре. Максимум флуоресценции восстновленных РЦ сдвинут на ю нм в крсную область спектра по отношению к препарату интактных ХФ. Это означает, что Стоксовский сдвиг для Р87о вдвое больше, чем для Бхл а ССА. Кроме того, спектр флуоресценции РЦ заметно шире, чем ХФ. На рисунке II показаны кинетики затухания флуоресценции для РЦ при 9Ю нм после возбуждения пикосекундными лазерными импульсами около soo нм. Затухание, по-видимому, не-зкспоненциально и хорошо апроксимируется двумя компонентами: короткоживущий компонент с временем жизни r1=6ii пксек и дол-гоживущий компонент с т2=эо±ю пксек; их относительные амплитуды равны А1:А2=з,5:1. Измерения с различными препаратами, при возбуждении в различные полосы: 365 нм (полоса Соре), 7бо нм (БФ РЦ) и soo нм (Р800) с изменяющейся интенсивностью возбуждения от ю8 до ю11 фотонов/см2 в импульсе в присутствии и в отсутствии Na2s2o4, показали, что разброс значений тх находится в пределах 7±2 пксек. Время жизни долгоживущего компонента v2 варьирует в этих условиях от эо до 240 пксек. Короткоживущий компонент наблюдался только при х>820 нм с максимумом около 9ю нм и его спектр заметно не зависел от длины волны возбуждающего света. Величина тх была постоянна в пределах ошибки эксперимента во всем измеряемом спектральном диапазоне 820-970 нм. Эти харктерные особенности, а также спектральную зависимость х2 можно видеть из спектрохронограммы излучения флуоресценции восстановленных РЦ, показанной на рис. 12. Из этого следует, что при этих условиях долгоживущая флуоресценция гетерогенна. Когда температура уменьшается до 77 К, амплитуда короткоживущего компонента уменьшается, но время жизни

Tim?, ps

Рис. II. (А) Кинетики затухания флуоресценции при комнатной температуре препаратов РЦ R.rubrum при 910 нм в присутствии I0~3M Na2S204. (В) Кинетики затухания флуоресценции при\ температуре 77° К препаратов РЦ R.rubrum при 910 нм в присутствии I0~3M Na2S204- Возбуждение 800-нм пикосекундными световыми импульсами. Аппаратная функция с полной шириной на полувысоте равной 17 пксек показана слева внизу.

Рис. 12. Спектрохронограмма флуоресценции препарата РЦ

.rubrum при комнатной температуре в присутствии 10 -J М a2S2°4" ПикосвкУнДное возбуждение при 760 нм. Спектральная ирина щели монохроматора 1,6 нм.

остается равным 6ti пксек, т.е. такое же как при комнатной температуре (рис.Пв), тогда как х2 падает до 70 пксек.

Полученные данные важны потому, что относятся к фотохимически активному р870, который является источником пикосекунд-ного компонента флуоресценции, и эта флуоресценция излучается во временном интервале между поглощением света и образованием промежуточного состояния радикальной пары [р+87о г~]. Необходимо отметить хорошее совпадение между нашими флуоресцентными и последними пикосекундными абсорбционными данными. Вторым важным фактом является то, что непосредственно измеренное время первичного разделения зарядов было тем же при комнатной температуре и при 77К, что находится в полном соответствии с независимостью от температуры квантового выхода фотоокисления Р870. Долгоживущий компонент флуоресценции с временем жизни Ю0-200 псек является гетерогенным, и наблюдается даже в наиболее чистых препаратах. Принимая во внимание, что долгоживущий компонент наблюдается также при условиях, когда все фотохимически активные Р87о фотоокисленны, можно заключить, что он принадлежит или фотохимически неактивному р870 или следовым количествам антенного бактериохлорофилла, или обоим вместе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты приводят к однозначному выводу, что структурно-функциональная организация фотосинтезирующего аппарата фототрофных бактерий тесно связана и взаимозависима с состоянием экосистемы, может отражать изменения в этом состоянии и служить интегральным биологическим индикатором состояния экосистемы. Структура основной ССА фотосинтезирующего аппарата зеленых бактерийво многом определяется физико-химическими параметрами окружающей среды (освещенность, температура, рН, химический состав) и имеет широкий диапазон изменения. Эффективность функционирования молекулярных механизмов фотосинтеза (в частности, время переноса энергии по ССА к РЦ, время разделения зарядов в РЦ, квантовый выход преобразования энергии света в электрохимическую энергию в РЦ в значительной степени зави-

сит от состояния внешней среда. Существует тесная взаимосвязь между структурой ССА зеленых бактерий и выполняемой ею функцией по переносу энергии возбуждения. Молекулы Бхл с основной ССА зеленых бактерий ориентированы почти идеально так, чтобы наилучшим образом обеспечить выполнение своей функции по максимально быстрому (20-60 пксек) и высокоэффективному (более 97%) переносу поглощенной ими энергии света на минорную ССА и далее на рц. Наиболее сложный, и в то же время наиболее важный (после термоядерной реакции синтеза гелия на Солнце) из всех природных механизмов - молекуляный механизм преобразования энергии света в электрохимическую энергию в фотохимических РЦ фототрофных бактерий, создан природой таким образом, что скорость (б ± i пксек) и эффективность (более 98%) преобразования энергии крайне высоки и в настоящее время не достижимы ни в одном техническом устройстве. Так что изучение фотосинтезирую-щего аппарата фототрофных бактерий крайне важно для построения исскуственных моделей ССА и преобразователей энергии. Кроме того, фототрофные организмы по своему положению в любой экосистеме являются первым и самым чувствительным звеном пищевой цепи и основным источником биомассы, энергии и кислорода для всех других организмов. И структурно-функциональная организация фотосинтезирующего аппарата фототрофных организмов может служить наиболее адекватный интегральным биологическим индикатором оценки состояния экосистемы. Фотосинтезирующий аппарат фототрофных бактерий обладает важным преимуществом, позволяющим следить за его состоянием с помощью спектральных методом неразрущающего контроля. Фотосинтетические пигменты обладают большим коэффициентом экстинкции (порядка IО5), что позволяет легко и большой чувствительностью контролировать их состояние с помощью абсорбционной и флуоресцентной спектрометрии, не нарушая состояние самих живых объектов, то есть in vivo и "ин-тактно". Вместе с тем, изменение структуры фотосинтезирующего аппарата под влиянием изменений окружающей среды легко контролируется по их спектрам. В частности, если разрушающее воздействие на (Joтосинтетиков выходит за пределы адаптационных воз-

можностей, происходит постепенная феофитинизация бактериохло-рофиллов (то есть отщепление мд2+ от порфиринового кольца). Этот процесс пропорционален интенсивности и продолжительности воздействия легко наблюдаем спектрально, как абсорбционными, так и еще лучше флуоресцентными методами, и может служить условной шкалой такого воздействия.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1.Разработан комплексный системный подход к оценке состояния окружающей среды по состоянию фотосинтезирующего аппарата фототрофных бактерий. Обоснована общая методология такого подхода и предложены методы его реализации.

2.Впервые на основной свегособирающей антенне зеленых бактерий обнаружено, что векторы дипольных моментов молекул бактериохлорофилла с ориентированы почти идеально вдоль длинной оси хлоросом. Qy-переходы молекул бактериохлорофилла с ориентированы параллельно друг другу и плоскости мембраны. Угол между длинной осью хлоросом и дипольными моментами Оу-переходов молекул бактериохлорофилла с равен 0° + 7°.

3.Разработан универсальный фазово-флуорометрический метод измерения времени жизни флуоресценции фотосинтезирующих пигментов in vivo в пикосекундном диапазоне. Определено время переноса энергии от основной светособирающей антенны зеленых бактерий к минорной - перенос энергии от бактериохлорофилла с к бактериохлорофиллу а происходит за 20-60 пксек с эффективностью большей 97%.

4.Обнаружены характерные особенности изменения спектров поглощения зеленых бактерий в процессе роста, по которым можно оценить стадию роста культуры бактерий. Эта характеристика имеет практическое значение при проведении оценки окружающей среды по состоянию биологических интегральных индикаторов.

5.Показана значительная вариабельность основной полосы поглощения Бхл с светособирающей антенны зеленых бактерий в зависимости от состояния окружающей среды. Это дает возможность по спектрам поглощения зеленых бактерий оценивать состо-

таие окружающей среды.

6.Впервые проведены прямые измерения времени переноса энергии от светособирэющей антенны на активные (восстановление) реакционные центры у пурпурных бактерий методом селектив-юй пикосекундной абсорбционной спектроскопии, которое оказа-гось равным во + 15 пксек.

7.С помощью пикосекундного флуоресцентного спектрохроно-'рафа измерено время разделения зарядов в фотохимических реак-(ионных центрах пурпурных бактерий r.rubrum. Было показано, но это время равно 6 t I пксек (независимого от температуры).

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих )аботах:

А.Ю.Борисов, А.П.Разживин, С .Г.Харченко,З.Г.Фетисова, В.С.Козловский, В.И.Годик, А.С.Пискарскас, Р.В.Данелюс. Хлорофильный аппарат фотосинтезирующих организмов как преобразователь солнечной энергии. Раздел i. Выбор модельных систем и методов исследования. // Москва, ВНТИЦентр, - 1978

- n б6760673, - 64 с.

. А.Ю.Борисов, А.П.Разживин, С.Г.Харченко, В.С.Козловский, А.С.Пискарскас и Р.В.Данелюс. Хлорофильный аппарат фотосинтезирующих организмов как преобразователь солнечной энергии. Раздел 2. Оптимизация методов выделения хроматофэров и реакционных центров. // - Москва, ВНТИЦентр, - 1979,

- n Б983042, - 30 с.

. А.Ю.Борисов, С.Г.Харченко. Исследование моделей и предельного КПД первичного фотоэлектрического процесса фотосинтеза. // - Москва, ВНТИЦентр, - 1980, - n 01804б, - 29 с. . М.П.Скачков, З.М.Трухан и С.Г.Харченко. Фотоиндуцированные изменения диэлектрических фотопотерь в микроволновой области фотосинтезирующих бактерий Rhodospirillum rubrum. // Биофизика, - 1980, - т.25, - вып.з, - с.564. . А.Ю.Борисов, З.Г.Фетисова и С.Г.Харченко. Применение метода фазовой флуорометрии для измерения длительности флуоресценции в пикосекундном диапазоне. // yi Всесоюзная конференция по фотоэнергетике растений, - Львов, - 198о, Тезисы докла-

ДОВ, - С.150.

6. М.П.Скачков, Э.М.Трухан и С.Г.Харченко. Исследование микроволновых фотопотерь в хроматофорах фотосинтезирующих бактерий Rhodospirillum rubrum. // Биофизика, - 1981, - Т.26, -ВЬГП.1, - С. 69.

7. Z.G.Fetisova and S.G.Kharchenko. New complex method of picosecond-time scale measurement of fluorescence lifetimi with phase fluorometer and its application to determinatioi of excitation transfer rates in photosynthetic pigment antenna. // IY International Seminar on Energy Transfer ii Condensed Matter, - Czechoslovakia, - Prague, - 1981, Abstracts, - p.42.

8. Z.G.Fetisova and S.G.Kharchenko. New complex method of picosecond-time measurement of fluorescence lifetime witl phase fluorometer and its application to determination o] excitation transfer rates in photosynthetic pigment antenna. // IY International Seminar on Energy Transfer in Condensed Matter, - Czechoslovakia, - Prague, - 1981, Proceedings, - p.132.

9. А.Ю.Борисов и С.Г.Харченко. Исследование моделей фотохимических реакционных центров. //Москва, ВНТИЦентр, - i98i,

- N 027176, - 26 С.

ю. А.Ю.Борисов, Р.А.Гадонас, Р.В.Данелюс, А.С.Пискарскас, А.П.Разживин и С.Г.Харченко. Исследование переноса и деградации энергии возбужденных состояний в светособирающе1 антенне хроматофоров пурпурной бактерии Rhodospiriiiui rubrum методом селективной пикосекундной спектроскопии // Доклады Академии Наук СССР, - 1982, - т.264, - n 4,

- С.980.

11. А.Ю.Борисов, Р.А.Гадонас, Р.В.Данелюс, А.С.Пискарскас А.П.Разживин, Р.И.Ротомскис и С.Г.Харченко. Дезактивацю возбуждений в хроматофорах пурпурных бактерий при разны; состояниях реакционных центров. // i Всесоюзный биофизический съезд, - Москва, - 1982, Тезисы докладов, - т.1,

- С.301.

l2. А.Ю.Борисов, Р.А.Гадонас, Р.В.Данелюс, В.С.Козловский,

A.С.Пискарскас, А.П.Разживин и С.Г.Харченко. Перенос энергии возбуждения из светособирающей антенны на реакционный центр в хроматофорах Rhodospiriiium rubrum по данным селективной покосекундной спектроскопии. // Доклады Академии Наук СССР, - 1982, - т.266, - N 2, - с.482.

.з. А.П.Разживин, В-И.Сидельников и С.Г.Харченко. Измерение 4,6 и 12-й производных спектров поглощения реакционных центров И хроматофоров ИЗ Rhodospiriiium rubrum. // Биофизика,,- 1984, - Т.29, - ВЫП.6, - С.959.

4. A.P.Razjivin, V.I.Sidelnikov and S.G.Kharchenko. Stady of the structure of Rhodospiriiium rubrum chromatophore absorption spectra by the derivative spectrophotometry. // Studia Biophysica (DDR),- 1984,- V.102,- N 2, - p.153.

5. З.Г.Фетисова, С.Г.Харченко, Ю.Н.Благовещенский и А.Ю.Борисов. Комплексный метод измерения времени жизни флуоресценции в пикосекундном диапазоне с помощью фазового флуороме-тра и его применение для определения скорости переноса энергии возбуждения в светособирающей пигментной антенне зеленых бактерий. // Вестник Московского Университета,

- сер.16, БИОЛОГИЯ, - 1984, - N 4, - с.56.

5. С.Г.Харченко и И.Ф.Бухова. Об изменении спектральных характеристик полосы поглощения основной светособирающей пигментной антенны зеленых серных бактерий при изменении культуральных условий. // Всесоюзная конференция "Контроль и управление биотехнологическими процессами", - Гог. "

- 1985, Сб. докладов, - с.197.

B.И.Сидельников и С.Г.Харченко. Применение метода производной спектрофотометрии для анализа спектральной гетерогенности спектров поглощения зеленых бактерий. // Всесоюзная конференция "Контроль и управление биотехнологическими процессами",- Горький,- 1985, Сб. докладов,- c.i98.

. С.Г.Харченко и З.Г.Фетисова. Ориентация векторов переходных моментов бактериохлорофиллов светособирающей суперантенны зеленых бактерий. // iv Всесоюзная межуниверситетс-

кая конференция "Биология клетки", - Тбилиси, - 1985, Сб. докладов, - часть 2, - с.725.

19. A.M.Freiberg, V.I.Godic, S.G.Kharchenkо, K.Timpinann, A.Yu.Borisov and K.K.Rebane. Picosecond fluorescence of reaction centers from Rhodospirillum rubrum. // FEBS Letters, - 1985, - V.189, - N 2, - p.341.

20. A.M.Freiberg, V.I.Godic, S.G.Kharchenko, K.Timpmann. Eci-tation energy transformation in bacterial photosynthesis by picosecond fluorescence of intact cells and isolated reaction centers. // V International Seminar on Energy Transfer in Condensed Matter, - Czechoslovakia, - Prague,

- 1985, Proceedings, - p.211.

21. R.Paliwal, S.G.Kharchenko, A.Yu.Borisov. Comparative effe-ciency of primary light conversion in photosynthetic bacteria Rhodospirillum rubrum and Rhodopseudomonas viridis. // Indian Journal of Biochemistry and Biophysics, - 1985,

- v.22, - p. 364.

22. Z.G.Fetisova and S.G.Kharchenko. Storage of light energy in primary steps of photosynthesis in green bacteria: structure-function relationships. // XI IUPAC Symposium on photochemistry, - Lisboa, - Portugal, - 1986, Proceedings,

- 2P-10.

23. Z.G.Fetisova, S.G.Kharchenko and I.A.Abdourakhmanov. Strong orientational ordering of the near-infrared transition moment vectors of light-harvesting antenna bacterio-viridin in chromatophores of the green photosynthetic bacterium Chlorobium limicola. // VII International Congress on Photosynthesis, - USA, - 1986, Poster Abstracts,

- p.105-098.

24. Z.G.Fetisova, S.G.Kharchenko and I.A.Abdourakhmanov. Strong orientational ordering of the near-infrared transition moment vectors of light-harvesting antenna bacterio-viridin in chromatophores of the green photosynthetic bacterium Chlorobium limicola. // FEBS Letters, - 1986, -V.199, - N 2, - p.234.

25. С.Г.Харченко и В.И.Сидельников. Анализ гетерогенности све-тособирамцей антенны зеленых бактерий методом производной спектрофотометрии. // i Всесоюзная конференция "Современные "Современные проблемы биохимии и физико-химической биологии", Сб. докладов, М. - 1986, - часть 2, - с.1бб.

26. С.Г.Харченко, И.А.Абдурахманов и З.Г.Фетисова. Анализ спектров линейного дихроизма хромагофоров зеленых бактерий, ориентированных в полиакриламидном геле. // Доклады Академии Наук СССР, - 1987, - т.гэз, - N 5, - с.1259.

2?. Z.G.Fetisova, S.G.Kharchenko and I.A.Abdourakhmanov. Strong orientational ordering of the near-infrared transition moment vectors of light-harvesting antenna bacterio-viridin in chromatophores of the green photosynthetic bacterium Chlorobium liraicola. // Progress in Photosynthesis Research, Biggins, J.(ed), Martinnus Nijhoff Publishers, Dordrecht, - The Netherlands, - 1987, - vol.1, - p.415.

28. С.Г.Харченко и Л.П.Родикова. Цитологическое изучение структуры фотосинтезирующего аппарата зеленых бактерий. // Всесоюзная конференция "Преобразование световой энергии в фотосинтезирующх системах и их моделях", - Пущино,

- 1989, Сб. докладов, - с.141.

29. S.G.Kharchenko and L.P.Rodicova. Cytological studies of green bacteria photosynthetic apparatus structure. // VIII International Congress on Photosynthesis, - Sweden, -Stockholm, 1989, Physiologia Plantarum, 1989, v.16, Fasc. 3, Part 2, A 68, p.341.

30. Харченко С.Г. Характерные особенности изменений спектров поглощения клеток фототрофных бактерий как показатель стадии развития культуры бактерий. // Докл. АН СССР, - 1991,

- Т.320, - N4, - С.1003.

31. Харченко С.Г. Особенности изменения спектра поглощения клеток фототрофных бактерий как показатель стадии развития культуры бактерий. // Сб. докл. Мездународн. конф. "Фотосинтез и фотобиотехнология", 16-23 июня 1991 г.,

- Пущино, - с.121.

32. Харченко С.Г. Оценка эффективности преобразования световой энергии в электрохимическую реакционными центрами пурпурных бактерий. // Труды и Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", 22-28 сентября 1991 г., - Самарканд, - с.204.

33. Харченко С.Г. Характерные особенности изменений спектров поглощения фототрофных зеленых бактерий как показатель стадии роста культуры. // Микробиология, - 1992, - т.61,

- ВЫП.З, - С.438.

34. Kharchenko S.G. Characteric features of transformations of green bacteria as an index of bacteria culture state. // IX International Congress on Photosynthesis, - Nagoya,

- Japan, August 30 - September 4, Photosynthesis Research,

- 1992, - vol.34, - No.1, - p.115.

35. Харченко С.Г. Структурно-функциональная организация фотосинтетического аппарата зеленых бактерий. // Тез. докл. Международной конференции стран СНГ "Структурно-функциональная организация фотосинтетических мембран и их моделей", 8-11 ИЮНЯ 1993 Г., - Пущино.

36. Харченко С.Г., Егорова Т.А. Состояние пигментного аппарата фотосинтезирующих микроорганизмов как отражение состояния популяции. // Тез. докл. Международной конференции стран СНГ "Структурно-функциональная организация фотосинтетических мембран и их моделей", 8-и июня 1993 г.,- Пущино.

37. S.G.Kharchenko. Intrachlorosome element structure model. // International Conference "Modelling of primary stages of photosynthesis", October 4-8, - 1993, - Pushchino,

- Russia, Proceedings, - p.10.

38. Харченко С.Г. Анализ экологического риска в решении проблем экологии города. - Международная конференция "Экология города", и-13 апреля 1994 г., - Москва. Сб. докладов,

- С.7.

39. Kharchenko S.G. General problems of ecological risk analysis. // EERO Symposium on chemical risk assessment. New scientific approaches and oppotunities.

0. Kharchenko S.G., Lutsky. Assessment of the environment region state. // EERO Symposium on chemical risk assessment. New scientific approaches and oppotunities.

1. Lutsky J.M., Kharchenko S.G. Assessment of man health state. // EERO Symposium on chemical risk assessment. New scientific approaches and oppotunities.

Ц - фотохимический реакционный центр СА - молекулярная светособирающая антенна хл - Оактериохлорофилл лс - хлоросома

Ж - хлоросомо-мембранный комплекс I - хроматофэры

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ:

Информация о работе

Харченко, Сергей Григорьевич
доктора физико-математических наук
Москва, 1995
ВАК 03.00.02

Автореферат

Структурно-функциональная организация фотосинтезирующего аппарата фототрофных микроорганизмов как показатель состояния окружающей среды - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы