Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация фермент-субстратного комплекса сайт-специфичной рекомбинации FLP с дрожжами S.CEREVISIAЕ

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация фермент-субстратного комплекса сайт-специфичной рекомбинации FLP с дрожжами S.CEREVISIAЕ"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

На правах рукопису

УДК 577.151.02 577.151.36 577.151.45

ВОЗІЯНОВ Юрій Анатолійович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНА ОРГАНІЗАЦІЯ ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНОГО КОМПЛЕКСУ САЙТ-СПЕЦИФІЧНОЇ РЕКОМБІНАЗИ РЬР З ДРІЖДЖІВ З.СЕІІЕУШАЕ

(03.00.03 - молекулярна біологія)

РГВ од

І 5 ДЕН 1996

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ -1996

Робота виконана в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України та на кафедрі Мікробіології Університету штату Техас, США

доктор біологічних наук

О.І. Корнелюк та професор М. Джайарам

доктор біологічних наук, професор С.М. Храпунов та кандидат біологічних наук

О.І. Черепенко

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України

ф Є? /<р-£г

Захист відбудеться "/у " 1996 р. на засіданні

Спеціалізованної вченої ради Д 016.11.01 з захисту докторських дисертацій в Інституті молекулярної біології і генетики НАН України за адресою 252143, Київ, вул. Академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Автореферат розісланий "/? 1995 р.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук

Л.Л. Лукаи

Наукові керівники:

Офіційні опоненти:

Провідна установа:

АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОБЛЕМИ. Сайт-спєцифічна рекомбінація залучена до таких процесів, як інтеграція і ексцизія лізогених бактеріофагів, транспозиції, інверсії контролюючих елементів генної активності, переключення типів спарювання, перебудови між генами варіабельних і константних ділянок імуноглобулинів. Вивчення процесу сайт-специфічної рекомбінації на різних модельних системах дозволяє підійти до розуміння природних процесів спрямованих змін геному.

2-мкм плазміда з S.cerevisiae кодує систему сайт-специфічної рекомбінації, яка складається з білку Flp, каталізуючого інверсії однієї ділянки плазміди відносно іншої по механізму "flip-flop", і двох інвертованих рекомбінаційних сайтів на плазміді. Ця рекомбінаційна система залучена до процесу ампліфікації 2-мкм плазміди у клітинах дріжджів.. Механізм ампліфікації 2-мкм плазміди на цей час є моделлю механізму генної ампліфикації.

Дисертаційне дослідження присвячене вивченню початкових етапів сайт-специфічної рекомбінації, яка каталізується білком Flp

- зв'язуванню білку Flp з ділянкою рекомбінації і наступному розрізуванню ДНК.

Процес зв'язування білку Flp з ділянкою рекомбінації передбачає встановлення специфічних точкових контактів з визначеною послідовністю ДНК. Для розуміння цього процесу необхідно вивчення контактів білку з ДНК, яке стимулюється ще й тим, що білок Flp мас щонайменш два ДНК-зв'язуючих домени, причому, в первинній структурі білку Flp не знайдено гомології з жодним з відомих ДНК-зв’язуючих мотивів (Panigrahi & Sadowski, 1994). Раніше методом "відбитків" було досліджено ряд потенційних ДНК-білкових контактів в ділянці Flp-рекомбінації (Bruckner & Сох, 1986: Panigrahi & Sadowski, 1992). В нинішній роботі досліджені деякі потенційні точкові контакти білку Flp з

ДНК в малому і великому жолобку з використанням аналогів канонічних основ, з якими неможливо утворення ряду специфічних ДНК-білкових контактів. Результати дослідження дозволяють розширити уявлення про процес зв'язування білку Fip з ДНК.

Білок Flp, зв’язуючись з ділянкою рекомбінації, згинає її, причому вугол вигину становить більш ніж 140 градусів, і ного центр розташован у центрі спсйсерної послідовності ділянки рекомбінації (Schwarts & Sadowski, 1990). В дисертації проведено теоретичний аналіз первинної послідовності ділянки Flp-рекомбінації, який свідчить, що про ймовірну схильність ділянки рекомбінації до згинання, зумовленого зв'язуванням з білком, і, можливо, до протікання перших ферментативних етапів рекомбінації - розрізуванню ДНК і/або переносу ланцюгу.

Зв'язування білку Flp з ділянкою рекомбінації приводить до першого каталітичного етапу рекомбінації - розрізуванню ДНК. Результати проведених в дисертації експериментів по вивченню реакції розрізування свідчить про те, що розрізування ДНК білком Flp відбувається до утворення рекомбінаційно-компетентного синаптичного комплексу (комплексу між двома ділянками рекомбінації із зв'язаними з ними молекулами ферменту) і підгримує ідею про достатність зв'язування димеру білку Flp з однією ділянкою рекомбінації для ініціації розрізування ДНК.

МЕТА ТА ЗАВДАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ. Метою роботи було вивчення характеру зв'язування білку Flp з ділянкою Flp-реком-бінації, а також вивчення першого каталітичного егапу рекомбінації - розрізування ДНК білком Flp.

Виходячи з мети робота в ході її виконання були поставлені такі завдання:

1. Розробити методику оцінки ступеня спорідненності різних ДНК-субстратів до білку Flp за допомогою фрагментів ДНК, що

містять один. БІр-зв'язуючий елемент ДНК і спейсерну послідовність (т.з. "половинних" сайтів рекомбіназ).

2. Провести мутаційний аналіз БІр-зв'язуючого елементу ДНК з використанням аналогів основ, з якими неможливо утворення ряду специфічних, водневих зв'язків, а саме: 7-деазагуаніну та інозину замість гуаніну, 7-деазааденіну замість аденіну та 4-0-метилтиміну замість тиміну.

3. Провести аналіз первинної послідовності ділянки Рір-рекомбінації, а саме розподілу "вигиноутворюючих" динуклео-тидів та олігонуклеотидів з відомими конформаційними властивостями.

4. Розробити методи аналізу структурної організації фермент-субстратного комплексу білку Рір з ділянкою рекомбінації на етапі розрізування ДНК. '

5. Провести одночасний моніторинг утворення продуктів реакцій розрізування ДНК білком РІр та рекомбінації в цілому в різних умовах.

НАУКОВА НОВИЗНА РОБОТИ. 1. Вперше показано, шо розрізування білком РІр ДНК відбувається до утворення сипап-тичного комплексу, і для розрізу ДНК достатньо утворення комплексу між димером білку Р!р та однією ділянкою рекомбінації. -

2. Виявлено, що при надоптимальному молярному співвідношенні білку РІр до Рір-зв'язуючого елементу ДНК блокується утворення продуктів рекомбінації, але це блокування не пережкоджає розрізуванню ДНК білком РІр.

3. Виявлено, що білок РІр утворює з Рір-зв'язуючнм елементом ДНК множинні контакти різного ступеню "критичності" для зв'язування.

4. Виявлено, що білок Flp утворює ДНК-білкові контакти одночасно в великому та малому жолобках подвійної спіралі ДНК щонайменьш з п'ятгю основами Flp-зв'язуючого елементу ДНК, причому білок Flp має контакти з Flp-зв'язуючим елементом ДНК в малому жолобку з обох боків подвійної спіралі.

5. Виявлено, що в ділянці Flp-рекомбінації існує схильність до згинання, зумовленого зв'язуванням з білком Flp.

6. Запропоновані І впроваджені методи розведення і блокування утворення рекомбінаційно-компетентного сннаптичного комплексу білку Flp з ділянками рекомбінації за допомогою рекомбнацій-но-неактивного аналогу субстрату білку Fip для вивчення реакцій розрізування ДНК і рекомбінації в цілому.

.7. Запропонована та впроваджена методика використання "половинних” сайтів рекомбіназ і аналогів основ для вивчення точкових контактів Сілку Flp з ДНК.

8. Запропоновано модель ранніх етапів Flp-рекомбінації та робочу модель ділянки Flp-рекомбінації, зв'язаної з білком Flp.

ПРАКТИЧНА ЦІННІСТЬ РОБОТИ. Запропоновані в роботі методи аналізу білково-нуклеїнових контактів та організації фер-мент-субстратного комплексу можуть бути рекомендовані для дослідження інших моделей сайт-специфічної рекомбінації, а також при дослідженні структурно-функціональної організації різних ДНК-білкових комплексів.

АПРОБАЦІЯ РОБОТИ. Матеріали роботи доповідалися на конференціях Austin Spring Meeting (Austin, США, 1994) та Workshop on Site-Spscjfic Recombination and Transposition (Woodshole, США, 1994).

РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. ВИВЧЕННЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ БІЛКУ FLP З ДІЛЯНКОЮ РЕКОМБІНАЦІЇ

1.2. Мутаційний аналіз Flp-зв’язуючого елементу ДНК з використанням аналогів основ.

Процес зв'язування білку Flp з ділянкою рекомбінації (рнс.І) передбачає встановлення специфічних точкових контактів з визначеною послідовністю ДНК. Для розуміння цього процесу необхідно вивчення контактів білку з ДНК. Раніше методом "відбитків" було досліджено ряд потенційних ДНК-білкових контактів в ділянці Flp-рекомбінації (Bruckner & Сох, 1986; Panigrahi & Sadowski, 1992).

В нинішній роботі досліджені деякі потенційні точкові контакти білку Flp з ДНК в малому і великому жолобках з використанням аналогів канонічних основ, з якими неможливо утворення ряду специфічних ДНК-білкових контактів. Для цього в роботі було розроблено методику оцінки ступеня спорідненності різних ДНК-субстратів до 6ûiKyFIp за допомогою фрагментів ДНК, іцо містять один Flp-зв'язуючий елемент ДНК та спейсерну послідовність (т.з. "половинних" сайтів рекомбіназ). Методика включає дослідження відносної реакційної здатності "половинних" сайтів рекомбіназ, які мали в Flp-зв'язуючому елементі ДНК замість канонічних основ їх аналоги, в реакції переносу ланцюгу (Serre et al.,1992; Sax-ena et al. ,1994). Реакція переносу ланцюгу в "половинних" сайтах включає розрізування ланцюгу ДНК з супутнім ковалентним приєднуванням білку Flp до ДНК, і з'єднання ланцюгу шляхом переносу фосфатної групи на 5-ОН групу, якою закінчується спейсерна послідовність (рис.2). Базуючись на даних попередніх, робіт про кореляцію ефективності реакції рекомбінації із зв'язуванням белку Flp з мутантними ділянками рекомбінації, в яких

імія-ліяч"»гац'|г ■ -■ ^і«-.ііііяідгя«т|яя?ттаняі

12 о.о. 8 и.о. t 12 и.о. 12 и.о.

Рис. 1. Ділянка рекомбінації білку Flp. Ділянка рекомбінації складається з трьох Flp-зв'язуючих елементів (1а, Га і ГЬ). Між елементами 1а і Га - спейсерна послідовність. 1 - місця розрізу ДНК білком Flp.

--------ч-р-ТТТ +Пр ■—-—■■*-p;Q-Y/Flp -pip — . і Т 0 т Д .

.... AAAGATCT-OH ~ІТП ------AAAGATCT-QH *------------.д д G

Рис.2. Утворення продукту реакції переносу ланцюгу в "половинному" сайті. => - Flp-зв'язуючий елемент ДНК. Р - фосфатна група. Y - тирозин активного центру білку Flp.

було замінено кожну пару основ в Flp-зв'язуючому елементі ДНК на три можливі пари основ (Senecoff et al., 1988), а також на тому, що каталітичні амінокислотні залишки білку Flp не приймають участі у зв'язуванні з основами Flp-зв'язуючого елементу ДНК (Parsons et al., 1990), вимірювання реакційної здатності "половинних" сайтів розглядалося в роботі як задовільна міра зв'язування "половинних’' сайтів білком Flp. ,

В роботі було використано такі аналоги канонічних основ ДНК, які перешкоджають утворенню потенційних водневих зв'язків між білком і деякими атомами/групами атомів основ ДНК в великому або малому жолобках: 7-деазагуанін і інозин замість гуаніну, 7-деазааденін замість аденіну, 4-О-метилтимін замість тиміну. "Половинні" сайти містили аналоги основ тільки в одному з двох ланцюгів (один аналог основи на один "половинний" сайт). Всього було використано 24 мутантних "половинних" сайти.

Результати експериментів наведені у табл. 1. Чисельні значення в таблиці показують у скільки разів зменшується реакційна здат-

Табл. 1. Реакційна здатність "половинних" сайтів, що містять аналоги основ.

І А2 АЗ , Т4 А5 СИ 07 А8 А9 СЮ ТІЇ Т12

700 7.1 1.3 2.5 2.2

7РА .1.3 1.7 6.7 1 2.4 1 1.3 2.0

І 1 1 20 1

40МеТ 62 4.0 3.9 25 4.1 3.9 4.0 4.1

Зверху показано послідовність Рір-зв'язуючого елементу ДНК. і -місце розрізу ДНК білком Бір. 700 - реакційна здатність "половинних" сайтів, що містять 7-деазагуанін; ТО А - 7-деаза-аденін; І- інозин; 40МеТ - 4-0 - метилтимін. Діапазон коливань значень -10-20% від указаних у таблиці величин.

ві А2 АЗ Т4 , А5 С6 в? А8 А9 СЮ Т11 ТІ2

□

□ □□

_ __А__ ___ Т4

□

великий

жолобок

С Т Т А Т С С

А2 АЗ Т4 А5 06 07 А6 А9 СЮ Т11 Т12

□ □□

□□□□□□□□□

”

N

.

малий

жолобок

Рис.З. Розподіл контактів білку РІр с основами Рір-зв'язуючого елементу ДНК у великому (А) і малому (Б) жолобках ДНК. "І'Г -N7- и N3- атоми аденіну і гуаніну; "М-Г - ГШ2-група гуаніну; "О" - 04-атоми тимина.

N

N

N

МИ

ність мутантних "половинних" сайтів порівняно з реакційною здатністю "половинного" сайгу, який містив тільки канонічні основи (активність якого прийнята за 1), тобто І - відсутність афекту, 20 - 20-ти кратне зниження активності.

Виявлені суттєві ефекти замін тиміну на 4-О-метилтимін у всіх АТ-парах РІр-зв'язуючого елементу ДНК в роботі були інтерпретовані з відомою обережністю, тому що наявність тільки одного з двох водневих зв'язків в парі 40МеТ-А, а також послаблення цього зв’язку внаслідок метилювання атому кисню в положенні 4 тиміну може викликати деформації локальної структури ДНК. Але, значне зниження реакційної здатності "половинних" сайтів, що містили 4-О-метилтимін в позиціях 2 і 5 РІр-зв'язуючого елементу ДНК порівняно з таким в позиціях 3, 4, 8, 9, П и 12 Рір-зв'язую-чого елементу ДНК, на нашу думку, свідчить на користь можливих контактів білку Рір з атомами кисню в цих позиціях. Після введення поправочних коефіцієнтів в подальшому аналізі використовувались такі значення для зниження реакційної здатності "половинних" сайтів, що містили 4-О-метилтимін в позиціях 2 и 5 РІр-зв'язуючого елементу ДНК - 5.2 и 2.1 разу, відповідно.

В роботі ідентифіковано ряд потенційних ДНК-білкових контактів, не виявлених в попередніх роботах (рис.З): Ю-атоми аденіну в позиціях 2, 3,4, 8, 11 і 12, 04-атоми тиміну в позиціях 2 та 5 і ї4Н2-групу гуаніну в позиції 7 РІр-зв'язуючого елементу ДНК.

Проведений в роботі аналіз отриманих даних про розподіл контактів в Рір-зв'язуючому елементі ДНК показав, що:

- потенційні контакти розподілені по всьому РІр-зв'язуючому елементу ДНК як у великому, так і в малому жолобках ДНК. Контакти білку з Рір-зв'язуючим елементом ДНК в малому жолобку розташовані з протилежних боків подвійної спіралі ДНК, і, ймовірно, білок РІр як би обплітає ДНК;

- щонайменш з п'ятпо парами основ Flp-зв'язуючого елементу ДНК білок Flp має контакти як у великому, так і в малому жолобках ДНК. Це може мати значення для підвищення специфічності зв'язування білку з ДНК, а також може відображати особливості динаміки зв'язування різних доменів білку Flp з Flp-зв'язуючим елементом ДНК (від'ємна кооперативність зв'язування для пар AT у позиціях 2, 3, 5 і 11 Flp-зв'язуючого елементу ДНК та позитивна кооперативність зв'язування для пари GC в позиції 7 Flp-зв'язуючого елементу ДНК);

- не всі потенційні контакти мають однакове значення для зв'язування білку Flp з ДНК. Контакти були поділені на три групи -найменш та найбільш "критичні" контакти, а також контакти проміжної "критичності". Найбільш "критичні" контакти з Flp-зв’язуючим елементом ДНК білок Flp утворює, в основному, в першій половині Flp-зв'язуючого елементу ДНК, біля фосфо-діефірного зв'язку, який розрізується білком Flp. "Найкритичний" з виявлених контактів - з аміногрупою гуаніну пари GC - розташований в позиції 7 Flp-зв’язуючого елементу ДНК. В роботі припущено, що найменш "критичні" контакти використовуються білком Flp в первинному скринінгу FIp-зв'язуючих елементів ДНК. При оптимальному зв'язуванні контакти цієї групи можуть сприяти "запуску" конформаційних змін білку Flp, що приводять до послідовного процесу міцного специфічного зв'язування білку з ділянкою Flp-рекомбінації через найбільш "критичні" контакти та контакти проміжної "критичності".

Результати роботи погоджуються з точкою зору на процес специфічного зв'язування білку Flp з ДНК як на процес встановлення послідовних серій слабких контактів з індивідуальними парами основ ДНК (Kimball et al., 1995). Такий спосіб зв'язування

може бути загальним правилом для ДНК-зв'язучих білків, що впізнають довгі ділянки ДНК.

1.2. Теоретичний аналіз спроможності ділянки Flp-рекомбінації до згинання.

Зв'язуючись з ділянкою рекомбінації, білок FIp його різко згинає, причому вугол вигину становить більш ніж 140°, а його центр розташований у центрі спейсерної послідовності ділянки рекомбінації (Schwarts & Sadowski, 1990). Якщо припустити, що первинна структура ділянки Flp-рекомбінації оптимізована в ході еволюції, досить природно виникає питання - чи існує в ділянці рекомбінації схильність до згинання? Така схильність змогла б полегшити сам процес згинання. Схильність деяких фрагментів ДНК, що зв'язуються з білками, до згинання, що викликається зв'язуванням, було виявлено у ряді робот ( Travers, 1989).

Для виявлення суттєвих особливостей первинної структури ділянки Flp-рекомбінації в роботі проведено порівняльний аналіз розподілу "вигиноутворюючих" динуклеотидів (Barber et al.,1990) в ділянці Flp-рекомбінації з таким в ділянках рекомбінації деяких інших рекомбіназ інтегразної родини (рис.4). Динуклеотиди, що мають тенденцію до вигину у бік великого жолобку ДНК (major-philic dimers) (ТА, CG, CA/TG, GG/CC), позначені на рисунку символом '+'; у бік малого жолобку (minor-philic dimers) (AT, АА/ТТ, GT/AC) - а ті, що не мають виразної тенденції до вигину - 'о'. В ділянках рекомбінації можливо виділити чотири симетрично розташованих блоки по три нуклеотида (два динуклеотиди з одним спільним нуклеотидом), що мають тенденцію до вигину у бік малого жолобку ДНК. Розташування виділених блоків динуклеотидів таке (відстань між 1-м (3-м) і 2-м (4-м) блоками становить

и

-*

GAAGTTССТАТАС TTTCTAGA GAATAGGAACTTC Flp

TTGATGAAAGAA TACGTTA ТТСТТТСАТСАА R1

TTTCATTAAGGAA TAAGTAA TTCCCTAATGAAA В2

GGTTGCTTAAGAA TAAGTAA ТТСТГААОСААСС ВЗ

АААТGGAAAGGAA TGGTTCA ТТССТТТССАТТТ МІ

ATTTGTCTGATAA TGAAGCA TTATCAGACAAAT KD1

CAGCTTT ПТАТАС TAAGTTG Int

TAACTTCGTATAA TGTATG CTATACGAAGTTA Сге

GATTGGTGCATAA TGTATA TTATGTTAAATCA ХаС

---------------------------------------tjl ". =зЬ----------------------------------------------------------

-15-14 -13-12 -11-10-9 •« -7 .-5 -4 -3 -г -1 0 1 2 3 4 5 ( 7 в 9 10 11 12 13 14 15

- + Q - + 0 - - 0 0 - - + - + - - + - - 0 0 - - 0 + - 0 + - к

- 0 + - - + - 0 + 0 - - + - 0 0 + - - - 0 + + 0 + - - + 0 - Е2

- - + с 0 - + - 0 0 - - + - 0 0 + - - - 0 □ - + - 0 0 0 - - ЕЗ

- - + + 0 - - 0 + 0 - - + + - - - + - - 0 + 0 - - 0 + + - - НІ

- - + - 0 0 + 0 - + - - + 0 - 0 0 + - - + - 0 + 0 0 - + - - К01

- - + + - + 0 + - + - - + - + - + - - + - + - - t - - - 0 ХегС

- 0 - - 0 + 0 + - + - 0 - - о о 0 0 0 0 - - + 0 + 0 - - 0 - FLP

- - 0 - 0 + - + - + - - + - + - + 0 0 + - + _ + 0 - 0 - - Сге

+ 0 0 0 - - - - + - - 0 + - 0 - - + Int

I П Ш N

Рис.4. Розподіл "вигиноутворюючих" динуклеотидів в ділянках рекомбінації деяких рекомбіназ інтегразної родкни. Зверху -ділянки рекомбінації рекомбіназ Flp (S.cerevisiae), R, (Z.rouxii), B2 (Z.bailii), B3 (Z.rouxii), Ml (Z-fermentati), KDl (K.drosophilarum), Int (фаг лямбда), Сге (фаг PI) XerC/XerD (E.coli). Показано тільки верхні ланцюги. Зннзу - розподіл "вигиноутворюючих" динуклеотидів в ділянках рекомбінації.

10 пар основ), що вигини ДН1С у бік малого жолобку у відповідних місцях можуть призвести до глобального вигину ДНК.

2-й і 3-й блоки розташовані у місцях розрізу рекомбіназами ДНК. В роботі припущено, що при вигині у бік малого жолобку виникають напруження у фосфодіефірному зв'язку 05'-Р, що розрізується рекомбіназами, і підсилення вигину динуклеотида у бік малого жолобку при зв'язуванні білку з ділянкою рекомбінації може полегшувати проходження реакції розрізування ДНК і/або наступної реакції переносу ланцюгу ДНК на відповідний сайт ділянки рекомбінації-партнеру. Присутність у 2-му і 3-му блоках в ділянці Flp-рекомбінації "нейтральних" динуклеогидів, ймовірно, відображає особливості механізму реакції розрізування білком Flp ДНК. Це припущення посередньо підтримується фактом про різну ефективність розрізування ДНК білком Flp в позиціях -4/-3 (більш ефективна реакція) і 3/4 (менш ефективна), та особливостями розрізування ділянок рекомбінації деякими іншими рекомбіназами інтегразної родини.

Спейсерна послідовність ділянки Flp-рекомбінації (TTTCTAGA) містить тетрануклеотид CTAG. Цей тетрануклеотид має особливі властивості. Аналіз кристалу олігонуклеотиду d(CTCTAGAG) (Hunter et аі.,1989) показав, що цей олігонуклео-тид має вигин у бік великого жолобку з центром в динуклеотиді ТА. Тетрануклеотид CTAG є важливою складовою частиною trp-оператора. Аналіз ко-кристалу trp-penpecopy і trp-оператору (Otwinowski et аі.,1988) також показав присутність вигину у бік великого жолобку з центром в динуклеотиді ТА тетрануклеотиду CTAG. Таким чином, можно обгрунтовано припустити, що спейсерна послідовність ділянки Flp-рекомбінації має схильність до вигину у бік великого жолобку ДНК з центром приблизно у центрі спейсерної послідовності ділянки рекомбінації.

На основ аналізу первинної послідовності ділянки Flp-рекомбі-нації в роботі запропоновано робочу модель ділянки Flp-рекомбі-нації, зв'язаної з білком Flp. Основними особливостями моделі с чотири вигини ДНК у бік малого жолобку по краях Flp-зв'язуючих елементів ДНК, і вигин у бік великого жолобку ДНК з центром у центрі спейсерної послідовності ділянки Flp-рекомбінації.

Проведений в роботі аналіз первинної послідовності ділянки Flp-рекомбінації, а також порівняння його результатів з даними роботи про мутаційний аналіз спейсерної послідовності цієї ділянки (Umlauf & Сох, 1988) дозволяє обгрунтовано припустити, що в ділянці Flp-рекомбінації існує схильність до згинання, яке викликається зв'язуванням з білком Flp, і, можливо, до протікання перших ферментативних етапів рекомбінації - розрізування ДНК-субстрату і/або переносу ланцюгу. В роботі також припущено, що білок Flp в процесі пошуку ділянки рекомбінації впізнає її не тільки шляхом встановлення з нею специфічних ДНК-білкових контактів, але й по спроможності приймати необхідну конформацію при зв'язуванні з білком Flp.

2. ВИВЧЕННЯ РЕАКЦІЇ РОЗРІЗУВАННЯ ДНК БІЛКОМ FLP

Білок Flp розрізує ДНК досить незвичайним способом - мономер білку Flp, зв'язаний з одним з Flp-зв'язуючих елементів ДНК, розрізує ДНК не біля свого місця зв'язування, а через спейсер у місці зв'язування другого мономеру на тому ж ланцюзі ДНК (Lee et al., 1994). Відкриття такого способу розрізування ставить таке питання - коли відбувається розрізування ДНК? Чи є взаємодія комплексу двох рекомбінаційних сайтів із зв'язаними з ними білком Flp (структури, абсолютно необхідної на етапі переносу ланцюгів ДНК) необхідною умовою реакції розрізування? Цілком

очевидно, що відповідь на це запитання дозволить глибше зрозуміти механізм сайт-специфічної Рір-рекомбінації.

Для відповіді на це запитання були розроблені спеціальні експерименти. Основна ідея цих експериментів полягала у тому, щоб утворити такі умови проведення реакції рекомбінації, при яких би так чи інакше зменшувалась би кількість новоутворених рекомбінаційно-компетентних синаптичних комплексів. Рекомбінація в ці-Л0і\іу абсолютно залежить від утворення таких комплексіз, тому оцінка ефективності рекомбінації в цих експериментах слугувала мірою утворення синаптичних комплексів. Реакція розрізування ДНК білком РІр може залежити, а може і не залежите від утворення синаптичного комплексу. Якщо утворення синаптичного комплексу передує реакцію розрізування, то її ефективність повинна корелювати з кількістю новоутворених синаптичних комплексів, тобто з ефективністю рекомбінації в цілому. Якщо ж реакція розрізування передує утворення синаптичного комплексу, такої кореляції відмітити буде не можливо.

Вищеозначені умови утворювались: 1) при розведенні реакційній суміші (при розведенні збільшується час, що потребують компоненти реакції (білок+ДНК) на зустріч один з одним) (рис.5); 2) при введенні в реакційну суміш аналогу субстрату (який містить вставку з 4 п.о. в спсйсерній послідовності ділянки рекомбінації*), що блокує утворення рекомбінаційно-компетентного синаптич-ного комплексу (табл.2); 3) при надоптимальних свіввідношеннях білок/ДНК (при яких ефектівність рекомбінації знижена) (рис.6).

Проведені експерименти показали, що:

- реакція розрізування ДНК білком РІр в визначенних умовах не с швидкість-лімітуючою стадією рекомбінації;

- в умовах, коли ефективність рекомбінації в цілому різко знижена (тобто різко знижена кількість рекомбінаційно-компетен-

Рис.5. Залежність утворення продуктів реакцій рекомбінації

(----) і розрізування ДНК (- - -) від часу при різних об'ємах

реакцийної суміші.

Чає, хв

Рис.6. Залежність утворення продуктів реакцій рекомбінації

(----) і розрізування ДНК (- - -) від часу при співвідношеннях

білокУДНК, що збільшуються.

Табл. 2. Ефективність реакцій розрізування і рекомбінації в присутності аналогу субстрату.

1*8* 11=1/2(118+118*) СЬв СІВ*

А Б2 * ві + Б ♦ в** — — — — —

Б2-

В Б1 ♦ 8 ♦ в** 18.4 8.1 13.3 4.1 57.8

Б2-

С Б1 ♦ ♦ в ♦ Б* ♦ 14.6 8.7 .11.7 .4.6 57.6

82-

*** в ♦ 17.0 11.5 14.3 5.6 56.3

в**

вг*

Е 81 + 8 ♦ Б* ♦ 11.0 6.5 8.8 5.6 58.4

вг**

її 81 ♦ в ♦ в** 4.3 2.8 3.6 4.4 59.9

ЯБ - ефективність рекомбінації між міченим "повним" субстратом (8) і неміченим "повним" субстратом (Б1); ЯБ* - ефективність рекомбінації між Б1 і міченим "пузирковим" субстратом (Б*); Я -об'єднана ефективність рекомбінації; СЬБ - ефективність реакції розрізування субстрату Б; СЬБ* - ефективність реакції розрізування субстрату Б*. Б2 - немічений аналог "повного" субстрату із вставкою 4 п.о. в спексері, неактивний у реакції розрізування ДНК; - наявність чи відсутність субстрату. А

- контроль; В - субстрат Б2 в реакційній суміші відсутній; С і О -реакційні суміші містили додатково 0,02 і 0,04 пмоль субстрату Б1, відповідно; Е і Б - реакційні суміші містили додатково 0,02 і 0,04 пмоль Б2, відповідно. В таблиці вказано середні значення двох серій реакцій. Діапазон коливань значень - 10-20% від вказаних в таблиці значень (крім значень дня Я).

тних синаптичних комплексе), ефективність реакції розрізування залишається незмінною;

- при надоптимальних співвідношеннях білку Рір до ДНК блокується утворення продуктів рекомбінації в цілому, але це блокування не перешкоджає розрізуванню ДНК білком Рір. Можливо, при перевищенні оптимального співвідношення виникають доповнюючи контакти типу білок-білок і/або білок-ДНК, які роблять неможливим або сильно уповільненим утворення рекомбінаційно-компетентного комплексу білку Бір з двома ділянками рекомбінації.

На основі отриманих даних в роботі зроблено висновок про те, що розрізування ДНК білком Рір відбувається до утворення рекомбінаційно-компетентного синаптичного комплексу. Ці дані краще всього погоджуються з моделлю, згідно якої розрізування ДНК білком їїір ініціюється при зв'язуванні димеру білку з однією ділянкою рекомбінації, тобто з половиною синаптичного комплексу. В роботі припущено, що утворення комплексу димеру білку Иір з однією ділянкою рекомбінації, здатного до розрізування ДНК, є проміжним етапом, полегшуючим утворення рекомбінаційно-компетентного комлексу тетрамеру білку Рір з двома ділянками рекомбінації.

На основі проведених дослідів в роботі запропонована модель ранніх етапів Рір-рекомбінації. Модель передбачає, що перший ферментативний етап рекомбінації- розрізування ДНК - може бути ініційовано, коли білок Рір зв'язується з однією ділянкою рекомбінації, тобто коли утворюється половина рекомбінаційно-компетентного синаптичного комплексу. У відсутність партнеру по синаптичному комплексу розрізана ДНК швидко відновлює свою первісну цілісність, і розрізи ДНК не приводять до необоротних пошкоджень. Відбувається так би мовити осцилювання

розрізування-відновлення ДНК. Коли з'являється партнер по реакції рекомбінації, утворюється синаптичний комплекс між двома ділянками рекомбінації, і стає здійсненною умова переносу ланцюгу по рекомбінантному типу.

11а закінчення слід відзначити, що в роботі проведено комплексне дослідження початкових етапів Рір-рекомбінації. Найбільш суттєвими результатами е такі:

. - білок Бір утворює з Бір-зв'язуючим елементом ДНК контакти різного ступеня "критичності" для зв’язування;

- з теоретичної точки зору, в ділянці Рір-рекомбінації існує схильність до згинання, що викликається зв'язуванням з ним білку Рір;

- розрізування ДНК білком Рір відбувається до утворення реком-бінаційно-компетентого синаптичного комплексу тетрамеру білку Рір з двома ділянками рекомбінації. Реакція розрізування ініцює-ться при зв'язуванні з ділянкою рекомбінації димеру білку Рір.

ВИСНОВКИ

1. Проведений в роботі мутаційний аналіз РІр-зв'язуючого елементу ДНК з використанням аналогів основ дозволив ідентифікувати ряд потенційних точкових контактів білку Рір з N7-атомами гуаніну, Ю-атомами аденіну, 04-атомами тиміну і МН2-групою гуаніну РІр-зв'язуючого елементу ДНК. Потенційні контакти білку Рір з ДНК розподілені по всьому Рір-зв'язуючому елеменгу ДНК як в великому, так і в малому жолобках ДНК. Білок Ріргмає контакти з Рір-зв’язуючим елементом ДНК в малому жолобку з обох боків подвійної спіралі ДНК, тобто білок, зв'язуючись з ДНК, як би обплітає її.

2. Різна чутливість білку Рір до введення однакових аналогів основ в різні позиції РІр-зв'язуючого елементу ДНК, дозволяє зро-

бити висновок, ідо білок FIp утворює з ділянкою FIp-рекомбінації коїпакти різного ступеня "критичності" для зв'язування. Найбільш "критичні" контакти з Flp-зп'язуючим елементом ДНК білок Flp утворює, в основному, в першій половині Flp-зв'язуючого елементу ДНК біля фосфодіефірного зв'язку, що розрізується білком Flp. "Найкритичніший" з виявлених контактів білок утворює з аміногрупою гуаніну пари GC, розташованої в позиції 7 Flp-зв'язуючого елементу ДНК.

3. Аналіз первинної послідовності ДНК в ділянці Flp-рекомбі-нації, проведений в роботі з метою з’ясування схильності ділянки до вигину, що викликається зв’язуванням з ним білку Flp, показав невипадковість розподілу "вигиноутворюючих" динуклеотвдів та олігонуклеотидів з відомими конформаційними властивостями в ділянці Flp-рекомбінації. Аналіз свідчить на користь схильності ділянки рекомбінації до згинання, що викликається зв'язуванням з білком Flp. На основі аналізу розподілу запропоновано робочу модель ділянки Рір-рекомбінації, зв'язаної з білком Flp. Основними особливостями моделі є чотири вигини ДНК у бік малого жолобку по краях Flp-зв'язуючих елементів, і вигин у бік великого жолобку ДНК з центром у центрі спейсерної послідовності ділянки FIp-рекомбінації.

4. Виявлено, що надоптимальне співвідношення білку Flp до Flp-зв'язуючого елементу ДНК, яке блокує реакцію рекомбінації в цілому, не перешкоджає розрізуванню ДНК білком Flp.

5. Показано, що утворення рекомбінаційно-компетентного си-наптичного комплексу двох зв'язаних з білком Flp ділянок рекомбінації не є необхідною умовою ініціації реакції розрізування ДНК білком Flp. Достатньою умовою є зв'язування білку Flp з однією ділянкою рекомбінації.

6. Аналіз реакції розрізування ДНК білком Flp дозволяє запропонувати модель ранніх етапів FIp-рекомбінації, згідно з якою зв'язування білку Flp з ділянкою рекомбінації у відсутність партнеру по синаптичному комплексу приводить до процесу розрізування-відновлення ДНК, що повторюється, який відбувається до утворення синаптичного комплексу двох ділянок рекомбінації.

. СПИСОК ПРАЦЬ, НАДРУКОВАНИХ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ:

1. Saxena P., Whang I., Lee J., Lee J., Voziyanov Y., Mendoza V., Jayaram M. Role of tyrosine phosphorylation - dephoshorylation in copy number control of the yeast plasmid 2 micron circle //Cell, and Mol. Biol. Res.- 1994,- 40, N.3.- P.215-222.

2. Возиянов Ю.А, Возможная роль индивидуальных ДНК-белковых контактов сайт-специфической рекомбиназы Flp из

S.cerevisiae с азотистыми основаниями Flp-связывающего элемента ДНК //Биополимеры и клетка,- 1996.- 12, N.1.- С.89-94.

3. Voziyanov Y., Lee J., Whang I., Lee J., Jayaram M. Analyses of the first chemical step in Flp site-specific recombination: Synapsis may not be a pre-requisite for strand cleavage //J. Mol. Biol. 1996.- 256, 4,-P.720-735.

4. Возиянов Ю.А., Корнелюк А.И. Взаимодействие белка Flp с участком рекомбинации: индуцированное фермент-субстратнос соответствие//Биополимеры и клетка.-1996.- 12, N.3.- С. 17-26.

АНОТАЦІЇ

Возиянов Ю.А. Структурно-функциональная организация фермент-субєтратного комплекса сайт-специфнческой рекомбина-зы Flp из дрожжей S.cerevisiae. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03

- молекулярная биология. Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины. Киев, 1996. Защищаются 4 печатные работы. В работе изучались начальные этапы Flp-зависимой сайт-специфической рекомбинации - связывание белка Flp с участком рекомбинации и разрезание белком ДНК. Обнаружены наиболее и наименее "критичные" контакты белка Flp с основаниями Flp-связывающего элемента ДНК. Оказалось, что белок Flp оплетает ДНК. В участке Flp-рекомбинации, вероятно, существует предрасположенность к изгибанию, вызываемого связыванием с ним белка Flp. Показано, что белок Flp разрезает ДНК до образования рекомбинационно-компетентного синаптического комплекса.

Voziyanov Y. Structure-functional organization of substrate-enzyme complex of site-specific recombinase Flp from yeast S.cerevisiae. Dissertation thesis for Candidate of Science degree on speciality 03.00.03 (molecular biology). Institute of Molecular Biology and Genetics, NASU. Kiev,1996. 4 printed papers are defended. In the present work the first stages of Flp-dependent site-specific recombination - binding of Flp-protein to site of recombination and protein-dependent cleavage of DNA - have been studied. The most and the least "critical" contacts of Flp-protein with the bases of Flp-binding element have been found. It turned out that Flp protein wraps DNA. The Flp recombination target very likely has a tendency to bend upon Flp protein binding. It has been found that Flp protein cleaves DNA before recombination-competent synaptic complex is formed.

Ключові слова: Flp, сайт-специфічна рекомбінація, білок-нуклеї-нове впізнавання.

Зам. 96. Формат 60x90/16. 06л. вид. арк. 1.0

Підписано до друку 14.10.96 р. Тирад 100 прим.

Поліграфічна дільниця ІТ-і> ім. М.М.Боголюбова НАН України