Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная характеристика участка хромосомной ДНК, ассоциированного с ядерной оболочкой

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная характеристика участка хромосомной ДНК, ассоциированного с ядерной оболочкой"

На правах рукопись

Шабарина Анна Николаевна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА УЧАСТКА ХРОМОСОМНОЙ ДНК, АССОЦИИРОВАННОГО С ЯДЕРНОЙ

ОБОЛОЧКОЙ

03.02.07 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

г 1 моя 2013

005539277

Москва 2013

005539277

Работа выполнена в группе структурно-функциональной организации эукариотических хромосом лаборатории генетических основ морфогенеза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

ГЛАЗКОВ Михаил Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

КУЛИКОВ Алексей Михайлович Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, старший научный сотрудник лаборатории генетики

доктор биологических наук ЧУРИКОВ Николай Андреевич Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, зав. лабораторией организации генома

Ведущая организация:

ФГБУН "Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук"

Защита диссертации состоится "18" декабря 2013 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, 26.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН: http://idbras.corncor.ru/.

Автореферат разослан _2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета /у С

кандидат биологических наук /К^Р^/и^ О.В. Бойко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Регуляция экспрессии генов — один из основных молекулярных механизмов дифференцировки клеток и развития организма в целом. В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что этот процесс осуществляется на нескольких уровнях и пространственная организация хромосом в ядре играет в этом существенную роль. Показано, что формирование петельных доменов, постоянное или временное взаимодействие хромосомного локуса с ядерной оболочкой может обуславливать его положение в 3-х мерном объеме ядра и функциональное состояние гена(ов) этого локуса (Pai, Engelke, 2010; Montavon, Duboule, 2012). В свою очередь, пространственная организация хромосом в интерфазном ядре в большой степени определяется характером их прикрепления к ядерной оболочке.

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что ядерная оболочка — это не только структурный компонент ядра, но и полноценная функциональная единица, участвующая в различных процессах. Различные конформационные изменения хромосомной ДНК, компактизация/декомпактизация хроматина, активация или сайленсинг — многие регуляторные процессы функционирования генома осуществляются на ядерной оболочке или при её участии (Guelen et al., 2008; Zullo et al., 2012). Наряду с этим, во многих работах показана "точечная" ассоциация с ядерной оболочкой, затрагивающая непротяжённые участки интерфазных хромосом (Tsanev, Tsaneva, 1986; Fais et al., 1989; Владимирская и др., 1998). При этом происходит разделение хромосомной ДНК на ряд доменов.

В связи с этим большой интерес представляют исследования последовательностей ДНК, обуславливающих прикрепление хромосом к ядерной оболочке (яоДНК), а также барьерных элементов — большой группы последовательностей, предположительно участвующих в установлении границ между структурными/функциональными единицами эукариотических хромосом.

Предметом изучения в данной работе является фрагмент яоДНК, выделенный из ядерных оболочек гепатоцитов мыши, клон EnvMA. Эта последовательность является эволюционно консервативной и обладает рядом необычных характеристик (Глазков и др., 1999). Многообразие функций ядерной оболочки позволяет предположить, что участки заякоривания интерфазных хромосом на ядерной оболочке могут играть в ядре не только структурную роль, но и выполнять дополнительные функции. В настоящее время экспериментальные данные по этому вопросу отсутствуют.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение структурно-функциональных характеристик участков хромосомной ДНК, обуславливающих прикрепление интерфазных хромосом к ядерной оболочке (яоДНК). В соответствии с целью в работе были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ нуклеотидной последовательности яоДНК методами

биоинформатики;

2. Провести анализ барьерных свойств последовательности яоДНК;

3. Провести анализ регуляторных свойств последовательности яоДНК;

4. Провести анализ инсуляторных свойств последовательности яоДНК;

5. Определить особенности мест интеграции трансгенов и провести анализ мест локализации последовательности яоДНК на хромосомах ВгоьорЬйа melanogaster.

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые проведено исследование функциональных особенностей участков хромосомной ДНК, обуславливающих прикрепление интерфазных хромосом к ядерной оболочке. Проведён анализ нуклеотидной последовательности яоДНК методами биоинформатики, определены особенности её нуклеотидного состава, а также проведён сравнительный анализ яоДНК с другими последовательностями-претендентами на роль барьерных элементов хроматина. В составе яоДНК выявлены консервативные области, одна из которых представляет собой полипуриновый трек, обладающий гомологией до 100% с геномами различных объектов от бактерий до человека. Эти данные позволяют предполагать существование общего ("древнего") нуклеотидного мотива, обуславливающего прикрепление хромосомной ДНК к клеточной/ядерной оболочке.

Впервые проведён экспериментальный анализ функциональных характеристик яоДНК. Обнаружено, что фрагмент яоДНК способен защищать фланкируемые трансгены от эффекта положения, при этом регуляторной функцией изучаемый фрагмент не обладает. Последовательность яоДНК не является инсулятором, однако она может взаимодействовать с инсулятором Жаг(, что было впервые показано в данной работе. Определение сайтов интеграции трансгенов показало, что трансформированные конструкции локализуются в междисках политенных хромосом дрозофилы. В геноме нетрансформированных мух участки, гомологичные яоДНК, выявляются на границах дисков/междисков политенных хромосом.

Полученные результаты имеют важное фундаментальное и прикладное значение. Они вносят весомый вклад в понимание структурно-функциональной организации эукариотических хромосом и могут быть использованы при разработке технологии конструирования биологически безопасных трансгенов для нужд медицины и сельского хозяйства. Кроме того, представленные данные открывают ряд возможностей для дальнейших исследований яоДНК как мало изученной последовательности, участвующей в разграничении генных доменов.

Личный вклад автора. Биоинформатический анализ, молекулярно-генетические манипуляции с ДНК (клонирование, ПЦР и т.д.) осуществлялись автором лично. Трансформация эмбрионов дрозофилы проводилась в Лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Первый эксперимент по Р-опосредованной трансформации эмбрионов дрозофилы был проведён

совместно с к.б.н. Н.Г. Шостак; все последующие трансформации проводились автором лично. Генетические скрещивания и ведение линий дрозофилы также осуществлялись автором. Гибридизация in situ для определения локализации трансгенов на политенных хромосомах дрозофилы была проведена совместно с д.б.н. И.И. Киреевым (Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова). Остальные FISH-эксперименты выполнены автором лично.

Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), XV Школе "Актуальные проблемы биологии развития" (Звенигород, 2008), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), International Moscow Conference on Computational Molecular Biology (Moscow, 2009), 21st International Wilhelm Bernhard Workshop on the cell nucleus (Ustron, 2009), Международной конференции "Хромосома 2009" (Новосибирск, 2009), Конференции молодых учёных ИБР РАН (Москва, 2009), 14-й Международной пущинской школе-конференции молодых учёных "Биология — наука XXI века" (Пущино, 2010), XVI Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2010), IV Международной школе молодых учёных по молекулярной генетике "Геномика и биология клетки" (Звенигород,

2010), 22nd International Wilhelm Bernhard Workshop on the cell nucleus (Riga,

2011), 17-й Международной Пущинской школе-конференции молодых учёных "Биология — наука XXI века" (Пущино, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, 4 из которых — статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает 202 источника. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 2 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали штаммы Escherichia coli XLl Blue и DH5a, линии Drosophila melanogaster. ylwim, y\vu*;S2CyO, hsFLP,ISA/Sco; +, у IV11 ls;CyO, [waCRE]/Sco;+.

Биоинформатический анализ яоДНК проводили с помощью базы данных GenBank и программы Blast. Для получения трансгенных организмов был использован метод Р-опосредованной трансформации эмбрионов дрозофилы. Локализацию трансгенных конструкций и участков яоДНК на хромосомах дрозофилы определяли методом FISH-анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Структурный анализ яоДНК (анализ in silico)

Ранее в нашей Лаборатории были клонированы и частично охарактеризованы фрагменты хромосомной ДНК, выделенные из ядерных оболочек гепатоцитов мыши. Предметом изучения в данной работе является наиболее представленный в клонотеке (около 50%) фрагмент, EnvMA. Его отличительной особенностью является достаточно высокая гомология с участками генов НРО архебактерии Helicobacter pylori (62%) и NTH 1380 Metanobacterium thermoautotrohicum (75%) (Глазков и др., 1999). Сканирование фрагмента EnvMA компьютерной программой предсказания участков взаимодействия фрагментов хромосомной ДНК с различными хромосомными/внутриядерными субструктурами (ChrClass) свидетельствует о его принадлежности к классу фрагментов хромосомной ДНК, выделенных из ядерной ламины — одного из элементов ядерной оболочки (Глазко и др., 2000).

1.1. Общая характеристика фрагмента EnvM4

Последовательность фрагмента EnvMA (рис. 5) имеет длину 300 нуклеотидов, она является белок-некодирующей, т. к. содержит большое количество стоп-кодонов во всех рамках считывания. Кроме того, в последовательности имеется 171 сайт узнавания ДНК-топоизомеразой I. Важной особенностью изучаемой последовательности является то, что она содержит несколько полипуриновых треков, в которых можно выделить звено AAAG, и один протяжённый полипуриновый трек длиной 17 нуклеотидов с 191 по 207 следующего состава: AAAAAGAAAAGAAAAGA.

CCAGTCTGGT СССТАСССАТ ССАТСАСАСА AAGTAGGAAC GGAGACCTAC TTGCATGAAC CAGATAATAA AATGCTTACA AGAAAACACA GGGCATGAGT CTTCACTGTC TCAGATTTTT ACAATGGTGT CTAGGGATGA TGTGAAAAGG CCAGAAGTCA AAGCAGGGCT ACACAGAGAA ACCTGTCTTT AAAAAGAAAA GAAAAGACCT GTGTTCAAAT СТСТААСАТС ATGTAAAGCC AGCACAGGTA AAGAGCAATA GCAACAAAAG ACAGCCCCAC GCATGCACAC ACATGAGCAT

Рис. 1. Нуклеотидная последовательность фрагмента EnvMA Подчёркиванием выделен полипуриновый трек (объяснения см. в тексте).

1.2. Анализ гомологии последовательности EnvM4 у разных организмов

Поиск гомологии фрагмента EnvMA с различными объектами с помощью ресурсов GeneBank и Mouse Genome Informatics выявил участки последовательности, имеющие 90 - 100% гомологии в геномах как высших организмов (растений и животных, включая человека), так и одноклеточных, и микроорганизмов (рис. 2). При этом, кроме участков гомологии, характерных для каждого из объектов, практически у всех есть общий фрагмент гомологии длиной 12 нуклеотидов (с 193 по 204 нуклеотид), который представляет собой полипуриновый трек (AAAGAAAAGAAA).

В геноме мыши выявлено в общей сложности более 200 000 копий различных участков последовательности EnvMA, которые обнаружены в

Homo sapiens

Mus musculus

Rattus rtorvegicus

Oryctolagus cuniculus

Canis familiaris

Sus scrofa

Ovis aries Bos taurus

Gallus gallus

0 100 200 300

Рис. 2. Гомология последовательности EnvMA с геномными фрагментами различных организмов Шкала изображает последовательность EnvMA длиной 300 нуклеотидов. Горизонтальные отрезки — участки EnvMA, показывающие гомологию в геномах различных организмов.

100 200 300

- ' "—- -^55 ' —= ' Xenopus laevis

— —— = Danio rerio

Drosophila melanogaster

Caeriorhabditis elegans

Arabidopsis thaliana Oryza sativa

Saccharomyces cerevisiae

Dictyostelium discoideum

Plasmodium falciparum

100 200 300

Рис. 2. Продолжение

Aquifex aeolicus Bacillus subtilis

Escherichia coli

Methanocaldococcus jarinaschii

Aeropyrum pernix

девятнадцати из двадцати хромосом мыши (кроме Y-хромосомы). Размер участка гомологии варьирует от 20 до 173 нуклеотидов, а степень гомологии — от 57 до 100%. В геномах других организмов области, гомологичные консервативному участку фрагмента EnvMA, встречаются менее часто. В общей сложности программа BLAST показывает для последовательности EnvMA более 77 тысяч гомологий. Следует отметить, что эволюционная консервативность фрагментов хромосомной ДНК мыши, выделенных из ядерных оболочек гепатоцитов мыши, ранее была показана гибридизационным методом (Глазков и др., 1999). Корреляции между длиной нуклеотидной последовательности того или иного клона (или целой хромосомы) и количеством участков гомологии с фрагментом EnvMA не обнаружено.

Также была выявлена гомология отдельных участков нуклеотидной последовательности фрагмента EnvMA с геномами еще одной группы архебактерий, в частности — с Aeropyrum pernix и Methanocaldococcus jannaschii (рис. 2). Интересно, что гомологичные геному Aeropyrum pernix участки равномерно распределены практически по всей длине последовательности EnvMA. Эти данные могут свидетельствовать о том, что эта последовательность возникла у архебактерий и служила для прикрепления ДНК к клеточной оболочке. Кроме того, возможно, первоначально функционально значимой являлась вся последовательность EnvMA, а в процессе эволюции различные части последовательности теряли свою функцию и элиминировались отбором.

1.3. Анализ особенностей нуклеотидного состава последовательности

EnvM4

Учитывая широкую распространённость полипуринового трека в геномах различных организмов, был проведен поиск наиболее консервативных позиций нуклеотидов в обнаруженных гомологичных EnvMA сайтах геномов мыши и Drosophila melanogaster. Поскольку в геноме дрозофилы было найдено более 600 гомологичных участков, а в геноме мыши — более 200 000, для анализа были взяты только 63 участка генома дрозофилы и 140 участков генома мыши, гомологичных EnvMA на 79 - 100%.

С помощью программы MEGA и ресурса Weblogo было проведено сравнение между собой фрагментов геномов, гомологичных различным участкам в EnvMA. При этом фрагменты, гомологичные одному и тому же участку в EnvMA, сравнивали между собой, а не с другими фрагментами. В результате было обнаружено, что ключевыми позициями в EnvMA являются полипуриновый трек (участок с 168 по 218 нуклеотид), а также еще два участка (с 61 по 91 и с 238 по 288 нуклеотид), для которых характерно наличие определенных нуклеотидов на конкретных позициях (рис. 3). Эти данные позволяют сделать вывод о том, что функциональным является не только полипуриновый трек, но и другие участки в последовательности яоДНК и, возможно, большое значение имеет не сам порядок нуклеотидов, а их взаимное расположение. Кроме того, приведённые графические отображения консервативности нуклеотидного состава последовательности EnvMA наглядно

демонстрируют повышенное процентное содержание в ней пуринов, что обуславливает особую конформацию этого участка ДНК (рис. 3).

А Б

Рис. 3. Анализ особенностей нуклеотидного состава последовательности Ет>МА по данным сравнения гомологичных участков в геноме Б. melanogaster Внизу приведены порядковые номера нуклеотидов в последовательности яоДНК: А -нуклеотиды 168-218; Б - нуклеотиды 238-288. Напротив каждой цифры в столбце представлены символы нуклеотидов, встречающихся на этой позиции. Высота столбцов отражает консервативность сиквенса в этом месте; высота каждого символа в столбце — относительную частоту встречаемости каждого нуклеотида на данной позиции.

Поскольку было выявлено неслучайное взаимное расположение нуклеотидов в участках, гомологичных ЕтМ4, представлялось интересным выяснить, является ли фрагмент ЕтМ4 частью какой-либо протяжённой функционально значимой последовательности. Для ответа на этот вопрос сравнили между собой участки генома, находящиеся на расстоянии 300 нуклеотидов с 5'- и 3'- сторон от участка гомологии. Этот анализ также проводили отдельно для геномов дрозофилы и мыши, так как, во-первых, участки гомологии у этих организмов отличаются по размеру, что может исказить результаты исследования, а во-вторых, консенсусные последовательности для разных организмов могут отличаться. Проведённое исследование не выявило гомологии сравниваемых последовательностей и возможного консенсуса в этих участках генома. Это означает, что фрагмент ЕтМ4 не входит в состав какой-либо иной функционально значимой последовательности, по крайней мере, в тех хромосомных сайтах дрозофилы и мыши, которые были проанализированы.

1.4. Анализ локализации эволюционно-консервативного участка фрагмента Еп\'М4 в генных доменах хромосом разных организмов

На следующем этапе были исследованы особенности локализации участков, гомологичных полипуриновому треку последовательности ЕтМ4, по отношению к генам у различных организмов. Для этого был проведён анализ нуклеотидных последовательностей из базы данных ОепЬапк, показавших гомологию с эволюционно-консервативным треком фрагмента ЕтМ4. Среди исследованных нуклеотидных последовательностей было обнаружено, что

участки, гомологичные консервативному треку, локализуются преимущественно в межгенных участках, реже — в интронах генов.

Следует отметить, что кроме единичного расположения сайтов, гомологичных EnvMA, у некоторых объектов наблюдается тандемное расположение участков гомологии, например, у слизевика Dictyostelium discoideum, а также в геномах плазмодия, дрожжей, нематоды, рыбы, лягушек, курицы, крысы, кролика, собаки, свиньи.

1.5. Анализ конформациопных особенностей мест локализации фрагмента

EnvM4 в геномах дрозофилы и мыши Представлялось интересным исследовать вопрос о наличии в непосредственной близости от участков, гомологичных EnvMA в геноме, сайтов дестабилизации дуплексов (Stress-Induced Duplex Destabilization, SIDD). Известно, что эти сайты располагаются в участках прикрепления хромосом к ядерной оболочке, а также в местах взаимодействия ДНК с некоторыми регуляторными белками (Benham et al., 1997). Для анализа были взяты фрагменты генома дрозофилы, располагающиеся на расстоянии 300 нуклеотидов с 5'- и 3'- сторон от сайта гомологии. В результате было обнаружено, что в этих последовательностях находятся от 4 до 14 SIDD-сайтов. Такая же картина характерна для участков, гомологичных EnvMA, в геноме мыши. Интересно, что при этом в самой последовательности EnvMA выявлен только один сайт дестабилизации дуплекса (с 65 по 72 нуклеотид, ТААТАААА). Это согласуется с нашими предыдущими данными о том, что в участках генома, гомологичных EnvMA, могут происходить определённые конформационные изменения молекулы ДНК, которые могут обуславливать или быть следствием взаимодействия ДНК с различными внутриядерными структурами.

1.6. Нуклеотидная последовательность EnvM4 и регуляторные элементы Исследование фрагмента EnvMA с помощью программы Matlnspector

показало, что практически по всей длине последовательности, с 4 по 300 нуклеотид, располагаются сайты узнавания для регуляторных факторов различных организмов. Всего в составе последовательности фрагмента EnvMA обнаружены сайты узнавания для 76-и регуляторных белковых факторов позвоночных. Также была обнаружена гомология последовательности EnvMA с генами факторов транскрипции и элонгации мыши и с LCR Г-клеточного рецептора мыши. Поскольку эти последовательности являются регуляторными элементами, можно предположить, что последовательность EnvMA может каким-то образом участвовать в регуляции экспрессии генов.

1.7. Нуклеотидная последовательность EnvM4 и барьерные элементы Для анализа предположения о возможной барьерной функции фрагмента EnvMA было проведено сравнение этой нуклеотидной последовательности с различными претендентами на роль барьерных элементов (MARs/SARs, LCR, инсуляторами) и анализ этих последовательностей.

Поскольку программа ChrClass относит последовательность EnvMA к классу фрагментов хромосомной ДНК, выделенных из ядерной ламины, а не к классу MARs/SARs (см. разд. 1), неудивительно, что фрагмент EnvMA не показывает какой-либо гомологии с MARs/SARs в базе данных на сайте Genomatix (97 объектов). Более того, в последовательности EnvMA отсутствуют нуклеотидные мотивы, характерные для MARs/SARs: А-блок (ААТАААТ/СААА), Т-блок (ТТА/ТТТ/АТТТ/АТ), АТАТТТ, ААТАТТТТ, ATTA или АТТТА. Поиск гомологии фрагмента EnvMA с инсуляторами дрозофилы — War i, 1А2, s u(Hw) из ретротранспозона gypsy и ses- и ses'-элементами гена hsplQ — не дал результатов. Однако, несмотря на отсутствие гомологии в нуклеотидных последовательностях фрагмента EnvMA с MARs/SARs или инсуляторами, между этими элементами имеется структурное сходство — наличие полипуриновых/полипиримидиновых треков. Более того, в некоторых барьерных элементах, также как и во фрагменте EnvMA, имеются полипуриновые/полипиримидиновые треки, размер которых допускает формирование 3-х цепочечной шпилечной структуры ДНК (ics-элемент), или имеются несколько пар комплементарных полипуриновых/ полипиримидиновых треков, способных образовывать триплексы ДНК с выпетливанием участка ДНК между ними (5'MAR гена лизоцима курицы: позиции 358-367 и 879-888, 644-655 и 677-687).

Фрагмент EnvMA не имеет гомологий с LCR уЗ-глобиновых генов человека. Однако в LCR Г-клеточного рецептора мыши выявлены 2 участка, имеющие 100% гомологию во фрагменте EnvMA в позиции с 164 по 183 нуклеотид и 1 участок, имеющий 89% гомологию во фрагменте EnvMA в позиции с 164 по 200 нуклеотид. Кроме того, в LCR Г-клеточного рецептора мыши также имеются нуклеотидные последовательности, способные формировать //-форму ДНК. Таким образом, структурная (конформационная) организация нуклеотидной последовательности фрагмента EnvMA имеет сходство с известными барьерными элементами. Следовательно, можно предположить, что этот фрагмент может выполнять сходные функции.

Учитывая полученные результаты, с помощью программы MEGA был проведён сравнительный анализ яоДНК и некоторых барьерных элементов. Для этого были использованы нуклеотидные последовательности LCR гена Т-клеточного рецептора (ТСRa) мыши, 5'MAR гена лизоцима курицы, а также инсуляторов дрозофилы: ses- и ses'-элементов, инсулятора su(Hw) из ретротранспозона gypsy, Wari и \А2.

Дендрограммы, построенные разными методами, дали идентичный результат и демонстрируют, что исследованные барьерные элементы не являются однородной группой, а распределены в два кластера (рис. 4). В один кластер (более гетерогенный) входят ses- и scs'-элементы, EnvMA, LCR и su(Hw); в другой — 5'MAR гена лизоцима курицы, а также инсуляторы Wari и 1А2. Фрагмент EnvMA оказался наиболее "родственным" ses/ses' -элементам. Однако эти хромосомные участки, наряду с некоторым сходством в структурной организации (наличие полипуриновых/полипиримидиновых треков, сайтов гиперчувствительности к нуклеазам), имеют функциональные

отличия: scs/scs'-элементы обладают функцией инсулятора (Kellum, Schedl, 1992), a EnvMA — нет (см. разд. 2.3).

-scsl

-scs2

£

- Su(Hw)

- MARlys

Рис. 4. Дендрограмма отношений родства нуклеотидных последовательностей хромосомных элементов, для которых предполагается функция барьерного

элемента

ses- и ici'-элементы обозначены как scsl и scs2, соответственно; 5'MAR гена лизоцима курицы — MARlys. Остальные обозначения см. в тексте.

Полученные результаты показывают, что изучаемая последовательность яоДНК обладает рядом необычных характеристик и может выполнять функции барьерного элемента, т.е. участвовать в разграничении хроматиновых доменов генов. Дальнейшее исследование этого вопроса проводили экспериментально.

2. Функциональный анализ яоДНК 2.1. Анализ барьерных свойств фрагмента EnvM4

Для изучения функциональных характеристик яоДНК был использован метод получения трансгенных мух с помощью Р-опосредованной трансформации. По современным представлениям под барьерной функцией понимают защиту трансгена от эффекта положения — от гетерохроматизации окружающим хроматином и от воздействия как позитивных, так и негативных эндогенных регуляторных элементов. При изучении этого вопроса широко используют трансгенные системы, в которых репортёрный ген(ы) фланкируют различными тестируемыми последовательностями ДНК. Подобному анализу подвергались многие хромосомные фрагменты, например, Л-элемент, 5'- и 3'MARs гена аполипопротеина человека, некоторые инсуляторы. В качестве одного из контролей при этом использовали случайные последовательности ДНК сходной длины (Kellum, Schedl, 1991 и др.). В отличие от тестируемых, случайные фрагменты хромосомной ДНК во всех экспериментах показывали отрицательный результат, поэтому в настоящее время данный контроль уже не используется (Kyrchanova et al., 2007).

Чтобы определить наличие барьерных свойств у фрагмента EnvMA, необходимо проанализировать уровень экспрессии фланкированных им генов. Для этого была создана конструкция, в которой гены yellow, mini-white и их регуляторные элементы фланкированы последовательностями EnvMA (рис. 5Б). Полученной конструкцией трансформировали эмбрионы дрозофилы по

стандартной методике (Spradling, 1986). Количество копий трансгена в линиях мух определяли с помощью Саузерн-блот гибридизации; для анализа брали только однокопийные линии. Известно, что уровень экспрессии генов yellow и white прямо коррелирует с интенсивностью пигментации, поэтому по уровню окраски особей можно судить об уровне экспрессии этих генов (Qian, Pirrotta, 1995).

Д

Рис. 5. Генетические конструкции, использованные в работе Прямоугольниками обозначены гены yellow и mini-white, треугольником — последовательность EnvM\, фигурной стрелкой — промотор гена yellow. Е — энхансер гена white, Ев и Ew - энхансеры тела и крыльев гена yellow. Iw - инсулятор Wari. Цветом обозначены элементы, которые можно удалить из конструкций посредством сайт-специфичекой рекомбинации.

В результате трансформации конструкции в эмбрионы дрозофилы были получены 10 трансгенных линий. Во всех трансгенных линиях наблюдается интенсивная окраска глаз и кутикулярных структур, что свидетельствует о высоком уровне экспрессии генов yellow и mini-white (рис. 6А, строка АЕВ-Е-Ew-Y-W-Iw А), в то время как при трансформации контрольной конструкции (рис. 5А) наблюдается широкий диапазон окраски тела и глаз у трансформированных мух (рис. 6А, строка EB-E-Ew-Y-W-Iw). Наблюдаемый в случае опытной конструкции высокий уровень экспрессии означает, что на трансген не влияют или слабо влияют окружающие сайт интеграции последовательности ДНК/регуляторные элементы, то есть репортёрные гены защищены от эффекта положения. Очевидно, этот результат обусловлен наличием в составе трансгена специальных последовательностей ДНК,

фланкирующих репортёрные гены. В данном случае это фрагменты ЕтМА. Мы предполагаем, что последовательности ЕтМА способствуют формированию независимого транскрипционного домена, защищая фланкируемые гены от влияния окружающего хроматина в месте инсерции.

3 Л 5 Б сЖ Ж тЖ Ор Юр Кор тКор Ер

EB-E-Ew-Y-W-Iw 14 8 16I2S |2 1 2 3 ? 9 4 2|28

АЕггЕ-Е!ГУЛ\'-Ь„А OW II 5 4110

ДЕ

^ AEB-EW-Y-\V-IWÀ 16 4 [0/10 ГШ] 10/10

AEB-E-%-Y-WA [2 4 2| S |1 3 1 2 fi !

ДЕ

AI^-Ew-Y-WA 12 4 2|0/8 [S] S/S

Рис. 6. Результаты анализа барьерной функции фрагмента EnvMA А - конструкция 5Б. Б - конструкция 5В. Под чёрными треугольниками приведены фенотипы репортёрных генов. Для yellow— пятибалльная шкала, где 1 соответствует полной инактивации гена, а 5 — уровню пигментации дикого типа. Для mini-white — Б (белые глаза, полная инактивация гена), сЖ (светло-жёлтые), Ж (жёлтые), тЖ (тёмно-жёлтые), Ор (оранжевые), тОр (тёмно-оранжевые), Кор (коричневые), тКор (тёмно-коричневые), Кр (красные, окраска дикого типа). Цифрами в прямоугольнике обозначено количество линий, имеющих соответствующую окраску. Справа от прямоугольников указано общее количество линий или количество линий, у которых наблюдались изменения фенотипа в результате сайт-специфической рекомбинации, по отношению к общему количеству линий (см. разд. 2.2).

Однако согласно недавним литературным данным в 3'-области гена white находится регуляторный элемент (Wari), способный оказывать влияние на экспрессию генов и функционирование других регуляторных элементов (Chetverina et al., 2008). Было показано, что этот инсулятор присутствует также и в использованной модельной системе с репортёрными генами yellow и mini-white и может обуславливать результаты, полученные с ее помощью ранее. Это дало нам возможность оценить влияние на экспрессию трансгенов инсулятора Wari и исследовать его совместное действие с фрагментом EnvMA. В связи с этим было необходимо изменить используемые конструкции для трансгенеза и провести их повторную интеграцию с целью уточнения результатов.

Чтобы различить влияние на экспрессию репортёрных генов фрагмента EnvMA и инсулятора Wari, последний элемент был удален из конструкции, после чего была проведена повторная трансформация эмбрионов дрозофилы опытной конструкцией (рис. 5В). В результате были получены 8 независимых линий. Из данных, представленных на рисунке 6Б, видно, что уровень экспрессии репортёрных генов в полученных линиях выше базового, однако в целом ниже, чем в предыдущем эксперименте (строка AEB-E-Ew-Y-WА). Очевидно, это обусловлено отсутствием в составе трансформированной конструкции инсулятора Wari. Из этого следует, что фрагмент EnvMA и

инсулятор Wari могут взаимодействовать, при этом их совместное действие дает больший эффект, чем действие только яоДНК.

Затем была поставлена задача сравнить экспрессию трансгенов, отделённых друг от друга последовательностью EnvMA. Для изучения этого вопроса была создана конструкция, в которой изучаемыми последовательностями фланкирован только один из репортёрных генов, mini-white (рис. 5Г). Остальные элементы конструкции такие же, как в предыдущих экспериментах. В результате трансформации были получены 9 трансгенных линий. Во всех линиях обнаружен средний - высокий уровень экспрессии трансгенов, а в одной из линий из двух трансгенов экспрессируется только ген mini-white (рис. 7, строка Eb-E-Ew-Y ▲ W-IwA).

1 2 3 4 5 Б сЖ Ж тЖ Op тОр Кор тКор Кр

Ер-Е-Еда -У-W- Iw |4 S 16128 ¡2123 5 9 4 2|28 Ев-Е-Е^-YAW-^A II 3 3 219 13 3 Ц9

Рис. 7. Результаты анализа взаимодействия фрагмента EnvMA и инсулятора

Wari

Обозначения, как для рисунка 6.

Как и в предыдущем случае, в конструкции присутствует инсулятор Wari и поскольку, как показано выше, он взаимодействует с фрагментом EnvMA, можно было бы ожидать, что уровень экспрессии репортёрных генов будет достаточно высоким. Однако обнаружено, что уровень экспрессии гена mini-white у трансгенных мух такой же, как в предыдущей конструкции (коричневые-красные глаза), а уровень экспрессии гена yellow — несколько ниже и имеет более широкий диапазон (от 1 до 5). Отличием от предыдущих экспериментов в данном случае является то, что между генами yellow и mini-white находится фрагмент яоДНК. Следовательно, усиливающее действие инсулятора Wari не может преодолеть барьер, образованный фрагментом EnvMA. В результате экспрессия гена mini-white, фланкированного последовательностями EnvMA, нормализована, а экспрессия гена yellow находится на более слабом уровне и подвержена влиянию окружающего хроматина в месте инсерции.

Чтобы сопоставить результаты, полученные при трансформации различных конструкций, была составлена сводная таблица результатов анализа барьерной функции фрагмента EnvMA (Табл. 1). Из данных, представленных в таблице видно, что последовательность EnvMA защищает трансгены от эффекта положения. Когда она фланкирует трансгенную конструкцию, наблюдается высокий уровень их экспрессии. При этом в присутствии инсулятора Wari интенсивность окраски глаз и кутикулярных структур в целом выше, чем в его отсутствии. Вероятно, это можно объяснить тем, что EnvMA и Wari взаимодействуют между собой функционально и/или физически. Однако влияние инсулятора Wari ограничивается фрагментом EnvMA, т.е. его действие не распространяется на трансген, отделённый последовательностью EnvMA.

Таблица 1. Суммарные результаты анализа барьерной функции яоДНК

Конструкция yellow mini-white

1-й <*5 t ID И Щ <j H c. О тОр Кор тКор О. й

EbEEw - yellow - mini-white - Wari 4 8 16 2 1 2 2 5 9 4 2

A - EbEEw - yellow - mini-white - Wari - A 6 4 1 5 4

A - EbEEw - yellow - mini-white - Д 2 4 2 1 3 1 2 1

EbEEw - yellow - Д - mini-white - Wari - A 1 3 3 2 3 3 3

Схемы конструкций, как на рис. 5, фенотипы трансгенных линий, как в подписи к рисунку 6. Цифрами в таблице обозначено количество линий, имеющих соответствующую окраску.

Полученные результаты показывают существование кооперативного действия различных барьерных элементов, что позволяет по-новому взглянуть на предложенные модели их действия, однако необходимы дальнейшие исследования, которые позволят пролить свет на природу взаимодействия этих элементов.

2.2. Анализ регуляторных свойств фрагмента EnvM4

Необходимо отметить, что результаты, представленные в предыдущем разделе, также могут быть получены в случае, если тестируемая последовательность выполняет регуляторную функцию в транскрипции. Для того чтобы это проверить, было проведено вырезание энхансера гена white из трансгенных конструкций методом сайт-специфической рекомбинации in vivo. Если изучаемая последовательность способна усиливать экспрессию репортёрных генов, то в результате вырезания энхансера их экспрессия не изменится или изменится незначительно. В данном эксперименте экспрессия гена mini-white во всех линиях упала до базового уровня (рис.6, строка АЕ), причём этот результат не зависит от наличия или отсутствия в конструкции инсулятора Wari. Уровень экспрессии гена yellow не претерпел изменений. Это свидетельствует о том, что изучаемые последовательности EnvMA не влияют непосредственно на экспрессию, но способствуют поддержанию определенного уровня экспрессии трансгена независимо от места его интеграции.

2.3. Анализ инсуляторных свойств фрагмента EnvM4

Поскольку для некоторых барьерных элементов была показана способность выполнять функцию инсулятора, т.е. препятствовать взаимодействию между энхансером и промотором, была поставлена задача исследовать инсуляторную функцию фрагмента EnvMA. Необходимо отметить, что эксперименты, проверяющие способность чужеродных инсуляторов выполнять свои функции в других организмах, неоднократно проводились ранее.

Для трансформации были использованы конструкции, в состав которых входят гены yellow и mini-white дрозофилы, их регуляторные элементы и фрагмент EnvMA, помещённый между энхансерами и промотором гена yellow. Также в одной конструкции присутствовал инсулятор War i, способный оказывать влияние на экспрессию генов и функционирование других регуляторных элементов (рис. 5Д), а в другой — нет (рис. 5Е). В результате проведения трансформации эмбрионов дрозофилы были получены 8 независимых линий, в каждой из которых наблюдается ослабление экспрессии репортёрных генов (рис. 8А, строка Eb-E-Ew AY-W-Iw; рис. 8Б, строка Ев-Е-EwAY-W).

Эти данные можно объяснить влиянием фрагмента EnvMA в случае, если он препятствует взаимодействию энхансеров и промоторов генов, т.е. является инсулятором, либо влиянием хромосомного окружения в месте инсерции. Для того чтобы различить эти два варианта, было проведено вырезание фрагмента EnvMA in vivo посредством сайт-специфической рекомбинации во всех полученных линиях. В результате было обнаружено, что экспрессия генов yellow и mini-white во всех линиях не изменилась (рис. 8, строка А А). Это означает, что изучаемый фрагмент не влияет на взаимодействие энхансера и промотора, т.е. не является инсулятором.

1 2 3 4 5 Б сЖ Ж тЖ Ор Юр Кор тКор Кр

^-E-E;rY-W-Iw |4 3 16I2S 12 12 3 5 9 4 2|2S

^-E-E^AY-W-V Ш 2 ЦЦ 2

^-E-E^-Y-W-V Ш 0/2 1 1| 0/2

EjfE-E^AY-W |1 1 1 3| 6 |1 1 1 3] 6

^-Е-Ед-Y-W II 1 1 3| 0/6 II 1 1 31 0/6

Рис. 8. Результаты анализа инсуляторных свойств фрагмента EnvMA А - конструкция 5Д. Б - конструкция 5Е. Обозначения, как дая рисунка 6.

Однако необходимо обратить внимание на тот факт, что в полученных трансгенных линиях уровень экспрессии репортёрных генов существенно ниже, чем тот, который обычно наблюдают в подобных экспериментах. Поскольку, как показано выше, это не связано с инсуляторными свойствами фрагмента EnvMA, это можно объяснить дефектом энхансера гена white в конструкции в результате встраивания в геном, либо специфическим местом интеграции трансгена. Нативность энхансеров была проверена методом ПЦР-анализа. Таким образом, можно заключить, что низкий уровень экспрессии репортёрных генов может быть обусловлен специфическим местом локализации трансгена в хромосоме/в объеме ядра. Возможно, изучаемый фрагмент яоДНК оказывает влияние на место встраивания трансформируемой конструкции в "хозяйские" хромосомы или обуславливает её локализацию в специфических областях ядра.

2.4. Анализ сайтов интеграции трансгенных конструкций на хромосомах

дрозофилы

Для того чтобы изучить особенности интеграции в хромосомы дрозофилы трансгенов, фланкированных фрагментом EnvMA, был использован метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Политенные хромосомы являются удобной моделью для определения местоположения интересующего участка ДНК на цитологической карте хромосом, а также позволяют исследовать расположение зонда относительно участков с различной степенью компактизации хроматина (дисков/междисков).

В качестве зонда была взята ДНК конструкции, использованной для трансформации (см. рис. 5Б). Поскольку в исходной линии мух (y'w"18) присутствуют копии генов, взятых в качестве репортёров {yellow и white), на каждом препарате может выявляться до трёх сигналов, которые соответствуют "хозяйским" генам и трансгену. Однако их легко различить, поскольку хромосомная локализация этих генов хорошо известна из литературных данных (yellow: 1А5-1А5, white: ЗВ6-ЗВ6); кроме того, сигнал от интегрированной конструкции более интенсивный, так как в нём совмещаются оба гена.

А Б В

Рис. 9. Локализация трансгенов, фланкированных фрагментами EnvMA, на политенных хромосомах Drosophila melanogaster методом FISH А - линия 6, трансген на хромосоме II. Б - линия 7, трансген на хромосоме III. В - линия 8, трансген на хромосоме X. Стрелками отмечены сигналы зонда. Буквой Т отмечен сигнал, соответствующий трансгенной конструкции.

В этом эксперименте было исследовано расположение трансгенных конструкций на политенных хромосомах относительно диск/междиск-рисунка хромосом. Анализ препаратов политенных хромосом трёх линий показал, что трансгены локализуются в междисках политенных хромосом дрозофилы (рис.

9).

Действительно, ранее было показано, что встраивание Р-транспозонов у дрозофилы происходит в основном в районы междисков, в которых, по современным представлениям, находятся постоянно транскрибируемые гены. Однако в настоящее время появляется все больше данных о том, что деконденсация хроматина междисков может иметь и другое функциональное значение. Показано, что многие междиски содержат участки с высоким потенциалом связывания с белками ядерного матрикса, а в некоторых междисках обнаружены сайты связывания инсуляторного белка BEAF-32

(Демаков и др., 2010), что свидетельствует о возможном участии междисков в барьерной или инсуляторной функции.

2.5. Анализ локализации участков, гомологичных Еп\М4, на хромосомах

дрозофилы

Следующей задачей было исследование расположения участков, гомологичных ЕтМА, на хромосомах нетрансформированных мух. Для приготовления препаратов политенных хромосом использовали личинок исходной линии (у1 и?11 8); в качестве зонда — фрагмент плазмиды, содержащий последовательность ЕтМА, а также смесь нескольких фрагментов геномной ДНК, содержащих участки гомологии с последовательностью ЕтМА, амплифицированных методом ПЦР на основании ранее полученных данных о локализации участков гомологии в геноме дрозофилы (см. разд. 1.2). В результате этого эксперимента было обнаружено, что участки, гомологичные последовательности ЕтМА, располагаются на границах дисков/междисков политенных хромосом (данные не представлены). Эти результаты согласуются с нашими данными о том, что изучаемая последовательность может участвовать в установлении границ между "активным" и "неактивным" хроматином (см. разд. 2.1), а также с тем, что районы сайтов гомологии этого фрагмента в геномах дрозофилы и мыши обладают необычной конформацией (см. разд. 1.5). Кроме того, по результатам сравнительного анализа фрагмента ЕтМА с другими претендентами на роль барьерных элементов хроматина, он оказался наиболее "родственным" ясз/ясз'-элементам, которые также были обнаружены на границах дисков/междисков политенных хромосом в локусе генов теплового шока дрозофилы (Шуагёу е/ а!., 1985).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая полученные данные, можно констатировать, что последовательность ЕтМА, выделенная из ядерных оболочек, обладает рядом необычных характеристик. Она способна "нормализовывать" экспрессию трансгена независимо от места его интеграции в случае, когда трансформированная конструкция фланкирована последовательностями ЕтМА. Мы предполагаем, что последовательность ЕтМА способствует формированию независимого транскрипционного домена, защищая фланкируемые гены от влияния окружающего хроматина в месте инсерции. При этом последовательность ЕтМА является нейтральной в отношении регуляторной активности и не проявляет свойства ни энхансеров, ни сайленсеров, ни инсуляторов, но способна взаимодействовать (функционально и/или физически) с инсулятором Жаг1. Все эти данные удовлетворяют общепринятым критериям для участков хромосомной ДНК, претендующих на роль барьерных элементов хроматина, выдвинутых Келлумом и Шедлом (КеНшп, 5сЬе<11, 1991).

Такие свойства яоДНК, вероятно, являются следствием особенностей её строения. В составе изучаемой последовательности обнаружен протяженный полипуриновый трек длиной 17 нуклеотидов, имеющий высокую гомологию в

геномах различных организмов от бактерий до человека, а также участки с неслучайным взаимным расположением нуклеотидов, что говорит о том, что эволюционно консервативными и, предположительно, важными для выполнения её функции являются различные участки в последовательности яоДНК. Кроме того, в районах сайтов гомологии мы обнаружили скопление сайтов дестабилизации дуплекса (SIDD), которые располагаются в участках прикрепления хромосом к ядерной оболочке и в местах взаимодействия ДНК с некоторыми регуляторными белками (Benham et al., 1997). Это свидетельствует о необычной конформации этого геномного участка, которая может обуславливать или быть следствием взаимодействия ДНК с различными внутриядерными структурами.

Эволюционно-консервативный участок в составе яоДНК представляет собой полипуриновый трек, который обладает осью симметрии и может образовывать триплексную структуру ДНК (Я-форму ДНК). Такие конформационнные изменения приводят к терминации транскрипции РНК-полимеразой II (Ing et al., 1993; Michel et al., 1993) и привлечению специальных регуляторных белков, благодаря чему может быть реализована барьерная функция яоДНК. С другой стороны при формировании триплексной структуры образуются однонитевые участки ДНК, которые, по данным разных авторов, прочно и неспецифично по отношению к нуклеотидным последовательностям способны связываться с ядерными оболочками (белками ядерной ламины). Мы предполагаем, что этот механизм может лежать в основе прикрепления хромосомной ДНК к ядерной оболочке.

В настоящее время активно изучаются последовательности ДНК, предположительно участвующие в разграничении генных доменов, т.н. барьерные элементы. Однако это гетерогенная группа последовательностей, которые не обладают сходством строения или нуклеотидного состава, что может свидетельствовать о сложности организации границ хромосомных доменов генов. По-видимому, границы между "активным" и "неактивным" хроматином представляют собой не какой-то один тип последовательностей ДНК, а, скорее, совокупность нескольких участков ДНК, обладающих различными свойствами и функциями. В зависимости от конкретного генного домена и его хромосомного окружения, это могут быть, в частности, яоДНК и инсуляторы. Их совместная "работа" приводит к формированию в хромосоме домена с независимой от окружения экспрессией.

Таким образом, нами впервые показана функциональная роль фрагментов ДНК, участвующих в прикреплении хромосомной ДНК к ядерной оболочке, в обеспечении барьерной функции, что проявляется в защите (транс)генов от эффекта положения.

ВЫВОДЫ

1. Последовательность яоДНК содержит несколько участков, обладающих высокой эволюционной консервативностью, один из них — полипуриновый трек — присутствует в геномах всех исследованных организмов, начиная с

архебактерий. В геномах различных объектов участки, гомологичные последовательности яоДНК, локализуются в некодирующих областях геномов, чаще в межгенных участках или в интронах генов. Области геномов Mus musculus и Drosophila melanogaster, гомологичные яоДНК, характеризуются необычной конформацией ДНК; они выявлены во всех хромосомах за исключением Y-хромосомы.

2. Последовательность яоДНК, фланкирующая трансгены, обуславливает стабильно высокую экспрессию трансгенов независимо от места интеграции в "хозяйские" хромосомы.

3. Последовательность яоДНК не обладает регуляторной функцией в транскрипции, но способна взаимодействовать (функционально и/или физически) с инсулятором Wari.

4. Последовательность яоДНК не препятствует взаимодействию между энхансером и промотором репортёрного гена, т.е. не обладает функцией инсулятора.

5. Трансгены, фланкированные яоДНК, интегрируют в междисковые области политенных хромосом D. melanogaster. Последовательности хромосомной ДНК дрозофилы, гомологичные фрагменту яоДНК, располагаются на границах дисков/междисков политенных хромосом.

6. Последовательность яоДНК является барьерным элементом хроматина в соответствии с общепринятыми критериями (Kellum, Schedl, 1991), т.к. является нейтральной в отношении регуляторной активности и не проявляет свойства ни энхансеров, ни сайленсеров, ни инсуляторов. При этом фрагменты яоДНК способны устанавливать во многих хромосомных сайтах домен генной активности, независимый от окружения, если они расположены на флангах трансгена.

СТАТЬИ В ЖУРНАЛАХ, СООТВЕТСТВУЮЩИХ ПЕРЕЧНЮ ВАК

1. А.Н. Шабарина, Е.И. Прилепа, М.В. Глазков. Необычная нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, выделенного из ядерных оболочек гепатоцитов мыши // Генетика. 2006. Т. 42. № 7. С. 879-886;

2. А.Н. Шабарина, Н.Г. Шостак, М.В. Глазков. Роль участков прикрепления хромосом к ядерной оболочке в функциональной организации хромосом // Генетика. 2010. Т. 46. № 9. С. 1175-1177;

3. А.Н. Шабарина, М.В. Глазков. Участки прикрепления интерфазных хромосом к ядерной оболочке: барьерные элементы, но не инсуляторы // Генетика. 2012. Т. 48. № 8. С. 1012-1016;

4. А.Н. Шабарина, М.В. Глазков. Барьерные элементы хроматиновых доменов и ядерная оболочка // Генетика. 2013. Т. 49. № 1. С. 30-36.

ПАТЕНТЫ

1. Дрозд С.Ф., Глазков М.В., Шабарина А.Н. Патент на изобретение № 2358013. Опубл. 10.06.2009. Бюл. № 16;

2. Дрозд С.Ф., Глазков М.В., Шабарина А.Н., Мартынова М.Ю., Сломинский П.А. Патент на изобретение № 2375458. Опубл. 10.12.2009. Бюл. № 34.

Заказ № 16-Р/11/2013 Подписано в печать 08.11.13 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шабарина, Анна Николаевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ ИМ. Н.К. КОЛЬЦОВА РАН

На правах рукописи

04201450168

Шабарина Анна Николаевна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА УЧАСТКА ХРОМОСОМНОЙ ДНК, АССОЦИИРОВАННОГО С ЯДЕРНОЙ

ОБОЛОЧКОЙ

03.02.07 — генетика

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н. М.В. Глазков

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................................................................................5

1. ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................................................7

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................13

2.1. Ядерная оболочка и пространственная организация хромосом в ядре..........................................................................................................................................13

2.2. Механизм прикрепления ДНК к ядерной оболочке..............................16

2.3. Структурные участки хромосомной ДНК........................................................20

2.4. Структурно-функциональная организация эукариотических хромосом..................................................................................................................................................23

2.5. Барьерные элементы хроматина....................................................................................................26

2.5.1. Барьерные элементы I типа................................................................................28

2.5.1.1. Инсуляторы дрозофилы........................................................................28

2.5.1.2. Инсуляторы позвоночных..................................................................31

2.5.1.3. Модели действия инсуляторов......................................................33

2.5.2. Барьерные элементы IIтипа..........................................................................37

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................................................41

3.1. Материалы..........................................................................................................................................41

3.1.1. Бактериальные штаммы......................................................................................41

3.1.2. Линии Drosophila melanogaster..........................................................................41

3.1.3. Препараты ДНК...............................................................................................................41

3.1.4. Ферменты............................................................................................................................42

3.1.5. Буферы и растворы........................................................................................................42

3.2. Методы..................................................................................................................................................44

3.2.1. Биоинформатические методы........................................................................44

3.2.2. Культивирование микроорганизмов............................................................45

3.2.3. Трансформация клеток Е. coli с применением СаС^............45

3.2.4. Выделение плазмидной ДНК из Е. coli....................................................46

3.2.5. Очистка плазмидной ДНК....................................................................................47

3.2.6. Манипуляции с ДНК....................................................................................................47

3.2.7. Создание конструкций для трансформации дрозофилы.. 50

3.2.8. Условия содержания дрозофилы..................................................................51

3.2.9. Трансформация эмбрионов дрозофилы....................................................51

3.2.10. Фенотипический анализ экспрессиирепортёрных

генов в трансгенных линиях....................................................................................................52

3.2.11. Вырезание фрагментов ДНК по механизму сайт-специфической рекомбинации in vivo..........................................................53

3.2.12. Выделение геномной ДНК из мух................................................................54

3.2.13. Саузерн-блот гибридизация............................................................................55

3.2.14. НЦР на матрице геномной ДНК................................................................57

3.2.15. Определение первичной последовательности ДНК и анализ полученных данных..................................................................................58

3.2.16. Гибридизация in situ................................................................................................58

4. РЕЗУЛЬТАТЫ..........................................................................................................................................61

4Л. Структурный анализ яоДНК (анализ in silico)..............................................61

4.1.1. Общая характеристика фрагмента EnvM4....................................61

4.1.2. Анализ гомологии последовательности EnvM4 у разных организмов............................................................................................................................62

4.1.3. Анализ особенностей нуклеотидного состава последовательности EnvM4............................................................................65

4.1.4. Анализ локализации эволюционно-консервативного участка фрагмента EnvM4 в генных доменах хромосом разных организмов........................................................................................................67

4.1.5. Анализ конформационных особенностей мест локализации фрагмента EnvM4 в геномах дрозофилы и мыши............69

4.1.6. Нуклеотидная последовательность EnvM4 и регуляторные элементы..................................................................................................................70

4.1.7. Нуклеотидная последовательность Ет>М4 и барьерные

элементы..............................................................................................................................71

4.2. Функциональный анализ яоДНК............................................................................74

4.2.1. Анализ барьерных свойств фрагмента ЕпуМ4................................75

4.2.2. Анализ регуляторных свойств фрагмента Ет>М4......................81

4.2.3. Анализ инсуляторных свойств фрагмента ЕпхМ4....................81

4.2.4. Анализ сайтов интеграции трансгенных конструкций

на хромосомах дрозофилы....................................................................................84

4.2.5. Анализ локализации участков, гомологичных ЕпуМ4, на хромосомах дрозофилы............................................................................................85

5. ОБСУЖДЕНИЕ........................................................................................................................................88

6. ВЫВОДЫ........................................................................................................................................................98

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................99

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат; БСА - бычий сывороточный альбумин; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; ДТТ - дитиотрейтол;

МДГ - мобильные диспергированные гены;

м.п.н. - миллионов пар нуклеотидов;

н. - нуклеотид;

п.н. - пар нуклеотидов;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

скДНК - фрагменты хромосомной ДНК, выделенные из

синаптонемного комплекса; срДНК - фрагменты хромосомной ДНК, выделенные из сердцевин

розеткоподобных структур; т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов; трис - трис (гидроксиметил) аминометан; ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

ялДНК - фрагменты хромосомной ДНК, выделенные из ядерной ламины;

яоДНК - фрагменты хромосомной ДНК, выделенные из ядерной оболочки;

АС - Accession (номер доступа в базе данных);

BAF - Barrier-to-Autointegration Factor;

BEAF32 - Boundary-Element-Associated Factor 32 kD;

CIAP - Calf Intestine Alkaline Phosphatase;

CP190 - Centrosomal Protein 190 kD;

ere - causes recombination;

CTCF - CCCTC-binding Factor;

FISH - Fluorescent in situ Hybridization; flp - flipase;

FRT - Flipase Recombination Target; HS4 - Hypersensitive Site 4; hsp70 - heat shock protein 70; INM - Inner Nuclear Membrane; LAD - Lamina-Associated Domain; LBR - Lamin B Receptor; LCR - Locus Control Region; LOX - Locus of Crossing over (X); LTR - Long Terminal Repeat; LB - Luria-Bertani;

MARs/SARs - Matrix/Scaffold Associated Regions;

mod(mdg4) - modifier of mdg4;

NPC - Nuclear Pore Complex;

ONM - Outer Nuclear Membrane;

PBS - Phosphate Buffer Saline;

ses - specialized chromatin structure;

SDS - Sodium Dodecyl Sulfate;

SIDD - Stress-Induced Duplex Destabilization;

SSC - Saline Sodium Citrate;

su(Hw) - Suppressor of Hairy wing;

TAE - Tris-Acetate-EDTA;

trl - Trithorax-like;

UCEs - UltraConserved Elements;

Wari - White-abutting resident insulator;

Zw5 - Zeste-white 5.

1. ВВЕДЕНИЕ

Регуляция экспрессии генов — один из основных молекулярных механизмов дифференцировки клеток и развития организма в целом. В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что этот процесс осуществляется на нескольких уровнях, первым из которых является хромосомный уровень, а последним, недавно установленным, — локализация хромосомы, хромосомного локуса или гена в 3-х мерном объёме ядра (Pai, Engelke, 2010; Montavon, Duboule, 2012). При этом главное внимание уделяется расположению этих структур по отношению к ядерной оболочке. Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что многие регуляторные процессы, связанные с функционированием генома, осуществляются на ядерной оболочке (Gerasimova et al., 2000; Byrd, Corees, 2003; Xu et al, 2004; Misteli, 2005; Akhtar, Gasser, 2007; Pickersgill et al., 2006; Guelen et al, 2008; Pai, Engelke, 2010; Zullo et al., 2012). Во многих исследованиях показано, что локализация хромосомного локуса около ядерной оболочки коррелирует с его неактивным состоянием, а перемещение внутрь ядра — с активным (Reddy et al., 2008; Finían et al., 2008; Shevelyov et al., 2009). Такой тип ассоциации хроматина с ядерной оболочкой можно отнести к функциональному типу. Наряду с этим, во многих работах показана "точечная" ассоциация с ядерной оболочкой, затрагивающая непротяжённые участки интерфазных хромосом (Tsanev, Tsaneva, 1986; Fais et al., 1989; Владимирская и др., 1998). Предполагается, что этот тип ассоциаций хромосом с ядерной оболочкой обуславливает внутриядерную локализацию хромосом/хромосомных областей в объёме ядра, где они формируют так называемые "хромосомные территории". При этом происходит разделение хромосомной ДНК на ряд доменов. По расчётам разных авторов, количество таких сайтов — десятки и сотни тысяч (Davies, Small, 1968; Онищенко, Ченцов, 1974; Lebkowski, Laemmli, 1982; Tsanev, Tsaneva, 1986; Paddy et al., 1990; Luderus et al., 1992). При этом возникает вопрос, могут ли участки

заякоривания интерфазных хромосом на ядерной оболочке выполнять какие-либо другие функции, помимо структурной (фиксации хромосом в объёме ядра)? Экспериментальные данные по этому вопросу отсутствуют, однако предполагается, что ген(ы), расположенный между двумя такими сайтами, может находиться в обособленном домене, что обуславливает возможность его функционирования вне зависимости от окружающих его других генов (Bell, Felsenfeld, 1999; Chambeyron, Bickmore, 2004; Goetze et al, 2005).

Ранее в нашей Лаборатории были выделены фрагменты хромосомной ДНК (Глазков и др., 1999) из фракции ядерных оболочек гепатоцитов мыши (яоДНК). Эти фрагменты были клонированы и секвенированы, установлено, что яоДНК являются белок-некодирующими нуклеотидными последовательностями. Гибридизационным методом была показана их эволюционная консервативность (Глазков и др., 1999) и их специфичное связывание с белками ядерной оболочки в системе in vitro (Глазков и др., 1998а). Методами биоинформатики показано, что фрагменты яоДНК отличаются от других структурных участков хромосом, в том числе и от MARs/SARs (Rogozin et al., 2000; Glazko et al., 2001). Среди коллекции фрагментов яоДНК наибольший интерес вызвал фрагмент EnvM4, т.к. он обладал наибольшей представленностью в коллекции (50%), а также наличием гомологии с геномом архебактерий.

Существование в эукариотической хромосоме доменов, имеющих разную степень компактизации (эухроматин, гетерохроматин), соседствование в хромосоме транскрипционно-активных и неактивных локусов привело к представлению о существовании специальных границ между такими хромосомными областями. По современным представлениям такими границами являются так называемые "барьерные элементы". Согласно одной из точек зрения, важную роль в их функционировании играет ядерная оболочка, однако механизм их действия остается неясным.

Изложенное выше свидетельствует о том, что ядерная оболочка — это не только структурный компонент ядра, но и полноценная функциональная

единица, участвующая в различных процессах. В связи с этим мы предполагаем, что последовательности ДНК, ассоциированные с ядерной оболочкой (яоДНК), могут играть в ядре не только структурную роль, но и выполнять дополнительные функции в разграничении хромосомных/генных доменов. Исследование этого вопроса является очень важным для понимания механизма прикрепления ДНК к ядерной оболочке, а также природы и функций барьерных элементов, и позволит расширить имеющиеся в настоящее время знания о структурно-функциональной организации эукариотических хромосом.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение структурно-функциональных характеристик участков хромосомной ДНК, обуславливающих прикрепление интерфазных хромосом к ядерной оболочке (яоДНК). В соответствии с целью в работе были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ нуклеотидной последовательности яоДНК методами биоинформатики;

2. Провести анализ барьерных свойств последовательности яоДНК;

3. Провести анализ регуляторных свойств последовательности яоДНК;

4. Провести анализ инсуляторных свойств последовательности яоДНК;

5. Определить особенности мест интеграции трансгенов и провести анализ мест локализации последовательности яоДНК на хромосомах Огояоркйа melanogaster.

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые было проведено исследование структурно-функциональных характеристик участков хромосомной ДНК, обуславливающих прикрепление интерфазных хромосом к ядерной оболочке.

В ходе данной работы был проведён анализ нуклеотидной последовательности яоДНК методами биоинформатики, определены

особенности её нуклеотидного состава, а также проведён сравнительный анализ яоДНК с другими последовательностями-претендентами на роль барьерных элементов хроматина. В составе яоДНК выявлены консервативные области, одна из которых представляет собой полипуриновый трек, обладающий гомологией до 100% с геномами различных объектов от бактерий до человека. Эти данные позволяют предполагать существование общего ("древнего") нуклеотидного мотива, обуславливающего прикрепление хромосомной ДНК к клеточной/ядерной оболочке. Также были выявлены конформационные особенности нуклеотидных последовательностей ДНК, располагающихся в непосредственной близости от участков, гомологичных EnvM4, в геномах Mus musculus и Drosophila melanogaster.

В данной работе впервые был проведён анализ функциональных характеристик яоДНК. Были получены линии мух, трансформированные генетическими конструкциями с различным взаимным расположением изучаемой последовательности и репортёрных генов. В результате было показано, что фрагмент яоДНК способен защищать фланкируемые трансгены от эффекта положения, при этом регуляторной функцией в транскрипции изучаемый фрагмент не обладает. Также наши результаты свидетельствуют о том, что последовательность яоДНК не является инсулятором, однако она может взаимодействовать с инсулятором Wari, что было также впервые показано в данной работе.

Методом FISH-анализа на политенных хромосомах дрозофилы было показано, что трансформированные конструкции локализуются в междисках хромосом. Также нами были изучены особенности локализации участков, гомологичных EnvM4, в геноме ^трансформированных мух. Обнаружено, что участки яоДНК в геноме дрозофилы располагаются на границах дисков/междисков политенных хромосом.

Полученные результаты имеют важное фундаментальное и прикладное значение. Они вносят весомый вклад в понимание структурно-функциональной организации эукариотических хромосом и могут быть

использованы при разработке технологии конструирования биологически безопасных трансгенов для нужд медицины и сельского хозяйства. Кроме того, представленные данные открывают ряд возможностей для дальнейших исследований яоДНК как мало изученной последовательности, участвующей в разграничении генных доменов.

Личный вклад автора. Биоинформатический анализ, а также молекулярно-генетические манипуляции с ДНК (клонирование, ПЦР и т.д.) осуществлялись автором лично. Трансформация эмбрионов дрозофилы проводилась в лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН. Первый эксперимент по Р-опосредованной трансформации эмбрионов дрозофилы был проведён совместно с к.б.н. Н. Г. Шостак; все последующие трансформации проводились автором лично. Генетические скрещивания и ведение линий дрозофилы также осуществлялись автором. Гибридизация in situ для определения локализации трансгенов на политенных хромосомах дрозофилы была проведена совместно с д.б.н. И. И. Киреевым (Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова). Остальные FISH-эксперименты выполнены автором лично.

Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая 2008), XV Школе "Актуальные проблемы биологии развития" (Звенигород, 19 - 24 октября 2008), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 21-27 июня 2009), International Moscow Conference on Computational Molecular Biology (Moscow, 20 - 23 July 2009), 21st International Wilhelm Bernhard Workshop on the cell nucleus (Ustron, 31 August -04 September 2009), Международной конференции "Хромосома 2009"

(Новосибирск, 31 августа - 06 сентября 2009), Конференции молодых ученых ИБР РАН (Москва, 2009), 14-й Международной пущинской школе-конференции молодых учёных "Биология — наука XXI века" (Пущино, 19 -23 апреля 2010), XVI Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 5-7 октября 2010), IV Международной школе молодых учёных по молекулярной генетике "Геномика и биология клетки" (Звенигород, 29 ноября - 3 декабря 2010), 22nd International Wilhelm Bernhard Workshop on the cell nucleus (Riga, 25 - 29 August 2011), 17-й Международной Пущинской школе-конференции молодых учёных "Биология — наука XXI века" (Пущино, 22 - 26 апреля 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, 4 из которых — статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК.

2.