Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная изменчивость Silybum Marianum(L.) Gaertn. в условиях интродукции на Среднем Урале

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная изменчивость Silybum Marianum(L.) Gaertn. в условиях интродукции на Среднем Урале"

На правах рукописи

КОШЕЛЕВА Елена Александровна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ БНУВиММАЫАЫиМ(Ъ.) ОАБЯТЫ. В УСЛОВИЯХ ИНТРОДУКЦИИ НА СРЕДНЕМ УРАЛЕ

03.02.01 - «Ботаника»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

17 АПР 2ОН

Новосибирск - 2014

005547087

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Ботаническом саду Уральского отделения Российской академии наук.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Шавнин Сергей Александрович.

Официальные оппоненты: Науменко Николай Иванович

доктор биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Курганский государственный университет», зав. кафедрой;

Жмудь Елена Викторовна, кандидат биологических наук, доцент, ФГБУН Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, старший научный сотрудник.

Ведущая организация: ФГБУН Ботанический сад-институт Уфимского научного центра Российской академии наук.

Защита диссертации состоится 27 мая 2014 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.058.01 при ФГБУН Центральном сибирском ботаническом саде СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101.

Факс: (383) 330-19-86. E-mail: botgard@ngs.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУН Центрального сибирского ботанического сада СО РАН. Сайт в Интернете: http://www.csbg.nsc.ru.

Автореферат разослан 4 апреля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н., с.н.с.

Ершова Эльвира Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Расторопша пятнистая (Silybum marianum (L.) Gaertn.) - это полиморфный вид семейства Asteraceae, произрастающий на территории влажного климата Средиземноморья. В интродукции с целью получения ценного лекарственного сырья данный вид выращивается и изучается в Украине и Сибири. Особое внимание ученых всех стран уделялось изучению химического состава плодов расторопши - уникального по своим компонентам (Jane М., 2000; Червяковский, 2001; Rudjabian Т., 2008; Цаприлова, 2008; Мазуренко, 2009; Hadaruga D.I., 2009; Щекатихина, 2010; Вовк, 2011; Юрьев, 2011 и др.). Однако мало обращалось внимания на изучение морфологической структуры расторопши в целом как растительной системы, так и, в частности, отдельных ее компонентов. Также не было выявлено исследований по вопросу взаимосвязи различного компонентного состава и его соотношения с морфоструктурой растения и причин, объясняющих данное явление. Выявленные проблемные вопросы являются необходимыми для решения фундаментальных и прикладных проблем биологии, фармакогнозии, физиологии и систематики вида. Таким образом, исследуемый вид является достаточно хорошо изученным с точки зрения химического состава и фармакологических свойств, но при этом слабо изучена морфология вида. Поэтому S. marianum представляет собой удобный объект для изучения закономерностей морфоструктуры растительной системы через изменчивость количественных и качественных признаков морфологических компонентов растения с их биохимическим составом.

Цель исследовании: анализ изменчивости и выявление закономерностей структурно-функциональной организации S. marianum в условиях Среднего Урала.

Задачи исследования:

1. Выявить основные закономерности формирования морфологической (фенотипической) структуры по комплексу качественных и количественных признаков побега, соцветия, плода, листа на примере четырех модельных групп (МГ) S. marianum',

2. Изучить динамику накопления биологически активных соединений в семенах и листьях S. marianum в зависимости от условий произрастания;

3. Изучить сезонный ритм развития S. marianum в разных условиях произрастания;

4. Создать алгоритм базы данных внутривидовой изменчивости S. marianum по морфологическим характеристикам в условиях интродукции на Среднем Урале.

Научная новизна. Впервые проведено изучение внутривидовой изменчивости морфологических параметров генеративной и вегетативной сферы S. marianum в интродукционном эксперименте (на примере г. Екатеринбурга и с. Байкалово Свердловской области). Выявлены ключевые признаки плодов, соцветий, листьев для установления принадлежности тех или иных растений S. marianum к определенной морфогенетической группе. Изучено накопление биологически активных соединений флаволигнанов в семенах, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в листьях разных морфогенетических групп S. marianum. Установлены закономерности накопления флаволигнанов в зависимости от морфометрической структуры генеративной сферы. Создана база данных по изменчивости качественных признаков вегетативной сферы S, marianum.

Практическая ценность работы. Результаты исследования вносят вклад в фундаментальные и прикладные аспекты медико-биологических наук, в частности - в решение проблемы формирования структурно-функциональной организации растительной системы, на примере S. marianum. Полученные данные по морфологической структуре вида позволяют выявлять наиболее перспективные для интродукции генотипы и группы особей для получения лекарственных форм сырья с разным накоплением биологически активных соединений. Показаны преимущества комплексного анализа морфологической и биохимической изменчивости вида S. marianum.

Основное положение, выносимое на защиту:

Ключевые признаки: окраска семенной кожуры, толщина слоев перикарпия, форма листа, опушение листовой пластинки, «колючесть» соцветия, опушение стебля позволяют прогнозировать накопление флавоноидов в листьях и флаволигнанов в плодах S. marianum.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на Всероссийской, с международным участием, конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. A.M. Горького «Биология будущего: традиции и инновации» (Екатеринбург, 2010), XVI Всероссийском Конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2011), XXIV Зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2012).

Личный вклад автора. Автором выполнена работа по закладке эксперимента на двух участках (г. Екатеринбург и с. Байкалово) и сбору материала для морфологического и биохимического анализа. Проведены лабораторные исследования (морфометрические измерения растений, органов и тканей, количественное определение флавоноидов в листьях и флаволигнанов в плодах расторопши пятнистой), а также статистический анализ данных, интерпретация и обобщение полученных результатов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Рукопись состоит из введения, 5 глав, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Диссертация изложена на 132 стр. машинописного текста, содержит 11 табл., 19 рисунков. Список литературы включает 176 работ, в том числе 21 на иностранных языках.

Благодарности: Автор глубоко признателен коллективу лаборатории Интродукции травянистых растений Ботанического сада УрО РАН, в частности -д.б.н. Шавнину С.А., к.б.н. Неуймину С.И., к.б.н. Васфиловой Е.С., Болотник Е.В. за всестороннюю помощь. Автор благодарен к.с-х.н. Флягину E.H. и Костициной М.В. за своевременную помощь и обсуждение результатов, а также к.х.н. Алексеевой Л.И. за проведенный ею ВЭЖХ-анализ и обсуждение полученных результатов.

Работа выполнена при финансовой поддержке проекта № 12-С-4-1028 и интеграционного проекта № 20 СО РАН «Адаптационные механизмы в природных и интродукционных популяциях растений Сибири и Урала» (г. Новосибирск) и Молодежного Гранта УрО РАН № 11-4-НП-344 «Мониторинг состояния интродукционных и естественных популяций рода Silybum Ь.и рода Prunella L. на Среднем Урале по изменчивости структурных и функциональных признаков» (г. Екатеринбург).

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ

В данной главе анализируются работы отечественных и зарубежных авторов, посвященные изучению структурно-функциональной изменчивости растений (Кренке, 1940; Синская, 1963, 2002; Кондратенко, 1975; Высочина, 1999; Корона, 2007; Ростова, 2009; Храмова, 2010). Подробно анализируются работы по структурно-функциональной организации растительной системы (Садовский, 1974; Малиновский, 1980; Урманцев, 1978) и рассматриваются основные тенденции развития структурно-функциональных классификаций (Злобин, 2009, 2012; Смирнов, 2007; Мамаев, 1972; Иванов, 2006 и др.). На основании обобщенных литературных данных определена актуальность проблемы исследования структурно-функциональной изменчивости S. marianum, выращенной в условиях интродукции на Среднем Урале.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей диссертационной работе проанализирован материал, собранный автором в период 2008-2011 гг. в условиях интродукции с двух участков: Ботанический сад УрО РАН г. Екатеринбург, Свердловской области, подзона южной тайги (участок 1) и опытный участок с. Байкалово Свердловской области, подзона северной лесостепи (участок 2).

В качестве исходного материала были использованы семена различного происхождения: семена интродукции Ботанического сада УрО РАН (МГ 1 и МГ 2), полученные с исследовательской станции лекарственных растений Национального Института здоровья (Япония), семена сорта «Дебют» селекции Средне-Волжского филиала ВИЛАР (МГ 3) и семена природной репродукции Краснодарского края (МГ 4). Каждая из указанных групп отличается по окраске семенной кожуры: МГ 1 -темные, МГ 2 - светлые, МГ 3 - черные, МГ 4 - пятнистые семена. Объем материала исследования составил по 400 особой из каждой группы.

Посев проводился на делянках площадью 1*8 м2 с нормой высева 9 семян на 1 м". Расстояние между растениями составляет 30 см, а в междурядьях - 50 см. В пределах каждой делянки изучаемые группы высеивались рендомизированно (случайным образом) в восьми повторностях.

В каждой точке сбора проводили отбор типичных особей S. marianum в фенофазе созревания плодов. Измеряли диаметр базальной части побега, высоту растения и число боковых побегов. С каждого растения срезали по 4-6 соцветий первого и второго порядков ветвления. Соцветия маркировали и оставляли на досушивание. Далее с помощью сканера Epson perfection 1270 полученный материал фотокопировали, после чего изображения обрабатывались в программе CorelDraw ХЗ. Измеряли следующие параметры: диаметр соцветия, длина колючек, длина и ширина листочков черепитчатой обертки первого и второго порядков, остистость и др. (рис. 1). Анализ проводили по 15 признакам и 5 последовательностям элементов признака генеративной сферы.

Каждое соцветие обмолачивалось, и полученные семена подвергались дальнейшей анатомо-морфологической обработке. Морфологический анализ семян проводили с использованием программного обеспечения ПО SIAMS MesoPlant (Петров и др., 2005). В качестве анализируемых количественных признаков были выбраны: длина семени, ширина семени, периметр семени, площадь семени и средняя проекция семени. Описание формы семян S. marianum проводили с помощью

3

параметров: фактор формы, фактор компактности и фактор удлинения. Для анатомического анализа были зафиксированы семена всех групп расторопши пятнистой в растворе глицерин - спирт - вода в соотношении 1:1:1. Срезы готовили вручную в четырех повторностях. Изучение объектов проводили с помощью микроскопа Leica DM 1000 (при увеличении х]0, х20, *40). Измерение характеристик тканей выполняли с использованием программного пакета AxioVision 4.8.

Рис. 1. Морфометрические признаки соцветия Silybum marianum (L.) Gaertn.: а - угол между листочками черепитчатой обертки [ порядка, b - угол между листочками черепитчатой обертки II порядка, с - длина шипа, d - длина основания листочка черепитчатой обертки I порядка, е - длина основания листочка черепитчатой обертки II порядка, / - длина листочка черепитчатой обертки I порядка, g - длина листочка черепитчатой обертки 11 порядка, h - ширина придатка листочка черепитчатой обертки i порядка, i - ширина придатка листочка черепитчатой обертки II порядка, J - площадь 1, к -площадь 2,1- площадь 3, т - площадь 4, D - диаметр соцветия.

Для формального выражения внутривидовой дифференциации S. marianum по вегетативной сфере оценивались следующие качественные и количественные признаки листьев: опушение листа, остистость, длина листа, ширина листа, угол наклона между основными жилками и др. (рис. 2). При этом «опушение» - это качественный признак, который измерялся в баллах. Морфометрический анализ проводили по 8 признакам и 8 последовательностям элементов признака вегетативной сферы. Общее количество измерений 10 ООО параметров у листьев S. marianum.

В дальнейшем полученные величины признаков семян, соцветий и листьев были формализованы с помощью математического алгоритма «Радикальный (интегральный) показатель системы сжатых отображений» (Рп ССО) (Неуймин и др., 2007, 2009).

Качественное определение состава флавоноидов осуществляли с помощью метода высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на оборудовании «Knauer» с использованием колонки MicrosorbT -100 А С18, элюента вода -ацетонитрил-тетрагидрофуран (80:20:6) при скорости элюирования 0.7 мл/мин, детектирование проводили при А.=336 нм. УФ-спектры флавоноидов снимали во время ВЭЖХ на оборудовании «Knauer». Количество рассчитывали методом абсолютной градуировки по лютеолину.

Рис. 2. Морфологические признаки листа Silybum marianum (L.) Gaertn.: a - ширина главной жилки, b - длина главной жилки, с - длина шипа, d - общая длина жилки II порядка, е, к -длина жилки III порядка, f— длина жилки II порядка, ш — ширина жилки II порядка.

ВЭЖХ фенолкарбоновых кислот осуществляли на оборудовании «Кпаиег»: насос Smartline 1000, детектор UV-VIS Smartline 2500, Х=250 нм с использованием колонки Microsorb™ -100 А С18, элюента вода- ацетонитрил-фосфорная кислота (85:15:0.05, по объему) при скорости элюирования 0.7 мл/мин. Количество фенолкарбоновых кислот рассчитывали методом абсолютной градуировки по галловой кислоте.

Количественное определение суммы флавоноидов в листьях S. marianum осуществляли с помощью метода спектрофотометрии по методике Б.В. Рогожина (2006) с использованием лимонно-борного реактива.

Количественное определение суммы флаволигнанов в плодах расторопши определяли с использованием методики Государственной фармакопеи (ВФС № 423380-99 «Плоды расторопши пятнистой»).

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью программы Microsoft Excel 2003 с использованием t-критерия Стьюдента.

Для характеристики частот Рп ССО использовали кластерный анализ по количественному сходству правила single Linkage (одиночной связи) или методом ближайшего соседа.

Частотный анализ комбинаций параметров «формовых» признаков семян проведен по методу JI.A. Животовского (Животовский, 1988). Показатель силы влияния факторов на результирующий признак рассчитывали по методу Н.А. Плохинского (1966, 1970) и Дж. Снедекора (1961) в изложении Г.Ф. Лакина (Лакин, 1990).

Для выявления взаимосвязи накопления БАВ и морфологических признаков использовали регрессионный анализ ПО STATISTICA 6.0.

ГЛАВА 3. ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННАЯ СТРУКТУРА ГЕНЕРАТИВНОЙ И ВЕГЕТАТИВНОЙ СФЕР 5Н. У В СМ МАШАШМ (Ь.) САЕШТЧ.

3.1 Исследование комплекса анатомо-морфологических признаков плодов ЗИуЬит тапапит (Т.) СаеПп.

Сравнительный анализ морфологического строения плодов разных морфогенетических групп ЯНуЬит тапапит (Ь.) СаеНп.

В результате исследований установлено, что для каждой группы плодов расторопши пятнистой, выделенных по окраске семенной кожуры, характерен свой комплекс диагностических морфологических признаков, по которым можно идентифицировать особи 5. тапапит. Так, МГ 1 и МГ 4, а также МГ 2 и МГ 3 имеют сходные значения по признаку длины семянки, в то время как по признаку ширины они имеют достоверные различия (р<0,02). Исключением является МГ 1 и МГ 2, которые сходны по ширине семянки (р=0,32), но различны по длине (р=0,01) (табл. 1).

Для оценки изменчивости анализируемых морфологических признаков был использован коэффициент вариации, который оценивали по шкале уровней изменчивости, предложенной С. А. Мамаевым (Мамаев С.А., 1975). Уровень изменчивости считается очень низким при СУ< 7 %, низким при СУ= 8-12 %, средним при СУ = 13-20 %, высоким при СУ = 21-40 % и очень высоким при СУ>40 %.

Таблица 1

Количественные показатели двух морфологических признаков плодов 577уЪпт таггапит (Ь.) ОаегШ.

Группа длина ширина

Х±ДХ, мм CV,% Х±АХ, мм CV,%

МГ 1 6,25±0,03 2,63 3,43±0,02 2,79

МГ 2 6,73±0,05 3,81 3,38±0,03 5,18

МГЗ 6,65±0,03 2,76 3,30±0,03 4,59

МГ 4 6,29±0,05 4,23 3,15±0,05 9,25

Установлено, что наиболее стабильным количественным признаком для всех четырех модельных групп 5. marianum является длина семени (CV<7 %), в то время как ширина семени имеет более широкий диапазон изменчивости (CV< 9 %) (табл. 2).

Каждая модельная группа S. marianum обладает характерным комплексом морфологических диагностических признаков. Так, все четыре модельные группы имеют достоверные различия по признакам площади (р<0,05) и диаметра (р<0,01). Однако МГ 1 и МГ 2 сходны по морфологическим признакам: периметр (р>0,05), фактор формы (р=0,31), фактор компактности (р=0,11) и фактор удлинения (р=0,42). МГ 3 и МГ 4 сходны по фактору формы (р=0,41), но при этом МГ 4 имеет достоверные различия по всем остальным признакам и параметрам (р<0,05).

Сравнительный анализ анатомического строения плодов разных модельных групп Silybum marianum (L.) Gaertn.

Сравнительный анализ анатомического строения четырех модельных групп S. marianum показал, что семенная кожура имеет общий план строения и сходные признаки внутренней структуры. Известно, что для семейства Asteraceae характерен

6

плод - семянка. На анатомическом срезе расторопши наблюдаются четко выраженные оболочки плода (перикарпий) и непосредственно оболочки семенной кожуры (рис. 3). Однако наибольшим значением для плодов расторопши является строение перикарпия (Куркин, 2010).

Рис. 3. Поперечный срез кожуры семянки ЭИуЬит таг1апит (Ь.) СаеЛп. (х20): 1 - остаток эндосперма, 2 - спавшиеся клетки паренхимы семенной кожуры, 3 - спавшиеся клетки паренхимы плода, 4 - склереиды, 5 - спавшиеся клетки эндокарпия, 6 - волокнистые клетки мезокарпия, 7 - пигментный слой, 8 - вытянутые клетки эпидермиса эндокарпия, 9 -кутикула; 1-4 - оболочки семенной кожуры, 5-9 - оболочки плода.

На рисунке 4 представлены основные слои перикарпия четырех МГ 5. тапапит, которые являются основными ключевыми признаками. Так, МГ 1 характерны сильноизвилистые толстостенные клетки эпидермиса, крупные округлые клетки пигментного слоя и рыхлый волокнистый слой. МГ 2 характеризуется плотно прилегающими в виде дуги толстостенными клетками эпидермиса, овальной формы клетками пигментного слоя и плотным слоем волокнистых клеток. МГ 3 по характеристикам однотипна МГ 2, в то время как МГ 4 подобна МГ 1.

Рис. 4. Анатомическое строение перикарпия ЗИуЬит таг1аппт (Ь.) ОаеЛп.: А - МГ 1, Б - МГ 2, С - МГ 3, Д - МГ 4.

В результате было выявлено, что МГ 1 достоверно отличается от остальных по толщине пигментного слоя (р<0,03), МГ 2 - по палисадоподобно вытянутым клеткам эпидермиса (р=0,03), МГ 3 - по спавшимся клеткам паренхимы плода (р<0,04), МГ 4 -

7

по спавшимся клеткам паренхимы семенной кожуры (р<0,0001). Однако при сравнении общей толщины всех исследуемых оболочек попарно выявили, что МГ 1 и МГ 4, также как МГ 2 и МГ 3 не имеют существенных различий.

3.2. Исследование комплекса морфологических признаков соцветий 5/7уЬит тапапит (Ь.) вае^п.

На основе сравнительного морфологического анализа четырех модельных групп Б. тапапит в двух географически разных точках (г. Екатеринбург и с. Байкалово), выделенных по интенсивности окраски и толщины семенной кожуры, были получены идентичные структурные характеристики соцветий. Это обусловлено тем, что диагностические признаки генеративных органов растений обладают низким уровнем изменчивости к экологическим и географическим факторам (Мамаев, 1973; Абдуллина, 2012).

Анализ показателей сходства по Л.А. Животовскому (1982), на основании которого проведен кластерный анализ, по совокупности качественных и количественных признаков не выявил связи с географической дифференциацией модельных групп.

В результате морфологического анализа были выделены 4 типа соцветий:

1. Соцветиям МГ 1 свойственны средние размеры конечных корзинок. Обертка шаровидная; листочки обертки черепитчатые, по краю с колючезубчатым придатком. Листочки черепитчатой обертки I порядка удлиненные, листовидный придаток узкий. Качественный признак «колючесть» - низкий (1 балла). Листочки черепитчатой обертки наружного и средних рядов находятся в одной плоскости.

2. Соцветия и их структурные элементы МГ 2 обладают небольшими размерами. Обертка узко-шаровидная. Листочки черепитчатой обертки I порядка широкие. Основание листочков черепитчатой обертки II порядка удлиненные. Листочки черепитчатой обертки наружного и средних рядов переходят в небольшой листовидный придаток, направленный вверх. Качественный признак «колючесть» -средний (3 балл).

3. Соцветия МГ 3 крупных размеров. Обертка широко-шаровидной формы. Листочки черепитчатой обертки I порядка (наружные) широкие с небольшим колючезубчатым придатком. Листочки черепитчатой обертки средних рядов располагаются близко друг к другу по всей окружности соцветия. Качественный признак «колючесть» - высокий (>5 баллов).

4. Соцветиям МГ 4 характерны крупные правильные соцветия. Листочки черепитчатой обертки I порядка разных размеров с явно выраженным или небольшим колючезубчатым придатком. Листочки черепитчатой обертки средних рядов с узким колючезубчатым придатком располагаются равномерно по всей окружности соцветия. Качественный признак «колючесть» - очень высокий (8 баллов).

Установлено, что каждая модельная группа расторопши пятнистой обладает отличительными морфолого-биологическими характеристиками, как на визуальном уровне, так и на уровне распределения альтернативных признаков. Наиболее значимыми признаками являются качественный признак «колючесть» и выделенный нами индекс площадей I и 11 порядков черепитчатой обертки, которые помогают идентифицировать особи 5. тапапит.

3.3. Исследование комплекса морфологических признаков листа Silybum marianum (L.) Gaertn.

В результате морфометрического анализа листьев была проанализирована структура листовой пластинки у четырех модельных групп S. marianum. Было проанализировано 50 листьев с каждой группы.

Выявлено, что для каждой модельной группы расторопши существуют свои характеристики листа:

1. Листья МГ 1 обладают небольшими размерами, сидячие. Хорошо выражена верхушка листа. Жилки II и III порядков практически одинаковых размеров. Доли листа между собой не перекрываются. Опушение слабое, представлено отдельными единичными редкими волосками (1 балл).

2. Листья МГ 2 плоские, сидячие, жесткие, рассечение долей слабое. Верхушка листа небольшая. Жилки II порядка удлиненные, а жилки III порядка укороченные. Опушение у основания листа интенсивное, а далее по жилкам редкие волоски (5 баллов).

3. Для листьев МГ 3 характерны средние размеры листа. Хорошо выражен черешок. Лист сильно рассечен. Доли листа волнистые. Жилки второго и последующих порядков заканчиваются длинным желтоватым шипом. Жилки II порядка укороченные, а жилки III порядка удлиненные. В основном, верхушка листа (конечная доля) округлой симметричной формы. Опушение листа - 3 балла, представлено длинными единичными волосками на черешке и жилках.

4. Для листа МГ 4 свойственны следующие признаки: лист крупных размеров, волнистый. Черешок выражен слабо. Доли листа сильно рассечены. Каждая жилка листа заканчивается удлиненным шипом. У основания и верхушки листа жилки II и III порядков равны, в срединной части - жилки II порядка удлиненные, а жилки III порядка укороченные. Опушение махровое, длинные волоски покрывают все жилки листа (9 баллов).

3.4. Основные характеристики побега Silybum marianum (L.) Gaertn.

Проанализировав основные метрические признаки побега четырех модельных групп S. marianum в течение 3-летних измерений можно выявить следующие закономерности для особей, произрастающих в г. Екатеринбург: во-первых, происходит уменьшение диаметра стебля у особей МГ 1, МГ 2, МГ 3. Во-вторых, у этих же модельных групп в 2010 году было отмечено наибольшее число боковых побегов. В-третьих, у особей МГ 1 и МГ 4 была зафиксирована положительная динамика роста параметра «высоты» побега, в то время как для МГ 2 и МГ 3 отмечена обратная зависимость.

Для особей, произрастающих на опытном участке с. Байкалово, было выявлено, что для побегов МГ 1 и МГ 3 наблюдается тенденция к уменьшению параметров «высоты» и «диаметра базальной части побега», но в 2010 году отмечено наибольшее число побегов. Для побегов МГ 2 и МГ 4 было отмечено увеличение всех показателей по всем исследуемым признакам от 2009 г. к 2011 г.

Следует отметить, что каждая модельная группа растений расторопши пятнистой имеет свои особенности роста и развития.

ГЛАВА 4. ОСОБЕННОСТИ НАКОПЛЕНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ЯПУВиММАША№М (Ь.) САЕГПТч'. В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ ПРОИЗРАСТАНИЯ

4.1. Качественный состав флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в листьях 8НуЬит тапапит (Ь.) СаегШ.

Для определения качественного состава флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в листьях расторопши пятнистой были приготовлены экстракты, которые анализировали методом обращено-фазовой ВЭЖХ.

При хроматографировании экстрактов листьев расторопши пятнистой выделено 7 пиков, флавоноидов и 6 пиков, соответствующих фенолкарбоновым кислотам, которые выбраны на основании сравнения значений времени удерживания веществ 1К на хроматограмме.

В результате анализа установлено, что каждая выделенная нами модельная группа имеет свои превалирующие компоненты по изучаемым веществам. Так, по содержанию флавоноидов, в листьях МГ 1 было обнаружено наибольшее содержание компонента 6 (29,4 %), наименьшее - компонента 7 (1,9 %). В листьях растений МГ 2 выявлено два максимально накапливающихся компонента — это компонент 6 (25 %) и компонент 5 (24,7 %), минимальным является - компонент 7 (2,5 %). Растениям МГ 3 характерно максимальное накопление компонента 5 (31,2 %), минимальное накопление - компонента 4 (5 %). Для листьев растений МГ 4 свойственно максимальное содержание компонента 5 (40,2 %) и минимальное содержание компонента 1 (2,9 %).

Для каждой группы растений было установлено различное максимальное накопление компонентов фенолкарбоновых кислот. Так, в листьях растений МГ 1 и МГ 3 накапливается компонент 6 (36,7 % / 27,2 % соответственно), для МГ 2 характерно накопление компонента 10 (31,2 %), МГ 4 накапливает компонент 11 (48,2 %).

Таким образом, для каждой модельной группы тапапит характерно различное соотношение компонентов флавоноидов и фенолкарбоновых кислот.

4.2. Количественное определение суммы флавоноидов в листьях и флаволигнанов в плодах ЗИуЬит тапапит (Ь.) СасгШ.

Для биохимического анализа по определению суммы флавоноидов были использованы листья расторопши пятнистой четырех модельных групп собранных из двух географических точек (участок 1 и участок 2) в фазе цветения. Исследование проводилось в течение двухлетнего периода 2010-2011 гг.

Таблица 2

Количественное содержание флавоноидов в листьях ШуЪит тапапит (Ь.) СаегТп.

Место сбора Год МГ 1 Х±ДХ, мг/г МГ 2 Х±ДХ, мг/г МГЗ Х±ДХ, мг/г МГ4 Х±ДХ, мг/г

Участок 1 2010 4,56±0,23 2,39±0,09 13,85±1,26 нет

2011 5,61±1,13 3,59±0,81 13,05±1,65 4,75±0,65

Участок 2 2010 6,35±1,02 4,12±0,24 13,96±1,27 Нет

2011 6,79±1,46 4,42±0,33 14,21 ±0,65 6,87±1,03

В результате спектрофотометрического анализа установлено, что накопление флавоноидов в листьях 5. тапапит 2010 года варьирует в интервале 4,12-13,96 мг/г (участок 2) и 2,39-13,85 мг/г (участок 1). В 2011 г. количество флавоноидов находится в диапазоне 4,42-14,21 мг/г (участок 2) и 3,59-13,05 мг/г (участок 1) (табл. 2).

Следует отметить, что вне зависимости от года и места произрастания, максимальное накопление флавоноидов в фазе цветения наблюдалось у МГ 3, которое соответствовало 13,05-14,21 мг/г. Минимальное накопление веществ выявлено в МГ 2, и составляло 2,39-4,42 мг/г. Также отмечено, что в с. Байкалово динамика накопления флавоноидов в листьях 5. тапапит по двум годам для каждой МГ изменялось незначительно, в отличие от полученных результатов по накоплению в г. Екатеринбурге.

Для количественного определения флаволигнанов нами было использовано фармакопейное сырье - плоды 5. тапапит, которые предварительно измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Исследование также проводили в течение двухлетнего периода 2009-2010 гг.

При анализе количественного содержания флаволигнанов в плодах 5. тапапит в 2009 г. были выявлены узкие диапазоны накопления: 3,13-3,96 мг/г в растениях с. Байкалово и 2,20-2,34 мг/г в растениях г. Екатеринбурга. В 2010 г. отмечено значительное повышение суммы флаволигнанов: 3,97-5,25 мг/г в растениях с. Байкалово и 3,02-4,68 мг/г в растениях г. Екатеринбурга (табл. 3).

Таблица 3

Количественное содержание флаволигнанов в плодах 5/7уЬит тапапит (Ь.) ОаеПп.

Место сбора Год МГ 1 Х-АХ, мг/г МГ 2 А=ДХ, мг/г МГЗ Х±ДХ, мг/г МГ 4 Х±АХ, мг/г

Участок 1 2009 2,34±0,03 2,20±0,03 нет нет

2010 4,68±0,02 3,02±0,01 4,00±0,03 4,23±0,01

Участок 2 2009 3,13±0,01 3,85±0,04 3,96±0,05 нет

2010 5,25±0,15 3,97±0,04 4,15±0,01 4,38±0,00

В целом, при сравнении средних значений количества флаволигнанов в плодах 5. тагиапит наблюдалось увеличение веществ в 2010 году и максимальное накопление обнаружено в плодах, полученных от растений, произрастающих в с. Байкалово Свердловской области. Скорее всего, это связано с климатическими и экологическими факторами. Как уже было отмечено, 2010 год характеризуется жарким летом с небольшим количеством осадков, в то время как в 2009 году в июне преобладала теплая погода с незначительными осадками, а июль выдался холодным с проливными дождями.

Фенологические наблюдения, проведенные нами на экспериментальных площадках, показали, что в течение 4-летнего исследования продолжительность фенофаз различается. Отмечено, что вид 5. тапапит в условиях Среднего Урала проходит весь цикл развития за один сезон, хотя по литературным данным известно, что расторопша пятнистая - это двулетнее растение (Куркин, 2010).

4.3. Связь внутривидовой изменчивости Silybum marianum (L.) Gaertn. по морфологическим признакам с биохимическими параметрами

Выявленные различия по содержанию биологически активных веществ показали, что выделенные нами модельные группы расторопши пятнистой по окраске семенной кожуры отличаются не только анатомическими, морфологическими, но и биохимическими параметрами, следовательно, их можно считать морфогенетическими группами (МГГ).

В ходе регрессионного анализа были получены три математические модели, позволяющие предположить возможные уровни связи накопления флаволигнанов с показателями толщины различных слоев семенной кожуры плода (табл. 4). Для оценки уровня связи признаков мы анализировали только вес значимых признаков (Beta).

Таблица 4

Коэффициенты регрессии между количеством флаволигнанов и толщиной слоев плода ВйуЪит тагшпит (Ь.) ОаеПп.

№ Признаки Multiple R R-squear Beta p-level

1 Пигментный слой 0,999 0,999 0,709 0,015

Слой волокнистых клеток 0,999 0,999 -0,570 0,019

2 Пигментный слой 0,998 0,997 1,060 0,030

Слой спавшихся клеток 0,998 0,997 -0,601 0,052

3 Слой волокнистых клеток 0,999 0,998 -1,715 0,026

Слой спавшихся клеток 0,999 0,998 1,212 0,038

Из приведенных результатов анализа в табл. 4 следует, что зависимость между биохимическим признаком - количество флаволигнанов и анатомическими признаками - пигментный слой и слой волокнистых клеток эндокарпия сильная (Я2>0,75).

Следует отметить, что в ходе регрессионного анализа из всех возможных вариантов комбинаций анатомических признаков были выделены три основные признака, а именно пигментный слой, слой волокнистых клеток эндокарпия и слой спавшихся клеток эндокарпия, которые относятся к оболочкам плода и именно они задействованы как основные резервы флаволигнанов в плодах расторопши пятнистой.

Из трех полученных вариантов регрессии наиболее подходящим для нашего исследования оказалась вторая модель, показывающая зависимость, что с увеличением толщины ткани «Пигментного слоя» происходит увеличение накопления флаволигнанов.

ГЛАВА 5. АЛГОРИТМ БАЗЫ ДАННЫХ ПО ВНУТРИВИДОВОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ПРИЗНАКОВ 8И.\В11ММАМА№М(Ь.) С.АЕКТГЧ.

В данной главе мы систематизировали полученные данные в виде классификатора по исследуемому растительному объекту. База данных позволяет упорядочить полученную информацию о внутривидовых таксонах, полиморфизме и изменчивости интродуцированного вида 5. тапапит, которая получена с помощью анатомических, морфологических, биохимических методов исследований. Кроме того, база данных обеспечит надежное хранение и легкий доступ к нужной информации специалистов широкого круга исследований.

База данных состоит из двух блоков: первый - информативный блок, включающий общую характеристику о виде в целом. В нем расписаны все возможные проявления морфологических признаков вида, а также указаны жизненная форма и паспортная информация; второй - представляет собой информацию о внутривидовой систематике вида, которая также разделяется на разделы.

5.1. Схема базы данных по внутривидовой изменчивости признаков

5ИуЬит тапапит (Ь.) Саег1п.

В данном пункте главы представлен первый раздел внутривидовой систематики, который проиллюстрирован в виде схемы по основным диагностическим качественным признакам. Нами были выбраны следующие морфологические признаки: форма листа, опушение нижней стороны листа и опушение стебля. Такой выбор признаков связан с возможностью сразу выделить одну из нескольких морфогенетических групп расторопши.

Так, первым идентифицирующим признаком является - форма листа. Для 5. тапапит выделено две формы: лист перистолопастной (МГГ 1, МГГ 2, МГГ 4) и лист перисторассеченный (МГГ 3). Следующим признаком является - опушение нижней стороны листа: волоски в виде щетинок (МГГ 1) и интенсивное опушение жилок листа (МГГ 2, МГГ 4). Завершающим признаком является - опушение стебля, который представлен в виде единичных волосков (МГГ 2) или мучнистого налета (МГГ 4).

Таким образом, для каждой морфогенетической группы 5. тапапит выделен свой диагностический признак помогающий идентифицировать особи исследуемого вида.

5.2. Общая характеристика морфогенетических групп вида ЗНуЬит

тапапит (Ь.) Г;аег(п.

Второй раздел внутривидовой систематики подразумевает собой характеристику каждой морфогенетической группы 5'. тапапит в определенной последовательности. Так, для каждого таксона предоставляется информация о названии и происхождении, далее дается морфологическая характеристика плода, соцветия, листа и побега.

Морфогенетическая группа 1 - Стебель обычно до 1,3-1,5 м высотой, темно-зеленый со светлыми на тон полосами. По всей высоте стебля располагаются тяжи белых волокон. Верхняя часть стебля покрыта белыми волокнистыми тяжами - 5 баллов.

Лист небольших размеров, перистолопастной, несимметричный, при этом одна сторона листа больше другой. Хорошо выражена верхушка листа. Доли листа между

собой не перекрываются. Соотношение белого к зеленому на поверхности листа - 5 баллов (белого мало и полосы размыты). Главная жилка листа у основания опушена длинными разреженными волосками - 3 балла. На нижней стороне листа единичные длинные волоски. В основном волоски выражены в виде щетинок.

Соцветия средних размеров. Обертка шаровидная; листочки обертки черепитчатые, по краю с колючезубчатым придатком. Листочки черепитчатой обертки I порядка удлиненные, листовидный придаток узкий. Качественный признак «колючесть» - низкий (1 балла). Листочки черепитчатой обертки наружного и средних рядов широкие и короткие, подняты вверх и находятся в одной плоскости.

Интродуцированная морфогенетическая группа расторопши пятнистой Ботанического сада УрО РАН. В интродукцию поступила с 2002 года из Японии.

Морфогенетическая группа 2 - Стебель достигает 1,4-1,5 м в высоту, темно-зеленый, ребристый с единичными белыми волосками. Верхняя часть стебля темно-зеленая с белыми волокнами.

Лист перистолопастной, плоский, жесткий, несимметричный, разделение на доли слабое. Верхушка листа небольшая. Соотношение белого к зеленому на поверхности листа - 3 балла. Опушение листа - 5 баллов. У основания листа опушение более интенсивное, а по всей длине расположены редкие волоски. На нижней стороне листа также интенсивное опушение, волоски длинные.

Соцветие небольших размеров. Обертка узко-шаровидная. Листочки черепитчатой обертки I порядка широкие. Основание листочков черепитчатой обертки II порядка удлиненное. Листочки черепитчатой обертки наружного и средних рядов переходят в небольшой листовидный придаток, направленный вверх. Качественный признак «колючесть» - средний (3 балл).

Интродуцированная морфогенетическая группа расторопши пятнистой Ботанического сада УрО РАН. В интродукцию поступила в 2002 г. из Японии.

Морфогенетическая группа 3 - Стебель достигает 2 м в высоту, темно-зеленый с более светлыми полосами. По всему стеблю располагаются белые волокнистые тяжи. В верхней части стебля опушение войлочного типа, белое - 3 балла.

Лист перисторассеченный, несимметричный, одна доля больше другой. Черешок у листа голый, без волосков. Доли листа волнистые. Жилки второго и последующих порядков заканчиваются длинным желтоватым шипом. Жилки II порядка укороченные, а жилки III порядка удлиненные. В основном верхушка листа (конечная доля) округлой симметричной формы. Опушение листа - 3 балла, представлено длинными единичными волосками на черешке и жилках.

Соцветия крупных размеров. Обертка широко-шаровидной формы. Листочки черепитчатой обертки I порядка (наружные) широкие с небольшим колючезубчатым придатком. Листочки черепитчатой обертки средних рядов располагаются близко друг к другу по всей окружности соцветия. Качественный признак «колючесть» -высокий (>5 баллов).

Данная морфогенетическая группа - сорт «Дебют» является стандартным образцом расторопши пятнистой. В Ботаническом саду вошла в интродукцию с 2008 г.

Морфогенетическая группа 4 - Стебель обычно достигает 2-2,25 м в высоту, широкий в диаметре, ребристый, светло-зеленый с белыми полосками (жилками). На всей поверхности стебля располагается мучнистый налет. В верхней части стебель покрыт полосками из белых волокон - 9 баллов.

Лист крупных размеров, волнистый с симметричными долями. Черешок выражен слабо. Доли листа сильно рассечены. Каждая жилка листа заканчивается

удлиненным шипом. Опушение махровое - 9 баллов. На нижней стороне листа длинные волоски, расположенные по главным жилкам листа.

Соцветия крупные, шаровидные, в плоскости образуют круг. Листочки черепитчатой обертки I порядка разных размеров с явно выраженным или небольшим колючезубчатым придатком. Листочки черепитчатой обертки средних рядов с узким колючезубчатым придатком, располагаются равномерно по всей окружности соцветия. Качественный признак «колючесть» - очень высокий (8 баллов).

Дикий тип расторопши пятнистой, произрастающий в Краснодарском крае. В интродукцию Ботанического сада УрО РАН введен с 2010 г.

Таким образом, полученный классификатор в форме базы данных позволяет оценить степень изменчивости вида S. marianum, что способствует сохранению и воспроизводству наиболее ценных морфогенетичеСких групп расторопши, тем самым сохраняя генетические ресурсы вида. А также способствует развитию и усовершенствованию внутривидовой систематики, что является необходимым условием успешного изучения биоразнообразия растений (Князева, 2007).

ВЫВОДЫ

1. Каждая выделенная морфогенетическая группа S. marianum обладает отличительными морфолого-биологическими характеристиками генеративной и вегетативной сфер. Так, наиболее значимыми признаками для плода являются слои перикарпия, для соцветия - качественный признак «колючесть» и выделенный нами индекс площадей I и II порядков листочков черепитчатой обертки, для листа - форма листа, характер опушения листа и длина жилок II и III порядков, для побега -опушение стебля и высота растения.

2. Сравнительный анатомо-морфологический анализ плодов S. marianum по совокупности признаков показал, что наиболее стабильным количественным признаком для всех четырех МГГ Silybum marianum, отличающихся по окраске семенной кожуры (МГГ 1 - темные, МГГ 2 - светлые, МГГ 3 - черные, МГГ 4 -пятнистые семена), является длина плода (CV<7%), в то время как ширина плода имеет более широкий диапазон изменчивости (CV=2-9%).

3. Установлено, что S. marianum в условиях Среднего Урала проходит весь цикл развития за один сезон, успешно цветет и плодоносит, хотя по литературным данным известно, что расторопша пятнистая - это двулетнее растение.

4. В результате обращено-фазовой ВЭЖХ экстрактов листьев S. marianum было выявлено, что для каждой выделенной морфогенетической группы характерны различные превалирующие компоненты флавоноидов и фенолкарбоновых кислот. Так, по содержанию флавоноидов в листьях МГГ 1 было обнаружено наибольшее содержание компонента 6 (29,4%), МГГ 2 - компоненты 6 (25%) и 5 (24,7%), МГГ 3 и МГГ 4 - компонент 5 (31,2% / 40,2% соответственно). По содержанию фенолкарбоновых кислот в растениях МГГ 1 и МГГ 3 выявлен компонент 6 (36,7% / 27,2% соответственно), МГГ 2 - компонент 10 (31,2%), МГГ 4 - компонент 11 (48,2 %).

5. В результате спектрофотометрического анализа установлено, что накопление флавоноидов в листьях расторопши пятнистой 2010 года варьирует в интервале 4,1213,96 мг/г в растениях подзоны северной лесостепи и 2,39-13,85 мг/г в растениях подзоны южной тайги. В 2011 г. количество флавоноидов соответствовало диапазону 4,42-14,21 мг/г в растениях подзоны северной лесотепи и 3,59-13,05 мг/г в растениях подзоны южной тайги. Выявлено, что вне зависимости от года и места произрастания

максимальное накопление флавоноидов в фазе цветения наблюдалось у растений МГГ 3, которое соответствовало 13,05-14,21 мг/г. Минимальное накопление веществ выявлено в растениях МГГ 2 и составило 2,39-4,42 мг/г.

6. При анализе количественного содержания флаволигнанов в плодах S. mariamim в 2009 г. были выявлены узкие диапазоны накопления: 3,13-3,96 мг/г в растениях подзоны северной лесостепи и 2,20-2,34 мг/г в растениях подзоны южной тайги. В 2010 г. отмечено значительное повышение суммы флаволигнанов: 3,97-5,25 мг/г в растениях подзоны северной лесостепи и 3,02-4,68 мг/г в растениях подзоны южной тайги.

7. Обнаружено, что при раннем зацветании S. marianum и при продолжительной фазе цветения происходит максимальное накопление флавоноидов в листьях и флаволигнанов в плодах расторопши пятнистой.

8. В результате регрессионного анализа были получены 3 математические модели, позволяющие предположить возможные уровни связи накопления флаволигнанов с показателями толщины различных слоев семенной кожуры: модель 1 - взаимосвязь пигментного слоя со слоем волокнистых клеток, модель 2 -пигментного слоя со слоем спавшихся клеток, модель 3 - слой волокнистых клеток со слоем спавшихся клеток. Из трех возможных типов взаимосвязи наиболее адекватной является следующая зависимость: с увеличением толщины ткани «Пигментного слоя» происходит увеличение накопления флаволигнанов.

9. В основе базы данных по внутривидовой изменчивости вида S. marianum лежат три наиболее значимых качественных признака: форма листа, опушение нижней стороны листа и опушение стебля, которые позволяют быстро и точно идентифицировать по этим критериям растения расторопши пятнистой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Шавнин, С.А. Использование закономерностей морфологических элементов при анализе измеряемых характеристик биологических объектов (на примере Silybum marianum (L.) Gaertn.) / C.A. Шавнин, С.И. Неуймин, A.A. Монтиле, Е.А. Кошелева, А.И. Монголе // Научно-практический журнал «Вестник ИрГСХА». Выпуск 44. - Иркутск, 2011. - С. 139-149.

2. Болотник, Е.В. Содержание веществ фенольной природы рода Prunella L. и рода Silybum L. в условиях интродукции на Среднем Урале / Е.В. Болотник, Е.А. Кошелева, A.A. Ермошин // Аграрный вестник Урала. - 2012. - № 7 - С. 22-24.

3. Кошелева, Е.А. Структурные особенности соцветий морфогенетических групп Silybum marianum (Asteraceae), произрастающих в условиях интродукции в Сибири и на Урале / Е.А. Кошелева, Е.К. Комаревцева, В.А. Черемушкина, С.И. Неуймин // Растительный мир Азиатской России.-2014.-№ 1(13). — С. 19-24.

В других изданиях:

1. Кошелева, Е.А. Теоретические и практические аспекты паспортизации биоразнообразия (на примере Silybum marianum (L.) Gaertn.) / Е.А. Кошелева, С.И. Неуймин // Труды Института биоресурсов и прикладной экологии. Выпуск 9: V Всероссийская научно-практическая конференция «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий». Оренбург, 7-10 июня 2010 г.: сборник статей / Оренбург: Изд-во ОПТУ, 2010. -С. 139-149.

2. Кошелева, Е.А. Новый подход к выделению конструктивных элементов признака с целью инвентаризации формового разнообразия на примере Silybum marianum (L.) Gaertn. / Е.А. Кошелева, С.И. Неуймин // Биология будущего: традиции и инновации: Материалы

Всероссийской, с международным участием, конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. A.M. Горького, Екатеринбург, 2528 октября, 2010 г. - Екатеринбург: Изд-во АМБ, 2010. - С. 63-64.

3. Кошелева, Е.А. Анализ накопления биологически активных соединений в Silybum mariamim (L.) Gaerth. в зависимости от условий произрастания / Е.А. Кошелева // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIV Зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - Москва, 2012.-С. 28.

4. Болотник, Е.В. Основные принципы выделения диагностических признаков на примере видовых представителей семейств Lamiaceae и Asteraceae в условиях интродукции в Ботаническом саду УрО РАН / Е.В. Болотник, Е.А. Кошелева // «Биология, химия, физика: вопросы и тенденции развития»: материалы международной заочной научно-практической конференции. (01 февраля 2012 г.) - Новосибирск: Изд. «ЭКОР-книга», 2012. - С. 22-27.

5. Кошелева, Е.А. Динамика накопления флавоноидов в листьях Silybum marianum (L.) Gaerth. в условиях интродукции на Среднем Урале / Е.А. Кошелева // Материалы докладов II всероссийской (XVII) молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (в 2 томах). Том I. Биологические науки (XX Всероссийская молодежная конференция «Актуальные проблемы биологии и экологии»). Физиология человека и животных. Медицина и здравоохранение. Фундаментальные науки - медицине (Сыктывкар, Республика Коми, Россия, 22-26 апреля 2013 г.). Сыктывкар, 2013. - С. 62-63.

6. Кошелева, Е.А. Изменчивость качественного состава фенолкарбоновых кислот в листьях Silybum marianum (L.) Gaertn. / Е.А. Кошелева, JI.И. Алексеева // Химия и технология растительных веществ: Тезисы докладов VIII Всероссийской научной конференции. Сыктывкар-Калининград, 2013. - С. 118.

Подписано в печать 02.04.2014 г. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 104 ФГБОУ ВПО «Уральский государственный лесотехнический университет». Отдел оперативной полиграфии. 620100, г. Екатеринбург, Сибирский тракт, 37

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кошелева, Елена Александровна, Екатеринбург

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

НАУКИ

БОТАНИЧЕСКИЙ САД

УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201457799

КОШЕЛЕВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА

СТРУКТУРНО - ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЯП УВиМ МАМАШМ (Ь.) САЕЫт В УСЛОВИЯХ ИНТРОДУКЦИИ НА

СРЕДНЕМ УРАЛЕ

Специальность 03.02.01 - «Ботаника»

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор С.А. Шавнин

Екатеринбург - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение..............................................................................................................................................................4

Глава 1. Основные подходы к изучению структурно-функциональной

изменчивости растений..........................................................................................................................9

1.1. Историческая справка изучения «изменчивости»................................................9

1.2. Основные тенденции развития структурно-функциональных классификаций растений........................................................................................................................16

1.3. Структурно-функциональная организация растительной системы... 18 Глава 2. Материалы и методы исследования..................................................................21

2.1. Объект исследования....................................................................................................................21

2.1.1. Ботаническая характеристика вида БПуЬит тапапит (Ь.) ваейп.. 21

2.1.2. Ареал БПуЬит тапапит (Ь.) Оаейп..............................................................................23

2.1.3. Химический состав БИуЬит тапапит (Ь.) ваейп........................................24

2.2. Полевые исследования и камеральная обработка материала..................26

2.3. Материал исследования..............................................................................................................29

2.4. Методика сбора материала и анатомо-морфологический анализ... 31

2.5. Определение состава вторичных метаболитов......................................................33

2.6. Методика математической обработки..........................................................................36

2.6.1. Математический алгоритм «Радикальный показатель системы сжатых отображений» (Рп ССО) анализа качественных и количественных морфологических признаков............................................................36

2.6.2. Анализ взаимосвязи анатомо-морфологических признаков с биохимическими параметрами......................................................................................................38

Глава 3. Пространственно-временная структура генеративной и

вегетативной сфер 57/уЪит тапапит (Ь.) Оаейп..............................................................40

3.1. Исследование комплекса анатомо-морфологических признаков плодов БИуЬит тапапит (Ь.) Оаейп........................................... 41

3.2. Исследование комплекса морфологических признаков соцветий

57/уЪит тапапит (Ь.) Оаейп..................................................... 50

3.3. Исследование комплекса морфологических признаков листа БИуЬит тапапит (Ь.) ОаеЛп....................................................... 58

3.4. Основные характеристики побега ШуЬит тапапит (Ь.) Оаейп.... 63

Глава 4. Особенности накопления фенольных соединений БИуЬит тапапит (Ь.) Оаейп. в зависимости от условий произрастания......... 68

4.1. Качественный состав флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в листьях БПуЬит тапапит (Ь.) ваеЛп........................................... 70

4.2. Количественное определение суммы флавоноидов в листьях и флаволигнанов в плодах ЗИуЬит тапапит (Ь.) Оаейп........................................76

4.3. Сезонное развитие БИуЪит тапапит (Ь.) ваейп...................... 79

4.4. Связь внутривидовой изменчивости по морфологическим признакам с биохимическими параметрами..................................... 83

Глава 5. Алгоритм базы данных по внутривидовой изменчивости БИуЪит тапапит (Ь.) ваейп..................................................... 86

5.1. Схема базы данных по внутривидовой изменчивости признаков БИуЪит тапапит (Ь.) ваейп..................................................... 88

5.2. Общая характеристика морфогенетических групп вида БИуЬит тапапит (Ь.) Оаейп................................................................. 91

Выводы................................................................................................. 94

Список используемой литературы............................................... 96

ПРИЛОЖЕНИЕ...................................................................... 116

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. В современном мире остро стоит проблема сохранения биологического разнообразия лекарственных растений в связи с нерациональным использованием сырьевых ресурсов. Важнейшими центрами, занимающимися этой проблемой, являются Ботанические сады. При этом одним из приоритетных направлений их деятельности является интродукция, то есть введение в культуру растений видов, имеющих небольшие природные ареалы, а также видов не местной флоры, находящихся на грани исчезновения с целью сохранения их генофонда через культивирование.

Для комплексного изучения состояния интродуцентов на территории Ботанических садов используют следующие методы исследования: изучение ритмов роста и развития, особенности морфо- и онтогенеза, особенности репродуктивной биологии и сравнительной анатомии. В основном большинство этих методов основывается на исследовании изменчивости морфологических и биохимических признаков на популяционном, видовом или организменном уровнях, что позволяет собрать большой статистический материал для планирования долгосрочного содержания растительных коллекций.

В последнее время наиболее актуальными в этом направлении становятся

и

исследования внутривидового разнообразия лекарственных растений с целью выявления наиболее продуктивных форм с заданным накоплением биологически активных веществ.

В связи с этим, объектом исследования был выбран полиморфный вид расторопша пятнистая (8ИуЪит тапапит (Ь.) ОаегШ.) семейства сложноцветные (Аз1егасеае), произрастающий на территории Средиземноморья. В интродукции, а в частности с точки зрения промышленного возделывания, с целью получения ценного лекарственного сырья, данный вид выращивается и изучается на Украине и в Сибири. Особое

внимание отечественными и зарубежными учеными уделяется изучению химического состава плодов расторопши. Известно, что в плодах расторопши содержится уникальная группа фенольных соединений - флаволигнаны, которые обладают антиоксидантными и гепатопротекторными свойствами. На ее основе создан ряд препаратов европейского и российского производства: Силибор (Россия), Силимар (Россия), Легалон (Германия), Карсил (Болгария) и др. Однако, следует отметить, что расторопша в основном является объектом изучения медицинских и сельскохозяйственных наук, поэтому остается ряд не решенных вопросов, затрагивающих фундаментальные проблемы биологии. Отсутствие исследований по морфологической структуре, а также взаимосвязи содержания биологических активных соединений с морфоструктурой растения

делает этот вид оптимальным для исследований по изучению закономерностей

» <

изменчивости морфоструктуры растения и биохимической пластичности вида.

Цель и задачи исследования. Цель работы - анализ изменчивости и выявление закономерностей структурно-функциональной организации расторопши пятнистой (БПуЬит тапапит (Ь.) ваегШ.) в условиях Среднего Урала.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Выявить основные закономерности формирования морфологической (фенотипической) структуры по комплексу качественных и количественных признаков побега, соцветия, плода, листа на примере четырех модельных групп (МГ) тапапит;

2. Изучить динамику накопления биологически активных соединений в семенах и листьях тапапит в зависимости от условий произрастания;

3. Изучить сезонный ритм развития тапапит в разных условиях произрастания.

4. Создать алгоритм базы данных внутривидовой изменчивости тапапит по морфологическим характеристикам в условиях интродукции на Среднем Урале.

Основное положение, выносимое на защиту:

Ключевые признаки: окраска семенной кожуры, толщина слоев перикарпия, форма листа, опушение листовой пластинки, «колючесть» соцветия, опушение стебля позволяют прогнозировать накопление флавоноидов в листьях и флаволигнанов в плодах 5". тапапит.

Научная новизна. Впервые проведено изучение внутривидовой изменчивости морфологических параметров генеративной и вегетативной сферы 51. тапапит в интродукционном эксперименте в двух точках (на примере г. Екатеринбурга и с. Байкалово, Свердловской области). Выявлены ключевые признаки плодов, соцветий, листьев для установления принадлежности тех или иных растений Б. тапапит к определенной морфогенетической группе. Изучено накопление биологически активных соединений флаволигнанов в семенах, флавоноидов и фенолкарбоновых кислот в листьях разных групп тапапит. Установлены закономерности накопления флаволигнанов от морфометрической структуры генеративной сферы. Создана база данных по изменчивости качественных признаков вегетативной сферы 51. тапапит.

Теоретическое и практическое значение. Результаты исследования вносят вклад в фундаментальные и прикладные аспекты медико-биологических наук, в частности - в решение проблемы формирования структурно-функциональной организации растения, на примере 5". тапапит. Полученные данные по морфологической структуре вида позволяют выявлять наиболее перспективные для интродукции генотипы и группы особей для получения лекарственных форм сырья с разным накоплением биологически активных соединений. Показаны преимущества комплексного анализа морфологической и биохимической структуры вида 5. тапапит.

Личный вклад автора. Автором выполнена работа по закладке эксперимента в двух точках (г. Екатеринбург и с. Байкалово) и по сбору материала для морфологического и биохимического анализа. Автор лично выполнил лабораторные исследования (морфометрические измерения,

анатомические срезы плодов, количественное определение флавоноидов в листьях и флаволигнанов в плодах расторопши пятнистой), статистический анализ данных, интерпретацию и обобщение полученных результатов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на Всероссийской, с международным участием, конференции молодых ученых, посвященной 90-летию Уральского государственного университета им. A.M. Горького «Биология будущего: традиции и инновации» (Екатеринбург, 2010), XVI Всероссийском Конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2011), XXIV Зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2012).

По теме диссертации было выполнено 5 дипломных проектов кафедрой ботаники и фармакогнозии Уральской Государственной Медицинской Академии: «Сравнительная оценка фармакологических свойств у различных генетических форм расторопши пятнистой (Silybum marianum L.)» (2009), «Динамика накопления флавоноидов в семенах расторопши пятнистой {Silybum marianum (L.) Gaertn.)» (2011), «Анализ накопления БАС в новом для фармакопеи сырье Silybum marianum (L.) Gaertn.» (2011), «Сравнительный анализ фенольных соединений в проростках расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn.)» (2012), «Оценка качества сырья расторопши пятнистой {Silybum marianum (L.) Gaertn.), поступающего в аптечную сеть» (2012).

Благодарности. Автор глубоко признателен коллективу лаборатории Интродукции травянистых растений Ботанического сада УрО РАН, в частности - д.б.н. Шавнину С.А., к.б.н. Неуймину С.И., к.б.н. Васфиловой Е.С., Болотник Е.В. за всестороннюю помощь. Автор благодарен к.с-х.н. Флягину E.H. и Костициной М.В. за своевременную помощь и обсуждение результатов, а также к.х.н. Алексеевой Л.И. за проведенный ею ВЭЖХ-анализ и обсуждения полученных по нему результатов.

Работа выполнена при финансовой поддержке проекта № 12-С-4-1028 и интеграционного проекта № 20 СО РАН «Адаптационные механизмы в природных и интродукционных популяциях растений Сибири и Урала» (г. Новосибирск) и Молодежного Гранта УрО РАН № 11-4-НП-344 «Мониторинг состояния интродукционных и естественных популяций рода Silybum Ь.и рода Prunella L. на Среднем Урале по изменчивости структурных и функциональных признаков» (г. Екатеринбург).

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ

1.1. Историческая справка изучения «изменчивости»

Одной из основных проблем в биологии является проблема сохранения и изучения биологического разнообразия. В течение всей научно-исследовательской деятельности постоянно происходит поиск общих законов, управляющих естественным разнообразием и математически точному описанию морфологических закономерностей (Васильев и др., 2009).

Изучение изменчивости имеет первостепенное практическое значение. Еще Дарвин указал, что эволюция немыслима без изменчивости, и поэтому изучение фактов, относящихся к изменчивости, есть составная часть изучения эволюции (Майр, 1947).

В ходе развития биологической науки было сделано много попыток собрать, каталогизировать, классифицировать различные проявления изменчивости в природе (Филипченко, 1927). Так, Ю.А. Филипченко (1978) выделил две категории изменчивости: индивидуальная и групповая. В первом случае речь идет об отличиях между особями даже в однородном материале, а

и I . I .

во втором - о различиях между группами особей, всегда относящихся к одному виду (Филипченко, 1978). Автор отмечал неясность разграничения индивидуальной и групповой изменчивости. Дело в том, что в понятие изменчивости входят два различных элемента: чисто статистический и динамический. Статистический элемент подразумевает рассмотрение изменчивости как известное состояние, а динамический - изменчивость как процесс. При этом каждое состояние возникает в результате известного процесса: все индивидуальные и групповые отличия, которые мы наблюдаем, возникли под влиянием тех или иных причин. Таким образом, мы переходим к изучению динамики изменчивости и говорим об изменчивости как о процессе (Филипченко, 1978).

П.В. Терентьевым (1957) была предложена своя классификация изменчивости: топографическая (географическая), морфическая (связана с экологическими условиями и определенными стадиями развития) и неопределенная (подчиняется нормальной кривой изменчивости).

Особое внимание изучению изменчивости растений внутри вида уделяла E.H. Синская (1963, 2002). Она указывает на наличие следующих категорий изменчивости: флюктуации, обратимые колебания приспособительного характера, клональная изменчивость, возрастная изменчивость, изменчивость вследствие нарушения гомеостазиса растительного организма, групповая изменчивость, гибридизационная и интрогрессивная изменчивость, рядовая, скрытая и явная изменчивость, географическая и экологическая изменчивость (Синская, 1938, 1948, 1963,2002).

По мнению С.А. Мамаева (1972), основная цель в классификации феномена изменчивости заключается в выявлении закономерности структурообразовательных процессов. Им были выделены следующие формы изменчивости: индивидуальная, половая, хронографическая, экологическая, географическая, гибридогенная; и следующие три основных критерия изменчивости: изменчивость структурных признаков, изменчивость функциональных признаков и изменчивость качественных (химических) признаков (Мамаев, 1972).

Наиболее значимыми являются изучение индивидуальной и групповой изменчивости в пределах вида. Одним из ведущих исследователей внутривидовой изменчивости является Н.И. Вавилов, который на основе фактического материала по параллельной изменчивости морфологических и физиологических признаков дикорастущих и культурных растений поставил задачу систематизации явлений внутривидовой изменчивости и сформулировал выявленные закономерности в «Закон гомологичных рядов в наследственной изменчивости» (Вавилов, 1920). По его мнению, при сравнении генетически близких видов и родов каждый из них может быть охарактеризован комплексом

неварьирующих признаков, присущих всем формам и особям, входящим в состав данного вида. Для условного описания этого комплекса признаков, постоянных в пределах вида или рода и отражающих его морфологическую, физиологическую и генетическую специфику, но отличающих его от других видов и родов, Н.И. Вавилов (1920) предложил назвать «радикал». Таким образом, радикал - это постоянные признаки вида, по которым легче всего распознать принадлежность растения к тому или иному виду (Синская, 2002).

К закону Вавилова постоянно возвращаются современники, которые пытаются модернизировать его или сформулировать свой закон для объяснения полученных закономерностей в своих исследованиях (Филипченко, 1925; Кренке, 1933-1935; Синская, 2002; Неуймин, 2011). Особенно часто можно встретить указания на его прогностическую ценность (Васильев и др., 2009). Так, Н.И. Вавиловым (1920) было отмечено, что «по мере углубления исследования биолог перейдет от морфологических признаков к физиологическим и биохимическим свойствам. Будущее принадлежит дифференциальной систематике на основе биохимических и физиологических отличий в пределах вида» (Вавилов, 1920).

Изучая изменчивость признаков, Н.П. Кренке (193