Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организациягеномной РНК-1 вируса кольцевой пятнистости гвоздики и экспрессия рекомбинантных белков оболочек икосаэдрических вирусов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организациягеномной РНК-1 вируса кольцевой пятнистости гвоздики и экспрессия рекомбинантных белков оболочек икосаэдрических вирусов"

Р Г Б ОД 2 2 АПР Шй

На правах рукописи

ГЕНЕРОЗОВ Эдуард Викторович

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМНОЙ РНК-1 ВИРУСА. КОЛЬЦЕВОЙ ПЯТНИСТОСТИ ГВОЗДКИ И ЭКСПРЕССИЯ РЕК<МБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ОБОЛОЧЕК ЙКОСАЭДР1ИЕСКЙК ВИРУСОВ.

(03.00.03. - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологические наук.'

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в лаборатории молекулярной вирусологии ВНШ сельскохозяйственной .биотехнологии РАСХН.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Завриев С. К.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Морозов С.Ю.

. ■ кандидат биологических наук

Лунин В.Р.

'Ведущая организация - Биологический факультет МГУ.

Защита диссертации состоится " " _1995

в _ час. на заседании диссертационного совета Д.020.40.01 при

ВНЩ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул.Тимирязевская, д."42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " "_1896 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Мэликова С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из фундаментальных задач современной фитовирусологии является установление структуры вирусных геномов. Результаты, полученные в последнее десятилетие сделали возможным более глубокое изучение и поникание стратегии экспрессии вирусного генома, механизмов репликации, молекулярной основы процессов взаимодействия вирусов с растением-хсзяинсм и переносчиками вирусной инфекции. Структура генома, характерная для каждой систематической группы вирусов, является одним из наиболее объективных критериев при построении филогенетических линий вирусов и их систематики.

В то же время, совершенно очевидно, что работы, направленные на изучение структуры и экспрессии геномов фитовирусов имеют не только фундаментальное значение, но и определяют новые подходы к прикладным проблемам вирусологии являясь основой для разработки новых, высокоэффективных методов диагностики и борьбы с вирусной инфекцией.

Одной из интересных, как в фундаментальном, так и в практическом плане групп растительных вирусов, является недавно выделенная группа диантовирусов, представители которой поражают ряд важных сельскохозяйственных и декоративных растений. В настоящее время четко идентифицировано только труг диантовируей:-вирус кольцевой пятнистости гвоздики (ВКПГ), вирус некротической мозаики красного клевера (ВНМКК) и вирус некротической мозаики сладкого клевера (ВНМСК). В отличие от ВНМКК и ВНМСК, структура и механизм экспрессии генома кцторых достаточно хорошо исследованы, ВКПГ остается наименее изученным с этой точки зрения представителем данной группы.

Темой настоящей диссертационной работы явилось исследование структуры геномной РНК-1 ВКПГ, получение и исследование серологических свойств рекомбинантного белка оболочки (БО) ВКПГ и близких ему по структуре рекомбинантных БО икосаэдрических вирусов: -кармовируса морщинчатости турнепса (ВМТ) и лютеовируса скручивания листьев картофеля (ВСЛК).

ч

Цель и задачи исследования.

Основной целью работы было определение полной нуклеотидной последовательности геномной РНК-1 'ВКПГ.. В ходе исследования

решались следующие специфические задачи: получение банка кл нов, содержащих кДНК копии фрагментов геномной РНК-1 ВКП определение первичной структуры клонированных фрагментов кДН анализ нуклеотидной последовательности РНК-1 8КПГ, сравнится ное. изучение кодируемых РНК-1 ВКПГ белков, анализ возможн; механизмов экспрессии белков, кодируемых РНК-1 ВКПГ.

Целью второго этапа работы являлось-,, получение рекомб нантных БО ВКПГ, ВМТ и ВСЛК. На этом этапе "решались следуют задачи: клонирование генов БО ВКПГ, ВМТ и ВСЛК, экспресс полноразмерных и (или) делегированных форм БО указанных вирус в E.coli, исследование серологических свойств экспрессированн рекомбинантных ЕО ВКПГ, ВМТ и ВСЛК с помощью антисыворот полученных к интактным вирионам.

Научная новизна работы.

В настоящей работе впервые определена полная нуклеотидн последовательность геномной РНК-1 ВКПГ. Установлено, что ген ВКПГ содержит основные элементы, характерные для диантовирусо Представлены данные о гомологии белков, кодируемых РНК-1 ВКПГ соответствующими белками, кодируемыми кармо-, томбуе, некро-лютеовирусами. Проанализированы возможные механизмы экспресс генов, локализованных в РНК-1 ВКПГ. Впервые получены рекомб нантные белки оболочек ВКПГ, ВМТ, ВСЛК и (или) их делетирова ные формы. Показано,что серологическое родство этих белков нативными вирионами в значительной степени детерминирует конформацией S-домена БО.

Практическая ценность работы.

Данные о нуклеотидной последовательности РНК-1 ВКПГ мог быть использованы для создания основанных на методе ПЦР и мо/ кулярной гибридизации систем тестирования диантовирусс Антисыеаротки, к полученным рекомбинантным БО ВМТ и ВКПГ мол использовать для иммуноферментного тестирования инфицировав растений.

Апробация работы.'

Материалы диссертации докладывались на семинарах лабо[ тории молекулярной вирусологии ВНИИ СБ и международной кон(] ренции памяти А. Н. Белозерского (Москва, МГУ, 1995). •

убликации.

По материалам диссертации опубликовано 2 печатные работы, уклеотидная последовательность.РНК-1 ВКПГ представлена в базе анных EMBL/GenBank под номером LI 8870.

груктура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор -(тературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", аклгачения, выводов и списка использованной литературы. Работа зложена на 133 машинописных страницах, включая 2 таблицы и 20 1СУНКОВ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ хЗУПЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. . Структурная организация РНК-1 ВКПГ.

. 1. Стратегия определения нуклеотидной последовательности.

РНК-1 выделяли из очищенного препарата ВКПГ фенольной гпротеинизацией. ДНК комплементарную РНК-1 ВКПГ синтезировали клонировали в плазмиды pBS(+) и pGEM7zf(+), как описано в ¡зделе "Материалы и методы". Первоначальный отбор клоков, здержащих фрагменты кДНК, соответствующие РНК-1 ' ВКПГ, зоводили методом гибридизации колоний на фильтре с 32р- мечен-t первой цепью кДНК РНК-1 ВКПГ. В результате•были отобраны и сарактеризованы три плазмиды, содержащие фрагменты кДНК, фекрывающие более 80% РНК-1 ВКПГ (Рис-1).

• ДНК комплементарная З'-концевой области РНК-1 ВКПГ "была жтезирозана с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидного >аймера, идентичного З'-концевой области кДНК вставки клона ;RS03S (Рис 1) и слабовырождэнного прзймера, комплементарного -концевым нуклеотидам РНК-1 ВНМКК.

Последовательность 5'-концевых нуклеотидов РНК-1 ВКПГ была ¡ределена методой прямого дидезокейнуклеотидного секвени->вания с вирусной РНК.

Протяженные ■ кДНК вставки клонов укорачивали с помощью :зоиуклеазы III по, протоколу ErBse-a-base system, Promega. гклеотидные последовательности полученных серий клонов с 1Конаправленными делениями кДНК определяли методой дидезокси-

0РС1

27кДа

К1

0РС2

54кДа

ОРСЗ

37кДа

0РС4

[20кДа_)(-)ОРС

1000

2000

3000 I

I

3756

5'

рСИ5009 I

БсоШ ШпсЛ РгиЦ

—I-1-из

. ШпсЦ РгиП ХЬа! рСЖБ0381-\-1-[---1

Аср!_.Бсс^Б! НтсП РгиП .

РСЕ3124

Рисунок 1. Структурная организация геномной РИК-1 ВКПГ стратегия определения ее иуклеотидной последовательное^ Использованные для секвенирования клоны рСПЗООЭ, рСЯ3038 рСЙБ!24 изображены отрезками и соориентированы относителы карты РНК—1 ВКПГ. Укороченные клоны изображены тонкими линиям! Сверху схематически изображены открытые рамки считывания (ОР< РНК-1 ВКПГ. Приведены мол. массы кодируемых ими белко! Пунктиром отмечена не встречающаяся у других диантовирусов ОР1 и ОРС, расположенная в (-)цепи РНК-1 ВКПГ. Заштрихованный пр: моугольник символизирует слитный 08кДа белок, синтезирующийся ходе непрерывной трансляции ОРС1 и 0РС2.

/клоотидного секвенированип по Сэнгеру (Sanger et al . , 1977) с ^пользованием [а 32Р]- или [а 33P]dATP и модифицированной ДНК злимеразы фага Т7 (Sequenase, US Biachemicals) .

.2. Кодирующие районы РНК-1 ВКПГ.

В РНК-1 ВКПГ (3756 нуклеотидов) было выявлено четыре по-анциальные протяженные открытые рамки считывания (ОРС), кото-iis схематически представлены на рисунке 1.

5'-проксимальная ОРС РНК-1 ВКПГ (0РС1) кодирует потен-бальный полипептид длиной 236 аминокислотных остатков и мол.' ассой 27,161 кДа (27 кДа белок). Эта рамка начинается с AUG-эдона в положении 58 и заканчивается терминирующим кодоном в эложении 765. Следующая ОРС (0РС2) начинается с инициаторного )Доиа'в положении 942 и заканчивается териинирусидчм кодоном в эложении 2364. Она кодирует потенциальный полипептид с злег.улярной массой 54,317 кДа (54 кДа белок) и длиной 474 «инокислотных остатков. Между ОРС1 и ОРС2 расположена после-)вательность из 177 нуклеотидов. ОРСЗ начинается AUG-кодоном в ¡лояении 2367, терминируется в положении 3402 и кодирует ¡тенциальный белок длиной 345 аминокислотных остатков с мол. »ссой 37,924 кДа (37 кДа белок). 3'-проксимальная четвертая 'С (ОРС4) инициируется в положении 3495 и терминируется в шожении 3747. Потенциальный белок, кодируемый этой ОРС, имеет >л. массу 9.575 кДа (9 кДа белок) и состоит из 84 аминокислот-IX остатков.

Анализ кодирующего потенциала указанных ОРС с помощью 1горитма Трифонова (Trifonov Е. N.. 1987), позволяющего отлить потенциально транслируемые ОРС от случайных, показал, что 'С1, ОРС2 и ОРСЗ РНК-1 ВКПГ должны эффективно транслироваться I vivo. Наличие в РНК-1 ВНМКК и ВНМСК сходных по размерам ОРС, дирующих белки РзРгт и БО имеющие сходные мол. пассы (27, 57 и кДа), также подтверждает, их функциональную зкачииость.

В то же время, по сравнении с ОРС1-ОРСЗ РНК-1 ВКПГ, дирующий потенциал 0РС4 оказался существенно более низким, тересно, что QPC4 не имеет аналогов у BHMfCK и ВНЖК (Xiong. & 1т;;пэ1, 1989), (Ge et al., 1993). З'-концевая область РНК-1 азанных вирусов представлена некодирующей последовательностью клеотидов и не содержит столь протяженных ОРС. Только 9 клеотидов З'-концевой нетранслируемой области РНК-1 ВКПГ

расположено после терминирующего кодона 0PC4. Учитывй перечисленные факты, представляется маловероятным, что ОРС РНК—1 ВКПГ кодирует окспрессирующийся in vivo и несущий какие либо функции пслипслтид.

1.3. Анализ нуклеотидной последовательности (-)цепи РНК-1 ВКПГ_

Нами также Сыл проведен компьютер ный анализ послелог

тельности (-)цепи РНК-1 8КПГ. В результате чбыла выявлена од| протяженная потенциальная ОРС, кодирующая полмпептид длиной U аминокислотных остатков с мал. массой 20 ,¿-01 кДа. Эта OF располагается в позициях 3146 и 3704 (-)цепи РНК-1 ВКПГ области, комплементарной ОРС1 (Гис 1). ОРС несколько мзньил размеров, кодирующая потенциальный полипептид с молекулярис массой 13,6 кДа обнаруживается в аналогично« районе (-)цег РНК-1-ВНМКК. но отсутствует в (-)цепи РНК-1 BHMCK.

Наличие потенциальных ОРС в (-)цепях геномных РНК отмече! и у ряда других фитовирусоп, например, карла- и потексвирусс (Levay & Zavriev, 1991). В то же время функциональная знач! мость ОРС, расположенных в (-)цепях РНК этих вирусов, если oí вообще имеет место, пока не ясна.

1.4. Анализ аминокислотных последовательностей потенциальш белков, кодируемых РНК-1 ВКПГ.

1.4.1. 27 и 54 кДа белки.

Ряд косвенных данных, полученных в ходе анализа аминоки! лотных последовательностей 27 и S4 кДа белков ВКПГ, указыва! на то, что они входят в состав вирусиой РНК-зависимой РН! полимзразы (РзРп).

Основным аргументом в пользу этого является высокая ст пень сходства аминокислотных последовательностей этих белков аналогичными 27 и 57 кДа белками, кодируемыми РНК-1 ВНМК которые в составе комплекса из 27 кДа и слитного £38 кДа бел обладают субстрат-специфической РНК-полимеразной активность что было экспериментально продемонстрировано in vitro (Bates al., 1995). Сходство между 27 и 54 кДа белками ВКПГ и соотве ствуюцмии бедкави ВКМКК составляет 71% и 79%, соответственн Аналогичное сравнение с 27 кДа и 57 кДа белками ВНМ показывает 63% и 76% процентов гомологии (Рис 2).-

:пг 182-CIIYAAAYRAMTPDQESIDATKMAYNPKSQARRDLVSILRKÎIISFGGFK—SLEDF MICK 152-ALVYAAAYLAMTPDGRSIDSVKLAYMPKSQARRTLVSAIF!Et;XAVAGFK—SLEDF IWCK 1 B2-VLVYAAAYLAMTPDQHSIDSVKLAYHPKSQARRTLVTAVREt.'KAVAGFK—SLEDF

IT 21 8-VNLAMH---PMTGRSVYSRAWRRLC-RLPDDQAISF---VRG----------CLREL

;КГ 244-IEIMDKDCVRYVDRDVILPLAIGC-CFVYPDSVEESAALWGSaESLGVK-GGLVRL :кя 280-ENVGDKFKLDIASKTYLKQVASMSVPIPTNKDIKLKMVLQSPEARARRERMDVLDS

IT 154-PTEDDLLSRALMNTHATRAAVRGMDNVQGEG'iYWNNRLGIGGayGLAFRSKGCLERR * * ' * * * * * * *

;ПГ LSAPVSFPVEDAPYOILGIPEIKVADKRASRVCKFKRVVGLPSLSAGQSVCVHKTSLHNM

¡MKK LGCPLSrPVEDAPYPILGIPEIRVAEKRASRVMKSKRVVGLPAVSAGLKVCVKQTSLHHM

IMCK LGGPLSFPVEDAPYPILGIPEIRVAEKRASRVMKSKRVVGLPAVSAGLKVCVHQTSLHNM

IT VGRETQISRGENP-------AMRV—FPLANPPKVRRIFHICGMGÜGLDFGVHNUSLNNL

;кт PGVVTQINRDIPSDVLLPQEVLEV—RTGPPMAKDRNIFMVAGCPSQARFLVKNHCLKNL

:кя VGFLEGLCTASGFESPFPILGLPE—IAVTDGARLRKV------SSHIRYLSLHNALVAV

IT PGFSTSVSRGEHP-------DLVV—IPSGRPEKQRQLLRYSGIGGHL-LRHHNNSLSNL

** * * * * * *** * ** * *** ** **

:nr IVSLEQRVFRVKNETGEFVVPPQPSKGAF-DSISYFREAWKKKLYSKGPVVKSSIDDVVA IM К К IVSLERRVFRVKNSAGELVVPPKPIQNAF-DSI5YFREEWLRKLSHKGQILICSSLADVVA ¡MCK IVSLERRVFRVKNAAGELVVPPKPIONAF-DSISYFRDAWLRKLSHKGQVLKSSIADVVA

IT RRGLMERVFYVEDAQKQLKPAPQPIPGIF-GKLSGIRRRLVRLA-GNHTPVPREKYPS

:iCT KRGLVERVFCVERNGKLART-PQPTKGAF-GRLSPFRKAVCEKV---GVAHRLGYDGFLS

(КЯ ER----RVFTVGKGDKAIYP-PRPEHDIFTDTMDYFQKSIIEEV--GYCKTYPAQLLAN

IT RRGLMERVFYVEGPNG-LQDAPKPVKGAF-RTLDKFRDLYTKNS»--RHTPVTSEQFLM

****** * * * ** ***** * *

* * * * * * *

I II

I-1 -I-

:ПГ CYSSEKICKLYQKGAATLSHRPLHWRDSKVRAFIKVEKLECDKK-APVPRTIQPRSKRYHL IMKK CYSSEKRKLYQKAAQSLEKKPVQ\YRDSKVQAFIKVEKl.ECDTK-DPVPRTIQPRSKRYNL IMCK CYSSEKRKLYQKAADSLEKKPVQWRDSKVQAFÍKVEKLECDTK-DPVPRTIQPR&KRYNL IT FYKGRRATIYQKALDLYMTCRLSRKDAELKTFVKAEKINFTAKKDPAPRVIQPRDPRYNI :кт YYSGAKLRTYTRAVESLHITPVSERDSHLTTFVKAEKIS—TSKGDPAPRVIQPRNPRYNV СКЯ SYSAGKRAMYHKAIASLKTVPYKQKDANVQAFLKKEKHW-MTK-DIAPRLICPRSKRYNI IT NYTGRKLTIYREAVDSLSHQPLSSRERNLKTFVKAEKLNLSKKPDPAPRVIQPRSPRYNV

** ** ** ж* **# ** *# * *** **** * ** ** Ä********* * * **.**.**** ***

III IV

I I-1 I I

:ПГ CIGRYLRLNEKRMLDAIDAVFGEKTVLSGLDNKAQGRAIAKKWSKYESPIGIGLDASRFD IMKK AICQYLRLNEKKMLDSIDDVFKEKTVLSGLDNRAQGRAIAFlKYmKYQNPIGIGLDASRFD IMCK VIGQYLRLNEKKMLDAIDDVFGEKTVLSGLDNRAQGRAIAHKWRKYQN'PIGIGLDASRFD TT EVGKYLKPYEHHLYRAIDAMVÍGGPTVLKGYDVGELGNÍMSNTWDKFRKTCAIGFDMKRFD :кт ELGRYLRKMESKLMICAVDGVFGETTCIfCGYTADEVGAIFRAKWDRFDKPVAIGLDASRFD ЖЙ ILGTRLKFN'EKKIMHAIDSVFGSPTVLSGYDNFKCGHIIAKKWQKFACPVAIGVDASRFD fT CLGHYLRHYEHHAFKTIAKCFGEITVFKÜFTLEQQGEIMRSKWNK'.'VNPVAVPLDASRFD

*ft *** * *** *** **** ç** * * a* * ** ** * * * ** * * ** * * ***

icyHGK 2. (начало)..

ВКПГ ОНСЗКОАЬКРЕНЗРУНЕСРРООКТБРОЬЮ'Л'аиННЕаЗАЬМРТЕЗЬУКУНГК-СЯМ ВНМКК QHGSYDЛLKFEQTFYKACFPGDQQLHTLLKV¿QLS^JTGSALLPTGELVnYRTKGCn^í внмск айсзуоАькрЕнтрУКЕСРРсооа1Еаьикнаитмто5А1.ьртеЕиУр.снткуся;;

ВМТ ОНУЗУОАЬК,;.|ЕНЗУУЫАаР-ЫСРЕила1^,О^ЫКЙУСНА5-Оар1КУаУОССЦ[.,1.

ВККГ аНСЗУЕАСОУЕНЗРУРАМУРСЫКИ-СКЬЕЕУ'.'ОиНМКвКСУУР-СаТХТУВКЕиСаМ,

ВЖКЯ ОНУЗЕаАиИУЕНСХУЫаГР-СОЗЕЫАЬАиЕНанамХКМРУЕ-ОКМЬНРКУНйНЯ«

ВНТ аНУЗУЕАЬЕ¥ЕНЕРУЬК0УРП0К01К№11К0а1С>^СТАРАЗ-0а11КУКК1С6Са»;

*************** *** * ** ** *** ж * * % ***** *****

** * ** * * * * *•- ч г;^

V 4

-1 I г-1-1

ВКПГ ЫТСиСНКХШСЗМУНАУЬКЕУСУЫА-ЗиАКМСООСУЬРСЕКСОРНЯХШЗиРЕУ/РЬ ВНМКК NTGLGMKILKÍGSMVHAFLKErQVRA-SLAW;<aOOCVLFCEKGOYEQI^^R^lLEQ'^VFb ВНМСК ИТ61С^1МСЗМУНАРЕКЕТаУНА-5ЬАШС00СУ1РСЕКС0УЕа1Ш.ЧиЕаУ/Р1.' ВМТ МГА16ЫСи1АС31ТКУЬМК—С1КС-Ки1ММаООСУЬРРЕАОЕУОНУНЕНи-ННУ/1. ВККТ ^Т31С,,.'У1и.!САМУ)!аГ}.:ЯНЬС1НЕ1-ЗЬАЫССООСУ11УЕЯН,МЦК010ЯТЬРЕУР1 ВЖКЯ ГЯЗгЛСмЖЫЬ'ССМ^.'.НАУиККЬСУЕА-ЕЬС.'^.'СООСУИТОНА.ЧЕКьРО-СМУСНП' ВНТ 1^Т5!..6«С1ШгЛ?тсЬКЕНиМ1Ыи-ЗЬАЫМСООСУ1УСЕКАОиККкТ331ЕРУРК'

*Ж ****;*** ** *********** **** ** * ****

** ** -Те *******

VII VIII

I-1 1-1

ВКПГ ШУУЕЕРУЕ^ЕРУУРСНЗОРУСУАТКУ/АМУНа1_-63!-ЗНОСРЗТСШи1РТТРНО ВНМКК ЕМТУЕКРУОУЬЕКУАРСПЗаРУС1АТС№АМУВС11.-С31_ЗРОСР5ТСЮ171.МРКТРКО ВНМСК ЕМТУЕКРУО^ЕКУУРСПЗаРУС1АТаИАМУРаЬ-СЗЦЗРОСРЗТСШ1.иРКТРКО ВМТ СЗСХАЕеРаУЕЬЕКУЕРСОМЗРХРОаЕе'.УУМУК^НУЗСЗКОЗУЗТТа^АМЕКОААР ВККТ ТМКУЕОРУРСН-ЕЕУЕРСОАНРУОРСЮтЧ^НМУНТАМЗКОУНСУШХНОиАТВЯА ВЖКЯ ЫМУТЕКРУУЕиЕОиЕРСС)ЗКРУ31МС^НМУЯН-Р0316КОЗТТ1.1-5М1.Ш50УКЗ

ВНТ (К№ЕУЕКРУр1РЕН1ЕРСОТ(ЭРУРОвЗОУ1МУрКР5>^ТЗКОУТ31_1РСОТКАОУАЕ ** ** **' **** ***** * * **** ***** * * *' *

* * * ** * *** **

ВКПГ иС0а-Ю11ШБУРУНМА0АКНМУААС,6ШКРПиКА1_НКС?.1ЕУЗУ/Я0---Р[_САРТГ,

ВНМКК 1-6СЗСЫ611Ы[}иУР1КМАС)АК1-МНа1ССШКРМ-ОА1.НКС!МЕУЗ|УНО---Н1_СШТК

ВНМСК исаСЫС11Ш6УР1НМАС!АК1-МНКЗАЕТС331Ут31_НКОМ£Уа\тО—

ВМТ ЮЕСв1-А1АССУР71.С!ЗУУЗС1_—ККЫРВРЬАСОУКККМООУЗРОЗвгУЙЬЗКМС^

ВККТ 0ННБа1_А!_ЗАС1РУУЕТР------YSRFKLY—ОУРНКНО—РЛОТУТНУНКУ.'!^

ВЖКЯ VAQCGLVL^IA^VPILESFYKCLYRSSGYKKVSEEFIK^Ш--SYGTDERLQGRRTV

внт увЕС^хыввхру^дыРУокиотвхтткРтктсЕРаттсвУнз—яумняу/> **** ** **** * ** * * * *

* * *

Рисунок 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей белков диантовирусов и предполагаемых РНК-полимераз кармов морщинчатости турнепса (ВМТ), томбусаируса кустистой карлико томатов (ВККТ), лютеовируса желтой карликовости ячменя (ВаИ некровируса некрозов табака' (ВНТ). Идентичные аминокисл остатки обозначены *,' гомологичные - *. , , .

* Пробелы (-) введены д;

достижения максимального сходства. Цифрами дано число Ы- и С-концевых аминокислотных остатков, не представленных в выравнивании.

Как и у других диантовирусов, в случае -1 рибосомального :двига рамки считывания при трансляции 0РС1 и 0РС2 ВКПГ, что эудет обсуждено позже, происходит синтез слитного В8 кДа белка, ^шляющегося каталитически активной формой РзРп. Аналогично, 57 <Да белок ВКПГ скорее всего не транслируется in vivo как отдельный белок и входит в состав РзРп только в составе 88 кДа Зелка (Bates et. al., 1995).

Слитные белки со сходными мол. массами от 87 до 99 кДа экспрессируются при трансляции генов РзРп . кармо-, томбус-пютео- и некровирусов. Выравнивание аминокислотных последовательностей 88 кДа белков диантовирусов и предполагаемых РНК-полимераз кармовируса морщинчатости турнепса (ВОТ), томбус-вируса кустистой карликовости томатов (ВККТ), лютеовируса желтой карликовости ячменя (ВЖКЯ) и некровируса некрозов табака (ВНТ) представлено на рисунке 2. Анализ этого выравнивания, а также выполненных ранее с другими представителями указанных групп выявляет сходство В8 кДа белка ВКПГ и предполагаемых РзРп рассмотренных вирусов. Наибольшее число консервативных аминокислотных остатков локализовано в центральной и С-концевой части этих белков.

Так же как и в РзРп других кармоподобных вирусов, в последовательности 83 кДа белка ВКПГ отсутствует РНК-хеликазный "мотив (GKS) (Kóonin. Е. V.. 1931). В то же время в последовательности 88 кДа белков диантовирусов и белков РзРп близкородственных ин вирусных групп выявляются охарактеризованные ранее консервативные мотивы, встречающиеся в РзРп всех (+)РНК содержащих вирусов (Kocnin, Е. V. & Dolja, V.. V. 1993; Koonin. Е. V. 1991; Chandresse, T., et. al., 1990) (Рис 2 I-VIII). Участие некоторых из перечисленных консервативных участков в репликации вирусных РНК показано экспериментально (Sankar, S. & Porter, A. G. 1992; Kroner, P., et. al., 1989; Inokuchi , Y. & Hirasihrna, A. 1987).

1.4.2. 37 кДа. белок.

Высокая степень сходства аминокислотных последовательностей 37 кДа белков ВКПГ, ВНМКК и ВНМСК свидетельствует о том,-что 37 кДа белок ВКПГ является вирусным белком оболочки. БО ВКПГ гомологичен БО ВНМКК и ВНМСК на 515Í и 54%, соответственно. По аналогии с БО большинства сферических фитовирусов, БО ВКПГ

должен быть структурирован в четыре, домена Н, а, 3 и Достоверное сходство аминокислотных последовательностей обнар живается и при сравнении 37 кДа белка ВКПГ с БО друг кармоподобных вирусов, а также с БО собемовируса мозаичное южных бобов (ВМЮБ) (Рис 3). При этом наиболее высокий урове гомологии отмечается в центральных, соответствующих Б-домен участках.. БО.

(^-концевой А- и следующий за ним а-домены БО ВКПГ наймем консервативны среди дианто- и других каркоподобных вирусо Значительное по сравнению с Б-доменом число аминокислотн остатков аргинина и лизина в последовательности И- и а- домен БО ОКПГ придает указанным доменам положительный заряд. Преобле дание основных аминокислот характерно и для Я-доменов БО других сферических вирусов (Рис 3) (Оо^а, V. V. & Коотп, V. 1991).

Оболочечный Э-домен, связанный Л-концевой частью с доменом, - самый протяженный и наиболее консервативный домен сферических вирусов. Последовательность Б-домена БО ВКПГ на 5 гомологична аналогичным участкам БО ВНМКК и ВНМСК.

Компьютерный анализ аминокислотной последовательности домена БО ВКПГ выявляет специфическое чередование а-спиралей Р-цепей его вторичной структуры, которые могут формирова характерную для БО сферических вирусов бочкоообразную конформ цию. Восемь антипараллельных Р-цепей этой структуры, формиру щих два параллельных Р-слоя, схематически представлены на р сунке 4. Выравнивание последовательностей Б-доменов БО диант и кармоподобных вирусов показало, что области наибольше сходства их аминокислотных последовательностей соответству указанным Р- цепям, взаимодействие между которыми стабилизиру вторичную структуру (Рис 4) . Наиболее консервативными являют Ро, РЕ м Р1 элементы, содержащие инвариантные д проанализированных БО аминокислотные остатки глицина, чт очевидно, говорит о их принципиальной роли в формирован бочкообразной структуры.

Консервативная бочкообразная структура обнаруживает практически во всех БО РНК-содержащих сферических вирусов

& R-домен

1Г ■MTSRQSRKSKM

ЖК MSSKAPKKSKQ

ÍCK MSTKAPKKSKQ (T MAMVKRMNNTGMIPVSTKQLLALGAAAGATALQGFVKNNGMAIVEGAVDLTKRAYKAVRR

Г MENDPRVRKFASDGAQWAIK-YíQKK-------GWSTLTSRQKQTARA

)Б MATRLTKKQLA----QAIQNTLPNPPRRKR

1K MSTVVVKGNVN----GGVQQPRRRRRQSLR

* * * *

PB

(га-дом сн I-1

1Г ALVPKQRQ—NLARTVICTVKIPYATTQIVTTSNPPKKG----QIKVSGRQLFMSLITSSS

ÍKK RSQPRNRT—PNT-SVKTVAIPFAKTQIIKTVNPPPKP---ARGILHTQLVMSVVGSVQ

1CK RSKPRNRN—P3T-SVKTVTIPFAICTQIVKTVNPPPKP---TKAALHTQLVLSVVGSIA

;t rggkiccjqminhvggtggaikiapvavtrqlvgskpkftgrtsgsvtvt-hreylsqvnnst AMGIKLSPVAQPVQKVTRLSAPVALAYREVSTQPRVSTARD-GITRS-GSELITTLKKNT ЗБ RAKRRAAQVPKPTQAGVSM-APIAQGTMVKLRPPMLRSSM—DVTILSHCE-LSTELA-V

1K RRANRVQPVVMVTAPGQ----PRPRRRRRGGNRRSRRTGV—PRGHGSSETFVFTKDNLM

* * * * * * ■ ** *

*

PC - aA pD pE

1Г FV-VNN-GLPTPSLLSLMPSNQYLFPSLAYEAANYDLYRFAKLRLSYVKDTNATVSGRVS IKK MR-TNN-GKSNQRFR-LNPSNPALFPTLAYEAANYDMYRLKKLTLRYVPLVTVQNSGRVA 1CK LR-ANN-GKA3QRFR-LNPSNPALFPTIAYEAANY0MYRMKKLTLRYVPLVTVQNSGRVA ;Т G—FOVtJGGI VGMLLQLNPLNGTLFSvVLPAIASNFOQYTFfJSVVLHYVPL.CSTTEVGRVA

DTEPKYT------TAVLNPSEPGTFNQLIKEAAQYEKYRFTSLRFRYSPMSPSTTGGKVA

55 TV-TIVV------TSELVMPFTVG—WLRGVAQNWSKYAVWAIRYTYLPSCPTTTSGAIH

Ж G—NSQG------SFTFGPSLSDCPAFKDGILKAYHEYKITSILLOFVSEASSTSSGSIA

***** ■*- ****** *¥ *** * ***** * *

pE aB pF pG

I I-1 I-1 I

1Г LMWDRDSQDVPPNSRVSIPQCTKSVSTA-VYE----------------------SCA

«K MIft'DPDSQDSAPQSRQEISAYSRSVSTA-VYE-----------------------KCS

1CK MIWDPDSQDSVPQSRQEISAYSRSISTA-VYE-----------------------KCS

IT ' IYFDKDSEDPEPADRVELANYSV'LKETÁ-PWA-------—--------------EAM

LAFDRDAAKPPPNDLASLYNIEGCVSSV-PWT------------------------GFI

)Б MGFQYK/ADTLPVSVWQLS-MLKGYVTGPVWEGQSGLCFVNUTKCPDTSRAITXALDTNE

1K —YELDPHCKVSSLQSYVNQFQIPQGGA---------------------------KTY

* ** * * * * ** *

*

pG aD aE . pH . pl

1Г IDl~LPXDDVWRFVRDTDVVDR--KLSDYGQÍFTAVHSGSTT—DEVGDVYLDYTIELK-135

!KK LT---1 PADNQYv'RF V ADMTTVDR—KLVDFGQLLFVTHSGSDG—IETGDIFLDCEVEFK-131

:CI< LT---1PADNQWRFVADSNVVDR—KLVDYGQLLFVNHSGSEG—IETGDVFLECEVEFK-1 31

ГГ LR---VPTDKIKRFCDDSSTSDH—KLIDLGQLGIATYGGAGT—NAVGDIFISYSVTLY—114

LT--VPTDSTDRFVADGIS-DP—KLVDFGKLIMATYGQGAMDAAQLGEVRVEYTVQLK-112

16 VSEKRYPFKTATDYATAVGVNAMIGNILVPARLVTAMEGGSSKTAVNTGRLYASYTIRLI-9 IK QA----RMINGVEVÍHDSSEDQCRI------------LVVKG.4GKSSDTAGSFRVTIRVALQ—3

* ** * *!** * * **** * * * * ***** * *

*

:унок 3. Выравнивание аминокислотных последовательностей R-, а-, и

[оыеков 37кДа белков диантовирусов и белков оболочек томбусвируса

¡гитой карликовости томатов (ВККТ), кармовируса морщинчатости

menea *(BMT), собемовируса мозаичности вжных бобов (ВМЮБ) И'

еовнруса скручиваемости листьев картофеля (ВСПК). Идентичные

шокислотные остатки обозначены », ', .

* гомологичные - *. Пробелы (-;

¡дены для достижения максимального сходства. Над аминокислотной

:ледовательнастыз S-доиена обозначены границы а- спиралей и Р- цепей

i вторичной структуры.

Рисунок 4. Схема возможной укладки ß- цепей S-домена БО ВКПГ. ß-цепи схематично изображены прямоугольниками. Окружностями отмечено

расположение R-, а-, и Р-доменое БО. Направление укладки полипептидной цепи указано стрелками, ß-цепи, отмеченные заштрихованными прямоугольниками, направлены к поверхности вириона, незаштрихованные - к центру вириона.

растений и животных, за исключением бактериофага MS2 (Pol ja, V. & Koonin. E. V., 1991); Rossmann M. G. & Johnson J. I 1987).• ' - '

С-хонцевой Р-домен БО ВКПГ умеренно консервативен (30-3' среди БО дианто-, кармо- и томбусвирусов. Р-домен БО указан! вирусов формирует внешнюю поверхность вирусной частицы обуславливает характерную гранулярность поверхности вирион обнаруживаемую при электронно-микроскопическом исследова диантовирусов.

2. Вероятные механизмы экспрессии белков, кодируемых РН ВКПГ.

2.1. Особенности трансляции 27 и 54 кДа белков РНК-1 ВКПГ.

Как уже отмечалось, в ходе трансляции 0РС1 и 0РС2, коду юцих 27 и 57 кДа белки ВНМКК, происходит -1 рибосомальный cf рамки считывания, вследствие чего трансляция Henpept продолжается в 0РС2,- и синтезируется слитный. 88 кДа бе; являющийся каталитически активной формой РНК-полимеразы (Xii г. et. al.,1993; Bates, H.J. , et. аЛ. , 1995; Kim, К. Н Lommel , S. А., 1994). Необходимыми элементами для для ocyi

твления такого механизма трансляции РзРп в ВНМКК являются специфическая гептануклеотидная последовательность и расположенный после терминаторного кодона 0РС1 элемент вторичной структуры РНК а виде стабильной шпильки (Kim, К. Н. & ¡.оголю 1 , S. А., 1994). Результаты поиска эквивалентных структурных элементов п РНК-1 ВКПГ дают основание утверждать, что в ходе трансляции ОРС1 и 0РС2 происходит сдвиг рамки считывания, аналогичный описанному п ВНМКК.

Непосредственно после терминаторного' кодона 0РС1 ВКПГ выявлена последовательность из семи нуклеотидов GGAUUUU, идентичная таковой в РНК-1 ВНМКК и являющаяся сайтом сдвига рамки считывания. Гомологичные выявленному гелтануклеотиды вовлечены в процесс сдвига рамки считывания и у некоторых ретровирусов (Bates, H.J., et. al., 1995) (Рис 5). Компьютерный анализ вторичной структуры РНК-1 ВКПГ, проведенный по алгоритму Цуквра (Zuker, М. & St?egler, Р., 1981) предсказывает высокую вероятность образования в районе терминатора 0РС1 шпильки, сходной по своей структуре и стабильности со шпильками, предсказанными в аналогичных районах РНК-1 ВНМКК и ВНМСК (Xiong, 2. & l.ommel , S. А., 1989; Ge, Z. et. al., 1993) (Рис 5). В случае с ВНМКК наличие указанной шпильки и ее роль в -1 рибосомальном " сдвиге рамки считывания •было" подтверждено экспериментально (Xiong, Z. et. a "I., 1993; Kim, К. H. X Lommel, S. А., 1994).

Кроме перечисленных фактов, о возможности -1 рибосомаль-ного сдвига рамки считывания в ВКПГ также свидетельствует сходство мол. массы продукта непрерывной трансляции ОРС1 и ОРС2 с 88 кДа белком ВНМКК.

2.2. Анализ субгеномной РНК.

Отмеченное выше сходство структуры и локализации генов БО диантовирусов дает основание предположить, что по аналогии с другими диантовирусами экспрессия БО ВКПГ осуществляется с соответствующей субгеномной РНК.

Существование у ВНМКК сгРНК, экспрессирукяцей БО доказано экспериментально. В частности, картирован 5'-конец. сгРНК, анализ последовательности которого выявил 14-ти членный коровый элемент промотора, гомологичный 5'-концу РНК-1 ВНМКК (Zavriev, S. К. et. al., 1995).

зсИ0

СВЭУ (-50.3 кса!)

ъ

Ч

с—с с~о в—с и—А

—с

Зи

,о—с с

с—в с—с и—А и—А и—А Ш-О А о—С А—и С—С

Ш—А А с Ге

С—С с

С А

и в

и в"

(-52.3 кса!)

6А&5АШйШАЕсЕ

| 1

сс—<з№ с—в в—с и—А

Шио-с

с—с с—е

и— Ад и с .

и—аа А и—А в

с

(л-С

А—и С—С и—А

Г3**

с-есе

Е1

. с

SCNJ.1V (-48.7 кса!)

зСЕИд

Сс-сН0

с—в е—с и—А .

с—б ' с—а ■

II—А ''А и—а.: Е

с—с

А—и -

с—й и—А

С-йС

с—в

|Рс '

Рисунок 5. Сравнение предсказанных элементов вторичной структуры РНК в районе рибосомального сдвига рамки считывания в ВКПГ, ВНМКК и ВНМСК. Нуклеотиды, находящиеся в идентичных позициях и нагомологичные по крайней мере в двух, из представленных структур, выделены темным фоном. Гептануклеотид, являющийся сайтом сдвига рамки считывания выделен рамкой.

Содержание одноцепочечной формы сгРНК диантовирусов в инфицирозанных растениях настолько незначительно, что не позволяет ее проанализировать традиционным способом Northern гибридизации. Одной из вероятных причин этого может быть низкая стабильность одноцепочечной формы сгРНК. Таким образом наиболее доступный, если не единственным способом анализа сгРНК диантовирусов, является анализ их репликативных двухцепочечных форм, присутствующих в инфицированных растениях в детектируемых количествах.

Результаты электрофоретического разделения в агарознсм геле двухцепочечной РНК, выделенной из растений инфицированных ВКПГ представлены на рисунке 6. Двухцепочечные РНК соответствующие по своим размерам геномным РНК-1 и РНК-2 ВКПГ (около 4000 нт и 1400 нт, соответственно) являются их репликативными формами. Наиболее подвижная зона является двухцепочечной формой сгРНК.

Сравнение нуклеотидной последовательности откартированной 5'-концевой области сгРНК ВНМКК и последовательности, предшествующей инициатррному кодону ОРСЗ РНК-1 ВКПГ, выявляет их значительное сходство (68/0. Причем наиболее консервативной является область РНК-1 ВКПГ, соответствующая 5'-концевым нуклеоти-дам сгРНК ВНМКК и содержащая нуклеотидную последовательность, практически идентичную выявленному в ВНМКК элементу промотора для синтеза сгРНК. В случае с ВНМКК было показано, что область (-)цепи РНК-1, содержащая указанный элемент промотора сгРНК, может формировать стабильную вторичную структуру в виде шпильки, значимость которой для синтеза сгРНК была доказана экспериментально (Zavriev, S. К. et. al ., 1995).

Компьютерный анализ вторичной структуры (-)цепи РНК-1 ВКПГ показывает возможность формирования в аналогичном районе шпильки, сходной по своей структуре с выявленной в РНК-1 ВНМКК. Структуры этих шпилек приведены на рисунке 7. Совокупность этих данных позволяет предположить, что синтез сгРНК ВКПГ и ВНМКК инициируется в сходных позициях и с гомологичных промоторов.

Заключение к'разделам'Т и 3. " . '• '

Результаты анализа нуклеотидных последовательностей РНК-1 ВКПГ, РНК-1 других диантовирусов и геномных РНК вирусов близкородственных им групп, а также сравнительный анализ аминокислот-

j

1 г; а 4

РНК-1

-РНК-2-сгРНК-

-11501

-) -4507-5077

"" /2ВЗЭ

,2450-2556 /2140 -.-1986 -1700

|/15Э -1093

1-В05

1-514

Рисунок 6. Электро-срореграмма двухцепо-чечной РНК после разделения в 155 агарозном геле. Двухцепочечная РНК из:

1 - неинфицированных растений;

2 - инфицированных БКПГ растений ШсоИ-апа Ьеп^Ьаттапа-,

3 - инфицированных ВКЛГ растений Nicot7-ала clevelandi7.

4 - маркер ДНК Х/РяИ.

0% сс->

А-1) ГС-СА

Си-АА С-С 1)-Л ■ Б-С

,?с-сс с

Ай

сси

и и

с-аи а-и с-я

В-А.

л-и

и

С-5

з^гзи)-«--^2331)5'

и и в и с и

V-k И-А

ъ-д

С—ч С—А «-С А—I)

А-и

А—0 АА0 С-С

С

^ А—13 С-С и-А А-и

и-А С-й И-А

3'(2г42)-С-(5-(2г?.5)5'

-ссс<"

и^б3!.

ВН14.1К -геЛЫа1/шо1 ВКПГ -17,гИ1«1/да"1

Рисунок 7. Сравнение предсказанных элементов вторичной структуры (-)цепи РНК-1 ВНМКК и ВКПГ б районе промотора для синтеза• субгеномной РНК. 14 5'-концевых нуклеогидов сгРНК ВНМКК, формирующие коровый элемент промотора .и аналогичные им в ВКПГ выделены жирным шрифтом. Приведенные -нуклеотидные позиции указаны по (+)цепи РНК-1 ВНМКК и ВКПГ. ■

кых последовательностей белков, кодируемых этими вирусами указывают на высокую степень гомологии белков, кодируемых ВКПГ и другими диантовирусами. Это обосновывает объединение этих вирусов в одну группу.

Оснозные кодирующие районы РНК-1 ВКПГ соответствуют аналогичным у ВНМХК и ВНМСК. Наиболее консервативными белками, кодируемыми РНК-1 диантовирусов, являются 27 и 54-57 кДа белки, выполняющие функцию вирусной РНК-зависимой рнк-полимеразы и гомологичные аналогичным белкам других кармоподобных вирусов. Менее консервативными являются белки оболочки (37 кДа). Тем не менее, в последовательности БО обнаружены консервативные элементы, характерные для БО кармо-, томбуе-, лютео-, собемо- и некоторых других сферических фитовирусов.

Исследование регуляторных элементов последовательности РНК-1 ВКПГ и ее вторичной структуры позволяет предположить, что в ходе трансляции белков РзРп ВКПГ происходит рибосомальный сдвиг рамки считывания, а экспрессия белка оболочки осуществляется с помощью субгеномной РНК.

Наряду с большим сходством в структуре РНК-1 диантовирусов, выявлены и некоторые различия. Так, в РНК-1 ВКПГ идентифицирована З'-концееал ОРС, не имеющая аналогов в геноме других диантовирусов. Не выявлено 'достоверной' гомологии между 5'-' и 3'-концевыми нетранслирующими последовательностями РНК-1 и РНК-2 ВКПГ. Тем не менее, эти факты существенно не меняют общих представлений о геноме диантовирусов.

3. Получение и исследование рекомбинантных БО ВКПГ. ВМТ и ВСЛК.

Получение и исследование свойств рекомбинантных вирусспе-цифических белков является одним из интересных как с фундаментальной так и с прикладной точки зрения направлением в фитови-русологии. Перспективным подходом в иммуноферментной диагностики инфицированных растений является использование для этих целей антисывороток полученных, как правило, к рекомбинантным вирусным белкам оболочек.

Приведенные выше результаты анализа аминокислотных последовательностей БО- ВКПГ и- других кармоподобных вирусов выявили значительное сходство а их структурной организации. В связи с этим исследование не ограничивалось получением и изучением серологических свойств только рекомбинантного БО

ВКПГ, но также было осуществлено с аналогичными белками ВМТ и ВСЛК.

Гены БО ВКПГ и ВСЛК амплифицировали с помощью ПЦР на кДНК, полученной на тотальной РНК, выделенной из зараженных растений, а ген БО СМТ амплифицировали с помощью содержащего его кДНК-копию плазмидного вектора. Клонирование и экспрессию проводили в плазмидных векторах серии pQE ("Oiagen" GnbH, Германия) в штаммах £. coli Ml 5'и - SGI 3009, содержащих репрес-сорную плазмиду pREP4. Хроматографическую очистку реко;.:бинан-тных белков на колонках с Ni-NTA агарозой проводили по методике QIAexpressianist. В ходе осуществленного клонирования были получены плазмидныв конструкции, содержащие полноразмерные гены БО ВКПГ, ВМТ и ВСЛК, их делетированные формы, а также плазмиды, экспрессирующие фрагменты или полноразиерные БО указанных вирусов в составе слитных продуктов с дегидрофолатредуктазой (ДГФР) или хлораыфениколацетилтрансферазой (CAT). Схемы полученных в ходе клонирования конструкций представлены на рисунке В.

3.1. Экспрессия рекомбинантных БО ВКПГ. ВМТ и ВСЛК в В.coli и анализ их серологических свойств.

БО ВКПГ. " ' ' "

К сожалению, в ходе индукции клеток E.coli, несущих конструкции, содержащие ген БО ВКПГ получить полноразмерный рекомбинантный белок не удалось. Анализ хроматографически очищенных продуктов экспрессии выявил белки с мол. массой около 15-20 "кДа, являющиеся предположительно продуктами деградации полноразмерного БО ВКПГ (37 кДа). В ходе экспрессии конструкции pCR-D (Рис 8) было зафиксировано незначительное количество слитного с ДГФР БО ВКПГ, тем не менеа стабильность его оказалась также невысокой. Только• при экспрессии конструкции PCR—D-Ä578 (Рис В), несущей делетированный с N-хонца ген БО ВКПГ удалось получить относительно стабильный рекоибинактный белок.

Тём не менее, иммуноблотинг'с антисывороткой, полученной К вирионам ВКПГ показал наличие специфической реакции с низкомолекулярными белками, полученными при экспрессии конструкций pCR и pCR-D и отсутствие серологического родства со стабильным, но

E'fP рГС

roo __!_

ВэпЗП

бй-ЦЩ

SCO _I_

ECO

БНПГ

pOl jCS-D

з с d s ? с ii i [; -:;.•:'-

cpsycHi j-y* ■

екП/BssKI lUticC KLeim

Crii-j;- . --. »ta '"T^^l'jja с в в у о н з {■

всш

pPL

- ]Н I

ТОтч'Д]

5чИ

р С D Е Г О П Г

рРМ)

. faH-

¿val t-

incdni

в С 0 E F s a I I

oPL-CAT-оШЭ

flgU/Лтл! 1^вв;ЦаоП 1Пс»Ш

.c.vr.

В С Э 2 F G H I

fPIr-B -йЭ-ЭТ jFb-!>-<4<4

СгН-Г

•■••in?S9b

■ rin^-U KJcdai

|S Р G И l|

етн-

, ПЙЛ1.":

■chi/i Hp с:

G H I

6 в тал Серело— i'. г.;» редст^о с

+ +

+/- +

+

+

+ -А

+ -

+ -

Рисунок 8. Схема конструкций, содержащих гены БО ВМТ. ВКПГ и ВСЛК и (или) их фрагменты. Конструкции схематически изображены прямоугольниками и выравнены по S-домену БО. Линия сверху указывает масштаб в аминокислотных остатках. Названия вирусов и конструкций (см. текст) помещены слева. Справа приведены данныа, характеризующие стабильность и серологические свойства белков, полученных при их индукции с соответствующих конструкций. Буквами R и Р обозначены соответствующие домены БО, буквами B,C,D,E,F,G,H,I ' - р-цепи вторичной структуры S-домена. Гены дегидрофолатредуктазы \ и хлорамфениколацетилтрансферазы обозначены как DHFR и CAT соответственно. Последовательность ' из шести остатков гистидина обозначена как 6хН. Над схемой каждой конструкции указаны сайты, по которым проводили клонирование.

делегированным с Ы-конца белком (CR-D-Ä578) . Выявленное серологическое родство 15-20 кДа белков в зоне и БО в структуре вириона при несоответствии их мол. масс подтверждает предположение, что эти белки являются продуктами частичной деградации рекомбинантного БО ВКПГ. Наиболее вероятно, в данном случае происходит специфический гидролиз рекомбинантного белка, не нарушающий структуру его антигенных детерминант. Таким образом, несмотря на низкую стабильность, рекомбинантные БО ВКПГ, зкспрессированные с конструкций, содержащих их полноразмерные гены, специфически реагируют с антисыаороткой к вирионам ВКПГ.

БО ВМТ.

Анализ продуктов экспрессии пг.азмидной конструкции рТС (Рис В), несущей полноразмерный ген БО ВМТ, выявил белок с электрофоретической подвижностью около 40 кДа, соответствующей рассчитанной мол. массе БО ВМТ - 38 кДа (Carrington, J. С. et. al ., - 1989). В иммуноблотинге рекомбинантный БО ВМТ специфично реагировал с антисывороткой к вирионам ВМТ. Полученная к рекомбинантному белку кроличья антисыворотка также специфично реагировала с вирионами ВМТ как в иммуноблотинге, так и в ИФА-тестах на плашках.

Таким образом, в отличие ,от ВКПГ рекомбинантный БО ВМТ в аналогичных условиях экспрессии в E.coli оказался более стабильным. Кроме того, его высокое серологическое родство с нативными вирионами ВМТ позволяет использовать полученную к нему антисыворотку для тестирования ВМТ-инфицированных растений.

БО ВСЛК.

Аналогично БО ВКПГ в экспериментах с конструкциями, содержащими ген БО ВСЛКК, удалось получить только делетироваи-ные формы рекомбинантного белка, слитного с ДГФ>Р или CAT. Каких-либо белков, экспрессируемых конструкциями pPL и pPL-D (Рис В), содержащими целый ген ЕЙ ВСПК, либо продуктов их. деградации не было выявлено ни при анализе тотального белкового препарата, ни после его аффинной очистки на Ni-NTA агарозе. Стабильные формы рекомбинантных белков были получены только в ходе индукции конструкций pPL-CAT-Ä1B9, pPL-D-A367 и pPL-D-Ä444 (Рис В), содержащих значительно укороченный с 5"-конца ген БО

ВСЛК. Тем не менее, из экспрессировавшихся рекомбинантных белков в инмуноблотинге слабо взаимодействовал с антисывороткой против вирионов ВСЛК лишь 42 кДа белок, наименее делегированный с N-конца (pPL-CAT-<iia9, Рис 3).

3.2. Обсуждение эффективности использования рекомбинантных БО сферических фитоеирусоп для иммуноферментной диагностики растений.

По сравнению с наиболее распространенным на сегодняшний день использованием з диагностике антисывороток, полученных к вирусным частицам, выделенным из инфицированных растений, применение антисывороток, полученных к рекомбинантным БО имеет ряд существенных преимуществ. В основном они связаны с отсутствием необходимости выделения в больших количествах чистых вирусных препаратов, не загрязненных антигенами растительного происхождения, а также, в случае множественной инфекции, морфологически близкородственными вирусами и (или) их изолятами. Немаловажным фактом является и относительная дешевизна получения таким способом рекомбинантных антигенов в больших количествах.

Применение такой методики для диагностики нитевидных фито-• вирусов показало хороший результат (Аршаза Н. В.', и 'др. 1995; Конарвва Т. Н.. и др. неопубликовано). Тем не менее, анализ полученных нами результатов экспрессии и серологического тестирования рекомбинантных БО ВКПГ, ВМТ и ВСЛК выявил ряд проблем, в первую очередь связанных с низкой стабильностью некоторых рекомбинантных белкоа.

Одной из причин нестабильности таких белков, может являться несбалансированность положительного заряда их N-концевых областей при экспрессии в Е.соЛ. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей БО сферических фитовирусов показал достаточную консервативность их структурной организации. Хотя локализованные в N-концевой области R- и а-домены БО обладают ограниченным сходством (Рис 3), тем не менее, для них характерен положительный заряд, обусловленный большим числом аминокислотных остатков аргинина и лизина.

Среди индуцированных нами БО наибольший N-концевой положительный заряд имеет БО ВСЛК, 22 из 6В аминокислотных остатков в последовательностях R- и а-доменов которого

представлены остатками аргинина (Рис 3. подчеркнуто). Меньший по величине положительный заряд имеют R— и а-домены БО ВКПГ, и еще менее положительно заряжен М-конец БО ВМТ. Известно, что в ходе сборки, сферического вириона положительно заряженный R-домен капсидного белка участвует в связывании вирусной . РНК и сориентирован внутрь вирусной частицы (Sorger, Р. К., et. а"1 . , 1986). В условиях экспрессии в Е. coli образование рекомбинан-тных БО со структурой, в которой положительный заряд N-конца в отсутствие вирусной РНК был бы нейтрализован, маловероятно, что может повлиять на их стабильность. Такхе положительно заряженные аминокислотные остатки могут служить мишенями для некоторых протеопитических систем.

Предположение о корреляции величины заряда N-концевой области БО исследованных вирусов с их стабильностью косвенно подтверждает выявленный в настоящей работе факт прямой зависимости стабильности рекомбинантных БО исследованных вирусов от величины положительного заряда их R-домонов. Так стабильные формы рекомбинантных БО ВКПГ и ВСЯК удалось получить только при индукции конструкций, с делегированными участками последовательности, кодирующей R- и а-домены (Рис 8).

Другая проблема, с которой мы столкнулись при исследовании рекомбинантных БО заключается в том, что стабильные укороченные формы БО часто оказываются серологически' неродственными - с нативными вирионами.

Судя по всему, специфичность антисывороток к интактным вирионам сферических вирусов обеспечивает их взаимодействие с антигенными детерминантами локализованными в Р- и S-доменах БО (Giesman-Cookmeyer, D. , et. al. , 1994). Как уже отмечалось, последовательность S-домена БО икосаздрических вирусов формирует два консервативных Р-слоя, образованных восьмью антипараллельными Р-цепями (Rossmann М. G. & Johnson J .Е., 1987) (Рис 4). Наиболее консервативные области. S-доиена соответствуют указанным Р-цепям, взаимодействие между которыми стабилизирует вторичную структуры БО.

Анализ серологических свойств рекомбинантных БО, лишенных R-, а- и некоторых участков S-домена (ом. Рис 8), выявил специфическую иммунную реакцию с антисывороткаки к соответствующим вирусам только в тех вариантах, когда в рекомбиканткцх белках были сохранены все Р-цепи, формирующие S-домен. Наиболее веро-

ятно, что консервативная для 50 сферических вирусов укладка Р-цепей формирует специфическую конфорнацик» з- и Р-доменов, узнаваемую антителами. В таком случае, отсутствие специфической иммунной реакции белков с Ы-концевыми делециями, не имеющих части Р-цепей (конструкции рСЯ-0-Д578, рР1_-0-Лзб7 и рР1_-0-Д444 Рис 8), является скорее всего следствием невозможности образования в рекомбинантном белке нативной структуры Б-домена БО.

Таким образом, полученные результаты показывают, что подход, основанный на получении вирусспецифических антисывороток к рокомбинантным БО сферических фитовирусов для использования их в иммуноферментной диагностике растений не всегда прост. Тем не менее положительные результаты, полученные з опытах с рекомбинантными БО БМТ и (ЗКПГ (в варианте с рСП-О, Рис 8) , позволяют считать его достаточно перспективным.

вызоды.

1. Получен банк клонов, содержаний в плазмидных вектора> кДНК РНК-1 ВКПГ и определена полная нуклеотидная последовательность РНК-1 ВКПГ, длиной 3756 нуклеотидоа. Выявлено четыре ОРС, кодирующие потенциальные белки с мол. кассами 27 кДа, 5' кДа, 37 кДа и 9 кДа.

2. Установлено сходство структурной организации геномо; ВКПГ и других диантоаирусов, а также высокая степень гомологии белков, кодируемых соответствующими ОРС. Сравнительный анали: аминокислотных последовательностей белков, кодируемых РНК-' ВКПГ позволил установить, что 0РС1 и ОРС2 кодирую-вирусспецифическую репликазу, а ОРСЗ - белок оболочки.

3. Идентифицированы структурные элементы РНК-1 ВКПГ вовлеченные в рибосомальный -1 сдвиг рамки считывания в ХОД! трансляции 88 кДа белка.

4. Выявлена субгеномная РНК, с которой зкспрессируетс: белок оболочки ВКПГ. Охарактеризованы консервативные струк турные злементы промотора для синтеза субгеномной РНК.

5. Получены полноразмарные и делетированные формы рекомби нантного белка оболочки ВКПГ, ВИТ и ВС/1 К. Установлено, чт серологическое родство рекомбинантных белков оболочек ВКПГ, ВМ и ВСЛК с нативными вирионами в значительной стелен детерминируется конформациай Б-домена белка оболочки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ryabov, E.V., Generozov, E.V., Kendall, T.L., Lommel, S.A., and Zavriev, s.K. (1994). Nucleotide sequence of carnation ringapot dianthovirus RNA-1. Journal of General Virology. V. 75. P. 243-247.

2. Генерозов Э.В., Рябов E.B., Конарева Т.Н., Аршава Н.В.; Узбекова С.В. и Завриев С.К. (199S). Получение рекомбинантных белков оболочек сферических фитовирусов и исследование возможности их использования для иммуноферментной диагностики. Молекулярная биология. Т. 30 (II) С. 4G1-469.