Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация геномной РНК вируса крапчатости Ежи сборной

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация геномной РНК вируса крапчатости Ежи сборной"

На правах рукописи

СБОРНОЙ.

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени • кандидата биологических наук.

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в лаборатории молекулярной вирусологии ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Завру.ев С.К.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Агранавскш! A.A. кандидат биологических наук, Лукин В.Г.

Ведущая организация - Биологический факультет МГУ.

Зашита диссертации состоится " " _1996 г.

в _час. на заседании Диссертационного Совета Д. 020.40.01 при

ВНИИ'сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г.Москва, ул.Тимирязевская, д.42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " " _1996 г..

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук ,у> Меликова С. А.

ОБЩАЯ 'ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Изучение геномов фитовирусов помогает совершенствовать методы тестирования вирусоз в растениях, прогнозировать их влияние на урожайность культур, а в ряде случаев и получать культуры, устойчивые к вирусам. Исследования организации генов вирусов легло в основу принципиально новых методов борьбы с вирусными болезнями. Хороший пример тому -получение трансгенных растений, устойчивых к тем или иным вмрусным заболеваниям.

Поскольку все виды культурных растений поратаются фито-вирусами, изучение структуры и экспрессии фитовкрусов имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение.

Темой настоящей работы явилось изучение структуры генома вируса крапчатости Ежи сборной (ВКЕС), который является представителем группы собемовирусов. В природе ВКЕС заратает растения Ели сборной, хотя экспериментальными хозяевами могут быть пшеница, овес и другие злаковые растения. ВКЕС вызывает желтые полоски и испещренность на листьях, что часто приводит к гибели 50-80 7. инфицированных растений еще до цветения.

Следует отметить, что к началу исследования были известны полные нуклеотидные последовательности НРНК только двух собемовирусов. Нгряду с представителями--других групп РНК-сод ержащих фитовирусов, обладающих сферическими частицами (кармо-, диаято-, лютеовирусов- и др.), структура генома собемовирусов а также механизмы их экспрессии относительно мало-изучены.

Цель к задачи исследования. Целью настоящей работы явилось определение полной нуклеотидной последовательности геномной РНК ВКЕС. В ходе исследования решались следующие специфические задачи: клонирование и картирование ВКЕС-специфических кДНК, определение первичной структуры клонированных фрагментов кДНК, сравнительное изучение белков, кодируемых РНК ВКЕС, а так же сравнение стратегии экспрессии геномной РНК ВКЕС с З1сспрессией других сферических вирусов. ' ^

Научная новизна работы. В настоящей работе определена полная нуклеотвдная последовательность РНК ВКЕС. Представлены данные о гомологии белков ВКЕС с тагавыыи, кодируемыми геномами собемо-, лютео- и ряда других сферических вирусов. Картирована начало субгеномной РНК. Изучение генома ВКЕС позволяет заключить, что этот вирус использует стратегию экспрессии, наиболее сходную с лютетеовирусами.

Практическая ценность работы. Данные нуклеотидной последовательности РНК ВКЕС, первого отсеквекированного собемовируса в России и третьего в мире, могут быть использованы для тестирования собешвирусоз в злаковых растениях, для уточнения классификации вирусов и их эволюционной систематики и получения трансгенных растений, устойчивых к ВКЕС.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на семинарах лаборатории молекулярной вирусологии ВНИИ СБ и международной конференции "Молекулярные ответы растений на биотические и абиотические стрессы", Хельсинки, 1996.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 печатные работы. Полная нуклеотвдная последовательность геномной РНК ВКЕС протяженностью 4083 нуклеотидов депонирована в базу данных GeneBank под номером L40905.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и обсуждение экспериментов, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 119 машинописных страницах,-включая 4 таблицы и 17 рисунков.

- 2 -

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ. РАЕОТИ.

1. Иатериалы и методы исследования.

РНК выделяли из очищенного препарата ВКЕС методом фенол-хлороформной депротеинизации согласно [Kanyuka et al, 1992].

кДНК комплементарную РНК ВКЕС, синтезировали по методу [Watson & Jackson, 1939]. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки тетрациклин-устойчивого штаьма Е. coli XL-Blue. Отбирали бесцветные колонии. Плазмиды выделяли по [Маниатис и соавт., 1984.]. Размер вставок кДНК в рекомбинантных плазмидах определяли рестриктным анализом.

Для секвенирования протяженных вставок кДНК получали клоны, содержащие однонаправленные делеции вставок кДНК по методике Erase-a-Base System ("Pmnega").

Нуклеотидную последовательность кДНК-вставок определяли по методу Сэнгера [Seng-er et al., 1977].

Прямое определение нуклеотидной последовательности 5'-конца РНК ВКЕС делали методам секвенирования с помощью РНК-зависимсй ДНК-полимеразы M-MLV ("Gibco") и олигонуклеотидного праймера, комплементарного нуклеотидам 64-81 РНК по методике [Fichot & girard, 1990]. Определение 5'-конца сгРНК проводили так же, как и прямой сиквенс РНК, с помощью пракиера, комплементарного нуклеотидам 3271-3297 РНК, опуская стадию, терми-нации.

Присоединение поли(А) З'-концу геномной РНК проводили с помощью поли(А) полимеразы E.coll ("Boehri-nger") по протоколу фирмы' -"Pharmacia".

In vitro трансляцию РНК ВКЕС проводили в лизате ретикула-цитов кролика по методу [Pelham & Jakson, 1976]

2. Молекулярная организация РНК ВКЕС.

2.1. Выявление кодирующих районов.

В последовательности РНК ВКЕС обнаружено четыре протяженные ОРС, кодирующие потенциальные полипептвды длиной более 100 аминокислот (рис, 1). 0РС1 (позиции с 70 по 396) кодируют белок длиной 109 алпшокислот с мол. массой 12,3 кДа. Три следующие ОРС частично перекрываются друг с другом. 0РС2 (позиции 429-

0РС1

0PC3

0PC2

0PC4

1000

2000

■. 2000

-4Cj(

w5

i_i i_

W175

».'46

>7542

w57

wsl2

ws36

walO i_i

W203

Рисунок 1. Схематическое изображение структуры генома ВКЕС и клониор ванных фрагментов кДНК, использованных для определения нуклеотидн последовательности.

2133). кодирует белок длиной 569 аминокислот с мол.-массой 60,7 rçZ(a; ОРСЗ (позиции 1742-3254) белок длиной ' 505 аминокислот с мол. массой 55,3 кДа и 0РС4. (позищш 3093-3855) белок длиной 225 аминокислот с мол. массой 27,6 кДа. На 5'- и 3'-концах РНК ВКЕС расположены нетранслируемые районы (НТР) из 69 и 228 нуклеотидов, соответственно.

2.2. Анализ аминокислотных последовательностей потенциальных белков ВКЕС.

2.2.1. 0РС1.

0РС1 РНК ВКЕС кодирует 12,3 кДа белок. Этот крайне гидрофобный белок шеет нейтральный заряд. Не било найдено значимого статистического сходства между этим белком и белками, кодируемыми 0РС1 других собемо- и лютеовирусов. Среди лютеовирусов статистическое сходство кодируемых 0РС1.белков показано только условно [Guillye étal.; 1994]. Функция'0РС1 белка" неизвестна, и высокая вариабельность его аминокислотных последовательностей пока не позволяет предсказать какую либо возможную

функциональную роль.

2.2.2 0РС2.

Потенциальный продукт экспрессии 0РС2 ВКБС содержит по крайне мере два ярко выраженных домена. Методе! предсказания гидрофобности отдельных доменов [Sipos & von Heijne, 1993] показано, что 50 N- концевых амшогаюлот полипептида, кодируемого 0РС2, включают гидрофобную область, которая может образовывать- трансмембранный домен (рис. 2). В центральной части этого белка занимающей область от 130-140 до 310-330 аминокислотных остатков, расположен дсмен с мотивом UXXGXSG, тшичным для химотрнпсин-подобной сериноЕОй сротеазы [Gor-balennya et al., 1389] 'собемовирусов и лютеовгрусов подгруппы BCJIK (рис. 3). По аналогии с VPg-содержащпет пикорна- и потивирусами, модно предположить, что в собемо- и лютеовирусах сегмент длиной в 70-8СГ аминокислотных остатков, расположенный между гидрофобным и протеазным доменами 0РС2-белка и также обладающий гидрофобными свойствами, может представлять собой VPg [Dernier et al., 1991].

2.2.3. 0PC3.

С-концевой домен,' кодируёмый ОРСЗ, частично .перекрывает ген белка оболочки ВКЕС (рис. 1). Он содержит характерный для всех РНК репликаз дсмен, включающий мотив ИЗО, окруженный относительно консервативными аминокислотными остатками [Koonin, 1991] (рис. 4). Кроме того, первичная' структура этого домена сходна'со структурой предполагаемых РНК-зависимых РНК полимераз (РзРп) других собемо- (ВМЮБ-С, ВШЗ-В и ВЭКР) и лютеовирусов (вируса скручивания листьев картофеля (ВСЖ) и вируса западной желтухи свеклы (ВЗЖС)) [Othman & Hull, 1995; Vincent et al., 1991] (рис. 4), а также неклассифицированного бацилоподобного вируса шампиньонов (ЕВШ) и вируса деформирующей то заики гороха (ВДМГ). Поэтому очевидно, что эта область кодируемая 0РСЗ-белком является вирусной РзРп. ,

N-концевой сегмент ОРСЗ белка ВКЕС имеет ограниченное, но. статистически достоверное сходство с белковыми доменами, кодируемыми ОРСЗ лютеозирусоЕ (приблизительно 300-400 нуклеотидов

ВКЕС 0РС1

VPg

J ОРСЗ 1 } POL

U Ipboti СР .

РВОТ!

РОЬ

QPC4

продукт сдвига рашш

ЕШБ

0РС1

VPg

Л

ОРСЗ i

0РС2 * IPEOSj

PROT!

JSl

СР

0РС4

РОЬ

продукт сдвига рашш

ВСЛК

0РС1

0РС2 VPg •

ОРСЗ

* * |PROT|

* IPR01;

РОЬ

0РС5

0РС4

СР 0РС6

-1-1-

РОЬ продукт сдвига рашш

Рисунок 2 Схематическое изображение структуры геномов соб°мовщзусов ВКЕС и ВМШ и лютеовируса ВСЛК. ОРС и области, кодщзушше белок оболочки, полимеразу и протеазу отмечены как СР, роь иршп соответственно. Предполагаемые трансмембранные звездочками. Стрелки указывают ™™

положение

тгоелполагаемых точек сдвига рамки. Границы белковых доменов и гипотетических ОРС, не содержащих ишщиаторных кодонов отмечены прерывистыми линиями. Заштрихованные прямоугольники., - области «Р-доменов. " ,

*

*

I * » 1 » *

ВКЕС 143 РКЗ—1Л/А1.У50БЬ1,ЗСЖ!£Н1 КСР1КЗОЕУ1ХТА1Л\ЛЖТН1 £Н—1,СК1ХЗККУР1 ВПСР 151 ррг—ШУЬУНПЗта1Л1/ЛЪте1ТТС1ШиКГННН1АА1£РНа1АУКСа1ЬККУАЬ

вгяв 149

БШ 251 РНаЬУА11даП^СТиУСКаКЬ^-и)СНЛи,УТЛА11УАЕЕСКШЗНЬСАЙ1БГ;-КТ

В32С 219 ГКЕСТ1Р1ТНАЕСКНАетАгС1КЬУКОЕ!1А1ИГАТ1П7ШХТНАУАУ5АКаЬКТК1

ВСЖ 220 1'К5АУ1ЕЬОНЕ};а5ЯЬСУАНС1Ш,УЭЗИЗАЬ\ГГАЕНСЬЕа№АТ----ЗЬКТСЯМ

1_I

- I I $

ВКЕС ЖСТ'ХУАЗЗАЕЗБЦгРУЬУЗУРКМИЗ-УХ^'СТАР^

ЕЗНР 1)А--РУ1Ла)Н1,]П1ЮЛКУЕУРРЕ1УЗ-ЬиГ^КгЛСХЖРЬ,;К0ТАУ51Л^'С335ТЕ

ЕДБ ЕГШ^^САВРгаоетЬУКУРТАтеА-КЬАУКБТКУХЛРтеСТАУОТРСаОПЗКО

В31С Р1ЛЕККТ1АХ51ЖС1етШ{СР-Р№П!а1ЛЛТМА^Т71ТЛ.М]ЬАКСКА31УЗК1)НХ)

ВСЛК РМЗТППККЗАЕНШ 31 ь,;ар-р;Л'Жашз,/каАНК1тл1)К1сксглзкутьЕкс

1_I

* * ** *-* ***** 4 Ж*-**

ВКЕС ТУССТСТАЕ-1^РРН1таКТОТТСШЗеЗРЬУНК1)А1Ут11ХЗАКРЗАСУННАСН

ВШР РЗгСТа1А01О1)НРРЫЕЯОЗТ7С5ШЕаЗРЬУНКСС\Г^СХЛ1аААШУНУАЗНУА

ЕЖ ЪК£аий:АКАи)НА>ЕГШТАРТАКСдаБСТ1ЪУТПГЙ1УСТ1НТаУУ1)1СТЗКНА1М

БЕШ кшгр:сьу&тт5АПМйРЕнасзтьк-с™5атг1Уш:)!1К7уа1нзЕСна1УЕНРсьзь

331С щ'>гззУАЕ1УазЕСТ1)УМУьгнтЕйскзс;зрукнскт1ШЖБаАЗАТ—СМУНЬ

всяк Е™шзАТ11)аАНноруз\?1хотарстузатстеззк!)ььетькакрьЕ—еесну

Рисунок з. Выравнивание аминокислотных последовательностей протеаз соОемовирусов, БЗЗ и лвтеовирусов. Консервативные мотивы подчеркнуты. Идентичные аминокислотные остатки отавчеш двойными, а гомологичные одиночными звездочками. • Пробелы (-■) введены -для оптимизации выравнивания. Указаны расстояния от первой аминокислота шшшептида, кодируемого 0РС2.

от 5'-конца) (рис. 2 и 5). Аналогичные белковые домены можно обнаружить и в Л-концевой части продукта ОРСЗ Б8Ш и ВД№ (рис. 5). Однако таких доменов не найдено перед РзРп в полипептиде, кодируемом 0РС2 других собемовирусов. Компьютерный поиск позволил нам найти аналог этого домена в продуктах, кодируемых ОРСЗ У ВМШ и ВЖР (рис. 2 и 5). Этот домен был назван УРдоменом, так как он содержит высококонсерватпвный ¡.ютив с универсальным дипептидом Тгр-Рго.

ВКЕС ВЕКР к.шз

БВОТ

взхс вслк

ВКЕС

В2КР

НЛБ

БШ

В31С

ВСЛК

ВКЕС

ВПСР

ВШЕ

БВШ

В32С

ВСЛК

ВКЕС

В2КР

НДБ

БВШ

К32С

ВСЛК

ВКЕС

В1КР

ВШБ

БВШ

В31С

ВСЛК

ы ии г, г»ш % шш и% % п

210 ЕЬ\7ККЗЬСБР\ШЬКУКОЕРНЗКОК1ЕОСНЕНЫ53\?БЬ¥1)9ЬУЕКМЬРСРОНТТЕ1 659 Е^ЕКСЪа)П'ИЛЛ?К,ЧЕРНРКККЬ1,ЕГЖКНи БЗУЗЬУтЬУЕЕМЬРСРОЫЛТЕ1 605 ЕМУтЯ^РУМ^КОЕРНРЗНКЬКЕСКУЮЛ 53Ч31УШЬУЕГ<МЬтеАСЛ1ЕЬЕ1 203 Е1Л/01К;1 ССА\/КУК1 КОЕРНЗЬЕтШЗШИ 1ААУС1/ЛХЛ УГМАСМКвШАЕ1 200 ЕЬ7И)О1£СР1НЬК7КСЕРНК0АКи)ЕаКУга,ЗМетЗЬТОС!МАОТЬТОЫ0НККЕ1 313 ЕЬУОЕСи11Р1Т{Ь1Л;каЕ1'НКОЗК11)ЕСКУКЬ1Н'ЗУ81,У1:ОЪУЛК,;ЬЕ01)0()КЛгЕ1

I_I 1_I

Г II

! « » » * ' ' ' Ч

А1АМЗДРЗКРСН31£КА30УАШШ)1ЛЮШ0ТНРСАМ--------

гттаодаь'КРсмаи.тРЕО! шм>ш ГОККОАНРААЕ--------

АЕИОЗ!РБКРСМСЬЗУ1ИОАЬАIПШШУКНТУСРААЕ--------

БСИЕ5СРБАРСМС1Л1)Еаиг-ТЬУЗТА0УМАЕНСТ1СЕ------------ТШЗСМ

I__I I_

. III

1Ш I 3 I Л , 3 3 $

К)^ОГЛ;т;А1)УЕНЕ1ЕЫЗ-ЗРРАи1АКАА1-БР^УС1ИНАТРОЪТ!1аЕЬЕТОЕЬ ШЕУОК'ЕШББиИга 1№а-МК0аниШАА1 - ЗНУУСЕММ37Ю.Ь31ЙТ1Л ООЕЬ mSVaIШUlADVEmlVI^-SFPPMtiAI^Ar1Я-nKFSCF^lnSVlЛLSíЮQUJЮEL

ШЭТА1ШШ1)Ш1 УЕИИ.Т1 ШЯРАТЕКШЗ-СНШЛ ЗНЭТЬСЬЗКЗТЬЬАй I н _I

-АШЗСК -АЫЗСР

IV

и 33 Ч I I ЗЗШ' I

РСиЖЗЗЗУСТЗЗЗНЗМЕСтЛ--------ЕЫвБ—РКС1АМСТ)ВЗУЕО>7УН1)А

Р01ЖЗС2УСТо2ТНЗК№США--------Е1Л С 3— РНС1ЛМСТЖЭТЕСМ I ЕС А

РСГНШЗЗУСТЗЗТНЗРЛ НСЬМА--------Е1ЛСЗ—теСЯАМаГОЗУЕСРУЕСА

РСС0Х^ХШУНТЗЗа15ЕМНУ1АТМРАНУЬАС0УБСРРШ31}1А.МСШЗГЕ1НЕКСЬ

РСТ1ЭШЗЗУетЗЗЗИ5Н1КУМАА--------КНТСЛ--1ИАМА>ГСТЮА15:3-НРАБ

РСТОКБСЗУМТЗЗЗНЗРЛ ЕУМАА--------УНССА—ШАМАМСП>1)АЕЕА-Р«31)

V

VI

з з ш * • *

РККУЗАШ1иЖЕУЕАСРУ1^Р)!СПЯЖЕУЗРСЗН1Л ЗКСЖАЕЬ-----ЕТИРКСЦН

ОЗКУААШГГСКЕУУРС-КТКСНЕ1Д£СТРСЗНЫШ1СНАЕЬ-----ТБИРКАиН

НЕКУАСТ/ЗНЬС)ШУКРСАТТРТСЭ1,УАУЕРСЗ}ГУ IКИ1 КАРЬ-----ТЭТРКТЬУЕ

ЕЕУШЗ;СНТУКМС-----Уои'сьускЕРсзоургсъсалур^орзктьунръзн

1ЛАУКШ31та-------ЕУЗЙОЪ---ЕКСЗН1КР-АР1)ЪАШЛтаЖШУК1ЛУа

ЬЕЕУКтизкет--------СТСЗВЕХ—ЕгсзштятьАУРтотакмьукына

1_

VII

Рисунок 4. Выравнивание аминокислотных последовательностей РзРп собемовирусов, БВШ и лотеовирусов. Консервативные мотивы РзРп подчеркнуты. Идентичные аминокислотные остатки отмечены двойными, а гомологичные одиночными звездочками. Пробелы (-)введены для оптимизации выравнивания. Указаны длина гиконцевых амиокислотных остатков, не приведенных для выравнивания.

* *

ВКЕС 23 SALGQLIEYAGYVWRDEGIINS—DGMPFRSAGKSSCRFREAVCRAVHRBVRAAE

ЕЗКР 17 GALGRLT QI/TET/TNDSLGTiSLP- SDGHPF^GKSGVI FGEllAGKSVCAAVKDAV

ЕГ2Б 14 GCLAAQIELGDYKFSC- GPTHE-TGGMPKRNCGSSTCKFREVSRKPVADA1i/TAAT

БЕЗ 6 FSGAPSJ JGASYFKWQQGRGEED— NVRGVGTFEI FNPGGGKTHAPSKEEO-----

B33C 8-J AGEFimyFSELYNWEVPTSPREVi'GFFiHCGKLPQyYHPKOKEESGWGKTLVGNHP

ВШК 118 AKOFTSY FDA I YKWGAOEEG CP- PGFRKCGNIPGY YHPRTKGETKWGOKLCOVHP

«

EKEC SEFI'ELKEIAWP3RGSMElGSliK)AGRFEHVEAPAHL0LAlT

ЕЖР SVFT^IXGFGWPEEGSKAELDFPHPPSRPVOQilGMSPRARASSP

ЕЯБ KVFPELSELGWPERGSGAEI GSLIJJOAGKFVPTKAPSNLEQAYN

БШ EEVEELHKWSWTTiGT IAATKQAFLTHTKRLKTGFITPCLAAIШ

1ШС ALGEKTEGPGWPKFGPEAELKSLRLOASKVJLERAOSAEl PSDAE

ВСЛК eladktagfghpkagfeaeloslnloaakwloraesatipgaea

Рисунок 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей №Р-доменов собемовирусов, ЕВШ н лэтеовирусов. Консервативные котзви подчеркнуты. Идентичные аминокислотные остатки отмечены двойными, а гомологичные одиночны?,и звездочками. Пробелы (-) ввэдеш для оптимизации Еыравшшапия. Указаны длины эт-концевых участков, не приведенных для выравнивания.

2.2.4. 0РС4.

В геноме ВКЕС 0РС4 расположена также,_ как и гены белков оболочки других собемовирусов [Othman & Hull, 19951. Мол. масса продукта 0РС4 близка к таковой капсидного белка ВКЕС, рассчитанной по его электрофоретической подвижности в поли-акриламидном геле. Сравнение аминокислотных последовательностей продукта 0РС4 и белков оболочки собемовирусов и других небольших сферических фитовирусов выявило их значительное сходство (рис. 6) [Dolja & Koonin, 1991].-. Дендрограмма, основанная на выравнивании аминокислотных последовательностей белков оболочки сферических вирусов также указывает на близкое ' родство белка 0РС4 с белками оболочек других собемовирусов. Эти факты подтверждают предположение о том, что белок 28 кДа является белком оболочки ВКЕС.

3. Возможный механизм экспрессии протеазного и полимеразного доменов ВКЕС.

Эксперименты по изучению стратегии экспрессии генома* норвежского изолята ВКЕС CMakinen et al., 1995] показали, что

EKEC MVRKGAAÏKAP-------QQPKPRAQQQPGGRRRR

ВИР «ÎAKKGKKINSN-------QGQQGKRK--SRKP

ШЕЕ ИАТКШККОЬА-------QAIQNTIiMPP—REKR

BKKT BffOTG ЮТ VSIKQLLAXG AAAG AIAIßGFVXNNG LIAI VEG A VDLIKRaYKAVRR

Е-Л HENDPRYRX.----------PASDGAQWAIKïïQKK-----GWSClŒSRQKQ—ÏARA

БКПГ LECSRQSR—KSKM

ВСЛК MSÏYYYKGNTN-------GGYQQPRRRRR—QSIR

ВКЕС RG-RSMEPVSRPIiiPPAAV GSTbKAGRGKTÀGYSDW—PÏÏPGMITSYIiGG-PQRÏAGTT BSKP RG-RSAKPQLQH—AI'VAQ ASRISGTVPGPXSSNÎW—PlilSVEFIiADPK-RSST—SA ЕШБ ■ RAKRRAAQVPmQAGYSK-APIAQGTKVKLRPPMIR—SSIIDVTIISHCE-LSIE-IAY

вккт ксакк0(Ж!ЖтсатсаА1клруАта(Л.УС5крк?тс1а;2СБтота-ш1ЕХ1£0У™за}

Бш: AJiGmSPYAQI^QKyTRISAPYAI^YPJWSTCffRTS^

ЕКПГ ALVPKQRQ—M^KïyKiCVKXPYAiîTQIVÎTSÎiPPKKG----QIKYSGRQbPKSIÜTSSS

ВСЛК RRANRYQPYYMYTAPGQPRRKR---RRRCGNHRSRRTCV---PRGRGSSKTPYITKDNIAi

* »

ВКЕС ES-QYPI---YSPA AT.n-RYG—TIAKAYAIWRPKHWEIVY--bPRCSÏQŒDGSIE

ВЖР DA-ÏÎYD----CYPFHEP-RVW—SbARCÏS!irî£FÏR?fflWY---LPEY5AÏVAGSIE

KSK ÎY-ÏIVY-TSKLVMPiTVG—WERGYAQîraSKYAWVAIRYTXIiSCPTITSGAIH

BKKT G—yQYKGGlTGIŒMI^HiuTIiSYiTCA^

Ш1 БФЕРЮТ---TAViroSEPGTracaaîŒAAQYEKÏRPTSIJIPKXSPMSPSTTGGKV'A

БКПГ ?Y-Viffi--GICTP3I^IMPS№YItFPS:UYli^^

ВСЛК G—KSQG-----БРТРСР515БСРАЖ0а11^УНЕта'51тЗРУЗгАБВТБЗС51А

* I * * î s*

ВКЕС KG?:m>YAISYPfflramLà-5STSIT]E^

ВИСР KC?LYDYAraiPRYÎGKMS-RIAGP¥TSSVWYGAK;-CHIJ5GG--SAI!NAWAS>ÎDCSR

ВШБ MGFQYEMADïffYSWCaS-rratGYYTCPYVfEGCSCrLCï

БККТ IYPDKDSEDPEPADRVELANYSVXKETA-PWA----------------ЕАМ

ВМТ ' LAÎDRDAAKPPPNBLASLYKIEG CYSSY-PiM}--------------GPI

БКПГ XMWDRDSQDVPPKSRTSIPQCïKSySTA-VYE-------------------SCA

ВСЛК —ZEEDPHCKVSSLQSYVNQPQIPQGGA-------------------K2Y

** j *

ВКЕС PSNKWPKLSWST——PEESEN A HT>TBTY7PARPyV-RSDPPyVi'AJ0PGHXWIJ^SRItJ<K

B1KP YG—ÏÏKRVTSSI-PSSVD-PNVYKIIIPARIJLy-RSSIKPTVSMPGKIYVXiSirTIE

ЗЯЕ YSEKEYPPKTAÏDYAïAyGW^n:GrraVPAPJ,VÎ-A)^G5SF^AmGîaYASYTIK[J

BECKT LR-YPTDiaRRPCDDSSTSDH—KLXDLG CtLGIAiP YG GAGT—NAYGDIPISYSYTLY

КЛ Iff--TPÜÜ35TDRFYADGIS-DP—KITIIgGKTiTKAT'YGQGAMiAAQIgEyRTEECTQbK.

ВКПГ ID-IiPIDDYWRF YRDTBYYDR—KXSDYG QIPTAYHS GSÏΗDEY G DYYXD YÎIELX

ВСЛК OA--EMXHGVEîiEDSSEDQCRI-------iVfKGIJGKbSDTAGSPRVTIKVAba

Î * I

ВНЕС CSYSPSINL

вшр dpydpiiîjt

ШЮБ EPIAAAINL

ВИСТ PPQPTNTIi (115)

ЙП NRÜGSOSDA (103) - - ■

ВКПГ DRQPÎASMY (126)

ВСЛК HPK

Рисунок 6. Выравнивание аминокислотных последовательностей белков оболочки ряда сферических фатовируссв. ВККТ - вирус карликовой кустистости томатов, ВМТ - вирус морщинистости турнепса, ВКПГ - вирус, кольцевой пятнистост и гвоздики, идентичные аминокислотные остатки отмечены двойными, а гомологичные одиночными звездочками.

белок, кодируемый ОРСЗ, синтезируется как часть полипротеина, включающего также белок, кодируемый ОРС2. Таким путем синтезируются также неструктурные белки'лютеовкрусов [Prüfer et al., 19923. Сигнал трансляционного сдвига рамки считывания, включающий гептануклеотид UUUAAC, за которым следует шпилечная структура, обнаружен и в геномах ВМЮБ и ВЖКР в самом начале области перекрывания 0РС2 и 3. Поэтому можно предположить, что при трансляции 0РС2 ВМШ и ВЖКР также происходит сдвиг рамки в результате чего образуется полипептид, включающий кодируемые ОРСЗ протеазу и WP-домен. Тагам образом, экспрессия WP-домена у собемовирусов может происходить исключительно по механизму -1 трансляционного сдвига рамки (рис. 2).

4. In vitro трансляция.

•В опытах по in vitro трансляции геномной РНК ВКЕС наблюдались два главных продукта с мол. массами 67 и 28 кДа, соответственно, что коррелируется с результатами анализа нуклеотидной последовательности РНК ВКЕС. Белок 28 кДа, являющийся, как показал анализ его аминокислотной последовательности, белком оболочки вируса, транслируется с матрицы сгРНК, цнкапЬидир'ованной в вирусные ' частицу. 67 'кДа" б'елок вероятно является продуктом трансляции 0РС2. Картина трансляции в бесклеточной системе в целом соответствует предсказаниям, сделанным на основе анализа нуклеотидной последовательности генома ВКЕС. В отличие от геномов ВМШ CWu et al., 1987] и ВЖКР (Ngon et al., 1994], анализ "генома ВКЕС показывает, что непрерывной ОРС, которая приводила бы к образованию продуктов с мол. массой около 100 кДа, нет. Однако Макинен и соавторы показали, что такой белок наблюдается в очень малых количествах в системе in vitro трансляции, что объясняется механизмом -1 трансляционного сдвига рамки считывания 0/,akinen et al., 1995]. Этот белок состоит из 942 аминокислот и тлеет мол. массу 103,4 кДа. В начале области перекрывания 0РС2 и ОРСЗ можно идентифицировать два характерных структурных элемента для -1 рибосомального • сдвига рамки трансляции: последовательность UUUAAAC [Makinen et al., 1995] и шпилечная структура.

5. Анализ вирусной сгРНК для синтеза бедка ободочки.

Для картирования 5'-ганца сгРНК ВКЕС использовали сгРНК, выделенную из агарозного геля после злектрофоретического разделения тотальной РНК, инкапсидированной в вирусные частицы. Препарат сгРНК отжигали с праймером, комплементарным 5'-концевой последовательности гена белка оболочки (см. Материалы и Методы) и полученный РНК-ДНК гибрид достраивали с помощью обратной транскриптазы. С помощью того же праймера, провели секЕенирование по Сэнгеру клона' кДНК, перекрывающего зту об- ласть РНК ВКЕС. Сравнение электрофоретической подвижности продуктов элонгации праймера■обратной транскриптазой и секвениро-вания клона кДНК позволило установить, что 5'-конец сгРНК соответствует позиции 3057 геномной РНК ВКЕС (рис. 7). Таким образом, инициаторный кодон белка оболочки расположен на расстоянии 35 нуклеотидов от 5'-конца сгРНК. Важно отметить, что сразу за первым AUG-кодоном, тандемно расположен второй (рис. 8), , имеющий в отличие от первого, оптимальный контекст (AUGAUGG) для инициации трансляции [Kozak, 1981], и, видимо, являющийся истинным инициаторным кодоном гена белка оболочки. Все участки геномов собемовирусов, предшествующие гену белка оболочки, содержат UCAGA или, как вариант, UCBAA мотив, -вероятно, вовлеченный в процесс инициации синтеза сгРНК (рис. 8). Участки, предшествующие стартовым нуклеотидам сгРНК белка оболочки обычно включают структурные элементы субгеномных про-мотороЕ [Niblett & Toler, 1977]. Они содержат мотивы, которые близки или идентичны у различных представителей одной группы вирусов [Ding1 et al., 19903. В геномах собемовирусов мы не нашли общих мотивов, предшествующих последовательности UCAGA. Однако после нее находятся ОС-богатые инвертированные повторы, потенциально способные образовывать шпилечную структуру из 5 или 6 пар нуклеотидов с петлей длиной 10-12 нуклеотидов (рис. 8). Эта шпилечная структура высоко консервативна и, видимо, играет важную роль в инициации синтеза сгРНК, будучи, возможно, цис-элементом, узнаваемым.вирусной репликазой.

Рисунок 7. Картирование 5'-конца сгРНК ВКЕС. Радиоавтограф продуктов элонгации праймера, комплементарного 5'-концевой области гена БО ВКЕС (см. Материалы и методы), отожженного с препаратом сгРНК выделенной из агарозного геля -2; с тотальной вирусной РНК - 1; результаты секвенирования клонированного фрагмента кДНК ВКЕС - 6,А,Т,С.

)

ВКЕС

а в и

и с

исАСАшесшса

А-и

а-с э-с

С-Й

с-с

АЩСЮГацо]

ШСР

с ^ в

с в А

А С

и

и с

иаЗААССАилиСЦСС

А-и с-с й-С й-С и-А

с-с

ааа]С|АОС|

и с с с

А А

и и

А С

ВШБ-В А в

иСАСАСАСОАиОТА

С-С С-С С-С

а-с

и-А (5-С

МА] дии-гагг- ГАОД]

Ю-с

и с и с

А А О и С С.

. иСАСАСЗШАЦС

и-А (3-С СЬ-С СЧЗ С-С и-А

САААА1С-28КТ- [1051

Рпсупок 8. Вероятше шшшЕчвые структуры собэмовзрусшх РНК в участках, соответсвуищх предполагаемому 5'-концу сгРНК белка оболочки ВКЕС. Последовательность ислсл. шдчерснута, консервативные шпилечные структуры и шпциаторные кодоны ВО обведены.

6. 5'- и З'-нетрансдируемые районы.

5'- и З'-нетранслируеше районы (НТР) РНК ВКЕС состоят из 69 и 223 нуклеотидов, соответственно. Недавно предсказана стабильная шпилечная структура первых 60 нуклеотидов РНК ВЖКР [Меоп еЬ а1., 1994]. Важность таких структур, как сигналов инициации синтеза (+)РНК, была показана на примере нескольких (+)РКК-содержагаих вирусов Шие^а! е1 а1., 1994]. Подобный тип вторичной структуры можно предсказать для 30 5'-концевых нуклеотидов РНК ВКЕС. Как и в случае геномных РНК ВЖКР и В!,Ж [Н^оп еЬ а1., 1994], 3'-концевые участки РНК ВКЕС образуют протяженную шпилечную структуру. По аналогш с другим вирусом, комовирусом мозаики вигны, можно предположить, что такая структура З'-НТР важна для узнавания репликазой [ИоИП еЬ а1., 1993]. В районе 130 3'-концевых нуклеотидов РКК ВКЕС также прослеживается возможность образования внутренней вторичной структуры, напоминающей структуру тРНК. Предполагают, что такой мотив может играть роль цис-элемента в области геномного промотора РНК-содержащих вирусов, например, у пикорнавирусов тигйа1 е1 а1., 1994].

Таким образом на основании сравнения нуклеотидной последовательности геномной РНК ВКЕС и аминокислотных последовательностей кодируемых ею полипептидов, можно заключить, что нами исследован русский изолят собемовируса ВКЕС. Основной характерной чертой структуры, генома этого вируса, отличающей его от других собемовирусов является расположение генов РзРп и протеазы. Оно близко к таковому в лютеовирусах -эти гены перекрываются в различных рамках считывания, в то время как в других собемовирусах они находятся'в одной рамке.

выводы.

1. Определена полная " нуклеотидная последовательность геномной РНК ВКЕС протяженностью 4083 нуклеотидов. Выявлено 4 протяженных ОРС, кодирующие в 5'->3' направлении 4 потенциальных полипептида с молекулярными массами 12,3 кДа (109 аминокислотных остатков), 60,7 кДа (569 аминокислотных остатков), 56,3 кДа (505 аминокислотных остатков), и 27,6 кДа (225 аминокислотных остатков).

2. Установлено, что геном ВКЕС содержит все элементы, характерные для собемовирусов. 5'-проксимальная ОРС кодирует крайне гидрофобный • белок, возможные функции которого, как и у других собемовирусов неизвестны. 60,7 кДа белок высоко гомологичен химотрипсин-подобной сериновой протеазе собемо- и лютео-вирусов подгруппы ВСЖ. 56,3 кДа белок содержит характерный для всех РНК-зависимых РНК-полимераз GDD мотив. 27,6 кДа белок показывает значительное сходство с белками оболочек'собемовирусов и других небольших сферических фитовирусов.

3. В опытах по in vitro трансляции вирусной РНК наблюдались два главных продукта с мол. массами 67 и 28 кДа, что согласуется с результатами анализа последовательности РНК ВКЕС. 28 кДа белок оболочки вируса, транслируется с-сгРНК, инкалсидиро-ванной в вирусных частицах. 67 кДа белок вероятно является продуктом трансляции 0РС2.

4. Картирован 5'-конец сгРНК ВКЕС . В этой области обнаружен структурный структурный мотив (позиции 3070-3093), характерный для всех РНК собемовирусов.

5. Приведен • анализ нетранслируемых 5'- и З'-концов РНК ВКЕС. Выявлены потенциально стабильные вторичные структуры, которые может образовывать вирусная РНК в этих районах

Основное содержание диссертации отражено в следующих работах.

1. E.V. Ryabov, A.A. Krutov, V.K. Novikov, O.Y. 'Zheleznyakova, S.Yu. Morozov, and S.K. Zavriev- (1996).-Nucleotide Sequence of RNA from the Sobemovirus found in Naturally Infected Cocksfoot Plants Shows a Novel, Luteovirus-

Like Arrangement of the Putative Replicase and Protease Genes. Phytopathology, V.86, N 3, pp. 314-320.

2. А.А. Крутов, E.B. Рябов, В.К. Новиков, О.В. Железникова, Д.А. Зеленина, С.Ю. Морозов, С.К. Завриев., 1996. Геном собемовируса из Dactytilis glomerata имеет лютеовирус-подобную организацию модуля генов репликазы и протеазы. Молекулярная биология, Т. 30, вып. 3, с. 564-576.