Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация и локализация мобильных элементов МЕС и NLR1 в геномах хирономид

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация и локализация мобильных элементов МЕС и NLR1 в геномах хирономид"

Р Г 5 Р05/Р сииская академия наук 5 СЕН 198/} сибирское отделение

институт цитологии и генетики со ран

На правах рукописи УДК 576.311.575.113

СОБАНОВ Юрий Валентинович

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ МЕС И 1Ш11 В ГЕНОМАХ ХИРОНОМИД

Клеточная биология - 03.00.25

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1994

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Научный руководитель: кандидат биологических наук,

А.Г.Блинов

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Сф&щиальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук, А.Ю.Керкис

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

кандидат биологических наук, С.Я.Слободянюк Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск

Институт биоорганической химии СО РАН, г. Новосибирск

Защита диссертации состоится 1994 года

на заседании специализированного совета по

защите диссертаций на соискание • ученой степени доктора наук Д - 002.11.01 при Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институте цитологии и генетики СО ^АН Автореферат разослан " {/?" . 1994 года

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

А.Д.Груздев

Актуальность проблемы. Мобильные элементы являются одной из наиболее интенсивно исследуемых областей организации и функционирования генома эукариот. Впервые информация о мобильных элементах появилась в работах по исследованию генетической нестабильности у кукурузы (McClintok, 1952). Молеку-лярно-генетически мобильные элементы исследуются с середины 70-х годов (Rubin et al.,1976; Georgiev et al.,1977). В процессе этих исследований было установлено, что мобильными элементами являются последовательности ДНК, содержащие гены, экспрессия которых обеспечивает размножение этих последовательностей в геноме.

В настоящее время обнаружены и исследованы десятки мобильных элементов из различных, таксономических групп, включая микроорганизмы, животных и растения. Было обнаружено, что внедрением мобильных элементов вызвано большинство классических фенотипических мутаций Drosophila melanogaster, а также некоторые генетические болезни человека. В результате этих исследований произошли существенные изменения в представлениях о спонтанном мутагенезе. Существенно изменились представления и о стабильности генома. Было обнаружено, что в результате перемещения мобильных элементов может наблюдаться дестабилизация генома в виде гибридного дисгенеза, транспозиционных взрывов и микротранслокации.- Большая часть этой информации получена на D.melanogaster. При исследовании геномов других видов, таких как мышь и крыса, оказалось, что спектр мобильных элементов у различных видов сильно различается. Следовательно, одной из актуальных проблем исследования организации и функционирования генома эукариот в настоящее время является изучение мобильных элементов у разных видов.

Кроме того, до сих пор мало изучены происхождение, разнообразие и эволюция мобильных элементов. Полные нуклеотидные последовательности выявлены далеко не для всех известных мобильных элементов. Отсутствие такой информации существенно ограничивает понимание происхождения и эволюции мобильных элементов. По-видимому, решение этих проблей возможно при анализе информации о новых и ранее описанных мобильных элементах, обнаруженных' у видов из различных таксономических групп.

Использование хирономид как экспериментальной модели: для исследования мобильных элементов имеет ряд положительных аспектов:

1) Геномы хирономид представляют собой удобные объекты для молекулярно-цитологических исследований мобильных элементов, в первую очередь, в связи с тем, что в клетках некоторых тканей хироноиид, в частности, в клетках слюнной железы расположены политенные хромосомы, наличие которых позволяет производить тонкую хромосомную локализацию изучаемых фрагментов ДНК в геноме.

2) Интенсивные работы в области -эволюционной цитогенетики хироноиид являются существенным основанием для исследования эволюции мобильных элементов.

3) Наличие подвидов и видов-двойников в роде СЫгопошиз позволяет исследовать вопрос возможной взаимосвязи между дивергенцией видов и семейств мобильных элементов в геномах этих видов.

Следует также отметить, что у наиболее хорошо изученного среди хирономид вида - СМхопотиз 1Ьгшхп1 - уже охарактеризовано 3 семейства мобильных элементов, относящихся к различным классам. Поэтому перспективным в плане описания разнообразия мобильных элементов хирономид в первую очередь является продолжение работы по исследованию новых мобильных элементов в геноме СМгопопшв Шипта!.

В продолжение' работ по молекулярно-цитологической характеристике мобильных элементов, проводимых в лаборатории клеточной биологии ИЦиГ, перспективными являлись исследования с использованием в качестве зондов клонов рС^2 и РС6.10" в результате исследования их нуклеотидных последовательностей только в клоне рС^ 2 была обнаружена последовательность, по своей организации похожая на мобильный элемент, относящийся к группе транспозонов (Богачев и др., 1986). При этом полилокальная гибридизация этих клонов на политешшх хромосомах СЫгопргаив -Шипи»! указывает на присутствие в обоих этих клонах последовательностей мобильных элементов.

Цель е задачи исследования. Целью настоящей работы, являлось обнаружение и характеристика новых мобильных элемен-, тов у хирономид. В задачу настоящей работы входило исследова-

I

2

вне мобильных элементов ChlrononniB thunmi, содержащихся в клонах рС., 2 и pCg 10, и их полная характеристика. Второй задачей данной работы было исследование распространения в геномах других видов хирономид мобильных элементов, гомологичных выявленным нами. В работе решались следующие конкретные задачи:

1.Скрининг геномной библиотеки Chironotmia thunmi на клоны

Р°1.2 ЯРСб.Ю-

2.Молекулярно-цитологическая характеристика отобранных клонов.

3.Установление нуклеотидной последовательности мобильных элементов и фланкирующих их последовательностей.

4.Сравнение установленных последовательностей с ранее • изученными.

5.Цитологический анализ распределения и Southern-blot анализ структуры NLR1 мобильного элемента у видов двойников н подвидов рода Chironomus.

Научная новизна работы. В процессе проведенного исследования было доказано, что ранее выявленная последовательность ЫЕС в геноме Chironoima tfturaii является дейстательно мобильным элементом. Впервые обнаружен и охарактеризован неизвестный ранее Non-LTR ретротранспозон NLRClrl Chironorais thunmi и установлена его полная нуклеотидная последовательность.

Проведен анализ распределения NLR1Ch-элемента в геномах 23 видов сем. Chironomidae. Впервые обнаружено, что этот мобильный элемент специфичен для видов рода ChironoimiB. Максимальная его представленность обнаружена у вида, где он был обнаружен - Chironomua thunmi, и близких ему видов: C.piger, C.dorsaliB.

Изучен межвидовой полиморфизм длин рестрикционных фрагментов NLR1Ch-элемента у видов-двойников группы рГшювиэ и подвидов С.thunmi, C.piger. На основании этих данных установлено, что у видов рода Chironomus присутствуют как минимум 3 различных по структуре семейства .Non-LTR ретротранспозонов.

Научно-практическое значение. Полученные в работе данные подтверждают факт широкого распространения мобильных элементов разных типов в геномах эукариот и вносят вклад в понимание процессов дивергенции и распространения мобильных элементов. В структуре впервые описанного NLR1Ch-элемента выявлены

все характерные для Non-LTR ретротранспозонов структурные элементы. Показано, что по количественным и качественным характеристикам дивергенция семейств NLR1-элементов отражает степень эволюционного расхождения видов, в которых он исследовался. Из этих данных следует, что, используя последовательности ДНК Non-LTR ретротранспозонов в качестве зондов, мсшю выявлять степень родства малоизученных родственных видов, исследуя дивергенцию семейства мобильных элементов, а следовательно, и сопряженную с ним дивергенцию видов.

Доказательство мобильности ранее описанного вероятного транспозона ИЕС было крайне важно в связи с нетипичностью его структуры для мобильных элементов этого класса. На основании данных о структуре МЕС-элемента существенно расширяются представления о транспозонах. Как выяснилось, их концевые инвертированные повторы могут быть длинной более 100 п.н. и, по-видимому, содержать в своем составе промотор для РНК-палимеразы II. Эти данные расширяют представления о структурных характеристиках транспозонов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на VIII двустороннем симпозиуме СССР - ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" (Иркутск, 1989), на VI международном совещании по структуре и функции Колец Бальбиани (Джексон, США, 1993).

Публикации. Основные результаты работы изложены в трех научных публикациях.

Структура и объем работы. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, включающих 12 рисунков и одну таблицу.. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка цитируемой литературы.

Первая глава представляет обзор литературных данных по молекулярно-биологической организации и экспрессии в геноме мобильных элементов разных классов. Вторая глава - описание молекулярно-биологических методов, используемых в данной работе. В третьей главе приведены результаты экспериментального исследования, и в четвертой - обсуждение полученных результатов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для наработки гибридных фагов использовали штамм E.coli К-802. Для трансфориации плазмид применяли компетен^гные клеточные культуры E.coli JM103 и М15, приготовленные по методу Чанга, Миллера (Chung, Miller, 1988). Субклонирование исследуемых фрагментов ДНК проводили с использованием плазмид pUC19, pUC128. In 3itu гибридизацию'проводили по методу Гелл и Пардью (Gall, Pardue, 1971). Остальные методики, использованные в данной работе, проводили, как описано в руководствах по молекулярному клонированию в книгах Маниатиса (Маниатис и др., 1984) и Мазина (Мазин и др., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I.Скрининг геномной библиотеки и характеристика ДНК рекомбинантных фагов

Геномная библиотека Chironomus thurraii в бактериофаге

q

\EMBL4 с титром 3x10 фаговых частиц/мкл была получена от Dr. J. Niessing. В качестве зонда для скршшнга использовали ранее полученную плазмиду рС1 2, которая гибридизовалась приблизительно в 90 местах на политенных хромосомах Chironomus thurraii (Богачев и др., 1986). Приблизительно 8хЮ5 рекомбинантных фагов из геномной библиотеки Chironomus thmrai высевали на твердый агар с культурой E.coli К802, реплики снн-

32

мали на фильтры Hybond N, которые гибридизовали с Р-меченой плазмидой рС1>2* в результате было получено 20 положительных ответов. Соответствующие рекомбинантные фаги были наработаны, выделены и очищены. Далее из этих фагов была выделена ДЙК, которую использовли в последующих экспериментах.

Исследование МГЭ, изложенное в данной работе, проходило в рамках более общей работы по молекулярно-цитологическому анализу организации тканеспецифического пуфа Вйа. В интересах этой темы и определялся выбор клонов для скрининга геномной библиотеки С. thunrol. Возможность изучения МГЭ в рамках этой темы опиралась на предварительно полученные молекулярно-цитологические данные о клонах pC.j g и pCg -jq. В частности, в составе клона рС1 2 были обнаружены инвертированные повторы, фланкированные с внешних сторон короткими прямыми повторами (Богачев и др., 1986). Полилокальное распределение клона

рС6.10 давало основание для поиска в его структуре мобильного элемента, а стабильная гибридизация этого клона с пуфом ВЯа позволяла надеяться, что среди геномных'клонбв, локализующихся в этом районе, обнаружится клон, габридазуюцийея с клоном рС610. Таким образом, при характеристике по локализации на политенных хромосомах слюнных желез С.Щщий, отобранных в результате скрининга геномных клонов, обнаружение клонов с полилокальным распределением было ожидаемым результатом. Гибридизация этих клонов с клоном РС6 10 существенно облегчила изучение локализованного в них мобильного элемента, так как структура клона рС6ю ранее была изучена.

Следовательно, в результате скрининга геномной библиотеки С.Шлтй, используя в качестве зонда клон рС. „ мы имели все основания получить клоны с полилокальным разделением на хромосомах либо из-за гибрвдиз'ации клона, содержащего транспозон, либо из-за локализующегося в ВНа другого мобильного элемента, подобного мобильному элементу клона рс6 1п. в таком случае подтверждение мобильности вероятного транспозона в клоне рс12 возможно при анализе последовательности ДНК, в которую этот транспозон встроился.

Х20 В

I-

О ,Е,

*41Н С.

янсс н н я ся

\4Э С , £ ,

тп—гп—гг

янсс н и я ся

х51Ы С , Е ,

г.сс и н я ся

ни вня всвя я

А , В, .р,

II III НИ I

нн вня всвя я

нн вня всвя я

НТТП

нн вня всвя я

5 8 Я

1кЬ

р24А1

РИ0.1 Схема перекрып« клонов х£0, х41Ы, л.43 и х5Ш. Двойной чертой обозначен участок, соответствующий «обильному элементу ШД1 Сй. Сайты рестрикции обозначены: в-ВапЯ1; с-С1а1; и-ЩпсИП; я-ЕсоМ.

А

я

В

я

А

В

я

В

А

я

^-меченая ДНИ двадцати отобранных рекомбинантных фагов была прогибридизована in sltu на политенные хромосомы клеток слюнной железы Chironomus thuirmi. Результаты этих экспериментов показали, что шестнадцать из двадцати клонов гибридизова-лись только в район А2Ь хромосомы IV, где развивается тканес-пецифический пуф BRa. Остальные четыре клона - х20, х43, хД1Ы и x51N - кроме' района А2Ь хромосомы IV имели еще более 100 мест гибридизации, распределенных по всем четырем хромосомам.

ДНК рекомбинантных фагов с полилокальным распределением была гидролизована рестриктазами и исследована с помощью электрофореза в агарозном геле. В результате рестрикционного анализа было установлено, что эти клоны содержат встройки перекрывающихся фрагментов геномной ДНК. На рис.1 приведена схема перекрытия этих клонов. Клоны х43 и X41N оказались идентичными и отличались от клона x51N более длинным фрагментом В. Область этого фрагмента перекрывается клоном х20, однако последовательности ДНК,' соответствующие фрагментам 43С и 43Е, в клоне х20 отсутствуют.

2.Подтверждение мобильности вероятного транспозона МЕС, расположенного в клоне рС.| 2.

Выявление гомологии последовательности клона рС^ 2 с EcoHI-фрагментами ДНК отобранных гибридных фагов проводили-с помощью Southern-blot гибридизации. Результаты гибридизации приведены на рис.2а.

Для дальнейшего анализа EcoRI-фрагмент D клона х20 был субклонирован в плазмиде pUC-18. Полученный субклон был обозначен p20D. Для выявления соответствия последовательности ДНК субклонированного фрагмента последовательности клона рС1 2 ДНК субклона p20D была электрофоретически проанализирована в акриламидном геле после гидролиза Hiníl-рестриктазой. Часть Hinfl-фрагментов субклона p20D совпадала с Hiníl-фрагментами клона рС1Из анализа рестриктной карты клона рС^ 2 был сделан вывод о том, что совпадающие фрагменты относятся к области, фланкирующей вероятный мобильный элемент, обнаруженный в С1 2 фрагменте.

Стратегия секвенирования клона p20D построена на основе ранее полученной нуклеотидной последовательности клонерррС1 2

¿a), ^

z z

e f- p>

N M t Л

I Шт»

00

Рис.2 БоиШет-Ыо! гибридизация с Р-мечеными клонами рС12(а) и РС6.10 ^ ЕсоН1-гидролизованной ДНК гибридных фагов, после разделения в 1% агарозном геле (А), из геля ДНК переносили на капроновый фильтр и гибридизовали с соответствующими зондами

Т1 Ш

I шг

TI ЙГП П I г

500 Ър

Рис.3 Схематическое изображение клона рС1>2(А) и p20D (Б), распределения сайтов рестрикции и стратегии секвенирова-ния клона p20D. Схематически обозначен блок повторов (R) и мобильный элемент (МЕС). Двойной чертой отмечены участки фрагментов ДНК, последовательности которых приведены на рис.4 Сайты рестрикции обозначены: A-AvaII; B-BamHI; C-Clal; E-EcoRV; H-Hlnil; H'-HindIII; S-SaÎHI

1 GCAAATTTTAACTAATGCTTTACTTATCAATCATTTCCTTCCTCAGCTTTCCTAAATCAACGACACTTTA

2 GCAAATTTTAgCTAATGCTTTAtTTATCAATaATTTtCTTCCTCAGCTTTCCT-AATCAACGACACTTTA

1310

1 AACAGCTATTTCAATCGATTCACAAACCCAACAGAATTTAAAGACGATCCTGAACTTCACACGTCAAAT<I

2 AACAGCTAcrTCAAraGATTCACAAACCCAgCAGAArTTAAAGACGArCCTGAACrrCACACGTC^CTTÎ _._._._;_;_._1410

1jagcctttccacgcaaaaatgagactcggtatttttttggttttggctcaataaaaccataaataatggtc

■_._.__ПВО

1 CAAACTATAATATGTTATATATTTTTGGAAAGCTCTC|AGTGTAAGCTTTTAATGTGGGTGAAAATAAGGT

1550

1 AAGTTATATTATCAAGGGTTGGAAACTTTCAGTTGAAACTGTCGATCAACAAACATTTTTGCGCGACACG

1620

1 ctgtgctttactctttaaagcaaacaggagtattttaattgaattacattaaataaataaggtattagtg

1690

1 CAAAAAGGAAAGTTTTrCAAATTATTCTGCTTGGTTTrATTTrTATGAGTTTTCAAACCTTGGTAATTTT

1760

1 тстаттсгттттттттаaaaaatgcttatatcttgtccaaacattcgatttaattgatgatttaaacgct

■ _1830

1 gtttatcttatttttttcaaactttaaatttaagctcaaaactacttccaaagggtatc| gagagctttcc

_■ _____._1900

1 AAAААГАТСТДАСАГАrTArAGTTTGGACCATTArTrArGGTTrTATTGAGGCAAAACCAAAAAAATACC _._.__.... 1970

1 gagtctcattttcgcgtggaaaggct) AAAATSaagtcattaaaaaagtaataaaaagcatcgacctcaac

г AAGTCATTAAAAAAGTAATcAAtAGCATCGACCTCAAC

2040

1 TGCA TTAAGC.A ACAGTTAAA ТА ГАСОССА A A ATGGAGATTTA ACACTTTTAGA AGTCGA AGTAAGA АТГС г TGCATTAAGCAACAGTTAAAaATArCCaAAAATGGAGATrTAACACTTTrAGAAGTCGAAGTAAGAATTC

Рис.4 Частичная нуклеотидная последовательность клонов рС1 2 • (1) и p20D (2) в районе встройки мобильного элемента МЕС. Несовпадающие нуклеотиды в последовательности p20D обозначены прописными буквами. Концевые инвертированные повторы транспозона МЕС отмечены рамкой, дуплицированные при внедрении элемента "мишени" обозначены жирным шрифтом.

и изображена на рис.3. Установление нуклеотидной последовательности проводили по методике Максама-Гилберта.

Сравнение последовательностей ДНК С1 2 и 20D позволило выявить 596-п.н. встройку во фрагменте С1 2. На рис 4 приведено сравнение фрагментов этих последовательностей. 596-п.н. встройка содержит 107 п.н. концевые инвертированные повтори и фланкирована короткими прямыми повторами. AAATG. Именно эти 596 п.н., предполагалось, являются транспозиционной встройкой

(Богачев и др.,1986). 20Б-фрагмент содержит только одну AAATG последовательность в этом месте последовательности при отсутствии 596-п.н. встройки.

Кроме 596-п.н. встройки, 20D и С1 ¿ фрагменты имеют другие различия. К одному типу различий относятся 22 нуклео-тидные замены. Отличие другого типа относится к тандеыным повторам с консенсусной последовательностью AGGTTAAGTTGCCAAA-TTTTG, присутствующим*в обоих ДНК фрагментах. С1Фрагмент содержит 12, а 20Б-фрагмент - 24 копии этого повтора.

Таким образом, мы экспериментально подтвердили, что ранее описанный вероятный транспозон МЕС является действительно мобильным элементом.

3.Обнаружение и характеристика мобильного элемента клона Cg

На основании результатов молекулярно-цитологической характеристики клонов х20, x41N, л43 и х51Н было сделано предположение, что они содержат встройки ДНК, полилокальное распределение которых обусловлено мобильным элементом, отличным от выявленного в клоне рС1 2 транспозона МЕС. По цитологической характеристике такими свойствами обладал полученный ранее из макробиблиотеки C.thunroi клон рС& 10 (Zalniev et al., 1985), по-всей видимости, содержащий в своем составе мобильный элемент. Для проверки этой гипотезы была проведена

QO

Southern-blot гибридизация Р-меченого клона pCg с EcoRI-гидролизатами гибридных фагов. В результате было обнаружено, что клоны х20, х43, х41Н и x51N имеют в своем составе последовательности, гомологичные клону рС6 10, (рис.26).

Для дальнейшей работы использовали рекомбинантный фаг х43. Чтобы выяснить, в какой части фага х43 содержится вероятный мобильный элемент, все его субклонированные фрагменты в форме ^-меченой клонированной ДНК гибридизовали in situ на политенные хромосомы из клеток слюнных желез C.thunmi. Три из них, р43В, p43D и р43Р, гибридизовались только в район А2Ь хромосомы IV; три других клона - р43А, р43С и р43Е - гибридизовались более чем в 100 мест других хромосом. Основываясь на данных in- situ гибридизации, мы сделали вывод о том, что вероятный мобильный элемент находится в А, С и Е ЕеoR1-фрагментах фага х43 (рис.1).

Для того, чтобы о последующем отличить последовательность мобильного элемента от фланкирующей его последовательности ДНК, был проведен поиск клонов, гомологичных фланкирующей мобильный элемент последовательности. Для этого электро-форетически разделенную EcoRI-гидролизованную ДНК фага л43 переносили на фильтр Ну bond. N и гибридизовали с несколькими 32Р-мечеными субклонированными фрагментами, не содержащими последовательности мобильного элемента. Таким образом, в результате Southern-blot анализа было установлено, что EcoR1-фрагмент А1 фага х24 гибридизуется с А и С фрагментами фага х43, в котором присутствует мобильный элемент.

Для установления нуклеотидной последовательности мобильного элемента были использованы пять рекомбинантных плазмид: р43А, р43НН, p43RC, р43С, и р24А1. Схема стратегии секвениро-вания следовала из располажения сайтов рестрикции элемента. В результате была определена полная нуклеотидная последовательность мобильного элемента.

Полноразмерный мобильный элемент содержит 4.787 п.н., без учета ограничивающей дупликации последовательности ТАТСА-CTAGCAAC, рис 5. ДНК клона р24А1 содержит только одну копию этой последовательности, а мобильный элемент отсутствует. Обнаруженный мобильный элемент не имеет длинных концевых повторов. В нем были обнаружены две протяженные ORF(0RF1-I887 п.н. в позиции 154-2040 и 0RF2-2649 п.н. в позиции 2033-4681). 0RF2 перекрывает 0RP1 в +1 рамке считывания. Поли(А) трек (24 п.н.) расположен в 3'-концевой области мобильного элемента. Аналогичным образом расположены поли(А)- и А-богатые последовательности, обнаруженные у всех изученных Non-LTR ретротранс-позонов. Из анализа нуклеотидной последовательности и сравнения ее с известными классами МГЭ следует, что обнаруженный нами мобильный элемент является представителем класса Non-LTR ретротранспозонов. Этот элемент был обозначен как NLRICth.

, Клон pCg 1 q содержит правую часть выявленного элемента, но нуклеотидная последовательность, фланкирущая элемент с 3'-конца, отличается от соответствующего района клона рДЗНН. Следовательно, в клоне \43 мы обнаружили другую копию мобильного элемента. Эти копии не идентичны по нуклеотидной последовательности. Они отличаются друг от друга несколькими

нуклеотидными заменами и укороченной поли(А)-последователь-ностьв у мобильного элемента клона pCg^g.

Изученные Non-LTR ретротранспозоны шест подобную структурную организацию (Finnegan 1989; Xiong, Eickbush, 1990). Эти элементы содержат две ОВР, которые могут быть как разделенными, так и перекрывающимися, и два нетранслируемых района на 5'- и 3'-концах. 3'-концевая область содержит поли(А)- „ последовательность варьирующейся длины или A-богатые тавдем-ные повторы, например (ТАА)П, как в структуре I-элементов D. melanogaBter (Fawcett ei al,1986; Abad et al.,1990). Все Kon-LTH ретротранспозоны ограничены дуплищрованными мишенями.

NLR1Cth элемент C.thumni, полностью соответствует структуре Non-LTR ретротранспозонов: наличие двух перекрывающихся ORF, длиной 1887 п.н. и 2649 п.н.; 5'- и 3'-нетранслируемые районы, соответственно, 153 п.н. и 185 п.н., олиго(А) последовательность в 3*-концевой области и фланкирующие дуплициро-ванные мишени. В открытых ранках считывания присутствуют цие-теиновые мотивы (0RF1) и консервативные ВТ домены (в 0RF2). Цистеиновые мотивы были обнаружены в эукариотической кДНК, кодирующей связывающие белки, участвующие в регуляции генов, и в белках, связывающихся с ретровирусным геномом (Berg, 1986; Gorelick et al.,1988). Ретротранспозон содержит в гене gag один или два таких мотива.

Используя данные сравнения последовательностей генов, кодирующих ревертазы (Xiong, Eickbush, 1990), мы сравнили последовательность 0RF2 элемента NLRICth с соответствующими последовательностями других Non-LTR ретротранспозонов. Максимальное сходство было обнаружено с 0RÏ2 элементов Р, G, Doc и Jockey D.melanogaeter,рис.4. Все семь известных консервативных RT доменов обнаружены в структуре 0RF2 элемента NLRICth.

Сравнительный анализ вероятных аминокислотных последовательностей, кодирующихся 0RF1 и 0RP2, и 5'- и 3'-нетранслируеыых районов NLR1Cth с аналогичными последовательностями других Non-LTR ретротранспозонов показал наибольшее сходство с Р, С, Doc, Jockey элементами дрозофил, хотя это сходство ограничено консервативными последовательностями 0RF1 и 0RF2. В конечном итоге мы считаем, что NlíUCh элемент C.thunsni является характерным представителем группы Non-LTR ретротранспозонов.

\

1 2

NLRlCth SCLKLNHFPKfíWKWAKVIPIPKHGKP ASELSS YRPISLLSSISKILERVLLNRIHÜHLEON !JI IPWCQCGFRFGRSTSWQL

Doc AlAKLGYFPQKVKKST1VM1PKPGKD KTQPSS YRPISLL TCLSKLFEKMLtLR ISPHU?/ N H TT P THQFGFREKHGTIEQV

F /11 rKLCKFPOfiWKMMK/ IMIPKPGKN ¡¡TVASS YRP ISL / SCI 3K£,FVLKCVLIRLHÖH«TFH HI IPAHQFGFRESHGTIEQV

G SCRFIGYFPKQ*KRAEVITIPKPGKP EANLAS YRPISLlATLSKlLERVFbRRVLPVLDEA GLIPDHQFGFRRSHGTPEQC

Joc.f. SIhRVGYFPKARPTASI ÏMÏLKPGKQ PLDVD S YRPTSLLPSLGKtTLZRL ibHRILTSEEVT RAIPKFQFGFRLQHGTPEQL

Joe .m. SVLDVGÏFPKAWKSASIIMIHKTGKT PTDVDS YRPTSLLPSLGKIMERL 11.HULLTCKDVT К AI Pk'FQFGFRl. QHGTPEQh

1 NEIFNSHIPQAYKTSLIIPILKPNTD KTKTSS YRPISLNCCl AKILDK11AKRLWLVTYH Ш,INDKQFGFKKGKSTSDCh

T1 LSbSLGVFPALVKSCVLFPVHmGCR -SIVSN YRPITQTCATAKXFELCIFPTILHSCSSA —ISPKGHGFMPGRSTSTNL

____3____4

NLRiCth 1KV1KSAKENLN NKKSTGtf IFLDVEKAFDRWHNGLLYKtfLKLAiFP LPL1 KTViîSFLSERSFAVF 1KGQFS EIKHIÍCPGVP Doc NRITSEIRTAFE HREYCTAlFLWAOKFORWLDGbLFXI IKÍLPQ NTH-ÏLLLKSYLYNRVFKIRCDTSTS RDCAIEAGVP F NRITTEIRT AFE YREYCTAVFLTNSOKFDKWLDGLMFKIK1SLPE STH-KLLKSYLYDRKFAVRCNTATS TVHTIEAG4P

G HRLVEQILEAFE RKQYCCAVMLOVKQAFDfCWHPGhHYKI KTHLPG SHF-AFLKSFTEGREFQVCCGTATS TPRPIRAGVP

Joc.f. HR4VNFSLEALE KKKIMGÄ'CFLD JOOAFDRWHPGLLYK/IK.SLLSP QLF-QLIKSFVEGRKFSVTADGCRS SVY.F1EAGVP Joc.m. HRVVNFKLEAME HKEYAVGAFLDIQQKFmWHPGÍLYKAKRLFPP QLY-LVVKSFLEERTFHVSVDGYKS SIKPI/1AGVP

I LYVDYL1TK---SWUTSLVTLQFSRKFViRVGVHSI 1QQLQEVKTG PKI I KY1KNFTEGRK1 TVRVGPUTS SPLPLFNGIP

3 TI HSFVTNlFRSFE AGTOLDAÏYTDFHAKFDSLPHSL1IAKLSKLGFG DGIISVLSSYLSNRSCRVKTGSYLS EEFFCTSGVP

4___5 ___6___

NLRlCth QGAVLSPTLYNIFTYDVVRETTNH--------lGLKADDTALYHSAENS ADIVTH LQHIG RXYQQY M NKUK1 NtllKQKTQA

Doc QGS4bGPILYTLY1AT>FPIDYNLT--------TSTFADDTAILSRSKCP 1KATAL LSRHLTSVERVLADVRISWVGKCKQ

F QGSVLGPTLYLIYTAOIPTNSRL T-------VSTFADDTAILSRSRSP IQATAQ LALYLl DIKKVLSDVRIKVHEQKCKH

G QGSYLGPILYTLYTAOLPITPSRSL----■—T VAT KADDTAT L ASKS DP QEAST1 ILSQLDALDPVLKRVTÏAVÏtADILSSQ

Joe. С. QGSVLGPTLYSTFTADMPNQHAVTG LAEGEVL I ATi'ADDIAVLTKSTCI VEATDA IQCYLDAFQEVAVKHNVSINAGKCAN Joc.m. QGSVLGPTLYSVFASDMPTIfTPVTE VDEEDVL IATYADOTAVLTKSKSI LAATSG bQEYLDAFQQVAENVNVRIHADHLCAN I GGSPISVILFF1AFNKLSNI[SLHK . El К FNAYküDFFLlINFNKN TNTNEN bDHLFDDlENWCSYSG ASLSLSKCQl! Tí QGCVLSPLLFSLF1NDVCNVLPPDG ------ HLLYAOOIKIFLPVSSS -SDCMS bQKYLNAFVHWCSSNLLRLCPDKCSV

Рис.4 Сравнение консервативной части аминокислотной последовательности обратной транспозазы. Приведены последовательности Non-LTR ретротранспозонов I, G, F, Doc и Jockey O.nelano-gaster (Fawcett et al., 1986; Dl Hocera, Casarl, 1987; Dl Mocera, 1988; O'Hare et al., 1991; Prllmagl et al.,1987), Jockey-элемента D.funebris (Mlzrokhl, Kazo, 1990) и,

Tl-элемента A.gamblae (Beeansky, 1990). Жирным шрифтом обозначены аминокислоты,

совпадающие с последовательностью ревертазы HLRiCh-элемента.

N

Вида

Число мест гибридаз.

100 100 100

genoß ChironoimiB комплекс pseudottammi

1. C.ûorsallB

2. C.melanescens

3. С.ар. n

комплекс thunnil группа piger

4. C.piger > 100

5. C.tbunmi (lab.population>> 100 C.thurorai (nat. population^ 120

группа plumosua

6. C.plumosus

7. C.balatonicus

8. C.borokenslB |9. C.entiB

10. С. nudlventris

11.C.agilis 2

комплекс thurani

12.C.nuditarBiB

13.C.riihlroakensis

14.C.Bororius

15.C.obtuBldenB

16.C.axinularlus

17.C.cingulatus

18.C.BolItuB

60 -60 -50 -50 -50 -50 -

50 -50 -20 -20 -<20 <20 <20

100 100 80 80 80 80

80 80 50 50

4.Обнаружение и характеристика HLRICh элементов в других видах хирономид

Возможность успешного анализа распространения описанного Non-LTR ретротранспозона NLR1 у родственных видов хирономид основывалась на консерватизме RT-дсмена Non-LTR ретротранспо-

зонов. В таб.1 приведены результаты In situ гибридизации \43 клона, содержащего NLR1Cth-элемент, на политенные хромосомы различных видов хирономид. Было установлено, что гомологичные элементы поли-локальш. Из этих" данных следует, что рет-роэлемент IJLR1 широко представлен, а возможно, и специфичен для видов рода Chtronoraus. На основании данных об эволюционной близости исследованных видов и данных о представительности NLR1-ретротранспозона у этих видов, можно сделать вывод о том, что различие в количестве копий элемента между видами в общем отражает их эволюционную удаленность.

Степень структурного подобия элементов этого семейства у разных видов также коррелирует с их эволюцион-

genus Camptochironomus

19.C.tentans

genus CryptochironoinuB

20.С. gr.delectus genus Glyptotendipes

21.G.barbipes genus Llplniella

22.L.arenicola

23.L.rooderata

20 - 50

Таб.

I. Число сайтов гибридизации H^-x43 зонда на политенные хромосомы видов ceM.Chironominae.

Рис.6 Southern-blot гибридизация геномной ДШС разных видов хирономид с фрагментами NLRICh-элемента. BglII-гидроли-зованную геномную ДНК видов разделяли в 1,2% агарозном геле и переносили на капроновый фильтр. Гибридизация с Р-меченным клоном рДЗНН, представляющим весь N1R1Ch-элемент (А). Гибридизация с Р-меченным клоном р43А (В)

ной близостью. Так, у близких видов C.thunmi и С.piger проявляются все три внутренних BglII-фрагмента. У эволюционно удаленных от C.thurrmi видов группы plumosus гомология проявляется только с BglII$parMeHTaMH 3'-концевой части 0RF2 NLR1, которые отличаются по размеру от гомологичных BglII-фраг-ментов NLRICth. У видов, не входящих в эту группу, C.nuditarsis и C.balatonicus, величины фрагментов одинаковы и отличаются по размеру от гомологичных фрагментов как C.thunmi, так и 'видов группы plumosus. На основании этих данных можно заключить, что в роде Cironomus существует как минимум 3 семейства гомологичных элементов.

\

ВЫВОДЫ:

1) Доказана мобильность ранее описанного вероятного транспозона ИЕС C.thunmi.

2) Выявлено и охарактеризовано с помощью In Bitu и Southern-blot анализа 4 геномных клона содержащих мобильный элемент.

3) Установлена полная нуклеотидная последовательность мобильного элемента принадлежащего к классу Non-LTR ретротранспозонов.

4) Проведен сравнительный анализ нуклеотидной последовательности Non-LTR ретротранспозона NLR1 Ch с известными мобильными элементами этого класса.

5) С помощью In situ гибридизации показано, NLR1 -элементы распределены на хромосомах полилокально и специфичны для рода ChironomuB.

6) С помощью Southern-blot анализа показано, что в роде ChironomuB присутствует как минимум три семейства Non-LTR ретротранспозонов.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Blinov A.C., Sobanov Y.V., Gaidaroakova E.K., Bogachev S.S., Kolesnikov N.N., Filippova U.A., Kiknadze 1.1. MEC: A transpoeable element Iron Chironomus thunini (Diptera). Ио1. Gen. Genet. 1991, V.229, P.152-156

2) Blinov A.G., Sobanov Y.V., Bogachev S.S., Filippova M.A., Donchenko A.P. Chironomus thummi genome contains a Non-LTR retrotranspoBon. Mol. Gen. Genet. 1993, V.23T, P.412-420

3) Blinov A.G., Sobanov Y.V., Scherbic S.V., Filippova И.А. Distribution of the NLRCthl Non-LTR retrotransposon. Abst. ol the VI International Balbiani ring workshop. Jackson, USA, 1993