Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адаптивная роль хромосомных инверсий у личинок рода Chironomus

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Адаптивная роль хромосомных инверсий у личинок рода Chironomus"

На правах рукописи

0

Большаков Виктор Викторович

АДАПТИВНАЯ РОЛЬ ХРОМОСОМНЫХ ИНВЕРСИЙ У ЛИЧИНОК РОДА Chironomus (Díptera, Chironomidae)

03.02.08 - Экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Борок-2013

г 9 АВГ 2013

005532288

Работа выполнена в лаборатории биологии и систематики водных беспозвоночных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН

Научный руководитель Андреева Алла Михайловна

доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН, ведущий научный сотрудник

Гришанин Андрей Константинович

доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН, старший научный сотрудник. Стегний Владимир Николаевич,

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет», заведующий лабораторией Эволюционной цитогенетики НИИ биологии и биофизики.

Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Защита состоится 3 октября 2013 в 10.00 на заседании диссертационного совета ДМ 002.036.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН по адресу: 152742 Ярославская обл., Некоузский район, п. Борок, ИБВВ РАН; тел./факс: (48547) 24-0-42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН.

Автореферат разослан « /£_ » <1д 1.

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Л. Г. Корнева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований.

Личинки хирономид — один из важнейших элементов водных экосистем. Они участвуют в самоочищении водоёмов и являются ценным кормовым объектом многих видов рыб. Представители рода Chironomus заселяют самые разнообразные водоёмы, от луж до водохранилищ. Ареал их обитания охватывает все континенты, исключая Антарктиду (Michailova, 1989; Butler et al., 1999; Голыгина, 1999; Шобанов, 2000; Гурьев, 2002; Гундерина, 2010). Одним из механизмов адаптации у хирономид, по мнению многих авторов, является хромосомный полиморфизм (Кикнадзе и др., 1991; Гундерина и др., 1999; Шобанов, 2000). При детальном изучении цитогенетической структуры популяций обнаруживаются уникальные сочетания дисков хромосом, характерные для конкретных условий обитания, при этом географической изменчивости практически не выявлено (Дёмин, Шобанов, 1990; Гундерина и др., 1999). Это позволяет предположить, что в цитогенетической структуре популяции заложены регуляторные механизмы, обеспечивающие адаптацию особей к специфическим условиям среды. В процессе хромосомных перестроек могут затрагиваться гены, участвующие в обеспечении тех или иных физиологических функций организма (Жимулёв, 2003). Важнейшей функцией организма является дыхание. Оно обеспечивается, в том числе, гемоглобином -основным белком гемолимфы, который может рассматриваться в качестве удобной модели для оценки влияния различных хромосомных перестроек на физиологическое состояние личинок хирономид. Поэтому адаптивную значимость некоторых типов инверсий у полиморфных видов хирономид можно исследовать с помощью анализа изменчивости гемоглобина.

Цель работы: Исследовать влияние хромосомной изменчивости на способность личинок рода СЫгопотт заселять различные биотопы (типы и зоны водоёмов). Для достижения поставленной цели решались следующие Задачи:

1. Изучить уровень внутривидового хромосомного полиморфизма и особенности распределения инверсий у 5 видов СЫгопотт в зависимости от условий обитания.

2. Изучить внутри- и межвидовое разнообразие гемоглобинов у личинок из разных условий обитания и выявить наиболее изменчивый из исследуемых видов рода СЫгопотии.

3. Оценить связь между разнообразием фракционного состава гемоглобинов у СЫгопотиз рЫтохт из разных условий обитания и цитогенетической структурой кариотипа.

4. Оценить уровень структурного разнообразия гемоглобинов у исследуемых личинок рода СЫгопотт.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Впервые обобщён обширный материал по цитологическим и биохимическим исследованиям хирономид. При изучении локальных популяций Ch. plumosus удалось выделить типы популяций: терминальные (обладающие специфическим (ограниченным) набором геномных комбинаций, приспособленных к конкретным условиям обитания) и интерстициальные (обитают в условиях, обеспечивающих выживание и воспроизводство особей из нескольких терминальных популяций). Выявление терминальных и интерстициальных популяций позволяет по-новому рассматривать процессы микроэволюции и видообразования у хирономид. У Ch. plumosus в плече В обнаружена и прокартирована новая последовательность - pluB9. Исследованы кариотипы межвидовых гибридов Ch. plumosus х Ch. entis

(впервые для Палеарктики), Ch. plumosus х Ch. muratensis (впервые для Рыбинского водохранилища). В фенотипах гемоглобинов исследованных видов хирономид обнаружены новые, неотмеченные ранее, фракции гемоглобина. Обнаружено влияние различных вариантов хромосомных инверсий в плечах А, В и С на частоту встречаемости и относительное содержание различных фракций гемоглобина. Впервые описано высокое разнообразие нативных гемоглобинов - от мономеров до октамеров, построенных из различных низкомолекулярных субъединиц. Анализ множественности структурных вариантов гемоглобинов расширяет представления об эволюции данного белка у беспозвоночных. Результаты работы позволяют дополнить картину филогенетических отношений внутри рода Chironomus, расширяют представление о структурной организации гемоглобинов хирономид. Выявлена дифференциация функций разных структурных форм гемоглобинов на стадиях метаморфоза у Ch. riparius: в то время как содержание тетрамеров относительно стабильно, содержание тримеров, димеров и мономеров снижается. На примере Ch. riparius показано участие гемоглобинов в энергетическом и пластическом обмене.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Материалы, представленные в работе, могут найти применение при разработке методик с использованием некоторых видов хирономид в качестве универсальных биологических маркеров.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА. Все диссертационные материалы получены непосредственно автором или при его непосредственном участии.

Считаю своим долгом выразить признательность заведующему лабораторией Биологии и систематики водных беспозвоночных д.б.н. H.A. Шобанову за предложенную тему исследования и всестороннюю поддержку, а также сотрудникам всех лабораторий ИБВВ РАН за оказанную помощь.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы были представлены на XIII международной школе-конференции «Биология внутренних вод» (Борок, 2007); XXVIII международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоёмов Европейского Севера» (Петрозаводск, 2009); XIV международной школе-конференции молодых учёных «Биология внутренних вод» (Борок, 2010); международной конференции «Зоологические исследования в регионах России и на сопредельных территориях» (Саранск, 2010); международной конференции «Экология малых рек в XXI веке» (Тольятти, 2011); всероссийской конференции с международным участием «Физиологические, биохимические и молекулярно-генетические механизмы адаптаций гидробионтов» (Борок, 2012).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 9 статей, из них 3 в журналах из списка рекомендованного ВАК.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на 189 страницах машинописного текста, состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы, включающего 282 источника, в том числе 160 на иностранном языке. Содержит 51 таблицу и 60 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА I. Обзор литературы.

В главе представлены сведения об объёме и структуре рода Chironomus. Приведены данные о степени как внутривидовой, так и межвидовой изменчивости хирономид на цитологическом и биохимическом уровне. Рассмотрены закономерности распределения хромосомных инверсий по ареалу обитания хирономид. Подробно изложена информация об эволюции, структуре и функции гемоглобинов животных, находящихся на разных ступенях эволюции и развития. Приведены данные о хромосомной локализации генов глобинов у хирономид. Описаны различные методические подходы к изучению гемоглобинов. Представлена информация о степени изученности гемоглобинов хирономид.

ГЛАВА II. Материалы и методы.

Работа выполнена в ИБВВ РАН на базе лаборатории Биологии и систематики водных беспозвоночных и Центра коллективного пользования «Молекулярные технологии», в период с 2007 по 2011 гг.

Материалом исследования послужили личинки Chironomus IV возраста из природных популяций Ярославской, Ленинградской, Костромской и Тверской областей, а также из лабораторной культуры ИБВВ РАН, собранные с 2007 по 2010 год.

Места сбора проб: 1). ст. «Пятачок» - Рыбинское водохранилище, окрестности пос. Борок. 2). ст. «Заручье» - р. Ильдь, окрестности д. Заручье. 3). ст. «Ива» - р. Ильд, берег напротив д. В. Никульское. 4). ст. «Оз. Победное» - Ленинградская область. 5). ст. «Сток» с очистных сооружений около пос. Борок. 6). ст. «Устье р. Сёбла». Тверская область. 7). ст. «Кострома», Костромская область. Пруд около очистных сооружений г. Костромы. 8). ст. «р. Устье», окрестности п. Семибратово. 9). Лабораторная культура CA. riparius ИБВВ РАН.

Объекты исследования: Chironomus agilis Shobanov et Djomin 1988, Chironomus entis Shobanov 1990, Chironomus muratensis Ryser, Scholl, Wülker 1983, Chironomus plumosus L. 1758, Chironomus riparius fsyn: C. thummi) Meigen 1804

Материал собирали при помощи дночерпателей Экмана-Берджи с площадями захвата 1/40 и 1/100 м2. Один сбор включал от 5 до 30 подъёмов дночерпателя, в зависимости от количества личинок. В большинстве случаев личинок выбирали из грунта на месте сбора, а в ряде случаев грунт, промытый в мешках из газового сита №10, хранили в холодильнике и разбирали в течение одного дня.

В работе применяли многоуровневый анализ, подразумевающий строгую последовательность действий при предварительной подготовке образцов (рис. 1). Она включала в себя отбор и замораживание гемолимфы, фиксацию тела личинки в растворе Карнуа, определение пола и возраста индивидуально для каждой особи.

Рис. I. Последовательность действий предварительной подготовки препаратов для цитологических и биохимических исследований, а - личинка, б - чашка Петри с дистиллированной водой, в -фильтровальная бумага, г - часовое стекло, д - препаровальная (вольфрамовая) игла,

е — гемолимфа, ж - пробирка с сахарозой для хранения гемолимфы, з -пробирка с раствором Карнуа для фиксации тела личинки.

По стандартной методике изготавливали морфологические и давленные цитологические препараты хромосом (Дёмин, 1989). Фотографирование хромосом проводили на микроскопе Jenaval с объективом х40 при помощи фотоаппаратов Canon PowerShot А410 и А720. При идентификации видов по кариотипу предпочитали использовать цитофотокарты из Атласа «Кариотипы и морфология личинок трибы Chironomini» (Кикнадзе, Шилова и др., 1991), и картирование по модернизированной системе Максимовой (Максимова, 1976; Шобанов, 1994а). Инверсионные варианты хромосомных плеч обозначали по Шобанову (19946). Для фракционирования белков использовали методы диск-электрофореза, SDS-электрофореза, электрофореза в градиенте концентрации ПААГ. После электрофореза проводили специфическое (бензидиновый реактив) и неспецифическое (Coomassie brilliant blue R-250) окрашивание (Maypep, 1971). Молекулярные массы (ММ) белков определяли в градиенте концентраций 5 - 40% ПААГ (Андреева, 2008) и денатурирующих условиях в ПААГ с 8М мочевиной (Creighton 1979, 1980) и в SDS-ПААГ (Laemmli, 1970), в качестве маркеров использовали сывороточный альбумин человека (САЧ) и овальбумин (OA) и набор маркеров PageRuIer™ Prestained Protein Ladder Plus (Fermentas). Результаты обрабатывали с помощью специализированного программного пакета «OneDscan

Таблица 1.

Количество кариологических препаратов и образцов гемолимфы хирономид

Вид Карио-логическии анализ* Электрофорез**

диск-. 2D-SDS 2D-Grad 2D-8M urea

Ch. plumosas 370 632 23 7 11

Ch. agilis 5 5 1 1 1

Ch. entis 5 3 1 1 1

Ch. muratensis 124 146 2 1 1

Ch. riparius 39 52 4 26 1

Всего исследовано около 1500 образцов

^количество изготовленных кариологических препаратов, **количество образцов гемолимфы в электрофорезе.

ГЛАВА III. Кариофонды популяций.

III. 1. Кариогип Chironomus agilis

У личинок Ch. agilis со станций «Пропасть» и «устье р. Сёбла» обнаружено 7 дисковых последовательностей хромосом: agiAl, agiB2, agiCl, agiDl, agiEl, agiFl, agiGl. Выявлена высокая морфологическая вариабельность хромосомы IV: по активности колец Бальбиани и степени конъюгации гомологов. Все особи представлены одной геномной комбинацией А 1.1.В 2.2.С 1.1.D 1.1. Е 1.1.F 1.1. G 1.1.

III. 2. Кариотип Chironomus entis

У личинок Ch. entis со станции «устье, р. Сёбла» обнаружено 9 дисковых последовательностей хромосом: entAl, entA2, entBl, entCl, entC2, entDl, entE2, entFl, entGl, отмечены три геномные комбинации, среди которых доминирует А 1.1. В 1.1. С 2.2. D 1.1. Е 2.2. F 1.1.G 1.1.

III. 3. Кариотип Chironomus muratensis

У личинок Ch. muratensis со станций «Ива», «Пропасть» и «устье р. Сёбла» нами обнаружено 11 дисковых последовательностей хромосомных плеч: murAl, murA2, murBl, тигВ2, тигВЗ, murCl, murDl, murD2, murEl, murFl, murGl. Отмечена зависимость частоты встречаемости некоторых зиготических сочетаний от глубины обитания личинок. Всего отмечено 8 геномных комбинаций, среди которых доминировала А 1.1. В 1.1. С 1.1. D 1.1. Е 1.1. F 1.1. G 1.1.

III. 4. Кариотип Chironomus plumosus

У личинок Ch. plumosus со станций «Пятачок», «Ива», «Пропасть» «оз. Победное», «Кострома», «р. Устье», «устье р. Сёбла» обнаружено 17 дисковых последовательностей хромосом: pluAl, pluA2, pluA3, pluA4, pluBl, pluB2, pluB9, pluCl, pluC2, pluDl, pluD2, pluD3, pluEl, pluE2, pluFl, pluF2, pluGl. Последовательность pluB9 описана впервые. Отмечено наибольшее разнообразие геномных комбинаций - 38. Доминировали, в основном, А 1.1. В 22 С 1.1. D 1.1. Е 1.1. F 1.1. G 1.1. и А 1.1. В 1.1. С 1.1. D 1.1. Е 1.1. F 1.1. G 1.1.

III. 4.1. Анализ частоты встречаемости зиготических сочетаний СЛ. plumosus из различных биотопов Рыбинского водохранилища и его притоков.

При изучении структуры кариофондов популяций Ch. plumosus были выделены популяции-близнецы, разделённые десятками и сотнями километров и различающиеся, как разные выборки из одного биотопа. С другой стороны, обнаружены популяции, расположенные в непосредственной близости друг от друга, которые не имели общих генотипических комбинаций, и популяции, включающие в себя две кариоформы без гибридных (переходных) вариантов (Шобанов, 1994г). Кариоформа — ограниченная совокупность генотипических комбинаций, характерных для популяций, обитающих в определённых условиях, к которым эти кариоформы адаптированы (Шобанов, Большаков, 2011). Одним из примеров пространственно-генетического мозаицизма Ch. plumosus могут служить популяции из района Рыбинского водохранилища: где можно выделить «Прудовую», характеризующуюся наличием гомозиготы pluB 1.1., и «Водохранилищную», включающую pluB 1.2. и pluВ 2.2., кариоформы (Шобанов, 1994г).

Нами были проанализированы популяции из акватории Рыбинского водохранилища и его притоков (ст. «Пропасть», «Заручье», «Пятачок») обитающие в биотопах с промежуточными характеристиками: с небольшими глубинами, как и в прудах, и с гидрологическим и гидрохимическим режимами близкими к водохранилищным.

При анализе частоты встречаемости зиготических сочетаний хромосомных плеч у Ch. plumosus, во всех отмеченных выше биотопах были встречены «Прудовые» и «Водохранилтцные» кариоформы. Частота встречаемости «Прудовой» кариоформы варьировала от 6 до 75%, а «Водохранилищной» от 3 до 94%. В 4-х случаях из б доминировала «Водохранилищная» кариоформа, составляя от 88 до 94% от общей численности, и в 2-х - «Прудовая», 66 и 75%. Закономерность в этом случае отметить сложно. Различия наблюдались даже в пробах, сроки сбора которых разделяли две недели. Возрастная структура обеих кариоформ в отдельно взятой пробе была примерно одинаковой. Следовательно, в данных условиях они представлены личинками, вышедшими из кладок, отложенных в исследованных биотопах в один и тот же период. В случае иммиграции возрастная структура «Прудовых» и «Водохранилшцных» кариоформ была бы различной, поскольку в прудах вылет происходит значительно раньше (примерно на 1-1.5 мес.), чем в водохранилище. Таким образом, в районе Рыбинского водохранилища можно наблюдать популяции населённые прудовыми и водохранилшцными кариоформами, между которыми отсутствует панмиксия (свободный генетический обмен), и в тоже время есть биотопы, в которых обитают как прудовые, так и водохранилищные кариоформы.

III. 5. Кариотип Chironomus riparius

Представлено описание кариотипа Chironomus riparius по Кикнадзе и др., (1991).

III. 6. Кариотипы межвидовых гибридов видов-близнецов.

На станции «устье р. Сёбла» в результате кариологического анализа были обнаружены межвидовые гибриды: Ch. plumosus х Ch. muratensis, и Ch. plumosus x Ch. entis.

III. 6.1. Кариотип межвидового гибрида Ch. plumosus x Ch. muratensis.

Отмечен впервые для Рыбинского водохранилища. Хромосома I. Морфологическое строение плеч (активные районы) murAl, murB2, pluAl и р!иВ2 характерно для родительских форм. Хромосомы расконъюгированы. Хромосома II. Плечи с последовательностями murCl, murDl, pluC2, pluD2 морфологически сходны с родительскими формами. Гомологи сконъюгированы в районе 12-13. В районе 16 последовательности murCl отмечен характерный для вида Ch. muratensis пуф. Хромосома III. Особенности строения murEI, pluE2 характерны для родительских форм. Хромосома IV. Особенности строения плеч murGl и pluGl характерны последовательностям родительских Ch. muratensis видов. Морфология хромосом также характерна для родительских видов.

III. 6. 2. Кариотип межвидового гибрида Ch. plumosus х Ch. entis.

Ранее гибрид был описан только для Неарктики (Голыгина, и др., 2007).

Хромосома I. Морфологические особенности плеч entA2, entBl, pluAI, pluB2 характерны для родительских форм. Хромосомы сконъюгированы в прицентромерном районе. Хромосома II. Морфологические особенности в строении плеч и дисковые последовательности entC2, entDl, pluC2, pluDl характерны для родительских форм. Хромосомы сконъюгированы в районе 20-22. Хромосома III. Плечи entEI, entFl, pluEl, pluFl у обоих видов обладают одинаковыми дисковыми последовательностями, и строение характерно для обеих родительских форм. Хромосомы сконъюгированы в районе 16-19. Хромосома IV. Хромосомы имеют одинаковую последовательность entGl, pluGl, морфологические особенности хромосом характерны для обеих родительских форм.

При анализе дисковых последовательностей хромосом обоих межвидовых гибридов выявлены некоторые закономерности: в обоих случаях обнаружены

последовательности p¡uB2, pluC2, при этом последовательности pluB2, murBl, eníB2 имеют одну общую инверсию (относительно pluBI). Подобное явление наблюдается и с последовательностями pluC2, eníC2 имеющих общую инверсию в районе 16-22. Последовательности плеча F аналогичны pluFl.

ГЛАВА IV. Фракционный состав гемоглобинов у хирономид из группы plumosas

IV. 1. Классификация фракционного состава гемоглобина у хирономид из группы plumosus. Фенотипы гемоглобинов (НЬ) классифицировали в соответствии с количеством фракций и их электрофоретической подвижностью (Rf). Такой подход позволил из массива полученных данных выделить особей, обладающих одинаковым фракционным составом гемоглобинов, и провести их сравнительных анализ.

IV. 2. Фракционный состав гемоглобинов Chironomus riparius.

Гемолимфа исследована у 52 личинок, собранных с двух станций. У личинок из стока с очистных сооружений, собранных 24.11.2008, было обнаружено 4 фенотипа гемоглобинов, включающие от 6 до 9 фракций. Сбор и отбор гемолимфы 26.11.2008 — обнаружено 8 фенотипов, включающих от 4 до 9 фракций, в том числе 3 фенотипа дополнительной фракцией с подвижностью 0.60. У части личинок, собранных 26.11.2008, содержавшихся в отстоянной воде, без пищи и субстрата до 09.12.2008 (отбор гемолимфы), в электрофорезе отмечено исчезновение фракций с Rf 0.74 и 0.80. У личинок из лабораторной культуры была обнаружена дополнительная фракция с Rf 0.60, при этом фракции 0.48, 0.68 и 0.69 не обнаружены ни у одной особи; всего отмечено 4 фенотипа, включающих от 5 до 7 фракций.

IV.3. Фракционный состав гемоглобинов Chironomus muratensis.

На станции «Ива» (06.09.2007) исследована 51 личинка, у которых отмечено 13 фенотипов НЬ из 3 - 7 фракций. На станции «Пропасть» (28.06.2007) собрана 91 личинка, выявлено 4 фенотипа из 4 - 6 фракций. На станции «устье р. Сёбла» (04.09.2010) было найдено 4 особи с одним фенотипом из 5 фракций. При анализе фенотипов НЬ личинок с данной станции обнаружена обратная зависимость между отдельным содержанием фракций: 0.43 и 0.62, а также 0.77 и 0.82.

IV. 4. Фракционный состав гемоглобинов Chironomus plumosus.

На станции «Пятачок»: 28.06.2007, 02.07.2007, 13.09.2007, 05.06.2008, 03.07.2008, была изучена гемолимфа 87 особей и описано 70 фенотипов гемоглобинов из 4 - 11 фракций. Наиболее часто встречались варианты, содержащие 7 и 8 фракций, наиболее редко — варианты из 4 и 11 фракций. На станции «Пропасть» (28.06.2007) изучено 20 особей, обнаружено 17 фенотипов гемоглобинов, включающих от 6 до 11 фракций индивидуально, доминировали фенотипы из 8 и 10 фракций. Станция «оз. Победное» (05.12.2008), у 8 особей отмечено 8 фенотипов, включающих от 6 до 10 фракций. Станция «Кострома» (11.01.2009) изучено 20 особей, отмечено 17 фенотипов гемоглобинов, включающих от 6 до 11 фракций индивидуально. В 6 вариантах были отмечены дополнительные фракции с подвижностью выше 0.51 (0.51*) и 0.64 (0.64*), нигде более не встречавшиеся. На станции «р. Устье» (30.01.2009) у 9 особей обнаружено 9 фенотипов, включающих от 6 до 8 фракций индивидуально.

IV. 5. Особенности возрастных изменений фракционного состава гемоглобинов Chironomus plumosus

На примере Chironomus riparius было показано, что гемоглобин начинает синтезироваться у личинок начиная с I возраста; максимальной концентрации он достигает во время 5-8 фаз IV возраста; и полностью фенотип стабилизируется у личинок 6-10 фаз IV возраста (Шобанов, 1993), что объясняют последовательным

включением глобиновых генов (Wuelker, et. al., 1969). Таким образом, у Ch. riparius фракционный состав гемоглобинов формируется постепенно: с III возраста по 4-ю фазу IV возраста количество медленных фракций гемоглобинов увеличивается с 2 до 10 (Шобанов, 1993). Нами у Ch. plumosus 2-й фазы IV возраста, обнаружено до 7 фракций гемоглобина, у личинок 3-й фазы IV возраста от 6 до 10 фракций, в тоже время для личинок 4-8 фаз IV возраста характерно от 4 до 11 фракций.

ГЛАВА V. Корреляция уровня инверсионного полиморфизма хромосом и фракционного состава гемоглобинов Ch. plumosus

Личинки Ch. plumosus из изученных биотопов обладали высоким уровнем изменчивости как на биохимическом (98 фенотипов гемоглобина), так и на цитологическом уровнях (отмечено 36 геномных комбинаций). Инверсии затрагивали хромосомные плечи - А, В, С, D и Е. Индекс разнообразия Шеннона в различных сборах принимал значения от 0.57 до 1.00 для геномных комбинаций, и от 0.50 до 0.90 для фенотипов гемоглобинов.

V. 1. Результаты кластерного анализа

В результате анализа нами выявлена слабая обратная зависимость между количеством фракций в фенотипе и присутствием последовательности рІиАЗ в гетерозиготе с pluAl.

V. 2. Результаты регрессионного анализа

Используя уравнение множественной регрессии нам удалось установить что, последовательности дисков хромосом в плече А достоверно оказывают влияние на относительное содержание (ОС) и частоту встречаемости (ЧВ) гемоглобинов 1 и 4 (рис. 2). Так, относительное содержание компонента 1 при сочетании pluAl.l составляет 4.6%, при pluAl.3 - 1.2%, а у особей с сочетанием pluA1.2 данный компонент отсутствует. При этом частота встречаемости компонента 1 при сочетании pluAl.l и pluAl.3 различается незначительно. Относительное содержание компонента 4 во всех случаях составляет около 5%, в то же время частота встречаемости этого компонента в случае стандартной последовательности находящейся в гомозиготе pluAl.l, составляет 79%, в случае pluAl.2 - 42%, и у особей с pluAl.3 - 54%.

суммарный спектр

Л/

о.о

0.25

«ОС» «ЧВ»

/Ї" компонента(%) « компонента (%)

Al.l Al.2 А1.3

«ОС» компонента(%)

А1.1 А1.2 А1.3

«ЧВ» компонента (%)

Достоверность при р=0.05

Al.l Al.2 А1.3

I

м-

1

Al.l Al.2 А1.3

Рис. 2. Влияние последовательностей плеча А на фенотип гемоглобинов (обозначения см. в тексте).

Последовательности дисков хромосомы I плеча В оказывают влияние на частоту встречаемости 6 фракции (рис. 3). В случае стандартной последовательности р!иВ1.1 он встречается у 70% особей, в то время как у особей с р!иВ1.2 и р1иВ2.2 в 91и 95% случаев соответственно.

суммарный спектр

«ЧВ» компонента (%)

Рис. 3. Влияние последовательностей плеча В на фенотип гемоглобинов (обозначения см. в тексте).

Достоверность при р=0.05

На компоненты 3 и 9, вероятно, оказывают влияние последовательности дисков хромосомы II плеча С (рис. 4). Частота встречаемости этих компонентов составляет во всех случаях около 60%. В то время как относительное содержание значительно различается. При сочетании р1иС1.1 относительное содержание фракции 3 составляет 9.3%, при р!иС1.2 снижается до 5.8%. Относительное содержание фракции 9, прир1иС1.2, наоборот, увеличивается с 4.8% до 8.4%.

суммарный спектр «ОС» КОМПОНеНТа(%) «ЧВ» КОМПОНеНТЭ (%)

«ОС» компонента(%) «ЧВ» компонента (%)

/ ¡2 то |

І і

Рис. 4. Влияние последовательностей плеча С на фенотип гемоглобинов (обозначения см. в тексте).

Досгозерность при р=0.05

ГЛАВА VI. Структурная организация гемоглобинов хирономид рода СЫгопотт.

Разделение белков проводили в нативных (диск-электрофорез, электрофорез в градиенте концентраций ПААГ) и денатурирующих условиях (БОБ-электрофорез, электрофорез с 8М мочевиной).

VI. 1. Анализ молекулярных форм гемоглобинов гемолимфы

VI. 1.1. Разделение гемоглобинов гемолимфы по заряду

В диск-электрофорезе у СИ. agilis выявлено более 11 фракций гемоглобина, у СИ. еи/и более 12, у СИ. тигШет'к более 12, СИ. рЫтоят более 14 и у СИ. прапш более 16.

VI. 2. Дифференциация нативных молекул гемоглобинов по молекулярной массе в градиенте концентраций ПААГ

В градиенте концентрации ПААГ гемоглобины СИ. agШs представлены молекулами с ММ от 14.2 до 120 Ша (всего 16 компонентов), СИ. епШ - от 16.6 до 120 Ша (14 компонентов), СИ. тигмет'к - от 14.7 до 133 Ша (17 компонентов), СИ. рЫтозю — от 16 до 144 Ша (17 компонентов) и СИ. прапш - от 15.2 до 59 Ша (15 компонентов). У гибрида СИ. рЫтоьш х СИ. тигмет'хь - от 13.8 до 130 Ша (15 компонентов).

VI. 3. Разделение гемоглобинов по молекулярной массе в электрофорезе с 8М мочевиной

У СИ. agilis в невосстанавливающих условиях были обнаружены агрегаты гемоглобина с ММ от 38 до 618 Ша, СИ. ея/к - от 18 до 540 Ша, СИ. тигШетгз - от 40 до 141 Ша, СИ. рЫтоБиэ - от 16 до 847 Ша, СИ. прапш - от 47 до 523 Ша. Таким образом, в присутствии 8М мочевины мы наблюдали образование высокомолекулярных белковых комплексов, и лишь у СИ. епИ5 и СИ. р1ито$ж помимо агрегированных НЬ обнаружены и неагрегированные формы с ММ 18 и 16 Ша соответственно.

VI. 4. Анализ субъединичного состава гемоглобинов хирономид

В восстанавливающих условиях ЗОБ-электрофореза у СИ. agilis было обнаружено 16 различных субъединиц с ММ от 9.7 до 15.7 Ша, СИ. епШ — 15 субъединиц с ММ от 10.6 до 15.8 Ша, СИ. тигШею1$ - 18 субъединиц с ММ от 11 до 15 Ша, СИ. рЫтояш — 17 субъединиц с ММ от 13 до 16.5 Ша, СИ. прапия — 8 субъединиц с ММ от 11.8 до 15.2 Ша. У гибрида СИ. тиШетгь х СИ. р1итози.<; обнаружено 18 субъединиц с ММ от 10.9 до 15.6 Ша, у СИ. епШ х СИ. рЫтоэт обнаружено 16 компонентов с ММ от 11.6 до 15.6 Ша.

VI. 5. Анализ структурной организации гемоглобинов

Анализ дифференциации гемоглобинов в градиенте концентрации ПААГ и БОБ-электрофорезе позволил предположить, что в гемолимфе они представлены разнообразными молекулярными формами от мономеров до октамеров.

В гемолимфе СИ. agilis нами были обнаружены октамерные формы с ММ 120 Ша, пентамеры с ММ 56.7 и 68 Ша, тетрамеры с ММ 44 и 45.3 Ша, тримеры с ММ 33 и 35.4 Ша, димеры с ММ 24.7 и 26.2 Ша, мономеры с ММ 14.2, 18, 18.3, 19.4, 20.9, 22.8 Ша. У СИ. епШ обнаружены октамеры с ММ 120 Ша, гексамеры с ММ 75, пентамеры с ММ 60.5 Ша, тетрамеры (возможно пентамер) с ММ 65.6 Ша, тримеры с ММ 31.8, 38.2 и 39.6 Ша, димеры с ММ 21.01, 24.7 и 26.7 Ша, мономеры с ММ 16.6, 19.5 и 19.8 Ша. У СИ. тигШепь'и обнаружены октамеры с ММ 133 Ша, гексамеры с ММ 95 Ша, тетрамеры с ММ 50, 52 и 63 Ша, тримеры с ММ 28.3 и 34

Ша, димеры с ММ 20.3 и 24 Ша, мономеры с ММ 14.7, 15.8, 16.5, 17.5, 18.9, 19.7 и 21.9 Ша. В гемолимфе СИ. р1итозиз также обнаружены октамеры с ММ 144 Ша, пентамеры с ММ 77 Ша, тетрамеры с ММ 60 и 64 Ша, тримеры с ММ от 40, 44, 46,

47 и 48 Ша, димеры с ММ 27, 28, 29, 32 и 36 Ша, мономеры с ММ 16, 17, 20, 22.5 и 24 Ша. У Ск прагш обнаружены тетрамеры с ММ 59.6 Ша, тримеры с ММ 38.5 и 41.3 Ша, димеры с ММ 22.8, 23.5, 26.5, 27.5 и 30.2 Ша, мономеры с ММ 15.2, 17.1, 17.3,17.4, 19.5,20.1 Ша.

VI. 6. Сравнение субъединичного состава гемоглобинов изученных видов хирономид.

В результате сравнительного анализа структурной организации гемоглобинов у личинок СЫгопотив, мы установили, что медленные фракции НЬ представлены октамерами, гексамерами, пентамерами и тетрамерами, для средних фракций характерно более высокое разнообразие - гексамеры, пентамеры, тетрамеры, тримеры, димеры, и мономеры, в то время как быстрые фракции представлены, почти исключительно, мономерами.

Особенно стоит выделить Ск прапт, в гемолимфе которого наблюдается несколько меньшее разнообразие субъединиц формирующих отдельные фракции, а также отсутствие высокоагрегированных форм, характерных для других изученных видов.

VI. 7. Особенности агрегации белков гемолимфы хирономид в ПААГ с 8М мочевиной.

Практически все субъединицы гемоглобинов агрегировали в присутствии 8М мочевины, кроме одной из области с Я/ 0.68-0.70 Ск епИя и Ск р1ито$и$. Исключением являются высокомолекулярные агрегаты с ММ выше 500 Ша, формирующиеся белками, в нативных условиях обладающие различной электрофоретической подвижностью.

VI. 8. Анализ субъединичного состава гемоглобинов межвидовых гибридов хирономид.

При исследовании гемоглобинов из гемолимфы гибрида Ск рЫтоБт х Ск тига1ет'1$ мы отметили характерные для родительских видов субъединицы. В гемолимфе гибрида Ск ркипоьт х Ск епйз нами отмечено почти полное соответствие субъединичного состава гемоглобинов субъединицам Ск ел/и, исключением являются субъединицы из фракции с 7?/0.76-0.82 с ММ 11.6 Ша.

VI. 9. Молекулярные формы гемоглобина на последних фазах развития личинки Ск. прапт.

Рассчитано ОС тетрамеров (60 Ша), тримеров (42 Ша), димеров (27 и 22 Ша) и мономеров (17 Ша). Фракция на границе Кольрауша не окрашивалась на белок, однако, окрашивалась бензидином, поэтому мы предположили, что это гем-содержащий продукт деструкции гемоглобина гемин. Наибольшей стабильностью в онтогенезе обладают тетрамеры с ММ около 60 Ша (рис. 5). У предкуколки ОС этого компонента составляет около 35%, как для гемоглобина, так и для общего белка. ОС тримера с ММ 42 Ша, общего белка и гемоглобина, резко снижается через

48 часов после начала метаморфоза, стоит также заметить, что ОС белковых молекул выше в четыре раза, чем гем-содержащих. По ходу развития плавно снижается ОС (по пероксидазной активности) димерного гемоглобина с ММ 27 Ша. Однако относительное количество белка в этой фракции увеличивается. Содержание белковых компонентов с ММ около 22 Ша на протяжении развития куколки

постепенно повышается, а ОС гем-содержащнх молекул практически не изменяется. Количество молекул гем-содержащего белка с ММ около 17 Ша, остаётся практически неизменным, в то время как ОС белкового компонента постепенно снижается. ОС компонента с ММ около 10 Ша, вероятно не содержащего белка, значетельно возрастает (в 18 раз) через 24 - 48 часов после начала метаморфоза.

относительное содержание 60 50%

40%

30%

20%

10% 0%

42

27

22

17 ю Юа

' N

'А / » і » *

/ \ / ...............-г— г * * *

. и -І-..І — * -г-4=—1 . 1- .1. / _!-—

Рис. 5. Относительное содержание гемоглобина (пунктир) и общего белка (сплошная линия) в гемолимфе СИ. гірагіиз во время метаморфоза. Отмечены компоненты с ММ около 60, 42, 27, 22 и 17 Ша, и 10 Ша. «Ь» - личинки (предкуколки) перед началом метаморфоза и через 0.5, 15, 24 и 48 часов после начала метаморфоза.

VI. 10. Изменение относительного содержания структурных компонентов белка из гемолимфы СИ. титМет'к при изменении солёности.

При сравнении ОС белковых компонентов в гемолимфе личинок содержавшихся в условиях солёности 20 г/л в течение одного часа и 5г/л - 24 часа, мы отметили различия в изменении ОС гексамеров. При 20 г/л ОС белка (гексамера) снижается, в то время как при 5 г/л его содержание относительно стабильно. ОС белка из фракции 0.77, представленной мономерами, димерами и тримерами, увеличивается в обоих случаях. Вероятно, белки из данной фракции играют важную роль в поддержании стабильности внутренней среды. Подобное явление может иметь адаптивное значение в поддержании осмотического давления.

VI. 11. Результаты эксперимента по выживаемости личинок в условиях повышения солёности (адаптация к условиям солёности).

В результате анализа данных полученных из эксперимента по акклиматизации личинок СИ. р1ито$ш к условиям солёности от 1 до 5.3 %о в течение 10 дней, мы выявили незначительное повышение смертности особей из эксперимента. В первые три дня эксперимента солёность повышалась по 1 %о в день, за это время смертность в контроле составила 3.3, 11.3 и 12.7% соответственно, в то время как в эксперименте 8, 13.5 и 18.5% соответственно. Высокая смертность отмечена при 4 %о на 6 день эксперимента. Смертность в контроле составила 42%, в эксперименте 33.5% личинок. При дальнейшей акклиматизации при 5.3 %о в течение 4 дней смертность в контроле составила 12.7%, в эксперименте 18.5%. В итоге к концу акклиматизации в контроле выжило 17.3%, и в эксперименте 8% особей. Высокую смертность на 4 день, при повышении солёности с 3 до 4 %о, можно объяснить механическим повреждением (прокусыванием) покровов личинок соседними особями, т.к. в течение всего эксперимента личинки не питались. Однако подобная

картина наблюдалась и в экспериментах других исследователей: личинок содержали на искусственном грунте и подкармливали раз в три дня, и при 5%о на 6 день также гибло до 15% личинок Ch. riparius (Bervoets, Wils, 1996).

ГЛАВА VII. Обсуждение полученных результатов

VII. 1. Апализ хромосомной изменчивости

У Ch. agilis из Рыбинского водохранилища в каждом хромосомном плече зафиксировано по одной последовательности дисков, и единственная геномная комбинация А 1.1. В 2.2. С 1.1. D 1.1. Е 1.1. F 1.1. G 1.1., отмеченная при первоописании (Шобанов, Дёмин, 1988). Нами впервые с точностью до диска выполнено картирование плеча В. При этом последовательность плеча В представленная в первоописании (Шобанов, Дёмин, 1988) соответствует последовательности инверсионного варианта В2, описанного Кикнадзе (Кикнадзе и др., 1991). Последовательность В1, характерная для сибирских популяций, в Рыбинском водохранилище нами не отмечена, так же как и при первоописании (Шобанов, Дёмин, 1988). Таким образом, можно говорить о географической изменчивости дисковой последовательности в плече В: в сибирских популяциях встречается, в основном, последовательность agiBl, в то время как, в Рыбинском водохранилище, европейской популяции, исключительно agiB2.

У личинок Ch. entis из русловой части Рыбинского водохранилища отмечены три геномные комбинации, во всех случаях плечо Е представлено гомозиготой entE2.2. Ранее эта последовательность отмечалась в Палеарктике с частотой от 2 до 27% (Западня Сибирь - Новосибирская область, Урал - Томская область), и лишь в одном случае до 80% (Западная Сибирь - Томская область); в Неарктике не встречена (Kiknadze, Butler et al., 2000). В плече С у всех особей из изученных нами популяций встречена последовательность entC2, при этом entCl обнаружена только в гетерозиготе с enlC2, что характерно для европейских популяций (Дёмин, Шобанов 1990).

У Ch. muratensis из изученных популяций нами было обнаружено 11 дисковых последовательностей хромосомных плеч. В плече В отмечена редкая последовательность тигВЗ с частотой 14%. Последовательность murDl характерна для европейских популяций (Кикнадзе, Керкис, 1986). В Рыбинском водохранилище она встречается с частотой от 31 до 86%, при этом у личинок собранных с глубины 14 м (устье р. Сёбла) частота встречаемости murDl. 1. - 86%, на мелководье (до 1.5 м - ст. «Пропасть» и «Ива») - 31-69%. При изучении Ch. plumosus из озера Тиструп (Tystrup) Педерсен (Pedersen, 1984) отметил, что частота встречаемости р1иВ1.2. на глубине 18-20 м - 50-64%, а на 5-6 м от 0 до 9% (Pedersen, 1984). Подобное явление он связывает с тем, что последовательность pluBl.2. обусловливает способность личинок переносить почти полное отсутствие кислорода на большой глубине в течение длительного периода. Вероятно, в случае с Ch. muratensis мы наблюдаем сходное явление. Что может свидетельствовать об адаптивном значении последовательностей murDl. 1. и pluBl.2. (Кикнадзе, Керкис, 1986). Однако говорить лишь о недостатке кислорода было бы не совсем верно, т.к. личинки с pluBl.2. составляют значительную часть (до 41.5%) популяций обитающих в условиях с благоприятным кислородным режимом, и в тоже время они почти полностью отсутствуют в некоторых водоёмах с дефицитом кислорода (Шобанов, 1994г). Возможно, помимо кислородного режима важную роль играет давление водяного

столба (1 м - 73 мм рт. ст., или 10,3 м - 1 атм.). Однако нам не известны работы, в которых уделялось бы внимание данному фактору.

В изученных нами популяциях Ch. plumosus выявлено 17 последовательностей дисков хромосом, при этом одна обнаружена и прокартирована впервые, обозначена нами как р!иВЗ (Шобанов, Большаков, 2011). Однако данное обозначение было использовано ранее в работе Батлера с коллегами (Butler, Kiknadze et al., 1999) для другой последовательности, поэтому, логичнее присвоить обнаруженной нами последовательности - pluB9. Ранее в Рыбинском водохранилище и его окрестностях были выделены популяции «Прудовых» и «Водохранилищных» кариоформ, заселяющих различные по характеристикам биотопы (Шобанов, 1994г). В обследованных нами биотопах, обладающих промежуточными гидрологическими и гидрохимическими характеристиками (Шилова, Шобанов, 1984) были собраны личинки, обладающие как «Водохранилищными», так и «Прудовыми» геномными комбинациями. Проанализировав ранее полученные данные (Шобанов, 1994г) можно выявить ещё одну кариоформу, обитающую в оз. Искрецкое (Дарвинский заповедник), у которой доминирует кариотипическая комбинация А 1.1. В 1.1. С 1.1. D 1.1. Е 2.2. F 1.1. G 1.1. (86.8%). Отличительные особенности этой «болотной» кариоформы - в плече Е нет стандартных гомозигот, при этом Е2.2. встречается у 97.4% особей, а плечо В представлено исключительно последовательностью pluBl.l. Таким образом, в районе Рыбинского водохранилища выявлены популяции, между которым отсутствует непосредственный генетический обмен и популяции «генообменники». На основании этого, мы предлагаем разделить популяции Ch. plumosus на терминальные - обладающие ограниченным набором геномных комбинаций, приспособленных к конкретным условиям обитания, и интерстициальные - обитающие в условиях, обеспечивающих выживание и воспроизводство особей (кариоформ) из двух и более терминальных популяций (рис. 6) (Шобанов, Большаков, 2011).

Те

При изучении хромосомных препаратов из устья реки Сёбла нами были обнаружены гибриды Ch. plumosus х Ch. muratensis и Ch. plumosus x Ch. entis.

Гибрид Ch. plumosus x Ch. entis для Палеарктики отмечен впервые, ранее подобные гибриды отмечались лишь в Неарктике (Kiknadze, Butler et al., 2000), однако, не были прокартированы, что исключает возможность сравнения

Интерстициальные

Рис. 6. Схема района Рыбинского водохранилища и окрестностей пос. Борок. Расположение «Терминальных» и «Интерстициальных» популяций С/г. р/дагоя«.

полученных нами последовательностей. О находках гибридов Ch. plumosus х Ch. muratensis также отмечалось ранее (Голыгина, Истомина, 2007), однако, для Рыбинского водохранилища, и возможно для европейской части России отмечается впервые. При анализе кариотипов Ch. plumosus х Ch. muratensis и Ch. plumosus х Ch. entis были отмечены активные районы хромосом характерные для родительских видов. В обоих случаях были обнаружены последовательности pluB2 и pluC2, вероятно обеспечивающие возможность скрещивания родительских форм. По морфологическим признакам гибридные особи можно отнести к Ch. muratensis, или Ch. entis соответственно.

VII. 2. Изменчивость фракционного состава гемоглобинов

У Chironomus plumosus нами выявлено 98 внутривидовых фенотипов Hb, включающих от 4 до 11 фракций, с электрофоретической подвижностью от 0.17 до 0.83. Всего у Chironomus было обнаружено до 16 фракций Hb с Rf от 0.17 до 0.99, (Шобанов, 1986, 1993, 2004). Ранее фенотипы Hb ранжировали по количеству компонентов, без учёта электрофоретической подвижности отдельных фракций (Шобанов, 2000), что затрудняло анализ сходных фенотипов. Поэтому для упрощения ориентации в больших массивах данных нами был применён новый подход ранжирования (подробнее в дисс. гл. IV), который позволяет выстраивать их не только с учётом количества фракций, но и электрофоретической подвижности. Это позволило присвоить каждому фенотипу индивидуальный номер.

У Ch. riparius нами были обнаружены новые, не отмеченные ранее фракции (гл. IV.), которые, предположительно, могут быть как самостоятельными белками, так и продуктами деградации более «медленных» фракций (Шобанов, 1993); при этом у всех исследованных особей Ch. riparius отсутствовали три фракции белков, отмеченные ранее Шобановым (1993). У Ch. plumosus новые фракции отмечались с частотой до 35% (ст. «Кострома»), В гемолимфе Ch. muratensis фракция 0.46 не отмечена ни у одной особи, которая отмечалась Шобановым (2004) с частотой 18.2%. Можно заметить, что изменения в составе гемоглобинов носят как единичный, так и распространённый (обычный) характер, и так же встречаются у видов с низкой хромосомной изменчивостью. Некоторые изменения в составе гемоглобинов (исчезновение или появление фракции) могут быть проявлением стресса животных, в результате которого меняется ряд физиологических параметров. Например, на шести видах Chironomus показано, что ионный состав гемолимфы меняется в течение первых часов после физического раздражения личинок (Мартемьянов, Шобанов, 1997). В результате термического (химического и проч.) воздействия, уже в течение часа в гемолимфе обнаруживаются белки теплового шока (Morales et al., 2011). Другие изменения фракционного состава гемоглобинов могут быть результатом более длительного воздействия иных факторов. На примере ферментных систем Ch. riparius из трёх лабораторных культур, имеющих общее происхождение, показано, что спустя более чем 20 лет после их разделения увеличиваются генетические расстояния между исходной (Саратов — 1961г.) и дочерними популяциями (ИЦиГ-1, ИЦиГ-2 - 1981г.) (Гундерина и др., 1986). Нами отмечено, что у личинок Ch. riparius содержавшихся в отстоянной воде без субстрата и питания, из фенотипа исчезали фракции с Rf 0.74 и 0.80. Подобное сокращение концентрации дыхательных пигментов у некоторых беспозвоночных происходит в период линьки или отсутствия питания, что связывают с их пластической и энергетической функциями (Klotz, et al., 1948; Wieser, 1965; Алякринская, 1979).

Опираясь на эти данные, можно предположить, что белки с Rf 0.74 и 0.80, могут быть использованы личинками Ch. riparius в качестве источника питательных веществ в период отсутствия пищи.

Стоит отдельно отметить, что фракционный состав гемоглобинов Ск plumosus очень изменчив: мы не отметили ни одной фракции со 100% встречаемостью; лишь компонент 0.82 (димер) встречается у 99%, 0.73 (димер) и 0.58 (тетрамер) соответственно у 95 и 92% особей из изученных биотопов, можно предположить, что эти фракции обеспечивают основные адаптивные функции. У всех изученных нами особей присутствовала хотя бы одна (чаще несколько) фракция с высокой (Rf >85, мономеры), средней (Rf 0.58-0.83, от димеров до пентамеров) и низкой (Rf<0.58, от пентамеров до октамеров) электрофоретической подвижностью, что подкрепляет предположение о функциональном сходстве компонентов с близкими значениями электрофоретической подвижности (Шобанов, 2004).

При анализе электрофореграмм Ch. plumosus мы обнаружили, что у особей 2-3 фазы IV возраста состав гемоглобинов включал до 10 фракций индивидуально, или, наоборот, у некоторых особей 7 фазы он включал 5 фракций. Известно, что состав гемоглобинов Ch. riparius формируется постепенно, начиная с I возраста, и стабилизируется после 5 фазы IV возраста (Шобанов, 1993). Таким образом, можно предположить, что фракционный состав гемоглобинов Ск plumosus в отличие от Ch. riparius стабилизируется раньше, скорее всего в III возрасте.

VII. 3. Коррелятивные связи между хромосомным полиморфизмом и фракционным составом гемоглобинов

Ранее мы упоминали о высоком разнообразии фенотипов гемоглобинов Ch. plumosus, однако, причины такой изменчивости не установили. Как известно, высоким разнообразием Ch. plumosus обладает и на хромосомном уровне: у изученных нами личинок было обнаружено 17 последовательностей дисков хромосом, что натолкнуло нас на мысль о возможной взаимосвязи этих явлений. Мы уже указывали на возможные адаптивные свойства отдельных геномных комбинаций и их неравномерное распределение по ареалу (Гундерина и др., 1999), однако, свойства этих комбинаций проявляются опосредованно - через белки, и в частности гемоглобины, составляющие до 90% от всех белков гемолимфы (English, 1969). Можно предположить, что хромосомные перестройки оказывают влияние на состав гемоглобинов (присутствие или отсутствие фракций) в гемолимфе хирономид. Гены глобинов располагаются в хромосоме в виде кластеров (рис. 7), содержащих информацию об аминокислотной последовательности 7 — 11 белков (Schmidt et al., 1988; Као, Trewitt et al., 1994; Kao, Hankeln et al., 1995; Trewitt et al., 1995).

Рис. 7. Схематическое представление кластера генов глобинов VIIB у Ch. thummi (riparius) (Trewitt, et al., 1995)

Для некоторых видов Chironomus установлено положение двух таких кластеров -отвечающих за синтез HblV и HbVIIB, располагающихся на хромосомах Е и D соответственно (рис. 8).

Рис. 8. Вероятное

положение у Ch. plumosus кластеров генов глобинов HblV и HbVIIB на хромосомах Е и D соответственно (Schmidt et al., 1988). Скобками отмечены pluD2 - pluD5, pluE2 и др. -районы затрагиваемые

инверсиями (по: Шобанову, 1994). Цифры от 1 до 24 -районы хромосом.

pluBl pluDl pli.FI

Кластеры генов глобинов HbVIIB могут находиться в районе хромосомы, включающем несколько инверсий, и таким образом кластер может инактивироваться. Можно предположить два варианта: в результате перестройки может нарушаться целостность гена (или всего кластера), либо он попадает в неактивный район хромосомы. Положение кластеров других генов глобина пока не установлено, однако, их существование допускается (Schmidt et al., 1988). Поэтому, используя полученную ранее информацию об уровне хромосомного полиморфизма и разнообразии фенотипов гемоглобинов, мы попытались установить, существует ли между ними корреляция.

С помощью регрессионного анализа нами было выявлено влияние хромосомного полиморфизма на формирование фенотипов гемоглобинов у Ch.plumosus: последовательности плеча А на 1 и 4 фракции Hb (рис. 2), плеча В на 6 фракцию Hb (рис. 3) и плеча С на 3 и 9 фракции Hb (рис. 4). Вероятным механизмом, наблюдаемого явления, предположительно, является эффект положения гена. Известно, что существенное влияние на активность генов оказывает их окружение, и взаимодействие участков ДНК расположенных даже в разных хромосомах (Стегний, 1993; Гвоздев, 1993. 2001; Назаренко, 2002; Жимулёв, 2003 и др.).

Чтобы оценить адаптивное значение хромосомного полиморфизма мы можем вернуться к популяциям Ch. plumosus из района Рыбинского водохранилища. У особей из «Прудовой» популяции обнаруживается исключительно последовательность pluBl.l, а из «Водохранилищной» pluBl.2 и pluB2.2, которые оказывают влияние на 6" компонент из спектра гемоглобинов, частота его встречаемости составляет около 70% и 95% соответственно. Данные о функциональной нагрузке гемоглобинов у Ch. plumosus в литературе отсутствуют, однако, у вида-близнеца Ch. riparius компонент с близкими электрофоретическими характеристиками обладает наивысшим сродством к кислороду (Weber et al., 1985). Можно предположить (с осторожностью), что популяции, в которых 6 й компонент встречается чаще, лучше приспособлены к обитанию в условиях низкого содержания кислорода.

В результате исследования гемоглобинов хирономид (Ch. agilis, Ch. entis, Ch. muratensis, Ch. plumosus, Ch. riparius) мы установили, что всё разнообразие

фенотипов Hb обеспечивается разнообразием на уровне субъединиц с ММ от 10 до 16 kDa. В гемолимфе изученных нами видов обнаружено от 8 (rip) до 18 (mur) различных субъединиц формирующих в нативных условиях, как олигомеры, так и мономеры. Следует отметить, что ранее у Ch. riparius и С. tertians были обнаружены лишь мономеры, гомодимеры (Weber et al., 2001; Tichy 1975, 1981 и т.д.) и гетеродимеры (Sladic-simic et al., 1979), с ММ субъединиц около 16 kDa, что было подтверждено исследованиями их аминокислотной последовательности. Изучив способы структурной организации гемоглобинов хирономид, мы выяснили, что наибольшим разнообразием представлены мономеры: от трёх (Ch. entis) до семи (Ch. riparius) с ММ от 14 до 23 kDa, димеры: от двух (Ch. agilis) до пяти (Ch. plumosus). Наименее разнообразны октамеры и гексамеры с ММ от 144 до 95 kDa соответственно, полностью отсутствовавшие у Ch. riparius.

Количество нативных компонентов в градиенте ПААГ и в SDS-электрофорезе практически одинаково (табл. 2.), поэтому мы можем допустить, что если одному олигомеру (в нативных условиях) соответствует одна субъединица, то вероятно он является гомо-олигомером; если олигомеру соответствуют несколько субъединиц, вероятно, он гетеро-олигомер. К примеру, гемоглобин VIIB Ch. th. thummi (riparius) состоит из двух субъединиц различающихся шестью аминокислотами (Sladic-simic et al., 1979). У Ch. riparius в нативных условиях обнаружено 15 компонентов, которым соответствует всего 8 различных субъединиц. Вероятно, в данном случае мы наблюдаем посттрансляционную модификацию белков, в результате которой может измениться их электрофоретическая подвижность.

В ранних исследованиях гемоглобинов в ПААГ с 8М мочевиной отмечали образование высокомолекулярных белковых комплексов (Manwell, 1966). Агрегирование белков отмечается в виде патологии у млекопитающих, и в норме у хрящевых рыб (Андреева, 2006, 2008; Андреева, Фёдоров, 2010). У акул и скатов мочевина участвует в регуляции осмотического давления, и её концентрация в крови повышена (Проссер, 1977; Шмидт-Ниельсен, 1982 и др.), у хирономид на органические осмотически активные соединения приходится, от общего числа, до 50%, из них около 25% на аминокислоты, и около 25% на другие соединения, в том числе и мочевину (Шовен, 1953; Проссер, 1977; Тыщенко, 1986). Мочевина, как известно, на разные белки оказывает не одинаковое влияние и приводит либо к агрегации, либо к диссоциации белков, и зависит от поверхностной структуры белка (Александров, 1985). В результате исследования мы выяснили, что у хирономид способность к агрегации проявили все представленные субъединицы.

На SDS-электрофограммах гибридов Ch. plumosus х Ch. entis и Ch. plumosus x Ch. muratensis нами были обнаружены субъединицы характерные для обеих родительских форм, что свидетельствует о кодоминантном наследовании генов глобинов. Подобное уже было описано в результате анализа Ch. tentons из нескольких популяций, различающихся кариологически и обладающих разными электрофоретическими спектрами гемоглобинов (Thompson et al., 1969).

<~-¡ 2 t¿ ¿Z*

я -- s-Я

Ǥ

ce H

o a ¡r

s

o

x, я

2 K¡

n я a"

u vo o

ьГ a £ o к o

б Ы o я я ¡r я

«

я н о я о,

я &

X X 3 Я а Я н С сЗ

3

я

ш о л

о я й сх и Я Я

а. U

Í 1 о ? 0 1 Ё О *> 1 é о о' |> Оч VI vi о о"

i ч О о <л v¡ О О о о'

i ts СП т-4 о о о о о о' о о"

ib g" ь 1 1>" СП Т* к .-н va е-' i—<

ь СП -é т-4 ю со еч 00 Г-н V) СИ СЧ ел"

¿ к СИ ЧГ <-н »-и п V") С) <ч т OÍ rs СП сп" СП

¿ s а Я Cr. ri "Ч" ТГ .—1 (Ч СП vi' СО "Т. сп" п ю" гг

в я 81 f ю «-Ч VI 1-Н 00 Т—< г- со

М g _ в га о ¡ sil 11 §! А Я 2 о " g S « VI г-н тг »-Н г- »-н Vi

м в - 8 8 s S j í ¡á s р * ¡3 * t-H л (Ч »-н л (N « А *-н л vo л

в й § Hi & "M Г" R 5 a 11 г—t Í гН 1 v£> 7 ОЭ О*

9 ti w О Ig g В P ■ a S n a S % X 3 s s A 4 ° W У Я в a. и сг, 1-Н Ь

Вид 5Р б •й 6 б 1 I d S 1 t S .3 с а w d

VII. 4. Изменчивость гемоглобинов в филогенезе, онтогенезе и под действием факторов среды

Ранее мы выяснили, что по субъединичному составу гемоглобинов Ch. riparius отличается от других изученных видов. Вероятно, объяснение этому можно найти, изучив их филогенетические отношения. Ниже приведены наиболее наглядные дендрограммы филогенетических

отношений между видами Chironomus, основанные на сравнении фенотипов гемоглобинов (рис.9, а), морфологического сходства центромерных районов хромосом (рис. 9, б) и молекулярно-генетического анализа гена глобина gb2b (рис. 9, в). Кроме этого, исследования гена gb2b показали близость Ch. riparius к видам Camptochironomus, а не к Chironomus (Guryev et al., 2001). Таким образом, Ch. riparius и остальные изученные нами виды Chironomus эволюционно достаточно далеки друг от друга, что и объясняет различия на биохимическом уровне.

Анализ динамики содержания разных молекулярных форм гемоглобина и его деструкции на разных стадиях развития Ch. riparius показал, что в ходе метаморфоза идёт деградация не всех, а определённых молекулярных форм. Устойчивость молекул с ММ 60, 42 и 17 kDa, свидетельствует, вероятно, об их необходимости в течение всего метаморфоза: перенос кислорода, и поддержание постоянства уровня рН. Содержание молекул с ММ 42 kDa начинает резко сокращаться спустя 48 часов после начала метаморфоза, что может свидетельствовать об их участии в пластическом обмене. К завершению метаморфоза заметно увеличивается содержание белковых компонентов с ММ 22 и 27 kDa (одновременно теряющих гем), начинающих принимать более активное участие в регулировании осмотического давления.

- bor

/р mu -M-ent

'i-aci

-agi,, bon plu j nud bal

/{-pi ' tl:

-Г

1-Я

-hal

_r-plu

Lbor

nud spl

agi2

ent\

\

mur '

\ Г P|U

bal/ cili ann ber

th.....x-

P'.....

p lur

L pSC - dor

Рис. 9. Дендрограммы филогенетических отношений между видами хирономид построенные на основании: а — сходства электрофоретических спектров

гемоглооинов (Шобанов, 2004), б -сходства центромерных районов хромосом (Hankeln et al., 1994), в -молекулярного анализа гена глобина gb2b (Guryev et al., 2001). (на схемах: th — thummi=riparius, pi - piger, plu -plumosus, agi - agilis, и т.д.).

"t. 100

7S $0 2S 0

Изменение относительного содержания некоторых гемоглобинов в онтогенезе

может быть связано, прежде всего, с их функциональной активностью. Ранее уже

было сказано об участии некоторых фракций в поддержании осмотического

давления (Шобанов, 2004). Уменьшение относительного содержания белка может

быть связано не только с его распадом до отдельных субъединиц, но и до

аминокислот, вклад которых в создание осмотического давления у двукрылых

насекомых составляет около 25% (рис. 10) (Тыщенко, 1986).

Рис. 10. Процентные соотношения

концентраций осмотически эффективных

соединений в плазме гемолимфы у

первичнобескрылых насекомых (А),

стрекоз (Б), прямокрылых (В), двукрылых

(Г) и чешуекрылых (Д) (из: Тыщенко,

- 1986).

МолА ОНЬфт Ьрйга ¿ернЬ^е«

В результате исследования воздействия солёности мы выявили различные стратегии поддержания осмотического давления. Так в течение суток, в условиях солёности 5 г/л незначительно уменьшается относительное содержание 0.69 и 0.72 фракций включающих тетрамерные, тримерные и димерные формы, а содержание октамерных, гексамерных и особенно мономерных форм возрастает. При солёности 20 г/л, происходит разрушение высокомолекулярных форм из 0.43 и 0.53 фракций, за счёт которых увеличивается относительное содержание низкомолекулярных фракций 0.69 и 0.82. Таким образом, в виде диссоциации олигомеров, мы наблюдаем ответную (адаптивную) реакцию организма в попытке удержать воду с помощью низкомолекулярных соединений (Проссер, 1977; Тыщенко, 1986 и др.). В условиях же критической солёности (20 г/л) гемоглобиновые комплексы разрушаются, что приводит к нарушению осмотического гомеостаза, и последующей гибели личинок.

Мы предполагаем, что гемоглобины хирономид участвуют не только в транспорте кислорода и осморегуляции. Сокращение относительного содержания фракций в период голодания у Ск прапиз, вероятно, может свидетельствовать о возможности их использования в качестве источника энергии (при отсутствии пищи, линьке или метаморфозе). Случай использования аминокислот в качестве источника энергии отмечен у мухи це-це (Тыщенко, 1986). В период метаморфоза у многих

беспозвоночных в качестве дополнительного источника аминокислот используются лизирующиеся органы (Тыщенко, 1986), поэтому, можно предположить, что гемоглобины принимают участие и в пластическом обмене. Известно, что у некоторых беспозвоночных олигопептиды гемолимфы служат хранилищем аминокислот (Тыщенко, 1986). Таким образом, высокая гетерогенность гемоглобинов хирономид обусловлена их функциональностью, мы предполагаем, что они принимают участие в транспортировке и запасании газов, осморегуляции, пластическом обмене и служат источником энергии.

Заключение

Всё живое непрерывно изменяется под влиянием окружающей среды. В относительно стабильных условиях существования у организмов появляются адаптации, способствующие наиболее эффективному освоению доступных ресурсов. Однако при крайних значениях любого из факторов эффективность снижается. Становится очевидным, что между узкой специализированностью и пластичностью у одного отдельно взятого организма возникает конфликт, разрешить который позволяет разнокачествеппость особей в популяции. Широкое варьирование признаков как бы настраивает популяцию на среду обитания. Вследствие чего, при крайних значениях какого-либо фактора (компонентов среды), отдельные особи в популяции оказываются более устойчивыми, и обеспечивают сохранение системы в целом (Майр, 1974; Константинов, 1986).

Исследование цитогенетической структуры видов рода СМгопотш позволяет выявить высокое разнообразие различных типов инверсий, распределяющихся мозаично в различных географических точках. Многие хромосомные комбинации оказываются приуроченными к конкретному типу водоёмов, что связано с их адаптивными функциями. Для детального изучения этого вопроса нами был выбран вид СЛ. рЫтозия обладающий наибольшим количеством хромосомных инверсий на одну особь. В результате исследования нами установлено существование различных типов популяций СЛ. р1итози$ расположенных в непосредственной близости друг от друга, и обладающих как узким набором хромосомных комбинаций -«терминальные», и широким - «интерстициальные» популяции. При этом «терминальные» обитают в биотопах со специфическими характеристиками, тогда как «интерстициальные» обитают в условиях, обеспечивающих существование и генетический обмен между особями из нескольких «терминальных» популяций (Шобанов, Большаков, 2011).

Впервые для оценки влияния отдельных хромосомных перестроек (последовательностей) на физиологическое состояние личинок был использован анализ изменчивости гемоглобинов. На примере самого распространённого вида СИ. р1ито$т, у которого помимо высокого уровня хромосомного полиморфизма, обнаружено наибольшее разнообразие фенотипов гемоглобинов, показано достоверное влияние хромосомных последовательностей, располагающихся в плечах А, В и С, на формирование фракционного состава гемоглобинов. Вероятно, инверсии затрагивают регуляторные области хромосом, ответственные за активность генов глобинов, отвечающих за адаптивных возможности личинок. Подробное исследование структурной организации гемоглобинов хирономид позволило впервые выявить высокое разнообразие как нативных форм гемоглобинов, так и образующих их субъединиц. В гемолимфе личинок СМгопотт были обнаружены

гемоглобины в виде мономеров, димеров, тримеров, тетрамеров, пентамеров, гексамеров и октамеров, обладающие, предположительно, различной функциональной значимостью в онтогенезе и в изменяющихся условиях окружающей среды. Кроме того, полученные результаты позволяют предположить, что гемоглобины хирономид не ограничиваются лишь дыхательными функциями, вероятно, они так же могут принимать участие в энергетическом и пластическом обмене. Благодаря структурному разнообразию и разной функциональности, гемоглобины обеспечивают экологическую пластичность личинок хирономид в постоянно изменяющихся условиях. Изменения в составе гемоглобинов, прежде всего, связаны с изменениями среды обитания, носящих как продолжительный, так и временный характер и являются физиолого-биохимической реакцией на изменения среды.

Выводы

1. Личинки Chironomus plumosus, обитающие в зоне литорали и профундали, характеризуются узким набором хромосомных инверсий разного типа, в то время как личинки, обитающие в сублиторали — широким набором хромосомных инверсий.

2. Наибольшей специфичностью хромосомных последовательностей обладают группировки личинок Chironomus plumosus из зоны литорали и профундали, что позволяет считать их самостоятельными популяциями.

3. В результате цитогенетических исследований у Chironomus agilis было выявлено 7 дисковых последовательностей хромосом, у Chironomus entis - 9, Chironomus muratensis - 11, Chironomus plumosus - 17. Обнаружена и прокартирована новая последовательность у Chironomus plumosus -pluB9. У личинок Chironomus muratensis, собранных в русловой части водохранилища последовательность murDl встречается чаще, чем у обитающих на мелководье.

4. Личинки, обитающие в сублиторали, имеют специфичный набор гемоглобинов. Высокое разнообразие фенотипов гемоглобинов (98) обеспечивает широкие возможности адаптации у Chironomus plumosus. У видов с менее широкими возможностями заселения, уровень разнообразия фенотипов значительно ниже (от 1 до 16).

5. Хромосомные инверсии, специфичные только для личинок, обитающих в профундали или только из литоральной зоны водоёма, влияют на относительное содержание и частоту встречаемости разных гемоглобинов. Высокий уровень хромосомного полиморфизма способствует отбору фракций гемоглобина, специфичных к определённым экологическим условиям.

6. Гемоглобины всех исследованных видов представлены множественными формами. Впервые помимо мономеров и димеров у личинок хирономид обнаружены октамеры, пентамеры и тримеры гемоглобина.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации: Статьи в ведущих рецензируемых научных журналах из перечня, рекомендованных ВАК РФ

1. H.A. Шобанов, В.В. Большаков. Кариофонды Chironomus plumosus (L.) (DIPTERA, CHIRONOMIDAE). V. Терминальные и интерстициальные популяции // Цитология. 2011.T.53.N.1. с. 98-102.

2. В.В. Большаков, A.M. Андреева. Особенности структурной организации гемоглобина Ch. plumosus L. (Diptera, Chironomidae) // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2012. Т. 43. N. 3. с. 219-224.

3. A.M. Андреева., И.П. Рябцева, В.В. Большаков. Анализ проницаемости капилляров разных отделов микроциркуляторной системы для белков плазмы крови у некоторых представителей костистых рыб // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2008. Т. 44. N. 2. с. 212-213.

Статьи в других изданиях

4. Большаков В.В., Андреева A.M. Особенности структурной организации гемоглобина Chironomus plumosus (L.) // Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоёмов Европейского Севера. Материалы XXVIII Международной конференции г. Петрозаводск. Петрозаводск: КарНЦ РАН, 2009. - с. 93-96.

5. Большаков В.В., Шобанов H.A. Кариофонды популяций Chironomus plumosus L. (Diptera, Chironomidae) в прибрежье Рыбинского водохранилища и его притоках // Биологические ресурсы Белого моря в внутренних водоёмов Европейского Севера. Материалы XXVIII Международной конференции г. Петрозаводск. Петрозаводск: КарНЦ РАН, 2009. с. 97-99.

6. Большаков В.В., Андреева A.M. Динамика относительного содержания мономерных и олигомерных гемоглобинов в онтогенезе мотыля (DIPTERA: CHIRONOMIDAE) // Зоологические исследования в регионах России и на сопредельных территориях: Материалы Межд. науч. конф. / Редкол.: А.Б. Ручин (отв. ред.) и др. - Саранск: Типография «Прогресс», 2010. - 332 с. - с. 148-150.

7. В.В. Большаков, P.A. Фёдоров. Анализ субъединичного состава гемоглобинов из гемолимфы Chironomus muratensis (DIPTERA, CHIRONOMIDAE) // Материалы XIV Школы-конференции молодых учёных "Биология внутренних вод". Борок, 2010. с. 20-23.

8. В.В. Большаков. Изучение взаимосвязи фракционного состава гемоглобинов гемолимфы и хромосомной изменчивости Chironomus plumosus L. (Diptera, Chironomidae) // Материалы XIV Школы-конференции молодых учёных "Биология внутренних вод". Борок, 2010. с. 14-19.

9. В.В. Большаков. О природе гемоглобинов мотыля // Тезисы конференции "Экология малых рек в XXI веке..", Тольятти, 2011. с. 26.

Подписано в печать 23.05.2013. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Заказ № 26. Усл.печ.л. 0,945. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Принтхаус - Ярославль» 150000, Россия, г. Ярославль, ул Свободы, 126,

(4852) 73-04-74, 30-49-80 e-mail: printhouse-yar@yandex.ru, print_house-06@inbox.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Большаков, Виктор Викторович, Борок

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН.

На правах рукописи

04Z01361642

Большаков Виктор Викторович

АДАПТИВНАЯ РОЛЬ ХРОМОСОМНЫХ ИНВЕРСИЙ У ЛИЧИНОК РОДА CHIRONOMUS (DIPTERA, CHIRONOMIDAE)

03.02.08 - Экология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор биологических наук Андреева Алла Михайловна

Борок - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................4

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................8

I. 1. Хирономиды, как объект исследования.......................................................................8

I. 2. Объем и таксономическая структура семейства СЫгопот1с1ае.................................9

I. 2. 1. Таксономическая характеристика подсемейства СЫгопоттае..........................11

I. 2. 2. Кариологические исследования хирономид..........................................................12

I. 2. 3. Морфологическая и биохимическая изменчивость хирономид..........................15

I. 3. Гемоглобин...................................................................................................................18

I. 3. 1. Эволюция и функции гемоглобина........................................................................18

I. 3. 2. Структурная и функциональная дифференциация гемоглобинов хирономид. .18

I. 3. 3. Структурная организация гемоглобинов...............................................................21

I. 3. 4. Хромосомная локализация генов глобинов...........................................................24

I. 3. 5. Подходы к изучению гемоглобинов.......................................................................28

I. 3. 6. Подходы к анализу (установлению) филогенетических связей между представителями рода СЫгопотт....................................................................................32

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................33

II. 1. Места сбора проб........................................................................................................33

II. 2. 1. Предварительная обработка образцов для многоуровневого анализа..............34

II. 2. 2. Методика изготовления морфологических и кариологических препаратов. ...35

II. 3. Электрофоретические методы, использовавшиеся в работе..................................37

II. 3. 1. Аналитический диск-электрофорез.......................................................................37

II. 3. 2. Электрофорез в градиенте концентраций ПААГ................................................43

II. 3. 3. 808-электрофорез по Леммли...............................................................................47

II. 3. 4. Электрофорез с 8М мочевиной.............................................................................50

ГЛАВА III. КАРИОФОНДЫ ПОПУЛЯЦИЙ...........................................................................53

III. 1. Кариотип СЫгопотт agilis......................................................................................53

III. 2. Кариотип СЫгопотт епНя.......................................................................................56

III. 3. Кариотип СЫгопотт тига1ет1$.............................................................................61

III. 4. Кариотип СЫгопоттр1ито$т................................................................................66

III. 4. 1. Анализ частоты встречаемости зиготических сочетаний СИ. рЫтоьш из

различных биотопов Рыбинского водохранилища и его притоков................................77

III. 5. Кариотип СЫгопотт прапт..................................................................................78

III. 6. Кариотипы межвидовых гибридов видов-близнецов............................................79

III. 6. 1. Кариотип межвидового гибрида Ск р1ито$т х СИ. тига1ет1$.......................80

III. 6. 2. Кариотип межвидового гибрида Ск р1ито$т х Ск епШ.................................83

Заключение к главе..............................................................................................................86

ГЛАВА IV. ФРАКЦИОННЫЙ СОСТАВ ГЕМОГЛОБИНОВ У ХИРОНОМИД ИЗ

ГРУППЫ РШМОБиБ.................................................................................................................87

IV. 1. Классификация фракционного состава гемоглобина у хирономид из группы

рЫтозт................................................................................................................................87

IV. 2. Фракционный состав гемоглобинов СЫгопотт прапт.....................................88

IV. 3. Фракционный состав гемоглобинов СЫгопотт тигШет1$.................................92

IV. 4. Фракционный состав гемоглобинов СЫгопотт р1ито$т...................................96

IV. 5. Особенности возрастных изменений фракционного состава гемоглобинов

СЫгопотт р1ито$т.........................................................................................................104

Заключение к главе............................................................................................................105

ГЛАВА V. КОРРЕЛЯЦИЯ УРОВНЯ ИНВЕРСИОННОГО ПОЛИМОРФИЗМА ХРОМОСОМ И ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА ГЕМОГЛОБИНОВ.................................106

V. 1. Результаты кластерного анализа.............................................................................107

V. 2. Результаты регрессионного анализа.......................................................................108

Заключение к главе............................................................................................................110

ГЛАВА VI. СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕМОГЛОБИНА ХИРОНОМИД РОДА

CHIRONOMUS..........................................................................................................................111

VI. 1. Анализ молекулярных форм гемоглобинов гемолимфы.....................................112

VI. 1.1. Разделение гемоглобинов гемолимфы по заряду.............................................112

VI. 2. Дифференциация нативных молекул гемоглобинов по молекулярной массе в

градиенте концентраций ПААГ.......................................................................................116

VI. 3. Разделение гемоглобинов по молекулярной массе в электрофорезе с 8М

мочевиной...........................................................................................................................120

VI. 4. Анализ субъединичного состава гемоглобинов хирономид...............................123

VI. 5. Анализ структурной организации гемоглобинов.................................................134

VI. 6. Сравнение субъединичного состава гемоглобинов изученных видов хирономид

.............................................................................................................................................138

VI. 7. Особенности агрегации белков гемолимфы хирономид в ПААГ с 8М

мочевиной...........................................................................................................................139

VI. 8. Анализ субъединичного состава гемоглобинов межвидовых гибридов

хирономид..........................................................................................................................142

VI. 9. Молекулярные формы гемоглобина на последних фазах развития личинки Ch.

riparius................................................................................................................................143

VI. 10. Изменение относительного содержания структурных компонентов белка из гемолимфы Ch. muratensis при изменении солёности...................................................145

VI. 11. Результаты эксперимента по выживаемости личинок в условиях повышения

солёности (адаптация к условиям солёности)................................................................148

Заключение к главе............................................................................................................149

ГЛАВА VII. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.........................................150

VII. 1. Анализ хромосомной изменчивости....................................................................150

VII. 2. Изменчивость фракционного состава..................................................................154

VII. 3. Коррелятивные связи между хромосомным полиморфизмом и фракционным

составом гемоглобинов.....................................................................................................156

VII. 4. Изменчивость гемоглобинов в филогенезе, онтогенезе и под действием

факторов среды..................................................................................................................160

Заключение.........................................................................................................................163

Выводы...............................................................................................................................165

Список использованной литературы...............................................................................166

ВВЕДЕНИЕ

Личинки хироиомид - один из важнейших элементов водных экосистем. Они участвуют в самоочищении водоёмов и являются ценным кормовым объектом многих видов рыб. Представители рода Chironomus заселяют самые разнообразные водоёмы, от луж до водохранилищ. Ареал их обитания охватывает все континенты, исключая Антарктиду (Michailova, 1989; Butler et al., 1999; Голыгина, 1999; Шобанов, 2000; Гурьев, 2002; Гундерина, 2010). Одним из механизмов адаптации у хирономид, по мнению многих авторов, является хромосомный полиморфизм (Кикнадзе и др., 1991; Гундерина и др., 1999; Шобанов, 2000). При детальном изучении цитогенетической структуры популяций обнаруживаются уникальные сочетания дисков хромосом, характерные для конкретных условий обитания, при этом географической изменчивости практически не выявлено (Дёмин, Шобанов, 1990; Гундерина и др., 1999). Это позволяет предположить, что в цитогенетической структуре популяции заложены регуляторные механизмы, обеспечивающие адаптацию особей к специфическим условиям среды. В процессе таких хромосомных перестроек могут затрагиваться гены, участвующие в обеспечении тех или иных физиологических функций организма (Жимулёв, 2003). Важнейшей функцией организма является дыхание. Оно обеспечивается, в том числе, гемоглобином - основным белком гемолимфы, который может рассматриваться в качестве удобной модели для оценки влияния различных хромосомных перестроек на физиологическое состояние личинок хирономид. Поэтому адаптивную значимость некоторых типов инверсий у полиморфных видов хирономид можно исследовать с помощью анализа изменчивости гемоглобина.

Цель работы: Исследовать влияние хромосомной изменчивости на способность личинок рода СЫгопотш заселять различные биотопы (типы и зоны водоёмов).

ЗАДАЧИ

1. Изучить уровень внутривидового хромосомного полиморфизма и особенности распределения инверсий у 5 видов СЫгопотш в зависимости от условий обитания.

2. Изучить внутри- и межвидовое разнообразие гемоглобинов у личинок из разных условий обитания и выявить наиболее изменчивый из исследуемых видов рода СЫгопотш.

3. Оценить связь между разнообразием фракционного состава гемоглобинов у СЫгопотш р1ито$ш из разных условий обитания и цитогенетической структурой кариотипа.

4. Оценить уровень структурного разнообразия гемоглобинов у исследуемых личинок рода СЫгопотш.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Впервые обобщён обширный материал по цитологическим и биохимическим исследованиям хирономид. При изучении локальных популяций Ск рЫтоэш удалось выделить типы популяций: терминальные (обладающие специфическим (ограниченным) набором геномных комбинаций, приспособленных к конкретным условиям обитания) и интерстициальные (обитают в условиях, обеспечивающих выживание и воспроизводство особей из нескольких терминальных популяций). Выявление терминальных и интерстициальных популяций позволяет по-новому рассматривать процессы микроэволюции и видообразования у хирономид. У Ск рЫтоят в плече В обнаружена и прокартирована новая последовательность - р1иВ9. Исследованы кариотипы межвидовых гибридов Ск р1итозж х Ск епШ

(впервые для Палеарктики), Ск рЫтоьш х Ск тигШетгя (впервые для Рыбинского водохранилища). В фенотипах гемоглобинов исследованных видов хирономид обнаружены новые, неотмеченные ранее, фракции гемоглобина. Обнаружено влияние различных вариантов хромосомных инверсий в плечах А, В и С на частоту встречаемости и относительное содержание различных фракций гемоглобина. Впервые описано высокое разнообразие нативных гемоглобинов - от мономеров до

октамеров, построенных из различных низкомолекулярных субъединиц. Анализ множественности структурных вариантов гемоглобинов расширяет представления об эволюции данного белка у беспозвоночных. Результаты работы позволяют дополнить картину филогенетических отношений внутри рода Chironomus, расширяют представление о структурной организации гемоглобинов хирономид. Выявлена дифференциация функций разных структурных форм гемоглобинов на стадиях метаморфоза у CK riparius: в то время как содержание тетрамеров относительно стабильно, содержание тримеров, димеров и мономеров снижается. На примере Ch. riparius показано участие гемоглобинов в энергетическом и пластическом обмене.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Материалы, представленные в работе, могут найти применение при разработке методик с использованием некоторых видов хирономид в качестве универсальных биологических маркеров.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА. Все диссертационные материалы получены непосредственно автором или при его непосредственном участии.

Считаю своим долгом выразить признательность заведующему лабораторией Биологии и систематики водных беспозвоночных д.б.н. H.A. Шобанову за предложенную тему исследования и всестороннюю поддержку, а также сотрудникам всех лабораторий ИБВВ РАН за оказанную помощь.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы были представлены на XIII международной школе-конференции «Биология внутренних вод» (Борок, 2007); XXVIII международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоёмов Европейского Севера» (Петрозаводск, 2009); XIV международной школе-конференции молодых учёных «Биология внутренних вод» (Борок, 2010); международной конференции «Зоологические исследования в регионах России и на сопредельных территориях» (Саранск, 2010); международной конференции «Экология малых рек в XXI веке» (Тольятти, 2011); всероссийской конференции с международным участием «Физиологические, биохимические и молекулярно-генетические механизмы адаптаций гидробионтов» (Борок, 2012).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 9 статей, из них 3 в журналах из списка рекомендованного ВАК.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на 189 страницах машинописного текста, состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы, включающего 282 источника, в том числе 160 на иностранном языке. Содержит 51 таблицу и 60 рисунков.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Хирономиды, как объект исследования.

Широкая распространённость, экологическая значимость, доступность в природе и простота содержания в лабораторных условиях делает хирономид удобным объектом для гидробиологических, экологических, цитологических, генетических и биохимических исследований.

Хирономиды играют важную роль в жизни водоёмов. Исследования показали, что плотность популяции личинок хирономид может доходить до десятков и сотен тысяч экземпляров на один квадратный метр (Черновский, 1949; Zinchenko, 1989;

"У

Зинченко, 2002), при численности 348 тыс. экз. /м их общая масса достигает 1,8

л

кг/м (Sokolova, 1992). Хирономиды являются важнейшим объектом питания бентосоядных промысловых рыб и их молоди, частота встречаемости личинок в пищевом комке достигает 99% (Ассман, 1969; Константинов, 1958; Травина, 2005; Яворская, 2008; Паньков, 2008).

Личинки хирономид принимают самое активное участие в минерализации органического вещества и самоочищении водоёмов (Константинов, 1958; Looser, 1998; Зинченко, 2003; Клишко, Авдеев и др., 2005). Пропуская пищевые частицы через кишечник, обрабатывая их ферментами, хирономиды повышают, таким образом, продукцию бактерий (Johnson, 1989; McLachlan, 1977, 1979, 2009), количество которых в комочках их испражнений может достигать 1-3 млрд. на 1 г, что на 3 порядка больше, чем в воде (Волга и её жизнь, 1978). Строительство в грунте трубок-домиков (Walshe, 1947, 1950) увеличивает площадь раздела фаз вода-грунт в несколько раз (Шобанов, 1986), что в свою очередь способствует увеличению поглощения кислорода (Graneli, 1979) и выделению в воду аммиака (Tatrai, 1986), фосфора и железа донными осадками (Lewandowski, 2005, 2007). Сами хирономиды, накопившие большое количество тяжёлых металлов в онтогенезе на стадии личинки, вероятно, избавляются от них в процессе метаморфоза (Groenendijk, 1999). Позднее, обнаружили, что миграция элементов из личинки в куколку и далее во взрослое насекомое происходит со значительным

снижением их концентрации за счет перехода металлов в отторгаемые экзувии при линьках (Клишко, Авдеев и др., 2005).

Хирономиды используются в качестве тестового объекта для оценки антропогенного воздействия на водоёмы (Балушкина, 1976; Saether, 1979; Sharley et al., 2004; Истомина, 2008; Щербенок, 2008). О возрастании степени антропогенной нагрузки на водоёмы часто судят как по морфологическим деформациям у личинок (Brinkhurst et al., 1968; Rosenberg, 1992; Назарова, 2002; Kim, 2005) и имаго (Hoffmann, 2005), так и по биохимическим и физиологическим показателям (Graney, Giesy, 1986-1988; Giesy et al., 1988). Даже простое появление в водоёме Ch. plumosus свидетельствует, по соображениям некоторых авторов, о повышении его трофности (Thienenmann, 1923; Lundbeck, 1936; Saether, 1975). Так же остатки склеротизированных фрагментов хирономид используются при долгосрочных наблюдениях и определении степени нарушения природного лимногенеза, в таком быстроразвивающемся направлении как палеолимнологический биомониторинг (Walker, Mathews, 1989; Walker, 1995; Ильящук, 2001).

Порой при кормлении аквариумных рыб живым мотылём у людей может проявляться аллергическая реакция на гемолимфу, а при массовом вылете взрослых насекомых обостряться бронхиальная астма (Kawai, 1996, 1998; Hirabayashi, 1997; Зинченко, 2002).

I. 2. Объем и таксономическая структура семейства Chironomidae

Изучение хирономид началось ещё в 17 веке. Тогда впервые были описаны личинки и куколки. Первое описание комара сделано в 1713 году Робертом Гуком (Thienemann, 1923). На протяжении 18 века накапливались общие данные о биологии, строении и прочих морфологических и биологических особенностях хирономид.

С начала 19 века усиленно развивается систематика хирономид. В 1803 г. Meigen выделяет из древнего линнеевского рода Típula, роды Chironomus и Tanypus, описывает большое число новых видов. В 1944 году издаются определительные таблицы хирономид (Thienemann, 1944), но только до подсемейства или до ро�