Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дивергенция последовательностей дисков политенных хромосом у видов рода Chironomus (Diptera, Chironomidae) из цитокомплекса "pseudothummi"

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Дивергенция последовательностей дисков политенных хромосом у видов рода Chironomus (Diptera, Chironomidae) из цитокомплекса "pseudothummi""

На правах рукописи

БРОШКОВ АНДРЕИ ДМИТРИЕВИЧ

Дивергенция последовательностей дисков политенных хромосом у видов рода Chironomus (Díptera, Chironomidae) из цитокомплекса «pseudothummi»

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

з 1 ОКТ 2013 005536003

Новосибирск — 2013

005536003

Работа выполнена в Секторе эволюционной геномики хирономид Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институте цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук (ИЦиГ СО РАН), г. Новосибирск.

Научный руководитель: Ия Ивановна Кикнадзе

доктор биологических наук, профессор, г. н. с. сектора эволюционной геномики хирономид Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Официальные оппоненты: Павел Михайлович Бородин

доктор биологических наук, профессор, завлабораторией рекомбинационного и сегрегационного анализа Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Михаил Георгиевич Сергеев

доктор биологических наук, профессор,

в. н. с. лаборатории экологии насекомых Института систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск.

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Зоологический институт Российской академии наук (ЗИН РАН),

г. Санкт-Петербург.

Защита диссертации состоится 20г. на утреннем заседа-

нии диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 10.

тел.: (383)363-49-06, факс: (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.

Автореферат разослан 20/Зг.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Т. М.Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования. Интенсивное развитие молекулярной сравнительной геномики животных в последние годы подтвердило высказанное ранее цитогенетшсами [Dobzhansky, 1970) заключение о том, что хромосомные перестройки и, прежде всего, инверсии, играют ведущую роль в дивергенции геномов при видообразовании (Kumar étal., 2001; Zdobnov et ai, 2002; Eichler, Sankoff, 2003; Marques-Bonet et al, 2004; Severson et al. 2004; Ayala, Coluzzi, 2005; Kirkpatrick, 2010). Использование молекулярных методов при сравнении линейной организации геномов животных из самых разных таксонов позволило выявить значительно большее число хромосомных перестроек, изменявших порядок генов в геномах при видообразовании, чем это удавалось цитогенетикам при анализе хромосом, но это не уменьшило значение хромосомного анализа при изучении дивергенции геномов животных в процессе видообразования, а, напротив, привлекло еще большее внимание к проблеме роли хромосомных перестроек в дивергенции геномов (Kirkpatrick, 2010). В настоящее время ключевым направлением в сравнительной геноми-ке является определение числа и локализации хромосомных разрывов в геноме, изменяющих линейный порядок генов в группах сцепления, что позволяет реконструировать филогенетическую историю видов и более крупных таксонов. Наиболее удобной моделью для изучения роли хромосомных пересгроек в эволюции геномов служат политенные хромосомы Diptera, и, в особенности, политенные хромосомы видов рода Chironomus, широко распространенных но всему миру и обитающих в самых разнообразных экологических условиях, что позволяет оценивать взаимосвязь хромосомных перестроек и факторов среды.

Кариотипы видов рода Chironomus строго видоспецифичны за счет фиксированных хромосомных перестроек: реципрокных транслокаций целых хромосомных плеч и инверсий. Это дает возможность определять локализацию границ разрывов хромосомных перестроек, их спектр у разных видов и восстанавливать цитогенетическую историю каждого вида (Keyl, 1957,1961,1962; Martin, 1966, 1979, 2011, 2012а,b; Wulker, 1973, 1980, 2010; Michailova, 1989; Michailova étal, 2007; Кикнадзе и др., 1989,1991, 1996, 2004, 2008; Kiknadze et al, 2010; Петрова, 1989,1990; Шобанов, 2000,2002а,б).

До последнего времени эти исследования проводились в основном на видах рода Chironomus, принадлежащих к цитокомплексу «thummi». Виды данного цитокомплекса имеют сочетание хромосомных плеч АВ (хромосома I), CD (хромосома И), EF (хромосома III), G (хромосома IV). В роде Chironomus имеется еще ряд других цитокомплексов, кариотипы видов этих цитокомплексов различаются сочетанием хромосомных плеч: АЕ CD EF G (цитокомплекс «pseudo-thummi»), AC ED FB G (цитокомплекс «parathummi») и др. (Keyl, 1962).

Малоизвестно, насколько закономерности хромосомной эволюции, выявленные в цитокомплексе «thummi», характерны для других цитокомплексов. Наличие в кариотипах видов других цитокомплексов транспонированных хромосом сильно изменяет линейную структуру геномов, что может влиять как на хромосомный полиморфизм, так и на активность генов. В связи с этим,

необходимо сравнить закономерности хромосомной эволюции у видов рода СЫгопотю из цитокомплексов «ИшттЬ и «рзеисЬЙштгт», различающихся транслокацией плеч в двух из четырех хромосом кариотипа: АВ и ЕЙ (цито-комплекс «Йштпн»), АЕ и ВР (цитокомплекс «pseudothuшmi»).

Изучение кариотипов у видов рода СЫгопотш из разных цитокомплексов представляет собой удобную модель для сравнительной геномики, т.к. позволяет оценить вклад различных типов хромосомных перестроек и их сочетаний в дивергенцию геномов при видообразовании.

Цели и задачи работы. Цель настоящей работы — изучить хромосомный полиморфизм, спектр и локализацию точек инверсионных и траслокацион-ных разрывов хромосом, приводящих к изменению линейной структуры генома при дивергенции кариотипов в процессе видообразования, у видов рода СЫгопотиз из цитокомплекса «р5еис1оЙштгш», а также сравнить комплексное влияние реципрокных транслокаций целых хромосомных плеч и парацентрических инверсий на эволюцию хромосом видов рода СЫгопотиз из цитокомплексов «Литгш» и «р5ет1оЙштгш».

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить кариотипы видов рода СЫгопотт из цитокомплекса «рБеисЬИшт-пи» в природных популяциях Западной Сибири и Восточной Европы.

2. Определить спектр и уровень хромосомного полиморфизма в популяциях изучаемых видов и оценить объемы их кариофондов. Сравнить характеристики межпопуляционного хромосомного полиморфизма у видов рода СЫгопотиз из цитокомплексов «рэеис^йштгш» и «Йштгти».

3. Определить спектр, частоты и локализацию точек инверсионных разрывов в хромосомах рода СЫгопотиз у видов из цитокомплекса «рБеис^Йштгш» и сравнить их с таковыми у видов из цитокомплекса «йштпи».

4. Установить филогенетические связи между видами рода СЫгопотиз из цитокомплекса «рБеисЬйшптн» на основании объединения данных о числе хромосомных разрывов между парами последовательностей дисков в хромосомных плечах.

5. Изучить особенности структуры центромерных районов в транслоцирован-ных хромосомах АЕ и ВР у изученных видов цитокомплекса «рзеийойштгш» в сравнении с хромосомами АВ и ЕР у видов цитокомплекса «Шитгш». Научная новизна. На основе детального цитогенетического анализа описана структура кариотипов видов рода СЫгопотиз из цитокомплекса «рзеис5о-Литгш» {С. рБеиёо^итт!, С. теЬпезсепз, С. эр. ргоре иНдтозия, С. «ёогзаиз»} в природных популяциях Западной Сибири и Восточной Европы, впервые проведено картирование хромосомных плеч С и Б у этих видов. Созданы цитофо-токарты кариотипов изученных видов. Вид С. иНдтозиз впервые обнаружен в Сибири, установлены существенные цитогенетические различия между европейскими и сибирскими популяциями (С. иПдтозш в Европе, С. Бр. ргоре иНд!-позю [С. иИдтозиз2) в Сибири). Впервые определены объемы кариофондов изученных видов.

С помощью компьютерного анализа впервые определено число и хромосомная локализация инверсионных разрывов в геномах 70 видов рода СЫго-

nomus из цитокомплекса «thummi» и 55 видов из цитокомплекса «pseudo-thummi», выявлены четкие различия по числу и локализации этих разрывов между данными цитокомплексами.

На основании числа инверсионных разрывов между парами последовательностей дисков (ПД) построено филогенетическое дерево для видов рода Chiro-nomus из цитокомплекса «pseudothummi» и продемонстрирована континент-специфическая корреляция дивергенции ПД в политенных хромосомах изученных видов.

Впервые в кариотипе у одного из видов рода Chironomus из цитокомплекса «pseudothummi» — С. «dorsalis» — в хромосомах АЕ и BF выявлено по два диска несущих признаки центромерных: плотная упаковка с интенсивным окрашиванием ацет-орсеином, положительное С-дифференциальное окрашивание, гибридизация с ДНК, выделенной из центромерного диска нетраслоциро-ванной хромосомы CD. У остальных видов рода Chironomus из цитокомплекса «pseudothummi» в политенных хромосомах выявлено по одному центромерно-му диску, но эти диски, как правило, значительно тоньше, чем центромерные диски в политенных хромосомах видов рода Chironomus из цитокомплекса «thummi».

Научно-практическая ценность. Описание кариотипа и хромосомного полиморфизма позволяет надежно идентифицировать виды хирономид и уточняет их ареалы.

Количественные данные о спектре и уровне хромосомного полиморфизма у видов рода Chironomus, представленные в диссертации, могут служить основой при проведении биомониторинга для оценки нарушений наследственного материала при загрязнении водоемов.

Результаты работы по анализу числа и хромосомной локализации точек инверсионных разрывов в кариофондах видов расширяют представления о роли хромосомных перестроек в дивергенции линейной организации геномов при видообразовании. Они используются в курсе лекций по клеточной биологии в Новосибирском государственном университете. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Реципрокные транслокации хромосомный плеч сопровождаются изменением локализации и частот инверсионных разрывов в хромосомах.

2. Географическая изоляция является важным фактором дивергенции ПД политенных хромосом у видов рода Chironomus.

3. В центромерных районах хромосом АЕ и BF у вида С. «dorsalis» диски «С», 19ef и 28de обладают признаками центромер.

Личный вклад автора. Автор собрал и зафиксировал личинок Chironomus из цитокомплексов «pseudothummi» и «thummi» в природных популяциях Западной Сибири. Кроме того, им был также обработан материал по видам цитокомплекса «pseudothummi», накопленный в лаборатории. Автор лично приготовил препараты давленых политенных хромосом, окрашенных ацет-орсеином, С-дифференциальным окрашиванием и флуоресцентной in situ гибридизацией (FISH). Он лично участвовал в анализе по оценке числа и локализации точек инверсионных разрывов и в построении филогенетических деревьев.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008), Международной конференции «Биоразнообразие, проблемы экологии Горного Алтая и сопредельных регионов: настоящее, прошлое, будущее» (Горно-Алтайск, 2008), Международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных «Карио-V» (Новосибирск, 2010), XVIII Международном симпозиуме по хирономидам (Trondheim,

2011), XIV съезде Русского энтомологического общества (Санкт-Петербург,

2012), отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН в 2009 и 2012 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК, и 7 тезисов докладов конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 178 источников. Работа изложена на 145 страницах, содержит 72 рисунка и 17 таблиц.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю профессору, д.б.н. И. И. Кикнадзе за постоянное внимание и поддержку за все время работы над диссертацией. Автор благодарит д.б.н. Н. Б. Рубцова и K.6.H В. В. Голыгину за предоставление микродиссекционных библиотек и помощь в проведении работы по изучению центромерной ДНК, д.б.н. Л. И. Гундерину, к-б.н. А. Г. Истомину, к.б.н. В. В. Голыгину и к.б.н. М. Т. Сиирин за предоставление материала, д.б.н. Л. И. Гундерину за большую помощь при обсуждении результатов и оформлении работы, к.т.н. Л. А. Мирошниченко и K.T.H. В. А. Гусева за помощь в проведении компьютерной обработки материала. Автор благодарит сотрудников кафедры цитологии и генетики НГУ: д.б.н. Л. В. Высоцкую, к-б.н. А. М. Гусаченко, к.б.н. О. В. Ермолаеву и к.б.н. О. С. Корниенко за всестороннюю помощь и поддержку при выполнении работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы личинки четырех видов рода Chironomus из природных популяций Палеарктики: С. pseudothummi Strenzke, 1959, С. mela-nescens Keyl, 1961, С. sp. prope uliginosus Keyl, 1960 и С. «dorsalis» sensu Strenzke (1959) (табл. 1). Для сравнительной оценки инверсионной изменчивости ПД в плечах хромосом видов рода Chironomus из различных цитокомплексов были проанализированы собственные и литературные данные о кариофондах 55 видов из цитокомплекса «pseudothummi» (196 ПД) и 70 видов из цитокомп-лекса «thummi» (281 ПД).

Приготовление препаратов, картирование хромосом, проведение С-дифференциального окрашивания хромосом и FISH. Давленые препараты политенных хромосом готовили по стандартной ацет-орсеиновой методике (Кикнадзе и др., 1991). Картирование хромосомных плеч А, Е и F проводили по Кайлу (Keyl, 1962), плеч С и D — по Девай и др. (Dévai et al., 1989). С-диф-ференциальное окрашивание проводили по методике, описанной в работе Л. Е. Сигаревой (1981). FISH проводили согласно стандартному протоколу, описанному в работе М. Т. Сиирин (Сиирин и др., 2003). ДНК-пробы были по-

Таблица 1

Общая характеристика исследованных популяций видов

рода СЫгопотиэ из цитокомплекса «р5еис1оЙщтті» _

Вид Место сбора Дата сбора Символ популяции Число личинок

С. рїеисіоіїитті Новосибирская обл., окр. Академгородка: р. Обь, с/т* «Маяк»; 10.06.83 Яи-Ы5К-МА 20

бассейн р. Ельцовка, с/т «Кристалл»; 02.08.94 29.09.02 03.10.85 яи-^к-кя ІШіж-тз 9 ....... 19

бассейн р. Зырянка, с/т «Цитолог»;

бассейн р. Зырянка, с/т «Нива». 29.08.87 яи-жк-м 15

Ярославская обл., п. Борок, р. Латка. 29.05.86 яи-удя-вь 5

Челябинская обл., ПО «Маяк», Кашкаров пр. 04.10.91 ЯІІ-СНЕ-КР 1

Нидерланды, Роберте Хей, торф, болото. 02.04.07 ІЧЬ-НІЬ-ЯН 33

С. теїапезсепз Новосибирская обл., бассейн р. Ельцовка, с/т «Кристалл». 15.09.86 Яи-Ы5К-КЯ 4

Ярославская обл., п. Борок, р. Латка. 25.05.85 Яи-УАЯ-ВЬ 8

Рязанская обл., г. Рязань, рыборазвод. пр. 03.07.85 яи-ядг-рр 160

Респ. Тыва, водоем в окр. г. Кызыл. 18.05.90 ии-тиу-кг 9

С. эр. ргоре иНдтотэ Новосибирская обл., окр. Академгородка: бассейн р. Ельцовка, с/т «Кристалл»; 29.09.02 Яи-Ы5К-КЯ 59

устье р. Ельцовка. 31.10.06 ЇШ-^К-ЕЬ 1

Ярославская обл., п. Борок, р. Латка. 29.05.86 ЯІІ-УАЯ-ВЬ 5

Челябинская обл., ПО «Маяк», Кашкаров пр. 29.10.91 ЯІІ-СНЕ-КР 4

С. «сіогеаііз» Новосибирская обл., окр. Академгородка: бассейн р. Ельцовка, с/т «Кристалл»; 27.07.90 яи-ызк-кя 7

бассейн р. Зырянка, с/т «Генетик»; 30.07.99 Яи^К-бЕ 12

г. Бердск, лужа у бердских пр. 25.06.07 ІШ^К-ВЬ 50

Ярославская обл., п. Борок, р. Латка. 29.05.86 Яи-УАЯ-ВЬ 10

Алтайский кр., оз. Ая. 20.09.89 ЯЦ-ЯАЬ-АУ 14

Приморский кр., ручей у бухты Лазурной. 14.11.00 Ш-РИ-БН 23

* Садовое товарищество.

лучены методом микродиссекции центромерных дисков. Визуализацию ДНК-проб, модифицированных биотином, проводили с помощью антител, меченных флюорохромом А1ехаР1иог488. Хромосомы были окрашены ОАР1.

Цитогенетические показатели инверсионного полиморфизма, анализ локализации инверсионного разрывов, построение филогенетических деревьев. В качестве цитогенетических показателей инверсионного полиморфизма видов рода СЫгопотш использовали: спектр и частоты ПД в популяции, спектр и частоты генотипических комбинаций ПД в популяции, процент особей, гетерозиготных по инверсиям, и среднее число гетерозиготных инверсий на особь. Для выявления локализации инверсионных разрывов применяли разработанный совместно с сотрудниками Института математики СО РАН модифицированный метод попарного сравнения ПД (Гусев и др., 2001; Ю-

knadze et al„ 2003; Miroshnichenko et al., 2011). Достоверность различий частот встречаемости групп точек инверсионных разрывов в политенных хромосомах видов Chironomus оценивали по методу <р Фишера (Плохинский, 1980). Построение филогенетических деревьев на основе полученной матрицы попарных расстояний у 125 видов Chironomus осуществляли с помощью MEGA 5.0 (Tamura etai, 2011). Использовали метод Neighbour-Joining (Saitou, Nei, 1987).

Микроскопический анализ. Для получения фотографий политенных хромосом использовали оборудование Центра коллективного пользования «Микроскопический анализ биологических объектов СО РАН». Препараты, окрашенные ацет-орсеином и методом С-дифференциального окрашивания, анализировали на микроскопе Axioplan 2 Plus, оборудованном CCD-камерой AxioCam HRcr и программой AxioVision (Carl Zeiss, Германия). Результаты FISH визуализировали с помощью люминесцентного микроскопа Axioplan 2 Plus (Carl Zeiss, Германия), оборудованном CCD-камерой CV МЗОО QAI, Япония) и пакетом обработки изображений ISIS4 (MetaSystems GmbH, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика кариотипов и особенности хромосомного полиморфизма изученных видов хирономид в природных популяциях Западной Сибири и Восточной Европы.

Впервые были детально исследованы кариотипы (рис. 1,2), ПД политенных хромосом и хромосомный полиморфизм сибирских и восточноевропейских популяций четырех видов рода Chironomus из цитокомплекса «pseudothum-mi»: С. pseudothummi, С. melanescens, С. sp. prope uliginosus и С. «dorsalis». Картированы 5 из 7 хромосомных плеч, проведен детальный анализ хромосомного полиморфизма, оценена географическая изменчивость линейной структуры генома, определены объемы кариофондов.

В работе представлены подробные цитофотокарты всех хромосомных плеч. Плечи С и D картированы впервые. Политенные хромосомы у данных видов более тонкие и длинные, чем у видов в цитокомплексе «thummi». Политенные хромосомы изученных видов имеют хорошую структуру с четко выраженными дисками и междисками. Центромерные районы политенных хромосом у изученных видов выражены не так четко, как у видов рода Chironomus из цитокомплекса «thummi». В некоторых случаях центромерный район с тонким диском у видов рода Chironomus из цитокомплекса «pseudothummi» удается установить только путем тщательного картирования и сравнения с центро-мерным районом хромосом «стандартного» вида Chironomus piger.

Впервые обнаружен уникальный случай — в кариотипе С. «dorsalis» в хромосомах АЕ и BF выявлено по два центромерных диска вместо одного (рис. 2). До сих пор подобное явление у хирономид не наблюдалось.

Установлено, что исследованные виды цитокомплекса «pseudothummi» являются полиморфными. Инверсионные ПД хромосом у них встречаются с низкой частотой и затрагивают только 1-3 плеча.

Кариофонды у видов рода Chironomus из цитокомплекса «pseudothummi» в основном невелики (8-13 ПД), реже встречаются виды с более крупными ка-риофондами (18-21 ПД) (табл. 2).

Рис. 1. Кариотип С. Бр. ргоре иИдтозиз из западносибирских популяций.

цЦ2А1.1, иН2В2.2 и т.д. — символы генотипических сочетаний в плечах хромосом; N — ядрышко; ВЯ — кольца Бальбиани; стрелки — центромерные районы.

Рис. 2. Кариотип С. «с^геаНз» из западносибирских популяций.

с1огА1.1, dorBl.l и т.д. — символы генотипических сочетаний в плечах хромосом; N — ядрышко; В1* — кольца Бальбиани; стрелки — центромерные районы, пунктирные стрелки — возможные центромеры.

Популяции исследованных видов имеют четкие различия в хромосомном полиморфизме. Особо различаются европейские и сибирские популяциями. Существенные цитогенетические различия, установленные между сибирски-

Таблица 2

Объемы кариофондов видов рода СМгопотиї из цитокомплекса «рБеїкіойщтті»

Вид Число последовательностей дисков в плечах Объем

А В С О Е Р Є кариофонда

С. рїешіоііштті 1 1 2 3 3 1 3 14

С. теїапевсепз 2 1 2 1 1 1 3 11

С. иІідіпоБШ1 2 3 3 4 2 3 1 18

С. Бр. ргоре иНдіпоЕиз 1 2 3 3 1 2 1 13

С. ¿¡окаНв 1 1 1 1 1 1 2 8

С. аргіїіпш2 2 1 2 2 1 1 2 11

С. \uridus3 3 6 2 1 3 4 2 21

С. рапкгаґоуае4 2 1 1 1 1 1 1 8

С. уозЫтаКш5 3 3 3 2 2 2 3 18

Изменчивость: 1-3 1-6 1-3 1-4 1-3 1-4 1-3 8-21

1 Юкпаске а!., 2010;2 Кикнадзе, Истомина 2009;3 Юкпаске, Мопипа, 2010;4 Кикнадзе и др., 1988,5 Кикнадзе и др., 2003.

ми и европейскими популяциями вида С. иИдмоБиз, позволили выделить сибирские популяции как С. Бр. ргоре иНдтоБШ. Подробные данные по хромосомному полиморфизму и его географической изменчивости представлены в диссертации.

Локализация и частоты инверсионных разрывов в геномах видов рода СЫгопотш.

Для выявления влияния перекомбинации разных плеч (групп сцепления генов) в двух хромосомах на процесс хромосомных перестроек (частоту разрывов и локализации точек разрывов) в эволюции нами было проведено детальное сравнение частоты и локализации точек инверсионных разрывов в политенных хромосомах видов рода СЫгопотиБ из цитокомплексов «Йшпнш» и «рзеис^йшпшп».

Многочисленные сайты инверсионных разрывов, накопленные за всю ци-тогенетическую историю цитокомплексов, распределены практически по всей длине плеч, как это видно на примере плеча А (рис. 3).

Обнаружены общие черты, характеризующие локализацию и частоты инверсионных разрывов по всем хромосомным плечам. В каждом из плеч четко выявляются несколько сайтов (2-4) с максимальной частотой разрывов (7090 %). Данные точки разрывов являются границами инверсий в космополит-ных базовых ПД в роде СЫгопотш. Точки разрывов с меньшей частотой (2050 %) встречаются в базовых ПД, найденных на 2-3 континентах. Разрывы, встречающиеся с малой частотой (до 20 %), являются границами инверсий в континент-специфических ПД.

Участки, не затронутые инверсионными разрывами (консервативные районы), малы (2-4 диска). В прицентромерных участках плеч такие районы крупнее (до 20 дисков).

Наряду с общей картиной распределения, локализацией и частотой точек инверсионных разрывов в хромосомах изученных видов, обнаружены четкие

Рис. 3. Локализация и частоты инверсионных разрывов в хромосомном плече А у видов рода Chironomus из цитокомплексов «thummi» (красные столбцы) и «pseudothummi» (синие столбцы).

различия по этим параметрам между видами рода СЫгопотш из цитокомпле-ксов «Йштпи» и «рБеис^Йштгт». Установлено различное количество космо-политных точек разрывов в изученных цитокомплексах. Вьшвлено наличие большого числа специфических точек разрывов для каждого из цитокомплек-сов (табл. 3).

Таблица 3

Сравнение количества точек инверсионных разрывов в плечах хромосом

видов рода СЫгопотиэ из цитокомплексов «Шитті» и «рзеисІоОштті»

Хромосомные плечи А Е Р С Е

Число последовательностей дисков 115 115 113 68 66 477

Число дисков в плече 115 86 137 135 139 612

Суммарное число точек инверсионных разрывов 55 34 61 55 83 288

Число точек инверсионных разрывов, общих для двух цитокомплексов 21 12 19 15 25 92

Число точек разрывов с максимальной частотой у видов цитокомплекса «Шитті» 4 3 2 7 4 20

«рБеисІоШитті» 4 2 2 3 2 13

Число точек разрывов, специфических для каждого из цитокомплексов «Шитті» 23 11 27 30 37 128

«рзеисіоШитті» 11 11 15 10 21 68

Дивергенция ПД и хромосомная эволюция у видов рода СЫгопотт из цитокомплекса «рзеїпіойштті».

Интегральное филогенетическое дерево, построенное на основании объединения данных о числе хромосомных разрывов между парами ПД в трех хромосомных плечах (А, Е, її) у 51 вида рода СЫгопотиэ из цитокомплекса «рэеи-сІоШитті» (рис. 4) свидетельствует о значительном вкладе континентальной изоляции в дивергенцию ПД в хромосомах видов рода СЫгопотиБ из этого цитокомплекса.

ПД в плечах хромосом А, Е и її у видов рода СЫгопотиБ из цитокомплекса «рзеисІоШитті» дивергировали относительно независимо друг от друга.

Гомологичные ПД в плечах А, Е и И у видов рода СЫгопотиэ из цитокомплекса «рБеисіоЙїитті», обитающих на разных континентах, свидетельствуют о существовании предковых ПД, общих для видов рода СЫгопотиэ.

Особенности структуры центромерных районов у видов рода СИігопо-тт из цитокомплекса «рзеїкІоЦштті».

В связи с тем, что разрывы хромосом при транслокации целых хромосомных плеч проходили в центромерных районах, было проведено сравнение структуры этих районов политенных хромосом в кариотипах видов рода СЫ-гопотш из цитокомплексов «Литті» и «рБеисІоІіштті». Особое внимание было уделено изучению хромосом С. «сіогеаііз» в связи необычной организацией центромерных районов политенных хромосом этого вида, где в трансло-цированных хромосомах АЕ и Вїї обнаружено по два «центромерных» диска, вместо одного (см. рис. 2).

Зоогеографические царства

С-ярЫг 8 С.гваїапсіісив

с.врыгб

С.сіиріех

С.оссісіепІаНз С^вскгопі СХерреп

С.тасісіепі

С. рзеис/оррояИиз С.іїттзі

Австралийское

ЗЭфиопское

^Ориентальное

^Австралийское

Палеарктическое

Палеарктическое

С.иіідіпозиз С.иіідіпо5и52 .

С.зрУР

С.зрСС

С.эрМОС

3 Неарктическое

Неотропическое

Неарктическое

Рис. 4. АЕР ОД-дерево филогенетических связей между 51 видом рода СЫгопотиБ из цитокомплекса «рБеиёоАштпи».

На рис. 5 представлено сравнительное цитогенетическое картирование дисков в центромерных районах политенных хромосом видов СЫгопотш из ци-токомплексов «Шитті» и «рБеисІоШитті». Показано, что в хромосомах АЕ и ВР морфологически идентифицируется центромерный диск (сплошная стрелка) у всех видов цитокомплекса «рзеисіойїитті», но у этих видов в прицент-ромерном районе плеча А также сильно гетерохроматизированы диски 19е£ а в плече В — диски 28ес1 (пунктирная стрелка).

С-дифференциальное окрашивание политенных хромосом С. «сіогеаііз» показало, что у этого вида в хромосомах АЕ и ВР оба толстых диска (центромер-ные диски и диски 19ef и 28ес1) являются С-положительными (рис. 6). В хромосомах АВ и ЕР у видов цитокомплекса «Шитті» диски 19еї и 28ес1 не дают положительного С-окрашивания. Хромосомы СО и С имеют лишь по одному типичному С-положительному центромерному диску в обоих цитокомплексах.

dorA1.1

dorE1.1 dorB1.1

dorF1.1

mlsF1.1

murF1.1

pigF1.1

murE1.1

pigE-i.1

murE1.1

pigE1.1

pigF1.1

Рис. 5. Картирование центромерных областей политенных хромосом АЕ, BF

у С. «dorsalis», С. melanescens и АВ, EF у С. piger (из Keyl, 1962], С. muratensis.

Стрелки соединяют гомологичные диски у разных видов.

pigA1.1

П1ИГА1

murB1.1

pigB1.1

pigA1.1

murB1.1

murA1.1

pigB1.1

, don u

, , l dcrDl.l

14» , ^ÈË v ш^ЩШЁ

, „ '% dorEI.Ï

doiOI.l m

Рис. 6. С-дифференциальное окрашивание политенных хромосом С. «dorsalis».

Изучение центромерных районов политенных хромосом у С. «dorsalis» с помощью FISH.

Для молекулярной характеристики С-положительные диски в хромосомах С. «dorsalis» были вырезаны с помощью микродиссекции, для каждого из них была получена ДНК-библиотека (табл. 4).

Таблица 4

Использованные в исследовании микродиссекционные ДНК-библиотеки

Обозначение библиотеки Хромосома Сайт микродиссекции

dorI2 АЕ диск 19е5

dorI3 АЕ центромерный диск

dor2c2 CD центромерный диск

dor2c3 CD центромерный диск

dor3c BF центромерный диск

dor3-2 BF тонкий С-положительный диск, находящийся между крупными С-положительными дисками

Все полученные ДНК-пробы были гибридизованы на хромосомы С. <^огеа-Ив». Оказалось, что ДНК-пробы dor2c2 и dor2cЗ из центромерного района хромосомы СО интенсивно гибридизуются с центромерными районами хромосом СБ и С. В хромосомах АЕ и ВР наблюдается два сайта гибридизации, соответствующим по локализации С-положительным дискам (рис. 7). Кроме того, имеются сайты локализации данных проб в отдельных дисках на хромосомных плечах, хотя интенсивность гибридизации в этих сайтах ниже, чем в центромерных и С-положительных дисках. ДНК-проба dorIЗ давала похожую картину гибридизации.

в D с Jy

ШЁ?? F А

Е и н

Рис. 7. FISH ДНК-пробы dor2c2 на иолитенные хромосомы С. «dorsalis».

Белые стрелки — центромерные районы, желтые стрелки — С-положительные диски в хромосомах I [АЕ) и III (BF). Буквами обозначены плечи хромосом.

ДНК-проба с!ог12 из второго крупного С-положительного диска хромосомы АЕ (район 19с[) наиболее интенсивно гибридизовалась только с сайтом, из которого была получена, а интенсивность гибридизации в остальных С-по-ложительных и центромерных дисках была значительно ниже и сравнима с уровнем гибридизации в других дисках в плечах хромосом. Сходная картина наблюдалась при гибридизации пробы <1огЗс.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Впервые были детально исследованы кариотипы и хромосомный полиморфизм в сибирских и восточноевропейских популяциях четырех видов рода СЫгопотив из цитокомплекса «рвеисЬйшпти»: С. рзеи^Митти С. теШпезсепБ, С. 5р. ргоре иИдтозиБ и С. «ёогеаНз». Полученные данные существенно дополнили ранние краткие исследования по структуре и популяционной изменчивости кариотипа у данных видов из западноевропейских популяций. Впервые представлены данные о кариофондах палеарктических видов рода СЫгопотиз из цитокомплекса «рзеис1о&итгш». Показано, что эти виды широко распространены в России и, в частности, в Сибири. Обнаружены четкие различия в особенностях хромосомного полиморфизма в исследованных сибирских популяциях видов по сравнению с европейскими. Цитогенетическая структура (набор и частоты] ПД в сибирских и европейских популяциях этих видов различается вследствие наличия эндемичных ПД и различий частот общих ПД. Практически все изученные виды цитокомплекса «р5еис1оЙштгт» демонстрируют хромосомный полиморфизм, а не являются мономорфными, как полагал Кайл (Кеу1,1960,1962).

Специально стоит отметить различия между европейскими и сибирскими популяциями С. иНдтозиз. Общих ПД между этими популяциями найдено 6 (видоспецифические); в европейских популяциях эндемичными являются 12 ПД в сибирских — 7. Такие различия позволили нам выделить сибирские популяции под названием С. эр. ргоре иИдтоБиБ (С. иИдто$и$2).

Обнаружены четкие различия по уровню хромосомного полиморфизма между видами цитокомплексов «р5еис1оШитгш» и «Йштгт». Виды рода СЫ-гопотиБ из цитокомплекса «Шитпи» более полиморфны, характеризуются большими объемами кариофондов. Уровень хромосомного полиморфизма у видов цитокомплекса «р5еис1оЙшгш1и» ниже. Однако мы обнаружили, что общая изменчивость их геномов в процессе дивергенции видов и дифференциации популяций довольно высока, а ее роль в анализе инверсионной геномики видов значительна.

Впервые проведен компьютерный анализ общего числа и локализации точек инверсионных разрывов у видов рода СЫгопотш из цитокомплексов «Липши» и «рэеиёойштгт» для определения закономерностей реорганизации линейной структуры их геномов при видообразовании. Показано, что в пяти хромосомных плечах изученных видов найдены, в общей сложности, 288 точек инверсионных разрывов, распределенных по всей длине изученных хромосомных плеч (А, Е, С, О, И). Незатронутые инверсионными разрывами участки хромосом малы.

Одним из важнейших результатов анализа распределения точек разрывов по длине хромосомных плеч является существование в геномах видов таких сайтов, в которых частота инверсионных разрывов достигала 80-100 %. Такие сайты можно было бы назвать «горячими» точками инверсионной изменчивости и предположить, что в этих сайтах разрывы возникают неоднократно в ходе эволюции. Однако точный анализ локализации данных сайтов показал, что, напротив, они являются границами наиболее давно возникших инверсий. Такие инверсии являются космополитными, и мы предполагаем, что они возникли еще в период существования суперконтинента Пангеи. Эти инверсии можно отнести к наиболее древним, границы инверсий (точки инверсионных разрывов) сохранились у современных видов рода СЫгопотш. Точки инверсионных разрывов, встречающихся с меньшей частотой, относятся к ПД найденным на 2-3 континентах. Разрывы с малой частотой характерны для отдельных континентов, т.е. они наиболее молодые.

При проведении данной работы нас интересовало, влияет ли изменение комбинации хромосомных плеч в каждой их хромосом генома на инверсионную изменчивость. Результаты нашей работы показывают, что такое влияние существует и оно значительно. Подобное заключение вытекает из сравнения спектра, локализации и частот инверсионных разрывов в геномах видов цито-комплексов «рэеис^йшптй» и «Йштгш», различающихся транслокацией плеч в двух из четырех хромосом генома. Было обнаружено, что в хромосомах видов каждого из цитокомплексов имеются специфические инверсионные разрывы. Это свидетельствует о том, что сайты возникновения инверсионных разрывов сильно различаются в каждом из цитокомплексов. Наибольшие различия затрагивают плечи А, Е и Р, что связано с тем, что эти плечи участвуют в реципрокных транслокациях. Однако наличие подобных специфичных различий в плечах С и Б (не вовлеченных в транслокационные изменения), свидетельствует о влиянии сочетания плеч на распределение точек инверсионных разрывов во всем геноме.

Основные закономерности дивергенции ПД в хромосомах видов рода СЫго-потиз из цитокомплекса «рзеис^Йштгш» совпадают с закономерностями эволюции последовательностей дисков в хромосомах видов этого рода: 1) географическая изоляция является важным фактором дивергенции ПД в хромосомных плечах; 2) эволюция каждого из хромосомных плеч осуществляется независимо; 3) надежность и точность схем филогенетических отношений между изученными видами растет с увеличением доли генома, используемой в анализе; 4) филогенетические отношения между видами, установленные на основании дивергенции ПД, соответствуют геологической истории формирования континентов.

В ходе изучения кариотипов видов рода СЫгопотиз из цитокомплекса «рБеис1оиштгт», были обнаружены уникальные особенности в структуре цен-тромерных районов политенных хромосом у вида С. «с^гзаМз». Изучение ка-риотипа этого вида выявило в транслоцированных хромосомах АЕ и ВР наличие двух дисков, имеющих признаки центромеры, что в свою очередь подняло вопрос о морфологической организации и идентификации центромерных ди-

сков у этого вида и других видов цитокомплекса «ряеийойштггн» в целом.

На основании результатов проведенных исследований можно сделать заключение о том, что у видов цитокомплекса «рэеис^Йшгшш» наличие двух «центромер» не является общим правилом, а закрепилось в эволюции лишь у одного вида — С. ««¡огсаНБ». Можно полагать, что в кариотипе С. «сЬгзаИз» осуществились следующие варианты перестроек хромосом: образование единой 'цёнтромеры в хромосоме СБ посредством центрических слияний акроцентри-ческих хромосом в кариотипе предкового вида и сохранение дЬух центромер в хромосомах АЕ и ЕШ с инактивацией одной из них при теломе'рно-центромер-' ном слиянии акроцентрических хромосом предкового вида. А при образова-йии комбинации АВ СО ЕЙ С (цитокомплекс «Оштгт») из АЕ СЭ ВР С (цитокомплекс «р5еис1о1:Ьитгги») путем обмена плеч Е и В с сохранением центромер у плеч АиР, инактивированные центромеры утеряли и свои морфологические свойства (гетерохроматинизацию, способность к С-окрашиванию). Поэтому у видов из цитокомплекса «Шитгш» в каждой хромосоме четко выявляется лишь один центромерный диск.

Таким образом, полученные в работе данные свидетельствуют о наличии значительных различий в хромосомном полиморфизме видов рода СЫгипотш из цитокомплексов «рзеис1оЙштгт» и «1Ьитгш», которые, по всей вероятности, обусловлены влиянием реципрокных транслокаций и парацентрических инверсий.

ВЫВОДЫ

1. Изучены кариотипы и хромосомный полиморфизм четырех видов СЫгопо-тш из цитокомплекса «рБеис^Аштгт» в природных популяциях Западной Сибири и Восточной Европы (С. р5еи(1оЛитт1, С. те]апе$сепз, С. эр. ргоре иП-дтозш, С. ««ЗогеаНя»}. Созданы цитофотокарты кариотипов изученных ви: дов, впервые картированы хромосомные плечи С и Б.

2. Обнаружен полиморфизм во всех хромосомных плечах изученных видов. \ Выявлена четкая цитогенетическая дифференциация между европейскими

. ■ и сибирскими популяциями. Сибирские популяции С. иИдто$ш по уровню дивергенции были выделены как сильно дифференцированные географические популяции и получили название С. Бр ргоре иИдтозих. Определены объемы кариофондов изученных видов, включающие основные и инверсионные последовательности дисков политенных хромосом: С. р$еи<1о&ит-т/ — 16, С. теЬпезсст — 11, С. Бр ргоре иНдтозив — 13, С. «(1ог5аИ5» — 8 последовательностей дисков. Объемы кариофондов свидетельствуют о том, что уровень хромосомного полиморфизма у видов рода СЫгопотив из цитокомплекса «рБеис1оЙ1ит1гй» ниже, чем у видов из цитокомплекса «ИштгпЬ.

3. Сравнительный анализ последовательностей дисков политенных хромосом 125 видов рода СЫгопотиз показал существенные различия в локализации, спектре и частотам инверсионных разрывов в хромосомах видов из цитокомплексов «Йштгш» и «рзеийойштгш». В общей сложности в пяти хромосомных плечах видов рода СЫгопотт из цитокомплексов «Йштгга» и «рзеис1о-ШишшЬ выявлено 288 точек инверсионных разрывов, из них специфическими для видов из цитокомплекса «Шиттш» являются 122, для видов из ци-

токомплекса «pseudothummi» — 68 точек разрывов. Полученные данные свидетельствуют о существенном влиянии изменения комбинаций групп сцепления генов на инверсионный полиморфизм.

4. Дивергенция последовательностей дисков политенных хромосом среди видов рода Chironomus из цитокомплекса «pseudothummi», свидетельствует о том, что географическая изоляция является важным фактором эволюции последовательностей дисков в хромосомных плечах. Эволюция каждого из хромосомных плеч осуществляется независимо.

5. Установлено, что точки разрывов хромосом, вовлеченных в реципрокную транслокацию целых плеч в хромосомах видов рода Chironomus, локализованы непосредственно вблизи центромерных дисков. Обнаружены четкие различия по размерам центромерных дисков политенных хромосом видов рода Chironomus из изучаемых цитокомплексов: в цитокомплексе «pseudothummi» центромерные диски хромосом малы, их трудно идентифицировать, в цитокомплексе «thummi» центромерные диски крупные. Обнаружен уникальный случай наличия в кариотипе С. «dorsalis» хромосом АЕ и BF, обладающих двумя дисками с признаками центромеры: плотная упаковка с интенсивным окрашиванием ацет-орсеином, положительное С-дифферен-циальное окрашивание, гибридизация с ДНК, выделенной из центромер-ного диска нетраслоцированной хромосомы CD.

Список основных публикаций по теме диссертации:

1. Kiknadze 1.1., Golygina V. V., Broshkov A. D., Gunderina L. I., Istomina A. G. Mystery of Chironomus dorsalis Meigen karyotype (Díptera, Chironomidae) // Сотр. Cytogen. - 2008. - V. 2, N. 1. - P. 21-35.

2. Брошков А. Д., Кикнадзе И. И., Истомина А. Г., Гундерина Л. И. Структура ка-риотипа хирономиды Chironomus uiiginosus Keyl, 1960 (Díptera, Chironomidae) // Евразиатский энтомол. журн. - 2008. - Т. 7, Вып. 1. - С. 57-6S-

3. Кикнадзе И. И., Брошков А. Д., Истомина А. Г., Гундерина Л. И., Валленд] к X. Географическая изменчивость последовательностей дисков политенных хромосом комара-звонца Chironomus pseudothummi (Díptera, Chironomí Jae) // Цитология. - 2008. - Т. 50, Вып. 6. - С. 539-548.

4. Кикнадзе И. И., Брошков А. Д. Кариотип и хромосомный полиморфизм у хирономиды Chironomus melanescens Keyl, 1961 (Díptera, Chironomidae) // Евразиатский энтомол. журн. - 2009. - Т. 8, Вып. 1. - С. 19-28.

5. Брошков А. Д., Мирошниченко Л. А., Кикнадзе И. И., Гусев В. Д. Локализация и частоты инверсионных разрывов в геномах видов Chironomus (Díptera, Chironomidae) // Вестник ВОГиС. - 2010. - Т. 14, Вып. 4. - С. 656-662.

6. Голыгина В. В., Кикнадзе И. И., Брошков А. Д., Карамышева Т. В., Рубцов Н. Б. Особенности строения центромерных районов политенных хромосом хиро-номид (Díptera, Chironomidae) // Вестник ВОГиС. - 2010. - Т. 14, Вып. 4. - С. 622-631.

Подписано в печать 10.10.2013 г. Формат бумаги 60 х 901/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ №59

Отпечатано на полиграфической базе ИЦиГ СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Брошков, Андрей Дмитриевич, Новосибирск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СО РАН

04201365091

на правах рукописи

БРОШКОВ АНДРЕИ ДМИТРИЕВИЧ

Дивергенция последовательностей дисков политенных хромосом у видов рода Chironomus (Díptera, Chironomidae) из цитокомплекса «pseudothummi»

03.03.04 — Клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель профессор, д.б.н. Ия Ивановна Кикнадзе

Новосибирск — 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................................................................3

ГЛАВА 1. ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ДИВЕРГЕНЦИИ

КАРИОТИПОВ У ХИРОНОМИД (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)..............................................10

1.1. Структура и эволюция кариотипа в семействе Chironomidae.............................11

1.2. Хромосомный полиморфизм, его роль в дивергенции популяций

и видов хирономид......................................................................................................................17

1.2.1. Парацентрические инверсии как основной фактор дивергенции геномов при видообразовании..........................................................................................19

1.2.2. Реципрокные транслокации целых хромосомных плеч

в роде Chironomus, цитокомплексы...............................................................................21

1.2.3. Локальные дупликации и делеции дисков...................................................................23

1.3. Реконструкция цитогенетической истории видов с помощью

анализа инверсионных последовательностей дисков............................................24

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................................32

2.1. Материалы........................................................................................................................................32

2.2. Методы................................................................................................................................................36

2.2.1. Изучение кариотипов............................................................................................................36

2.2.2. Картирование хромосом.....................................................................................................36

2.2.3. Изучение центромерных районов...................................................................................37

2.2.4. Цитогенетические показатели инверсионного полиморфизма....................38

2.2.5. Анализ локализации и частот инверсионных разрывов....................................38

2.2.6. Построение филогенетических деревьев...................................................................39

2.2.7. Микроскопический анализ...................................................................................................40

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................................................................41

3.1. Структура кариотипа и хромосомный полиморфизм у видов

рода Chironomus из цитокомплекса «pseudothummi»...............................................42

3.1.1. Chironomus pseudothummi Strenzke, 1959....................................................................43

3.1.2. Chironomus melanescens Keyl, 1961..................................................................................54

3.1.3. Chironomus sp. prope uliginosus.........................................................................................62

3.1.4. Chironomus «dorsalis» sensu Strenzke (1959).............................................................72

3.2. Эволюция последовательностей дисков у видов рода Chironomus

из цитокомплекса «pseudothummi»....................................................................................80

3.2.1. Локализация и частоты инверсионных разрывов

в хромосомах видов рода Chironomus.............................................................................80

3.2.2. Дивергенция последовательностей дисков и хромосомная эволюция

у видов рода Chironomus из цитокомплекса «pseudothummi»..........................93

3.3. Особенности структуры центромерных районов политенных

хромосом у видов рода Chironomus..................................................................................104

3.3.1. Морфология рисунка дисков в ценромерных районах политенных хромосому видов рода Chironomus в цитокомплексах «thummi»

и «pseudothummi»...................................................................................................................106

3.3.2. Изучение ценромерных районов политенных хромосом у С. «dorsalis»

с помощью С-дифференциального окрашивания.................................................111

3.3.3. Изучение ценромерных районов политенных хромосом у С. «dorsalis»

с помощью флюоресцентной in situ гибридизации (FISH)..............................112

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................................118

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................................128

ЛИТЕРАТУРА.......................................................................................................................................................130

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования.

Интенсивное развитие молекулярной сравнительной геномики животных в последние годы подтвердило высказанное ранее цитогенетиками (Dobzhansky, 1970) заключение о том, что хромосомные перестройки и, прежде всего, инверсии, играют ведущую роль в дивергенции геномов при видообразовании (Kumar et al, 2001; Zdobnov et al., 2002; Eichler, Sankoff, 2003; Marques-Bonet et al., 2004; Severson et ai, 2004; Ayala, Coluzzi, 2005; Kirkpatrick, 2010). Использование молекулярных методов при сравнении линейной организации геномов животных из самых разных таксонов позволило выявить значительно большее число хромосомных перестроек, изменявших порядок генов в геномах при видообразовании, чем это удавалось цитоге-нетикам при анализе хромосом, но это не уменьшило значение хромосомного анализа при изучении дивергенции геномов животных в процессе видообразования, а, напротив, привлекло еще большее внимание к проблеме роли хромосомных перестроек в дивергенции геномов (Kirkpatrick, 2010). В настоящее время ключевым направлением в сравнительной геномике является определение числа и локализации хромосомных разрывов в геноме, изменяющих линейный порядок генов в группах сцепления, что позволяет реконструировать филогенетическую историю видов и более крупных таксонов. Наиболее удобной моделью для изучения роли хромосомных перестроек в эволюции геномов до сих пор служат политенные хромосомы Díptera, в частности, политенные хромосомы видов рода Chironomus, широко распространенных по всему миру и обитающих в самых разнообразных экологических условиях, что позволяет оценивать взаимосвязь хромосомных перестроек и факторов среды.

Кариотипы видов рода Chironomus строго видоспецифичны за счет фиксированных хромосомных перестроек: реципрокных транслокаций целых хромосомных плеч и инверсий (Keyl, 1957, 1961, 1962; Martin, 1966, 1979, 2011, 2012а, 2012b; Wülker, 1973,1980,2010; Michailova, 1989; Michailova et ai, 2007; Кикнадзе и др., 1989, 1991, 1996, 2004а, 2008; Kiknadze et al., 2010; Петрова, 1989, 1990; Шобанов, 2000, 2002а,б). Это дает возможность определять локализацию точек разрывов хромосомных перестроек, их спектр у разных видов и восстанавливать цитогенетическую

историю каждого вида (Keyl, 1962; Martin, 1979, Wülker et ai, 1989; Кикнадзе и др., 1989,1991,1996, 20046, 2008; Kiknadze et ai, 2010; Шобанов, 2000,2002a,б).

До последнего времени эти исследования проводились в основном на видах рода Chironomus, принадлежащих к цитокомплексу «thummi». Виды данного цито-комплекса имеют сочетание хромосомных плеч АВ (хромосома I), CD (хромосома II), EF (хромосома III), G (хромосома IV). Они широко распространены в Северном полушарии (в Евразии и Северной Америке) и очень редко встречаются на других континентах. Помимо цитокомплекса «thummi» в роде Chironomus имеется еще ряд других цитокомплексов. Кариотипы видов разных цитокомплексов различаются сочетанием хромосомных плеч: АЕ CD EF G (цитокомплекс «pseudothummi»), АС ED FB G (цитокомплекс «parathummi»), AF CD BE G (цитокомплекс «maturus») и другие (Keyl, 1962). Малоизвестно, насколько закономерности хромосомной эволюции, выявленные в цитокомплексе «thummi», характерны для других цитокомплексов. В то же время, наличие в кариотипах видов других цитокомплексов транслоцированных хромосом сильно изменяет линейную структуру геномов, что может влиять как на хромосомный полиморфизм, так и на активность генов. В связи с этим, необходимо сравнить закономерности хромосомнй эволюции у видов цитокомплекса «thummi» и второго по числу видов в роде Chironomus цитокомплекса «pseudothummi». В противоположность цитокомплексу «thummi», виды цитокомплекса «pseudothummi» распространены в основном в Южном полушарии, их распространение в Северном полушарии сравнительно мало изучено, а в Сибири оно практически не исследовалось.

В целом сравнение эволюции кариотипов у видов рода Chironomus из разных цитокомплексов представляет собой удобную модель для сравнительной геномики, так как позволяет оценивать влияние различных типов хромосомных перестроек и их сочетаний на дивергенцию геномов при видообразовании. В последние годы в лаборатории эволюционной биологии клетки (Сектор эволюционной геномики хиро-номид) ИЦиГ СО РАН для анализа дивергенции последовательностей дисков поли-тенных хромосом был успешно применен метод компьютерного анализа попарного сравнения последовательностей дисков, разработанный в Институте математики СО РАН специально для изучения дивергенции последовательностей дисков, позволяющий реконструировать цитогенетическую историю видов (Kiknadze et al., 2003; Miroshnichenko et al, 2011; Гусев и др., 2001; Гундерина и др., 2005в,г; Кикнадзе и др., 2004а,б; Кикнадзе, 2008; Гундерина, Кикнадзе, 2010).

Цели и задачи работы.

Цель настоящей работы — изучить хромосомный полиморфизм, спектр и локализацию точек инверсионных и траслокационных разрывов хромосом, приводящих к изменению линейной структуры генома при дивергенции кариотипов в процессе видообразования у видов рода СЫгопотш из цитокомплекса «рзешЗо^штгш», а также сравнить комплексное влияние реципрокных транслокаций целых хромосомных плеч и парацентрических инверсий на эволюцию хромосом видов рода СИ1гопотиз из цитокомплексов «рзеис^Йштпн» и «Литгш».

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить кариотипы видов рода СЫгопотиБ из цитокомплекса «рБеис^Ьитгш» в природных популяциях Западной Сибири и Восточной Европы.

2. Определить спектр и уровень хромосомного полиморфизма в популяциях изучаемых видов и оценить объемы их кариофондов. Сравнить характеристики меж-популяционного хромосомного полиморфизма у видов рода СЫгопотиэ из цитокомплекса «рБешЗоЙштпп» и «Шипит».

3. Определить спектр, частоты и локализацию точек инверсионных разрывов в хромосомах видов рода СЫгопотиэ из цитокомплекса «рБеис^Йттгш» и сравнить их с таковыми у видов из цитокомплекса «Шиппт».

4. Установить филогенетические связи между видами рода СЫгопотиБ из цитокомплекса «рзеис^Ьипитп» на основании объединения данных о числе хромосомных разрывов между парами поледовательностей дисков в хромосомных плечах.

5. Изучить особенности структуры центромерных районов в транслоцированных хромосомах АЕ и ВРу изученных видов цитокомплекса «рБеисЬШитпп» в сравнении с хромосомами АВ и ЕР у видов цитокомплекса «Шитгт».

Научная новизна.

На основе детального кариологического анализа описана структура кариотипов четырех видов рода СИмпотиз из цитокомплекса «р5еи(1оШитгт» {С.рхеиёо-Митт!, С. эр. ргоре иНдтозт, С. те1апеБсеп5, С. «^ГБаПБ») в природных популяциях Западной Сибири и Восточной Европы, впервые проведено картирование хромосомных плеч С и О у этих видов. Созданы цитофотокарты кариотипов изученных видов. Вид С. иНдтоБиБ впервые обнаружен в Сибири, установлены существенные цитогене-тические различия между сибирскими и европейскими популяциями [С. иИдтоБиэ в Европе, С. ер. ргоре иИдтозиБ (С. иИдто5из2) в Сибири). Впервые определены базовые

объемы кариофондов видов, включающих основные и инверсионные последовательности дисков в плечах хромосом кариотипа.

С помощью компьютерного анализа впервые определено число и хромосомная локализация инверсионных разрывов в геномах 55 видов рода Chironomus из цито-комплекса «pseudothummi» и 70 видов из цитокомплекса «thummi»; выявлены четкие различия по числу и локализации этих разрывов между данными цитокомплек-сами.

На основании числа инверсионных разрывов между парами последовательностей дисков построено филогенетическое дерево для видов рода Chironomus из цитокомплекса «pseudothummi» и продемонстрирована континент-специфическая корреляция дивергенции последовательностей дисков политенных хромосом изученных видов.

Впервые в кариотипе у одного из видов рода Chironomus из цитокомплекса «pseudothummi» — С. «dorsalis» — в хромосомах АЕ и BF с помощью С-дифферен-циального окашивания выявлено по два центромерных диска вместо одного. С применением флуоресцентной in situ гибридизации установлено присутствие ДНК из центромерного диска нетранслоцированной хромосомы CD в обоих дисках хромосом АЕ и BF. У остальных видов рода Chironomus из цитокомплекса «pseudothummi» в политенных хромосомах выявлено по одному центромерному диску, но эти диски, как правило, значительно тоньше, чем центромерные диски в политенных хромосомах видов рода Chironomus из цитокомплекса «thummi».

Научно-практическая ценность.

Описание кариотипов и хромосомного полиморфизма хирономид позволяет надежно идетифичировать виды и уточняет их ареалы.

Количественные данные о спектре и уровне хромосомного полиморфизма у видов рода Chironomus, представленные в диссертации, могут служить основой при проведении биомониторинга для оценки нарушений наследственного материала при загрязнении водоемов.

Результаты работы по анализу числа и хромосомной локализации точек инверсионных разрывов в кариофонде видов расширяют представления о роли хромосомных перестроек в дивергенции линейной организации геномов при видообразовании. Они используются в курсе лекций по клеточной биологии в Новосибирском государственном университете.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Реципрокные транслокации хромосомных плеч сопровождаются изменением локализации и частот инверсионных разрывов в хромосомах.

2. Географическая изоляция является важным фактором дивергенции последовательностей дисков политенных хромосом у видов рода Chironomus.

3. В центромерных храйонах политенных хромосом АЕ и BF у вида С. «dorsalis» диски «С», 19ef и 28 de обладают признаками центромер.

Личный вклад автора.

Автор самостоятельно собрал и зафиксировал личинок Chironomus из цито-комплексов «pseudothummi» и «thummi» в изученных природных популяциях Западной Сибири. Кроме того, им был обработан материал (готовые постоянные препараты политенных хромосом) по видам цитокомплекса «pseudothummi», накопленный ранее в лаборатории. Автор лично приготовил давленые препараты политенных хромосом из слюнных желез личинок изученных видов с окрашиванием ацет-орсеи-ном, С-дифференциальным окрашиванием и флуоресцентной in situ гибридизацией (FISH). Он лично участвовал в компьютерном анализе по оценке числа и локализации инверсионных точек разрывов и в построении филогенетических деревьев.

Апробация работы и публикации.

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 6 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ. Материалы диссертации были представлены на Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008), Международной конференции «Биоразнообразие, проблемы экологии Горного Алтая и сопредельных регионов: настоящее, прошлое, будущее» (Горно-Алтайск, 2008), Международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных «Карио-V» (Новосибирск, 2010), XVIII Международном симпозиуме по хирономидам (Trondheim, 2011), XIV съезде Русского энтомологического общества (Санкт-Петербург, 2012), отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН в 2009 и 2012 гг.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, со-

держащего 178 ссылок. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 72 рисунка и 17 таблиц.

Список публикаций по теме диссертации.

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Брошков А. Д., Мирошниченко Л. А., Кикнадзе И. И., Гусев В. Д. Локализация и частоты инверсионных разрывов в геномах видов Chironomus (Diptera, Chironomidae) // Вестник ВОГиС. - 2010. - Т. 14, Вып. 4. - С. 656-662.

2. Голыгина В. В., Кикнадзе И. И., Брошков А. Д., Карамышева Т. В., Рубцов Н. Б. Особенности строения центромерных районов политенных хромосом хирономид (Díptera, Chironomidae) // Вестник ВОГиС. - 2010. - Т. 14, Вып. 4. - С. 622-631.

3. Кикнадзе И. И., Брошков А. Д. Кариотип и хромосомный полиморфизм у хирономи-ды Chironomus melanescens Keyl, 1961 (Diptera, Chironomidae) // Евразиатский эн-томол. журн. - 2009. - Т. 8, Вып. 1. - С. 19-28.

4. Kiknadze 1.1., Golygina V. V., Broshkov A. D., Gunderina L. I., IstominaA. G. Mystery of Chironomus dorsalis Meigen karyotype (Diptera, Chironomidae) // Сотр. Cytogen. -2008.-V. 2, N. 1.-P. 21-35.

5. Брошков А. Д., Кикнадзе И. И., Истомина А. Г., Гундерина Л. И. Структура кариотипа хирономиды Chironomus uliginosus Keyl, 1960 (Diptera, Chironomidae) // Евразиатский энтомол. журн. - 2008. - Т. 7, Вып. 1. - С. 57-65.

6. Кикнадзе И. И., Брошков А. Д., Истомина А. Г., Гундерина Л. И., Валлендук X. Географическая изменчивость последовательностей дисков политенных хромосом комара-звонца Chironomus pseudothummi (Diptera, Chironomidae) // Цитология. - 2008. -Т. 50, Вып. 6. - С. 539-548.

Тезисы докладов конференций и съездов:

1. Брошков А. Д., Гундерина Л. И., Кикнадзе И. И. Дивергенция инверсионных последовательностей дисков политенных хромосом у видов рода Chironomus (Diptera, Chironomidae) из цитокомплекса «pseudothummi». Материалы XIV съезда Русского энтомологического общества. - СПб., 2012. - С. 143.

2. Golygina V. V., Broshkov A. D., Ermolaeva О. V., Kiknadze 1.1. Study of molecular and cytological structure of centromeric regions in Chironomidae. Proceedings of the XVIII International symposium on Chironomidae. - Trondheim, 2011. - P. 20.

3. Голыгина В. В., Ваулин 0. В., Гундери