Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация генома бактериофага Т4 в области генов 31 и rIII

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация генома бактериофага Т4 в области генов 31 и rIII"

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ЛИТОВСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

РАУДОНИКЕНЕ АУШРА АЛЬБЕРТО

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА БАКТЕРИОФАГА Т4 В ОБЛАСТИ ГЕНОВ 31 И rill

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени нандидата биологических наук

ВИЛЬНЮС - 1991

Работа выполнена в Лаборатории генной инженерии Института биохимии Литовское Академии Наук.

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Р.Г. НИВИНСКАС

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

В.И. ТАНЯШИН

- академик литовской АН, доктор химических наук, профессор 5.А. ВОДКА

и

Ведущая организация - Институт биохимии им. А.Н. Баха

Академии Наук СССР.

Защита диссертации состоится "17м декабря 1991 г. в 11 часов на заседании специализированного совета К 011.05.01 в Институте биохимии Литовской Академии Наук, 2600 Вильнюс, ул. Мокслининку, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии литовской АН.

Автореферат разослан ноября 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Г. ¡ЬоиСС-Б.Ф. ЗОВИТБ-ЕРАЖЕНЕНЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность теш.' Несмотря на то, что изучение организации генома бактериофага Т4 приближается к завершающей стадия, в со еще остаются отдельные яесэя^енированные и ненаЬщенные генами области фагового генома (Kutter et al., 1990). Одной из таких "ненасыщенных" областей генома фага Т4 является участок с генами 31 и ПЛ. Сравнительно недавно в литература появились данные о секвэзшровании некоторых генов из этой области - гена 31 (Hlvlnskas, Black,'1988) и гена cd (Maley et al., 1990). В то жэ время до ста пор не установлены точная локализация и первичная структура гэна г III фага Т4, г67-мутация которого, наряду с г-мутациямп генов rl и rll, сыграла существенную роль в изучении организации фагового генома (Streisinger et al., 1964; Hosig, 1968). При этом следует оа-атить, • что на генетической карте фага ген ПИ первоначально .был локализован перед геном 31 (Streisinger et al., 1964), а спустя некоторое время - за геном 31 (Revel, Llelauals, 19Т8).

Область генома с генам 31 и г III долгое время, но била секвенирована в связи с трудностями при клонировании (Mlleham et al., 1980; Нивинскас, 1988), возникшими, видимо, из-за локализации в ней невдентифицированш . генов, продукты которых губительно действуют на бактериальную клетку, или жэ из-за присутствия сильных ранних промотот~в фага. В опытах in vitro (Gram et al-., 1984) было показано, что в данной области генома фага Т4 локализованы даже четыре ранние • промоторы фага, а также и потенциальный терминатор транскрипци**, что свидетельствует о сложной организации этой области генома. Если структура и точная локализация промоторов РЕ134.4 и Рв131.7 были определены пои секвестровании генов alc (Kutter et al., 1984) и раеТ (Mldgley, Murray, 1985), то точная, локализация как ранних промоторов Ре128.6 и Ре128.2, так и терминатора транскрипции, локализованного за геном 31 в полонении 1^8,6 т.п.п. генетической карты фага, остается невыясненной. В связи с вышеизложенным выбор участка генома с генами 31 и гШ бактериофага Т4 в качестве объекта наших исследований представляется вп'чнэ обоснованным. Актуальность выбранного направления наших исследований обусловлена тем, что информация о структурной организации генов в указанной области генома фага Т4 необходима для

- г -

развития дальнейших завершавших исследований структурной и функциональной организации генома бактериофага Т4 в целом.

Работа выполнена в рамках Всесоюзной научно-технической программы 0.74.05 (Физико-хишческая биология) но теме Института биохимии Литовской АН "Изучить механизмы активации и направленной экспрессии генома" (I Госрегастрацш 01 87 0049912).

Цель и згазд исследования. Цель работы заключалась, в изучении структурной организации генома фага Т4 в области генов 31 и rill. Соответственно общему направлению работы бшш определены следующие конкретные задачи исследования:

1) провести клонирование и изучить экспрессию,'генов фага Т4, локализованных в области гена 31;

2) определить нуклеотвдную последовательность клонированного участка фаговой ДНК, выявить первичные структуры клонированных генов и потенцаапьшэ рэгуяяторныэ-элементы транскрипции;

3) показать, что один из секвевированных генов является геном ПП фага т4* _

4) определить характер и локашизацЕв мутаций г67, гШ? и ГЕ540 в последовательности гена г11Г.

Научная новизна работа Результата по клонированию, секвеннрованию и экспрессии, генов из участка генома с геном 31 фага Т4 имеют приоритетный характер. Впервые е&чй было проведено клонирование я определение Еуклаоитдной последовательности участка ДНК длиной в 2218 п.я., включая ранее установленную (Hivinskaa, Black.,. 198В) 65S нуклеотндаув последовательность с геном 31. При изучении структурной органнзавда данного участка ДНК фага 14, наряду с кодирующей белок последовательностью гена 31, выявлена первичные структура .пяти до сих пор генетически нэвдентЕфнщровашшх генов. Установлено» что мезду г. лани ей и 31 локализованы два небольших гена фага Т4 -гены ORF 31.2 и ORF 31.1, и, vm сашга, закошено секшнирова-ниэ довольно длинного участка ДйК перэд геном 31. Выявлено, что за геном 31 локализованы -ери других небольших гена фага Т4 -геш ORÍ 31.-1, ОВР 31.-2 и OK? 31.-3. Обнаружены довольно продолжительные нэтранслируешэ участки ДНК, в которых выявлзнн следующие влементы регуляции транскрипции: . средний (Рц), поздний (PL) и ранний (РЕ) промоторы фага Т4, а такта р-независвшй терминатор яранскршщии. Установлено, что мевду

ранними промоторами Pg128.6 и íj.128.2 локализован только один ген фага, а именно, ген ОШ? 31.-3.

Показано, что гон ОШ? 31.-1 является геном ПИ бактериофага Т4 и, таким образом, впервые игявлена первичная структура геиа rill и определена ого точная ¡локализация на генетической и рестриктазной карте фата. Определена локализация и характер мутаций г67, гВВЭ и rES40 в последовательности гена гИГ. На основании анализа продукта гена гГИ, выявленного на основе нуклеотидной последовательноети этого гена, выдвигается предположение о потенциальной возможности гидрофобного взаимодействия rIU-белка с мембранами.

Созданная представительная коллекция плазмид с зглонирован-ными генами фага Т4 из области генов 31 и rill„ а также данные об нх нуклеотидной последовательности предоставляют возможность приступить к детальному изучению эксщ-зссяи указанных генов. Представлены результаты начальник этапов такого рода исследован;®,' т.е. изучена экспрессия клонированных генов в двуплазмидной система РШ-полимвразы фага Т7.

Представленная в работе нуклэотидная последовательность ДНК зарегистрирована в банке данных Европейской Лаборатории Молекулярной Биологин (ЕМВЬ, Гэйдельберг, ФРГ) под следувдики номерами;, М23722, Х54536 и Х58544.

Практическое значение работы. Настоящая работа является частью фундаментальных исследований генома бактериофага Т4. В то же время .некоторые ее результата могут найти и практическое применение. В частности, сконструированные Наш рекомбинантные плазмиды могут .быть использованы суперпродуцнрования

продуктов генов 31 и rIXI фага Т4. -

Экспериментальные рез}льтаты и теоретические выводы, характеризующие структурно-функциональную организацию области генома с генами 31 и rill бскгери: Jara Т4, используются при чтении лекций по молекулярной генетике для студентов V курса Химического факультета Вильнюсского универскх'ета.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научных конференциях Общества генетиков и селекционеров Литвы (Вильеюс, 1988, 1989); на Международном сймпози"уэ "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1S89); . на Эвергринской мевдувародаой конференции по бактериофагу Г 4 (Олимпия, США, 1991).

Публикации. По тема диссертация опубликованы 3 статьи и тезисы 7 докладов.

Структура и объем работа. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов.Есследования и их обсуждения, выводов. Диссертация наткана на !$■О страницах машинописного тенета, вгшгаая список литерат'-щ из наименований, 8 таблиц и 28 рисунков.

шшшт И МЕТОДУ шхждовшж

Объект исследования фрагмент ДНК бактериофага Т4, содвркааща гены 3t и rill.

Материалы. Штамм Е. coli EBÍ01 (l'", hsäS20(r~, т^), recáis. G)"a-14, proáZ, lacY\, galB2, rpaI20 (SnR), zyl-5, mtl-1, avpE44, k~) служил в качества реципиента при конструиро! ваш® реконбинантных плазмид. Штамм Е. coll JM101 <supE, thi, h{lac-proAB), IP', traSáñ, proAB, laal^ZMi51) был использован при работе как с фаговыми ректорами ШЗшрШ.и М13mpí 1, ■гак и о шшзшдаыш векторам pTZtöR и pTZ19R (все фарш "Pharmacy"). Шташ Е, coll HMS174 {recAÍ, tisúR) с длаздадаш рТГ-5 и рРГ-6, как и Е. coli К38 {SJrÜK) ллавмвдоЗ pGP1-2 хюлучены or S. Tabor -(Медицинская шеола Гарвардского университета, США). Щташ Е. colt В40 (sut) получен от b.w. Black (Ийдацдаская школа Кэршювдского университета, <Ж), а-шчеш Б. coli S/6/5 (su-) - от W.B. Wood (Колорадский; университет,, СйЩ.

Бактериофаг T4D дикого тина и его щтати по гену rill (Т4гб7, ЗМ-гВВЭ a T4rES40) были получены от W.B. Wood и E.H. Kutter (Эвергринский государственный тапладя, США).

Фаговые векторы ШЗщрЮ. и М13гярП баш использованы для клонирования и секвэввровашш ДНК фата Т4. Елазшдя рТТ-5 и рТТ-б б: ж использована для клонирования к аксяраосии гаков фага Т4 в даугааЕшддой система ШХ-гашис-раан фага Т7, -а плаэмида pTZ18R н pTZ19R - для шгонировашш, евквзщравання к сайт-направленного мутагенеза tri vitro ДНК фага £4.

Методы. Выделение плазмадвой ДНК, рвшшкативной и одаоце-почечной ДНК фага М13, одноцвпочвчной ДНК плаздад оврин pTZ, выделение ДНК из фагов Т4, гидролиз ДНК рестриктазагш, достраивание укороченных 3'-концов деуадепочечноа ДНК, отщепление нуклеотидов с концов двухдепочечной ДНК с помощью нуклеазы

Бо!31, дефосфорилировашю ДНК, лигвровате фрагментов ДНК, сайт-направленный мутагенез in vitro, трансформацию и отбор ' трансформантов, а тага® электрофорез ДНК в агврозном геле и в денатурирущем тлиакриламидном гело главным образом проводили по методикам, описанным в работах Haniatia et а^. (1982) н Sambroolc et al. (1989).

Нуклеотиднуш последовательность ДНК определяли дадезокси-нуклеотидннм методом Sanger et al. (1977) с использованием в качестве иен ш как fa-35S3dATP, так и [a-33PldATP, руководствуясь методическими указаниями фирм "Рйагтас1ан и "flew England. Blolaba", и применяя фрагмент Нленова или кэ ыодийщя-рованнузо ДНК-поликеразу фага Т7 (Секвеназу).. Ашлифшсацшэ ДНК in vitro с помощью PCR проводили по методике Йа1К1 et al. (1983), а экспрессию фаговая генов в двуплазщдной системе РНК-голимеразы фага Т7 - по методике Tabor (1990). 'Электрофорез белков проводили в градиентном ПМГ (10-17,5:5 акриламида, 5-20% сахарозы) в присутствии 0,1 % SDS по Laemmll (1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клонирование и экспрессия генов из участка генома с геном 31 фага Т4

• Ранее при клонировании гена 31 было ' показано, что. он локализован в EcoRI-(BglII )-Pai 1-фагмэь-гв фаговой ДНК длиной в 1,9 т.п.н., перед Bglll сайтом (рис. 1), и в результате сэкво-нирова.з!Я 656 нуклэотидаой последовательности этого фрагмента бит выявлена кодирующая ' белок последовательность гена 31 длиной в 333 нуклеогада (Nivlni'sa, Black, 1988). Так как ген 31 занимает лишь незначительную часть ScoRI-PaiI-фрагмэнта, то казалось вероятным, что этот фрагмент пряду с геном 31 может содержать несколько до сих' пор неиденгифкцировашшх генов, выявлению которых и посвящена значительная част" нашей работа.

G целью клонирования и экспрессии генов из участка ДЦПС с геном 31 на первом' этапе работы нами бал проведен рестриктвзшй анализ EcoRI-PatI-фрагменга, вщепленного из состава фагового вектора 111 Зир10 (Шшнскас, Блэк, 19СЗ). В результате рестрик-тазного анализа бит выявлены участки действия для рестриктаз,' таких как Bglll, Hpal, -Ncol, ВзШ и некоторых других, которые

- б -

R. I! Pr128.6 Pr-128.2

Lr-> ^ Ь __

1 cd 131.21 эй |ГзП ГзРП Гзн! ,__зо ~~

• 130Л)' 123.0 ' 128.0 1 127.0 125?

EcoRI BglH PstI . EcoRI Bgill

1-:- 3.1-lib --—r;-1

I- 4.2-kb -1

i- 1.9-kb -1

0 . 1J) 2.0 kb -

Рис. 1. Локализация гена 31 на генетической карте- фага' Т4. Показано местоположение участков действия для рвстриктаа EcoRI, BgUI и Pail, а также локализация генов и промоторов фага Т4. Внизу представлен клонирований фрагмент ДНК длиной в 2218 п.н. и стратегия его секвэкирования.

делят ScoíU-PaíI-ípamdHT на отдельные субфрагменты, - что и послушло основой дая следящего этапа работы, т. а. конструирования рекомбинантных плазмид серии pRA (рас. 2).

В' качестве векторов для клонирования фрагментов фаговой ДНК использовали плаздада рТ7-5 .и рТ7-6, содержащие промотор фага Т7, локализованный непосредственно перед полялинкером плазмид (рис. 2). Сконструированные плазмида серии pRA. были введены в клетки Е. coll К38 (HfrCk), содержащие плазмиду pGP1-2 с геном РНК-нолшэразн фага 17 (ТаЪог, Hlchaxüson, 1985). Созданная таким образом двуплазмидная система (РШ-полшмераза фага 17/промотор фага Т7) позволила нам индуцировать транскрипцию с промотора фага Т7 ' рекомбинштных плазмид в условиях подавленной (при помощи рифампицнна) транскрипции генов клетки-хозяина, т.е. анализировать белковые продукты клонированных генов фага Т4.

В результате анализа фаговых белков • в системе РНН-полиыеразы фага Т7 было показано, что с EcoRI-BglII-фрагмента фаговой ДНК длиной в 1,03 т.п.н. индуцируется синтез трех небольших ПОЛШ18ПТИДОВ, и выявлено, что полипептид с мол. массой около 12 кДа является продуктом гена 31, а другие два полипеп-тидв с очень близкими мол. массами - около 9-10 кДа - представ-

- г -

iАрг

рТ7- 5

2400 Ър

Pirulí

010

pHindlII -PstX -Salí Xbal .BareHI

Smal Saol EooRI

PvuII

EcoRI Ucol Hpal

pT7-5

-<r>-£

-cj-t -rbt

Hpal BglII ч /

BstHI

PstI

1ШШ11

о. во

gene 31

0.43

.o.-SI-

0.47 0.40 ^

1.9-kb

1втшш&£

tezzzzrit

±ZZ2ZZZtí-

±=j

tí-

j— pra5-1

— pha5-3

— pRA5-21 -

— PRA5-12

— pRA5-22

pT7-6

PT7-5

PT7-6-

PRA5-22 Д 11

pRA6-2

j- pRA5-4I¡ - píU6-1

Рис. 2. схема конструирования рекомсинантшх плазмид серил рМ. Сверху изображены векторные илазмиды рТ7-5 и рТ7-б. Нгкэ показаны фрагменты ДНК фага Т4 в составе рекомбкнантннх плазмид; заштрихованная часть - ген 31, стрелкой доказано направление тоанскрипции. Справа указано обозначение соответствующей реком-Окнашлой плазмады.

лявт собой продукты двух новых генов фага Т4, локализованных перед геном 31. При этом наблюдаемый уровень экспрессии одного из них является очень низким (рис. 3). В случае ВзШ-РаИ-фрагмента длиной в 0,87 т.п.н. было показано, что в нем локализованы два небольшие геаа фага Т4, кодиругакэ полипептвды с очень близкими мол. масс а?,я - около 5 кДа (рис. 3).

- В -

1 2 '3 4-5-6 7 8 9

ii I I I I I i I

к Pa

215- m .

12.5- фтщ mi ■

Рис. 3. Электрофоретическоа разделение продуктов експрессиа генов фага Т4 в деуплазмвдвой системе, содорааарй пяазшду pGxl-2 и шшзмида: рНА5-21 (2), рЙА5-22 (3), рйА5-12 (4), рМ5-22Ш (5), pRA5-1 (6), pRAG-2 (Т), pRA5-4$i (8) и рТТ-5 (9); стандарты молекулярной кассы в кДа (1). "

I

Таким образом, голучешшэ на первом этапе нашей работы' данные гоказываит, что в ScoRl-PatI-фрагыенто наряду с геном 31 находятся еще 4 гена, два из которых локализованы перед геном 31 и два - sa ним. Поскольку из всех генов, обнаруженных в изучаемом фрагменте' ф£ эвой ДНК, раньше был секвенирован только ген 31, то задачей нашей работы на следувдеы втало явилось определение первичной структуры новых генов фага Т4, локализованных в области гена 31..

2. Определенна и анализ нуклеотидной последовательности участка ДНК с геном 31 фага Т4

■ 0 целью выявления первичной структуры клонированных ш генов было проведено ^реклонирование отдельных субфрагментов Есои-РаН-фрагмента длиной в 1,9 т.п.н. из рекоыбинантных плазмид серии рМ в фаговые векторы' Ml3mp10 и Ы13тр11 и секвевирование методом Sanger et al. (1977). Стратегия и протяженность секвенирования показаны на рис. 1. Нуклеотидная последовательность представлена на рис. 4. ,

Следует отметить, что для определения нуклеотидной последовательности ДНК за РзП-сайтом (от 1910 до 2218 нуклеотвда на рис. 4) соответствующий фрагмент фаговой ДНК был амплифицирован in vitro с помощью шщмеразной цепной реакции (PCR), используя

ДНК-полнмвразу Tag и пару 20-членных олигодезок рибонуклэоти-дов, синтезированных (в НПО "Фершатас") на основе опродоленной наш последовательности ДНК перед Есо721-сайтом (рис. 4) и на основе известной последовательности раннего простора фага 14 Ре12В.2 (Liehlg, .Rugar, 1939).

В результате изучения нуклэотидной последовательности длиной в 2218 п.н. било выявлено, ' что, кроме кодирующей белок последовательности гена 31, ниш секвенированный участок ДИК в направлении ранней транскрипции содержит пять полных открытых рамок считывания: дво перед геном 31, т.о. Ой? 31.2 и OIIF 31.1, и три за геном 31, т.е. OIT 31.-1, ОН? 31.-2 и 0Б7 31.-3, которые представляют собой новые до сих пор неидентЕфищфован-ные гены фага Т4. Анализ первичной структуры каздого из новых генов позволил нам установить размеры атнх геноЕ, определить их точную локализацию в клонированном вами участке ДНК (рис. 1 ), а такна, на основе' нуклеотидной последовательности этих генов,-вычислить молекулярные массы кодируемых.ими шшпаптидов.

Таким обр зом, нами установлено, что кодирующая белок последовательность гена ОН? 31.2 состоит из 234 п.н. и кодирует полипептид с мол. массой 9396 Да (pi = 10,83). Сразу за эмш геном следует кодирующая белок последовательность из 306 п.п., двтерм&ирупцая синтез полипепт: ;а, т.е. продукта гена QHF 31.1, с кол. массой 11463 Да (pl^ = 9,96). Нами был ресеквенирован и ген 31, кодирунмая белок последовательность которого состоит из 333 п.н., а мол. масса кодируемого полишптзда равна 12078 Да (pi = 5,92). За геном 31 локализованные гены ОН? 31.-1, ОН? 31.-2 и ОНР 31.-3 состоят из "Î4S, 174 и 33.0 п.н., которые кодирую полипептидц с мол. шссаш 9323 да (pi = 9,28), 6500 Да (pi = 12,17) И 12В92 Да (pi = 6,83) соответственно. Синтез всех упонянутых полипептидов инициируется на AUG-кодонв,. на расстоянии нескольких нуклеоти-дов от каздого инициирующего кодона обнаруживается регуляторшй сигнал трансляции - последовательность Шайна-Далгарно (SD). Кодирунцая белок последовательность всех генов завершается тершшруодим кодоном UAA, и только в случае гена 31 тАтаиниру-щим кодоном является UGA-триплет. Следует отметить, что при замене ATG-тршлета в положении 1596-1598 нуклеотид (рис. 4) на CCG-триплэт путем сайт-направленного мутагенез . in vitro наш было установлено, что именно этот ATG, а не ATG, обнаруживаемый

ЕсоШ SD 0HF 31 -2->

' GMTTCIGTGGTGMTAATGAAA'fîrCGTTTGGTAAAACTCACAGCMT'rAGTTCT HetIysPheAr¿LeuValLysLeiaixrAlaIleSerSer

57 TATTCTAACGAGAACATCÍCATTTGCTGTAGAGTATAAGAAATATTTTTTCTCTAAATGG TyrSerAsnGliUsnlleSerPteAlaValGluTyrLySLysTyrPhePheSerbysTrp

117 AAAGAGTATTATAAGAOAMTTGGGTTTGTAIIGAHAGACGATATAGTTGGAAATCTGAT I^sGlnryrTyrLysTlirAanTrpValCysIleAspAr^roTyrSerTi'pLysSerAsp

1 TT TTAGAAAMTGCOAAAAATTAGTTTCCACGCTTAAAGAACGTGGMCAACTCATATTAM leuGlul^sCysGlnLysLeuLeuSe:rtfrrl^ SD ORF 31 ■ 1 >

237 ACTGTAATAGGrAAATAMrGAMCrGACMCTGAGCAGAAAGrAGCAATrCGTGAAATT ïhrValIliGIyIiy3**«MetI^sLeuTMlxrGliiGlnIiysV'alAlaIleArgGluIle ■ Ncol

29T TTGAAMCÏAMTTCTCCATGGGTGTTTCAÀACGTAGTTTTTGAAMGTCÏGATGGTACT

35T ATTCGTACTATGAMGGTACTOGTGA'TGCAGACTTTATGCCAACCATGOAMCTGGCAAA IleArgTMàetbysGlyThrArgAspAlaAspPheMetProïhrMetGlhTttrGlyLyB

41T ïTGACTGAATCrACTCGGAMGMTCTACrGACATGATrCCAGTATTîGATGTTGAGCTT LeifllirGluSerTlirArgLysGluSei^lffAspMetlleProV'alPheAspValGlüLeu

477 GGTGCGTGGCGAGGTTTTTCTATTGACAAATTGATTTCCGTTAATGGTATGAAAGTTGAG GlyAlaTrpArgGlyPbeSerlleAspLypieuIleSerValAsnGlyMetLysValGlu

-CO TM -10

53T САТТТОСТТСМТТТАТТССТАМТШдаСЖгаААОААСТАТтаСТгАТЕАетААТТСА HisLeuLeuGlnîhelleGlyLys***

ff pal SD Gene 31-> amNG71

59T TCTGTTMÇAAAAAGGAAAAACGATGTOTGAAGTACAAOAGCTACCAATTCGTGGTGTC ~ MetSerGluValGlnGTHLeuProIleArgiilaVal

656 GGTGAATATGrTATTrTAGTTTCrGAACOTGCAOAAGOCGGTGATGAAGAAGTTACAGAA GlyGluTyrVallleLeuValSerGluProAlaGlnAlaGlyAspGluGluValThrGlu

716 TCAGGACmmTCGGTAAACGTGTTCAAGGTGAAGTrCCTGAACTGTGTGTAGTTCAC SerGlyLeuIleIleGlybysArgValGlnGlyGluValProGluIeuCy3yalValHls

776 TCTGSCGGTCGTGATGTTCCTGAAGGTTrCTGCGAAGTTGGTGATTTGACrrCTCTTCCA SörValGlyProAspValProGluGlyPüeCyaGluValGlyA3pLeuIlirSerLeuPro Asnll am№4

836 GTIGGTCAAATTCGAAATGTTCCGCATCCTTTTGTAGCTCTGGGTCTTAAGCAvGCAAAA ValGlyGlnlle^IsnValProHlsProPheValAlaLeuGlyLeuLysüIriProLys

896 GAAATTAAACAAAAATTCGTTACCTGTCACTÄrAAAGCTATTCCGTGTCTTTATAACTGA GluIleLysGlalysPheValTlirCysHlsTyrLysAlalleProCysXeuTyrLys**«'

PI " ffpal

956 тагАМТМТМТАТСМТТСССТСТСаОААТМТМШААСССААСААТТСТАТСТСО

101 б TAGTCTACAACTGAGAGÄTCTGTCGAAAGAAGATGAAATTCAGAAGAACGTGACTACCGA

SD OR? 31.-1 (ШГ) >

1076 GTTTTAATCTCTAACGAG/iATï'TTTAAATGATTAAACAATTACAACACGCTCTÏGAACTG 1 гВБ9 _ T д^д fJetlleLyEGlnbeuainHl3AlaLeuGluIeu

1136 GAACGAAACGCATGGAATAA'IGGUCACGiAAACTAfGeCGCATCTAffGATGTTGAAGCG 12 GlriArgAsnÄISTfpADr^snGlyiüsGluAsnTyrGlyAlaSerlleAspValGluAla »*« = гВЬЗ G = гбТ

1196 GAAGCrCÏTGAAATCCTGCGTTATTTCAAACATOTGAATCCTGCTCAAACTGCATTAGCT 32 GluAlaIeuGluIleLeuAr^yî'PlieLysHïsLC'iiAsnProAlaGlriTiirAlaI.euAla G = TES40 Arg = гбТ 1256 GCTGAGCTÏCAGGAAAAAGATGAACTTAAATAÏGCTAAGCCTCTGGCTTCTGCTGCACGA ■ 52 AlaGluLeuGlnGliÄ^AspGlixLeiüLysTyrAlaLysProLeuAlaSerAlaAlaArg

G = TES40.

1316 AAAGCAG'MCGTCACmGTGGTAACAGTGAAGTAATTÏATTGGAGAT'rCACTGCCTTAG T2 LyaAlaValAr^llaPheValValThrleuIyo***

Glu = r2S40

1376 TGTGAGOTAAATCGAGGAGCCGTCGAACTGTCTGATTAATGAITTGOGAATCATTATAGT

1436 TTTMGACCCCGACAGTTTTACGGTGTACGTCTTGAATGTGAATGATGACGGGTTTATGG Bat NI

1496 TTATÇÇTGGTCGTTAAATATCCAAAAACCTATGTICCCCTTGAGGGCTTGCGCAGGCAAT

SD ORF 31.-2 >

1556 GCCMrnGTCCTGCATTTTCArTTAAMGAGAATTTATAArGGCAAAACAAGCTAAA

MetAlaLysGlnAlaLys

1614 GCAMGAMGCAGÏTGAAAAGAMGTTGGÎGATTCTAAACGCGCTGGCTACAAGCGTGGG AlabysLysAlaValGlubysbysyalGlyAspSerlysArgAlaGlyTyrbyaArgGly

Ее, ol ZI

1674 ÏCGAAGTCTCGTATCAATCAAACTGTIGAGAAGATCATGCGCCGAGCACGTGCGGÛTGTT SepAsnSerArgIleAsnGlnTlirValGluLysIleIíetArgArgAlaAr|AlaYalLeu

1734 CGAGATGATGCTTCTCGTTTTGGTAAGCAGAAAGCATAAGTTGAGGACTCCTrCGGGAGT

ArgAspAspAlaSerArgPheGlyLysGlnLysAla*** --► «-

4 -35 Pgt28.6 _10

1794 CCTTTTTTATTTTCCAAAGATTGCACAAAGTTGTmCAGTATAGTTCCTTTGTGAI&GT

--SD ORF 31.-3 > ра{1

1854 AmTCmCACAMCAMSMIMTAAMTGMAACGATTAATCTGAACGGTGÇAGra

MetLysThrlleAsnLeuAsnAlaAia/al

1913 AAAACTAAATGGTTGAATGGFAAATATGATGAAAGTATGTGGTTCTTAATGGGAGTTGAA LysThrLysCyaPheAsnGlyLysTyrAapGim'hriietí'rpPheleuMetAlaV'alGlu

1973 GGTGATArTATTGAAGTAGAAACAACAGAAGGTATGGGAACAGATTTCACCÏTTACAATT GlyAspIlelleGluValGluThrThrGluGlyMetGlyThrAspPheThrPheThrlle

2033 CAAGTTCATAATTTCTMACTGGTTGGATTTATGAATTGAATACAGTAATCGTTGGAAAA GlnValHlsAarffhePheThrtlyTrpIleTyrGlubeuAsnTlirVallleValGlyLya

2093 ATTGAAOAAAATGAATTAGGCGAATGGCATTATGTTACAGCTCGCCAACGTGCAGAACGC IleGluGlnAsnGlubeuGlyGluIrpHlsTyrValThrAlaArgGlnArgAlaGluArg

2153 TTAATTGAGAAGATGAAAAAAGTTGGTAAACTÎGACATGCAGCATTGGAAAGTAGTAAAA beurieGluI^sMetl^sIyaValGlybysbeuáspMetGlnHísTrpbysValValLya

2213 TAATTG ***

Рис. 4. Нуклеотидаая последовательность участка ДНК, содержащего renn 31 и rill бактериофага Т4.

но расстоянии 4ü нуклеогадов перэд ним (нуклеотида 1554-1556 на рис. 4), являйся инициирующим кодоноа гена ОКР 31.-2. Что касается гена ORF 31 .-3, то клонировать (и экспрэссировать) этот ген удалось только в случае удаления сильного раннего промотора РБ128.б, локализованного перед stsm геном. •

Регуляция экспрессии генов изучаемого наш участка генома In vivo, по-видимому, является довольно сложной, так как в нем обнаруживаются продолжительные .. экгеняне области, содержащие специфические последовательности промоторов всех трех типов, присуща фагу Т4 - среднего С Р?,) промотора перед геном 31, позднего (Р^) проыотора непосредственно за геном 31, а также и раннего (РЕ128.6) промотора мэад генами ORF 31.-2 и ОКР 31.-3 (рие. 4). Кроме того, участок ДНК за геном ORF 31,-2 имеет структуру (1128.6 на рис. 4), типичную для р-незашсшых тершшаторов транскрипции (Rosenberg, Court, 1979; Brendel et al., 1986), а именно: протяженные инвертированные повторы форшруют шпильку в мРНК, за которой следует сегмент олиго-U. Вычисленное значение свободной ьлергии AG - -60,7 кДж/ьюль указываэт на высокую стабильность этой вторичной структуры MPIIK. Обращает на ^ебя внимание • тот факт, что петля обнаруженной шшлыш состоит из нуклеотидаой последовательности UUSG, которая, как било показано (Tuerk et al., 1988), придает необычайно высокую стабильность шпилькам, имеющим структуру (X^CmJCGGflOg^.

Следует такие отметить, что к моменту окончания работы появились публикации других авторов (Keppel et al., 1990; Haley et al., 1990; Prlllpov et al., 1990) по секвенированиа фрагментов дше фага 14, в некоторой шре перекрывающихся с наш секво-шрованннм фрагые^ jom; обнаруженные различия детально обсуждаются в диссертационной работе.

3.* Идентификация гена rill бактериофага Т4 и локализация мутаций гбТ, гВВ9 и rES40

Ваюшчительшй этап нашей работы ' посвящен тещ rIL бактериофага Т4. Учитывая результаты картирования (Eeval LlelauBla, 1978), а такае гфвдположэние, что ПП район дол&Э] быть небольшим генетическим сегментом (Edgar et al., 1962), к поставили перед собой задачу определить, который из трв

небольших генов, локализованных за геном 31, т.е. рчр 31.-1, ОКР 31.-2 или ОКР 31.-3, является геном г11Г. О этой целью ш рэсеквенировалн все три гена, используя ДНК из мутаятного по гену гГЛ фь.'а Т4гбТ. Результата рвсогазэнирования показали, что единственное изменение, по сравнешв с изначально пеня секввни-рованпой ДНК, обнаруживается в кодирущоЗ белок последоввтель-• ности гена ОКР 31.-1. Тан, в случае ДШ из мутанта rS7 в кодонэ для 42-ого аминокислотного остатка произошла транзшщя А -> G (CAI->CGT), что в результате приводят к замене Н1з-42 на Arg-<(2 (ряс. 4). На основе того факта, что мутация rG7 изменяет пэрвичнуа структуру только гена 0RP 31 .-1, било сделано ьрэдполоЕание, что ОКР 31.-1 является геном гХГГ. Это прэдоолопениэ получило подтверждение з дальнейших опытах, в которых было показано, что перенос этой мутации (путей psKOKöi. :ации) нз соотвэтствущэй плазмады в геном фагэ T4D явного типа приводит -к появлению г-Фэдотапа.

Кроме г67~мутаций в последовательности гона ПИ била локализованы а две другие г-нутации этого гена: гВВ9 и гЕ340. líanra результаты показывает;, что rES40 мутация в гене rill представляет собой транзицию А -> G в 82-ом кодонэ атого гена (á&G -> GAG), в результате чего в продукте гена rill на место Ьуз-82 становится Glu~82. Было также показано, что мутант гЕЗ-Ю Ш90Т и , .ругув мутации - траязицшз А -> G в кодеке для 57-ого аминокислотного остатка - AAA -> AAG. данйом случа- замены аминокислоты (Ьуз) еэ происходит (рис. 4). В случае ыутанта. гВВ9 бала обнаружена трансверсия А -> Т в 15 кодоне гена rUI, т.е. GGA -> GGT. Эта задана А на Т в третьем положении кодона нэ шшводит к земзяз аминокислоты (Ala). Однако в случае этого мутанта била обнаружена и транзиты G -> А в 16 кодонэ, т.е. EGG -> TQА, что приводит к появлении опал(нонсепс)-кодона и тершнацка продукта гепа ПГГ па 16-ой 'аминокислоте (рис. 4).

Итак, полученные данные убедительно показывают, что ген ОН? 31.-1 является ' геном rill бактериофага Т4. Результаты, полученные при анализе экспрессии гена rill в двуплазмидней системе FHK-полиыеразы фага Т7, используя дополнительно сконструированные рекомбинантнне плазмида серии pRA, позв. .шли предположить, что формирование шпилечных структур в 5*-фланкирующей области гена rill (рис. 4) влияет на уровень экспрессии этого гена.

В данной работе приводится характеристика бедка гена rill. Последоваа.льность гена ПП кодирует полшептид с мол. массой 9,3 кДа, начисленная изоэлектрнческая точка pl = 9,23. Анализ аминокислотного состава показал, что основными структурными компонентами rIII-б лка является гидрофобные ■ аминокислоты. Компьютерный анализ Сежа гена гИГ позволил выявить наличие тсокогидрофобного сегмента в С-ковдевой части rlll-белка, что, видимо, указывает на потенциальную способность этого Сежа связываться с мембранами. Интересным представляется то, что обе иутацш (г67 н гЕ340) в гевэ гИГ приводят к замене положительно заряконннх аминокислотных остатков,, вследствие чего изменяется pl полшептида, т.е. pl = 9,83 в случае мутанта ГШ и pl = 7,00 - для мутанта г!340. Теоретически вычисленная вторичная структура гШ-бэлка указывает на ' преобладание конформации а-схшрали, которая составляет 66% • по сравнению с p-структурами, т.е. 16% ß-скяадчатого листа и 182 ß-поворотов (рзю. Б). Шявлено, .что мутации г57 и' rES40 не приводят к изменена» вторично? структуры селка гена rill.

59 ' б<? 89

т

г££40

Рис. 5. Схематическое изображение теоретически вычисленной вторичной структуры белка гена rj.ll'. (лад-! - а-снираль, (ллд) - ^..-складчатый лист, - ß-поворот. Указана локализация

мутаций гбТ к ГЕ340. Шчислэние проводилось по методу Chou, Fasman (19Т8).

Сравн кие ашнокислотшй последовательности белка гена ПП с ашнокислотвнш последовательностями, находящимися в базе данных белковых структур GenPept версия 64.3 (США), не выбило белков, проявляющих более или менее выраженную взаимную гомологию с продуктом гена rill.

B-ff В О Д Ы

1. При изучении экспрессии клонированию, генов фага Т4 в двуплазмядне.! системе РНК-полимвразн фага Т7 показано, что в EcoKL-Fstl-фрагменте днк длиной в 1,9 т.п.н. наряду с геном 31 локализованы ошв 4 гена, продукта1® которых являются полипэпти-да с кол. пассат около 10 и 6 кДа.

2. Определена нуклэотидная последовательность фрагмента ДШС фага Т4 длиной.в 2218 п.н. Выявлены первичные структура пяти до сих пор генетически неидентафщированвых генов, располоаэнных в участке с геном 31 в последовательности ORF ¿1.2, ORF 31.1, ГОН 31, OR? 31.-1, OR? 31.-2 И OR? 31.-3, которые состоят из 234 , 306, 333 , 246, 174 и 330 П.н. и кодируют полипептнды с мол. массами 9,4, 11,5, 12,1, 9,3, 6,5 и 12,9 iwi соответственно.

■ 3. Выявлено, что меягвнныэ области в секвенгрованном участке ДНК содержат средний (Ры) промотор фага перед геном 31, поздний (PL) промотор между генами 31 и ORF 31.-1, ранний (РЕ) промотор и р-независишй теряшатор транскрипции между генами ORF-31.-2 и ОНР 31.-3, причем ген OR? 31.-3 распологен между двумя ранними промоторами (Pg128.6 и Pg128.2) фага Т4.

4. Показано, что ген ORF 31 -1 является геном rlII бактериофага Т4, Установлен характер и локализация мутаций гб7, гВВЭ и rES40 в нуклеотидаой последовь.альности гена г11Г. В теоретически вычисленной вторичной структуре гГП-белка ггое-обладает конформация а-спирали (66%). Нутации г67 и rES40, приводящие к замене положительно заряженных аминокислотных остатков, не приводят к изменению вторичной структуры белка гена гШ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Раудоникенэ к., Нивинскас Р. Клонирование гена 31 фага Т4 в плазмядных векторах // Проблем экологического мониторинга и генетические аспекты орнитофауны и других организмов: Тез. конф. - Вильнюс, 1988. - С. 175-176.

2. Нивинскас P.P., Раудонлкене A.A., Гилд Н. Новый ранний ген перед средним геном 31 бактериофага Т4 // Ноле' •'лярная биология. - 1989. - Т. 23. Л 3. - С. 739-749.

3. Раудоникенэ А., Нивинскас Р.. Изучение экспрессии генов области Гьна 31 бактериофага 14 // Состояние и перспективы развития генетики и селекции в Литве: Тез. конф. - Вильнюс, 1939. - С. 9.

4. НаийопШеп' A.À., Nlvlnskas R.H. Cloning and expression oï bacteriophage T4 gene 31 region // Molecular Organization of Blolpgical Structures / Abstracts of International Symposium. - Moscow, 1989. - Book: I. - P. 8T.

Б. Raudoniklene A., Hivlnskaa K. Nucleotide sequence or bacteriophage T4 gene 31 region // Hucleic Acida Res. - 1990. -7. 18. Mi 14. - P. 4280.

6. Раудошпсене А.Д., Нивинскас Р.Г. Подтверждение наличия терминатора транскрипции в участке ДНК за rewM 31 бактериофага Т4 // Виооргашческая химия. - 1990. - Т. 16. Jê 8. -

С. 1141-1144.

7. Раудоникене А., Нивинскас Р. Первичные структуры двух новых генов перед геном 31 бчктериофагй Т4 // Молекулярные механизмы генетических процессов / VII Всесоюзный симпозиум: Тез. докл. - Москва, 1990. - С. 261-262. •

8. Раудоник ie А., Нивинскас Р. Клонирование, экспрессия и первичные структуры двух новых генов перед геном 31 бактериофага Т4 // Experimentine blologija (Экспериментальная биология, Вильнюс). - 1990. - & 2. - С. '137.

9. Raudonlklene А., Nlvlnsks3 R. Identirication or tlia гШ gene or bacteriophage 14 // Abstracts or Evergreen International Bacteriophage T4 Meeting. - Olympia, WA, August 1-6, 1991. ~ P. 3T.

■ 10. Nlvinskas R., Za^anckauskalte A., Vitenlene I., Raudonlkiens a. The complete nucleotide sequence between genes 31 and 30 oi bacteriophage T4 // Abstracts or Evergreen International Bacteriophage Ï4 Meeting. - Olympia, WA, August 1-6, 1991. - P. 69. .

OvV UxC-wi. ■