Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура нуклеиновых кислот и нуклеиново-белковые взаимодействия в вирусных частицах

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Структура нуклеиновых кислот и нуклеиново-белковые взаимодействия в вирусных частицах"

/?го

■МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ДОБРОВ Евгений Николаевич

СТРУКТУРА НУКЛЕИНОВЫХ кислот И НУКЛЕИНОВО-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦАХ

03.00.06 — вирусология

Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва — 1989

Работа выполнена в Межфакультетскоп проблемной научно-исследовательской Лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им. А. Н. Белозерского, МГУ

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент АН СССР, доктор химических наук, профессор А. А. Богданов

доктор медицинских паук А. Д. АльтштеГш

доктор биологических паук Г. Б. Завнльгельгкий

Ведущая организация: Институт Химической физики АН СССР

Защита диссертации состоится « » 1989 г. в.....часов

па заседании Специализированного Совета Д 053.05.70 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: Москва, 119899, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С материалами диссертации можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разос

1989 г.

Ученым секретарь Специализированного Совета кандидат химических наук

(В. Н. КАГРАМАНОВ)

/

ертации

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ Актуальность проблемы. Изучение структуры и функционирова-

ния молекул вирусных нуклеиновых кислот является одной из основных проблем современной молекулярной вирусологии. К настоящему времени достигнуты значительные успехи в расшифровке первичной структуры РШ и ДНК различного, в том числе и вирусного происхождения, в изучении процессов репликации, рекомбинации и экспрессии нуклеиновых кислот, их вторичной и третичной структуры в растворе. A priori ясно однакй, что структура свободных молекул нуклеиновых кислот в растворе вовсе не обязательно должна совпадать с их структурой в составе биологических объектов и, в частности, вирусных частиц. Столь ае очевидно, что глубокое понимание механиз-. нов функционирования молекул нуклеиновых кислот в составе биологических объектов вряд ли возможно без знания структуры ДНК и РНК именно в составе таких объектов. Относительная простота структуры делает вирусные частицы весьма удобным объектом для изучения этой проблемы.

Сегодня ухсе можно считать очевидным, что одним из свойств молекул нуклеиновых кислот, наиболее важных для функционирования, является способность к более или менее специфическим взаимодействиям с белками, выполняющими ферментативные, регуляторные, структурные и другие функции. Поэтому проблема н>клеиново-белковых взаимодействий, и в частности, нуклеиново-белкового узнавания, на протяжении вот уае нескольким десятилетий приковывает к себе большое внимание. В решении этой проблемы достигнуты определенные успехи, но основные принципы, лежащие в основе такого узна-вания« остаются до сих пор неизвестными.С этой точки зрения вирусы такле представляются весьма удобным объектом исследования, ;поскользу в основа структуры частиц подавляющего большинства ся-

■ русов лежит нуклеопротеидное япро. В случае вирусных частиц, вероятно, можно сказать, что обе указанные проблемы (проблема особенностей структуры ДНК и РНК in Situ и проблема нуклеиново-белко-вых взаимодействий) в какой-то мере перекрываются, поскольку именно взаимодействия с белком могут являться одним из основных факторов, способных изменить структуру нуклеиновых кислот in situ по сравнению с их структурой в растворе, в свободном состоянии.

Основной целью данной работы являлось исследование особенное-' тей структуры нуклеиновых кислот и природы нуклеиново-белковьк взаимодействий в частицах вирусов двух резко отличающихся групп -в сравнительно крупных сферических бактериофагах, содержащих двуце-почечную ДНК (дцЦНК) и в вирусах растений со спиральной симметрией, содержащих однодепочечную РНК

В случае бактериофагов, в вирионах которых ДНК составляет значительную часть массы (около 40%), а белковый компонент представлен значительным числом индивидуальных белков, основной задачей являлось обнаружение различий в свойствах (спектральных характеристиках, способности к модификации различными химическими агентами и пр.) свободных и внутрифаговых ДНК и определение природы факторов, обуславливающих эти различия. В случае спиральных вирусов растений, вирионы которых характеризуются низким содержанием РНК (5-6%) и наличием всего одного типа белковых молекул, основной задачей являлось изучение характера и механизмов воздействия белковой оболочки вириона на внутри вирусную РЩ и процессов РНК-белкового узнавания в ходе самосборки вирусных частиц.

Научная новизна работы. В работе впервые обнаружено, что ' молекулы дцЦНК в частицах "крупных" и "средних" фагов по целому ряду свойств отличаются от соответствующих свободных молекул ДНК,• находящихся в растворе. дцЦНК р составе фаговых частиц ойлацаит

спектром поглощения в зоне 250-290 ни, отличным от спектра свооои-ных нативных ДНК. Эти отличия сводятся к увеличению поглощения нь. 10-25%, отличному" по своим характеристикам, от изменений, наблюдаемых при денатурации ДНК в растворе. При разрушении фаговых частиц теп или иным способом наблюдается восстановление "нормального" спектра поглощения, характерного для нативной ДНК в растворе. Вну~ трифаговые ДНК характеризуются также специфической дисперсией оптического вращения и спектрами кругового дихроизма (КД), отличными от таковых для свободных ДНК (как нативных, так и денатурированных), причем наблюдается корреляция между особенностями спектров поглощения и спектров ДЦ для дшпЛЙ внутрифаговой ДНК.

Показано также, что внутрифаговые ДНК всех исследованных фагов характеризуются повышенной устойчивостью к термической денатурации в среде с формальдегидом по сравнению со свободным ДШ. Одновременно с этим формальдегид оказался способным вызывать етру^ ктурные перестройки ео Енутрифаговых ДШ при температурах значительно более низких, чем те, которые вызывают денатурацию. Не обнаружено никаких различий в характере реакции внутрифаговых и свободных ДНК с диметилсульфатом - агентом, чувствительны! к нарушениям нативнсй вторичной структуры дцДНК и к экранировке функциональных групп оснований белками. Показано также, что внутри-фаговые ДНК существенно отличаются от свободных по характеру воздействия моновалентиых катионов и Мд*на спектры КД.

На основании полученных данных делается вывод, что молекулы дцДШ в частицах бактериофагов находятся в особом структурном Состоянии, характеризующемся некоторые изменением параметров двойной спирали, индуцированным пло1ной упаковкой ЩИ ь. составе вирионов и/или суперспнрализецей внутрифаговой ДНК.

При изучении свойств молекул РНК в составе частиц нираль-

ньтс вирусов обнаружено, что все исследованные РНК нахоцятся In $ltu в состоянии с высоким гиперхромизмом и характеризуются специфическими спектрами дисперсии оптического вращения (ДОВ) и КД, резко отличающимися друг1 от друга и от спектров свободных РШ.

Опытами с использованием "гибридных" вирусов, содержащих РНК одного вируса и белов другого, показано, что характер оптической активности внутривирусньх РНК целиком определяется природой белкового компонента, т.е. характер взаимодействий с белком оболочки полностью.определяет структуру РНК в частицах спиральных вирусов.

Показана возможность образования прочных (скорее всего ко-валентных) сшивок ыеззду белком оболочки и РШ при УФ-облучении вируса табачной мозаики (BIU). Обнаружено, что при УФ-облучении ВТМ наряду с РНК-белковыми сшивками накапливаются и разрывы поли-нуклеотидной цепи внутривирусной РШ. Разработан метод определения числа разрывов и сшивок во внутривирусной РШ и о помощью этого метода определены величины квантовых выходов РНК-белковых сшивок и разрывов цепи РШ при УФ-облучении ВТМ. Из. УФ-облученного вируса выделены прочно сшитые РНК-белковуе комплексы и определена природа участка полипептидной цепи белка оболочки ЕГМ, подвергающегося сшиванию с РШ.

Разработан метод определения длины участка инициации реконструкции (0а) в молекуле РШ ЕГМ по величине мишени при УФ-инактивации способности РШ НШ к самосборке с белком рболочки. Полученная с помощью этого метода оценка сверху длины 0а составляет 76-114 нуклеотидов.

Предложена модель механизма самосборки частиц BIM in vitro, основанная на предположении о временном и пространственном ptfe- • делении процесса дислокации двуслойного Гдилиндричёбкога диска ■

субъединиц белка во фрагмент вирусной спирали и процесса структурных перестроек в белковых субъединицах на малых радиусах.

Практическая ценность работы. Полученные в работе результаты способствуют более глубокому пониманию основных принципов струп-турной организации и сборки вирусных частиц и тем самым могут способствовать разработке эффективных методов борьбы с вирусными инфекциями. УФ-облучение и обработка формальдегидом широко применяются для получения убитых противовирусных вакцин, и изучение механизмов инактивируйщего действия этих агентов на вирусы, предпринятое в данной работе, окалется полезным для более эффективного использования этих агентов. Разработанные методы определения числа нуклеиново-белковых сшивок и разрывов в РНК и оценки длины участка нуклеиновой кислоты, узнаваемого белком, могут бить использованы и при исследовании других нуклеопротеидных систем.

Апробация работы. Материалы работы были доложены и обсулдены на Симпозиуме по молекулярной природе вирусов (Ин-т Молекулярной биологии, Москва, 1965 ), П Международном Биофизическом Конгрессе (Вена, 1966), IX Международном Микробиологическом Конгрессе (Носква, 1966), Ш Конференции ФЕЮ (Москва, 1934), I Всесоюзном Биофизическом Съезде (Москва, 1982), научных конференциях Ме^фахультетскоЯ лаборатории Биоорганической Химии (Москва, 1970, 1974), международных и всесоюзных симпозиумах по вирусологии, организованных Институтом вирусологии АМН СССР (Москва, 1969, 1971), Всесоюзных конференциях "Вирусы микроорганизмов и расте-Ш'.й" (Пуч-.шо, 1981, Тагпент, 1966) иди.

ЧАСТЬ I. СВОЙСТВА ,Ц11К В МГ'ОШХ ЧАСТИЦАХ

1.1.-Особенности спектров поглоиенпд |»цут(л»Т<и'йььх ДЩ Объектом исолэдосания в первой части данной работ); ¡шились

6.

■ несколько бактериофагов,содержащих двуцепочечную ДНК (дцДНК).В состав головки бактериофагов и хвостового отростка ёходит большое число молекул целого ряда белков, тогда как фаговая ДНК представлена всего одной молекулой. Тем не менее, по весу ДШ составляет весьма значительную часть фагового корпускула (около 40%). Ясно, что особенности внутрифаговых. ДКК (если таковые имеются) могут существовать только до тех пор, пока существуют фаговые частицы, и поэтому для изучения структуры внутривирусных нуклеиновых кислот необходимо использовать недеструктивные методы. Оптические методы естественным образом отвечает этому требованию, и поэтому исследование свойств дцДНК в составе фаговых частиц было начато наыи со'сравнения спектров поглощения свободных и внутрифаговых ДНК (вфЦНК).

К моменту начала этой работы было уже хорошо известно, что денатурационные изменения в свободных дцДНК приводят к увеличение поглощения в зоне 240-290 нм. В этой области величины коэффициентов поглощения нуклеиновых кислот значительно превосходят аналогичные величины для белков, и поэтому при почти равном процентном содержании ДНК.и белка в фаговых частицах вклад последнего в поглощение в этой области оказывается весьма незначительным. Сравнение' спектров поглощения свободных и внутрифаговых ДНК существенно осложняется однако наличием у фаговых частиц (как и у вирионов большинства других вирусов) способности к светорассеянию.

Наличие светорассеяния существенно искажает измеряемые спектры поглощения фаговых суспензий, вызывая увеличение величин оптической плотности по сравнению с истинным поглощением фаговых частиц. При■разрушении вирионов и переходе ДНК в раствор вклад рассеяния в измеряемую оптическую плотность обычно сильно иэие- • няется. Для учета вклада рассеяния применяли метод экстраполяции,-

сущность которого сводится к проведению измерений оптической плотности в области, где компоненты системы (в нашем случае ДНК и белки) уже не обладают собственным поглощением ( Ь > 310 нм), и экстраполяции этих величин оптической плотности, обусловленной рассеянном, в двойной логарифмической шкале на интересующую нас область (240290 нм). Мы использовали метод экстраполяции для сравнения величин поглощения суспензий цельных фагов (когда ДНК находится в составе фаговых частиц) и разрушенных фагов (когда ДНК переходят в раствор). Для разрушения фагов мы использовали целый ряд разных методов, но особенно широко применялся метод "плавления" фагоЕых суспензий, получивший свое название по аналогии с плавлением препаратов свободной ДНК. Суспензии фагов прогревали при последовательно повышающихся температурах и в разных температурных точках измеряли величины истинного поглощения в области 260-290 (или 240290) нм. Параллельно проводились измерения еязкости фаговьзс суспензий для определения температуры разрушения фагоЕых частиц.

Результаты опытов по плавлению препаратов одного из исследовавшихся фагов - фага С^ представлены на рис. 1А. На этом рисунке представлен характер изменений величины истинного .поглощения при 260 нм (Е250) с повышением температуры. Видно, что в ходе прогрева фага величина £¡253 сперва нэ изменяется, а затем, при тем-.пературах, соответствующих приросту вязкости (т.е. разрушению фаговых частиц) происходит умзньшение величины Ь^бО пР15мерно на 10%. При дальнейшем прогреве какое-то Еремя величина Е^д не меняется, а затем происходит термическая денатурация ДНК, не отличающаяся от денатурации препаратов свободных ДНК. Таким образом, термическое разрушение частиц фага Сд сопровождается уменьшением их истинного поглощения при 260 нм на Как видно из •таблицы I, поглощение изменяется не только при 260 нм, ричем при

ё.

5:70-290 нм это падение поглощения имеет в процентном отношении даже большую величину (ниже, на рис. 2Б приведены разностные спектры • поглощения цельного и разрушенного фага Сд). Такая зависимость величины гиперхромиэма от длины волны отличает внутркфаговую ДЩ (вфЦНК) от обычных частично-денатурированных ДНК.

Таблица I. Гиперхромиэм внутрифаговой ДШ фага С

260 нм 270 нм 280 нм 290 нм

1. Поглощение разрушенного фага С в % к цельному

фагу 90,0 65,5 ' 78,5

2. Гиперхромиэм внутрифаговой ДНК в % к свободной

Сд ДШ 111,0 117,0 127,5

3. Гиперхромиэм при термической денатурации свободной Сд ДНК 139,0 143,0 140,0

74,0 135,0 140,0

Такое же по величине падение поглощения в зоне 260-290 нм мы наблюдали и при разрушении частиц фага Сд любыми другими способами, не вызывающими денатурации ДШ или сильной агрегации белка.

Падение поглощения в зоне 260-290 нм при разрушении вирионов отнюдь не являлось привилегией фага Сд. Уже в первых работах было обнаружено, что аналогичное изменение поглощений имеет место и при разрушении фага Т2. Позднее на протяжении ряда лет нами и многими другими авторами был исследован в этом отношении целый ряд фагов, содёрлшщих ццЦШ, и падение поглощения при разрушении было обнаружено у всех этих фагов.' Конкретные величины этого пацония' у разных фагов несколько отличалисв (крпйтшк примерами такого

Рис. I. Кривые "плавления фага Сд в и в ЗБС + 1,555 КСНО (В),

-о— истинное поглощение суспензии фага при 260 нм; ■ -о— поглощение препарата ДШ Сд при 260 нм;

-Д— относительная еязкость препарата фага

■ рпэличия могут служить фаги Сц и gBl, см. рис. 2.Б). Каковы же могут быть причины падения поглощения в зоне 260-290 нм, наблюдающегося при разрушении частиц фагов, содержащих дцЦНК?

Ясно, что это падение не может быть объяснено изменениями в поглощении белкового компонента фага.Я priori нельзя однако исключить, что пацение поглощения связано с неправильным определением зеличин поглощения цельного и/или разрушенного фага методом экстраполяции. Наш был проведен целый ряд экспериментов для проверки правомочности применения этого метода к исследуемым объектам. Результаты всех этих экспериментов свидетельствовали в пользу возможности использования метода экстраполяции для измерений истинного поглощения препаратов цельных и разрушенных фагов этой группы.

Кроме этого наш был использован альтернативный метод определения истинного поглощения цельных и разрушенных фагов. Суть этого метода состоит в проведении измерений поглощения в так называемой интегральной сфере, внутренняя поверхность которой покрыта веществом, хорошо отражающим свет. Кюветы помещаются в центр этой сферы и с помощью фотоумножителя измеряется освещенность внутри сферы. При ■ измерениях, в такой сфере величины поглощения суспензий интактного и разрушенного фагов оказались такими же, как и при измерениях на обычном спектрофотометре с использованием метода экстраполяции. Результаты этих опытов показывают, что метод экстраполяции может бсть использован для измерения,истинного поглощения суспензий "средних" по1 величине фагов, и .что разрушение фаговых частиц действительно сопровождается падением поглощения в области 260-290 нм.

Таким образом, падение поглощения, наблюдаемое при разрушении фагов, содержащих дцЦНК, может быть связано только с рааги-чиями з поглощении свободной и вфДНК. Следовательно, ДКН. в части-

цах фагов этой группы находится в частично-гиперхромном состоянии и это» гиперхронизм вфЦШ отличается по спектральным характеристикам от гиперхромизма, наблюдаемого при денатурации молекул дц№ в растворе. Позднее вывод о наличии гиперхромизма у внутрифаговых ДНК был подтвержден и в работах М.Маэстре с использованием еще одного (так называемого флгаороскатного) метода.

1.2. НеобычньД характер плавления внутрифаговых ДШ в среде с формальдегидом

Далее мы исследовали влияние формальдегида на характер изменений поглощения фага Сд в ходе "плавления". Известно, что формальдегид с одной стороны оказывает стабилизирующее действие на структуру фаговых капсидов, препятствуя их разрушению, а с другой '•• сникает температуру плавления (Т°л) дцЦШ. Оказалось, что при плавлении фага Сд в среде с 1,5$ НСНО, во-первых, почти не наблюдается падения поглощения (и прироста вязкости) в температурной зоне 50-65° и, во-вторых, процесс термической денатурации ДШ носит совершенно иной характер, чем в случае свободной дцЦНК (рис. 1Б). Следует подчеркнуть, что в этом случае, в отличие от плавления в отсутствие формальдегида, денатурации подвергается именно внутрифаговал ДНК, т.к. в среде с НСНО разрушения фаговых частиц не происходит. Если Т°л свободной ДШ фага С^ в $£Сс ^¡¿^ НСНО равнялась 67°, то в случае вфЦНК она составляла примерно 80° и процесс денатурации утрачивал кооперативность (рис. 1Б). ¡{роме того, в случае вфДНК величина прироста поглощения зависела от про должительиости инкубации при данной температуре. Полученные результаты нельзя объяснить непроницаемостью оболочки фага для формальдегида, поскольку охлелдение суспензий не приводило к ре катурации ДШ.

Такое же действие формальдегид оказывал и на кривые плавле-тя ДШ в составе всех остальных исследованных фагов (Т2, Т7 и др.), включая и фаг $В1 , вфДШ которого несколько отличается по спектрам поглощения и КД от остальных вфЦНК.

1.3. Концепция частично-разупоряцоченного состояния внутрйфаговнх ДНК

Из результатов описанных бьгае экспериментов следует, что в составе фаговых частиц ДНК находится в особом структурном состоянии, характеризующемся рядом особенностей и прежде всего, более высоким поглощением при 260-2Э0 ны, чем то, которое характерно для нативных дцЦШ в растворе. Что касается причин такого "час-тично-гиперхромного" состояния вфДНК, то в конце 60-х годов нами было высказано предположение, что оно обусловлено частичным раз-упорядочиванием двуспиральной вторичной структуры у молекул ДНК, находящихся в составе фаговых частиц. Поскольку прирост поглощения при термической денатурации свободных фаговых дцЦНК составляет при 260 нм примерно 40?, а величина падения поглощения на этой длине волны при разрушении фагов равняется примерно 10$, предполагалось, что в разупорядоченноы состоянии находится около .25% оснований вфДНК. Однако, если бы основания этой части вфДНК находились просто в разупорядоченноы (денатурированном) состоянии, она должна была бы реагировать с формальдегидом (а такая реакция приводит к существенному увеличении поглощения при 280290 нм) уже при комнатной (или близкой к ней) температуре. Поскольку такой реакции не наблюдалось (сы. рис. 1Б), бьио высказано предположение, что функциональные группы оснований разупоря-доченной части вфДНГС не свободны, а блокированы взаимодействием" с фаговыми белками (белками капсида и/или внутренними белг<аш

фага). Тог фатст, что спектральные характеристики гиперхромлаьа. вЗДШ- отличались от характеристик гиперхромизма денатурироиалн^х свободных Д1К (см. таблицу I), рассматривался как подтвержден/« гипотезы о взаимодействии разупорядоченных оснований с фаговыми белками. Взаимодействиями с белками объяснялась и повыпенная Т^ вф ДНК в среда с формальдегидом и утрата кооперативное™ плавления в этих условиях.

В дальнейшем, на протязении ряда лет в нескольких лаоорато-риях исследовалось взаимодействие вфДШ с цельи рядом химических агентов (бисульфитом, гидроксиламином, О-метилгидроксиламином, бронацетальдегидом и др.), которые в растворе реагируют с денатурированными, но не с нативныли дцЦШ. Для всех исследоваыщгх агентов была обнаружена способность в той или иной степени реагировать с вВДНК. Эти результаты рассматривались как подтверждение гипотезы о частично-разупорядоченном состоянии вфЦНК. Следует однако отметить, что степень "денатурации", обнаруживаемая с помощью разных химических модификаторов, оказалась существенно различной и составляла от примерно 30% для таких агентов как бисульфит и О-метилгидроксилшаш до 1% в случае бромацетальдегида.

Кроме того, в конце 60-х годов M.S. Мэстре было показано, что вфДШ характеризуются существенно измененной (по сравнению к н&тивными дцДНК) оптической активностью. Позднее, эти результаты бьши подтверждены нами на целом ряце других фагов и было обнаружено наличие некоей корреляции между "аномалиями" спектров поглощения п спектров КД в$ДШ. Было также показано, чти вфДШ резко отличаются о? свободных дцЦШ по способности образоьырать комп-т

лексц с нонами Ло15 Cl-1.

а

1.4. Другие объяснения специфических свойств внутрифаговых ДНК

В дальнейшем, используя растворы низкой ионной силы, нам удалось подобрать условия, при которых плавление ДНК происходило раньше, чем разрушение фаговых частиц. Оказалось, что в отсутствие НСНО вф ДНК не обладает никакой (или почти никакой) дополнительной термостабильностью по сравнению со свободной ДНК. Затем было обнаружено, что 40-минутная инкубация фагов Сд и Т2 с 4,8% НСНО (или прогрев при 60-65° с 1,5% НСНО) приводят к почти полному исчезновению гиперхромизма при 260 нм и к существенному изменению спектра КД и ДОВ в сторону сближения со спектрами свободных дцЦНК. В рамках гипотезы частично-разупорядоченного состояния эти наблюдения объяснялись разрывом связей между разупоряцо-ченннми основаниями и белками и восстановлением "нативной" дву-цепочечной структуры во Бсей (или почти всей) вфЦНК. При этом приходилось допускать, что формальдегид не препятствует такому "охлопыванию" комплементарных пар оснований.

К этому же времени относится появление ряда работ, результаты которых вообще не укладывались в гипотезу частично-разупорядо-ченного состояния. К их числу относятся данные ПК-спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния, а также данные по рассеянию рентгеновских лучей, которые свидетельствовали о наличии в составе фагов только более или менее нормальной"В-конформации ДНК. В это время были предложены дга альтернативных объяснения специфических свойств вфДШ. Оба эти объяснения были предложены М.Ф. Мостре, и по одному из них особые свойства вф ДНК определяются тем, что она находится в более закрученной конформаиик, чем_ та,которая характерна для дцЦНК в растворе, а по'другому- особенности вфЦНК обусловлены наличием у них элементов яицко-нриатал-

лической структуры.

1.о. Сравнительное исследование спектров поглощения и КД пяти внутрифаговых ДНК

Чтобы .попытаться выяснить причины возникновения специфических свойств вфЦНК, нами было проведено сравнение спектров поглощения (в области 240-290 нм) и спектров КД (в области 240-350 ни) четырех бактериофагов, содержащих дцЦШ (С , T7,FJ5и £В1). Эти фаги характеризуются примерно одинаковым процентным содержанием ДНК, но отличаются друг от друга по размерам головки и отростка, мол.массе ДШ, проценту Г-Ц пар в ДНК, еветорассеивамцей способности и пр. На рис. 2А приведены разностные спектры КД (фаг -свободная ДШ), а на риа. 2Б - разностные спектры поглощения . этих фагов.

Видно, что, во-первых, все исследованные фаги отличаются от соответствующих свободных ДШ по спектрам поглощения л КД , и, во-вторых, разностные спектры разных фагов характеризуются как наличием общих черт, так и определенными индивидуальными особенностями. Наличие общих черт в разностных спектрах поглощения и КД разных фагов,по-видимому, отражает единый механизм возникновения "аномалии" у разных вфДНК. Что не касается различий между разностными спектрами разных фагов, то они в наибольшей море проявляются при сравнении фагов Сд и £В1. Разностный спектр поглощения 5Б1 имеет точку перемены знака в районе 260 нм, тогда как в случае Сд (и остальных исследованных фагов) она располагается в районе 250 нм. Разностные спектры КД этих двух фагов также отличаются в наибольшей степени - разностный спектр £В1 характеризуется значительно меньшей интенсивностью отрицательной полосы, еп сдвигом с примерно 265 нм к примерно 21.5 нм и появление!- неболь-

Рис. 2. Разностные спектры КД (А) и поглощения (Б) дцДНК-содерясащих фагов:-о—Фаг сдт-*— Фаг Т7,—О— >-

шой положительной полосы при 285 им. Таким образом, наблюдасгсл определенная корреляция между особенностями спектров КД и снект ров поглощения индивидуальных вфЦНК.

В то же время не обнаруживается никакой корреляции между разностными спектрами поглощения и КД разных фагов и размерами головок и отростков фаговых Частиц, мол.массой ДНК, способности к светорассеянию и другими характеристиками вирионов. Ни для одного из фагов не обнаружено наличия "хвоста" дихроического поглощения при }\> 310 нм. Все эти данные свидетельствуют притие объяснения особенностей спектров поглощения и КД вфДНК за счет неправильного учета вклада светорассеяния в поглощение, дифферен -циального рассеяния и других тривиальных причин.

1.6. Действие высоких концентраций моновалентных солей и

Известно (В.И.Иванов, 1972), что повыпение концентрации и» -новалентных солей, понижение температуры или добавление метанола приводят к характерным прогрессивным изменениям спектров КД сьо-бодных ДцЦНК. Эти изменения, по всей вероятности, связаны с нькс торьш увеличением угла закручивания двойной спирали ДНК, что под тверядается сходством спектров КД ДНК в4М Ц|С£ и в пленках С-фор-мы ДНК. ДИ{ в составе комплексов с бутиламином и в составе нукле-осом такде имеют спектры КД^очень близкие к спьктру в 3-4 Ы 1,|СЬ . Ц. Мэстре было высказано предположение, что и особенности спектров КД вфЦШ также определяются увеличением угла закручивания двойной спирали.

Однако детальное сравнение разностных спгктров КД «фЦНК ' Минус свободная ДШ и свободная ДНК в 4И 11С£ минус свободная ДГЛ в БЗСХрис. 3) иоказывагт, что на самом деле эти два типа разнос. -

спектры КД внутрифагових ДНК

тных спектров весьма сильно отличаются друг от друга (особенно в зоне 240-270 нм) и стало быть нет оснований для того, чтобы приписывать сходную структуру свободной ДНК в uce и вМНК.

ле

х-

о

-I

-2

-3

-4 : '

/ 240 ' 260 ' 280 • 300 320

Рис. 3. Расчетные разностные спектры НД внутрифаговой • и свободной ДНК фага в Li С С. —а—вфДНК в SSC минус свободная ДНК в SSC;—Л—свободная ДНК в 4М UCe минус свободная ДНК в $$С ;—к—вфДНК в 4М 1,1 Се минус вфДШ в $$С ;-о-в$ДНК в 4М ЦСе минус свободная ДНК в 4М МСб .

К такому же результату приводит и сравнение действия высоких концентраций моновалентных солей на свободный и гфЦНК (рис.3,4).

Для вфДНК в отличие от свободных ДНК ве наблюдается линейной зависимости величины Д6макс ' от квадратного корня■концентрации соли и не наблюдается характерной для свободных ДНК зависимости "скорости" уменьшения Дбшкс> от природы катиона (рис.4). Что же касается ионов И^, то они вообще оказывают противоположное действие на спектры ДЦ свободных и вфДНК (рис.5).

макс.

сьо-

Рис. 4. Заьисимость Д^ боцной ивнутрифаговой ДНК Сд от концентрации моновалентных солей. Депротеинизироьанная ДНК:

_о—Цсе, —а— МаСе,

-НоССО; внутрифаговая ДНК:

1 - Ь1аМ

—д— цсе, —

V

2,45

лГс

Наблюдаемый характер зависимости 6

:акс.

вфДНК от концентрации солей не согласуется и с гипотезой настично-разулорядочен-ного состояния внутрифагоьых ДНК.

д8 С/.)

тех 120 НО 100

90

■Й__а

я /

• ^

Рис. и. Зависимость сво-

М&КС .

бодной и внутрифагоьой ДНК С^ от концентрации МдЗО;

-О- - свободная ДНК;

—П--«РЖ.

4 6 12 16 20 тМэ4

1.7. Модификация внутрифагових ДНК диметилсульфатом

С гипотезой частично-раэупорядоченного состояния но согласуются и результаты модификации внутрифаговых Т7 и Сд ДНК ^Н-диые-тилсульфатом - популярным реагентом, используемым для обнаружения рзяупорядоченних участков в дцДНК и экранировки функциональных групп оснований ДНК при ее взаимодействии с белками. Для вфЦНК

фагоа Т7 и С (таблица 2) в пределах чувствительности метода не

Я 7

било обнаружено ни изменения соотношения м А/и Г по сравнении с НЗ.ТИЕН1М! свободном ДНК (что свидетельствует об отсутствии экранировки фагоЕыни белками большого или малого аалобков ДНК), ни появления пика ц^А (что свидетельствует об отсутстяии разупоряш,-

¿и.

'■'9НЧЫХ участков в ДНК). В случае фага С^ и суммарное включение метки в вфЦНК оказалось примерно таким же, как и для свободной . ЩК (таблица 2), т.е. не наблюдалось и неизбирательного экранирования обоих желобков ДНК.

о

Таблица 2. Модификация свободных и внутрифаговых ДНК Н-диметил-

сульфатом

Общее количество метки, включающейся на 40 ыкг ДНК (имп./мин) Количество метки-чв пике мТ (имп./мин) м3А/ы7Г иЧ/и7Г

Фаг С '9400 7526 0,174 <0,03

ДШ С Фаг Т7 10245 8592 0,177 ¿0,03

5172 4178 0,149 <0,03

ДНК Т7 15350 12825 0,154 <0,03

ДНК Т7 после денатурации 11350 7705 0,072 0,298

Приведенные результаты заставили нас придти к заключении, ито все три гипотезы, предлагавшиеся ранее для объяснения особых свойств ЕфЦНК. (гипотеза частично-разупоряцоченного состояния, гипотеза увеличения угла закручивания спирали и гипотеза жидкокристаллического состояния) не способны объяснить весь "спектр" наблюдаемых аномалий этих ДНК. Против гипотезы частично-раэупо-рядоченного состояния свидетельствуют результаты изучения действия высоких концентраций солей на спектры КД гфЦНК, результаты модификации диметилсульфатом, а также данные других авторов по сшиванию вфДНК с белками псораленом, по. дифракции рентгеновских лучей и по-спектроскопии комбинационного рассеяния. Против 'гипотезы накручивания .СВ—С-перехоца") свидетегьс.тг>ют сущее гениу? рачг «тл между спектрами КД шутркфе.говых и "чакр.укшмх" Лм--.

различия в действии моновалентных солей и Мд на спектры КД и, на конец, отсутствие гиперхромизма у "закрученных" ДНК. Против гипотезы яидко-кристаллического состояния говорят высокая устойчивость Аномалий* вфДНК к повышению температуры, изменениям ионной силы и рН, а также внутримолекулярный характер конденсации ефЦНК,

Чем же в таком случае объясняются специфические свойства вфДНК? Вся сумма имеющихся на сегодня#данных, по нашему мнению, свидетельствует о том, что особые свойства вфДНК определяются тем общим, что присуще всем этим ДНК - а именно, плотной упаковкой, и, возможно, наличием суперспирализации. Эта плотная упаковка (и сулерспирализация) вызывают изменение параметров спирали всей молекулы вфЦШ в целом или отдельных ее сегментов, которые и проявляются в измененных оптических свойствах вфДНК, измененной реактивности в отношении некоторых химических -агентов и других особенностях вфДНК. Следует подчеркнуть, что эта измененная конформация вфДНК не может быть идентичной той, которая характерна для дцДНК в высоких концентрациях солей, в метаноле и в составе нуклеосом. Что же касается различий между индивидуальными вфДНК, то они при такой интерпретации должны отражать различия в степени или характере этих конформациокных изменений, определяемые разной плотностью упаковки (и, возможно, разной степенью суперспирализации) молекул вфДНК у разных фагов.

ЧАСТЬ П

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ШКЛЕИНОВО-БЕПКОВЫХ ВЗШОДЕЙСТБИЙ В РНК-СОДЕРЖАЩИХ СПИРАЛ УЖ

ВИРУСАХ РЯСТЕШ 2.1. Спектры поглощения РНК в спиральных вирусах растений и реакция этих РНК с Формальдегидом

В ходе начатого в конце бФ-х годов исследования структуры

гЖ в частицах вирусов растений со спиральной симметрией мы начали с использования тех методических подходов, которые ранее применялись при работе с дцЦНК-содержащими бактериофагами. Основное различие между этими двумя группами объектов состоит в том, что спиральные вирусы растений (СВР) содержат значительно меньшую весовую дол» нуклеиновой кислоты (около 5%), чем "хвостатые" фаги. Поэтому при сравнении, например, спектров поглощения цельного и разрушенного вируса становится необходимые учитывать, во-первых, вклад поглощений белка в суммарное поглощение суспензии, и, во-вторых, вклад возможных изменений поглощения белка в суммарные эффекты, наблюдаемые при разрушении вирионов.

Прежде всего мы определили характер спектров У2-поглощения РНК в частицах нескольких СВР в зоне 240-290 нм. В качестве объектов исследования были выбраны типовой представитель группы палочковидных вирусов растений - вирус табачной мозаики (ЗТМ), родственный ему вирус огурцов 4 (ВО-4) (вирус зеленой'крапчатости огурцов) и типовой представитель группы нитевидных вирусов - X-вирус картофеля (Х-ВК). Для определения степени гиперхромности внутри вирусных РНК, как и в случае ДНК-содержащих фагов, использовалось сравнение спектров поглощения цельных и разрушению: вирусов. Было обнаружено, что разрушение вирионов под действием нагревания (в присутствии детергентов или без них) сопрогождает-ся падением поглощения в зоне 260-290 ны, величина которого увеличивается с увеличением длины волны. Оказалось рциако, что примерно такие.же изменения (если учесть вклад белка в поглощение вируса на разных длинах волн) наблюдаются в ходе разрушения не содержащих РНК спиральных агрегатов белка этих вирусов. Поскольку разрушение ЕИр.усных частиц происходило при температуре?, при • которых свободная вирусняя РНК находится утл ? по.шоетьм дел- ■

тури р о ванн ом 'гиперхроыном состоянии, из этих данных следует, что а таксы не (Еысоко-гиперхримнон) состоянии находится РИС и в сос ■ таве вирионов. Результаты расчетов степени гиперхромности внутри-вирусных РНК ВПл, В0-4, и Х-ВК приведены в таблице 3.

Таблица 3. Гиперхромизм PIK в частицах спиральннх вирусов растений

260 нм 270 нм 280 нм 290 нм

I. Гиперхромизы PIK частицах БТМ в 123 ,0 122,0 120 ,0 122,6

2. Гиперхромизм РШ частицах ЕО-4 в 119 ,5 121,5 116,0 II:;,5

3. Гиперхромизм FIM частицах X-BÍC в . 123 ,0 124,0 123,0 110,0

4. Гиперхромизм пси термической денатурации •свободной PIK Х-ГК 122 ,0 124,0 122,0 112,0

Гиперхромизм рассчитывали в % к соответствующим свободным РШ в 0,01 ГI фосфатном буфера pH 7,2 при 20°С, с учетом вклада белка в поглощение вирусов и изменений в поглощении белка при разрушении пирионон.

Далее мы исследовали состояние оснований внутривирусних РШ СЕР с помотьо реакции с формальдегидом. Поскольку РНК ь внрионах СЕР находится в високо-гиперхроином состсянни, в данном случае речь могла идти из сб обнаружении денатурирующего действия формальдегида на рнутривирусниз РНК, a od обнаружении самого связывания IJCHO с aj.::!Horpynn2.v:i оснований. ¡Ьзестно, что такое связывание приводи? ;; увеличению поглощения с сдкошумом при 290 ни. Окапалось, что па способности взгииодеЯствогать с формальдегидом •Енугрлвируснкз РИС *р-эх исследованных CRP отличаются друг от друга (рю. 6). При 37° гнутрдвирусная PIK X-EÍ срашительио быстро (xco.i а лнзч:!?8л:»:;э ::зг.ле!Ш5г, чем сисбоднп; PIK) рщщрогаяа з формальдегидом. Е;!у.-р'-1пирусн.:л Pili ЕО-1 гмуичла и рмгдеп а фор-

л'пльдегицом значительно медленнее, а РНК в составе BTW вообще не взаимодействовала с этим реагентом.

вирусов растений в ходе инкубации с 1,Ъ% НСНО. Инкубация при 37° в 0,01 М фосфатном буфере pH 7,2.—о~ВШ;—Д—ВО;—Q—Х-ВК.

Эти результаты свидетельствуют о существенных различиях в состоянии внутривирусных РНК в частицах разных СВР, причем эти различия наблюдаются не только между нитевидным Х-ВК и палочно-вицньми BIM и ВО, но и внутри группы палочковидных вирусов. Способность внутривирусной РНК к реакции с формальдегидом говорит о том, что оболочка данного вируса проницаема для НСНО, и, что аминогруппы оснований РШ не участвуют во взаимодействиях с белком (или эти взаимодействия разрушаются под действием формальдегида). Различив в доступности для формальдегида аминогрупп оснований РНК в ВТЫ и в БО явилось одним из первых указаний на возможные различия в характере нуклеиново-белковых взаимодействий в частсц-хх этих вирусов, хотя эти результаты допускают и другое объяснение (за счет различий в проницаемости белковой оболочки).

2.2. Оптическая активность внутривир.уснкх РНК ь вирионах СВР

Весьма информативным оказалось исслецованье оптической актия-ности РНК в частицах СЕР в области 250-3&0 ни. В той работ» сначала использовался метод дисперсии оптической актирности (ДОВ), п затем (с появлением соответствующей аппаратуры) - более удобный метод кругового дихроизма (КД). Следует отметить, что, как и при измерении спектров поглощения, при измерениях спектров ДОВ и КД" внутри вирусных РНК в силу низкого процентного содержания РНК в СВР, необходимо учитывать вклад белкового компонента в оптическую активность исследуемых вирусов.

В этой серии работ кроме упоминавшихся вьше БИ, ВО-4 и Х-Ш использовались также родственный ВТМ вирус мозаики долихоса (ШД) и два атамма ВТ?«! - Ц и НИ . Использование этих вирусов было связано с тем, что они отличаются от дикого () штамма ВТМ по числу и локализации остатков триптофана в белке оболочки. Как видно . из рис. 7 и 8 по оптической активности все исследованные вирусы существенно отличаются друг от друга и от свободных РНК. Для определения оптической активности внутривирусных РНК из спектров цельных вирусов вычитались спектры препаратов вирусо-поцобных спиральных белковых агрегатов (белок Х-ЕК таких агрегатов не образует). Оказалось, что спектры ДОВ'и ЯД внутривирусных РНК СВР резко отличается друг от друга и от спектров свободных одноцепо-чечных РНК (рис. 3). При этом в большинстве случаев амплитуда спектров КД внутривирусных РНК в зоне 250-350 нм сказывается значителг-но более гысокой, чем у РгК в растворе. Таким образом, несмотря на то, что по величине гиперхромиэма в спектрах поглощения Ечутрнвирусные РМ\ СВР сходны с денатурированными РНК, величина их оптической активности свидетельствует о налички высокой сто:1?н1'. упорядоченности, в и:с структуре и о принципиальном отличи,« "той структуры от структур!/ как ндтивных, так и денатуриро-

<сс,

е&ннь'х РШ в растворе. Поскольку спектры ДОВ и КД неотличимых по морфологии U-BTU и, например, ВО сильно отличаются друг от друга (рис. 7А, 3), оптическая активность внутриьирусних РНК (по крайней мере в случае палочковидных вирусов) должна определяться не геометрией спирали, а конкретной природой РНК-белковых взаимодействий в частицах данного вируса.

из0' '

600

200 -200

-600

-1000

-1400

-1800

-2200

Рис. 7. Дисперсия оптического вращения препаратов спиральных вирусов растений. А: I - ВТК!; 2 - Х-ЕК; 3 - ВО; В: "гибридныэ"

вирусы: I - белок ВТМ + РШ ВО; 2 - Солок БО + РИС МП. *

Это предположение подтверждается результатами измерений ДОВ, так называемых "гибридных" вирусов, содержащих Pi 1С одного Елруса и белок другого (такие "гибридные" вирусы могут быть получены путем "с^саалиой0 реконструкции in vitro). Как видно из рис. ?Б, "гийрадниЯ" uipyc, еодера^Ш белок ЕО и -PIK BTLi, mati кз сг.скгр как прародин." ЕО, с. вирус, содержи'«! бело;: БТ1Д

Рис. 4. Расчетное спектры КД внутриейруеньх РНК палочковидных

вирусов гасгчиий. -штамм ЦйТМ;---итамм Щ ВГГ1Л;

-----птя.мм НКШ;......... ЩД;--ВО;—«—" препарат РНК

вталча Ц сТМ р 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2.

и РШ ВО, - такой же как природный ВГМ. Другими словами белковый компонент вируса "навязывает" любой включенной в его состав РНК определений характер оптической активности.

В свое время П.Чешом (1^68) было высказано предположение, что особенности оптической активности внутривирусйой PHK ВТМ определяются взаимодействием ее оснований с остатками триптофана в белке оболочки. Результаты наших исследований с использованием ряда штампов ЬТМ, отличающихая по числу и локализации остатков триптофана,позволили сделать вывод, что остатки триптофана не играют роли в определении характера оптической активности внутри-вирусной РНК вты.

2.3. Модель механизма самосборки EÍM ¡п vitro

Конец 70-х годоь ознаменовался двумя ыщныш событиями в изучении структуры и механизмов самосборки DTLI. Во-первых, с помощью метода рентгеноструктурного анализа были получены карты алектронной плотности для кристаллов так называемых 20 S двуслойных дисков белка ЬТМ (с разрешением 2,8 Ä ) и для ориентированных нитей цельного BIM (с разрешением 4,0 Á }. Было обнаружено, что в диске субъединицы дьух слоев на малых радиусах (вблизи оси) лежат на большем расстоянии друг от друга, чем на больших радиусах, и, таким образом, между слоями субъединиц образуется полость, открывающаяся в центральный канал диска. В вирионе такая полость между субъединицами двух соседних витков отсутствует. »

Кроме того, оказалось, что у субъединиц в составе диска участки полипептидной цепи, лежащие вблизи оси, находятся в подвижном состоянии, & в вирионе эти участки цепи приобретают жесткую структуру и как бы "замыкают" вирион со стороны центрального канала.

В составе вириона три основания рнутривирусной РНК взаимодействуют с одной белковой субъединнцей, с трех сторон (снизу и с боков), охватывая один из радиально располагающихся с<-спиральных сегментов (так называемую UR-спираль). При этом два вертикальных основания, охватывающие ^й-спираль с боков, распола-. гаются на расстоянии около 40 Á от оси, а горизонтальное основание (лежащее под UR-спиралыо) - на расстоянии около 40 Д ot оси.

Вторым важный событием явилось определение локализации участка инициации реконструкции [0&) в составе молекулы РНК ВТМ и последовательности нуклеотидов на этом участке. Оказалось, что 0ft располагается на расстоянии около ?о0 нуклеотидов от 3'- конца РНК ВИЛ (ее общая длина 6400 нуклеотидов) и что последовательность нуклеотидов в этой участке характеризуется интересной особенностью - с высокой вероятностью (II случаев из 17) в каждом третьем положении последовательности располагается остаток гуанина (..ХХГХХГХХГХХ..).

На оснований этих (а также ряда других) данных в 1977 г. Дж.Еаглером, Дж.Финчем и Д.Циммерноы была предложена красивая модель "морфологии* процесса самосборки HTM in vllrOH3 РНК и белка, получившая название "модели сборки изнутри". В соответствии с этпй моделью, в основном остающейся в силе и сегодня, при инициации самосборки участок цепи РНК ВТМ, содержащий 0а, через центральный канал 20S-диска проникает в полость между слоями субъединиц и вызывает дрелоквнию этого диска. Последующая элонгация вирусного нуклеопротеида в "главном" направлении (в сторону 5'-конпа FKO осуществляется за счет связывания последовательностей РНК с белком на Г>*-поверхности уже сформированного РШ, причем попх.екахич одевач^] участки PiiK подаются к месту сборки через центральной кана» :,г,е с}-орп:ропенного нуклеопротеида, а оба сво-

бодных хвоста РНК (и 3'- и Ь'-) располагаются с 3'-конца формирующегося ьириона.

На основании этих данных, наш совместно с Ы.Ше была предложена модель механизма самосборки ВШ in vitro. Основные положения этой модели сводятся к следующему:

1. Перестройки в белковых субъединицах иницирующего диска, ведущие к его дислокации во фрагмент спирали (дислокационные перестройки), и перестройки, ведущие к "замыканию" (достраиванию упорядоченной структуры полипептидной цепи на малых радиусах), есть дьа независимых, разделенных во ьремени и пространстве процесса.

2. Дислокационные перестройки осуществляются кооперативно

во всех субъединицах данного слоя под влиянием встраивания остатков гуанина в средних (горизонтальных) положениях каждого три-нуклеотидцого звена 0&; специфичность самосборки определяется именно специфичностью в отношении последовательности нуклеотидов процесса дислокации иницирующего диска.

3. Замыкающие перестройки осуществляются некооперативно (и неспецифически в отношении оснований) под влиянием встраивания вертикальных (боковых) оснований тринуклеотидных звеньев и фос-

' фатных групп; при сборке в 5»-направлении замыканию подвергаются субъединици предыдущего (в 3»-направлении) витка спирали.

В 1978 г., когда быза сформулировала эта модель, считалось общепринятым, что 20 S-агрегаты, используемко при инициации са-иосборки Bill in vitro соответствуют 20 S-дискам, исследовавшимся А.Блумзр и др. (1977) иетодоы рентгеноструктурного анализа. В 80-цв '' годы стали накапливаться все более и более убедительные свидетельства того, что в действительности при оптимальных для сборки условиях в препаратах белка' ГО! присутствуют и используются для

инициации не цилиндрические парные 20 Э-диски, а короткие (чуть больше двух витков) фрагменты спирали, имеющие примерно такуп же константу седиментации. Дж.Батлер в обзоре 1Э84 г. позражял против такого предположения на том основании, что короткие белковые спирали не могут включать РНК, поскольку они цолжни быть уже замкнуты. Однако это противоречие снимается, если принять, что в коротких спиралях дислокация не сопровождается замыканием (что является основным положением нашей модели).

Таким образом, данные об использовании при инициации сборки рте дислоцированных коротких спиралей, а не плоских дисков, можно рассматривать как подтверждение первого положения нашей модели. С остальном двумя положениями дело обстоит иначе. Если для инициации используется фрагмент спирали, то отпадает необходимость • постулировать специфические "дислоцирующие" нуклеиново-Селковке . взаимодействия с участием горизонтальных оснований и предполагать локализацию повторяющихся остатков гуанина именно в среднем поло- ' кении тркнуклеотидннх звеньев.

2.4. УЗ-икд.уцирор.анное списание РНК с белком в частицах ВТМ

Появление данных рентгеноструктурного анализа с разрешением ■ 4 А , аэвчрмиЗ.бД СК.Намба и Дж.Стаббс, 1936) вывело всю проблему структуры РНК и нуклеиноьо-белковых взаимодействий з ВТМ на совершенно иной уровень конкретизации. Еместе с тем, то обстоятельство, что НТК не образует истинных кристаллов и данные рентгеноструктурного анализа получены на ориентированных нитях, не позволяет надеяться на дальнейшее существенное повыпение разрешения в ближайшем будущем. А разрешение в 4 А (или даже в не является достаточным для прямого ответа на вопрос о природе взаимодействующих функциональных групп оснований и аминокислотных

остатков. Все это делает ьопрос об использовании альтернативных методов изучения природы нуклеиново-^елковьи взаимодействий в ВТЫ весьма актуальный.

Естественным кандидатом на роль такого альтернативного метода является химическое сшивание РШ с белком в составе вирионов ЕГЫ с последующей идентификацией сшиваемых компонентов. Однако наши попытки получить РНК-<5едковые сшивки в ВШ под действием даже таких сравнительно низкомолекулярных сшивающих агентов как бисульфит и О-метилгиедоксилашщ оказались безуспешными: оба эти агента не модифицировали внутриьирусную РШ ЬТМ и не вызывали формирования РШ-белковых сшивок, обнаруживаемых при равновесном центрифугировании. Как уже говорилось вше, внутривирусная РШ ШИ не модифицируется и формальдегидом. Попытка использовать для "разрыхления" белковой оболочки БШ обработку этиленгдиколем также не увенчалась успехом. Добиться прочного сшивания РЩ с бед-ком нам удалось только при использовании У®-излучения.

Первоначально для обнаружения возможности сшивания РНК с белком в частицах 1Ш1 под действием У4-изяучения мы использовали такой классический иетод как равновесное центрифугирование в градиенте плотности С. Было обнаружено, что, действительно, после УФ облучения (длина волны 254 ни) меченого ^Н-уридннон ВТЫ и прогрева ь среде с детергентом часть меченой РШ располагается в зонах градиента с плотностью меньшей, чем плотность свободной РНК КШ, что свидетельствует о формировании РНК^белковых сшивок. Однако этот РНК-белковый комплекс не образовывал в градиенте единого пика, а распределялся в виде широкой зоны с плотностью, промежуточной между плотностью цельного вируса (1,3 г/см^) и

о

свободной РШ (1,6 г/см ). Такое распределение меченого материала свидетельствует о гетерогенности полученного комплекса по со-

отношении PIK: белок, являющейся следствием накопления под действием У<£-излучения разрывов в полинуклеотидной цепи внутриеирусной РНК, Одновременное накопление РНК-белковых сливок и разрывов полинуклеотидной цепи РНК при УФ-облучении ВТМ сильно затрудняет определение квантовых выходов обоих этих процессов. Для этой цели мы предполагали использовать метод аналитического центрифугирований препаратов РНК, выделенных фенольнкм методом из облученного'Вируса. При этом мы исходили из того, что молекулы РНК (или их фрагменты), спитые с белком, должны при фенольной экстракции переходить в фенольнуп фазу и в получаемом препарате должна содержаться только РНК, не сиитал с белком.

По нашей просьбе,сотрудниками отдела математических методов Лаборатории им А.Н. Белозерского МГУ - Н.В.Васильевым и А.М.Леон-товичец было выведено уравнение, связывающее срецне-весовуп мол. массу экстрагируемой фенолом РНК, с числом разрывов и сшивок на молекулу. Полученное выражение имсло следующий вид:

м: ■_ e-V(2j3+e*)ja - 3,

и: е-а1-(2А+Аг)34 - _ß2Jt Ур.Ш

где a^i-e-'u+aa; ^ fi;

мо a3=f[i-eVsfîb?)], ■•

П- исходная средневесовая мол.масса FiJt; р] - средневесовая

w i w

мол.масса РЖ, остающейся в водной фазе при фенольной экстракции . из облученного данной дозой вируса (фрагменты РНК, сшить« с белком, остаются на интерфазе); ß - число разрывов на молекулу РНК;

у- число Fi'K-белковга сшивок на молекулу FHK (отношение ß/ ¡f дол жно оставаться постоянным при раэнкх дозах облучения); 'S суммарное чюло разрывов я сшивок на молекулу РНК (S +

Билко, что jpaFHeHTte (I) содержит две неизвестные величины (р и S ) и гоочту кг может быть решено. При анализе уравнения . мы, oüHeifO, "о*рат>ля тнишне на то, что его знаменатель вырока-

ет ьесовуи доле РНК, не связанной с белком,-которую мы будем обозначать р . , с „ „2 'о ог ,, ,„,

При рассмотрении этого уравнения видно, чю, если величины Р и 8 не слишком близки друг к другу (т.е. если вклац сшивок достаточно заметен), то с увеличением дозы облучения (с увеличе-кием 6 и О ') ьеличина Г быстро стремится к - ^ , а затеи

с 2 ° ®

(более медленно) - к ^/8 . Следовательно, предел, к которому стремится величина Р с увеличением дозь^соответствует .

Из этой величины легко рассчитать / § , т.е. отношение числа разрывов к общему числу разрывов и сшивок. Определить величину р мояно разными способами. Прежде всего, просто как величину фракции РНК, экстрагируемой фенолом из облученного вируса. Более точным является метод адсорбции на нитроцеллюлозных фильтрах (известно, что ь определенных условиях свободная РНК проходит через фильтры, а РНК, сшитая с белком, задерживается на них). Результаты, полученные с помощью обоих указанных методов, представлены на рис. 9. (На этом рисунке по оси ординат отложена доля РНК, свя-аывгисщайся с фильтрами, т.е. величина,-дополняющая р до единицы).

Ю0х(1-П ' {% связивания)

160 кв./нукл.

Рис. 9. Зависимость величины ьесовой фракции сшитой'с белком РШ БТЫ (I - р ) от дозы Ув-излучения. о по данным адсорбции на нитроцеллюлозных фильтрах; & по выходу РНК при фенольной экстракции.

Видно, что доля связывающейся с фильтрами РЖ (или доля не-экстрагируемой фенолом Р1Ю сперва увеличивается с увеличением дозы, а затем выходит на плато на уровне 0,65. В таком случае F= 0,35 и (поскольку p/8 =yff) ß /8 » 0,59, т.е. при использованных условиях разрывы составляют 59% от общего числа разрывов и сшивок во внутри вирусной РНК ВТМ.

Зная р/8 , мы можем выразить £> через § (ß) = 0,5э8)ч решить уравнение I и построить кривую зависимости MVN° от 8 .

Далее мы подвергали препараты ВТМ облучению разными дозами, выделяли РНК фенольныы методом и с помощью аналитического центрифугирования определяли мол.вес РИС по методу Бвдткер. Из полученных в разных опытах и при разных дозах величин Mw/Mw по кривой определяли соответствующие величины 8 . На. рис.10 приведены результаты экспериментов такого рода, выраженные как зависимость § от поглощенной дозы излучения (в квантах на нуклеотид).

пи РНК (5 ) от поглощенной дозы УФ-излучения.

Видно, что эта зависимость описывается прямой линией. Квантовый выход разрывов плюс сшивок, рассчитанный по этой прямой,

составляет 1,6x10"^. Поскольку (как было показано вьше) р ■= 0,59^ квантовый выход разрывов полинуклеотидной цепи внутриЕирусной РШ ВТМ равен 0,ЭЬхЮ"5, а квантовый выход РНК-белковых сшивок-0,65х10""5. Обращает внимание весьма низкая (по сравнению с другими нуклеопротеидными системами) величина квантового выхода сшивок. Что касается квантового выхода разрывов цепи внутривирусной РНК, то он оказался в 3 раза выше, чем измеренный нами квантовый выход

л

разрывов в свободной РНК ВТМ (3x10 ).

Для повышения квантового выхода сшивок мы (совместно с сотрудником Института спектроскопии АН СССР Д.Н. Никогосяном) использовали вместо обычного низкоинтенсивного УФ-излучения ( 10 Ьт/м*", 2Ь4 ны) высокоинтенсивное импульсное пикосекундное лазерное УФ-излучение ( ^ = ^^ Вт/м*", А = 266 нм). Обнаружено, что такое повыиение интенсивности приводит к увеличению квантового выхода РНК-белковых сшивок почти в 20 раз,-но при этом наблюдается и увеличение квантового Еыхода разрыва цепп РНК почти в 100 раз.

Низкая величина квантового выхода РНК-белковых сшивок и накопление разрывов цепи РНК заметно затруднили решение нашей следующей задачи - определения природы участка белка ИМ, сшивающегося с РНК при УФ-облучении.

Для идентификации участков молекулы белка ВТМ, подвергающихся сшиванию с РНК^был использован метод кидкостной хроматографии высокого разрешения. Препараты меченого Н-уридином ВТМ подвергали УФ-облученив дозой 300 кв./нукл., разрушали нагреванием с детергентом и пропускали через колонку с Сефадексоы б -200 для .отделения от основной ыассы свободного белка. Собранный пик высокомолекулярного материала пропускали через Сефадек^ в-50 (для удаления детергента) и обрабатывали РНКазой Т2 для гидролиза свободны?: "хвостов" РНК. Затеи белок с пришитой нуклеотндной мзткой

осаддали п изоэлектрической точке (рН 4,5), промывали и гицролиэо-сали трипсином. Смесь триптических пептидов разделяли на колонке с обращенной фазой Сферисорб С-6, и в полученных фракциях определяли радиоактивность и оптическую плотность при 214 и 280 ни.

В случае контрольных (необлученных) препаратов ИМ вся иетка элюировалась с колонки в первых двух фракциях (рис. II), где и должны элюироватьсл свободные нуклеотиды. В случае облученного вируса также обнаруживался пик Н-уридина в первых фракциях, но, кроне того, заметная часть метки элшровалась позднее, в виде второго

пика в районе 12-ой фракции.

35

Зн (имп.Дин.хЮ-3)

15

10

Л

5 10 15 20 25 30 35 40 №>. Рис. II. Наделение пептида белка оболочки ВТМ. сшивающегося с РНК при УФ-облучении. Препараты ВТМ, меченые Н-уридином, подвергали УФ-облучения, выделяли белок с пришитыми Н-нуклеотидами, гицролизовали его трипсином и пептиды разделяли с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения на йолонке "Сферисорб С-б". —О— необлучйнныЙ ВТМ;-- Ш, облученный дозой 300 квант./

нукл.

Материал этого пика подвергали еще одному циклу хроматографии на Сферисорб С-6 с использованием другой системы растворителей. В элюате было идентифицировано два пика оптической плотности, содержащих метку (А и Б). Материал этих пиков подвергали аминокислотному анализу и проводили два шага секвенирования по методу Эдыана. Результаты обоих этих методов показали, что пик А соответствует N -концевой части пептида Tö (остатки 93-99), а пик Б - С-конце-вой части этого пептида (остатки I00-II2).

Таким образом, при УФ-облучении ВГМ сшиванию с РШ подвергается участок полипептидной цепи белка оболочки, соответствующий триптическому пептиду Т8, причем сшивание происходит по как минимум двум аминокислотным остаткам этого пептида. Из этого следует, что в составе вириона участок полипептидной цепи, соответствующий остаткам 93-112, в каких-то своих частях сближен с полинукле-

отидной цепью РШ. Этот результат не противоречит последней ыо-

«

дели структуры КГМ Намбы и Стаббса (1936) с разрешением в 3,6 А .

2.5. Определение длины участка инициации реконструкции

(Од) в молекуле РШ ВЩ. на основании данных по УФ-инактииации способности РНК КТО к самосборке

Процесс самосборки ШМ in vitro состоит из двух стадий - стадии инициации, на которой происходит специфическое узнавание участка инициации реконструкции (0&) 20 £ -агрегатом белка ВГМ, и стадии элонгации, на которой происходит одевание белком всех остальных последовательностей, имеющихся в РШ НШ и, следовательно, не требуется специфического нуклеиново-белкового узнавания. Как yas говорилось вила (глава 2.3), локализация 0& в молекуле РШ ВТЫ била определена еще в конце 70-х годов. Однако функциональная длина этого участка оставалЕсы1еиз'востцоИ,и единственные денные на этот

счет были получены с помощью косвенного метода - путем определения минимальной длины фрагментов РНК ВТМ, защищаемых от РШаз при сборке с небольшим количеством белка.

Мы попытались использовать для определения функциональной длины 0Д метод, основанный на определении размера мишени в РНК BIW для инактивации ее способности к самосборке с белком tn vitro.'

Мы предположили, что при УФ-облучении свободной РНК EIM в ней в принципе могут образовываться два типа повреждений, нарушающих ее способность к самосборке с белком оболочки. К первому типу ш отнесли такие повреждения, которые должны ингибировать сборку при их появлении в любой точке- молекулы (к числу повреждений этого типа наверняка относятся разрывы полинуклеотидной цепи). Возникновение одного повреждения ЗТ0Г0 типа (для простоты - разрыва цепи) приведет к исключению из сборки в среднем половины молекулы (той, которая не содержит Оа), возникновение двух повреждений - к исключении 2/3 молекулы и т.д. Можно показать, что Ь общем виде процесс инактивации способности РНК к самосборке под действием пов-

s i - e'N

реждений этого типа будет описываться формулой: = , где

S - количество образованного нуклеопротеида, а N - число ударов первого типа на молекулу. Поскольку длина 0& составляет лишь небольшую часть длины всей молекулы РНК БШ, число ударов этого типа, попадающих в 0Д, будет составлять лишь очень малую часть от общего числа ударов ч начальная скорость сборки (V) будет весьма долго оставаться практически неизменной.

Возможно однако существование и второго типа повреждений -повреждений, которые нарушают структуру нуклеотидов и инактивиру-ют сборку только на той стадии, на которой необходимо нуклеиново-белковое узнаванно, т.е. стадию инициация. 'Если повреждение этого (Еторого): типа нарушает функционирование 0&, то из процесса ca.-

мосборки исключается сразу вся молекула. Поэтому процесс инактивации, под действием повреждений второго типа будет описываться обычной формулой 5. = , где М - число повреждений этого типа на 0а> Кроме того,"повреждения второго типа должны уменьшать начальную скорость сборки в той же мере, в какой они уменьшают ее выход.

Для экспериментальной проверки этой модели мы (совместно с Д.Н.Никогосяном) подвергали препараты свободной РНК ВТЫ УФ-облуче-нию и измеряли кинетику самосборки этой РШ с белком ВТЫ по приросту оптической плотности при 310 нм (этот метод основывается на увеличении светорассеиваощей способности суспензии за счет формирования рибонуклеопротеида 1ЯМ).

На рис. I2A суммированы результаты значительного числа экспериментов такого рода с использованием обычного низкоинтенсивного Уй-издучения ( Л = 254 нм, ^»Ю Вт/м^). Видно, что при всех использованных дозах начальная скорость сборки (V ) и выход сборки (S ) снижаются в равной мере, что свидетельствует в пользу инактивации за счет повреждений, которые мы относим ко второму типу. В то же время кривая инактивации не имела линейного характера, как того следовало бы окидать при "втором" механизме инактивации

(следует отметить, что кривая не описывается и уравнениями типа 1-е'" N

Результаты модельных экспериментов по УФ-облученшо уридин-монофосфата и полиуридиловой кислоты ртутной лампой (Д = 254 ни) и мощным пикосекундныи лазером ( Д= 266 нм) позволили придти к заключению, что отклонение кривой инактивации на рис. I2A от линейности связано с реверсией пиримидиновых дии;ров. Вклад такой реверсии долпен уменьшаться с увеличением'длшш волны излучения. 11 действительно, при использовании для Уй-инактивации способное-

ти РНК ВТМ к самосборке высокоинтенсивного лазерного излучения с Л = 266 нм кривая инактивации приобретала линейный характер (рис. 12Б). Как и при низкоинтенсивном облучении, в этой случае начальная скорость и выход сборки снижались в равной мере, что свидетельствует о том, что инактивация происходит за счет повреждений второго типа.КвзнтовыЯ выход инактивации при использовании лазерного излучения разной интенсивности (от 10™ до 10^ Вг/м^) сказался примерно одинаковый (0,9 - 1,31хЮ~4) и близким к квантовому выходу (1,25x10"^), рассчитанному по начальному линейному

квантов/ютшотшг • Рис. 12. Зависимость выхода (о ) и начальной скорости (л) сборки ВТМ ог дозы У$-излучения. А - низкоинтенсивное излучение ( 254 нм, 10 Вт/м'"); Е - ЕысокоинтенсиЕНое излучение ( Л= 266 нм 4хЮ13 Вт/м2).

Такой характер инактивации способности РШ ВТЫ к самосборке дает возможность попытаться оценить длину мишени для инактивации способности к самосборке, т.е. длину 0а> Длина мишени (0&) должна быть во столько раз меньше длины всей молекулы РШ ВТЫ (6400 нуклеотидов), ьо сколько раз квантовый выход инактивации способности РШ к самосборке меньше, чем квантовый выход повреждений, вызывающих'инактивацию.

Из изложенного выше следует, что пиримидиновые димеры должны принадлежать к числу таких повреждений. На основании имеющихся в литературе и полученных нами данных,выход пиримидиновых диме-

о

ров ь РШ ВТЫ должен составлять примерно 7,1x10"° при длине вол-

о

ны излучения в 2Ь4 нм и 8,6x10 при длине волны в 266 нм. Если димеры являются единственным вицом повреждений, вызывающих инактивацию способности РШ ВТМ к самосборке, то длина 0& должна составлять Э7-П4 нуклеотидов (6400х и 6400х Т'3?*1(Г.. ).

^ 7,1 8,6 хЮ

Весьма вероятно, что в инактивации 0а, помимо димеров, принимают участие и гидраты пиришдинов. Рассчетные величины суммарного квантового выхода димеров и гидратов пиримидинов в РШ ВТЫ соста-

о

вляют 9,0x10*^ для 254 им и ¡^хЮ""3 - для 266 нм. В таком случае длина 0& оказывается равной 76-92 нуклеотидам. Если в инактивации принимают участие какие-либо еще повреждения, длина 0& окажется еще меньше.

Полученные нами оценки длины 0& в молекуле РШ ВТЫ оказываются более или менее близкими к оценкам, полученным на основании определений минимальной длины участка РШ, защищаемого при самосборке от РНКаз. Следует отметить, что предлагаемый метод оценки длины 0& в принципе является более прямым, чей метод, основанный на защите ст гидролиза РШазоми. В то ш .время точность определений втим методом зависит от полноты учета всех видов

инактивирующих повреждений. Кроме того, на получаемые результаты может оказывать влияние и ряд других факторов, таких например, как вклад инактивации за счет нарушения "правильной" вторичной и третичной структуры молекулы. Тем не менее, предлагаемой метод, по нашему мнению, может оказаться полезным, тем более, что в принципе он применим и к другим системам РНК-белкового узнавания.

основные вывода

1. Обнаружено, что дцДНК в составе исследованиях фагов характеризуется более высоким поглощением в зоне 250-2Э0 нм, чем соответствующие иатиЕНые дцДНК в растворе. Спектральные характеристики этого гиперхромизма оказались существенно иными, чем у обычных денатурированных дцЦНК. Показано, что Д1К в частицах этих фагов характеризуются значительно более высокой Т°л в среде с формальдегидом, чем свободные дцДНК, и процесс "плавления" сфЦНК носит некооперативнкй характер. В отсутствие формальдегида Т°д вфЦШ существенно не отличается от Т°л соответствующих свободных ццЩК.

2. При сравнительном исследовании спектров поглощения и КД ДНК в частицах ряда фагов не обнаружено корреляции между особенностями оптических свойств ЕфДНК и морфологией вирионов, иол,массой ДНК, процентом Г-Ц пар в ДНК и пр.

3. Обнаружено, что вфДНК отличшэтся от свободных ДНК по. действии высоких концентраций моноралснтнкх солей и Ид на спектры КД в зоне 250-300 нм.

4. зфЦНК фагов С я Т7 не отличались от соответствующих Свободных ДШ по характеру модификации Н-диметилсульфатом. В пределах точности метопа е этих вфДНК не обнаружено участков с нарушении.«'. комплементарны« взаимодействиями.

b. IIa основании полученных результатов предполагается, что особенности оптических характеристик, реактивности по отношению к ряду химических, зондов и другие "аномалии" вфЦНК определяются изменениями параметров двойной спирали всей или части в&ЦНК, вызываемыми плотной упаковкой и/или суперспирализацией ДШ в частицах фагов этой группы.

6. Обнаружено, что РШ в вирионах спиральных вирусов растений находится в состоянии с высоким гиперхроыизмом. РШ в спираль.- ' ных вирусах растений резко отличаются по оптической активности (спектрам ОД и ДОВ) друг от друга и от свободных одноцепочечных РШ. Свойства внутри вирусных РШ определяются их взаимодействиями с белком оболочки вириона и природа белка оболочки обусловливает характер оптической активности РНК,

7. УФ-облучение вызывает формирование РНК-белковцх сшивок в ВШ, но одновременно образуются и разрывы цепи внутри вирусной РШ, Разработан подход к определению эффективности образования РШ-белковых сшивок и разрывов цепи PIK в нуклеопротеидах при их одновременном накоплении. При обычном низкоинтенсивном УО-облу-чении ( А = 2Ь4 на, 10 Вт/ц^) BTIi квантовый выход сшивок составляет О.бЬхЮ-5 и выход разрывов - 0,95x10"^.

Q. Из УФ-облученного ВТМ выделен прочно сшитый РНК-белковыД комплекс и показано, что в составе этого комплекса сшиванию■с РШ подвергается не менее двух аыннокислотных остатков белка оболочки ВШ, один из которых входит в состав участка полипептидной цепи 93-99, а другой в состав участка I00-II2.

9. Исследован процесс УФ-инактивации способности РШ ВШ к • самосборке с белком оболочки ВТМ In vitro. Предложен ыогод оцен-• Ш1 функциональной длину участка инициации реконструкции (0_) в составе молекул« PIK EsIU на основания размера иишенн для УФ-шап-

тивации способности к самосборке. Оценка (сверху) длины 0ft, полуденная с помощью этого метода, составляет 76-114 нуклеотидов.

10. Предложена модель механизма самосборки частиц ВТМ ln vltrO из РНК и белка.

Список' использованных сокращений

дцДШ - двуцепочечная ДИК; вфЦНК - внутрифаговая ДШ; S5C-<0,I5M МэСС+ 0,015 11 цитрат Ña , рН 7,0; КД - круговой дихроизм; КР -комбинационное рассеяние; ДОВ - дисперсия оптического вращения; Т°л - температура плавлений; СВР - спиральные вирусы растений; ВТО - вирус табачной мозаики; Х-ВК - Х-вирус картофеля; ВО - вирус огурцов 4; ЩЦ - вирус иозаики долихоса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. А.Т.Дембо, Е.Н.Добров, В.В.Леднев, Т.И.Тихоненко, Л.А.Фей-Г1Ш. Об упаковке ДНК внутри головок бактериофагов ДД7, Т2 и Сд. Биофизика, 1965, IQ, 404-407.

2. Т.И.Тихоненко, А.М.Лысенко, И.Г.Чирагадзе, Е.Н.Добров, Получение, очистка и концентрация бактериофага ДЦ7. Вопросы вирусологии, 1966, »1, 34-38.

3) Т.И.Тихоненко, Е.Н.Добров, Г.А.Великодворская, Н.П.Киселева, В.С.Полканов. Частично-денатуриразанное состояние ДНК в корпускулах'Т2 и Сд фагов. Биофизика, 1966, Ц, 386-397.

4. T.I. Tikhonenko, E.N.Dobrov, G.A. Velikodvorskaya, N.P.Kis-eeleva. Peculiarities of the secondary structure of phage DNA in situ. J. Holec . Biol., 1966 , J_8, 58-67.

5. T.I.Tikhonenko, E.N.Dobrov, A.I.Gorin, N.P.Kisseleva. Investigation of the secondary structure of DNA in situ. Abstr. II Inter-Cong. of Biophysics, Vienna" 1966, No118.

6. Т.И.Тихоненко, Е.Н.Добров. Структура ДНК внутри фагов. IX Ыездународн.Микробиология.Конгресс, Москва, 1966, стр.481.

7. Е.Н.Добров, С.М.Клиыокко, Т.И.Тихоненко. Влияние формальдегида на фаг и внутрй$аговуи ДНК. Биофизика, 1267, 12, 957-967.

8. Г.А.Великодворская, Е.Н.Добров, А.М.Лцсенко, Ю.П.Гофиан, Т.И.Тихоненко. Действие некоторых физических и химических факторов на бактериофаги Т2 и Сд. Acta viroiogica , 1967, Ц,245-251.

9. В.П.Рвачев, С. Г. Гун ей едкий, И.р.Сахновокий, Е.С.Сталинский, Т.И.'Гишшико, Е.Н.Добров. Исследование спектров поглощения фаговых суспензий с помощью интегрального фотометра. Еури.Прикд. Спектроскопии, 1968, g, 844-850.

10. Д.ИЛЛшчеккова, Е.Н.Добров, Р.А.Бехшх, В.И.Иванов. Исдоль-зованиа Ионов си* и дд+для изучения структуры ДНК в фагах. Молок. Баол., 1969,-3, 441-447.

11. ТЛ .Tikhonenko, E.N. Dobrov. peculiarities of the secondary structure of phage DNA in situ. Raaction with formaldehyde. J.Holec. Biol., 1969, 42, 119-132.

12. О.Я,Киселев, Е.Н.Добров. Бзохсмические v.-зтода в вирусологии. "Итога паука. Вирусология IS57-I968" Изд.ВОМТИ, 1970,стр.5-61.

13. Е.Н.Добров, С.В.Куст. Сизктрофотоштраческоа исскедовшша структуры РНК в частицах ВД1. Вопроси вирусологии, 1971, Ш, 366.371.

14. С.В.Куст, Е.Н.Добров, Т.И.Тихонвнко. Исследование структуры РНК в частицах Х-вируса картофеля. Молек.биол., 1972, 42-51.

15. О.С.Клслина, Е.Н.Добров, Т.И.Тихононко. Взаимодействие формальдегида с внутрифаговой ДНК. Вопр.вирусологии, 1972, 05, 634-637.

16. E.N.Dobrov, S.V.Kust, T.I.Tikhonenko. The structure of single-stranded virus RNA in situ. A study of absorption spectra and ORD of THV and PVX. J .Gen .Virol., 1 972, 161-172.

17. Е.Н.Добров, И.А.Андриапвилл, Т.И.Тихонвнко. Изучение кривых ЛОВ фага Сд в растворах низкой ионной силы. Биохимия, 1972, 32, 1088-1090.

18. И.А.Апдриашвили, Е.Н.Добров, Т.И.Тихонвнко. Влияние низкой ионной силы и состава среды на стабильность фага Сд и внут-рпфаговой ДНК. Биохимия, 32, 1251-1259.

19. Е.Н.Добров, Л.А.Маяуль, С.В.Куст, Т.И.Тихонвнко. Изучв- . низ действия этилэнгликоля ю вирусы растений со спиральной сим-иетрией. Молек.биол., 1973, 2< 257-263.

20. Е.Н.Добров, О.С.Кислина, Т.И.Тихонв1шо. Исследование ДОВ ДНК в частицах фагоз Сд п Т2. Биофизика, 1973, 18, 405-410.

21. Е.Н.Добров, С.В.Куст, Л.А.Маяуль, Т.И.Тихонвнко. Изучение структуры РНК в частицах палочковидного вируса огурцов. Биол. науки, 1974, JI2, 96-101.

22. T.I.Tikhonenko, E.N.Dobrov, O.S. Kislina. Peculiarities of the secondary structure of phage DMA in situ. V. Change in CNA conformation inside the phage. Arch.Biochem.Blophys.,1974, 160, 1-T3.

23. Е.Н.Добров, Н.А.Огарева, А.А.Машшш, Т.И.Тихонеяко. 0с-вобоядекие ДНК из фага Сд в видэ комплекса с белком. Вопр.вирусологии, 1975, И, 418-426.

24. Е.Н.Добров, ¡1.А.Огарева, Т.И.Тихонепко. Освобождение ДНК из фага Сд в виде комплекса с белком. Свойства ДНК в составе • комплекса. Вопр.кед.хиготи, 1976, 22, 98-105.

25. E.N.Dobrcv, S.V.Kust, O.A.Yakovleva, T.I.Tikhonenko. Structure of single stranded virus RNA in situ. IX. Optical activity of five TMV-llke viruses and their components. Blochitn.Blophys.Acta, 1977, £75, 623-637.

26. T.I.Tikhonenko, E.N.Dobrov, N.A.Ogareva, A.A.Manykin. Peculiar! Mes of secondary structure of phage DMA In situ. Release of rNA-prot?in сспэ1е>:. Siochim.Blophys.Acta, 1977, 477, 132-143.

27. Е.Н.Добров, С,В.Куст, В.К.Новиков, Т.И.Тиховенко. Дисперсия оптического вращения 5 вирусов группы ВТМ и их компонентов. Ыодек.биол., 1978, 12, 146-152.

28. Т.И.Тихоненко, Е.Н.Добров, Об учете светорассеяния при определении истинного поглощения. Молок.бдод,, 1978, Х£» 518-521.

29. Е.Н.Добров, М.Ше. Структура РНК и ыуклеиново-белковыо взаимодействия в вирусах группы ВТМ, "Ит.ога науки. Енрусодогия" Изд.ВИНИТИ.1978I T2, 7-49.

30. Д.А.Маяулъ, Е.Н.Добров, Т.И.Тихоненко. Прочное связывание РНК с б|лкоы в частицах палочковидного вируса. Биохимия, 1978, '13, 138-145.

. 31. M.Shie, E.N.Dobrov, Т.I.TiKhoncnko. A comparative study of the structure of TMV and CV-4 by laser Raman spectroscopy, Blochen. Blophys. Res. Communs., 1979, 81_, 907-914.

32. М.Ше, Е.Н.Добров. Модель сборки ВТМ in vitro . Молек. биол.,1979, 12, 769-776.

33. H.П.Киселева, И.С.Хромо», С.В.Куст, И.Г.Шеыякин, E.H. Добров.ТИ.Тихоненко. Связывание РНК с белком под дэйствием формальдегида. Природа и специфичность связи. Биохимия, 1981, ¿fi, 2019-2023.

34. Е.Н.Добров, 0.В.Куст, Выделение и оценка качества вирусных препаратов. Выделение и характеристика препаратов белков ji нуклеиновых кислот из вирусных частиц. "Практику« по общей вирусологии" Изд.МГУ, 1981, стр.60-83, 96-114.

35. О.А.Мизенина, Н.Ц.Кио-лвва, А.С.Кафтанова, Е.Н.Добров. Индуцируемое формальдегидом сшвание РНК с белком в небольших рибонуклеопротеидных частицах, реконструированных из белка BTU и фрагментов его РНК. Биохимия, ¿9, 787-796, 1984.

36. Е.Н.Добров, З.Х.Арбаева, С.В.Куст. Образование разрывов цепи РНК и РШ~балкових сшивок при УФ-о¡5лучении ВТМ. "Тезиоц дог<-ладов ХП конференции ФЕБО, Москва, 1984", стр.233.

37. И.А.Андрщшвили, Л.Л.Калацдаришвилц, Е.Н.Добров, А.В.Ка-расев, Т.Г.Чаюизвили. Два типа структурной организации дауспираль-ных ДНК в составе фаговых частиц. Молек.генет.ьщкроб.вирусод., 1985, И, 38-43.

38. А.В.Карасев, Д.Л,Кадандаррщили, И.А.лндриашвнли, E.H. Добров, Структура ВДК в частицах щгаи.бактериофагов по данный кругового дихроизш. Молек.гевот.цзкроб.впрусол., Î985, i>3, 16-18.

30. D. N. N i к о g о s у а п, Л. Л. О г а е v s к у, V. S. L е t о k h о v, Z. Kh. Л r b i e v a. E. N. Dob г о v. Two-step picosecond UV excitation of polynucleotides and energy transfer. Chcinical Physics, 1985, 97, 31—41.

40. E. N. D о b г о v. Z. Kh. A r b i e v a, I. S. Khromov, S. V. Kust. RNA-protein cross-link and RNA chain break formation on UV irradiation of TAW. Photochem. Photobiol., 1986, 43, 493—496.

41. E. N. Dobrov, Z. Kh. Arbieva, B. P. Ulanov, R. O. Esena-1 i о v, D. N. Nikogosyan. Comparative study of low-intensity and high-intensity picosecond laser UV-inactivation of TMV RNA ability to self-assemble with the virus proteir. Photobiochem, Photobiophys., 1986. 13, 115—131.

42. 3. X. A p б и e в а, П. В. К а л м ы к о и, Е. Н. Д о б р о в, Р. О. Ее е-п а л и е п, П. Г. Море в, Д. Н. Ннкогосин. Образование сшивок с белком п разрывов полинуклеотидной цепи РНК ВТМ in situ под действием высчкоинтеисивного пикосекундного лазерного УФ-излучения. Доклады АН СССР, 1986, 292, 227-230.

13. N. V. К a v е г i n, Yu. A. Smirnov, Е. N. Dibrov. The effect of UV irradiation on RNA-containing viruses. Soc. Med. Rev. E. Virol., 1987, 2, 67—88.

44. M. И. Голь д Ш т e ii и, С. В К уст, E. H. Добро в. Различия в механизмах самосборки in vitro ВТМ п Х-ВК. Мол. генет. микроб, вирусол. 1987, № 12, 45—49.

15. А. V. К а г a s е v, Е. N. D о b г о v. Some properties of linear double-stranded DNA in particles of inedium-size bacteriophages. Int. J. Biol. Macro mo!., 1988, 10, 227—237.

46. E. N. Dobrov. J. G. A t a b e k о v. Reconstitution of plant viruses, in „Plant Viruses" ed. C. L. Mandahar, CRC Press, Boca Raton, Fl. USA, 1989. vol. 1, p. 28—59,

.'1-15126 or 12.04.89 г. Заказ 529. Формат 60X84/ie- Тираж 130

Тип. ВАСХНИЛ. Москва, Б. Харитоньевский, 21

/¿i d¿s?

^/o ¿¿¿CCJtk M'é^f