Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура липополисахаридов и избирательная вирулентность возбудителей фоторабдоза

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структура липополисахаридов и избирательная вирулентность возбудителей фоторабдоза"

На правах рукописи

КИРШЕВА НАДЕЖДА АЛЕКСЕЕВНА

СТРУКТУРА Л ИПО ПО ЛИС АХЛРИДО В. И ИЗБИРАТЕЛЬНАЯ ВИРУЛЕНТНОСТЬ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФОТОРАБДОЗА

03.02.03 - микробиология 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оболенск - 2013

005532441

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Дентовская Светлана Владимировна - доктор медицинских наук Книрель Юрий Александрович - доктор химических наук, профессор Официальные оппоненты:

Коломбет Любовь Васильевна - доктор биологических наук, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, заведующий научной частью

Шепеляковская Анна Олеговна - кандидат биологических наук, филиал ФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук, старший научный сотрудник группы иммунохимии

Ведущая организация:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «20» сентября 2013 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу 142279, Московская обл., Серпуховский район, п. Обо-ленск.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «О» 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Род Photorhabdus семейства Enterobacteriaceae включает три вида подвижных биолюминесцентных почвенных грамотрицательных бактерий: Photorhabdus temperata, Photorhabdus luminescens и Photorhabdus asymbiotica. Бактерии всех трех видов - симбионты энтомопатогенных нематод семейства Heterorhabditidae, вместе с которыми вызывают гибель личинок широкого круга насекомых, что способствовало использованию P. luminescens в качестве биоинсектицида(Forst S. et al., 1997), Бактерии P. asymbiotica, в отличие от P. temperata и P. luminescens, патогенны для людей. К настоящему времени в клинической практике зафиксировано 18 случаев инфицирования людей (шесть в США и 12 в Австралии) бактериями P. asymbiotica (Gerrard J.G. et al, 2011). He исключено, что благодаря трудностям при идентификации патогена число заболевших людей значительно выше, чем это отражено в научных публикациях (Gerrard J. et al., 2004). В ряде случаев бактерии P. asymbiotica, выделенные из клинических образцов, расценивали как вторичную микрофлору раневых поверхностей, но не этиологический агент заболевания. Изучение патогенности Photorhabdus spp. до настоящего времени фокусировалось на использовании в качестве экспериментальной модели насекомых (HaUem Е.А. et al., 2007; Khush R.S., Lemaitre В., 2000; Tzou P. et al., 2002; Vodo-var N. et al., 2004), поэтому для изучения фоторабдозачеловеканеобходим подбор адекватных теплокровных модельных лабораторных животных.

Известно, что одним из основных факторов патогенности грамотрицательных бактерий является липополисахарид (ЛПС), а его структура определяет исход взаимодействия патогена с факторами врожденного иммунитета хозяина (Morrison D.C., Ryan J.L., 1987; Raetz C.R., Whitfield С., 2002; Montminy S.W., et al. 2006). Способность представителей рода PAo/orAa6di« эффективно преодолевать врожденный иммунитету насекомых, ав случае P. asymbiotica - и у людей, напоминает таковую у бактерийрода Yersinia-Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica-также патогенных и для насекомых, идля млекопитающих(HeermannR., FuchsT.M., 2008). В то же время установлено, что образование наиболее вирулентного вида рода Yersinia -Y. pestis-сопровождалось существенным изменением структуры ЛПС, в том числе утратой способности синтезировать ЛПС с О-полисахаридной цепью (Skurnik М. et al., 2000). P. Wilkinson et al. (2009) высказали предположение о том, что в ходе инфек-цииу людей может модифицироваться структура ЛПС P. asymbiotica, как это проис-ходиту других грамотрицательных патогенов, способных уклоняться от распознавания иммунной системой млекопитающего. Показано, что представители рода Photorhabdus ситезируют ЛПС в S-форме (Bennett Н.Р. J., Clarke D.J., 2005), включающий О-полисахарид (О-ангиген), олигосахаридную часть (кор) и липид А, однако его структура до настоящей работы не была определена ни у одного из видов, входящих в этот род.

Систематическое структурное исследование ЛПС и изучение биологических свойств бактерий рода Photorhabdus, отличающихся по патогенности для человека, необходимы для выяснения механизмов избирательной вирулентности представителей различных видов Photorhabdus для теплокровного хозяина.

Цель исследования - получение новых сведений о структурной организации липополисахаридов и биологических свойствах бактерий рода Photorhabdus, связанных с патогенностью для человека.

Задачи исследования

1. Создать и охарактеризовать представительную коллекцию штаммов Photorhabdus spp.

2 Определить структуру ЛПС представителей различных видов и подвидов рода Photorhabdus и оценить характер влияния температуры выращивания штаммов Photorhabdus spp. на структуру ЛПС.

3. Сравнить биологические свойства штаммов Photorhabdus spp., отличающихся по патогенности для человека (вирулентность для мышей, устойчивость к катионным антимикробным пептидам и комплементу сыворотки крови, эндоток-сическую активность ЛПС).

Научная новизна

Впервые установлены структуры О-полисахаридов рода Photorhabdus. В их составе обнаружены редко встречающиеся компоненты: D-глицеро-О-манно-гептозаиЗ.б-дидезокси-З-формамидо-О-глюкозавР. luminescens, 2-ацетамидо-4-амино-2,4,6-тридезокси-Г>-галактозаи 2-аминоэтилфосфатное производное N-ацетил-Г)-галактозамина в P. temperata. Особенностью О-полисахаридов P. asymbiotica является присутствие необычного А^-ацильного заместителя 2,4-диамино-2,4,6-тридезоксиглюкозы (Qui4N) - iV-формилглицила, который ранее не был обнаружен в бактериальных полисахаридах.

Впервые определена структура центрального олигосахарида (кора) ЛПС представителей трех видов рода Photorhabdus и обнаружено влияние температуры культивирования бактерий на содержание Ъ-глицеро-ХУ-манно-тътозы и степень фосфорилирования кора. Получены первые данные о степени ацилирования ли-пида A Photorhabdus spp., позволившие обосновать одинаковую эндотоксическую активность in vivo препаратов ЛПС P. asymbiotica и P. luminescens с одной стороны и Y. pestis с другой стороны.

Впервые показано, что штаммы Р. asymbiotica и Р. luminescens, в отличие от штаммов Р. temperata, патогенны для лабораторных мышей, и определены величины LD50 для мышей BALB/c представителей двух подвидов - Р. asymbiotica subsp. asymbiotica и subsp. australis. Выявлена гетерогенность представителей трех видов Photorhabdus spp. по устойчивости к антимикробным катионным пептидам и комплементу нормальной человеческой сыворотки.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные фундаментальные сведения о тонком строении ЛПС Photorhabdus spp. открывают путь для функциональной характеристики и оценки биологической роли отдельных генов их биосинтеза. Обнаруженное структурное разнообразие О-полисахаридов Photorhabdus spp. при низком разнообразии структур Р. asymbiotica на уровне подвидов имеют значение для уточнения таксономического положения изученных бактерий. Выявленное сходство О-полисахаридов Р. asymbiotica и таксо-номически отдаленных микроорганизмов, включая Shigella dysenteriae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio anguillarum, Francisella tularensis и

Francisella novicida, проливает свет на эволюционную историю О-антигенов гра-мотрицательных бактерий. Продемонстрированное на мышиной модели соответствие Р. дау/л6/о/г'сатретьему и четвертому постулатам Генле-Коха (Koch R., 1882) окончательно доказываетэтиологическую роль этих бактерий в развитии фотораб-доза теплокровных животных.

Создана и охарактеризована коллекция из 23 штаммов Photorhabdus spp., включающая штаммы, относящиеся к различным внутривидовым группам P. asymbiotica - возбудителя нового инфекционного заболевания человека - фо-торабдоза. В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п. Оболенск, Московская обл.) депонировано 23 штамма Photorhabdus spp. (федеральный уровень внедрения).

В базе данных Bacterial Carbohydrate Structure DataBase version 3 DELTA (http://csdb.glycoscience.ru/bacterial/) депонировано 3 структуры молекул ЛПС Photorhabdus spp. Номера доступа к структурам (Structure IDs): 26852, 26853, 26854 (международный уровень внедрения). (4 цитирования по данным Web of Science® на 13.07.2013 г.).

Выявленные структурные особенности О-полисахаридных цепей ЛПС бактерий Photorhabdus spp. могут послужить основой для серологического тапиров а-ния этих бактерий. Выделенные из штаммов Photorhabdus spp. препараты ЛПС в настоящее время применяются в иммунологических исследованиях в отделе им-мунобиохимии патогенных микроорганизмов ФБУН ГНЦ ПМБ (п. Оболенск, Московская обл.).

Разработанная мышиная модель фоторабдоза может быть использована для изучения формированияитеченияэкспериментальной фоторабдозной инфекции, а также создания эффективных схем антимикробной терапии заболевания.

Материалы диссертации используются в лекциях для аспирантов ФБУН ГНЦ ПМБ.

Методология и методы исследования

В исследовании использовались экспериментальные методы: микробиологические, биологические, биохимические, методы аналитической химии углеводов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Установленные структуры О-полисахаридов (О-антигенов) энтеробактерий родаР/х^огЛаЬсЛмиидентифицированныев их составе компоненты, редко встречающиеся в бактериальных полисахаридах, являются потенциальной основой для разработки схемы серотипирования бактерий этого рода.

2 P. asymbiotica соответствует всем четырем постулатам Генле-Коха и является этиологической причиной развития фоторабдоза теплокровных животных, а мыши линии BALB/c - адекватная модель для воспроизведения фоторабдоза человека

3. Бактерии P. luminescens subsp. laumondii при подкожном введении в высокой дозе способны воспроизводить клиническую картину фоторабдоза, не вызывая гибели мышей линии BALB/c.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты исследования получены с использованием современного поверенного и сертифицированного оборудования с привлечением статистических методов обработки данных.

Основные положения диссертационной работы представлены на II Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (25-27 мая 2010 г., Оболенск, Московская обл.); 4th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (19-22 сентября 2010 г., Финляндия); III Ежегодном всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (28-30 марта 2011 г., Москва); III Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности»

(31 мая-2июня 2011 г., Оболенск, Московская обл.); 5lh Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (2-6 сентября 2012 г., Суздаль).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены назаседании Ученого совета ФБУН ГНЦПМБ от28 января2010 г. (протокол№ 1, приказ№ 14от 04 февраля 2010 г.) с изменениями, утвержденными на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ от 15 марта 2013 г. (протокол№3). Результаты исследований доложены назаседании межлабораторного научного семинара ФБУН ГНЦПМБ (протокол № 29 от 29 апреля 2013 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе три статьи в рецензируемых изданиях (из них одна- в отечественном, две - в международном) и пять работ - в материалах конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, три главы результатов исследований с их обсуждением, заключение, выводы и список

использован ных источников, включающий 11 раб от отечественныхи 219 зарубежных

авторов. Работаиллюстрирована 15 рисункамии 12таблицами. Приложения состоят из двух статей, опубликованных по теме диссертации.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалы

Объектами исследования служили 23 uiwMMaPhotorhabdus spp. (пять штаммов P. temperata, шесть - P. luminescens и 12 - P. asymbiolica), один штамм К pseudotuberculosis и один штамм Е. coli, полученные из коллекций Университета Монпелье (Франция), Ирландского национального университета (Корк, Ирландия) и

«ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦПМБ, а также мыши нелинейные породы Swiss Webster и линейные: BALB/c, C57BL/6, СВА и C3H/HeN (19 ± 2) г.

Микробиологические методы

Бактерии выращивали на жидких или плотных питательных средах Luria-Bertani (LB) и Хотгингера. Для выделения ЛПС штаммы выращивали с аэрацией при температурах28 °С или 37 °С в фермеш-epeNew Brunswick Scientific с рабочим объемом 5 л в жидкой среде LB при pH 7,1. Основные морфологические, культуральные и биохимические свойстваполученных штаммов Photorhabdus spp. оценивали, как описано ранее (Givaudan А. et al., 1995; Farmer J.J. et al., 1989). Чувствительность

штаммов Photorhabdus s pp. к антибиотикам определяли методом дисков (Руководство по профилактике чумы, 1972). Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) полимиксина В (РМВ) (AppliChem GmbH, Germany) проводили, как описано ранее (Hitchen P.G. et al., 2002). Бактерицидные свойства сывороток изучали по опубликованному протоколу (Barnes M.G. et al,. 2001).

Биохимические и аналитические методы

Препараты ЛПС из сухой бактериальной массы штаммов Photorhabdus spp. выделяли методом экстракции горячим водным фенолом (Westphal О., Jann К., 1965) и очищали последовательным ферментативным расщеплением нуклеиновых кислот и белков с повторным ультрацентрифугированием (105000 х g, 4 ч). Очищенные препараты ЛПС лиофилизировали. Содержание белка в препаратах ЛПС оценивали методом гель-электрофореза, а присутствие нуклеиновых кислот определяли, как описано ранее (Knirel Y. A. et al., 2005).

Мягким кислотным гидролизом ЛПС разделяли на углеводную и липидную компоненты. Углеводную часть (О-полисахарид, коровый олигосахарид или кор с

присоединенным повторяющимся звеном О-полисахарида) фракционировали коло-ночнойхроматографией на геле Sephadex G-50. Липидную часть (липид А) после отделения центрифугированием очищали от фосфолипидов экстракцией смесью хлороформ-метанол. Состав липида А изучали методом жирнокислотного анализа (ГЖХ метиловыхэфиров, ав случае гидроксикислот - их триметилсилильных производных), а состав олигосахарида кора и О-полисахаридов - с помощью моносаха-ридного анализа (ГЖХ ацетилированных полиолов).

Установление строения выделенных низкомолекулярных компонентов (кора и липида А) проводили с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения с ионизацией электрораспылением (Knirel Y.A. et al., 2005). Для установления полной структуры кора и О-полисахаридов использовали одномерную и двумерную спектроскопию ЯМРвысокогоразрешениянаядрах 'Н, 13С и 3 Р (Kondakova A.N. et al., 2010,2011). Сигналы в спектрахЯМР О-полисахаридов были отнесены с помощью двумерной корреляционной спектроскопии 'Н, 'Н COS Y (Correlation Spectroscopy), TOCSYCTOtal Correlation Spectroscopy), ROESY (Rotating-frame nuclear Оverhauser Effect Spectroscopy, спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат), 'H,I3CHSQC (Heteronuclear Single-Quantum Coherence, гетеро-ядерная однокванговая корреляционная спектроскопия) и НМВС (Heteronuclear Multiple Bonds Correlation, гетероядерная корреляция через несколько связей).

Биологические и гистологические методы

Летальную токсичность препаратов ЛПС определялититрованием на актиноми-цин Д-сенсибилизированных мышах (Дентовская C.B. и др., 2008).

Оценку вирулешности проводили на мышах линий BALB/c, C57BL/6, СВА, СЗН/HeN и беспородных белых мышах при подкожном (п/к) и внугрибрюшинном (в/б) введении десятикратных разведений (от Ю8КОЕ до 1КОЕ) 2&-грацусных культур Photorhabdus spp. в изотоническом растворе NaCI в объеме 0,2 мл на животное (по четыре животных в группе). Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 суг. Погибших в ходе эксперимента и умерщвленных после его завершения животных вскрывали, органы и ткани подвергали бактериологическому исследованию.

Препараты для гистологических исследований готовили, как описано ранее (Меркулов Г.А., 1969). Парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали раствором гематоксилин-эозина (Лили Р., 1969) и микроскопировали под иммерсией в проходящем свете.

Статистическая обработка результатов и программное обеспечение

Математическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерной программы Excel для Wkidows версии 2010, рассчтывая среднюю арифметическую, стандартную ошибку средней арифметической, доверительный интервал. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием критерия Стьюдеша (р<0,05). При определении эвдотоксической акшвности препаратов ЛПС и вирулешноста штаммов вычисление величин LD50, а также доверительных интервалов (для вероятности 95 %) проводили по методу Kärber в модификации И.П. Ашмарина и A.A. Воробьева (Ашмарин И.П., Воробьев АЛ., 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Создание и характеристика рабочей коллекции представителей Photorhabdus spp.

В рамках настоящей диссертационной работы создана коллекция, состоящая из 23 штаммов Photorhabdus spp., принадлежащих к видам asymbiotica, temperata и luminescens. Набор штаммов P. asymbiotica включает два подвида- subsp. asymbiotica (US87, US86, US77, US88) и subsp. australis (AU97, AU92, AU88, AU81, AU46, AU36), а также группу штаммов Р. asymbiotica (0nlr40, CbKjl63), вьщеленных в Японии, подви-довая принадлежность которых в настоящее время не определена. По данным R. Kuvrata et al. (2008) они занимают промежуточное положение между подвидами australis и asymbiotica. Из пяти штаммов Р. temperata три принадлежат к subsp. cinerea (3240, 3107т, 3014) и два к subsp. temperata (К122, XNxhT). Ввд P. luminescens представлен штаммом P. luminescens subsp. laumondii TT01 и его производными с мутациями в генах биосинтеза ЛПС (TT01#28F4, TT01#6D10, ТТ01#6Е10), а также штаммами P. luminescens subsp. luminescens HbT и P. luminescens subsp. ahhurstii FRG04.

Основные морфологические, культуральные и биохимические свойства полученных штаммов Photorhabdus spp. соответствовали данным, используемым для определения видовой принадлежности представителей рода Photorhabdus. Согласно полученным результатам культуры Photorhabdus spp. оказались высокочувствительными к широкому спектру антимикробных препаратов активных против грамотри-цательных бактерий, включая карбапенемы группы ß-лактамов, тетрациклины, ам-фениколы, фторхинолоны, аминогликозиды. Большинство изолятов были слабочувствительными к макролидам и устойчивыми к линкозамидам. Учитывая спектр лекарственной устойчивости имеющихся в нашем распоряжении штаммов, практикующим врачам при лечении фоторабдоза необходимо уделять внимание выбору эффективных терапевтических антибактериальных препаратов.

Для получения препаративных количеств ЛПС из штаммов Phota-habdus spp. с целью определения химической структуры требуются значительные количества сухой биомассы, выращенной в стандартных условиях. Поэтому для культивирования штаммов Photorhabdus spp. при температуре 28 °С и одного штамма, Р. asymbiotica subsp.

asymbiotica US77 при температурах 28 °С и 37 °С в настоящем исследовании впервые использовали лабораторный ферментер New Brunswick Scientific BioFb 110 с рабочим объемом реактора 5 л. Все исследованные культуры Photorhabdus независимо от вида показывали сходную динамику роста с переходом к стационарной фазе через 8-10 ч от начала ферментации- Одна ферментация позволяла получить от 3,5 т до 11,0 г сухой биомассы и от 35 мг до 151 мгЛПС после экстракции, очистки и лиофилизации.

Химическая структура ЛПС представителей Photorhabdus spp.

Элекгрофоретичсское разделение препаратов ЛПС, выделенных из штаммов Р. asymbiotica по методу Р. Htchcock и Т. Brown (1983), показано характерную картину «лесенки» полос ЛПС, соответствующих молекулам с высокомолекулярным О-полисахаридом различной длины (рис. 1), что позволило в качестве способа выделения препаративных количеств ЛПС выбрать метод экстракции горячим водным фенолом (WestphalO., JannK., 1965).

Рисунок 1 - Электрофоретическое разделение препаратов ЛПС Р. asymbiotica в 15 % полиакриламидномгелес додецилсульфатнатрия (ДСП). Окрашивание по методу С.М. Tsai и С.Е. Frash (1982).

Треки представляют ЛПС из штаммов: 1 - US88; 2 - US87; 3 - US77; 4 - US86; 5 - AU36; 6 - AU46; 7 - AU81; 8 - AU88; 9 - AU92; 10 - AU97

Определенные впервые структуры О—полисахаридов патогенных для человека бактерий Р. asymbiotica subsp. asymbiotica и subsp. australis, а также Р. luminescens subsp. laumondii и Р. temperata subsp. cinerea и subsp. temperata приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Структуры О-полисахаридов бактерий рода Р1ю1ог11аЬ(1и$, установленные в настоящей работе

Штамм Структура О-полисахарида

Р. инутЪ 'юИса эиЬзр. агШга/к АШ6 ->3)-р-1>ди1о4КтС1уРо-( 1->4)-а-1>СфШсЛ-( 1 -М}<н>Са|рКАс А-( 1 -*Зуа-о<}иртс-( 1 -> 3 6 ОАс Ш2

Р. акутЬюйса эиЬзр. аяутЫойса иБ87 ->3>р-1>Ои1г*М31уРо-( 1 -И^сяКЗа^Ас А-( 1 ^4>а-1>СфЫАсА-( 1 ^3>а-1>ОирНАс-( 1 3 6 3 1 1 1 ОАс Ш2 ОАс

Р. 1итте$сет зиЬэр. 1аитопс1И ттоГ -^2)-р-ооНерр-(1-+3)-р-о-Оа|р-(1—>3)-а-о-С1с^Ас-(1—>-3)-р-о-01срМАс-(1—> 3 Т 1 а-Б-рирЗЫРо

Р. /етрегШа эиЬэр. стегеа 3240 ^3)-Р-0-Рис/;НАс4Ы-(1^4)-р-0-01с/;А-(1^3)-Р-0-0а1рНАс4РЕ(Ж1^

Р. 1етрга!а зиЬвр. 1етрега1а Х1№сНт —>2)-а-Е)-Мап/?-(1—>3)-р-В-Оа1/?-(1—>3)-а-Б-Оа]рЫАс-(1^ 4 т 1 а-3,6с1Нех/740Ме-(1->6)-а-В-01с/7

Принятые сокращения: ОаПЧАсА - 2—ацетамидо-2-дезоксигалактуроновая кислота, С^иПЧАс — 2—ацетамидо—2,6-дидезоксиглюкоза, (}1ф4№о - 4,6-дидезокси-4—формиламино глюкоза, ()ш4К01уРо - 4,6-дидезокси-4—(Л'-формилглицил)аминоглюкоза, ОЭНер - О-глицеро-ТУ-манно-гетпоза, Qu¡ЗNFo - 3,6-дидезокси-3-формамидоглюкоза, РисКАс4М - 2-ацетамидо-4—амино-2,4,6-тридезоксигалактоза, В-Са[МАс4/5Е1Ы - 2-аминоэтилфосфатное производное N— ацетилгалактозамина, 3,6с1Нех40Ме - 3,6-дидезокси-4-Ометил-ксшо-гексоза (колитоза или абеквоза).

Изученные О-полисахариды представляют собой гетерополисахариды, построенные из линейных или разветвленных повторяющихся звеньев, размер которых варьируется от трисахарида до пентасахарида.

Проведенное исследование выявило идентичность полисахаридных структур внутри двух подвидов (asymbiotica и australis) вида P. asymbiotica. Единственное отличие заключалось в повышенной степени О-ацетилирования О-полисахаридов у штаммов subsp. asymbiotica. Особенностью установленных структур О-полисахаридных цепей представителей вида P. asymbiotica являлась природа N-ацильногозаместителя Qui4N-AMj)opMnnrnnuHna, который до настоящего времени не был обнаружен в качестве заместителя данного или другого аминосахара в составе бактериальных полисахаридов.

Установлено, что О-полисахариды P. asymbiotica имеют сходное строение с полисахаридами отдаленных в таксономическом отношении бактерий: Sh. dysenteriae type 7 (Knirel Y.A. et al., 1988), E. coli 0121 (Parolis H. etal., 1997), P. aeruginosa Об (Knirel Y.A. et al., 2006), V. anguillarum (EguchiH. et al., 1992), F. tularensis (VinogradovE.V. etal., 1991)иF. novicida(VinogradovE. et al., 2004). Все они содержат дисахарице различными 1—»4-замещенными производными а-D-GaINA, прикрепленными к ЛГ-ацетил-ЕЪгексозамину (D-GlcNAc, D-QuiNAc или 2,4-диацетамидо-2,4,6-трвдезокси-Е>-глюкоза) в положение 3. При этом наибольшим сходством обладали О-полисахариды P. asymbiotica и F. tularensis, различие между которымизаключалисьв природеЛ'-ацильногозаместителя С2ш4Ы(формил или фор-милглицил);типе связи между повторяющимисязвеньями(Р-1—»2или а-1—»3); ами-нировании одного или обоих остатков GalNAcA и присутствии или отсутствии О-ацетильныхгрупп. Ранее было продемонстрировано, что наличие TV-формильной группы на Qui4N - концевом остатке повторяющегося звена- необходимо для синтеза ЛПС с длинной полисахаридной цепью у вакцинного штамма F. tularensis 15. Биологическая роль О-полисахаридных цепей ЛПС P. asymbiotica и А'-формилглицина как их специфического компонента требует дальнейшего изучения.

В составе О-полисахарида/5. luminescens subsp. laumondii ТТ01т (табл. 1) обнаружены два редко встречающихся в бактериальных полисахаридах компонента: D-глицеро-О-манно-гетпоза (ГОНер) и 3,6-дидезокси-3-формамидо-Г>-глюкоза (D-Qui3NFo). DDHep ранее находили в О-специфических полисахаридах бактерий Plesiomonas shigelloides (Czaja J. etal., 2000) и Vibrio cholerae (Chowdhury T.A. etal., 1991; Ansari A.A. et al., 1986), атакже в коре ЛПС различных бактерий. D-Qui3NFo до настоящей работы была обнаружена только однажды - в О-полисахариде Hafnia alvei 1204 (Katzenellenbogen Е. etal, 1995). Расположение одного из этих необычных компонентов, а именно a-D-Quip3NFo, в боковой цепи О-специфического полисахарида делает его наиболее доступным для клеток иммунной системы и антител, что позволяет предположить его доминирующий вклад в иммуноспеци-фичность P. luminescens subsp. laumondii ТТ01т.

В составе О-полисахарида P. temperata subsp. cinerea 3240 обнаружен еще один редко встречающийся аминосахар - 2-ацетамидо-4-амино-2,4,6-тридезокси-1>-галактоза (D-FucNAc4N), а также 2-аминоэтилфосфатное производное Аг-ацетил-1>-галактозамина (D-GaINAc4PEtN). Так же как и структура О-

специфического полисахарида Р. luminescens, приведенная выше, эта структура является уникальной среди известных структур бактериальных углеводов. Благодаря одновременному присутствию кислотных функций (фосфатной группы и карбоксильной группы глюкуроновой кислоты) и основных функций (аминогрупп FucNAc4N и этаноламина) этот О-полисахарид имеет цвитгерионный характер.

В составе пентасахаридного повторяющегося звена О-полисахарида штамма Р. temprata subsp. temperata XINach7 обнаружен новый компонент полисахаридов- 3,6-дидез о кс и-4-О-метил-ксило-гекс оз а (колитоза или абеквоза, 3,6dHex40Me). Полисахарид имеет разветвленную структуру с боковым дисаха-ридным ответвлением.

Строение кора ЛПС изучали в штаммах дикого типа всех трех видов рода Photorhabdus, а также в мутантных штаммах Р. luminescens и культурах Р. asymbiotica, выращенных при различных температурах (28 °С или 37 °С). При температуре 28 °С основной олигосахарид с полным углеводным скелетом из штамма Р. asymbiotica subsp. australis AU46 имел по данным масс-спектра молекулярную массу 2139,641 Да и состав, показанный в таблице 2. Остальные оли-госахариды этой же гликоформы содержали на один остаток фосфоэтаноламина (PEtN) больше или меньше, а в других гликоформах остаток гексозы заменен остатком гексозамина или отсутствуют один или два остатка гептозы или два остатка гептозы и один остаток гексозамина.

Детальное исследование строения основного олигосахарида Р. asymbiotica AU46 с помощью двумерной ЯМР-спектроскопии позволило установить следующую структуру углеводного скелета: ß-GaINAc-(W5)-(15)-GaloNAc-(l-»4,6)-a-

GaIN-(l—»4)-[a-DDHep-(l—>-2)]-a-GalA-(l—>-3)-[а-Нер-(1—♦7)]-а-Нер-(1—»-3)-tP-Glc-

(l-»4)]-a-Hep-(l->5)-Kdo, где Hep - h-глицеро-ТУ-манио-т&тозa, Kdo - 3-дез о кс n-D-манно-о кт-2-улозо но вя кислота. Остаток Kdo нестехиометрически замещен остатком 4-амино-4-дезокси-Ь-арабинозы (Ara4N). Положение PEtN-групп устанавливается.

Основная гликоформа кора Р. asymbiotica subsp. asymbiotica US77 имела молекулярную массу 1906,547 Да и состав, показанный в таблице 2. Наряду с ней присутствовали также гликоформы, содержащие на один остаток гептозы больше или меньше.

Такой же углеводный скелет, что и у Р. asymbiotica subsp. australis AU46, имел кор ЛПС Р. temperata subsp. cinerea 3240 (табл. 2), отличающийся присутствием дополнительной фосфатной группы. У этой бактерии обнаружена также укороченная гликоформа кора, лишенная одного из остатков гептозы.

Углеводная структура внутренней области кора Р. asymbiotica subsp. australis AU46 и Р. temperata subsp. cinerea 3240 с одной стороны и всех бактерий pomProteus с другой стороны сходны между собой: они включают общий гексасахаридный фрагмент a-GalA-(l-»3)-[a-Hep-(l-*2)-]-a-Hep-(l-*3)-[ß-Glc-(1—»4)]-a-Hep-(l—>-5)-Kdo, однако у бактерий Proteus spp. остаток GalA не замещен остатком DDHep, как это происходит у бактерий Photorhabdus spp. Особенностью внешних областей кора Photorhabdus spp. и некоторых штаммов Proteus spp. является присутствие остатка GalNAc в открытой (нециклической)

форме (GaloNAc), присоединенного к остатку гексозамина со свободной аминогруппой.

Таблица 2 - Химическая структура кора бактерий рода Photorhabdus

Подвид Штамм Структура основного олигосахарида*

P. asymbiotica

subsp. australis AU46 Kdo,Hep4HexA,Hex1HexN1HexNAc2l)EtN2

subsp. asymbiotica US77 Kdo,DDHep1Hep2HexA|Hex1HexN|HexNAc1PEtN2

P. temperata

subsp. cinerea 3240 Kdo, Нер4НехА, Hex, HexN, HexNAc2l'fctN2

P. luminescens

subsp. laumondii таг Kdo, Hep2HexA[Hex2HexN 1HexNAc,l'1l'fctN2

subp. lumninescens Hb' Kdo, Hep4HexA2HexN, HexNAc ,PenN! Lys, Gly,

subp. akhurstii FRG04 Kdo1Hep4HexA1HexiPenNiPiPEtN3

a При температуре выращивания 28 °C.

Основной олигосахарид кора из P. luminescens subsp. laumondii ТТ01т имел молекулярную массу 1794,465 Дай состав, приведенный в таблице 2. Он является укороченным по сравнению с кором P. asymbiotica subsp. australis AU46, остаток HexNAc заменен в нем остатком Hex, и он имеет дополнительную фосфатную группу. По предварительным данным его углеводный скелет обладает следующей структурой: a-Gal-(l—►5)-(lS)-GaloNAc-(l—>4,6)-a-GaIN-(l—>-4)-a-GalA-(l—»-3)-а-Hep-(1—*3)-[P-Glc-(l—>4)]-а-Нер-(1—>5)-Kdo.

Отличительной особенностью кора липополисахарида P. luminescens subp. lumninescens HbT является присутствие аминокислот Lys и Gly. Наиболее полная гликоформакора показана в таблице 2. Присутствуют также гликоформы, лишенные остатка HexNAc, остатка Lys или обеих аминокислот одновременно. Наиболее полная гликоформа P. luminescens subp. akhurstii FRG04 имела состав, приведенный в таблице 2.

Изучение влияния температуры выращивания на строение кора P. asymbiotica subsp. asymbiotica US77 показало, что при 37 °С основная гликоформа кора имеет молекулярную массу 1794,444 Да и состав

Kdo^epzHexA^eXjHexl^HexNAc^PEtNj такой же, как у бактерии P. luminescens subsp. laumondiiTTOl7 (табл. 2). Наряду с ней присутствовали оли-госахариды с пониженным содержанием фосфата и фосфоэтаноламина, а также гликоформа, содержащая на один остаток DDHep больше. Таким образом, с повышением температуры в коре снижается содержание DDHep и одновременно повышается степень фосфорилирования.

В мутантных штаммах P. luminescens subsp. laumondii ТТ01#6Е10 и P. luminescens subsp. laumondii TT01#6D10 наблюдали существенное укорочение кора. В штамме ТТ01#6 ЕЮ кор ограничен только внутренней областью с различной степенью достройки. При кислотной деградации ЛПС получены олигосаха-

риды следующего состава: Кёо,Нер2, КсІОіНергРЕіМь КсЬ,Нер2Нехь Кс1о,Нер2РЕ1Ы2, Кс^НергНех.РЕМ, и КсІО,Нер2Нех,РЕі^. В интактном ЛПС основная форма кора имеет состав Кс^НергНех^Ы,. В штамме ТТ01#6010 основная форма кора имеет состав К^НергНехА.Нехї^Нех^РЕїН,. Его углеводный скелет имеет следующую структуру, представляющую собой общий фрагмент коров всех видов РИоШіїаЬсІт-. а-Оа1Ы-(1->4)-а-Са1А-(1->3)-а-Нер-(1-»3)-[Р-аіс-(1-»4)]-а-Нер-(1-*5)-Кс1о.

Для мутантных штаммов Р. Іитіпезсст ТТ01#бЭ10 и ТТ01#6Е10 были получены предварительные данные по строению липида А. В обоих штаммах присутствовали пента- и гексаацильные формы липида А. Доминирующей была гексаа-цильная форма состава С1сМ2Р2(ЗН014:0)4(14:0),(12:0)ь характерная для липида А многих энтеробактерий, включая кишечную палочку. Однако у бактерий РИоЮгИаЬ^Б эрр. липид А отличается высокой степенью гетерогенности вследствие необычного присутствия жирных кислот с нечетным числом атомов углерода, а также замены кислоты ЗН014:0 на ЗН012:0, 12:0 на 14:0 и 14:0 на 16:0. Проводится более детальное изучение структуры липида А Рко^гкаЪйш врр.

Биологические свойства РНоШкаЬйю врр., связанные с патогенностью

В настоящем разделе нашего исследования приведены результаты изучения эндотоксической активности, устойчивости к антимикробным пептидам и чувствительности к сыворотке крови представителей РИоІогкаЬсіш Брр., отличающихся по патогенносте для человека и географическому происхождению.

Эндотоксическую активность препаратов ЛПС из штаммов Рко1огЪаЪ<1и8 врр., выращенных при температуре 28 °С, оценивали по способности вызывать гибель мышей линии ВАЬВ/с, сенсибилизированных к эффектам ЛПС актиноми-цином Д (10 мкг/мышь), при внутрибрюшинном (в/б) введении (табл. 3).

Таблица 3 - Токсичность препаратов ЛПС, выделенных из штаммов РНоШНаЪйиз 5рр., для актиномицин Д-сенсибилизированных мышей

Источник ЛПС ьб50, мкг"

Р. аяутЫоИса БиЬэр. АШ6 250 (62,8-395,3)

Р. а^тЫоИса эиЬзр. ахутЫойса иЭ77 65(20-515)

Р. аїутЬіоИса БиЬзр. аяутЬШса\}$?>6 435 (137,6-1732,9)

Р. Іитїпехсет йиЬэр. 1аитопсШТТ0\' 170 (разброс слишком велик)

У рюіи КМ260(11) 89 (28-894)

У7. шіагемія 15/10 > 1000,00

" Доверительный интервал для вероятности 95 % указан в круглых скоЬках.

Присутствие в препаратах ЛПС, выделенных из 28-градусных культур, пента- и гексаацильных форм липида А при доминирующем характере гексаациль-ной формы состава С1сЫ2Р2(ЗН014:0)4(14:0),(12:0)1, характерной для липида А многих энтеробактерий, включая кишечную палочку, объясняет полученные нами результаты по высокойтоксичносги препаратов ЛПС Р. азутЬШка эиЬзр. аихКа-

lis, P. asymbiotlca subsp. asymbiotica и P. luminescens subsp. laumondii, сопоставимой с токсичностью ЛПС из 28-градусных культур У. pestis.

Для успешной колонизации и дальнейшего развития инфекции патогену необходимо противостоять внутренним защитным механизмам хозяина (Fin-lay В.В., Falkow S., 1997). Один из видов такой защиты млекопитающих и насекомых - продукция катионных антимикробных пептидов (Choi К.Y. et al., 2012). Подавляющее большинство «диких» штаммов Photorhabdus spp., выращенных при температуре 28 "С, оказались высокоустойчивы к бактерицидной активности РМВ (табл. 4). Только три штамма: один патогенный для людей, P. asymbiotica subsp. asymbiotica US77, и два непатогенных - P. luminescens subsp. luminescens HbT и subsp. akhurstii FRG04- были чувствительны к РМВ при данной температуре культивирования. Нами высказано предположение, что устойчивость к поли-миксину В «диких» штаммов возбудителя, выращенных при температуре 28 °С (имитация пребывания бактерий в организме нематод и личинок насекомых) и относящихся к P. asymbiotica subsp. australis и subsp. asymbiotica, P. temperata subsp. cinerea и subsp. temperata и P. luminescens subsp. laumondii, как и у других энтеробактерий, связана с содержанием катионного компонента - Ara4N, присоединенного к фосфатным группам липида А, а также с наличием О-антигена и наружной области кора.

Устойчивость штаммов к бактерицидному действию сыворотки - одно из важ-нейшихусловий, необходимых для выживания и роста патогена в организме млекопитающих (Nolan L.K. et al., 2003). P. Wilkinson et al. (2008) впервые установили, что штамм P. asymbiotica subsp. asymbiotica\JS77 способен расти в Присутствии нормальной человеческой сыворотки. Мы изучили влияние комплемента НЧС на жизнеспособность 20 штаммов Photorhabdus spp., принадлежащих к различным видовым/внутривидовым группам. Все 12 штаммов P. asymbiotica переживали действие комплемента НЧС, лишь у двух из них-0п1г40 и CbKjl63, выделенных отэнтомопа-тогенных нематод H. indica в Японии, наблюдалось двукратное снижение жизнеспособности клеток в процессе инкубации с НЧС по сравнению с инкубацией в тНЧС. «Дикие» штаммы другою вида-P. luminescens также обладали устойчивостью к действию сыворотки. Из пяти исследованных культур P. temperata у сто йч ив о стью обладал штамм P. temperata subsp. cinerea 3107т, у двух штаммов жизнеспособность снижалась на 2-3 порядка, а бактерии Р. temperata subsp. cinerea 3240 и 3014 полностью гибли после инкубации с НЧС.

Известно, что в случае Burkholderiapseudomallei присутствие капсульного поли-сахариданеобходимо для предотвращения связывания СЗЬ компонента комплемента с клеточной поверхностью (Reckseidler-Zenteno S.L. etal., 2005). Возможно, что в случае P. asymbiotica феномен капсулообразования способен защитить микроорганизм от киллинга системой комплемента. Кроме того, в геноме штамма P. asymbiotica subsp. asymbiotica\JS17 обнаружен гомолог гена, кодирующего белок внешней мембраны Ail (OmpX) (Wilkinson P. et al., 2009), обеспечивающего устойчивость к сыворотке представителей рода Yersinia (Bartra S.S. et al., 2008). Установлено, что О-антиген играет главную роль в вирулентности таких грамотрицательных бактерий, как£. coli,Shigellaspp.,Klebsiellaspp.Y. enterocolitis и Salmonella spp., обеспечивая

устойчивость к комплеменіу и фагоцитозу (Bengoechea J. A. et al., 2004; Burns S.M. et al., 1998; Cortes G. etal., 2002; Murray G,L. etal., 2003). Однако, для установления роли капсулы, белка Ail или О-антигена в способности/5, asymbiotica расти в человеческой сыворотке необходим сайт-направленный мутагенез указанных генетических локусов с последующей их комплементацией.

Таблица 4 - Чувствительность штаммов РкЫоткаЬсШз врр. к бактерицидной активности полимиксина В и комплемента нормальной человеческой сыворотки____

Подвид Штамм МПК PMB (мкг/мл) Lg КОЕ/мл" жизнеспособных клеток после инкубации в:

НЧС тНЧС

P. asymbiotica

AU97 >3000 5,89 ±0,18 6,98 ±0,13

AU92 >3000 6,25 ± 0,22 7,10 ±0,16

australis AU88 >3000 6,35 ± 0,33 7,37 ± 0,36

AU81 >3000 6,20 ±0,19 7,20 ± 0,29

AU46 >3000 5,33 ± 0,34 6,39 ±0,14

AU36 >3000 5,99 ±0,02 6,96 ±0,13

US87 >3000 5,76 ±0,18 6,87 ± 0,05

asymbiotica US77 1,25 5,91 ±0,15 6,79 ± 0,08

US88 >3000 4,95 ±0,15 5,56 ± 0,34

US86 >3000 5,70 ± 0,21 6,30 ±0,16

0nlr40 >3000 4,62 ±0,18 6,40 ±0,11

СЫфбЗ >3000 4,18 ±0,12 6,28 ±0,14

P. tenwerata

3240 >3000 0 6,74±0,06

cinerea 3107' >3000 6,75±0,12 7,05 ± 0,02

3014 >3000 0 6,03 ± 0,08

temperata К122 >3000 4,46 ±0,11 6,54 ±0,10

XlNach1 >3000 2,48 ±0,14 5,76 ± 0,20

P. luminescens

luminescens Hb' 90 5,11 ±0,17 6,18 ±0,19

akhurstii FRG04 90 6,70 ± 0,09 5,85 ±0,21

iaumondii TIUl' >3000 4,0 ±0,10 4,18 ±0,18

laumondii TT01#28F4 2,5 4,62 ±0,18 5,33 ± 0,34

Iaumondii TT01#6D10 2,5 0 7,00 ± 0,25

laumondii TT01#6E1Q 2,5 0 6,89 ± 0,07

Y. pseudotuberculosis EV11M 5 1,20 ± 0,05 7,1 ±0,12

a Доверительный интервал вычисляли для вероятности 95 %.

Для доказательстваэтиологическойролипатогенного микроорганизма в развитии конкретного инфекционного заболевания до сих пор принято использовать опуб-

линованныеЯ.КосЬ'ом в 1882 г. четыре классических критерия, постулата Генле-Коха (Greenberg D.E. et al, 2006; Koch R., 1882):

1. Микроорганизм должен быть найден во всех животных, страдающих от болезни.

2. Микроорганизм должен быть выделен от пораженного животного в чистой культуре.

3. Микроорганизм должен вызывать болезнь при зараженииздоровых животных.

4. Микроорганизм должен быть повторно изолирован от экспериментально зараженного животного.

На момент начала наших исследований было доказано соответствие Р. asymbiotica как этиологического агента фоторабдоза человека двум первым критериям (GerrardJ. et al., 2004; Gerrard J.G.e/a/.2003), но оставался открытым вопрос о третьем и четвертом постулатах в отношении не насекомых (Vlisidou I. et al., 2009; Yang G. et al, 2006), атепло кровных животных. Для решения этих вопросов мы попытались воспроизвести фоторабдоз на модели лабораторных животных. Кроме того, подбор адекватных модельных лабораторных животных необходим для изучения формирования и течения экспериментальной фоторабдозной инфекции и для разработки эффективных схем антимикробной терапии заболевания. Наиболее часто используемым объектом в биологииявляются лабораторные мыши в силу невысокой стоимости, легкости разведения и ухода, атакже достаточно высокой инфекционной чувствительности. Нам удалось воспроизвести экспериментальный фоторабдоз (с гибелью животных от наиббльших заражающих доз) при п/к введении культуры Р. asymbiotica subsp. australis AU81 мышам четырех линий: BALB/c, C57BL/6, СВА и C3H/HeN. Беспородные белые мыши не гибли и не проявляли клинических признаков заболевания при заражении культурой Р. asymbiotica AU81 (табл. 5).

Таблица 5 - Вирулентность штамма Р. asymbiotica subsp. australis AU81

Лнння/порода мышей Средние сроки гибели, сутки LDJO, КОЕ'

BALB/c 1,4 ± 0,4 3,2 х 10° (7,9 х 105-1,3 х Ю7)

C57BL/6 1,2 ±0,4 1,8 х Ю7 (5,6 х 10е—1,4 х Ю')

СВА 1,4 ±0,8 1,8 х 10' (5,6 х 106—1,4 х 10')

СЗН/НеЫ 1,7 ±0,6 3,2 х Ю" (7,9 х Ю5—1,3 х Ю7)

Беспородные - > 10"

" Доверительный интервал для вероятности 95 % указан в круглых скобках.

Вирулентность штаммов - представителей двух подвидов Р. азутЫоИса -БиЬБр. ааутЫоПса 1^86 и БиЬБр. агШгаИз АШ1, а также двух энтомопатогенных

штаммов:/', temperata subsp. cinerea 3\07т и Р. luminescens subsp. laumondii770\T изучали на мышах линии BALB/c. В связи с тем, что естественный путь заражения человека фоторабдозом пока не установлен, а инфекционная чувствительность модельных животных при разных способах введения культуры может значительно отличаться, использовали два способа заражения мышей: п/к и в/б. Как при п/к, так и при в/б способе введения гибель мышей, зараженных максимальными дозами Р. asymbiotica AU81 и Р. asymbiotica US86, наблюдали в течение первых трех суток. Средние сроки гибели для Р. asymbiotica US86 составили при п/к заражении 2,7 ± 0,8 сут, при в/б - 1 сут, а для Р. asymbiotica AU81 при п/к заражении - 1,4 ±0,6 сут, при в/б - 1 сут. Отличия в величинах LD50 штаммов Р. asymbiotica обоих подвидов при п/к способе введения были не достоверны (р > 0,05). При в/б введении LD50 для штамма Р. asymbiotica subsp. australis AU81 была достоверно ниже аналогичного показателя для культуры Р. asymbiotica subsp. asymbiotica US 86 (p < 0,05) (табл. 6).

У погибших животных, зараженных культурами двух штаммов Р. asymbiotica, в месте введения микробной взвеси наблюдали ярко-выраженную гиперемию и инъекцию сосудов подкожной клетчатки. В высевах из органов павших мышей (регионарный лимфоузел, печень, селезенка) и крови из сердца отмечали рост колоний заражающих штаммов. На восьмые сутки у части мышей, выживших после заражения Р. asymbiotica AU81 и US86, на коже хвоста появились язвенные гнойно-некротические дермиты диаметром 1-3 мм (рис. 2, А).

Таблица 6 - Вирулентность штаммов Photorhabdus spp. для мышей линии BALB/c __

Штамм Photorhabdus spp. LD50, КОЕ"

п/к заражение в/б заражение

Р. asymbiotica subsp. asymbiotica US86 3,2 х 10' (10-3,2 х Ю8) 5,6 х Ю' (1,4 х 10-2,8 х Ю8)

Р. asymbiotica subsp. australis AU81 3,2 х Ю7 (10-3,2 х Ю8) 106 (2,5 х 105—4,0 х 106)

P. temperata subsp. cinerea 31071 > 10" > 10"

P. luminescens subsp. laumondii TT01' > 108 > 10*

а Доверительный интервал для вероятности 95 % указан в круглых скобках.

Бактериологические посевы их коростовых образований выявили рост чистых культур Р. а5утЫоИса. Известно, что язвенно-некротические абсцессы мягких тканей являются характерными клиническими симптомами фоторабдоза человека (Оеггагс! 5. е1 а1, 2004). Появление отдаленных от места введения гнойно-некротических поражений кожи мышей подтверждает гематогенную диссемина-цию возбудителя в ходе инфекционного процесса. ,

Подкожное введение энтомопатогенного штамма Р. 1иттезсет виЬвр. \aumondii ТТ01т мышам линии ВАЬВ/с в дозе 108 КОЕ не приводило к их гибели в течение всего срока наблюдения (21 день). Однако на девятые сутки у всех мы-

шей возникли язвенно-некротические изменения мягких тканей внутренней поверхности бедра в месте введения культуры (рис. 2, Б). В то же время мыши, зараженные Р. ¡етрегМа 3107т, оставались живыми и не проявляли клинических признаков инфекции на протяжении всего срока наблюдения.

А Б

Рисунок 2-Примеры патоморфологических изменений мягких тканей у мышей линии BALB/c.

(А) гнойно-некротические дермиты с ограниченной локализацией в коже хвоста после п/к введения культуры Р. asymbiotica subsp. australis AU81 во внутреннюю поверхность бедра; (Б) язвенно—некротическое поражение мягких тканей внутренней и наружной поверхности бедра после п/к введения культуры Р. luminescens subsp. laumondii ТТ01

Характер патоморфологических изменений органов мышей, павших после заражения штаммами двух подвидов Р. asymbiotica AU81 и US86, был сходен. Имело место неравномерное полнокровие и стаз крови в кровеносных сосудах подкожной клетчатки. В легких отмечали выпадение фибрина в просвете кровеносных сосудов (рис. 3, А и Б). В печени наблюдали дистрофию и мелкоочаговый лизис гепатоцитов (рис. 3, В и Г). В почках — резкое полнокровие мозгового слоя. Кроме того, обнаружили делимфотизацию органов иммуногенеза, включая селезенку, лимфатические узлы, тимус. При этом штамм AU81 вызывал более тяжелое течение инфекции: наряду с указанной патологией имел место фиброзный тромбоз синусов селезенки (рис. 3, Д и Е), мелкоглыбчатый распад лимфоцитов в тимусе, проникновение и размножение микробов между складками слизистой оболочки в толстом кишечнике.

Реакция на введение непатогенного для теплокровных животных штамма Р. temperata 3107т была ограничена образованием небольшого количества плазматических клеток в селезенке и лимфатических узлах.

Гибель экспериментальных мышей при заражении штаммами Р. asymbiotica US86 и AU81, наблюдаемая в течение первых трех суток, была вызвана токсическим действием на организм и связана с расстройством гемодинамики, изменением свертываемости крови, нарушением лимфопоэза в органах иммуногенеза. Прямое токсическое повреждение клеток выявили только в печени и, для штамма Р. asymbiotica AU81, в тимусе. Наиболее патогенным оказался штамм AU81 австралийского подвида как по тяжести патологии у павших, так и по длительности

лейкоцитоза у выживших животных. Патологоанатомическим признаком заболевания являются гнойно-некротические язвы в коже выживших животных. Мыши линии ВАЬВ/с являются адекватной моделью для воспроизведения фоторабдоза человека, а Р. аяутЫойса соответствует третьему и четвертому постулатам Ген-ле-Коха.

Ш&Ж

л »Л- . кУЧ.& г і . *

В

■- -'ХуГ

д

ш

Е

Рисунок 3 - Характер патоморфологических изменений в органах павших мышей линии ВАЬВ/с, зараженных культурой Р. авутЬюНса АШ1.

Исследованные органы: легкие контроль (А), легкие фоторабдоз (Б); печень контроль (В), печень фоторабдоз (Г); селезенка контроль (Д), селезенка фоторабдоз (Е)

Таким образом, полученные сведения о структурном разнообразии липопо-лисахаридов представителей рода Р]го1ог1гаЬ(1ш заложили основу для серологического типирования бактерий, функциональной характеристики и оценки биологической роли отдельных генов биосинтеза ЛПС РЬоЮгкаЪйт врр., а также для разработки эффективных схем антимикробной терапии фоторабдоза с использованием теплокровных модельных животных.

ВЫВОДЫ

1. Создана и охарактеризована коллекция, состоящая из 23 штаммов трех описанных к настоящему времени видов Photorhabdus - Р. asymbiotica, Р. temperata и Р. luminescens, являющаяся научным объектом для детального изучения возбудителя новой инфекции - фоторабдоза.

2. Установлено строение О-полисахаридов пяти подвидов, относящихся к трем видам Photorhabdus. Выявлены моносахариды, редко встречающиеся в бактериальных полисахаридах, которые благодаря их терминальному положению в О-полисахариде предположительно вносят наибольший вклад в иммуноспеци-

фичность бактерий.

3. Определена структура центрального олигосахарида (кора) ЛПС шести подвидов, относящихся ктрем видам Photorhabdus. Обнаружено, что повышение температуры культивирования бактерий Р. asymbiotica приводит к снижению содержания 1>-глш1еро-Т>-манно-гетош и одновременному повышению степени фосфорилирования кора.

4. Впервые выявлена патогенность двух видов Photorhabdus в отношении мышей. Патогенные для людей бактерии Р. asymbiotica обладали умеренной вирулентностью для мышей, вызывая при заражении в дозах 10 -10 КОЕ клиническую картину инфекции, подобную таковой у людей, и гибель -50-100 % животных. Бактерии Р. luminescens subsp. laumondii вызывали у мышей нелетальный инфекционный процесс, проявляющийся в возникновении язвенно-некротических изменений мягких тканей в месте введения культуры, аналогичных наблюдающимся при заражении Р. asymbiotica. Бактерии Р. temperata subsp. cinerea непатогенны для мышей - реакция на их введение ограничивалась образованием небольшого количества плазматических клеток в селезенке и лимфатических узлах.

5. Впервые показано соответствие Р. asymbiotica третьему и четвертому постулатам Генле-Коха, что окончательно подтверждает роль этих бактерий в развитии фоторабдоза теплокровных животных.

6. Установлено, что гибель мышей линии BALB/c при заражении штаммами Р. asymbiotica вызвана инфекционно-токсическим шоком и связана с расстройством гемодинамики, изменением свертываемости крови и нарушением лимфопоэза в органах иммуногенеза. Эндотоксическая активность препаратов ЛПС Р. asymbiotica близка к активности ЛПС У. pestis.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

а) статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Kondakova, A.N. Low structural diversity of the O-polysaccharides of Photo-rhabdus asymbiotica subspp. asymbiotica and australis and their similarity to the O-polysaccharides of taxonomicaliy remote bacteria including Francisella lularensis / A.N. Kondakova, N.A. Kirsheva. A.S. Shashkov, R.Z. Shaikhutdinova, N.P. Arabtsky, S.A. Ivanov, A.P. Anisimov, Y.A. Knirel // Carbohydr. Res. - 2011. - Vol. 346. - N 13. - P. 1951-1955. (2 цитирования по данным Web of Science® на 13.07.2013 г.).

2. Kondakova A.N. Structure of the O-polysaccharide of Photorhab-dus luminescens subsp. laumondii containing D-glycero-D-manno-heptose and 3,6— dideoxy-3-formamido-D-gIucose / A.N. Kondakova, N.A. Kirsheva. A.S. Shashkov, R.Z. Shaikhutdinova, N.P. Arbatsky, S.A. Ivanov, A.P. Anisimov, Y.A. Knirel // Carbohydr. Res. - 2012. - Vol. 351. - P. 134-137.

3. Киршева H.A. Инфекционная чувствительность мышей линии BALB/c к заражению Photorhabdus asymbiotica и Photorhabdus temperata / H.A. Киршева, E.A. Ганина, Т.И. Комбарова, Р.З. Шайхутдинова, С.В. Дентовская, А.П. Анисимов// Проблемы особо опасных инфекций,- Саратов. - 2012. - Т. 3. -№ 113.-С. 64-66.

б) тезисы научных конференций

4. Киршева Н.А. Строение О-полисахаридов Photorhabdus asymbiotica subsp. asymbiotica и subsp. australis! H.A. Киршева, A.H. Кондакова, E.B. Чиркова, Р.З. Шайхутдинова, C.A. Иванов, C.C. Ветчинин, A.C. Шашков, С.В. Дентовская, Ю.А. Книрель, А.П. Анисимов // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспо-требнадзора (25-27 мая 2010 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Они-щенко, И.А. Дятлова. - Протвино: А-ПРИНТ ЗАО, 2010. - С. 274-276.

5. Kondakova A.N. Structures of the O-polysaccharides of Photorhabdus asymbiotica subsp. asymbiotica and subsp. australis resembling that of Francisella tularensis / A.N. Kondakova, N.A. Kirsheva. A.S. Shahshkov, R.Z. Shaikhutdinova, S.A. Ivanov, A.P. Anisimov, Y.A. Knirel // Program and abstracts of the 4th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (September 19-22, 2010, Hyytiala, Finland). -Hyytiala, 2010.-P. 41.

6. Киршева H.A. Определение строения О-специфических полисахарид-ных цепей липополисахарида Photorhabdus asymbiotica subsp. asymbiotica и устойчивости Photorhabdus spp. к полимиксину В / Н.А. Киршева, А.Н. Кондакова, Р.З. Шайхутдинова, С.А. Иванов, Г.М. Титарева, А.С. Шашков, С.В. Дентовская, Ю.А. Книрель, А.П. Анисимов// Современныетехнологии обеспечения биологической безопасности: Материалы III научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора (31 мая -2 июня 2011 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова. - Протвино: А-Принт ЗАО, 2011. — С. 191-193.

7. Кипшева H.A. Экспериментальная фоторабдозная инфекция / H.A. Киршева, Р.З.Шайхутдинова, Г.М. Титарева, C.B. Дентовская, А.П. Анисимов // Инфекционные болезни. - 2011. - № 9. - С. 166.

8. Bakhteeva I.V. Structural studies on the lipopolysaccharide of Photorhab-dus temperóla subsp. temperata 3240 / I.V. Bakhteeva, G.M. Titareva, N.A. Kirsheva, A.N. Kondakova, A.S. Shashkov, Y.A. Knirel // Program and abstracts of the 5* Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (2-6 September 2012, Suzdal, Russia) - Suzdal, 2012.-P. 25.

Список сокращений, используемых в тексте

12:0 - лауроильная группа

14:0 - миристоильная группа

16:0 - пальмитоильная группа

в/б — внутрибрюшинно

ГЖХ - газожидкостная хроматография

ГКПМ-Оболенск - Государственная коллекция патогенных микроорганизмов и клеточных культур - Оболенск ДСН — додецилсульфат натрия

ИОХ- Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского КОЕ - колониеобразующая единица ЛПС - липополисахарид

МПК - минимальная подавляющая концентрация

НЧС - нормальная (неиммунная) человеческая сыворотка

п/к - подкожно

РАН - Рйссийская академия наук тНЧС - термоинактивированная НЧС

ФБУН ГНЦ ПМБ - Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» ЯМР - ядерный магнитный резонанс DDHep - и-глицеро-и-манно-гетоза

D-FucNAc4N - 2-ацетамидо-4-амино-2,4,6-тридезокси-1>-галактоза D-GaINAc - Л^-ацетил-О-галактозамин

D-GaINAc4PEtN - 2-аминоэтилфосфатное производное Л'-ацетил-D-галактозамина

I>-Qui3NFo - 3,6-дидезокси-3-формамидо-1>-глюкоза Gal - галактоза

GalA - галактуроновая кислота

GaINA - 2-амино-2-дезоксигалактуроновая кислота

GaINAcA - 2-ацетамидо-2-дезоксигалактуроновая кислота

Glc - глюкоза

GlcN — глюкозамин

GlcNAc — ТУ-ацетилглюкозамин

Gly — глицин

Hep - Ь-глицеро-ХУ-манно-тетоза. Hex — гексоза

Kdo - 3-дезокси-ЕК<1га/шо-окт-2-улозоновая (кетодезоксиоктоновая) кислота LB среда - среда Luria-Bertani

LD50 - доза летальная для 50 % животных (dosis letalis 50) Lys - лизин Man - манноза

Р - остаток ортофосфорной кислоты PEtN - фосфоэтаноламин РМВ - полимиксин В

QuiNAc - 2-ацетамидо-2,6-дидезоксиглюкоза

Qui4N - 2,4-диамино-2,4,6-тридезоксиглюкоза

Qui4NGlyFo - 4,6-дидезокси-4-<Лг-формилглицил)аминоглюкоза

Qui4NFo - 4,6-дидезокси—4-формиламиноглюкоза

3,6dHex40Me - 3,6-ДИдезокси—4—0-метил-кс«яо-гексоза(колитозаили абеквоза)

Благодарности

Приношу искреннюю благодарность своим научным руководителям д.м.н. Дентовской C.B. и Д.Х.Н., профессору Книрелю Ю.А. за осуществление руководства и оказание методической помощи в проведении исследовательских работ, а также д.м.н., профессору Анисимову А.П. за общую организацию и координацию работы.

Благодарю сотрудников ФБУН ГНЦ ПМБ к.б.н. Шайхутдинову Р.З., к.б.н. Иванова С.А., к.м.н. Титареву Г.М., Комбарову Т.И. за помощь при проведении экспериментов на разных этапах работы.

Выражаю искреннюю признательность д.х.н. Шашкову A.C. и к.х.н Кондаковой А.Н. (ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН, г. Москва) за помощь при проведении биохимических и аналитических исследований.

Благодарю директора ФБУН ГНЦ ПМБ чл.-корр. РАМН, д.м.н., профессора Дятлова И.А. за предоставленную возможность защитить диссертацию в диссертационном совете Д 350.002.01 при ФБУН ГНЦ ПМБ, а ученого секретаря диссертационного совета к.б.н. Фурсову Н.К. за организацию ее проведения.

Глубоко признательна ведущей организации, официальным оппонентам и всем рецензентам настоящей работы за высказанные замечания, вопросы и рекомендации.

Подписано в печать:

09.08.2013

Заказ № 8652 Тираж - 80 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru