Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура лакказы из Coriolus Hirsutus и строение ее активного центра

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структура лакказы из Coriolus Hirsutus и строение ее активного центра"

На правах рукописи

ПЕГАСОВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

СТРУКТУРА ЛАККАЗЫ ИЗ CO RIO LUS HIRSUTUS И СТРОЕНИЕ ЕЕ АКТИВНОГО ЦЕНТРА

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2004

Работа выполнена в ВНК "Ферментативные основы биодеградации" Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук О.В. Королева Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Р.А. Звягильская

кандидат физико-математических наук И.Н. Цыганник Ведущая организация:

Химический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится « $ » 2004 г. в «_»

часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1.

Автореферат разослан 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. В настоящее время ферментные препараты находят широкое применив в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине и ряде других областей. Практический интерес к изучению ферментов продиктован прежде всего их каталитическими характеристиками: активностью и специфичностью действия. Лакказа (КФ 1.14.18.1) является одной из наиболее просто структурно организованной медь-содержащей оксидазой, активный центр которой представлен ансамблем из четырех ионов меди. Лакказа обладает способностью катализировать окисление различных соединений, включая о,п-дифенолы, аминофенолы, полифенолы, полиамины, некоторые неорганические ноны и арилдиамины с сопутствующим восстановлением молекулярного кислорода до воды. Уникально широкая субстратная специфичность, которую можно увеличить использованием редокс-медиаторов, биоэлектрокаталитические свойства, высокая стабильность, использование кислорода в качестве второго субстрата, обуславливают перспективность использования лакказы в прикладных биотехнологиях. Следует отметить, что ж крупномасштабное практическое использование ограничено, несмотря на наличие ряда рекомбинантных лакказ. Очевидно, отсутствие установленого механизма действия фермента и взаимосвязи его структурных и каталитических особенностей ограничивает эффективное использование лакказы в биотехнологии.

Лакказы, впервые открытые более столетия назад, остаются предметом как фундаментальных, так и прикладных исследований. В настоящее время получено четыре пространственные структуры нативных гликозилированных лакказ. Однако, полученные данные оказались недостаточны для решения ключевых вопросов, связанных с механизмом катализа. Остался неясным механизм генерации окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) Т1 центра на структурном уровне, определяющий эффективность катализа. На

ГО С НАЦИОНАЛЬНАЯ

| Бимяогаи

основании структурных данных не выяснена роль и структура отдельных интермедиатов в процессе катализа и условия их взаимных переходов, и как следствие, не предложен механизм восстановления кислорода в трехъядерном медном кластере и роль отдельных медных центров (Т2 и ТЗ) в этом процессе.

Таким образом, для установления взаимосвязи структуры лакказ и их функций основным подходом является изучение структуры ряда высокоредокспотенциальных лакказ и их основных каталитических особенностей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение структуры высоко редокспотенциальной лакказы из Сопо1ш hirsutus и строения ее активного центра.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1. Определение аминокислотной последовательности данного фермента.

2.Исследование структуры фермента и его активного центра при температурно-фазовых переходах.

3.Определение по дифракционным данным кристаллической структуры белка.

Научная новизна.

Разработан протокол очистки лакказы из Сопо1ив МгвиЫх методом препаративного электрофореза. Определена аминокислотная

последовательность лакказы из СогШиз ЫгтШ5 072 по нуклеотидной последовательности кДНК. Показано, что лакказа существует в растворе в виде мономеров и димеров (соотношение 85% - 15%). Установлено, что при размораживании препарата фермента происходит процесс конформационной перестройки активного центра, сопровождающийся изменением каталитической активности. Найдены условия роста монокристаллов лакказы из СопоЫь ЫгзиШх 072. Собран набор дифракционных данных с разрешением 1.85 А. Структура лакказы решена методом молекулярного замещения и

уточнена до R-фактора 18.15%. Впервые получена структура нативного интермедиата, содержащего в центре трехъядерного кластера дополнительный кислородный лиганд. На основании полученных структурных и спектроскопических данных предложен механизм восстановления молекулярного кислорода в процессе ферментативного катализа.

Практическая ценность работы. Полученная впервые структура "нативного интермедиата" лакказы может быть использована для уточнения каталитического механизма действия фермента и для установления взаимосвязи структура-функция. Установленная взаимосвязь структуры фермента и его функций даст возможность не только повысить эффективность его практического использования, но и откроет возможности для получения рекомбинантных ферментов с заданными свойствами путем использования направленного точечного мутагенеза.

Объем работы. Диссертация изложена на {¿^ страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, выводов, содержит таблиц, рисунков. Список использованной литературы включает 1X5' наименований.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 3-м Биохимическом Съезде (Россия, С.-Петербург, 2002 г.), конкурсе на стипендию имени чл.-корр. РАН В.Л. Кретовича (Россия, Москва, ИНБИ РАН, 2003 г.), 10-й Молодежной научной конференции "Актуальные проблемы биологии и экологии", (Россия, Сыктывкар, 2003 г.), Н-м Московском международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития", (Россия, Москва, 2003 г.), 5-й Международной конференции по молекулярной и структурной биологии, (Австрия, Вена, 2003 г.).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 6 тезисов.

Результаты и обсуждение.

Очистка н характеристика фермента.

Ранее было показано, что С. Итшга 072 синтезирует две изоформы (О, C2) лакказы при росте на пептонно-глюкозной среде в условиях глубинного культивирования. Следует отметить, что данные изоформы практически всегда присутствовали в препаратах фермента на различных стадиях очистки в соотношении по белку С1:С2 - 83:17 и имели близкие изоэлектрические точки, лежащие в кислой области рН. Однако, в отличие от большинства изоферментов, синтезируемых базиднальными грибами, возбудителями "белой гнили", более каталитически активная изоформа С1 синтезировалась и в большем количестве. Это позволило нам использовать ее для изучения трехмерной структуры фермента и для исследования механизма его действия.

Согласно мнению ряда авторов трудности получения фермента в кристаллическом состоянии вызваны рядом причин, одной га которых является метод очистки фермента. Так, непременным условием успешной кристаллизации лакказы, Piontek К. с соавторами (2002) считают использование метода изоэлектрофокусирования для очистки фермента.

Для проверки данного предположения для очистки и выделения в гомогенном состоянии изоформы С1 использовали три протокола: ионообменную хроматографию (заключительная стадия - высокоэффективная жидкостная хроматография), изоэлектрофокусирование и препаративный электрофорез. Очистка по протоколу, включающему последовательные стадии ионообменной хроматографии, позволила достичь разделения изоферментов только на заключительной стадии - ВЭЖХ. Контроль чистоты объединенных фракций, содержащих С1, методом электрофореза в ПААГе показал гомогенность данной изоформы после очистки данным методом (так как электрофореграммы гомогенных препаратов изофермента С1 лакказы практически идентичны, на рис. 1 приведена лишь одна электрофореграмма).

Очистка ферментного препарата методом изоэлектрофокусирования в широком и узком градиенте рН имела свои особенности. Использование ультрафильтрации через мембраны с отсечением 10 кДа позволило удалить некоторое количество пигментов и низкомолекулярных белков. Изоэлектрофокусирование в широком градиенте рН показало присутствие белков, не обладающих ферментативной активностью, с изоэлектрическими точками в нейтральном диапазоне рН. Для получения гомогенного изофермента лакказы, проводили ре-шоэлектрофокусирование фракций, обладающих лакказной активностью. После повторного изоэлектрофокусировання в узком градиенте рН был получен лишь один изофермент С1, гомогенность которого подтверждалась электрофорезом в ПААГе в денатурирующих условиях.

Препаративный электрофорез для очистки лакказы и разделения изоферментов был использован впервые (рис.2). Предполагалось, что в условиях проведения препаративного электрофореза (рН 8.6) лакказа может практически полностью потерять ферментативную активность. Действительно, при определении ферментативной активности отдельных фракций после очистки этим методом, абсолютные величины ферментативной активности (усл. ед./мл) были значительно ниже таковых во фракциях после очистки согласно двум другим протоколам. Однако, последующий диализ против 0.05 М К-фосфатного буфера рН 6.5 позволил практически полностью восстановить активность фермента. Для сравнения приведем значения удельной активности лакказы после очистки методами: ВЭЖХ - 110-120, ИЭФ - 100-110, и препаративного электрофореза 24-26 (до диализа) и 98-105 усл.ед./мг белка (после диализа).

Таким образом, очистка согласно всем трем использованным протоколам позволила получить препараты гомогенного изофермента С1 с высокой удельной активностью.

Рис. 1. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях гомогенного

препарата шоформы С1 после заключительной стадии ОЧИСТКИ методом буфер рН 8.6).

изоэлектрофокусирования.

Изучение влияния темпепатурно-сЬаэовых переходов на ферментативную активность и структуру лакказы in Coriolus hirsutus.

Основная трудность при использовании лакказы для экспериментальной работы состоит в отсутствии стандартных лиофилизированных препаратов фермента В практике лабораторий, исследующих грибные лакказы, используют замороженный препарат фермента (хранение при -18°С) Как известно, в процессе заморозки и последующей разморозки могут происходить как обратимые, так и необратимые изменения структуры фермента и его состояния в растворе Поэтому было предпринято исследование состояния фермента в растворе после замораживания и последующего оттаивания

Исследование состояния фермента в растворе непосредственно до заморозки, сразу после перехода из твердой фазы в жидкую, через 4 ч и 24 ч после оттаивания проводили методом малоуглового рассеивания Экспериментальные кривые практически совпадали На рис 3 представлена объединенная кривая после сглаживания и введения коллимационной поправки, построенная в координатах Гинье (логарифм интенсивности log I от S2) Прямая, проведенная по начальному участку дает радиус инерции частиц

0 1 2 3 4 £ ^ МЛ

Рис. 2. Разделение изоформ лакказы

методом препаративного электрофореза (10% ПААГ, трис-НС1

Rg=23.3 А. Радиус сферической частицы с таким радиусом инерции равен 1.3 х Rg = 30.3 А.

Рис. 3. Объединенная кривая Рис. 4. Функция распределения по

интенсивности малоуглового рассеяния расстояниям р(г), рассчитанная по

лакказы в координатах Гннье после кривой малоуглового рассеяния.

сглаживания и введения коллимационной поправки.

Для уточнения размера частиц лакказы был построен график (рис. 4) характеристической функции р(г) (функции распределения по расстояниям). Значения функции распределения частиц по размерам рассчитывали с помощью программы косвенного Фурье-преобразования GNOM. Как видно из графика, положение максимумов кривых совпадает и соответствует радиусу сферы, равному 29 А. Полученное значение радиуса примерно соответствует молекуле с молекулярной массой 50 - 60 кДа, что совпадает с данными о молекулярной массе фермента, определенной ранее. Однако, "плечо" в области, соответствующей частицам с размерами 60 - 130 А, указывает на присутствие в растворе частиц, диаметр которых достигает 130 А. Рассчитанное соотношение мономерных и агрегировавших частиц составило 85% и 15%, соответственно. Таким образом, соотношение мономерных и агрегировавших частиц лакказы при исследованном температурно-фазовом переходе не изменялось.

Однако, по данным ряда авторов в растворе происходят взаимные переходы промежуточных форм лакказы, сопровождающиеся изменением

каталитической активности фермента. Поэтому изучение температурно-фазовых переходов лакказы включало исследование динамики ферментативной активности и изменения структуры активного центра. Изменения активности лакказы в концентрированных и разбавленных растворах фермента оценивали в течение трех часов после ее оттаивания. Следует подчеркнуть, что при измерении активности концентрация фермента в кювете была одинаковой -2x10"8 М. Согласно представленным данным (рис. 5) динамика зависимости активности от времени практически одинакова для концентрированного и разбавленного препаратов фермента: достаточно заметная активация в течении первых 40 мин. с незначительным падением каталитической активности между 40 - 60 мин., последующим ее возрастанием и выходом на плато (после 160 мин. инкубации). Таким образом, можно предположить изменение соотношения переходных форм фермента в растворе с последующим достижением равновесия через 3 часа. Так как изменения соотношения мономерных и агрегировавших частиц фермента в растворе не было зарегистрировано методом малоуглового рассеяния, полученные данные свидетельствуют о перестройках активного центра лакказы.

Для выяснения влияния температурно-фазового перехода на структуру активного центра фермента проводили спектрофотометрические исследования состояния Т1 центра (610 нм) и ТЗ центра (340 нм) в диапазоне температур 12-30 °С (рис.6). Следует отметить, что оптическая плотность фермента на 340 нм (характеристическая длина волны для ионов меди антиферромагнитной пары ТЗ) практически не менялась, что свидетельствует о значительной стабильности данного центра (кривая 1, рис. 6). Значительное падение оптической плотности наблюдалось при 610 нм (кривая 2, рис. 6), следовательно значительные изменения происходят в Т1 центре, которые могут быть оценены с помощью ЭПР-спектроскопии.

Рис. 5. Динамика ферментативной Рис. 6. Влияние температуры на

активности препаратов лакказы после спектральные характеристики

оттаивания и инкубации при комнатной медных центров лакказы. Изменение температуре. 1 - концентрированный (5 оптической плотности: 1 - при 340 мг/мл) и 2 - разведенный сразу после нм, 2 — при 610 нм. оттаивания (0.25 мг/мл) препараты фермента.

ЭПР-спектры лакказы, полученные непосредственно после оттаивания и в процессе инкубации при комнатной температуре, показаны на рис. 7. Вклад иона меди Т1 центра в результирующий спектр уменьшается в процессе инкубации. Кроме того в процессе инкубации происходит уширение и расщепление спектральной линии соответствующей вкладу иона меди первого типа. Очевидно, что уширение сигнала является следствием двух процессов -суперпозиции сигналов ионов меди I и 2 типа при комнатной температуре и появлением вклада ТЗ пары в результирующий спектр из-за усиления антиферромагнитного взаимодействия между ионами меди ТЗ. Поэтому моделирование спектров и определение параметров сверхтонкого расщепления становиться невозможным. Тем не менее, полученные данные однозначно свидетельствуют о структурных перестройках активного центра фермента в процессе температурно-фазового перехода, причем наибольшие изменения происходят в Т1 центре.

Рис. 7. ЭПР-спектры лакказы сразу после оттаивания (1) и через 30 (2), 60 (3), 90 (4), 120 (5), 150 (6) и 180 (7) минут. Инкубацию фермента и регистрацию ЭПР-

спектров проводили при температуре 20°С.

Определение аминокислотной последовательности лакказы С. hirsutus 072.

Для расшифровки полной пространственной структуры белка была установлена первичная структура его аминокислотной последовательности с помощью определения нуклеотидной последовательности кДНК лакказы С oriol us hirsutus 072. Полученная аминокислотная последовательность представленна на рис. 8. Определенная ранее N-концевая последовательность изофермента С1 была идентична аминокислотным остаткам с 22 по 32, а последовательность сигнального пептида - 1-21 остаткам. Таким образом, представленная последовательность имела сигнальный пептид, типичный для эукариотов, в котором основная область была гидрофобна, а С-конец содержал трипептид AHA (рнс. 8). Для исследуемой лакказы наблюдается полная идентичность аминокислотных остатков С-конца сигнального пептида и N-конца аминокислотной последовательности с другими грибными лакказами: Pycnoporus cinnabarinus, Trame tes villosa, Coriolus hirsutus IFO 4917.

Ш' ''' ' ' ' ' H?60

напряженность поля, мТ

Сигнальный пептид

МЗКГдЗЬЬТРШБ^АУАНА АУСРУАОЬТ1ТОААУ5РОСР8КдАУУУНОУТРаРЬУАСНЮОЯР

дЬЫУГОМЬТЬМ'М^5Т51Н^СРрдНОТтУАОСРАР1ЫдСР15РОН5Р1.УОР дУРОрАОТРУ/УН5Н1^ТОУСВОЬКОРРУУУОРШРНА5ЯУПУОНООТУ1ТЬ ADWYHTAAKLGPKFPGAADAWINGKGRAPVTLPASCSVIKVTKGKRYRFR ЬУ51^СЫРННТР5тСННЬТИЕУО5УЫ5дРЬЕУО5101РААЕаУ5РУЬОАКдА VDNYWIRANPNFGNVGFDGGINSAILRYDGAPAAEPTTNQTTSVKPLNEVDL НРЬУЗТРУРОАЗОКАтМАРОРКОЗОРРШОАЗРУРРТУРУЬЬР^ОАСуГАд DLLPSGSVYVLPSNASIEISFPATAAAPGAPHPFHLHGHTFAVVRSAGSTVYN Е0МРРЬУ5ТРУРОА50КАШМАРПРМО50РРШ0А5РУРРТУРУ1Х(211.5ОАдТ Ар0ЬЬР505УУУЬР8КА51Е15РРАТАААР0АРНРРНЬН0НТРАУУР5А05ТУ YNFDNPIFRDVVSTGTPAAGDNVTIRFDTNNPGPWFLHCHIDFHLEGGFAVV MAEDTPDVQAVNPVPQAWSDLCPTYDALDPNDQ Рис. 8. Аминокислотная последовательность лакказы из С. МгхШиз 072.

Аминокислотная последовательность состоит из 495 аминокислотных остатков, что соответствует молекулярной массе 53 кДа. Различие между рассчитанной молекулярной массой и определенной методом электрофореза в денатурирующих условиях и ВЭЖХ связано с наличием углеводной части, составляющей по независимым экспериментам 12%.

Степень сходства полученной аминокислотной последовательности исследуемой лакказы с последовательностями известных лакказ и мономерной субъединицы аскорбатоксидазы оценивали программой CLUSTALW. Полученные результаты представлены в Табл. 1,

Анализируя сходство представленных последовательностей, следует отметить, что наиболее консервативной частью аминокислотных последовательностей лакказ является непосредственное окружение ионов меди, состоящее из 10 гистидиновых и одного цистеинового остатков. Некоторыми авторами предполагалось ранее, что на значение потенциала нона меди Т1 центра влияет природа его аксиального лиганда, хотя данный лиганд и не координирует ион меди Т1. На основании этой гипотезы была предложена следующая классификация лакказ: высокоредокспотенциальные,

Табл. 1. Сравнение степени сходства аминокислотных последовательностей, величины окислительно-восстановителльного потенциала и природы аксиальной аминокислоты в Т1 центре для некоторых лакказ и

аскорбатоксидазы.

Coriolus hirsutus IFO 4917 Trámeles versicolor Pycnoporus cinnabarinus Trámeles villosa Coprinus cinereus Rhizoctonia solani Neurospora crassa Rhus vernicifera Ascorbate oxidase 1AOZ Аксиальная AK приТ1 £°T1, мВ (w НВЭ)

Coriolus hirsutas 072 87 79 73 72 58 47 32 25 25 Plie 812+10

Coriolus hirsutus IFO 4917 83 73 71 59 45 29 25 27 Phe _*

Trámeles versicolor 79 72 59 48 30 26 27 Phe 780±10

Pycnoporus cinnabarinus 69 57 45 29 26 25 Phe 750±20

Trámeles villosa 58 46 29 25 26 Phe 790±10

Coprinus cinercus 48 31 26 28 Leu 427

Rhizoctonia solani 30 27 26 Leu 680-730

Neurospora crassa 22 22 Leu 780

Rhus vernicifera 29 Leu 340

Ascorbate oxidase 1AOZ Met 394-434

* Не определялось.

имеющие аксиальный фенилаланин; среднередокспотенциальные, имеющие аксиальный лейцин, и низкоредокспотенциальные, имеющие аксиальный метионин. Однако, сравнительный анализ трех параметров: величина ОВП иона меди Т1, природа аксиального лиганда и степень сходства полной аминокислотной последовательности показал, что природа аксиального лиганда является не единственным фактором, влияющим на величину потенциала иона меди Т1 центра (Табл. 1). Лакказы из R. solani и N. crassa имели такое высокое значение ОВП, что могли бы быть отнесены к высокоредокспотенциальным лакказам, однако содержали в качестве аксиального аминокислотного остатка лейцин. Однако, для этих лакказ неизвестно, соответствует ли приведенная в банке данных аминокислотная последовательность той изоформе, для которой определяли ОВП иона меди первого типа. Поэтому анализ корреляции величины ОВП от природы аксиального аминокислотного остатка и степени сходства аминокислотных последовательностей корректнее проводить на лакказах

vernisifera и Ascorbate oxidase для которых данное соответствие установлено. Проведенный анализ данных показал, что высокоредокспотенциальные лакказы имеют большую степень сходства (Табл. 1). Если учесть 100% сходство первой координационной сферы активного центра лакказ, то можно предположить, что на потенциал иона меди Т1 центра могут влиять аминокислотные остатки второй координационной сферы.

Подбор и оптимизация условии кристаллизации лакказы Corwins

hirsutus.

Кристаллизацию фермента проводили методом диффузии паров в "висячей" капле. Широкий поиск условий кристаллизации проводили с использованием коммерческих наборов Crystal Screen Kit I, Crystal Screen Kit II, Crystal Screen Kit Cryo при двух температурах (4"C, 20"C). Капля состояла из равных объемов раствора белка в 0.05 М К-фосфатном буфере (КФБ) рН 7.0 (с

концентрацией белка ~30 мг/мл) и соответствующего раствора из используемых коммерческих наборов. Кристаллы в форме друз выросли в условиях: №7 Crystal Screen Kit II (10 % в/о ПЭГ 1000, 10 % в/о ПЭГ 8000).

(рис. 9). С уменьшением концентрации фермента в каплях наблюдалась тенденция к формированию монокристаллов, однако время их роста заметно увеличивалось. Так, при комнатной температуре и концентрации белка -25 - 30 мг/мл кристаллы формировались в течение 4-7 суток, в то время как при той же температуре, но концентрации фермента ~5 мг/мл - в течении 30 суток. При снижении температуры до 4°С время роста кристаллов увеличивалось до 45 и 150 сут при концентрации фермента -25 - 30 мг/мл и ~5 мг/мл, соответственно.

Согласно мнению ряда авторов, решающее значение для успешной кристаллизации лакказы имеет метод ее очистки, поэтому в подобранных оптимальных условиях роста кристаллов были проведены эксперименты по кристаллизации трех гомогенных препаратов лакказы полученных согласно трем протоколам очистки: ВЭЖХ, изоэлектрофокусирования и препаративного электрофореза. Рост кристаллов наблюдался для всех использованных препаратов фермента, а время их роста практически не отличалось.

В дальнейшем варьировали концентрации осадителей, фермента и рН буферной системы в небольших пределах. Оптимальными условиями кристаллизации лакказы оказались: 0.05

М КФБ рН 7.0, 10 % в/о ПЭГ 1000, 10 % в/о ПЭГ 8000. После нахождения оптимального рН для роста кристаллов, было изучено влияние концентрации белка на процесс кристаллизации. При концентрациях белка мг/мл были получены самые крупные кристаллы, достигавшие 1500 мкм

Рис. 9. Фото кристаллов лакказы из С. hirsutus.

Рентгеновский эксперимент.

Сбор кристаллографических данных и их обработка были выполнены в Европейской Лаборатории Молекулярной Биологии, Гамбург (Германия) Набор был собран с одного кристалла при 100К на рабочей станции BW7A при длине волны соответствующей краю поглощения атома меди, с

использованием 165 мм MAR CCD детектора. В качестве криопротектанта использовали парафиновое масло Обработка полученных данных была выполнена с помощью программ DENZO, SCALEPACK. Полученные кристаллы принадлежали орторомбической пространственной группе симметрии P2i2j2| с параметрами ячейки а=50.65, b=74.01, с=124.83 А. Плотность упаковки характеризовалась параметром Мэтьюза, равным 2.15 (40% содержание растворителя). В независимой части элементарной ячейки находилась одна молекула белка.

Решение пространственной структуры лакказы методом молекулярного

замещения.

В качестве исходной модели для решения структуры лакказы из методом молекулярного замещения были использованы координаты атомов лакказы Т. versicolor (PDB код 1GYC). Молекулы воды и остатки углеводов не включались в модель, координаты оставшихся атомов были использованы в программе Molrep для расчета функций вращения и трансляции с разрешением 4А. Верное решение соответствало первому пику функции вращения и первому пику функции трансляции, которые были значительно больше следующих пиков. Начальный Корреляция соответствовала

64.5%.

Кристаллическая структура. Уточнение и корректировка модели

фермента.

Позиции атомов и их температурные факторы для нативной лакказы уточнялись в несколько этапов программой REFMAC. Стадии

кристаллографического уточнения чередовались с ручной корректировкой модели фермента для учета отличий в первичной последовательности лакказ из С. hirsutus И Т. versicolor, построения модели углеводной части структуры и локализации молекул растворителя.

Визуальная корректировка основывалась на анализе разностных синтезов Фурье с коэффициентами (2Fo - Fc, <рс) и (Fo — F« <Рс), где Fo, F„ — экспериментальные и рассчитанные модули структурных факторов, а ф, -рассчитанные фазы структурных факторов. Для построения и корректировки модели молекулы фермента использовали комплекс графических программ О.

В результате такого уточнения была получена структура, содержащая 4267 неводородных атомов со значениями кристаллографических факторов при этом среднее отклонение длин связей и валентных углов от стандартных значений составляло 0.020 Â и 1.79" соответственно.

Было установлено, что четыре боковых цепи аминокислотных остатков полипептидной цепи имеют двойные положения: ПебЗ, Val201, Cys205, Thr343.

В модель были включены тринадцать углеводных остатков. Восемь из них были остатками N-ацетилглюкозамина, четыре из которых связывались с молекулами аспарагина (Asn54, Asn217, Asn329, Asn432) посредством N-гликозидной связи, а оставшиеся остатки N-ацетилглюкозамина и пять молекул a-D-маннозы соединялись между собой.

В ходе уточнения структуры были обнаружены большие расхождения в первичных последовательностях, определенных по данным рентгеноструктурного анализа и секвенированием кДНК. На основании этих данных аминокислотная последовательность, определенная секвенированием кДНК была существенно исправлена. Тем не менее, в модели осталось шесть аминокислотных остатков, не совпадающих с с остатками, определенными по нуклеотидной последовательности кДНК: Glu 242, Asp 419, Thr 423, Gly 429, Asn 431, Asp 440 (остатки Pro, Gly, Pro, Arg, неидентифицированный и Gin по

кДНК последовательности, соответственно). Все остатки за исключением Gly 429, для которого нет электронной плотности для боковой цепи, надежно локализованы по картам электронной плотности.

Пространственная структура лакказы. Лакказа из Сопо1ш НтШш является мономером, образованным тремя последовательно расположенными доменами (рис. 10). Домен 1 (Л1а1 -Asp128) содержит в себе две р-слоя, имеющих четыре поворота и четыре Зщ-спирали, три из которых находятся между -слоями, а одна расположена между доменами 1 и 2.

Второй домен (Рго129 - Ьеи308) имеет первый -складчатый лист с

Рис. 10. Схематическое изображение лакказы из

шестью поворотами, второй Р-Слой - с пятью, и как в домене 1 - три Зю-спирали в пептидах связывают отдельные Р-повороты и домены 1 и 3, соответственно, Зю-спираль между доменами 2 и 3 образует петлю длиной в 40 аминокислотных остатков. Третий домен (Уа1309 - Gln495) помимо Р-структуры, образованной двумя -слоями с пятью поворотами, имеет -складчатый лист с двумя поворотами, который вместе с -спиралью образуют полость, где расположен Т1 центр. В третьем домене спираль длиной в 13 аминокислот С-конца молекулы стабилизирована дисульфидным мостиком между Сув484 и Сув85 домена 1. Существует также второй дисульфидный мостик между доменами 1 и 2 (СувШ и Сув205), имеющий два положения.

Активный центр лакказы из C.hirsutus состоит из моноядерного медного центра Т1 и трехъядерного кластера Т2/Т3. Субстрат связывающий карман, в котором находится Т1 ион меди, располагается между 2 и 3 доменом, а Т2/Т3 кластер - в полости между 1 и 3 доменами (1-128, 129-308, 309-495).

Ион меди Т1 координируется двумя гистидиновыми остатками и одним цистеиновым, причем и ион меди и координирующее его атомы азота и серы

лежат в одной плоскости (рис. 11). His390 и His453 координируют ион меди Т1 через атомы с длинами связей 2.17 и 2.19 А соответственно. Цистеиновый аминокислотный остаток образует с ионом меди связь длиной 2.20 А. Аксиальное положение занимает Phe458, а с другой стороны на практически том

Рис. 11. Пространственное строение Т1 хе Расстоянии 3.60 А находится центра лакказы из С hirsutus. ILe450.

Кислород-восстанавливающий центр Т2/ТЗ находится на расстоянии около 12 А от поверхности молекулы фермента и локализован между 1 и 3 доменами (рис.12). В координации ионов меди этого кластера участвуют аминокислотные остатки, принадлежащие N-концу рб (His64, His66), С-концу Р7 (His 109, Hisl 11), N-концу Р26, С-концу Р28, Т2/Т3 кластер удален от Т1 иона меди на 12.2 А. Трехъядерный кластер Т2/Т3 связан с Т1 центром высококонсервативным для лакказ трипептидом His447 - Cys448 - His449, расположенным на С-конце -цепи (028), Cys448 координирует ион меди Т1, аминокислотный остаток His447 - a His449 -

Три медных иона в кластере Т2/ТЗ образуют почти равнобедренный треугольник с расстояниями:

3.85 А. На карте электронной плотности локализован в центре кластера кислородный лиганд 03 (рис. 12). Между двумя ионами меди в ТЗ центре находится кислородный мостиковый лиганд 01. Следует отметить, что этот кислородный лиганд присутствует во всех структурах лакказ.

Рис. 12. Пространственное строение Т2/Т3 кластера лакказы га С. hirsutus. Расстояние между кислородными лигандами 01 - 03 составляет 2.47 А, что соответствует длине водородной связи. Длины связей: ТЗ] - 01 =2 48 А, Т32 -01 =1.91 А, с углом 125.25°; ТЗ! - 03 =2.15 А, Т32 - 03 =2.52 А, с углом 109.78°.

Ионы меди ТЗ пары координируются шестью аминокислотными остатками гистидинов. Пять из гистидиновых остатков координируются N£2 атомами, а шестой - N61. ТЗ) координируется атомами N51 (His66), Ый (His 109), Nd (His449) и 03. Т32 координируется атомами N1* (Hislll), N*2 (His395), N*2 (His447) и 01. Координация каждого из этих ионов может быть описана как искаженный тетраэдр (рис. 12).

Окружение иона меди Т2, состоящее из атомов Шв64, Шв393 и двух кислородных лигандов О2 и О3, образует плоский квадрат. Гистидиновые аминокислотные остатки, координирующие ион меди Т2, имеют водородные связи с атомами основной цепи остатков Лвр77 и Авр419. Точный характер кислородных лигандов О1, О2 и О3 в кластере Т2/ТЗ не может быть определен из кристаллографических данных. Расстояния от иона меди до кислородных лигандов О2 и О3 равны: Т2 - О2 =1.88 А, Т2 - О3 =2.09 А. Расстояние между кислородными лигандами О2 — О3 составляет 2.09 А, что меньше длины водородной связи, поэтому можно предполагать, что данная связь ковалентная. Ранее кислородный лиганд 03 был найден только в трехъядерном кластере структуры лакказы из Ме1апосагрш аЛотусвя, однако там Т2 центр вместо О2 имел ион а расстояния до кислородного лиганда О3 равны что

соответствует водородной связи. Таким образом, впервые определена кристаллическая структура промежуточной формы лакказы - нативного интермедиата, содержащего три кислородных лиганда в Т2/ТЗ кластере.

Предполагаемый механизм действия фермента.

Лакказа катализирует четырехэлектронное восстановление молекулярного кислорода до воды. Первичным акцептором электронов является Т1 центр. Теоретический расчет показал, что перенос электронов от иона меди первого типа может осуществляться двумя путями: через связи аминокислотных остатков или туннельным переносом (пространственно) Трипептид Шв-Сув-Ык играет роль "мостика" между ионом меди первого типа и трехъядерным медным кластером, обеспечивая наиболее благоприятный путь переноса электронов. Одной из связей, участвующих в туннельном переносе

Табл. 2. Корреляция длины водородной связи между атомом О

Cys448 и атомом S1N His447 и величиной ОВП иона меди Т1

Лакказа JTTl.mV Длина водородной связи, A

Coriolus hirsutus 072 812 + 10 2.70

Trametes versicolor 780±10 2.78

Coprinus cinereus 427 2.84

Ascorbate oxidase 1AOZ 340 2.88

His. Структурный анализ лакказ, полученных в кристаллическом состоянии, показал, что у высокоредокспотенциальных лакказ длина данной водородной связи в трипептиде His-Cys-His короче, чем у низкоредокспотенциальных лакказ (табл. 2). Таким образом, высокая эффективность катализа

высокоредокспотенциальными лакказами обеспечивается более высоким значением электрондвижущей силы, определяемой разницей окислительно-восстановительных потенциалов ионов меди Т1 и Т3, и более коротким путем переноса электронов. Перенос электрона на Т3 кластер завершает первую стадию катализа, за которой следует стадия восстановления кислорода с образованием двух молекул воды. Известно, что в каталитическом цикле лакказы участвуют несколько взаимопереходящих форм фермента, а именно пероксо-форма, полностью восстановленная форма, окисленная "покоящаяся" форма и нативный интермедиат. Взаимные переходы промежуточных форм лакказы и время их жизни в растворе в значительной степени зависят от рН и температуры. Согласно общепринятой классификации промежуточных форм фермента, нативным интермедиатом является такая форма, у которой все ионы меди трехъядерного медного кластера находятся в окисленном состоянии и каждый из них имеет кислородный лиганд - 01, 02 и 03 ("трехмостиковая" модель). Окисленная "покоящаяся" форма отличается от нативного интермедиата отсутствием кислородного лиганда 03. В структуре трехъядерного медного кластера лакказы С. ЫпШш установлено наличие трех кислородных лигандов, два из которых являются "мостиками" между ТЗ1 и ТЗг (О1) и между Т3| и Т2 (О3), а третий - кислородным лигандом только Т2 (О2). Таким образом, в отличие от других известных структур лакказ, имеющих два кислородных лиганда (окисленная "покоящаяся" форма), для лакказы С. НтШш получена структура в форме нативного интермедиата. Обобщая результаты структурных исследований, предложена гипотетическая схема механизма восстановления кислорода в трехъядерном кластере (рис. 13).

Восстановление кислорода может происходить двумя путями. Первый путь предполагает участие в катализе нативного интермедиата, который, получая электрон от Т1 центра, переходит в окисленную "покоящуюся" форму с сопутствующим отщеплением одной молекулы воды. Следует отметить, что

после отщепления воды кислородный лиганд 01 остается мостиковым между ионами меди антиферромагнитной пары, а кислородный лиганд 03 переходит в положение, занимаемое 02 лигандом. Второй путь восстановления молекулярного кислорода предполагает перестройку Т2/ТЗ кластера окисленной "покоящейся формы после переноса электрона с Т1 центра с образованием "мостика" между Т3| и Т2 ионами меди. Такая конформация ТЗ центра способна связывать кислород с образованием «мостика» между Т3( и Т32. При этом остальные кислородные лиганды (01 и 02) находятся в тех же положениях. Таким образом, образуется нативный интермедиат, который после протонирования и отщепления молекулы воды может переходить в окисленную "покоящуюся" форму. Кислородным лигандом Т2 у данной формы становится 01, а кислородный мостиковый лиганд между Т3( и Т2 отщепляется в составе молекулы воды.

Выводы.

1.Разработан протокол очистки лакказы из Coriolus hirsutas методом препаративного электрофореза.

2.Определена аминокислотная последовательность лакказы из Coriolus hirsutas 072 по нуклеотидной последовательности кДНК. Установлено, что высокоредокспотенциальные грибные лакказы имеют более 70% степени сходства аминокислотных последовательностей.

3.Показано, что лакказа существует в растворе в виде мономеров и димеров (соотношение 85% - 15%). Методами ЭПР и оптической спектроскопии установлено, что при размораживании препарата фермента происходит процесс конформационной перестройки активного центра, сопровождающийся изменением каталитической активности.

4.Найдены условия роста монокристаллов лакказы из Coriolus hirsutus 072. На синхротронном источнике рентгеновского излучения собран набор дифракционных данных с разрешением 1.85 А. Структура решена методом

молекулярного замещения. Проведено кристаллографическое уточнение структуры до R-фактора 18.15%.

5.Впервые получена структура нативного интермедиата, содержащего в центре трехьядерного кластера дополнительный кислородный лиганд. Установлена коррреляция между длиной водородной связи между атомом Cys 448 О и атомом His 447 SIN и величиной окислительно-восстановительного потенциала иона меди Т1.

6.На основании полученных структурных и спектроскопических данных предложен механизм восстановления молекулярного кислорода в процессе ферментативного катализа.

СПИСОКОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Koroleva О. V., Pegasova Т. V., Stepanova Е. V., Rebrikov D. V., Zwart P., Lamzin V. S. Crystallisation and preliminary X-ray analysis of the laccase from Coriolus hrsutus.ll Jahresbericht 2002, Annual Report, Part II, pp. 117-118.

2. Степанова E. В., Гаврилова В. П., Ландесман Е. О., Пегасова Т. В., Королева О. В. Сравнительное изучение лакказ Cerrena unicolor 095, Cerrena unicolor 0784 и Pleurotus ostreatus. Прикл.Биохим. и Микробиология, 39 (4) 2003, 375-381.

3. Pegasova T.V., Zwart P., Koroleva O.V., Stepanova E.V., Rebrikov D.V., Lamzin V.S. Crystallisation and preliminary X-ray analysis of a four-copper laccase from Coriolus hirsulus. Acta crystallographica, 2003, 59, 1459-1461

4. O. V. Koroleva, T. V. Pegasova, E. V. Stepanova, O. A. Harichkova, К. М. Polyakov, K. Schirwitz, V. S. Lamzin Preliminary X-ray analysis of the laccase from Coriolus zonaius.ll Jahresbericht 2003, Annual Report, Part II.

5. Koroleva O.V., Rebrikov D.V., Stephanova E.V., Pegasova T.V., Landesman E.O., Gavrilova V.P. Molecular Analysis of a Laccase Gene from the White Rot Fungus Coriolus hirsutus. PDB code AY081775.I, 2002.

6. Королева О. В., Пегасова Т. В., Степанова Е. В., Ландесман Е. О. Исследование структуры С. hirsutus лакказы и ее активного центра, 3-й Биохим. Съезд, С. Петербург, 2002, с.495.

7. Пегасова Т. В., Степанова Е. В., Явметдинов И. С, Ткачев Я. В., Королева О. В., Структура и функция медьсодержащей оксидазы - лакказы и ее роль в обеспечении биологической устойчивости базидиальных грибов. 10 Молодежная научная конференция. "Актуальные проблемы биологии и экологии", Сыктывкар, Апрель 2003, с. 166-167.

8. Пегасова Т.В., Королева О.В., Степанова Е.В., Рябов А.Д., Фермент -медиаторные системы нового поколения. Москва, II Московский международный Конгресс. Биотехнология: состояние и перспективы развития. Ноябрь, 2003, Часть 2,225-226.

9. Королева О.В., Степанова Е.В., Пегасова Т.В., Ткачев Я.В , Тимофеев В.П., Исследование конформационных изменений лакказы при различных температурах. Москва, II Московский международный Конгресс. Биотехнология: состояние и перспективы развития. Ноябрь, 2003, Часть 2, 236237.

10.Koroleva O.V., Pegasova T.V., Stepanova E.V., Zwart P., Lamzin V.S., Ryabov A.D. Structural study of native and modified with ruthenium complex laccase from Coriolus hirsutus, 5th International Conference on Molecular Structural Biology, Vienna, September 3-7, 2003, 126/P78.

Типография ИМАШ РАН, г. Москва, М. Харитоньевский пер , 4

Лиц ПД № 00492 от 12 04 2000

Зак № (Д^ от У). СМ. 20РУ тир {¡(¡О экз

»-7980

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Пегасова, Татьяна Владимировна

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

Введение,

1. Глава 1. Обзор литературы.

1.1 История изучения активного центра медьсодержащих оксидаз и их представителя — лакказы.

1.2 Подходы к изучению структуры активного центра.

1.3 Условия получения кристаллов лакказ из различных источников.

1.4 Исследование структур лакказ методом рентгеноструктурного анализа.

Ход полипептидной цепи лакказ.

Структура активного центра лакказ на основе данных РСА.

Особенности пространственного строения центра Т1.

Особенности пространственного строения Т2/ТЗ-кластера

1.5 Механизм действия фермента.

Внутримолекулярный перенос электрона.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура лакказы из Coriolus Hirsutus и строение ее активного центра"

Уникальные каталитические свойства ферментов уже сейчас обеспечили им применение в самых разных областях биотехнологии: от научных исследований (генная инженерия, изучение структуры биополимеров и т.д.) до промышленных процессов (биосенсорные технологии; органический синтез, создание новых фармацевтических препаратов; обесцвечивание бумажной пульпы и тканей; детоксификация ксенобиотиков, включая пестициды и нервно- паралитические агенты; стабилизация напитков). Практический интерес к изучению ферментов продиктован прежде всего их каталитическими характеристиками: активностью и специфичностью действия. Установление взаимосвязи между структурой ферментов и их функциями является одной из главных задач биохимии и основой для создания прикладных биотехнологий.

К настоящему времени охарактеризованы несколько тысяч ферментов, для многих из них достаточно подробно описаны структуры их комплексов с субстратами и предложены вероятные механизмы проявления биологической активности. Кроме того, на основе полученных данных, используя метод направленного мутагенеза, создаются ферменты с повышенной стабильностью, каталитической эффективностью и желаемой субстратной специфичностью. Таким образом, белковая и генная инженерия открывают серьезные возможности для получения биокатализаторов с заданными свойствами, что расширяет сферу практического использования ферментативного катализа.

Семейство лакказ — медьсодержащих оксид аз, впервые обнаруженных более столетия назад в Японском лаковом дереве Rhus vernicifera, по-прежнему остается предметом фундаментальных исследований. Ферменты этого семейства найдены не только в растениях, но также в грибах, бактериях и насекомых. Лакказа обладает способностью катализировать окисление различных соединений, включая о,п-дифенолы, аминофенолы, полифенолы, полиамины, структуры лигнина, некоторые неорганические ионы, арилдиамины с сопутствующим восстановлением молекулярного кислорода до воды. Кроме того, она способна осуществлять прямой биоэлектрокатализ, то есть прямой перенос электрона с электрода на активный центр фермента. Физиологические функции лакказы поражают разнообразием и включают: участие в процессах формирования пигментов и образования плодовых тел грибов, биодеградацию лигнина и детоксификацию фенолов. Вышеперечисленные свойства данных ферментов обеспечивают возможность их широкого применения в различных отраслях биотехнологии.

Для более эффективного практического использования фермента в биотехнологии необходимым условием является детальное установление механизма катализа. Для получения фермента с более высокой стабильностью и активностью основным подходом является получение рекомбинантных ферментов и последующая модификация их точечными мутациями. Проведение таких исследований возможно только после расшифровки как первичной, так и пространственной структуры. Основные вопросы, до сих пор не решенные при исследовании данной группы ферментов, суммированы ниже:

- не выяснен механизм генерации окислительно-восстановительного потенциала Т1 -центра на структурном уровне, что имеет первостепенное значение для проявления каталитических свойств;

- не выяснен механизм восстановления кислорода и роль отдельных медных центров (Т2 и ТЗ) в этом процессе;

- не выяснен механизм биоэлектрокатализа и его связь с гомогенным катализом;

- не выяснена роль и структура отдельных интермедиатов в процессе катализа и условия их взаимных переходов.

Выяснение данных вопросов невозможно без определения пространственной структуры высокоредокспотенциальных лакказ, то есть ферментов, наиболее эффективно осуществляющих каталитическое превращение субстрата.

Установление трехмерной структуры ферментов на сегодняшний день проводится с использованием двух основных методов -рентгеноструктурного анализа и ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Однако возможности ЯМР-спектроскопии при исследовании ряда белков ограничены. Особые трудности возникают при изучении парамагнитных металлобелков, так как взаимодействие их неспаренных электронов с ядерными спинами вызывает значительное изменение химических сдвигов ядер и увеличение скоростей ядерной релаксации (спин-решеточной и спин-спиновой), что приводит к уширению сигналов, препятствуя их детектированию в спектре ЯМР, и, таким образом, затрудняет получение данных о структуре изучаемой системы.

Очевидно, что основным методом изучения структуры лакказы -медьсодержащего парамагнитного белка — является рентгеноструктурный анализ. Несмотря на получение фермента в кристаллическом виде, имеющиеся данные недостаточны для объяснения свойств лакказы. Таким образом, необходимо изучение структуры ряда высокоредокспотенциальных лакказ для установления взаимосвязи "структура - функции". В настоящей работе были поставлены следующие задачи: определение аминокислотной последовательности данного фермента; исследование структуры фермента и его активного центра при температурно-фазовых переходах; определение по дифракционным данным кристаллической структуры белка.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Пегасова, Татьяна Владимировна

ВЫВОДЫ.

1. Разработан протокол очистки лакказы из Coriolus hirsutus методом препаративного электрофореза, который позволил получить гомогенный препарат фермента с высокой удельной активностью.

2. Определена аминокислотная последовательность лакказы из Coriolus hirsutus 072 по нуклеотидной последовательности кДНК. Установлено, что высокоредокспотенциальные грибные лакказы имеют более 70% степени сходства аминокислотных последовательностей, при этом аминокислотные остатки, координирующие ионы меди, 100% идентичны у лакказ и аскорбат оксидазы.

3. Показано, что лакказа существует в растворе в виде мономеров и димеров (соотношение 85% - 15%). Методами ЭПР и оптической спектроскопии установлено, что при размораживании препарата фермента происходит процесс конформационная перестройка активного центра, сопровождающаяся изменением каталитической активности.

4. Найдены условия роста монокристаллов лакказы из Coriolus hirsutus 072: 0.05 М К-фосфатный буфер рН 7.0, 10% в/о ПЭГ 1000, 10% в/о ПЭГ 8000. На синхротронном источнике рентгеновского излучения собран набор дифракционных данных с разрешением 1.85 А. Структура решена методом молекулярного замещения. Проведено кристаллографическое уточнение структуры до R-фактора 18.15%.

5. Показано, что аксиальные Phe 458 и Не 450 находятся на равном расстоянии (3.6 А) от иона меди Т1. Установлена коррреляция между длиной водородной связи между атомом Cys 448 О и атомом His 447 51N и величиной окислительно-восстановительным потенциалом иона меди Т1. Впервые получена структура нативного интермедиата, содержащего в центре трехъядерного кластера дополнительный кислородный лиганд.

6. На основании полученных структурных и спектроскопических данных предложен механизм восстановления молекулярного кислорода в процессе ферментативного катализа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Пегасова, Татьяна Владимировна, Москва

1. Malmstrom В. G. Early and more recent history in the research on multi-copper oxidases //In Multicopper oxidases (Messerschmidt A., Ed.), World Scientific, Singapore, New Jersey, London, Hong Kong, 1997, pp. 1-22.

2. Bertrand G. //Compt. Rend. Acad. Sci., 1894, v. T118, pp. 1215.

3. Keilin D., Mann T. Laccase, a blue copper-protein oxidase from the latex of Rhus succedanea.// Nature, 1939, v. 143, pp. 23 24.

4. Malmstrom B. G., Mosbach R., Vanngard T. An electron spin resonance study of the state of copper in fungal laccase.//Nature, 1959, v. 183, pp. 321 322.

5. Branden R., Deinum J., Coleman M. A mass spectrometric investigation of the reaction between 18Ог and reduced tree laccase. A differentiation between the two water molecules formed.// FEBS Lett., 1978, v. 89, pp. 180 182.

6. Gray H. В., Solomon E. I. Electronic Structures of Blue Copper Centers in Proteins.// Copper Proteins, ed. T. G. Spiro (Wiley, New York, 1981) pp. 1-39.

7. Gray H. В., Malmstrom B. G. On the relationship between protein-forced ligand fields and the properties of blue copper centers.// Comments Inorg. Chem., 1983, v. 2, pp. 203 209.

8. Spira-Solomon D. J., Allendorf M. D., Solomon E. I. Low-Temperature Magnetic Circular Dichroism Studies of Native Laccase: Confirmation of a Trinuclear Copper Active Site.// J. Am Chem. Soc., 1986, v. 108, pp. 5318 -5328.

9. Cole J. M., Avigliano L., Morpurgo L., Solomon E. I. Spectroscopic and chemical studies of the ascorbate oxidase trinuclear copper active site: Comparison to laccase.//J. Am Chew. Soc., 1991, v. 113, pp. 9080 9089.

10. Solomon E. I., Lowery M. D., LaCroix L. В., Root D. E. Electronic absorption spectroscopy of copper proteins.// Methods Enzy-mol., 1993, v. 226, pp. 1- 33.

11. Solomon E.I., Sundaram U.M., Machonkin Т.Е. Multicopper oxidases and oxygenases.// Chem. rev., 1996, v.96, N 7, pp.2563 2605.

12. Malmstrom B. G., Reinhammar В., Vanngard T. Two forms of copper (II) in fungal laccase.// Biochim. Biophys. Acta., 1968, v. 156, pp. 67 76.

13. Hanna P.M., McMillin D.R., Pasenkiewicz-Gierula M., Antholine W.E., Reinhammar B. Type 2 depleted fungal laccase.// Biochem. J., 1988, v. 253, N 2, pp. 561 -568.

14. Beinert H., Griffiths D. E., Wharton D. C., Sands R. H. Properties of the copper associated with cytochrome oxidase as studied by paramagnetic resonance spectroscopy.//J. Biol. Chem., 1962, v. 237, P. 2337 2346.

15. Blumberg W. E., Levine W. G., Margolis S., Peisach J. On the nature of copper in two proteins obtained from Rhus vernicifera latex.// Biochem. Biophys. Res. Commun., 1964, v. 15, P. 277 283.

16. Fee J. A., Malkin R., Malmstrom B. G., Vanngard T. Anaerobic oxidation-reduction titrations of fungal laccase. Evidence for several high potential electron-accepting sites.// J. Biol. Chem., 1969, v. 244, P. 4200 4207.

17. Malmstrom B. G., Finazzi Agro A., Antonini E. The mechanism of laccase-catalyzed oxidations: kinetic evidence for the involvement of several electron-accepting sites in the enzyme.// Eur. J. Biochem., 1969, v. 9, p. 383 391.

18. Messerschmidt A., Spatial structure of ascorbate oxidase, laccase and related proteins: implications for the catalytic mechanism.// A. Messerschmidt (Ed.), Multi-Copper Oxidases, Singapore, 1997, pp. 23 79

19. Messerschmidt A., Huber R. The blue oxidases, ascorbate oxidase, laccase and ceruloplasmin. Modelling and structural relationships.// Eur Biochem., 1990, v. 187, pp. 341 -352.

20. Solomon E.I. Binuclear copper active site: Hemocyanin, tyrosinase, and type 3 copper oxidases.// In Spiro, T.G., Ed. Copper Proteins. Wiley, New York, 1981, pp. 41-108.

21. Solomon E.I. Coupled binuclear copper proteins: Catalytic mechanisms and structure-reactivity correlations.// Prog. Clin. Biol. Res., 1988, v. 274, pp. 309-329.

22. Solomon E.I., Penfield K.W., Wilcox D.E. Active sites in copper proteins. An electronic structure overview.// Structure and Bonding, 1983, v. 53, pp. 1 57.

23. Cole J. L., Clark P. A., Solomon E. Spectroscopic and chemical studies of the laccase trinuclear copper active site: Geometric and electronic structure.// Am. Chem. Soc., 1990, v. 112, pp. 9534 9548.

24. La Mar G.N., W. de W., Horrocks Jr., Holm R.H. NMR of Paramagnetic Molecules.// Acad. Press, New York, 1973.

25. Bertini I., Luchinat C. NMR of Paramagnetic Molecules in Biological Systems.// Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA, 1986.

26. Banci L., Bertini I., Luchinat C. Nuclear and Electron Relaxation. The Magnetic Nucleus-unpaired Electron Coupling in Solution, VCH, Weinheim, 1991

27. Piontek K., Antorini M., Choinowski T. Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.90-A resolution containing a full complement of coppers.// J. Biol. Chem., 2002, v. 277, N 40, pp.37663 37669.

28. Hakulinen N., Kiiskinen L.L., Kruus K., Saloheimo M., Paananen A., Koivula A., Rouvinen J. Crystal structure of a laccase from Melanocarpus albomyces with an intact trinuclear copper site.// Nat. Struct. Biol., 2002, v. 9, N 8, pp. 601 -605.

29. Enguita F.J., Martins L.O., Henriques A.O., Carrondo M.A. Crystal structure of a bacterial endospore coat component. A laccase with enhanced thermostability properties.// J. Biol. Chem., 2003, v. 278, N 21, pp. 19416- 19425.

30. Zaitsev V. N., Zaitseva I., Papiz M., Lindley P. An X-ray crystallographic study of the binding sites of the azide inhibitor and organic substrates to ceruloplasmin, a multi-copper oxidase in the plasma.// Biol. Inorg. Chem., 1999, v. 4, pp. 579-587.

31. Graziani M.T., Antonilli L., Sganga P., Citro G., Mondovi В., Rosei M.A. Biochemical and immunological studies of deglycosylated Rhus vernicifera laccase.//Biochem Int., 1990,v. 21, N 6, pp. 1113 1124.

32. Messerschmidt A., Rossi A., Ladensteinm R., Huber R., Bolognesi M., Gatti G., Marchesini A., Pettuzzelli R., Finazzi-Agro A. X-ray Crystal Structure of the blue oxidase Ascorbate Oxidase from Zucchini // Mol. Biol., 1989, v. 206, pp. 513-529.

33. Messerschmidt A., Luecke H., Huber R. X-ray structures and mechanistic implications of three functional derivatives of ascorbate oxidase from Zucchini.// J. Mol. Biol., 1993, v. 230, N 3, pp. 997 1014.

34. Reinhammar B.R.M. Oxidation-reduction properties of the electron acceptors in laccase and stellacyanin.// Biochim. Biophys. Acta, 1972, v. 275, pp. 246 259.

35. Andreasson L.-E., Reinhammar B. Kinetic studies of Rhus vernicifera laccase. Role of metal centers in electron transfer.// Biochim. Biophys. Acta, 1976, v. 73, pp. 579-597.

36. Yaropolov A.I., Skorobogat'ko O.V., Vartanov S.S., Varfolomeyev S.D. Laccase: propeties, catalytic mechanism, and applicability.// Appl. Biochim. Biotech., 1994, v. 49, N 3, pp. 257 280.

37. Xu F., Palmer A., Yaver D. S., Berka R. M., Gambetta G. A., Brown S. H., Solomon E. I. Targeted mutations in a Trametes villosa laccase: Axial perturbations of the Tl Cu.//J. Biol. Chem., 1999, v. 274, pp. 12372 12375.

38. Farver O., Skov L.K., Pascher Т., Karlsson B.G., Nordling M., Lundberg L.G., Vanngard Т., Pecht I. Intramolecular electron transfer in single-site-mutated azurins. // Biochemistry, 1993, v. 32, pp. 7317 7322.

39. Froehner S.C., Eriksson K.E. Purification and properties of Neurospora crassa laccase.// J. Bacterid., 1974, v. 120, N 1, pp. 458 465.

40. Huang H., Zoppellaro G., Sakurai T. Spectroscopic and Kinetic Studies on the Oxygen-centered Radical Formed during the Four-electron Reduction Process of Dioxygen by Rhus vernicifera Laccase.// J. Biol. Chem., 1999, v. 274, N 46, pp. 32718-32724.

41. Kyritsis P., Messerschmidt A., Huber R., Salmon G.A., Sykes A.G. Pulse Radiolysis Studies on Ascorbate Oxidase from Zucchini.// J. Chem. Soc., Dalton Trans., 1993, v. 5, pp. 731 735.

42. Onuchic J. N., Beratan D.N. A predictive theoretical-model for electron-tunneling pathways in proteins.// J. Chem. Phys., 1990, v. 92, pp. 722 725.

43. Beratan D.N., Onuchic J. N., Gray H.B. Electron tunneling pathways in proteins// In Metal Ions in Biologycal Systems (Sigel H. and Sigel A. Eds.), Dekker, New York, 1991, pp. 97 -127.

44. Beratan D.N., Onuchic J.N., Betts J.N., Bowler В., Gray H.B. Electron mediation pathways in ruthenated proteins.// J. Am. Chem. Soc., 1990, v. 112, pp. 7915 -7921.

45. Cole J.L., Ballou D.P., Solomon E. Spectroscopic characterization of the peroxide intermediate in the reduction of dioxygen catalyzed by the multicopper oxidases// Am. Chem. Soc., 1991, v. 113, pp. 8544 8546.

46. Cole J.L., Tan G.O., Yang E.K., Hodgson K.O., Solomon E. Reactivity of the laccase trinuclear copper active site with dioxygen: An X-ray absorption edge study.// Am. Chem. Soc., 1990, v. 112, pp. 2243 2249.

47. Aasa R., Branden R., Deinum J., Malmstrom B.G., Reinhammar В., Vanngard T. A paramagnetic intermediate in the reduction of oxygen by reduced laccase.//FEBS Letters, 1976, v. 61, N2, pp. 115-119.

48. Andreasson L.-E., Branden R., Malmstrom B.G., Vanngard T. An intermediate in the reaction of reduced laccase with oxygen.// FEBS Letters, 1973, v. 32, pp. 187- 189.

49. Clark P. A., Solomon E. Magnetic circular dichroism spectroscopic definition of the intermediate produced in the reduction of dioxygen to water by native laccase.// Am. Chem. Soc., 1992, v. 114, pp. 1108 1110.

50. Morie-Bebel M.M., Morris M.C., Menzie J.L., McMillin D.R. A mixed-metal derivative of laccase containing mercury (II) in the Type 1 binding site.// J. Am. Chem. Soc., 1984, v. 106, pp. 3677 3687.

51. Branden R., Deinum J. Type 2 copper (II) as a component of the dioxygen reducing site in laccase. Evidence from EPR experiments with 170.// FEBS Lett., 1977, v. 73, N 2, pp. 144 146.

52. Langford V.S., Williamson B.E. Magnetic circular dichroism of the hydroxyl radical in an argon matrix.// J. Phys.Chem. A, 1997, v. 101, pp. 3119 3124.

53. Andreasson L.-E., Branden R., Reinhammar B. Kinetic studies of Rhus vernicifera laccase. Evidence for multi-electron transfer and an oxygen intermedaite in the reoxidation reaction.// Biochim. Biophys. Acta, 1976, v. 438, pp. 370-379.

54. Branden R., Deinum J. Effect of pH on oxygen intermediate and dioxygen reduction site in blue oxidases.// Biochem. Biophys. Acta, 1978, v. 524, N 2, pp. 297 304.

55. Aasa R., Branden R., Deinum J., Malmstrom B.G., Reinhammar В., Vanngard T. A 170-effect on the EPR spectrum of the intermediate in the dioxygen-laccase reaction.// Biochem. Biophys. Res. Commun., 1976, v. 70, N 4, pp. 1204- 1209.

56. Lindley P.F., Card G., Zaitseva I., Zaitsev V., Reinhammar В., Selin-Lindgren E., Yoshida K. An X-ray structural study of human ceruloplasmin in relation to ferroxidase activity // J. Biol. Inorg. Chem., 1997, v. 2, pp. 454 463.

57. Farver O., Pecht I. Electron transfer in proteins: in search of preferential pathways // FASEB J., 1991, N 11, pp. 2554 2559.

58. Farver O., Pecht I. Low activation barriers characterize intramolecular electron transfer in ascorbate oxidase.// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, v. 89, pp. 8283 8287.

59. Farver O., Wherland S., Pecht I. Intramolecular electron transfer in ascorbate oxidase is enhanced in the presence of oxygen.// J. Biol. Chem., 1994, v. 269, pp. 22933 -22936.

60. Hansen F.B., Koudelka G.B., Noble R., Ettinger M.J. Effects of a Single Reduction?Reoxidation Cycle on the Kinetics of Copper Reduction in Rhus Laccase.// J. Biochemistry, 1984, v. 23, pp. 2057 2064.

61. Reinhammar B. J. An EPR signal from the half-reduced type 3 copper pair in Rhus vernicifera laccase. // Inorg. Biochem., 1981, v. 15, pp. 27 39.

62. Davis B.J. Disc electrophoresis: Method and application to human serum protein.// Ann. NY Acad. Sci., v. 121, pp. 404 407.

63. Westermeier R. Electrophoresis in practice, Weinheim-New York-Basel-Cambridge-Tokyo, VCH, 1993.

64. Варфоломеев С.Д., Наки А., Ярополов А.И. Кинетика и механизм каталитического восстановления молекулярного кислорода в присутствии лакказы.// Биохимия, 1985, т. 50, N 9, с. 1411-1419.

65. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal. Biochem., 1987, v. 162, pp. 156- 159.

66. Matz M., Shagin D., Bogdanova E., Britanova O., Lukyanov S., Diatchenko L., Chenchik A. Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR.// Nucleic Acids Res., 1999, v. 27, N 6, pp. 1558-1560.

67. Joensson L., Sjoestroem K., Haeggstroem I., Nyman P.O. Characterization of a laccase gene from the white-rot fungus Trametes versicolor and structural features of basidiomycete Laccases. // Biochim. Biophys. Acta, 1995, v. 1251, pp. 210-215.

68. Eggert C., LaFayette P.R., Temp U., Eriksson K.E., Dean J.F. Molecular analysis of a laccase gene from the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus.// Appl. Environ. Microbiol., 1998, v. 64, N 5, pp. 1766 1772.

69. Yaver D.S., Golightly E.J. Cloning and characterization of three laccase genes from the white-rot basidiomycete Trametes villosa: genomic organization of the laccase gene family Gene., 1996, v. 181, N 1-2, pp. 95 102.

70. Germann U.A., Lerch K. Isolation and partial nucleotide sequence of the laccase gene from Neurospora crassa: amino acid sequence homology of the protein to human ceruloplasmin.// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, v. 83, N 23, pp. 8854-8858.

71. Nitta K., Kataoka K., Sakurai T. Primary structure of a Japanese lacquer tree laccase as a prototype enzyme of multicopper oxidases.// J. Inorg. Biochem, 2002, v. 91, N 1, pp. 125-131.

72. Huang H.-W., Sakurai Т., Maritabo S., Marchesini A., Suzuki Sh. EPR and magnetic susceptibility studies of the trinuclear copper center in native and azide-reacted zucchini ascorbate oxidase // J. Inorgan. Biochem., 1999, v. 75, pp. 20 25.

73. Abragam A., Bleany B. Electron paramagnetic resonance of transition ions, Clarendon Press, Oxford, 1970

74. McPherson A. Preparation and analysis of protein crystals, John Wiley & Sons, Inc., 1982.

75. Otwinowski Z., Minor W. // Meth. Enz., 1997, v. 276, pp. 307 326.

76. Malkin R., Malmstrom B.G., Vanngard T. The reversible removal of one specific copper(II) from fungal laccase.// Eur. J. Biochem., 1969, v. 7, N 2, pp. 253 -259.

77. Горбатова O.H., Степанова E.B., Королева O.B. Изучение некоторых биохимических и физико-химических свойств индуцибельной формы внеклеточной лакказы базидиомицета Coriolus hirsutus.// Прикладная биохимия и микробиология., 2000, т. 36, N 3, с. 272 277.

78. Salas C., Lobos S., Larrain J., Salas L., Cullen D., Vicuna R. Properties of laccase isoenzymes produced by the basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora.// Biotechnol. Appl. Biochem., 1995, v.21, pp. 323 333.

79. Glenn J.K., Gold M.H. Purification and properties of an extracellular Mn (Il)-dependent peroxidase from the lignin-degrading basidiomycete Phanerochaete chrisosporium.// Arch. Biochem. Biophys., 1985, v. 242, pp. 329-341.

80. Gibson T.D., Hulbert J.N., Parker S.M., Woodward J.R., Higgins I.J. // Biosensors & Bioelectronics, 1992, N 3, pp. 701 -708.

81. Alden M., Magnusson A. Effect of temperature history on the freeze-thawing process and activity of LDH formulations.// Pharm Res., 1997, v. 4, pp. 426-30.

82. Svergun D.I., Semenyuk A.V., Feigin L.A. Small angle scattering data treatment by the regularization method.// Acta Cryst. A., 1988, v. 24, pp. 244-251.

83. Svergun D.I., Volkov V.V., Kozin M.B.; Stuhrmann H.B., Barberato C., Koch M.H.J. Shape Determination from Solution Scattering of Biopolymers.// J. Appl. Cryst., 1997, v. 30, pp. 798 802.

84. Maritano S., Carsughi F., Fontana M.P., Marchesini A. Study of the enzyme ascorbate oxidase by small angle neutron scattering.// Journal of Molecular Structure, 1996, v. 383, N 1-3, pp. 261 265.

85. Li K., Xu F., Eriksson K.E. Comparison of fungal laccases and redox mediators in oxidation of a nonphenolic lignin model compound.// Appl. Environ. Microbiol., 1999, v. 65, N 6, pp. 2654 2660.

86. Reinhammar B. Purification and properties of laccase and stellacyanin from Rhus vernicifera.// Biochem. Biophys. Acta., 1970, v. 205, N 1, pp. 35-47.

87. Hope H. Crystallography of biological macromolecules a generally applicable method.// Acta Cryst., 1988, v. B44, pp. 22 26.

88. Matthews B.W. Solvent content of protein crystals.// J. Mol. Biol., 1968, V. 33, pp. 491 -497.

89. Vagin A. A., Murshudov G. N., Strokopytov В. V. The BLANC program suite for Protein Crystallography.// J. Appl. Cryst., 1998, v. 31, pp. 98-102.

90. Murshudov G.N., Vagin A.A., Dodson E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method.// Acta Cryst., 1997, v. D53, pp. 240 255.

91. Murshudov G.N., Lebedev A., Vagin A.A., Wilson K.S., Dodson E.J. Efficient anisotropic refinement of Macromolecular structures using FFT.// Acta Cryst., 1999, v. D55, pp. 247 255.

92. Jones T.A., Bergdoll M., Kjeldgaard M. O: A macromolecular modeling environment.// In Crystallographic and Modeling Methods in Molecular Design (Bugg C., Ealick S., Eds.), Springer-Verlag Press, 1990, pp. 189- 195.

93. Laskowski R.A., MacArthur M.W., Moss D.S., Thornton J.M. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures.// J. Appl. Cryst., 1993, v. 26, pp. 283 291.