Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и каталитические свойства системы "трипсин - обращенная мицелла" в условиях изменения температуры

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структура и каталитические свойства системы "трипсин - обращенная мицелла" в условиях изменения температуры"

На правах рукописи

Захарченко Наталия Леруновна

СТРУКТУРА И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СИСТЕМЫ "ТРИПСИН - ОБРАЩЕННАЯ МИЦЕЛЛА" В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ

03.00.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2004

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биофизики Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук.

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук,

старший научный сотрудник Ю.Ф. Зуев

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор А.В. Анисимов

доктор химических наук, профессор А.В. Левашов-

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии

растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов

Защита состоится

3 Os^bjUX

2004 г. в

//

часов на заседании

диссертационного совета К002.005.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биохимии и биофизики КНЦ РАН {420111, г. Казань, а/я 30,ул. Лобачевского, 2/31)

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Казанского научного центра РАН

Автореферат разослан

2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

А.Б. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ферментативные реакции в биологической клетке чаще всего протекают вблизи или на поверхности раздела фаз. Среда, в которой существуют ферменты in vivo, по своим физико-химическим свойствам (полярность, вязкость, диэлектрическая проницаемость и пр.) и химическому составу существенно отличается от водных растворов, используемых во многих энзимологических исследованиях.

Системой, позволяющей максимально естественно моделировать природную иммобилизацию ферментов и их микроокружение, являются дисперсии обращенных мицелл. Дисперсии обращенных мицелл обладают такими качествами, незаменимыми при исследовании механизмов функционирования ферментов, как термодинамическая устойчивость и возможность изменять физико-химические параметры локального микроокружения фермента и субстрата. Они позволяют осуществить реакционный контакт соединений, растворимых в несмешивающихся растворителях. Кроме того, оптическая прозрачность систем обращенных мицелл позволяет контролировать спектральными методами структуру и каталитическую активность иммобилизованных в них ферментов. Многие ферменты демонстрируют значительную стабильность и высокую активность в системах обращенных мицелл, хотя в сравнении с водной средой могут проявлять специфические особенности (в изменении оптимума рН, субстратной специфичности и др.).

Одной из наиболее распространенных систем, используемых для моделирования происходящих в клетке процессов является обращенная микроэмульсия, стабилизированная анионным поверхностно-активным веществом бис(2-этилгексил)сульфо-сукцинатом натрия (Аэрозоль ОТ или АОТ). Наряду с такими свойствами, выигрышными с позиций мицеллярной энзимологии, как высокая солюбилизирующая емкость по отношению к воде, узкое распределение мицелл по размерам, эта система характеризуется тенденцией к кластеризации мицелл. Условия, при которых происходит спонтанная кластеризация мицелл в обращенных микроэмульсиях на основе АОТ, являются следствием внутренних перестроек в мицеллах, например, под действием температуры. При этом возможны изменения параметров локального микроокружения солюбилизированных реагентов.

Цели и задачи исследования. Целью работы является изучение структурных характеристик обращенных микроэмульсий на основе АОТ как среды для ферментативных процессов, а именно для гидролитического расщепления сложноэфирных связей в присутствии трипсина, и поиск взаимосвязи между структурными и каталитическими характеристиками системы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Изучить температурные изменения в структуре обращенных микроэмульсий методами ЯМР-самодиффузии и кондуктометрии.

• Исследовать влияние добавок/реагентов на структуру гидрофобной оболочки обращенных мицелл на основе АОТ методами ЭПР спинового зонда и кондуктометрии.

• На примере щелочного гидролиза сложных эфиров изучить каталитический эффект системы обращенных мицелл в условиях ее структурных перестроек под действием температуры.

• На примере гидролиза И-а-бензоил-Ь-аргинин этилового эфира (БАЭЭ) и п-нитрофенилацетата (ПНФА) в присутствии трипсина исследовать взаимосвязь структуры и каталитических свойств системы «фермент - обращенная мицелла».

Научная новизна:

• Исследована структура и каталитическая активность трипсина в условиях температурных перестроек обращенных мицелл, стабилизированных АОТ.

• Установлено, что максимум каталитической активности трипсина при гидролизе специфического катионного субстрата БАЭЭ в системе обращенных мицелл на основе АОТ смещается вниз по температурной шкале по сравнению с водным раствором, а при гидролизе неспецифического субстрата ПНФА такого смещения не наблюдается.

• На основании данных ИК-спектроскопии показано, что кооперативное плавление вторичной структуры трипсина в системе обращенных мицелл и водном растворе наблюдается в одном температурном интервале.

• Установлено, что вытеснение воды солюбилизированным ферментом в приполярную область монослоя АОТ обращенной мицеллы оказывает пластифицирующее действие на гидрофобную область мицелл, которое проявляется в нарушении упорядоченности упаковки углеводородных радикалов молекул АОТ.

• Предложен простой способ определения локализации субстратов в структуре обращенных мицелл, основанный на изменениях положения перколяционного перехода на температурной зависимости электропроводности микроэмульсий вода/масло.

Практическое значение работы.

• Полученные результаты расширяют и углубляют знания о физико-химических свойствах микроэмульсионных реакционных сред и об особенностях поведения солюбилизированных в них ферментов; они могут быть использованы для прогнозирования механизмов влияния внешних условий на функционирование ферментов в биологических системах и системах обращенных мицелл.

• Предложен новый методический подход, позволяющий качественно оценить место локализации реагентов в микрогетерогенной структуре обращенных мицелл.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международном симпозиуме «Lipid and Surfactant Dispersed Systems» (Москва, 1999); на 2 съезде биофизиков России (Москва, 1999); на Международной конференции «Biocatalysis-2000: fundamentals and applications» (Москва, 2000); на 1 Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов НОЦ КГУ «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2000); на Школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000); на 12 юбилейной конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001); на 5 Путинской конференции молодых ученых «Биология -наука 21-го века» (Пущино, 2001); на Международной конференции «Biocatalysis -2002: fundamentals & applications» (Москва, 2002); на 7 Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука 21-го века» (Пущино, 2003); на 5 -10 Всероссийских конференциях «Структура и динамика молекулярных систем» (Ка-

зань-Москва-Йошкар-Ола-Уфа, 1998-2003); на итоговых конференциях и семинарах КИББ КНЦ РАН (1998-2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 статей (из них 3 в международной печати, 6 в центральной печати, 8 в сборниках) и 6 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав и выводов. Работа изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 47 рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает 135 источников, из них на русском языке 36.

Работа выполнена при частичной поддержке РФФИ (гранты № 99-03-32037; 0103-06032; 02-03-32923).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении кратко обоснованы выбор темы и актуальность работы, сформулированы цель и задачи исследования.

В первой главе дается обзор современных представлений и экспериментальных данных по структуре и физико-химическим свойствам высокоорганизованных систем на основе поверхностно-активных веществ (ПАВ). Рассмотрены возможности методов, используемых в диссертации для исследования - структуры мицеллярных систем. Проведен краткий анализ известных данных по мицеллярному каталитическому эффекту в процессах химической трансформации органических соединений. Рассмотрены основные теоретические положения и экспериментальные данные о функциональной стабильности ферментов в системах обращенных мицелл.

Вторая глава содержит описание экспериментальных подходов - ЯМР с Фурье-преобразованием и импульсным градиентом магнитного поля (ЯМР ФП ИГМП), ЭПР спиновых зондов, кондуктометрии и ИК-спектроскопии, использованных в работе для исследования структуры систем обращенных мицелл, модификации структуры гидрофобных оболочек обращенных мицелл добавками/реагентами и структурного состояния трипсина. Описаны условия проведения кинетических экспериментов. Даются характеристики объектов исследования, методики приготовления образцов, обсуждается проведение измерений и обработка результатов.

• Коэффициенты самодиффузии компонентов микроэмульсий получены методов ЯМР ФП ИГМП на усовершенствованном ЯМР-спектрометре Тесла Б8 587 А с частотой резонанса 80 МГц на ядрах 'Н.

• Спектры ЭПР регистрировались на радиоспектрометре РЭ 1306 (СССР). В качестве спинового зонда использовалась 4-(2-н-ундецил-3-оксил-4,4-диметил-2-оксазолидинил) масляная кислота (4-8ЬБЛ). В исследованных системах молекулы 4-8ЬБЛ встраиваются в монослой АОТ, при этом их полярные группы располагаются на границе раздела вода/АОТ обращенных мицелл, а углеводородные радикалы направлены в сторону масляной фазы. Подвижность спинового зонда определяется структурной организацией окружающих его молекул АОТ.

• Изучение структуры трипсина проводилось на ИК - Фурье спектрофотометре Уес-1ог-22 (Бгикег) при спектральном разрешении см'1. Спектры записывались после 64 накоплений. Измерения выполнены в температурном диапазоне 20 - 60°С в термостатируемых кюветах -10 мкм из СаБ2-

• Электропроводность микроэмульсии вода/масло измерялась с использованием кондуктометра ОК 102/1 (КаёеИкВ, Венгрия) на частоте 80 Гц и 3 кГц. Измерения проводились в термостатируемой плоско-параллельной ячейке. Температура контролировалась с точностью ±0.2°С.

• Кинетические измерения выполнены на спектрофотометре ЦУ-УК 8рееов1 в термостатируемых кюветах с толщиной поглощающего слоя 0.5см. Скорость процесса определялась по изменению оптической плотности растворов во времени (при 400 нм для ПНФА и при 255 нм для БАЭЭ).

Третья глава посвящена исследованию структуры систем обращенных мицелл на основе АОТ и модификации структуры гидрофобной оболочки мицелл под действием добавок/реагентов. В работе использовались микроэмульсии вода-АОТ-декан, в которых размер водных ядер обращенных мицелл характеризуется молярным отношением вода/АОТ а концентрация мицелл - концентрацией ПАВ (Сдот)-

Использование метода ЯМР ФП ИГМП, который основан на комбинации традиционного метода ЯМР с ИГМП и возможностей экспериментальной техники ЯМР высокого разрешения (Рис.1), позволило получить коэффициенты само диффузии (КСД) всех составляющих исследуемых многокомпонентных систем и проследить за температурными изменениями, происходящими в них (Рис.2). Применение соотно-

шения Стокса-Эйнштейна с поправочными коэффициентами, учитывающими столкновения мицелл друг с другом и препятствия со стороны мицелл для молекул органической фазы (декан), позволило по экспериментальным КСД определить размеры мицелл. Так для системы с и^=20 радиус мицелл равен 4.8 нм.

3 2 1

1

H -

--j --------.-,- с- v—-

И ' 1 ' M 1 ' 1 M 1 ' 1 M 1 1 1 I ' 1 1 1 I ' 1 1 1 I ' 1 1 ' I ' 1 ' '

7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

Рис. 1. Диффузионные спады резонансных сигналов протонов для микроэмульсии вода/декан, стабилизированной АОТ, полученные с помощью ЯМР с ИГМП и Фурье преобразованием. (1 - метальные группы АОТ и декана, 2 - метиленовые группы АОТ и декана, 3 - вода).

Однако КСД АОТ и воды отражают диффузионное движение отдельных мицелл (низкотемпературный, прямолинейный участок зависимостей на Рис. 2) только при определенных условиях, которые определяются составом среды и температурой. При повышении температуры КСД АОТ и воды резко увеличиваются, что связано с образованием кластеров из мицелл в системе и обменом молекул воды и АОТ между мицеллами. Факт кластеризации мицелл подкрепляется также данными кондуктомет-рии, когда при определенной температуре наблюдается резкое увеличение электропроводности микроэмульсии, именуемое электрической перколяцией (Рис.3).

* Feldman Y., Kozlovich N.. Nir I., Garti N. // Phys. Rev. E, 1995,51,478-491.

Рис. 2. Температурная зависимость КСД компонентов микроэмульсии, стабилизированной АОТ: 1-декана, 2-воды, 3-АОТ. "0=26.3, Сдог1 0.047 М Стрелкой показана температура перколяционного перехода Тп, полученная методом электропроводности.

а, мкСм/см

10'•

10"

У --

ш ■ Т=31,5°С|

■ / | 7 !

;

/ /

> • ! • ш т * V.

—■—1—-

-0,4

0,5

О.

9 а. Н

, о

Л

10 20 30 40 50 60

Т,°С

Рис 3. Электропроводность микроэмульсии вода-АОТ-декан. (Пунктир - первая производная электропроводности по температуре).

Структурные исследования в микроэмульсиях, выполненные методами ЯМР ФП ИГМП и кондуктометрии позволили определить температурный диапазон кластеризации мицелл. Процесс кластеризации связан с изменениями, происходящими в

структуре гидрофобной оболочки мицелл, и при использовании микроэмульсий вода/масло в качестве реакционной среды происходит комплекс изменений физико-химических параметров локального микроокружения солюбилизированных реагентов, что может сказываться на их реакционной способности.

Рис 4. Температурные зависимости электропроводности микроэмульсии вода-АОТ-декан (\У0=20 САОт=0.42 М) в присутствии БАЭЭ (а) и ЕАПНА (б).

Показано, что введение реагентов в систему обращенных мицелл на основе АОТ может значительно влиять на процесс кластеризации, смещая температуру перехода. Это связано с модификацией структуры поверхности обращенных мицелл в результате взаимодействия водорастворимых добавок с головными группами ПАВ или при встраивании гидрофобных молекул в область углеводородных радикалов ПАВ. Так, специфические для действия трипсина субстраты БАЭЭ и М-а-бензоил-DL-аргинин-и-нитроаншгад (БАПНА) оказывают различное влияние на процесс кластеризации мицелл (Рис.4). Водорастворимый катионный БАЭЭ практически не меняет электропроводности системы, в то время как более гидрофобный катионный БАПНА приводит к существенному сдвигу температуры перколяционного перехода, что свидетельствует о его локализации в гидрофобной оболочке обращенных мицелл и модификации ее структуры.

Рис. 5. Температурные зависимости константы изотропного сверхтонкого расщепления аи для микроэмулъсий вода-АОТ-декан (Саот^ 3 М) с различным радиусом обращенных мицелл: О - без трипсина; • - с трипсином

Метод ЭПР фиксирует увеличение полярности микроокружения спинового фрагмента зонда 4-8ЬБЛ (Рис.5), что является следствием вытеснения воды в приполярную область монослоя АОТ при солюбилизации молекулы трипсина в мицелле.

Рис. 6. Температурные зависимости времени корреляции т вращения зонда и максимального сверхтонкого расщепления 2Атах в спектрах ЭПР для микроэмульсии вода-АОТ-декан

- с трипсином.

Появление воды в области углеводородных радикалов АОТ оказывает пластифицирующее действие на гидрофобную оболочку обращенных мицелл, которое проявляется в нарушении упорядоченной ориентации углеводородных радикалов молекул АОТ (уменьшение времени корреляции вращения спинового зонда и параметра на

Рис.6).

В четвертой главе представлены результаты изучения кинетических эффектов в системе обращенных мицелл в химических процессах, моделирующих действие гидролитического фермента при действии температурного фактора. Температурные зависимости наблюдаемой константы скорости щелочного гидролиза п-нитрофенил(этил)хлорметилфосфоната (ПНЭХФ) (Рис.7) и ПНФА показывают, что в отличие от водного раствора, в мицеллярной системе отмечается изменение наклона аррениусовской зависимости при определенной температуре

3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 1000/Т, к1

Рис. 7. Зависимость наблюдаемой константы скорости щелочного гидролиза ПНЭХФ в воде (1) и в обращенной мицеллярной системе вода-АОТ-декан при различных значениях параметра 26.3 (2), 20.0 (3), 15.1 (4); Сдот=0.42 М; Скаон=001 М; начальная концентрация ПНЭХФ - 5 10'5 М.

Оказалось, что значения Т,ф практически совпадают с температурой перколяционных переходов Тп в исследованных системах (Таблица 1). Для гидролиза соединений ПНЭХФ и ПНФА наблюдаются аномалии вблизи .температуры образования первого «бесконечного» кластера из мицелл - Т„. При повышении температуры происходит усиление флуктуации зарядов в обращенных мицеллах и увеличивается ионизация головных групп АОТ. Увеличение плотности отрицательного заряда на поверхности раздела вода/АОТ обуславливает рост электростатического отталкивания гидроксид-ионов от этой поверхности, где локализован субстрат (по данным ЯМР-самодиффузии ПНЭХФ распределен между монослоем АОТ мицелл и деканом примерно в равных долях) и уменьшает концентрацию нуклеофила вблизи поверхности раздела вода/АОТ, т.е. в зоне реакции.

Таблица 1. Значения Т„, Т,ф и энергия активации Еа щелочного гидролиза ПНЭХФ в обращенной мицеллярной системе вода-АОТ-декан (САот=0.42 М) до порога перко-ляшш.

W0 т„ г* ЕакДж/М

"С

15.1 27.5 27.5. 37.5

20.0 26.0 26.0 39.5

26.3 25.0 25.5 44.2

Аналогичные изменения в температурном ходе наблюдаемой константы скорости зафиксированы также для процесса щелочного гидролиза ПНФА.

Пятая глава посвящена изучению каталитической активности трипсина в условиях температурных изменений в мицеллярной системе на основе АОТ. Уровень каталитической активности трипсина в реакции гидролиза БАЭЭ в этой системе и в водном растворе практически совпадают в интервале температур 15°С - 25°С (Рис.8). При повышении температуры скорость гидролиза БАЭЭ в системе обращенных мицелл резко уменьшается.

Данные ИК-спектроскопии показывают заметное влияние мицеллярного окружения на структуру трипсина (Рис.9а). Однако температурная динамика разрушения вторичной структуры фермента в обеих средах достаточно близка и белок сохраняет

50 % исходной р-структуры вплоть до температуры 50°С. В микроэмульсионной среде обнаруживаются выраженные изменения в состоянии боковых групп тирозиновых остатков (Рис.9б). Поскольку трудно представить, какие взаимодействия в белке могут кооперативно нарушаться при сохранении пространственной целостности глобулы, можно предположить, что характер изменения полосы поглощения боковых групп тирозиновых остатков является отражением изменений в свойствах окружающей среды.

10 20 30 40 50 60 Т°, С

Рис. 8. Температурная зависимость начальной скорости гидролиза БАЭЭ трипсином в буфер ном растворе Тпз-НС1, рН = 8.2 - (о) и в микроэмульсии - (•). Реакция инициировалась вве дением субстрата,

Очевидно в данном случае, как и при щелочном гидролизе I, решающими оказываются температурные изменения в микроокружении реагентов в области температур 26 - 30,°С, где наблюдается перколяционный переход в исследуемых микроэмульсиях. Увеличение плотности отрицательного заряда на поверхности раздела во-да/АОТ обуславливает концентрирование и связывание катионного БАЭЭ вблизи поверхности и уменьшение его концентрации в окружении фермента, что критично для скорости ферментативного процесса. Другим фактором, который также является следствием возрастания уровня ионизации головных групп АОТ, может быть повышение концентрации свободных ионов натрия в локальном микроокружении фермен-

та. Ионы натрия способны нарушать третичную структуру трипсина и выступать обратимыми конкурентными ингибиторами гидролиза катионных субстратов.

40

О

О--о

б

20 30 40 50 60 70 80

20 30 40 50 60 70 80

Т,°С

Т,°С

Рис. 9. Температурная зависимость содержания р-структуры в молекуле трипсина (а) и сдвига максимума полосы поглощения боковых групп тирозиновых остатков трипсина (б) в растворе - (о) и в микроэмульсии Wo = 20, САот = 0.3 М - (•).

Изменения ферментативной активности трипсина в обращенных мицеллах на основе АОТ под действием температуры определяются изменением свойств микроокружения реагентов, происходящих как следствие увеличения ионизации головных групп АОТ при повышении температуры. Среда оказывает определяющее влияние на обоих участников реакционного процесса. С одной стороны может происходить удаление субстрата из зоны реакции за счет его электростатического связывания заряженной поверхностью мицеллярного агрегата. С другой стороны, происходят изменения в третичной структуре фермента, вызванные повышением концентрации проти-воионов вблизи его активного центра.

В отличие от БАЭЭ скорость гидролиза неспецифического субстрата ПНФА достигает максимума при температуре, существенно превышающей температуру пер-коляционного перехода. Высокореакционный ПНФА легко гидролизуется не только под действием активного центра трипсина, активный центр которого может выводиться из контакта с расщепляемой связью субстрата при его связывании поверхностью мицелл, но и под действием других нуклеофильных участков молекулы трипсина. Несмотря на изменения в структуре трипсина, вероятность реакционного контакта субстрата с нуклеофильными партнерами остается достаточно высокой вплоть до начала существенных изменений в структуре белка, которые наблюдаются выше 50°С.

Температурные перестройки микроокружения, а именно повышение плотности отрицательного заряда на поверхности раздела вода/АОТ, не оказывают заметного влияния на молекулы неионного ПНФА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изменение ферментативной активности трипсина в обращенных мицеллах под действием температуры определяется целым комплексом причин. Среда оказывает влияние на всех участников реакционного процесса. При повышении температуры, увеличивается ионизация полярных головных групп АОТ, что вызывает изменения свойств локального микроокружения реагентов. Увеличение плотности отрицательного заряда на границе раздела вода/АОТ может приводить к удалению субстрата из зоны реакции за счет его электростатического связывания заряженной поверхностью мицеллярного агрегата. С другой стороны, в результате изменений в водном микроокружении фермента происходят изменения в его третичной структуре.

ВЫВОДЫ

1. Особенности реакционного поведения трипсина проанализированы с позиций структурно-динамических свойств системы. Показана целесообразность применения взаимодополняющих физических методов к изучению структуры микрогетерогенных реакционных сред. Использование методов ЛМР-самодиффузии, ЭПР спиновых зондов, кондуктометрии и ИК-спектроскопии позволило получить ряд параметров, характеризующих структуру микроэмульсий на основе АОТ, применяемых в качестве среды для моделирования природной иммобилизации и функционирования ферментов.

2. При исследовании гидролитического расщепления М-а-бензоил-£-аргинин этилового эфира трипсином в условиях изменения температуры установлено, что каталитическая активность фермента в обращенных мицеллах имеет максимум при температурах значительно ниже оптимума активности в водном растворе. Сдвиг оптимума активности трипсина не связан с температурными изменениями во вторичной структуре фермента в системе обращенных мицелл, а вызван изменениями в локальном микроокружении реагентов.

3. Выдвинуто предположение, что наиболее критичными для уровня каталитической активности трипсина в реакции гидролиза N-а-бензоил-Ь-аргинин этилового эфира в обращенных мицеллах являются уменьшение концентрации субстрата в водном окружении фермента за счет увеличения степени диссоциации головных групп АОТ и электростатического связывания ими субстрата, а также возрастание концентрации ионов натрия вблизи активного центра фермента.

4. Установлено, что вводимые в микроэмульсию реагенты могут провоцировать структурные изменения в среде. Так, вытеснение воды в приполярную область монослоя АОТ при солюбилизации молекулы трипсина в мицелле оказывает пластифицирующее действие на гидрофобную оболочку обращенных мицелл, которое проявляется в нарушении упорядоченной ориентации углеводородных радикалов молекул АОТ.

5. Предложен способ определения локализации субстратов в структуре обращенных мицелл, основанный на относительных изменениях характеристик процесса электрической перколяции в микроэмульсиях вода/масло в присутствии добавок.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Zakharova L.Ya., Valeeva F.G., Kudryavtseva LA, Zakhartchenko N.L., Zuev Yu.F. Kinetics of hydrolysis of p-nitrophenyl ethyl chloromethyl phosphonate in a sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate-decane-water reverse micellar system, below and above the percolation threshold // Mendeleev Communications. -1998. - № 6. - P.224-227.

2. Кластерообразование в растворах обращенных мицелл и кинетика щелочного гидролиза О-этил-О-П-нитрофенилхлорметилфосфоната в них: Сб. статей. Ч.З. -Йошкар-ола, 1998. - 264 с.

3. The structure of the AOT interface in reverse micelles with solubilized BSA molecules: Proc. Symposium on «Lipid and Surfactant Dispersed Systems» Moscow, September 1999. - Moscow, 1999. - 282 p.

4. Захарова ЛЛ., Валеева Ф.Г., Кудрявцева Л.А., Коновалов А.И., Зуев Ю.Ф., Захарченко Н.Л., Федотов В.Д. Реакция щелочного гидролиза О-этил-О-п-нитрофенилхлорметилфосфоната в обращенной мицеллярной системе АОТ-декан-

НгО до и после порога перколяции. // Известия Академии Наук. Серия Химия. -1999. - № 12. - С.2266-2270.

5. Динамическая структура обращенных мицелл с иммобилизованными в них глобулярными глобулярными белками.: Тезисы докладов II съезда биофизиков России. Москва, август 1999 г. - Пущино, 1999. - Т. 2.- 746 с.

6. Динамические и структурные свойства микроэмульсий на основе Аэрозоля ОТ: Сб. статей. - Казань, 1999. - В.6. - 406 с.

7. Исследование структуры поверхностного слоя обратных мицелл, содержащих молекулы белка: Сб. статей. - Казань, 1999. - В.6. - 406 с.

8. Захарова Л.Я., Валеева Ф.Г., Кудрявцева Л.А., Вельский В.Е., Жильцова Е.П., Захарченко Н.Л., Зуев Ю.Ф.. Кинетика щелочного гидролиза О-этил-О-п-нитрофенилхлорметил-фосфоната в обращенной мицеллярной системе ДСН-гексанол-вода. // Известия Академии Наук. Серия Химия. - 2000. - № 2. - С.262-266.

9. Захарченко Н.Л., Ступишина ЕА, Зуев Ю.Ф., Федотов В.Д., Миргородская А.Б.. Исследование щелочного и ферментативного гидролиза пара-нитрофенилацетата в перколирующей микроэмульсии вода-Масло на основе АОТ. // Вестник Московского Университета. Серия 2. Химия. - 2000. - Т.41. - № 6. - С.386-389.

ЮАрхипов В.П., Идиятуллин З.Ш., Архипов.Р.В., Захарченко Н.Л., Зуев Ю.Ф., Федотов В.Д.. Диффузия воды в микроэмульсии вода-АэрозольОТ-декан. // Коллоидный журнал. - 2000. - Т.62. - № 4. - С.456-463.

1 l.The comparatively study of basic and enzymatic hydrolysis of ester bonds in AOT-based water-in-oil microemulsions: Abstracts of Int. Conference Biocatalysis-2000: Fundamentals and Applications. Moscow, June 2000. - Moscow, 2000. - 188 p.

12. Каталитическая активность трипсина в микроэмульсии АОТ-вода-декан в условиях кластеризации мицелл: Тезисы стендовых сообщений школы-конференции. Пущино, май-июнь 2000 г. - Пущино, 2000. - 340 с.

13. Stupishina EA, Faizullin DA, Zakharchenko N.L., Fedotov V.D., Zuev Yu.F. Catalytic activity, structure and stability of trypsin in an AOT-stabilised water-in-decane microemulsion. //MendeJeev Communications. - 2001. - V.I 1. - № 6. - P.237-239.

14. Вторичная структура и ферментативная активность трипсина в обратной микроэмульсии: Сб. статей. - Йошкар-Ола, 2001. - 4.1. - 284 с.

15.Каталитические свойства трипсина в микроэмульсии на основе АОТ: Тезисы докладов 5-ой Путинской конференции молодых ученых. Пущино, апрель 2001 г. -Тула.200Ь-356с.

16.Рыжкина И.С., Кудрявцева Л.А., Еникеев К.М., Бабкина Я.А.. Коновалов А.И., 3eев Ю.Ф., Захарченко Н.Л. Реакционная способность амфифильных каликс[4]резорцинаренов и фенолов в обращенной мицеллярной системе бис(2-этилгексил)сульфосукцинат натрия-декан-вода. // Журнал общей химии. - 2002. -Т.72.-В.9.-С.1487-1492.

17. Динамические характеристики микроэмульсии вода-АОТ-декан в присутствии каликс[4]резорцинаренов: Сб. статей. - Уфа, 2002. - В.9. - Т.1. - 328 с.

18. Структура и • каталитическая активность трипсина в условиях температурных переходов микроэмульсионной реакционной среды: Сб. статей - Уфа, 2002. - В.9. -Т.1.-328С.

19. Catalytic activity, structure and stability of trypsin in AOT-stabilized water-in-decane. microemulskm: Abstracts of Int. conference Biocatalysis — 2002: Fundamentals & Applications. Moscow, June 2002. - Moscow, 2002. - 152 с

20. Зуев Ю.Ф., Захарченко Н.Л., Ступишина ЕА, Федотов В.Д.. Вылегжанина Н.Н. Особенности иммобилизации субстрата и каталитическая активность трипсина в обращенной микроэмульсии. // Вестник Московского Университета. Серия 2. Химия. - 2003. - Т.44. - № 1. _ С.13-15.

21. Влияние солюбилизованного белка на структуру обратных мицелл, стабилизированных аэрозолем ОТ. Исследование методами ЭПР и электропроводности: Сб. статей. - Казань, 2003. - В. 10. - 4.2.285 с.

22. Электрическая перколяция в микроэмульсии вода-АОТ-декан в присутствии каликс(4]резорцинарена и щелочи: Сб. статей. - Казань, 2003. - В. 10. - 4.2. 285 с.

23-Yu.F. Zuev, N.N. Vylegzhanina, N.L. Zakhartchenko Effects of Protein Solubilization on the Structure of Surfactant Shell of Reverse Micelles. // Applied Magnetic Resonance. - 2003. - V.25. - № 1. - P.29-42.

4 Г/'

Отпечатано в 000 «Печатный двор». Казань,ул. Журналистов, 1/16. Тел.72-74-59,41-76-41,41-76-51. ЛицензияПД№7-0215от 01.11.01 Выдана Поволжским межрегиональным территориальнымуправлением МПТРРФ. Подписано в печать 04.03.04, Усл. печ. л. 1,25 Заказ№К-1413. Формат 60x841/16. Тираж 100экз. Бумага офсетная. Печать -ризография

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Захарченко, Наталия Леруновна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. МИКРОЭМУЛЬСИИ ВОДА/МАСЛО КАК СРЕДА ДЛЯ

БИОХИМИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

1.1. Высокоорганизованные системы на основе поверхностно-активных веществ

1.2. Структура и физико-химические свойства обращенных мицелл

1.3. Методы исследования структуры обращенных мицелл.

1.3.1. ЯМР самодиффузия.

1.3.2. ЭПР спиновых зондов.

1.3.3. Кондуктометрия

1.3.4. Другие методы исследования.

1.4. Мицеллярный каталитический эффект.

1.5. Ферменты в обращенных мицеллах.

Глава 2. МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования

2.2. Кондуктометрия.

2.3. Исследование структуры монослоя АОТ обращенных мицелл методом ЭПР спинового зонда.

2.4. Исследование структуры микроэмульсии методом ЯМР -самодиффузии.

2.5. Исследование структуры белка методом ИК-спектроскопии

2.6. Кинетические измерения.

Глава 3. СТРУКТУРА МИКРОЭМУЛЬСИЙ ВОДА/МАСЛО И

ЛОКАЛИЗАЦИЯ РЕАГЕНТОВ.

3.1. Температурные изменения в структуре системы обращенных мицелл, стабилизированных АОТ. ЯМР-самодиф фузия и электропроводность

Ш ' 3.2. Влияние модифицирующих добавок на процесс кластеризации обращенных мицелл

3.3. Определение локализации субстрата по данным методов ЯМР-самодиффузии и электропроводности.

3.4. Изменения в структуре гидрофобного слоя обращенных мицелл под действием иммобилизованного фермента.

Глава 4. ТЕМПЕРАТУРНЫЙ ФАКТОР И КИНЕТИЧЕСКИЕ ЭФ* ФЕКТЫ В СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ В ХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ, МОДЕЛИРУЮЩИХ ДЕЙСТВИЕ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ.

4.1. Щелочной гидролиз и-нитрофенил(этил)хлорметил-фосфоната в условиях кластеризации обращенных мицелл

4.2. Щелочной гидролиз и-нитрофенилацетата в системе обращенных мицелл.

Глава 5. КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ТРИПСИНА В УСЛОВИЯХ ТЕМПЕРАТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В МИКРОЭМУЛЬСИОННОЙ СРЕДЕ

5.1. Температурный фактор и каталитическая активность трипсина в системе обращенных мицелл.

5.2. Температурные изменения в структуре трипсина.

5.3. Влияние микроокружения на каталитическую активность трипсина в системе обращенных мицелл.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура и каталитические свойства системы "трипсин - обращенная мицелла" в условиях изменения температуры"

Ферментативные процессы лежат в основе функционирования любого живого организма. Особую роль в метаболизме играют процессы расщепления сложноэфирных и пептидных связей, протекающие под действием про-теолитических ферментов.

Ферментативные реакции в биологической клетке чаще всего протекают вблизи или на поверхности раздела фаз. Ферменты адсорбированы на биологических мембранах, встроены в мембрану или иммобилизованы внутри замкнутых мембранных структур. Даже плазматические ферменты зачастую образуют ассоциаты с компонентами клетки и функционируют в составе субклеточных единиц. Среда, в которой существуют ферменты in vivo, по своим физико-химическим свойствам (полярность, вязкость, диэлектрическая проницаемость и пр.) и химическому составу существенно отличается от водных растворов, используемых в большинстве энзимологических исследований.

Более двадцати пяти лет назад была предложена [Мартинек, 1977] уникальная по своим свойствам система - дисперсии обращенных мицелл, позволяющая максимально естественно моделировать природную иммобилизацию ферментов и их локальное микроокружение. Оказалось, что водорастворимые ферменты можно солюбилизировать в органических растворителях с помощью поверхностно-активных веществ (ПАВ), сохраняя при этом их каталитическую активность. Система обращенных мицелл представляет собой одну из структурных разновидностей .микроэмульсий [Миттел, 1980] - дисперсию микрокапель воды в органической жидкости. Поверхность водных микрокапель стабилизируется мономолекулярным слоем ПАВ, полярные головные группы которого расположены на водной поверхности микрокапли, а углеводородные радикалы ориентированы в сторону объемной органической фазы. Дисперсии обращенных мицелл обладают качествами, незаменимыми при исследовании механизмов функционирования ферментов [Березин, 1985]: 1) простота приготовления; 2) возможность изменения в широких пределах количества воды в микроокружении фермента; 3) термодинамическая устойчивость и оптическая прозрачность систем, позволяющая контролировать структуру и каталитическую активность фермента спектральными методами; 4) обеспечение реакционного контакта водорастворимого фермента с водонерастворимыми субстратами. Несмотря на то, что природа не подготовила ферменты для функционирования в системах с органическим растворителем, изучение закономерностей биокатализа в таких системах позволяет получать принципиально новые данные о стабильности белков и силах, поддерживающих каталитически активную конформацию ферментов [Гладилин, 1998]. Установлено, что многие ферменты демонстрируют хорошую стабильность и высокую активность в системах обращенных мицелл, хотя в сравнении с водной средой могут проявлять специфические особенности (изменение оптимума рН, субстратной специфичности и др.). Особенности поведения ферментов в системе обращенных мицелл имеют многочисленные экспериментальные подтверждения. Для объяснения «суперактивности» и субстратной специфичности ферментов в этих средах предложены теоретические модели, в которых рассматриваются различные аспекты влияния микроокружения на ферменты: изменения в структуре молекулы фермента [Walde, 1988; Stupishina, 2001], увеличение жесткости молекулы фермента под действием мицеллярной матрицы [Levashov, 2001; Klyachko, 2003], солевые эффекты [Walde, 1988; Fadnavis, 1998] и пр.

Параллельно, на протяжении последних десятилетий постоянно возрастает интерес к использованию различных микроэмульсионных сред, в частности обращенных мицелл, в качестве среды для проведения различных химических процессов не только ферментативной природы. Это обусловлено свойствами подобных систем солюбилизировать значительные количества веществ различной полярности (эффект концентрирования) и обеспечивать надежный контакт между соединениями несовместимыми в обычных условиях за счет большой межфазной поверхности [Garti, 2003; Holmberg, 2003; Kumar, 1999; Texter, 2001; Levashov, 2001; Schwuger, 1995; Qi, 1997].

Свойства микроэмульсии в первую очередь определяются составом системы. Вместе с тем, хорошо известно [Moulik, 1998], что вносимые добавки, в том числе химические и биохимические реагенты, могут существенно модифицировать ее структуру и физико-химические свойства. Одной из наиболее распространенных в мицеллярной энзимологии систем является обращенная микроэмульсия, стабилизированная анионным ПАВ Аэрозолем ОТ (АОТ). Наряду с такими свойствами, выигрышными с позиций мицеллярной энзимологии, как высокая солюбилизирующая емкость по отношению к воде, незначительное распределение по размерам мицелл, эта система характеризуется тенденцией мицелл к кластеризации [Moulik, 1998]. Условия, при которых происходит спонтанная кластеризация мицелл в обращенных микроэмульсиях на основе АОТ, являются следствием внутренних перестроек в мицеллах. При этом возможны локальные изменения параметров локального микроокружения солюбилизированных реагентов.

Основной целью работы является изучение структурных характеристик обращенных микроэмульсий на основе АОТ как среды для ферментативных процессов, а именно для гидролитического расщепления сложно-эфирных связей в присутствии трипсина, и поиск взаимосвязи между структурными и каталитическими характеристиками системы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить температурные изменения в структуре обращенных микроэмульсий методами ЯМР-самодиффузии и кондуктометрии.

2. Исследовать влияние добавок/реагентов на структуру гидрофобной оболочки обращенных мицелл на основе АОТ методами ЭПР спинового зонда и кондуктометрии.

На примере щелочного гидролиза сложных эфиров изучить каталитический эффект системы обращенных мицелл в условиях ее структурных перестроек под действием температуры.

На примере гидролиза Ы-а-бензоил-1-аргинин этилового эфира (БАЭЭ) и и-нитрофенилацетата (ПНФА) в присутствии трипсина исследовать взаимосвязь структуры и каталитических свойств системы «фермент - обращенная мицелла».

10

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Захарченко, Наталия Леруновна

выводы

1. Особенности реакционного поведения трипсина проанализированы с позиций структурно-динамических свойств системы. Показана целесообразность применения взаимодополняющих физических методов к изучению структуры микрогетерогенных реакционных сред. Использование методов ЯМР-самодиффузии, ЭПР спиновых зондов, кондуктометрии и ИК-спектроскопии позволило получить ряд параметров, характеризующих структуру микроэмульсий на основе АОТ, применяемых в качестве среды для моделирования природной иммобилизации и функционирования ферментов.

2. При исследовании гидролитического расщепления N-a-бензоил-/,-аргинин этилового эфира трипсином в условиях изменения температуры установлено, что каталитическая активность фермента в обращенных мицеллах имеет максимум при температурах значительно ниже оптимума активности в водном растворе. Сдвиг оптимума активности трипсина не связан с температурными изменениями во вторичной структуре фермента в системе обращенных мицелл, а вызван изменениями в локальном микроокружении реагентов.

3. Выдвинуто предположение, что наиболее критичными для уровня каталитической активности трипсина в реакции гидролиза Ы-а-бензоил-Х-аргинин этилового эфира в обращенных мицеллах являются уменьшение концентрации субстрата в водном окружении фермента за счет увеличения степени диссоциации головных групп АОТ и электростатического связывания ими субстрата, а также возрастание концентрации ионов натрия вблизи активного центра фермента.

4. Установлено, что вводимые в микроэмульсию реагенты могут провоцировать структурные изменения в среде. Так, вытеснение воды в приполярную область монослоя АОТ при солюбилизации молекулы трипсина в мицелле оказывает пластифицирующее действие на гидрофобную оболочку обращенных мицелл, которое проявляется в нарушении упорядоченной ориентации углеводородных радикалов молекул АОТ.

5. Предложен способ определения локализации субстратов в структуре обращенных мицелл, основанный на относительных изменениях характеристик процесса электрической перколяции в микроэмульсиях вода/масло в присутствии добавок.

В заключение хочу выразить сердечную благодарность своему научному руководителю Зуеву Ю.Ф., проф. Федотову В.Д. за постоянное внимание и поддержку при выполнении работы, Файзуллину Д.А. за проведение ИК-эксперимента и полезное обсуждение результатов, Ступишиной Е.А., Вылегжаниной Н.Н. и Идиятуллину Б.З. за помощь и консультации при выполнении экспериментальной части, всему коллективу лаборатории молекулярной биофизики за постоянную поддержку, а также Миргородской А.Б., Захаровой Л.Я. и коллективу лаборатории высокоорганизованных сред ИОФХ им. Арбузова, за полезное сотрудничество при выполнении данной работы.

99

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Захарченко, Наталия Леруновна, Казань

1. Архипов В.П., Идиятуллин З.Ш., Архипов Р.В., Захарченко Н.Л., Зуев Ю.Ф., Федотов В.Д. Диффузия воды в микроэмульсии вода-Аэрозоль ОТ-декаи// Коллоидн. Ж., 2000, 62, 456-463.

2. Березин И.В. Действие ферментов в обращенных мицеллах. 39-е Бахов-ское чтение, Наука, Москва, 1985, 40 с.

3. Бреслер С.Е., Шампань М., Френкель С.Я. Исследование ферментатив-но-активных осколков трипсина// Биохимия, 1961, 26, 909-915.

4. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс, Изд. ФАИР-ПРЕСС, Москва, 1998, 720 с.

5. Вассерман A.M. Спиновые зонды в мицеллах// Успехи химии, 1994, 63, 391-401.

6. Гладилин А.К., Левашов А.В. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями// Биохимия, 1998, 63, 408-421.

7. Гринштейн С.В., Кост О.А. Структурно-функциональные особенности мембранных белков// Yen. биолог, химии, 2001, 41, 77-104.

8. Дженкс В. Катализ в химии и энзимологии, Мир, Москва, 1972, 467с.

9. Захарченко Н.Л., Зуев Ю.Ф., Рыжкина И.С., Паширова Т.Н., Кудрявцева Л.А. Электрическая перколяция в микроэмульсии вода-АОТ-декан в присутствии каликс4.резорцинарена и щелочи// Струк. и дин. молек. систем. Сб. статей, 2003, X, 75-77.

10. Клесов А.А., Федосеев В.Н., Киррет О.Г. Природа субстратной специфичности трипсина. Взаимосвязь структуры и реакционной способности квазисубстратов трипсина, производных о-алкилметилфосфоновых и карбоновых кислот// Биохимия, 1977,42, 1939-1952.

11. Клячко Н.Л., Богданова Н.Г., Мартинек К., Левашов А.В. Замена воды на водно-органическую смесь в системах обращенных мицелл — путь к повышению эффективности ферментативного катализа// Биоорган, химия, 1990,16, 581-589.

12. Клячко Н.Л., Пшежетский А.В., Кабанов А.В., Вакула С.В., Мартинек К., Левашов А.В. Катализ ферментами в агрегатах поверхностно-активных веществ: оптимальная конструкция матрицы ПАВ// Биол. мембраны, 1990, 7,467-472.

13. Котрикадзе Н.Г., Ломсадзе Б.А., Царидзе М.А., Джишкариани О.С., Левашов А.В. Регуляция каталитических свойств фермента в «обращенных мицеллах»// Биофизика, 1999, 44, 231-235.

14. Кудряшова Е.В., Гладилин А.К., Левашов А.В. Белки в надмолекулярных ансамблях: исследование структуры методом разрешенно-временной флуоресцентной анизотропии// Усп. биолог, химии, 2002, 42, 257-294.

15. Ленинджер А. Биохимия, Мир, Москва, 1976, 960 с.

16. Линдман Б., Стильбе П. Молекулярная диффузия в микроэмульсиях// в кн. Микроэмульсии. Структура и динамика, под ред. Фриберга С.Е. и Ботореля П., Мир, Москва, 1990, 177-227.

17. Мартинек К., Левашов А.В., Клячко Н.Л., Березин И.В. Катализ водорастворимыми ферментами в органических растворителях// Докл. Акад. Наук СССР, 1977, 236, 920-923.

18. Мартинек К., Левашов А.В., Клячко Н.Л., Хмельницкий Ю.Л., Березин И.В. Мицеллярная энзимология//2шол. мембраны, 1985, 2, 669-695.

19. Матвеенко В.Н., Свитова Т.Ф., Волчкова И.Л. Микроэмульсии. VI Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2, Химия, 1996, 37, 99-115.

20. Матвеенко В.Н., Свитова Т.Ф., Волчкова И.Л. Микроэмульсии. II// Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2, Химия, 1996, 37, 201-214.

21. Метелица Д.И., Еремин А.Н. Обращенные мицеллы поверхностно-активных веществ в органических растворителях модель биологических мембран// Усп. биол. химии, 1988, 22, 145-173.

22. Миттел К.Л., Мукерджи П. Широкий мир мицелл// в кн. Мицеллообразо-вание, солюбшизация и микроэмулъсии, под ред. Миттел K.JI., Мир, Москва, 1980, 11-31.

23. Разумов В.Ф., Барышников Б.В., Разумова М.В. Кинетика бимолекулярной химической реакции в микроэмульсиях и мицеллярных растворах// Докл. акад. наук, 1996, 348, 62-65.

24. Русанов А.И. Мицеллообразование в растворах поверхностно-активных веществ, Химия, Санкт-Петербург, 1992.

25. Рыжкина И.С., Янилкин В.В., Морозов В.И., Кудрявцева Л.А., Коновалов А.И. Одноэлектронный перенос в ряду каликс4.резорцинаренов и их аминометилированных производных в системе АОТ-декан-вода// Журн. физ. химии, 2003, 77, 491-495.

26. Шапиро Ю.Е., Горбатюк В.Ю., Левашов А.В., Клячко Н.Л. Фрагментарная подвижность молекул в обращенных мицеллах Аэрозоля ОТ в н-октане, инкапсулирующих а-химотрипсин или альбумин// Биолог. Мембраны, 1993,10, 293-306.

27. Штыков С.Н. Химический анализ в нанореакторах: основные понятия и применение// Журн. анал. химии, 2002, 57, 1018-1028.

28. Янилкин В.В., Рыжкина И.С., Настапова Н.В., Паширова Т.Н., Бабкина Я.А., Бурилов А.Р., Морозов В.И., Коновалов А.И. Одноэлектронное окисление и нуклеофильность аминометилированных калике 4.резорцинаренов// Изв. АН. Сер .хим., 2003, 5, 1082-1088.103

29. Alexandridis P, Holzwarth J.F., Hatton Т.А. Thermodynamics of droplet clustering in percolating AOT water-in-oil microemulsions// J. Phys. Chem., 1995,99, 8222-8232.

30. Almgren M., Johannsson R. Deactivation of excited species by diffusion-controlled quenching in clusters of reversed micelles// J. Phys. Chem., 1992, 96, 9512-9517.

31. Barbaric S., Luisi P.L. Micellar solubilization of biopolymers in organic solvents. 5. Activity and conformation of a-chymotrypsin in isooctane-AOT reverse micelles///. Am. Chem. Soc., 1981,103, 4239-4244.

32. Bergenholtz J., Romagnoli A.A., Wagner NJ. Viscosity, microstructure, and interparticle potential of AOT/H^O/n-decane inverse microemulsions// Lang-muir, 1995,11, 1559-1570.

33. Bhattachaiya S., Senhalatha K. Dialkylaminopyridine catalysed esterolysis of p-nitrophenyl alkanoates in different cationic microemulsions// J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1996, 2, 2021-2025.

34. Bommarius A.S., Holzwarth J.F., Wang D.I.C., Hatton T.A. Coalescence and solubilizate exchange in a cationic four-component reversed micellar system// J. Phys. Chem., 1990, 94, 7232-7239.

35. Brinchi L., Di Proflo P., Germani R., Savelli G., Tugliani M., Bunton C.A. Hydrolyses of dinitroalkoxyphenyl phosphates in aqueous cationic micelles. Acceleration by premicelles//2000,16, 10101-10105.

36. Bumajdad A., Eastoe J., Nave S., Steytler D.C., Heenan R.K., Grillo I. Compositions of mixed surfactant layers in microemulsions determined by small-angle neutron scattering// Langmuir, 2003,19, 2560-2567.

37. Bunton C.A., Nome F., Quina F.H., Romsted L.S. Ion binding and reactivity at charged aqueous interfaces// Acc. Chem. Res., 1991, 24, 357-364.

38. Cametti C., Codastefano P., Tartaglia P., Chen S.-H., Rouch J. Electrical conductivity and percolation phenomena in water-in-oil microemulsions// Phys. Rev. A, 1992, 45, 5358-5361.

39. Chang G.-G., Huang T.-M., Hung H.-C. Reverse micelles as life-mimicking systems// Proc. Natl. Sci. Counc., 2000, 24, 89-100.

40. Chen J.M., Su T.M., Мои C.Y. Size of sodium dodecyl sulfate micelle in concentrated salt solutions// J. Phys. Chem., 1986, 90, 2418-2421.

41. De Gennes P.G., Touplin C. Microemulsions and the flexibility of oil/water interfaces// J.Phys. Chem., 1982, 86, 2294-2304.

42. Deo N., Somasundaran P. Electron spin resonance study of phosphatidyl choline vesicles using 5-doxyl stearic acid// Colloids and Surfaces B: Biointer-face, 2002, 25,225-232.

43. Dong A., Huang P., Cayghey W.S. Protein secondary structures in water from second — derivative amide I infrared spectra. // Biochemistry, 1990, 29, p. 3303-3308.

44. Eastoe J., Hetherington J., Sharpe D., Dong J., Heenan R.K., Steytler D. Mixing of alkanes with surfactant monolayers in microemulsions// Langmuir, 1996,12 3876-3880.

45. Eicke H.-F., Meier W. Nonmonotonic pattern of the critical percolation temperature due to the variations of additive chain length in water-in-oil microemulsions// ColloidPolym. Sci., 2001, 279, 301-304.

46. El Seoud O.A. Acidities and basicities in reversed micellar systems// in Reverse Micelles, Luisi P.L., Straub B.E. eds., Plenum Press, New York, 1984, 81-93.

47. Fadnavis N.W., Babu R.L., Deshpande A. Reactivity of trypsin in reverse micelles: pH-effects on the W0 versus enzyme activity profiles// Biochimie, 1998, 80, 1025-1030.

48. Feldman Y., Kozlovich N., Alexandrov Y., Nigmatullin R., Ryabov Y. Mechanism of the cooperative relaxation in microemulsions near the percolation threshold// Phys. Rev. E, 1996, 54, 5420-5427.

49. Feldman Y., Kozlovich N., Nir I., Garti N. Dielectric relaxation in sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate-water-decane microemulsions near the percolation temperature threshold// Phys. Rev. E, 1995, 51, 478-491.

50. Feng K.I., Schelly Z.A. Equilibrium properties of crystallites and reverse micelles of sodium bis(2-ethylhexyl) phosphate in benzene// J. Phys. Chem., 1995,99, 17207-17211.

51. Freed J.H. Theory of slow tumbling ESR spectra for nitroxides// in Spin labeling. Theory and application., Berliner ed., Acad. Press., New York, 1976, 53-132.

52. Garcia-Rio L., Herves P., Leis J.R., Mejuto J.C. Influence of crown ethers and macrocyclic kryptands upon the percolation phenomena in AOT/isooctane/H20 microemulsions// Langmuir, 1997,13, 6083-6088.

53. Garcia-Rio L., Leis J.R., Mejuto J.C., Репа M.E. Iglesias E. Effects of additives on the internal dynamics and properties of water/AOT/isooctane microemulsions// Langmuir, 1994,10, 1676-1683.

54. Garcia-Rio L., Leis J.R., Mejuto J.C., Perez-Juste J. Investigation of micellar media containing /?-cyclodextrins by means of reaction kinetics: basic hydrolysis of N-methyl-N-nitroso-p-toluenesulfonamide// J. Phys. Chem., 1997, 101,7383-7389.

55. Garti N. Microemulsions as microreactors for food applications// Curr. Opp. Coll. Interface Sci., 2003,8, 197-211.щ

56. Giustini М., Palazzo G., Ceglie A., Eastoe J., Bumujdad A., Heenan R.K. Studies of cationic and nonionic surfactant mixed microemulsions by small-angle neutron scattering and pulsed field gradient NMR// Prog. Colloid Po-lym. Sci., 2000,115, 25-30.

57. Grand D. Photoionization in cationic micelles: effect of alcohol or salt addition//У. Phys. Chem, 1990, 94, 7585-7588.

58. Grest G, Webman I., Safran S., Bug A. Dynamic percolation in microemulsions// Phys. Rev. A, 1986, 33, 2842-2845.

59. Haering G., Luigi P.L., Hausser H. Characterization by electron spin resonance of reversed micelles consisting of the ternary system AOT-isooctane-water// J. Phys. Chem., 1988, 92, 3574-3581.

60. Hanahan D.J. The enzymatic degradation of phosphatidylcholine in diethyl ether// J. Biol. Chem., 1952,195, 199-206.

61. Hao J. Effect of the structure of microemulsions on chemical reactions// Co/-loid Polym. Sci., 2000, 278, 150-154.

62. Hasegawa M., Yamasaki Y., Sonta N., Shindo Y., Sugimura Т., Kitahara A. Clustering of Aerosol ОТ reversed micelles as studied by nonradiative energy transfer'of solubilized probes// J. Phys. Chem., 1996,100, 15575-15580.

63. Hobson R.A., Grieser F., Healy T.W. Surface potential measurements in mixed micelle systems// J. Phys. Chem., 1994, 98, 274-278.

64. Holmberg K. Organic reactions in microemulsions// Curr. Opp. Coll. Interface Sci., 2003, 8, 187-196.

65. Holmberg К., Jonsson В., Kronberg В., Lindman В. Surfactants and Polymers in Aqueous Solutions. Wiley, Chichester UK, 2003, 545 p.

66. Ikeda S., in Surfactants in solutions, K.L. Mittal ed., Plenum Press, New York-London, 1984, p. 825.

67. Jain Т.К., Varshney M., Maitra A. Structural studies of Aerosol ОТ reverse micellar aggregates by FT-IR spectroscopy// J. Phys. Chem., 1989, 93, 74097416.

68. Jonsson В., Wennerstrom H., Nilsson P.G., Linse P. Self-diffusion of small molecules in colloidal systems// ColloidPolym. Sci., 1986, 264, 77-88.

69. Karukstis K.K., Frazier А.А., Martula D.S., Whiles J.A. Characterization of the microenvironments in AOT reverse micelles using multidimensional spectral analysis// J. Phys. Chem., 1996,100, 11133-11138.

70. Kibblewhite J., Drummond C.J., Greiser F., Healy T.W. Effect of pentanol on the mean interfacial solvent and electrostatic characteristics of cationic micelles// J. Phys. Chem., 1987, 91, 4658-4660.

71. Klyachko N.L., Levashov A.V. Bioorganic synthesis in reverse micelles and related systems// Curr. Op. in Coll. and Int. Scien., 2003, 8, 179-186.

72. Krimm S., Bandekar J. Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides and proteins// Adv. Protein Chemistry, 1986, 38, p.l81-364.

73. Kumar P., Mittal K.L. eds. Handbook of microemulsion science and technology, Marcel Dekker, New York, 1999, 849 p.

74. Kurumada K., Shioi A., Harada M. Dynamical behavior and structure of concentrated water-in-oil microemulsions in the sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate systems///. Phys. Chem., 1996,100, 1020-1026.

75. Kuznetsov A. N., Wasserman A. M., Volkov A. U., Korst N. N. Determination of rotational correlation time of nitric oxyde radicals in a viscous me-dium// Chem. Phys. Lett., 1971,12, 103-106.

76. Lang J., Jada A., Malliaris A. Structure and dynamics of water-in-oil droplets stabilized by sodium bis(2-ethylhexyl)sulfosuccinate// J. Phys. Chem., 1988, 92, 1946-1953.

77. Lang J., Lalem N., Zana R. Quaternary water-in-oil microemulsions. 2. Effect of carboxylic acid chain length on droplet size and exchange of material between droplets// J. Phys. Chem., 1992, 96, 4667-4671.

78. Lekkerkerker H.N.W., Dhont J.K.G. On the calculation of the self-diffusion coefficient of interacting Brownian particlesII J. Chem. Phys., 1984, 80, 57905792. ■ ■ "Л

79. Levashov A.V., Klyachko N.L. Micellar enzymology: methods and tech-niquee// Russ. Chem. Bull. (Engl. Ed.), 2001, 50, 1718-1732.

80. Levashov A.V., Klyachko N.L. Reverse micellar systems. General methodology// in Methods in Biotechnology: Enzymes in nonaqueous solvents, Vulfson E.N., Hailing P.J., Holland H.L. eds., Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2001, 15, 575-586.

81. Lindman В., Stilbs P., Moseley M.E. Fourier transform NMR self-diffusion and microemulsion structure// J. Colloid Interface Sci., 1981, 83, 569-582.

82. Luisi P.L., Giomini M., Pileni M.P., Robinson B.H. Reverse micelles as hosts for proteins and small molecules// Biochem. Biophys. Acta, 1988, 947, 209246. ;

83. Martin C.A., Magid L.J. Carbon-13 NMR investigations of Aerosol ОТ water/oil microemulsions// J. Phys. Chem., 1981, 85, 3938-3944.

84. McConnell H.M. Molecular motion in biological membranes// in Spin labeling. Theory and application., Berliner ed., Acad. Press., New York, 1976, 525-561.

85. Meier W. Poly(oxyethylene) adsorption in water/oil microemulsions: a conductivity study// Langmuir, 1996,12, 1188-1192.

86. Menger F.M., Donohue J.A., Williams R.F. Catalysis in water pools// J. Am. Chem. Soc, 1973, 95, 286-288.

87. Menger F.M., Portnoy C.E. Chemistry of reactions proceeding inside molecular aggregatesII J. Am. Chem. Soc., 1967, 89, 4698-4703.

88. Menger F.M., Yamada K. Enzyme catalysis in water pools// J. Am. Chem. Soc., 1979,101,6731-6734.

89. Miguel M.G. Association of surfactants and polymers studied by luminescence techniques// Adv. in Colloid and Interface Science, 2001, 89-90, 1-23.

90. Molinero I., Sierra M.L., Valiente M., Rodenas E. Physical properties of cetylpyridinium chloride micelles and their behavior as reaction media// J. Chem. Soc., Far. Trans., 1996, 92, 59-63.

91. Moulik S.P., Paul B.K. Structure, dynamics and transport properties of mi-croemulsionsII Adv. in Coll. and Int. Sci., 1998, 78,99-195.

92. Parker W. O'N. Multicomponent self-diffusion NMR study of acidic microemulsions and aqueous solutions of dodecylbenzenesulfonic acid// J. Phys. Chem., 1991,95,5329-5335.

93. Репа A.A., Hirasaki G.J. Enhanced characterization of oilfield emulsions via NMR diffusion and transverse relaxation// Adv. in Colloid and Interface Science, 2003,105, 103-150.

94. Pileni M.P., Zemb Т., Petit С. Solubilization by reverse micelles: Solute localization and structure perturbation// Chem. Phys. Lett., 1985,118, 414-420 .

95. Prince L.M., Ed. Microemulsions: theory and practice, Academic Press, New York, 1977,312 р.

96. Qi L., Ma J., Shen J. Synthesis of copper nanoparticles in nonionic water-in-oil microemulsions// J. Colloid Interface Sci., 1997, 186, 498-500.

97. Ranganathan R., Peric M., Medina R., Garcia U., Bales B.L. Size, hydration and shape of SDS/heptane micelles investigated by time-resolved fluorescence quenching and electron spin resonance// Langmuir, 2001, 17, 67656770.

98. Regev O., Ezfahi S., Aserin A., Garti N., Wachtel E., Kaler E.W., Khan A., Talmon Y. A study of the microstructure of a four-component nonionic mi-croemulsion by Cryo-TEM, NMR, SAXS, and SANS// Langmuir, 1996, 12, 668-674.

99. Robb I.D., Ed. Microemulsions, Plenum Press, New York, 1982, 268 p.

100. Ruan K., Zhao Z., Ma J. Effect of bromide salts on cationic micellar catalysis// ColloidPolym. Sci., 2001, 279, 813-818.

101. Schwuger M.J., Stickdom K., Schomacker R. Microemulsions in technical processes// Chem. Rev., 1995, 95, 849-864.

102. Smith R.E., Luisi P.L. Micellar solubilization of biopolymers in hydrocarbon solvents. Ill Empirical definition of an acidity scale in reverse micelles// Helv. chim. acta, 1980, 63, 2302-2308.

103. Soderman O., Nyden M. NMR in microemulsions. NMR translational diffusion studies of a model microemulsion// Colloid Surf. A-Physicochem. Eng. Asp., 1999,158,273-280.

104. Soderman O., Olsson U. Dynamics of amphiphilic systems studied using NMR relaxation and pulsed field gradient experiments// Curr. Opinion in Colloid andInterfaqce Science, 1997, 2, 131-136.

105. Soderman О., Stilbs P. NMR studies of complex surfactant systems// Progr. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc., 1994, 26, 445-482.

106. Stamatis H., Xenakis A., Kolisis F.N. Biorganic reactions in microemulsions: case of lipases// Biotechnol. Adv., 1999,17, 293-318.

107. Stejskal E.O., Tanner J.E. Spin diffusion measurements: spin echoes in the presence of a timedependent field gradient// J. Chem. Phys., 1965, 42, 288292.

108. Stilbs P. Fourier transform pulsed-gradient spin-echo studies of molecular diffusion//Prog. NMR Spectrosc., 19S7,19, 1-45.

109. Stupishina E.A., Faizullin D.A., Zakhartchenko N.L., Fedotov V.D. and Zuev Yu.F. Catalytic activity, structure and stability of trypsin in an AOT-stabilised water-in-decane microemulsion// Mendeleev Commun., 2001, 6, 237-240.

110. Suarez M.-J., Levy H., Lang J. Effect of addition of polymer to water-in-oil microemulsions on droplet size and exchange of material between droplets// J. Phys. Chem., 1993, 97, 9808-9816.

111. Texter J. ed. Reactions and synthesis in surfactant systems, Marcel Dekker, New York, 2001,433 p.

112. Tondre C., Herbrant M., Watarai H. Rate of interfacial reactions compared to bulk reactions in liquid-liquid and micellar processes: an attempt to clarify a confusing situation// J. Colloid Interface Sci., 2001, 243, 1-10.

113. Tougu V., Tiivel Т., Talts P., Siksnis V., Poyarkova S., Keavatera Т., Aavik-saar A. Electrostatic effects in trypsin reactions. Influence of salts// Eur. J. Biochem., 1994, 222, 475-481.

114. Walde P., Peng Q., Fadnavis N.W., Battistel E., Luisi P.L. Structure and activity of trypsin in reverse micelles// Eur. J. Biochem., 1988,173, 401-409.

115. Warren J., Stowriny L., Morales M. The effect of structure disrupting ions on the activing of myosin and other enzymes// J. Biol. Chem., 1966, 241, 309316.

116. Wikander G., Johansson L. B.-A. Micelle size determined by electron spin resonance and fluorescence spectroscopy// Langmuir, 1989, 5, 728-733.

117. Zakharova L.Ya., Kudryavtseva L.A., Konovalov A.I. Mechanism of the inhibiting action of electrolytes on the micellar effect in alkaline hydrolysis of p-nitrophenyl ethyl chlormethylphosphonate// MendeleevCommun., 1998, 3, 163-165.

118. Zakharova L.Ya., Shagidullina R.A., Valeeva F.G., Kudryavtseva L.A. The influence of the structure of ethyl aryl chlormethylphosphonates on the catalytic effect of direct and reverse micellar systems// Mendeleev Commun., 1999, 8, 201-203.

119. Zhou G-W., Li G-Z., Chen W-J. Fourier transform infrared investigation on water states and the conformations of Aerosol-OT in reverse microemulsions// Langmuir, 2002,18, 4566-4571.

120. Zulauf M., Eicke H.-F. Inverted micelles and microemulsions in the ternary system water/Aerosol-OT/isooctane as studied by photon correlation spectroscopy// J. Phys. Chem., 1979, 83, 480-486.