Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика активности протеазы и ингибитора трипсина в молозиве и молоке коров в норме и у больных маститом

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Динамика активности протеазы и ингибитора трипсина в молозиве и молоке коров в норме и у больных маститом"

ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА НАУЧНО -ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ; ;■•'■ л Я Ш имени Я.Р.КОВАЛЕНКО

л .0 и ь ^ о»

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК имени В.И. ЛЕШ НА

/

На правах рукописи

ИПАТОВА Ольга Михайловна

УДК 577.156+66.097.7:637.12/3.001

ДИНАМИКА АКТИВНОСТИ ПРОТЕАЗЫ И ИНГИБИТОРА ТРИПСИНА В МОЛОЗИВЕ И МОЛОКЕ КОРОВ В НОРМЕ И У БОЛЬНЫХ МАСТИТСМ

Специальность 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на.соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1968

Диссертационная работа выполнена в лаборатории физиологии и патофизиологии Всесоюзного ордена Ленина научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко, в лаборатории химии протеолитических ферментоз Института биоорганической химии имени М.М.Шемякина АН СССР.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор В.Ф.Поляков

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор В.В.Рудаков (Ленинградский ветеринарный институт)

кандидат биологических наук, Щедрин Е.Л.

(Всесоюзный Государственный научно-исследовательский контрольный институт ветеринарных препаратов)

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследова-

тельский институт физиологии, биохимии и питания с.-х. животных, г.Боровск.

Защита диссертации состоится " // " М-ЯиЯ 1960 г. в /У часов на заседании Специализированного совета Д.020.2В.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном ордена Ленина научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВЙЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

В.В.Амелина

. .ЙЙЫ

■дел

ртаций

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. В "Основных направлениях экономического "" 'пЗоциального развития СССР на 1986-1990 года и на период до 2000 года", принятых ХХУП съездом КПСС, определены основные задачи Агропромышленного комплекса СССР - достарение устойчивого роста сельскохозяйственного производства, надежное обеспечение страны продуктами питания и сельскохозяйственным сырьем.

Известно, что в состав молозива и молока входят вещества, необходимые дая адаптации и становления организма новорожденного. С первым приемом пищи устанавливается тесная связь организма с окружаюдей средой, рост и развитие которого находится в прямой зависимости от состава качественного молозива.

Система пищеварения, осуществляющая первичный контакт с пищей служит основным каналом поступления пластического и энергетического материала и является важным регулятором гомеостаза внутренней среды организма. И.П.Павлов указывал, что "существеннейшей связью животного организма с окружающей средой является связь через известные химические вещества, которые должны поступать в состав организма, т.е. связь через пищу" (И.П.Павлов, Собр.соч., 1951). Следовательно, пища является определявшим фактором в адаптации организма к воздействию условий внешней среды и в обеспечении оптимального роста и развития животных.

■ . Несмотря на определенные успехи в изучении состава молозива и молока, остается много неясного относительно изменешш содержания некоторых его компонентов в зависимости от физиологического состояния коров. К их числу относятся ферменты, которые до настоящего времени являются мало изученными ( В.П.Шидловская, 1985; в. ншЪег£ ^ а1 , 1983 и др).

В период раннего онтогенеза происходят глубокие физиологические изменения пищеварительной системы, особенно у авачшхх животных, которые рождаются с недостаточно развитыми в морфологическом и функциональном отношении органами пищеварения. Определение роли и участия в этих процессах протеолитическнх ферментов молозива позволит внести определенный вклад в изучение физиологии и паталогин пищеварения у телят в этот период.

Известно, что у организмов одним из древнейших способов регулятага: активности протеолитических ферментов является присутствие специфических веществ - ингибиторов протеолитических ферментов. Их содержание в организме связано с регулирующим влиянием на обмен веществ. Это касается не только эндогенных ингибиторов, но и экзогенных, поступающих, в частности, с пищей (ингибитор трипсина молозива коров) (В.Р.Никалаевская, М.И.Чершосов, 1981). Б этой связи вакное значение приобретает изучение состава и качества молозива, взаимосвязи активности протеазы и ингибитора трипсина, влияния их соотношения на питательную ценность молозива^

Несмотря на большие достеешшя ветеринарной науки в изучэ-нии биохимии и физиологии пищеварения жвачных животных в раннем постнатальном онтогенезе, до настоящего времени остается мало выясненными динамика качественных и количественных изменений в молозиве и молоке крупного рогатого скота в связи с возрао-том, породой и сезонами года.

Цель и задачи работы. .Целью работы явилось изучение динамики активности общей и адсорбированной на мицеллах казеина протеазы, а также ингибитора трипсина в молозиве и молоке коров в зависимости от сезона года, возраста, порода и физиологического состояния животных.

В связи с этим задачей исследований являлось изучегше в молозиве и молоке коров:

- общей и адсорбированной на мицеллах казеина активности протеазы;

- динамики общей активности ингибитора трипсина и во фракциях;

- коррелятивной зависимости наеду свободной и связанной на мицеллах казеина протеазой и ингибитором трипсина;

- динамики содержания общего белка в зависимости от возраста животных, их породы и сезона года;

- содержания свободной и казеин-связанной протеазы, ингибитора трипсина и белка у больных клинической формой мастита коров.

Научная новизна состоит в том, что впервые представлена динамика активности общей, а также адсорбированной на мицеллах казеина протеазы серинового типа и ингибитора трипсина в молозиве и молоке коров и выявлена коррелятивная взаимосвязь между активностью протеазы и ингибитором трипсина.

В молозиве и молоке клинически больных маститом коров установлены особенности в изменении протеолитической активности и уровня ингибитора трипсина.

На разработанный нами "Способ определения протеолитической активности молозива и молока коров" получено авторское свидетельство ( Л 1124032 от 15.07.1984г.), а также был модифицирован метод определения активности ингибитора трипсина.

Теоретическое и практическое значение. Установлены закономерности изменения активности общей, а также связанной с мицеллами казеина протеазы и ингибитора трипсина в молозиве и молоке коров до 70-го дня лактации в зависимости от порода, возраста и сезона года в норме, а также у клинически больных маститом животных. Выявлена взаимосвязь между общей протеолитической активностью и уровнем ингибитора трипсина в молозиве и молоке коров.

Полученные данные расширяют представление о биотических особенностях изменения активности протеазы и ингибитора трипсина молозива и о их возможном участии в процессах пищеварения в раннем постнатальном онтогенезе телят. Результаты исследований могут быть использованы при оценке качества молозива для кормления новорожденных телят и для контроля за качеством молока и молочных продуктов перед их технологической обработкой.

Материалы проведенной работы могут быть использованы:

- при издании учебников и руководств по физиологии пищеварения у животных и биохимии молока; в лекционном курсе для студентов биологических, ветеринарных и сельскохозяйственных вузов, а также для работников молочной промышленности;

- разработанный "Способ определения протеолитической активности молозива и молока коров" внедрен в научно-исследовательскую работу при биохимической характеристике молозива, молока и молочных продуктов.

Апробации результатов исследований. Материалы по теме дао- . сертацки доложены на конференции молодых ученых ШЭВ (1382; 1983), заседают Московского отделения Всесоюзного биохишчео-кого общества (ноябрь 1982г.), лабораторном научно-исследовательском совещании (ноябрь 1987г.), заседании Ученого Совета ШЭВ (декабрь 1987г.), межлабораторном совещании (февраль 1988г.).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 4. статьи и 2 методические рекомендации.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Диссертация содержит 220 страниц машинописного текста, включая 40 таблиц и 35 рисунков. В списке литературы указано 286 работ, 102 отечественных и 184 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методц. Работа выполнена в 1980-1984 гг. в лабо- . ратории физиологии и патофизиологии ШЭВ и в лаборатории химии протеолитических ферментов Института Биоорганлческой химии им. М.М.Шемякина АН СССР. Опыты проведены в колхозе им. Горького, Ленинского района, Московской области.

Нивотные были подобраны по принципу аналогов - породе, возрасту, живой массе, продуктивности, сезону года.

Для проведения опытов животные были разделены на 7 трупп.

Таблица I.

Характеристика подопытных трупп животных

Группа а Количество отелов Порода Сезон года

I 7 3-4 черно-пестрая зима

П 6 3-4 черно-пестрая лето

Ш 5 9 - 10 черно-пестрая зима

1У 3 • X черно-пестрая зима

У 6 3-4 айрширская'. зима

У1 4 3-4 айршрская лето

УП 4 I • айршрская зима

Материалом исследований служило молозиво и молоко подопытных коров. Отбор проб проводили через I; 3; 5; 7; 9; 15; 124 часа и 2-е, 3, 4, 5, 6, 7, 20, 30, 40, 50, 60 и 70-е сутки после отела»

От 25-ти коров больных клинической формой мастита брали пробы молозива и молока в летнее время года. Диагностировали мастит по клиническим признакам и при помощи 5^-ного раствора димастина совместно с ветеринарным врачом хозяйства С.И.Буха-ровым.

Отобранные образцы молозива и молока обеачотривали центрифугированием при 500 8 в течение 15 мин: и температуре 4°.

Из обезжиренного молозива и молока получали:

а) сыворотку, осаздением казеина путем добавления к образцам молозива и молока I н, раствора НС1 до получения рН 4,6 и поеледущего центрифугирования при 1500 8 в течение 10 мин;

б) фракцию кислотоустойчивого ингибитора трипсина после осаждения белков 5$-ным раствором трихлоруксусной кислоты

( В.СесЬоуа ег а1,197б );

в) образцы сыворотки, свободные от шцелл казеина двухкратным последовательным центрифугированием: при 20000 е в течение

I часа и температуре 0°, а затем при 100000 в в том же режиме.

При выполнении работы были использованы следующие методы: содержание-общего белка в молозиве, молоке и их сыворотке определяли по Лоури в модификации Ж.В.Шишковой (1980); общую активность ингибитора трипсина молозива, молока и во фракциях методами I). СесЬоуа et а1(197б), ПО В.Ф.Нартиковой И Т.С.Пасхи-ной (1977) в нашей модификации (О.М.Йпатова, 1984); активность протеазы в образцах молозива, молока и их фракциях определяли по разработанному нами способу (В.Ф.Поляков, Л.Д.Румш, 0.1.1.Адамова, 1984).

Полученный цифровой материал обработан методом вариационной статистики и корреляционного анализа с помощью ЭШ "Иаи-ря-2". Достоверную разницу определяли по таблице Стьюдонта, при Р £ 0,05 разницу считали достоверной (В.в.Урбах, 1375).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Динамика общей и адсорбированной на мицеллах казеина протеазы молозива и молока коров в зависимости от их возраста, порода и сезона года

Одним из важнейших критериев оценки молозива и молока коров является содержание в них ферментов (В.П.Шидаовская, 1985),

В таблице 2 представлена динамика активности протеазы молозива и молока коров черно-пестрой порода, из которой видно, что у животных 3-4 отела в летнее время активность фермента до 50-х суток после отела в 3-4 раза бьиа больше, чем у коров зимой.

Протеолптическая активность в молозиве коров первого отела в течешге первых двух суток снизилась на 20$ больше, а в последующем (до 40-го дня лактации) ее уровень на 100-290$ был выше, чем у животных 3-4 отела. Однако, в молозиве коров 9-10 отела . через двоо суток лактации активность фермента на 32$ была ниже, а затем (до 60-х суток после отела) - до 480$ превышала активность протеазы в молозиве и молоке животных 3-4 отела.

В молоке всех сравниваемых групп животных к 70-м суткам лактации происходило снижение активности фермента на 26-42$.

Динамика активности протеазы в молозиве и молоке коров айрширской породы представлена в таблице 3.

Из таблицы 3 видно, что в молозиве и молоке коров 3-4 отела айрширской породы в летнее время протеолптическая активность до 7.0-х суток после отела на 90-150$ бшга выше по сравнении с активностью фермента аналогичной группы животных, содержащихся на зимнем рационе.

В молозиве первотельных коров айрошрской породы (УП группа) в первые двое суток лактация протеолиткческая активность до 70$ была выше, а в последующем (до конца исследований) - на 35-80$ меньше, чем у животных 3-4 отела.

Активность протеазы в молозиве и молоке коров 3-4 отела айрошрской породы, содержащихся на зимнем рационе в среднем на 200-300$ была выше, чем у животных аналогичного возраста черно-пестрой породы. В течение первых двух суток после отела в летнее время в молозиве животных а^ыирской породы активность протеазы до 60$ была ниже, а в молоке с 30-х суток лактации -

Таблица 2»

Динамика активности протеазы молозива и молока коров черно-пестрой порода '( М * т; ^ трипсина/мл. 1СГ3; Р 0,05)

Время после отела

Зимний

рацион

I груша 3-4. .Р.Т

ЗУ группа 1-Д..9 ДеД..

: Ш группа : 9-10 отел,

¡Летни

•П группа :3-4 отел

й рацион

" = 8

* = 3

к I

А = 5 ^ к I П). : 'Л к I П).

I чао 0,6*0,06 1,9*0,5х 301,6 1,4*0,05х 218,7 2,2*0,5х 345,3

3 0,7*0,05. 1,8*0,3х 246,6 1,7*0,09х 225,3 3,2*0,3х 430,7

7 1,2-0,3 3,1*0,3х 261,9 2,6*0,Iх 218,6 3,7*0,6х 311,0

15 1,а±о,з 2,6*0,2Х 207,3 4,4*0,Iх 354,8 7,2*0,8х 579,0

24 3,1*0,5 3,8*0,Iх 125,2 - 4,1*0,2х 135,0 14,8*4,4 485,0

2-е сутки 6,8*1,1 5,3*0,3 77,7 4,7*0,2 68,5 22,5*2,9 328,5

4-е 6,6*0,7 6,2*0,1 93,5 7,4*0,2 112,2 20,1*4,1 303,0 ш

6-е 6,8*1,0 8,0*0,6 118,2 26,3*0,5х 387,1 29,6^3,2 435,3

7-е 7,3*0,6 23,1*0,9х 290,6 27,8*1,2х 379,9 39 ^ 5~3,5 540,-0

20-е 6,5*0,7 25,1*1,5х 383,2 32,8*1,Iх 500,1 39,6*2,7х 604,3

30-о 12,3*3,2 33,6*0,5х 273,4 64,5*1,3х 525,0 52,5*9,0 427,2

40-е 29,7*6,7 38,7*1,5 130,1 174,0*3,7х 585,0 53,3*3,5 179,3

50-о 98,6*7,6 52,С*1,3 52,7 126,9*5,5 128,7 52,8*7,5 53,5

60-е 113,2-15,7 93,2*1,1 82,2 142,8*3,0 126,1 59,5*1,3 52,5

70-с 195,0*22,1 114,0*12,5 58,5 144,1*4,1 73,9 116,3*19,9 59,7

'Р - достоверность разности по отношению к I группе

Таблица 3. Динамика активности протеазы в молозиве и молоке коров айрширской породы ( М £ ш ; ^ трипсина/мл» 1СГ3: Р£ 0,05)

Время после

Зимний рацион

t Летний рацион

отела :У группа отел : УП группа : 1-й отел : У1 группа : 3-4 отел

: п = 6 : п = 4 \% к У гр. : п = 4 ! % к У ГР.

I час 1,1-0,1 1,3*0,07х 122,7 1,6*0,3х 143,6

3 -"- 1,2-0,1 2,1*0,2х 170,7 1,2*0,1 100,0

7 3,4*0,3 2,8*0,4х 80,6 4,2*0,6х 121,7

15 3,5*0,1 4,7*0,5х 135,0 3,3*0,4 94,6

24 4,7*0,3 7,9*0,7х 166,7 5,7*0,6х 120,9

2-е сутки 7,6*0,4 7,9*0,7 103,9 21,3*2,4х 280,0

4-е 23,6*2,1 7,0*0,4х 29,4 27,1*5,3 114,8

6-е -н- 7-е 32,7^1,7 36,1*2,2 II,2*1,9х 8,2*0,8х 34,2 22,9 36,6*4,4 38,3*4,6 1Щ9 106,1

20-е 44,1*3,2 23,8*2,6 54,0 33,1*2,2 75,1

30-е -"- 54,4*3,4 27,0*0,9 49,6 56,3*3,0 103,6

40-е -"- 90,4*5,8 31,8*1,8 35,1 156,2*15,5 172,8

50-е 160,4*16,3 31,2*1,5 19,5 153,5*19,8 95,7

60-е 196,5*13,1 128,7*12,1 65,5 187,0*7,0 95,2

70-е 266,4*32,8 139,0*7,4 58,2 29313~22^ X 110,1

ХР - достоверность разности по отношению к У группе.

до 200$ больше, чем у коров черно-пестрой породы.

Ферменты молока находятся как в свободном, так и в ассоциированном СОСТОЯНИИ С его Компонентами (K.li.Shahani, 1966 ). Утворждаетсл, что но менее 9С# ссриновой протеазы молока адсорбировано на поверхности казеиновых мицелл ( A.T.Andrews, 1983; G. Humbert et al,1983 И Др.).

Динамика активности казеин-связанной протеазы молозива и молока коров черно-пестрой породы представлены на рис.1.

Из рисунка видно, что активность'адсорбированной на казеине протеазы в молозиве и молоке коров 3-4 отела черно-пестрой породы, содержащихся на летнем рационе в течение 70 дней лактации до 392$ была вьчсе, чем зимой.

В первые сутки поме отела активность казеин-связанной про-

Динамика активности казеин-связанной протеазы

нротеазн в молозиве первотельных коров черно-пестрой породы (.П группа) составляла 21-38$ от уровня активности животных 3-4 отела и, в последующем, до 40-х суток лактации на 20-50$ также бц-ла ниже; С 50-х по 70-е сутки лактации активность адсорбированного на казеине фермента в молоке первотельных коров до 85% была тав, чем у животных 3-4 отела;

В молозиве коров 9-10 отела в первые сутки лактации аклиг*-ность связанной с казеином протеазы на 21-73$ была меньше, а б Последующем, до конца исследований, - до 50С$ больше, чем у животных 3-4 отела;

Установлено, что в течение трех суток после отела в молозиве коров айрпшрской породы 3-4 отела, содеряащкся на летнем рациоио (У1 группа) активность адсорбированного на мицеллах каэе;:аи мента била до 2405» выше, чем зимой. В пооледутсем, до юнгп '.'с; :;.--довагай, активность казеии-'связанного фермента в их-с^лъь и

коров айрширской породы при летнем содержании колебалась в широ-. ких продолах ( от -48/5 до +103$).

В молозиве и молоке коров айрширской породы первого отела активность связанной с казеином протеазы до 270/» превышала соответствующую у животных 3-4 отела.

Выявлено, что за первые 15 часов лактации активность связанной с казеином протеазы в молозиве коров У группы (айрширская по- . рода, зимний рацион) на 20-50$ была меньше, а с 2-х по 60-е сутки лактации - до 290$ больше, чем у животных черно-пестрой порода. В молозиве и молоке коров айрширской порода, содержащихся на летнем рационе с 3-х по 20-е сутки лактации активность протеазы на 36-64¡2 была ниже, а в период 30-70-х суток после отела -до 200$ выше, чем у аналогичных коров черно-пестрой порода.

Следовательно, общая протеолигическая активность и активность фермента, адсорбированного на мицеллах казеина молозива и молока коров находятся в определенной взаимосвязи с их возрао- . том, породой и рационом кормления, связанным с сезоном года.

Выявлено, что в первые 5-7 часов лактации общая протеолити- • ческая активность обезжиренного молозива у всех подопытных групп коров была минимальной, а активность адсорбированного на мицеллах казенна фермента - максимальной (около одной тысячи раз больше, чем в молоке). Через 60-70 суток после отела в молоке коров, независимо от их возраста,породы и рациона кормления, общая активность протеазы соизмерима с активностью казеин-связанного фермента, т.е. наступает "равновесие" в распределении протеазы между жидкой частью молока и фракцией казеина.

2. Динамика активности ингибитора трипсина в молозиве и молоке коров

До настоящего времени нет сведений о динамике общей трип-синингибирукхцей активности молозива и молока коров.

Наш установлено (рис.2), что в первые сутки-лактации общая активность ингибитора трипсина в молозиве коров 3-4 отела черно-пестрой породы, содержащихся иа летнем рационе (П группа) на 1040$ была ниже, а в последующем, до конца исследований, аналогичной или до 64$ выше, чем у тех же животных зимой.

В молозиве и молоке коров черно-пёстрой породы первого отела

черно-пестрая порода единиц ИЕ

*—• I группа .—. П группа Ш группа о—о ТУ группа

Динамика активности ингибитора трипсина в молозиве и молоке коров

айрширская порода единиц ИЕ

•—• У группа 71 группа о—ь УП группа

-Н-

'г 4 г ■• го ее * >з ^ г * ' го (0

сутки после отела часы "сутки после отела

общая активность ингибитора трипсина в первые четверо суток после отела на 20-60$ была ниже, а затем, до конца исследований, на 2080$ визе, чем у аналогичных животных 3-4 отела;

Общая трипешишгибируадая активность молозива и молока коров 9-10 отела (Ш группа) в течение 40 суток лактации до 40$ была меньше, а в последующем (50-70-е сутки) - на 15-85$ превосходила уровень активности ингибитора у животных сравниваемой группы.

Из данных, представленных на рис.2 видно, что при содержании коров 3-4 отела айрширской порода на летнем рационе, за первые б суток лакташш общая активность ингибитора трипсина в молозиве на 10-30$ была ниже, а в молоке (с 20-х по 70-е сутки пооне отела) до 25$ больше, чем при зимнем кормлении.

В молозиве коров айрккрекой породы первого отела уровень обшей трппсшппггибирувцей активности на 10-40$ был ниже, а в молоке с 30-х суток лактации и до конца исследований - на 15-30$ выше, чем у аналогичных -тавотных 3-4 отела.

го о

100

60 20 15 10 5 У

Рис. 3.

Динамика активности кислотоустойчивого ингибитора трипсина молозива и молока коров

единиц ИЕ

черно-пестрая порода

, I груша -—* П группа -—„111 группа о—0и груша

«диниц №

айрширская порода

- У группа -- У1 группа -х УП группа

34 2

з -4 5 е

15 г+ г пси

г з * з е 4

С. у Г < >70<

Следует отметить, что независимо от рациона (зимнего или летнего) в течение первых суток лактации общая активность ингибитора трипсина в молозиве обеих пород коров была аналогичной, а в последующем (с 2-х по 70-е сутки лактации) в молозиве и молоке животных айрширской породы на 30-90$ была выше, чем у коров черно-пестрой породы.

Известно, что в молозиве свиней и коров доминирует специфический кислотоустойчивый ингибитор трипсина (н.Ьазкоиак! et а1, 1Э57;И.Ре11епЬегк, 1979 И Др.).

Проведенными исследованиями установлено (рис. 3), что в течение первых двух суток лактации в молозиве коров 3-4 отела черно-пестрой порода, содержащихся на летнем рационе (П группа), активность кислотоустойчивого ингибитора трипсина на 50-100$ была выше, а в последувдем (4-7-е сутки лактации) - на 15-335? меньше, чсш зимой,

В молозива коров черно-пестрой породы первого к 9-10 отелов I» сч-ргно три часа лактации активность кислотоусгойчягого ипгиби-

тора на 14$ и 7$ соответственно была ниже, а с 4-х по 7-е сутки после отела - на 20-100/» больше, чем у животных 3-4 отела.,

У коров 3-4 отела айрширской породы при содержании на летнем рационе в течение первых суток лактации активность кислотоустойчивого ингибитора трипсина в молозиве до 50$ была меньше, а в последующем (до 7-х суток лактации) - на 30-120$ выше, чем зимой (рис.3). У этой же породы коров первого отела в течение 7 дней молозивного периода активность ингибитора на 10-50$ была меньше, чем у аналогичных животных 3-4 отела.

Следует отметить, что за весь период исследований (независимо от рациона кормления) актишость кислотоустойчивого ингибитора трипсина в молозиве коров 3-4 отела айрширской породы на 40-70$ превышала значения у 'животных черно-пестрой породы.

Таким образом,'общая трипсинингибирушцая - активность кислотоустойчивой фракции находилась в определенной взаимосвязи с возрастом, породой животных и рационом кормления. Выявлено, что на актишость кислотоустойчивого ингибитора трипсина приходится 40-60$ от общего уровня ингибитора трипсина в молозиве первых 3-4-х суток лактации, а в последующем (до конца молозивного периода) применяемым методом не выявлялась. Общая активность ингибитора трипсина в молозиве коров в течение этого времени уменьшилась в 20-40 .раз и в последующем, до 70-х суток лактации, колебалась в незначительных пределах.

3. Динамика активности ингибитора трипсина ' в компонентах молозива и молока коров

Установлено, что в молозиве и молоке коров имеется протеаза серккового типа, адсорбированная на мицеллах казеина ( g.Get and с.А1а!з,1979; s.Heinsrdea, 198з и др.); Предполагается, что ингибитор трипсина, взаимодействуя с протеазой, участвует в процессах стабилизации молока. В связи с этим являлось актуальным изучение активности ингибитора трипсина, связанного с разными фракциями молозива и молока коров.

У коров 3-4 отела черно-пестрой породы, содержащихся на зимнем рационе (I группа) во фракциях молозива первого удоя ингибитор трипсина имел следушее распределение. В нативной сыворотке молозива, полученной после центрифугирования при 20000 g (I фракция)

Динамика активности ингибитора трипсина б компонентах молозива и молока коров единиц ИЕ

черно-пестрая порода, 3-4 отел, зимний рацион

I фракция »

П фракция •

сыворотка молозива и молока (рН 4,6) ;

кислотоустойчивая фракция • ■ нативное молозиво и молоко.

*—*

5 45

часы

5 6 1

сутки

бО

отела

и 100000 g (П фракция) активность ингибитора составила соответственно I07/Í и 94$ от общей его активности. В кислотоустойчивой фракции и в сыворотке молозива, полученной при pfi 4,6 активность ингибитора соответственно была на 58% и 13% меньше, чем в молозиве;

В последующем выявлено дальнейшее снижение трипсинингибирую-щей активности молозива. В частности, значительные сдвиги установлены во фракции кислотоустойчивого ингибитора, активность которого на 7-е сутки лактации составляла 105? от общей его величины в обезжиренном молозиве. В последующем, (20-70-е сутки лактации) активность ингибитора трипсина в I фракции (центрифугирование при 20000 g ) на 20% была выше, в сыворотке (рН 4,6) - на 26% низе, а во П фракции - находилась на уровне общей трипсинингибируицей активности нефракционированного молока.

Активность кислотоустойчивого ингибитора в первые сутки лак-таши составляла 50Í от общей трипсинингибируицей активности молб-яикд, а в носиодущем уианьпалась я на 20-е сутки в молоке и сталь-

зуемым методом анализа не выявлялась.

Таким образом, ингибитор трипсина имеет неодинаковую связь с компонентами молозива и молока и находится в определенной зависимости от возраста, породы животных и сезона года.

4. Активность общей и казеин-связанной протеазы, ингибитора трипсина и содержание белка в молозиве и молоке коров, больных клинической формой мастита

Заболевания коров обуславливают снижение продуктивности и изменения физико-химических свойств молока, в том числе и активности ферментов (Б.С.Баранова, 1984).

Установлено» что общая активность протеазы в молозива больных клинической формой мастита коров в первые сутки лактации около 5С$ была ниже по сравнению со здоровыми животными. Однако через 7 суток после отела активность фермента в молозиве заболевших коров уже в 2,8 раза превышала уровень здоровых животных.

Общая протеолитическая активность в молоке больных маститом животных (3 месяца лактации) была в 5,4 раза больше, чем у здоровых коров.

Исследованиями установлено, что активность адсорбированной на поверхности казеина протеазы в молозиве заболевших маститом коров в первые сутки после отела на 94-97$ была ниже, а в молоке заболевших на 50-е - 70-е сутки после отела в 15-29 раз превышала уровень здоровых животных.

В молозиве заболевших маститом коров в первые трое суток, после отела активность общего и кислотоустойчивого ингибитора трипсина была на 33-675? ниже, чем у здоровых животных. В дальнейшем в молозиве и молоке заболевших маститом коров общая трипсшшн-гибируияая активность в 5 раз превышала уровень здоровых животных.

Устаноачена особенность в проявлении кислотоустойчивого ингибитора в молоке больных маститом коров, которая характеризовалась высоким уровнем его активности, тогда как в молоке здоровых животных этот ингибитор не выявлялся.

У заболевших маститом коров через 7 и 70 суток после отела содержание общего белка в молозиве и молоке было соответственно в 2 и 3,3 раза, а в сыворотке молока в 6-7 раз больше, чем у здоро-

вых животных.

Таким образом, проведенными исследованиями было выявлено, что заболевание коров маститом оказывает влияние на динамику про-теолитической активности и ингибитора трипсина, на содержание общего и сывороточного белков в молозиве и молоке. Кроме того, проведенные исследования показали о довольно сложных взаимосвязях про-теаз и их ингибиторов в молозиве и. молоке коров, которые, несомненно, являются эволюционно закрепленными и определявшими факторами в период физиологического становления процессов пищеварения у новорожденных животных.

ВЫВОДЫ

I; Установлены закономерности изменения активности протеаз, ингибитора трипсина и общего белка в молозиве и молоке коров в динамике лактации и в зависимости от времени их отела;

2. В молоке коров черно-пестрой и айрширской пород выявлена общая закономерность, характеризующаяся к 70-м суткам лактации усилением активности протеазы в 250 ~ 25 раз по сравнению с молозивом первого удоя.

Активность протеазы в молозиве и молоке коров айрширской породы на 70$ (зимний рацион) и на 175325$ (летний рацион) была выше, чем у животных черно-пестрой породы,

3. Независимо от порода, возраста и сезона года, активность адсорбированной на мицеллах казеина протеазы в молозиве коров к седьмым суткам после отела уменьшалась на 99,5$.

4. В молозиве коров как черно-пестрой, так и айрширской порода общая активность ингибитора трипсина уменьшалась на 92,4$ в первые четверо суток после их отела. У коров 3-4 отела айрширской породы, независимо от сезона года, активность ингибитора трипсина в молозиве и молоке на 45-15$ была выше, чем у животных чернОт пестрой породы..

Независимо от порода у первотельных животных активность ингибитора была на 30±15$ ниже, чем у коров 3-4 отела.

5. В молозиве коров кислотоустойчивый_ингибитор трипсина • выявлялся до семи суток после отела и составлял около 40$ от общей его активности у коров черно-пестрой породы 3-4 отела при их содержании на аишвд рационе и 60$ - на летнем, а у животных айрширской породы -* около 60$ независимо от сезона года.

6. Сыворотка молозива и молока коров в зависимости от метода ее получения имеет разную трипсинвдгибирунцую активность: в сыворотке, полученной центрифугированием (20000в , I час), 'активность ингибитора на 15*5% была выше, а при осаждении казеина в изоточке (рН 4,6) - на 30*10$ ниже, чем в нативном молозиве и молоке коров до 70-го дня лактации.

7. В молозиве коров через 3-5 часов после отела уровень общего белка находился в пределах 14,87-27,99 г$, а в последующем происходило постепенное снижение его количества до 2,77-3,55

к четвертым - пятым,суткам после отела.

В молозиве коров айрширской породы с 2-х по 7-е сутки после отела количество общего белка на 45*15$ было больше, чем у живот- ■ ных черно-пестрой породы. В молозиве коров первого отала содержание общего белка на 22*15$ было ниже, чем у аналогичных пород животных 3-4 отела, независимо от сезона года.

8. В сыворотке молозива коров через 1-3 часа после'отела уровень общего белка находился в пределах 8,4-1,5 г$, а в после- . дупцем происходило постепенное его снижение до 1,0-0,7 т%, в основном, за молозивный период лактации.

При содержания коров айрширской породы 3-4 отела на зимнем рационе количество общего белка в сыворотке молозива на 30*10$ было ниже, чем у аналогичного возраста животных черно-пестрой породы. В сыворотке молозива первотельных животных черно-пестрой породы уровень белков на 25-60$? был меньше, чем у этой же породы коров 3-4 отела.

9. Выявлена прямая коррелятивная зависимость между активностью протеазы, адсорбированной на казеиновых мицеллах ( г » 0,87-0,98)

и активностями общего и кислотоустойчивого ингибитора трипсина ( г= 0,71-0,95 ) и обратная коррелятивная связь между общей цро-теолитической и общей ( г = 0,49-0,66), а также и кислотоустойчивой трипсинингибирушей активностью ( г = 0,57-0,93) в молозиве и молоке коров, независимо от их возраста, породы и сезона года.

10. Общая протеолитическая активность в молозиве и молоке больных маститом коров в 3-6 раз была выше, чем у здоровых живота ных. В молозиве больных маститом коров общая активность ингибитора трипсина и казеин-связанной протеазы соответственно в 2 раза и на 75*10$ бшга меньше, а в молоке в 3 и 14*2 раза больше, чем у здоровых животных. У «Золышх маститом коров в молоке и его сыворотке уровень общего белка соответственно в 2,5*"0,5 и 5 раз был выше,

чем у здоровых животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРОДОКЕНИЯ

I. Разработан "Способ определения протеодитической активности молозива и молока". Авторское свидетельство № II24032 от 15¿07,84г. Усовершенствован "Метод определения активности ингибитора трипсина в молозиве и молоке коров", утвержденный на секции общей и сравнительной биологии сельскохозяйственных животных Отделения ветеринарии ВАСХНИЛ и опубликован в сборнике "Методические рекомендации по применению современных биохимических методов исследования ферментов, липидов, половых горло-нов и микроэлементов в биологических объектах", М., 1984г.

2; Результаты исследований могут быть использованы при оценке качества молозива для кормления новорожденных телят и для контроля за качеством молока и молочных продуктов перед их технологической обработкой.

3. Полученные материалы используются на лекциях, семинарах проводимых о зооветеринарными специалистами, при характеристике биохимических свойств молозива и молока коров, а также в научно-исследовательской работе.

4» Результаты исследований динамики протеолитической активности молозива и молока у больных клинической формой мастита коров раскрывают особенности патогенеза болезни и могут быть использованы при разработке методов диагностики и терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации®

I. Адамова О.М., Поляков В.Ф. К методаве выделения и концентрации протеолитического фермента молока крупного рогатого скота.// Бюлл. ВИЭВ, - 1982 - В.48. - С;53-54.

2; Адамова О.М; Протеазингибируицая активность молозива и истока коров;// Ехшг. ВИЭВ, - 1983 ~ В.50 - С;53-55;

3; Платова О.М., Поляков В.Ф; Методика определения протеолитической активности молока и молозива коров.// Применение современных биохимических методов исследования ферментов, липидов, патовых гормонов и макроэлементов в биологачоскгас объектах - Ы. - 1984 - С.27-33.

4. Ипатова О.М. Методика определения ингибитора трипсина молока и молозива коров.// Применение современных биохимических методов исследования ферментов, лишдов, половых гормонов и микроэлементов в биологических объектах. - М. - 1984 -

С.34-38.

5. Ипатова О.М., Поляков В,<5. Динамика активности ингибитора трипсина в молозиве и молоке коров в зависимости от возраста животных и сезона года.// Деп. во ШИИТЭЙСХ, № 114 ВС-88. - М. - 1988 - 70.

6. Ипатова О.М., Поляков В.Ф; Динамика активности протеазы и ингибитора трипсина в молозиве и молоке коров больных клинической формой мастита.// Деп. во ВНИИТЭИСХ, й 115 ВС-88. - М,-1988 - IOC.

Л - 8 3 204 0т5.04.88 г. Заказ 13 15 Тираж 100 Формат 60x84/16 FbTartpHHT. Типография Васхнял.