Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и функция ионотропных глутаматних рецепторов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Структура и функция ионотропных глутаматних рецепторов"

АКАДЕМШ НАУК УКРА1НИ ШСТИТУТ ФШОЛОПК 1М. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ 1НСТИТУТ МЕДИЧНИХ ДОСЛ1ДЖЕНЬ п _ „ л _ МАКСА-ПЛАНКА

п о Ш1

г) Г( (1» .. На правахрукопису

е.. и

БУРНАШЕВ Наыь Абдурахманович

УДК 612.17

СТРУКТУРА ТА ФУНКЦ1Я ЮНОТРОПНИХ ГЛУТАМАТНИХ РЕЦЕПТОР1В

03.00.13 - ФЫолопя людини 1 тварин

Дисертащя у ншляд! науково'1 допошд! на здобутгя вченого ступени доктора бюлопчних наук

Кит 1993

Роботу- внконано у вишни клтшнох фЬюлоп!' (заш'дуючий - професор Б.Сакман) 1нстнгугу Мсднчнич дослщжень Макса Планка.

Офпиальш опоненти: академк В.I.Скок

д.бюл. наук Ф.В.Бурдига д.ф!3.мат.наук В.И.Тесленко

Пров1дна установа: 1нститут геронтологи АН Укра'щи

Захист вщбудеться 22 грудня 1993 року на засщанш спец1ал1зоиано'1 ради Д-016.15.01 при 1нстнтуп СЧзюлогп ¡м. О.О.Богомольця АН Украши (Ки'ш, вул. Богомольця 4).

С дисергашею можна ознайомитися в бШлттещ 1нституту фпюлогп ¡м. О.О.Богомольця АН Украшн.

Автореферат роислано " 2_1993 року

Вчений секретар спецкиизовано'1 ради доктор бюлопчних наук

3 А.СОРОКИНА-МАРИНА

ВСТУП

Актуалътстъ проблемы

СиНаптична передача у центральна! нервовш систем! (ЦНС) здшснюеться за допомогою основного нейротрансмггера глутамата, котрий актнвуе глутаматш рецептора. LU рецептори являють собою бшковд молекули, що вбудоваш в клтшну мембрану i утворюють ioiiHi капали. Пщ час сполучення трансмцера з рецептором останки! актнвуе проходження ¡онного струму через постсинаптичну мембрану.

ТрадицШио ¡онотропш глутаматш рецептори, класиф1кують, згшно з i'x здатшстю до переважного сполучення з вщповщними агошстами, на АМРА-каТнатш (ne-NMDA) та NMDA рецептори (Moneghan et al., 1989, Aimu. Rev. Pharmacol Toxicol., 29, 365; Watkins et al., 1990, Trends Pharmacol. Sci., 11, 25).

Синаптцчний струм складаеться з двох компоненте : швидкого та повгльнога. За допомогою фармаколопчного анализу струму було показано, вдо кожний з' компоненте обумовлений актившстю вшповшного типу рецептора. АМРА-ка'шатш рецептори вщповщають за швидку складову синаптичного струму i проводять головним чином iiaTpiem струми; NMDA рецептори вщповщають за пов1пышй компонент i характеризуются яскравою потенщалозалежною кальщевою проникнютю (Headley and Griilner, 1990, Trends Pharmacol. Sci., 11, 205; Collingridge and Singer, 1990, Trends Pharmacol. Sci., 11, 290). Входження. ioHiB кальшю в нервову клтшу, як вважйсться, грае першорядну роль у регулюванш ' довготривалих змш сииаптично! активное^, котрг становлять молекулярну основу таких процеав як пам'ять та навчання. В той же час, надмфне входження ioHie кальшю справляе токсичний ефект i призводнть до загибеЛ1 oiTiuiii (Nicol et al., 1988, Neuron, 1, 97; Cliol, 1988, Neuron, 1 623). Молекулярне клонування внявило наявшеть велико! кшькост! субодиниць глутаматних peuernopin i дозволило розпочати детальне дослщження властивостей pijinix Tiinie penenropiB i, зокрема, визначення структурних елемеитн), що вщповщають .за особливосп ioHHoi npoHUKiiocii субодиниць.

Пропонований цикл poGiT присвячено, головним чином, аналЬу аластивостей piiunx тппш рекомбшантпих глутаматних рецеторш на ochobi знания i'x riepBiiinioi сгрукгури. ¡накше кажучи, ниянлеишо того, як1 cni.4i.Hi структурni сл^менти вишачають характер ionnoi' пронпкноси глутаматних рецепторов i особливо i'x кальшию! npomiKHccii. Hi мигании

аналпувалися з використанням двох методичних пшход1в : eлeктoфiзioлoгiчнoí характеристики властивостей penerlTopiB, експресованих до фШробласпв, та техтки точково! мутаци, котра дозволяе цшеспрямовано змпиовати елементи первинно? структури. Зроблено спробу провести молекулярну щентифкашю нативних глутаматних рецепторов на ochobí ananisy властивостей субодиниць, що • входять до i'x складу.

Mema i основт задачг дослгджения

Мета uieí роботи - дослгдження властивостей рекомбпгантних глутаматних рецепторш у koiitckctí структура - фу11 к ц i я. Ochobhí завдання полягали у нижченаведеному :

1. Датн опис електроф!зюлопчних властивостей pÍ3HHX субодиниць клонованих глутаматних редептор!в, експресованих до клшш ф|бробласт1в.

2. Провести класифжашю глутаматних peneniopiB на ochobí анашзу ix функшоналышх особливостей i первинно! струкгурн.

3. Виявитн елементи у первиннШ структур! бщковоУ молекули, Korpí визначають ioimy ripoiniKnicTb глутаматних peuenropíb р[зннх клас|в.

4. Дослшити вплив посттранскрипцшних геиетичннх мехаипмт : "сплейсшгу" та "редагування" мРНК на характеристики ¡онного струму глутаматних peuenropÍB.

5. Провести молекулярну щентифжацпо глутаматних peuenropÍB у кштинах ЦНС на ochobí пор!вняння властивостей нативних i peK0M6ÍH3HTHHx рецепторш.

KoHKpeTHi завдання дослшжения викладеш у вщповщних роздшах.

Наукова новизна роботи

Проведено деталышй анал(з функщональних характеристик ycix-Turiie рекомбшантних ¡онотропних глутаматних peneriTopib. Проведено класиф!кащ'ю тутаматних peuenTopÍB на ochobí аналЬу структури та функшональннх характеристик.

Вперще щентифжовано дшянку в амшокислотшй послшовносп трансмембранного сегменту ТМ2 ((}/Я дшянка), що вщповшае за контроль ¡онно'1 провщност! АМРА рецептор1В.

Дослщжено структурш детермшанти проникноеп глутаматних рецептор1в для двовалентних ¡ошв. Для рецепторш АМРА типу показано, що низька проникшсть для ¡сипа калыию визначаеться наявшстю позитивно зарядженого амшокислотного залишку аргшшу у О/Я дшянш, внесеного до не! внаслщок редагування мРНК на тзшиий стадн розвитку. Показано, що рпний стугннь експреси редаговано! форми субодинйш СНиК-В визнача? Са2+ проникшсть гетеромерних канал1в.

Дослщжено вплив альтернативного "сплейсингу" на функцюнальш характеристики АМРА рецептор1в. Вперще ¡дентифжовано структурну композишю нативних глутаматних рецептор1в АМРА типу в клшшах Бергмановсько! глЦ, на оснсим пор1вняння (х влютивостей з властивостями рекомбшантних глутаматних рецептор1в.

Показано ¡снування восьми варшнтсв субодиниш С1иЯ-6 родини кашатних рецепторов, обумовлених редагуванням мРНК у трансмёмбранних дшянках ТМ2 1 ТМ1. Виявлено вплив редагування як у ТМ2, так 1 у ТМ1 на Са2+ проникшсть щс! субодинищ.

Для >ШОА рецептор1в ¡дентифжовано дшянку в ТМ2, котра вщповШае за контроль кальшево! .. ¡- маппево! проникност1 1 потнШалозалежного блоку юнами магшю цього типу рецептор1в.

В результат! дослшження для рпного типу рецептор1в вдалося виявйти спмын струкгури'1 еЛементн, що визначають характер ¡'хньо! юнно! провщносп. Сформульоваш уявлення вшкрили нов1 напрямки у дослщженш генетичних мехашзм1в контролю функцШ глутаматних рецегттор1в та '¡х молекулярно! щентифжаца.

Апробац1я роботи

Результата роботи були подан! на таких наукових э1браннях : на конференциях фЫолопчного товариства ФРН (Фрайбург, 1991; Мюнхен, 1993), на конференца ф(зюлопчного товариства Великобритана (Лондон, 1991), на щоргших конференшях Амернкансько! Асощаца з нейронаук (Ныо Орлеане, 1991; Анахайм, 1992), на ВеснянШ конференца з ппокампу (Кайманов! остроии, 1992), на конгресс 6вропейсько1 Асощацп з нейронаук (Мюнхен, 1992), на конференца бюф|зичного товариства США (Вашингтон, ¡993). Результат» роботи були також подаж 1

оОговорювалися пщ час читання лскшй i доповшей в шститутах унжерсигетах ФРН, АнглП', США.

Публмацп

Результат роботи подано у 22 статтях i коротких повщомленнях ; . провщних М1Жнародних журналах.

МЛТЕРШ1И I МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕННЯ

В цШ po6oTi подано тшьки ochobhí детагп методики, необхщш для подальшого викладення. Детально метод« дослщження, в тому чиыи техшка клонуиаиня субодиниць, точкова мутацш i способи виявлення посггрансткрипцШних зм'ш амшокислотних поелшовностей викладеш у пишовщних статтях.

Культура клгтгт i трансфекцЫ

Трансформоваж ембрюнальш клтши нирок людини (АТСС CRL 1573, 293) культивували на п ¡л клади i в середошшй MEM-Gibco (Eggenstein, ФРН), що мгстило 10 % телячо? плазми (fetal calf serum). ГПсля шкубацп в атмосфер! з 5 %С02 протягом 48 годин клтши трансфектували вщповщною плазмщою сДНК (PCDM-8), що MÍCTiwa амшокислотш послщовност! бажаних субодиниць, за допомогою методу Саз(Р04)2 прециптщи (Chen and Okayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 2745; Pritchctt et al., 1988, Science, 242, 1306). У випадках, коли трансфектували комбшаци, для кожно/ субодиниш брали плазмши однаковоУ ваги (1000 нг, 500 нг та 100 нг на одну чарунку культурального посуду). У леяклх випадках сДНК для рЫшх субодиниць трансфектували в пропорцй 1:10 або 1:5. Приблизно через 48 годин пюля трансфекцн клггини використовували для електроф1зюлопчного експерименту.

Глгальт клтини i кл'ипини нейрошв

Первинну культуру нейронов i пиалышх клтш мозочка 8-денних mypiB отримувпи за модифжованим нами методом, поданим в (Novelli et al., 1988, Brain Res., 451, 205; McCarthy and de Villis, 1980, J. Cell. Biol. 85, 890). Для елсктрофЫолопчнмх експеримсипв використовували гранулярш ненрони i астроцити веретецовидно! форми гючинаючи з 8 до

13 дня in vitro. Культивоваш астроцити веретеновидног форми, як вважають (Ortega et al., 1991, Neuroscience, 41, 335), e отшами Бергмашвсько!' глй.

Розчини

Склад. основннх розчишв, Korpi використовувалися у наших експериментах, наведено в Таблиц! 1.

Таблцця 1. Композици використовуваних у poóomi зовшитьо- та внутрпиньоклтишшх розчишв ( у мМ).

Розчини 3obhíiiihí ; "нормальний" "натр1евнй" "калылеинй" "магшевни" BHyTpitCliTHH-ний

NaCl

135 140

КС! MgCl2 СаС12 CsCl EGTA HEPHS 5,4 1 1,8

1 I

110 1

110

140

10

5 5 5 5 10

В деяких випадках була необхшшсть варновання концентрацию двовалентних'катюшв у "нормальному" ta "натр1евому" розчинах. Усякого роду 3Minn складу основних розчишв згадуються у Бщповщному Micui. рН ycix розчишв - 7,2. Yci aronicni i блокатори розчиняли у вщповщних концеНтрацЫх у зовшшшх розчинах. Доел щи провалили при 'шмнаттй температур! 20-23 °С.

ЕлектрофЫологш

Транефектоваш клтши на ги'дкладщ переносили до робочо5 камери на предметному столику нтертованого мжроскопа. Камеру постшно перфузували "нормальним" розчином. Реестрацш ¡онних струг.!¡в провалили ыд поодиноких клггин методом локально'{ ф1ксаца мембранного потеншалу в конф1гураци "whole-cell" (Hamill et al., 1981, Pflugers Archh', 391, 85), використовуючи пщсилювач EPC-7 (List Electronics, Darmstadt, ФРН). Агошсти, розчннеш в одному ¡з зовшшшх розчишв, подавалися за допомогою систем» шпидко! змши розчишв, Що

базувалася на подвшшй ninenji, яка приводилася в рух за допомогон и'езо-елемента (Рис. 1). Перед подачею агошста клггини вйтримувалиа по менилй Mipi 30 с у контрольному р'озчиш (вщповщний зовшшнп розчин без aroHicTa). Час повно! за Mi ни розчину, вйкпряшш npi перемиканж розчишв вщ 140 мМ NaCl на 140 мМ КС1 становив 2 mi для вщкриго!' пшетки i 10 мс для конф1гураци "whole-cell".

А В '

G tuR-A (fli p)/D

300 цМ L-glutamate

attached cell

200 pA

GluR-A(flop)

attached — cell

300 L-glutamate

80 pA

Рис. ]. Л : схема екстрнменталыт процедура швидкого подавання агошста. Дм оптимально! замши розчину клипина чоашша бути вМрваною в!д дна камеры.

Б : приклади вЮпов/'дей на подачу глутамата ¡ситин, що лежать на дш камери, та л/с/я того, як [х е/д/рвалн. В першому випадку швидкий компонент струму не ресструсться.

Збирання / обробка даиих

Вольт амперш характеристики (ВЛХ) отримували вим1рюванням амшитудн струму при. дискретних значениях мембранного потенщалу, або при пилкопод1бнш змий потенщалу в дтапазош ±100 мВ протягом 2 . с. В останньому випадку результуючу ВАХ отримували вщшманням ВАХ, отримано! за вцхсугносгп агошста вщ ВАХ, зареестровано!" пщ час постшно! склачово! струму, активоеаного агошстом. Оцифрован! крив1 усерёднювали через 4 мВ 1 отримаш усерсднеш значения використовувалн для апроксимацп кривих полшомшальними функщями. Щ полщомшальш фуикци використовувалн для обрахунку, потенщагпв

)еверсц 1 хордових провщностей при завданих потенщалах. Активоваш 1Гон1стами струми оцифровували i збер)гали у комп'ютернш систем! УВЕ-Ь1И та анашзувалн теля експерименту, Перед оцифровкою (з частотою 10 кГц струми фшьтрували з частотою 1-2 кГц (-3 дБ). Переб1Г щесенсетизацц струму в час! апроксимували експоненшальною функцшю викорйстовуючи Симплекс метод. Для визначення потенщалозалежносп провщнос-п канал1в застосовували схщцепод!бну змшу потенщалу. Сходинка потенщалу тривалктю 50 мс подавалася вщ пщтримуваного потенщалу 0 мВ до завданого значения. Струми, вим1рян1 у вщповщь на сходинку потенш'алу за вщсутносп агошета, шдтмалися вщ вщповщей на сходинку потентату, зареестрованих пщ час стащонарно! складово? активованого агошетом струму. Струми протягом ¡мпульсу потенщалу апроксимувалися виразом

I = 10е-1тв,

де I - час, Т - стала часу, 10 - екстапольована амплитуда струму до початку ¡мпульсу потенщалу (митгеве значения струму), В - амплитуда струму'наприкшш ¡Мпульсу. 10 використовували для побудови миттевоТ ВАХ, В - для побудови сташонарноГ ВАХ. У даш'й серп експеримештв струми ф!льтрували з частотою 4 кГц. Наявшсть струму витоку та емшено! с кл адово? не дозволило провести точних вим!р1в струну в межах 1 мс вщ початку сходинки потенщалу.

РЕЗУЛЬТАТИ I ОБГОВОРЕННЯ

Класифкацш субодиниць глутаматних рецептор!в

До тепер1Шпього часу клоновано бшьш як 14 субодиниць юнотропних глутаматних рецептор1в (НоПтап е( а1., 1989, Ыашге, 342, 643; Кетапеп е! а1., 1990, Яаепсе, 249, 556; ВеШег е1 а1., 1990, Ыеигоп, 5, 583; ЕвеЬ]егв е( а1., 1991, ИаШге, 351, 745; ВеШег е1 а1., Л/емгол, 8, 257; \Verner е! а1., 1991, Яатге, 351, 742; НегЬ е1 а1., 1992, Меигоп, 8, 775; МогуояЫ е! а!., 1991, ШШге, 351, 31; Мопуег е! а1., 1992, Яаепсе, 256, 1217; !\^иго е! а!., 1992, ЫаШге, 357, 70). Зпдно з гомолопчшетю та

io

функшональними властивостями ix можна подшити на три родини : AM РА рецептори., кашатт рецептори та NMDA рецептори (Рис. 2). Родина АМРА рецептор|'в охоплюе 4 субодиниш, позначен} тут як GluR-А, -В, -С, D (за шшою номенклатурою GIuRl, 2, 3, 4). Рецептори nid роднни мають внсоку афжшсть до АМРА (мжромолярний д1апазон) та низьку - до каУнату (наномолярний д1амазон). Характерною особлив!стю канат ¡в, утворюваних з цих субодиниць, е швидко десенсетизуюча пишов1дь при aruiiKauii глутамату або АМРА та недссенсетизуюча ка'шатна вщповщь (Рис. 3). Анал)з молекулярних та функцюнальних властнвостеи субодиниць цього типу виявив, що кожна субодиниця мае дшянку з 38 амшокислот Mix передбачуваними трансмембранними сегментами ТМЗ i ТМ4, котра може мати два BapiaHTH амшокислотНоУ послщовносп', контрольованих альтернативннм "сплайсингом". Ш два BapiaHTH було названо "flip" i "flop" (1* )'

Основна функцтнальна вшмппн'сть м1ж цими двома вар|'антами полягае в тому, шо активовании глутаматом струм в першому винадку десенсетизуеться до якогось сталого pinmi, icvii як "Пор" субодиниш десенсетизуються до ртня нульового струму

До родини каУнатних рецепторш належать субодиниш GluR-5, -6, -7 та KAI i КА2. Bei вони характеризуються внеокою афшшетю до каУнату (мкМ) i низькою до АМРА (нМ). При цьому титьки субодиниш GluR-5 i GluR-6 здатш утворювати функщональш канали. Капали, утворен1 з цих субодиниць, характеризуються десентизуючою кашатною вщповщдю (4, 5, 10, Рис. 3). Важливо також вшзначити, Що каналн GluR-6 не шдпоЫлають на аашкацпо АМРА. Щодо решти члешв родини каУнатних рецепторж, то хоча вони й не утворюють капалш caMi по co6i, однак при коексиреси з субодиницями GluR-5 i GluR-6 вони моднфжують властивосп останшх (5, Рис. 3). Слщ зазначити, що КА1 та КА2 субодиниш утворюють гетеромерт канали тшьки з GluR-5 та GluR-6. Тому ми об'еднали обидва ui типи субодиниць в одну родину каУнатних рецепторов.

Иомсри у дужках вщпопиэкггь власним публкацшм, шведсним наприкЫш роботи.

и

NMDA family

GluR

AMPA family

KA family

NR1

NR2 -А; -В; -C, -D

GluR -А; -В; -C; -D (or -1; -2; -3; -4)

GluR -5; -6; -7 KA1; KA2

Piic. 2. Класиф1кащя ¿lytna.uamiuix рецспторш. BideomoK гомологиностl структури субодшшць ncepediaii кожпоi родшш стшюттъ 55 - IS %. Гомолог1чн1сть структуры полиж родинами сюгадас 20 - 45 %.

Родина NMDA рецепторш охоплюе субодиниш NR1 i NR2A, В, С, D, Пи час коекспресй' субодиниш NR1 i будь яко! з субодиниць NR2A, -В, -С або -D утворюютъся канали, що р!зняться за кшетикою активованого глутаматом струму (Рис. 4) та чутлишстю до блокувапня юнами Однак, основн! характер»! властнвасп NMDA рецептор! в,

тобто, повмьна кшетика . активованого глутаматом струму, висока nponiiKiiicTb для ioniB Са чутлимсть до глшину та

потеншалозалежшсть ManiieBoro блоку збер1'гаються для Bcix комбшацш субодиниць (7). С;ид зазпачлти, що серед ycix субодиниць NMDA типу тьтьки NR1 формувала roMoMipni канали i тшьки при експреси в ооцитах (Moriyoslii et al:, 1991, Nature, 354, 31). Субодиниш NR2 експресувагшся тмьки в сполученш з NR1 як в ооцитах, так i в ф^бробластах. Це вказуе на те, що нативш NMDA рецептори, Biporwuo, е каналами гетеромершм структурн i при цъому субодиниця NR1 е обов'язковим компонентом!

Ъ-Ьч2£

АМРА, КА гесерЮге Капа1е 1.-дМата1е ог АМРА

аиЯ-А.-В, -С,-0

» Г «¡Р ^ (Юр

01иН5 Г

[

ЭЮПб 1-д1и1ата!е

I I АМРА

аияе/КА-г АМРА

Рис. 3. Записи струм ¡я у в1дпов1дь на швидке подаванпя агон1ст1в р1зт1г глутаматних рецепторов АМРА та кататного типу. Лит над кожиим записом вказують на тривсикть аплгкаци агонгстов. Для АМРА рецепторов катат подавали протягом 2 с. Для мина субодиницъ та агошст1в час подавання становые 300 мс. Мембранный потенща-г - 60мВ.

Рис. 4. Записи струлив через р'тй камбшацН субодиниць МММ рецепторт. Час аппкацп агогиспид позначений горизонтальною лйиею над кожним записом струму / становив 300 мс для вер: субодиниць. Си'д эвернути увагу на допжину гopuзoнmaльнo¡ лшИ над субодиницями НЮ - Ш2Р.

При всШ р1зноматтносЛ1 субодиниць глутаматних рецептор1в I вимшносп '¡X властивостей, структурно вс! глутамлтш рецептори можна об'еднатн в одну суперродину. Злдно з сучасннми уявленнями, вы глутаматт рецептори мають 4 трансмембранш дшянки з N та С термшалами, оберненнми назошп. Капали глутаматних рецептор1в, Вфогшно, угворюються з 5 субодиниць (Рис. 5), при цьому трансмембранний сегмент ТМ2 е дпянкою формування юнно! пори. Св1дчення на корпеть цього твердженнл булуть наведеш дал1 в анал1з1 структури та функцп глутамагних рецептор1в.

í *

Structure of AMPA/KA-Glutamate receptors

GluR-channel

•xtrac«liu)«r

AMPA/KA' GluR-eubumts

l:

— GluR-A Glun-B ОШС GKiR-0

I'i'c 5. Схсматичпе уяа.1сння структура каиа.ш гц'тичатша рсцспторш i розтсииування в мсмбрши трансмембранинх диянпк oxppuni ryfinrhiianii (ип /iгпулцЛ; c)€ocl'i.4!!!ih АИРА-кшиатного типу). Киьк1сть траисмемйрашшх дЫяиок та '¡х вюсморозташуеання пграУ'ачастъся з анапзу irnlcKCa eidponamii.

OcuoBiii nJiacriiBocTi протжапня ioiuioro струму через рекомбшанпи глутаматж рецептор» ЛМРА типу

Вольт-амперш характеристики субодипицъ ЛМРА типу

Швндке гюлавапня 300 мкМ глутамату на клптши, трансфектоват сДНК, що кодус гомомерш GIuR-A, -В, -С, -D рецептори (у Bepcii "flip"), виклнкало струм, котрий складаеться з шковоУ компонент, яка швцдко спалае до деякого сталого pinnH. Вшношення тикового струму до стало! складово) варивало вщ 2,5 до 8 в зачежносп вщ субодиниЦ!. Вольт-амперна характеристика (ВАХ) для GluR-A катило мала складний характер, демонструючи при шд'смиих мембранних потенщалах аномальне випрямлення, а при потеншалах бшьших за +60 мВ -нормальне випрямлення. Ми назвали такнй тип ВАХ подвшним випрямленням (Рис. 6А). АналоНчш ВАХ були зареестрован1 для двох шшнх субодиниць GluR-C та -D (Таблиця 2). Однак, для GluR-B каналов ВАХ мала харо гер нормального'випрямлення в fliana3oni потеншал1в ± УО мВ (Рис. 6В). Для кожно'У субодиниш характер ВАХ для тково'У та сталоУ складовнх струму був однаковим. Ця обставина дозволила в

подальшому для визначення ВАХ використовувати пилкопод1бну стимуляшю.

А

В

Рис. 6. Змсжнктъ характеру ВАХ eid типу субодиницъ глутаматних peuenmopie. Дам з eKcncpuMenmie на клтинах трансфсктованих поодинокими субодиницями GIuR-A (A) i GluR-B. (В). ВАХ були отримам при швидкому подаванм 300 мкМ глутамату при pi3Hux значениях тдтримуваного мембранного потенциалу. В кожнш' секцИ записи струм ¡в подаш 3.1 l'en, a eiônoeidni ВАХ для ni ков их (•)! сталих (О) компоненте струму - справа. Суцшышш л'тЫми вказши палшомтальHt функци, що екстраполюють eidnoeidHi експсрименталып точки. В кожному еипадку аналог'мм дат ompuMani на 3-4 inuiux клтинах. *

Коекспреая G!uR-A i -D субоднниць призводила до формувания rcTepoMipuiix каналов GluR-A/D, яю демонстрували ВАХ з подв1йннм випрямлениям, аналопчну до ВАХ гомом]рних складових (Рис. 7А). Однак, гетеромфш канали, сформован! з субоднниць GluR-A i GluR-B (GluR-A/B) мали ВАХ, тшбну до GluR-B (Рис. 7В). Експериментн,

проведен! ¡з застосуванням пилкопод1бного подавання мембранного потенщалу показали, що при одночаснш експреси двох субодиниць результуюч! гетером1рн1 канали мають просту ВАХ з нормальнйм випрямленням тшьки в тому випадку, коли 01иЯ-В е частиною рецептора (Таблиця 2). В протилежному випадку мають м|'сце ВАХ з подвшннм випрямленням. Ц] дат передбачають, що ОиИ-В субодиниця визначае характер ВАХ гетером1рного ансамблю. Под1бнють форм ВАХ ИиЯ-В та 01иЯ-А/В вказуе також на те, що при коекспреси ОиЯ-А 1 (ЛиЯ-В субодиниць гомом1рш С1иЯ-А канали практично не утворюються, або !х формуеться надто мало.

Рис. 7. Записи cmpyMia i eidnoeidni ВАХ дм т'кових (•) i сталих (О) компоненти струму d.w комбтацп субодиниць GluR-A/D (A) i GluR-A/B (В). Експерименталъш умови таы ж як на Рис. 3.

Таблица 2. Характер випрямлшт ВАХ раних субодмшць глутаматних рецепторк АМРА типу. Даш отримаы й стацюиарпих ВАХ, що бу.ш вширяш при nMKonodißuiü змий мембранного потенщалу. BidnouieiiiM хордовых npoeidiiocmeii G+gQ/G.gQ в'фображае форму ВАХ. Bidiioiueiuui мешие за 1 вказуе па апомалше випрямлення при exidnoMy Hanpmi струму в dianmoiti потенц'мл^в -80 мВ та +80 мВ. Biduouiewm ■быъш1 за 1 вказують на нормальне випря\шння ВАХ при eiixidnoMy напрям1 струму. ВАХ з подвштш випрямленшш мали величину cnieeidnotuenw суттево меншу за 1. Vucioei значения тдношень е середнЫи ± SEM для KUbKocmi клтии, зазначеноI в дужках. ND - eidnouieium lie обчиановалося.

Субодйниця G+8Q/G-80 G+80/G-80

Глутамат Кшнат (300 мкМ)

(300 мкМ)

GluR-A 0,07 ± 0,045 (5) 0,206 ±0,125 (7)

GluR-B 2,65 ± 0,51 (5) 2,87 ± 1,04 (4)

GIuR-C : 0,219 ±0,138 (4) ND

GluR-D 0,125 ± 0,034 (5) 0,122 ± -,048 (5)

GluR-A/B. . 2,02 ± 0,27 (5) 1,9 ±0,14 (9)

GluR-Ä/C ,0,45(1) ND

GluR-A/D 0,108 ± 0,037 (4) 0,09; 0,1 (2)

GluR-B/C 1,5 ±0,46 (4) ND

'GluR-B/D 2,2 ±0,16 (9) 2,28 ± 0,46 (4)

На вщмшу вщ гомомфних канал!В, ВАХ гм ко во го та сталого компонентов для комбшацп С1иЯ-А/С р^знилися одни вщ другого. Щоб ЫЛЬИСНО ВИЗНаЧИТИ ЦЮ ВЦШШШСТЬ, МИ ОбЧИСЛИЛИ СПШВЩНОШеННЯ хордовнх провщностей, котр! були В1ш1ря/н при потеншалах +80 мВ та -80 мВ (G+go/G_g(]), що е /.¡'¡рою потеншалозалежносл активованого агошстом струму. У 5 кл¡тинах, що експресували 01иК-А/В канали, це сшввшношення становило 1,77 ± 0,26 (середне значения ± ЭЕМ.для шкових значень струму та 2,72 ± 0,4 для стало! складово! (Р <0,05, парили 1-тест). Така р1эшшя передбачае, шо в гетероьнрних СЫЯ-А/В каналах швидко десенсетнзуючий щковий струм визначаеться, в)рогщно, конформацшним станом каналу, що в1ар1зняеться вщ стану, котрий проводить постшну складову струму. Стутнь десенсетизаци, виклнкано! 300 мкМ глутамату при -60 мВ також суттево р1знився у гомом1рних Ст1иК-,\ 1 GluR.-B.Ta гетерокпрних вк^-Л/В каналах. В кожному випадку

4А ■

хш десенсетизаци Шкового струму в час! визначався одшею експонентою з1 сгалнми часу : 6,5 + 0,56 мс (п=9) для 01иЯ-А; 35, 9 ± 9,8 мс (п=3) для С1иГ(-В 1 16,9 ± 2,3 мс (и=6) для вШЛ-А/В канал1в. Той факт, що для С1и-А/В канашв десенсетизац1я була моноекспоненщалыюю з пром1жною сталою часу вказуе на те, що струм в цьому випадку не е простою сумою струмш через гомокпрш канали вЫЯ-А та 01иЯ-В ¡, отже, ш субодшшш пщ час коекспресп дшсно формують канал з гегером1рною структурою.

Структуры детермшанти характеру юнпого струму через рекомбтаптш АМРЛ рецепторы

Мм показали, що характеристики юнного струму через СЛиК-В канагш вщр1зняються вщ характеристик струму через капали, котр1 сформован! з субодиниць ИиЯ-А, -С або -О та що наявшсть С1иЯ-В визначае ВАХ гетсромфних канал1в. Анал1зуючи псрвинну структуру рецепторш, ми знайшли, що трансмембрана дшянка ТМ2, котра «¡ропдно (за аналопею з ацетилхолшовими рецепторами) може приймати участь у формуванш юнно! пори, шентична для кожно'Г з чотирьох субодиниць по всш довжнш, за виключенням одного М1сця. В позици 586 амшокислотно! послщовносп С1иК-П(Я586) мютить позитивно заряджену амшокислоту аргйин (Я), той як в субодиницях 01иЯ-А, -С або -О в гомолопчних позиц1ях знаходиться нейтральна амшокислота глутамш ((}) О1иЯ-А(0582), - С(С?590) та -0((}587) (Рис. 8А). Викориеговуючи техшку точково! мутацн, для субодиниць С1иЯ-В 1 С1иЯ-0 нам вдалося отримати субодинищ-мутанти, у котрих вщповщно аргшш було замшено на глутамш ОиЯ-В(Я586(3) 1 навпаки С1иЯ-0(<3587Я). Форма ВАХ для субодиннць-мутагтв вщ тако! замши зворотньо змшилася (Рис. 8 В 1 С). Тепер мутоваш канали С1иЯ-В(Я586(3) мали ВАХ з подвшним випрямленням, тод1 як мутоваш канали С1иК-0(С|587Я) мали ВАХ з нормальнйм випрямленням.

GluR

Рис. 8. Шдмншктъ по одиш амиюкислот! в тансмембранному сегментГТМ2 зт'нюе форму ВАХ.

(A) Угар{ показана diaepaMa nepawwot структуры субодиниць глутаматних рецепторов AM РА типу, на як}й видно взосморозташування трансмембранпих дЫяпок. Унизу розкрито посМдовшстъ амиюкислот у сегмент/ ТМ2, BhhtiiitticMb лаж субодиницями GluR-В та рештою - mLibKu в однш амонокислото (поена nocnidoehicmb амиюкислот для ecix субодиниць наведена в роботi Keinanen et al„ 1990, Science, 49,. 556)

(B) Вплив на форму волып-алтерно! характеристики мутацп субодиницi GluR-В (верхня В АХ) до субодин ицо-мутанта GluR-B(R586Q) (нижпя ВАХ). Кожна ВАХ о/пр/сиана при тикоподШ/нй змип мембранного потенциалу па поодинокш кл'тгит.

(C) Даni cKcncpicueiimy anaiminiiwo до поданого в (В) з немутованою субодиницею GluR-D (верхня ВАХ) i мутантом GluR-D{ Q5S7R) (нижня ВАХ).. В кожному з експсримент1в в пкосто аг'ош'ста заспюсовувавсн глутамат (300 мкМ). Ц1 та аналог'тш Крит буяи auKopUcntaHi для пбчислснпя (ндношень хордових npoeidnocmeu, наведених в таблицях 2 та 3.

Оскшьки ВАХ стало! складово1 струму через rerepoMiprti глутаматш рецелТори аналогии ri до ВАХ для GluR-B канал1в, ми виршлши з^ясувати, чи обумовлене таке "домшування" самою субодтшцею (тобго

WS

падлишком субодинищ 01иИ-В в гетеромерному ансамблО, чи наявшсть аргнину ТМ2 доминантно визначае властивосп" гетеромерного каналу. Для цього ми дослщшш ВАХ гетеромерних комбшащй, в котрих одна або обвдв! складов! субодиниш булн мутантами (Рис. 9, 'Габлиця .3).

Рис. 9. Аргшшв трансмсмбраннШдизцщ ТМ2домшусуповедмц!гетеромернихкакал1в.

(A) Накладен! ВАХотрииаш' за допомогою такоподШно!змЫи мембранного потенщалу на двох рпних клтинах, нот експерсують а/иВ-В/О або 01иК-И(В5К6())/и (С!иК-В*/0) канаш.

(B) ВАХ. отримана на К1йпнин1, що експерсус гстсрплйрну комбтащю мутантЬ С1иЯ-Я;Я5Л'ЛЦ>/Г> (С,1иП-ВУД) / С1иН-В(й587®Д> (С1иК-В'/П'} Ця кс.чбщацЫ також мктить арг^нщ, привнесений мутантом 0!иК-В(Н5К7())

Результат» цих експеримечп'в показують, що reTepoMipni канапи мають ВАХ з нормальнНм випрямленням якщо в ансам&м е присутньою субодиниця, котра кистить aprmiii, незалежно вщ того, чи це буде GIuR-В, чи мутант GluR-D. Найнаочшше це показано у випадку, коли гетером1рн1 капали утвореш обома мутантами. Так, капали GluR-B(R5S6Q)/D(Q5S7R) мали ВАХ з яскраво вираженим нормальним випрямленням (Рис. 9В). Ця ВАХ практично не вшрЬняеться вщ ВАХ для вшповщно') комбшаии немутованих субодиниць (Рис. 9А). Але комбшацп субодиниць без арпншу в сегменте ТМ2 (наприклад, GluR-B(R586Q)/D (Рис. 9А) завжди мали ВАХ з подвшним випрямленням.

Таблиця 3. Характер випрямяення стацюнарних ВАХ для мутованих субодиниць глутамштшх рецепторы АМРА типу та комб'шацш, що листять по метит Mtpi одну мутоваиу субодштцю. Докладнше див. nidnuc до Таблиц! 2

Субодинищ GluR-B(R586Q) GluR-D(Q587R) GluR-B/D(Q587R) GluR.B(RS86Q)/D

GluRr B(R586)/D(Q587R) . GluR-A/B(R586Q) Glu-A/D)Q587R) GIuR-B/B(R586Q) GluR-D/D(Q587R) '

G+80/G-80 Глутамат (ЗООмкМ) 0,106 ± 0,042 (6) 1,52 ±0,1 (3) 1,65 ± 0,28 (3) 0,058; 0,83 (2) 1,44 ±0,15 (5)

0,27 ±0,1 (3) 1,08 ± 0,08 (3) 2,32 ± 0,28 (3) 1,14 ±0,08 (4)

G+80/G-80 Ka'iimr (300 мкМ) 0,055 ± 0,031 (4) 1,63 ±0,13 (5) 1,56 ±0,18(3) 0,023; 0,31 (2) 1,61 ±0,2 (5)

0,12 ±0,06 (4) 1,59 ± 0,15 (3) 2,35 ±0,14 (3) 1,86 ± 0,05 (4)

Шдлинностг характеру ВАХ у субодиниць С!иЯ-В та аиЯ-О визтчаються потенщалозалежшстю пров'гдпоспй капалгв

Форма ВАХ, вим1'ряно1 на окремш клчши, внзначаеться потеншалозапежшстю кшетики вщкривання та закривання каналу. Для з'ясування причини вщмшностей ВАХ для рпних субодиниць, ми провели експерименти, ¡з стрибкопод1бною змшою мембранного потеншалу. В цьому випадку потенщалозалежшсть провщносгп каналу повинна визначатися мнтгевою ВДХ, для котро! амплпуда струму втпрюеться одразу ж теля стрибка потеншалу, а потеншалозалежшсть

S* ■ .

кжетикн вщкривання та закрнвання каналу визначаеться релаксащею струму до нового сташонарного р>вня та стацюнарно1 ВАХ. Гомомйрш GInR-B капали демонстрували незначну релаксажю струму i мали мнтгеву ВЛХ з несугтево меншою кривизною поршняно i3 стацюнарною ВАХ (Рис. ЮА). Таким чином, капали, утвореж субодиницею GluR-B мають лмннну ВАХ, або з невеличкнм винрямленням у напрямку виходу счруму. Це пказуе на тс, що ïx провшж'сть практично не залежнть вщ потепщалу. Струм и через гомомфж капали GluR-D також мали тьтькн незначну релаксажю (Рис. 10В), a ïx миттева ВАХ мала подвшне виирямлення. Це пказуе на те, шо провщжсть таких каналш е потенщалозалежною i, Вфогщно, визначас вид стацюнарно! ВАХ. По/нбну миттеву ВАХ мали GluR-A капали. GIuR-B/D капали демонстрували 61'льшу релаксашю струму i ïx миттева ВАХ була практично линпною (Рис. ЮС). Hi дат передбачають, що вщмшшсть форми сташонарнпх ВАХ roMOMipuiix GluR-B канал ¡в та гомомфних GluR-A i -D, a також GluR-C каналш обумовлена, головнпм чином, вдайшйстю потеншалозалежносп ïx провщностей. Домжувания субодинищ GluR-B в гетером1рних каналах може бути пов'язане з и домжуванням у внзначешн потенжалозалежносп провщностг каналу. Однак, через те, що ВАХ для поодннокнх канаЛ1В не була побудована внаслшок мало! провщност) поодннокнх канал1в 1пС), не виключена' можшшсть швидко1 релаксацн К 1 мс), котру не можна пимфлти в наших умовах.

Наведен! дат ноказують, що ¡оннин транспорт через рекомбшантт глутаматш рецептори АМРА типу критично залежнть вщ амжокнслотно'1 послшовносп трансмембранного сегменту ТМ2. ApriiiiH, розмщений всередиж цього сегменту ближче до позаклпинного кшця, визначае форму ВАХ з нормальним випрямленням як для гомом1рних, так i для reTepoMipmix канашв. Випрямлення пров1дност1 в жкотинових ацетнлхолшових рецепторах заложить вщ pi3HHx амшокислотних залишюв у М2 трансмембранному сегмат ïxnix субодиниць (Imoto et al., 1988, Nature, 335, 6191; Villaroel et al., 1991, Proc. R. Soc. London, Ser. B, 243, 69). Тому якщо витыши заряд кщьця з аминокислот на зовшшнш cToponi М2 зробити позитивжшим, тод1 вщ'емна дшянка ВАХ для поодиноких канал¡в стае менш crpiMKoro. Отримаж нами результат можпа ¡нтерпр-тувати аналопчним чином. Змша заряду сегмента ТМ2 на позитивжший шляхом замши окремих амшокнслот (глутамша на aprinin) призводить до появн менш CTpiMKoï ВАХ при вщ'емних потеншалах. Таким чином, nauii даж пщтверджують точку зору про те,

10 ms

/(pA) 1200

JZOÛpA1 10ms

V{mV)

•1200

Jl50pA

10ms

Pue. 10. Ilomенцia.iозалежнктн npoeidnocmi каиал(в визначае eidMinnocmi у форлй стацшнарних ВАХ Mi ж GluR-B i GiuR-D капсиа ми. Вольт-ампер/и крив/ були побудовам /з застосуванням 'cmpuoKonodiônoï xuitiu мембранного потепщему (А) д.гя GluR-B, (В) àiя GluR-D i для GkuR-B/D канале, hua nodani записи струмie у eidnoeidb на стрибки nomeni(ia.iy (схематично зобрй veeni вище запиав струму) eid О до ±80, ±60, ±40 i ±20мВ. Резу\ьтуюч\ MUfntncei (•) та стащонарш (О) DAX nodani справа. Сущльними линями зображеч1 Kpuei помнолачалишх функцш, щи скстраполюють скспсри.непталъп1 точки. Для GltiR-B i Glu R-B/D капал] в стаццшнарш ВАХ мають яскраа'ние вира жене випрям.1?ння у на прядку струму naioeni, ni »с ми nunc ei В АX. Ступшь випрям.1еиня (G ^ля GluR-

В ь даному випадку складао !,S5 для стацюиарного. струму / 1,55 для миттсвого струму. Для GhiR-B/D ni значения eid non'¡дно cfùiadaiu 1,72 i 1,2. Для GluR-D цс ы'к)ношсиня було практично однаковим для оСюх випадыв i становило 0,08. АналогЫн1 результата були ompuuani на 2-3 шших кл'тиишх для к о ж/¡о! комб1иацИ с)-бодиниць

що сегмент ТМ2 глутаматних рецепторш АМРА типу пронизуе мембрану i формуе частику пори юнного каналу. Бщыгисть нативних АМРА peueinopÎB мають лшшну ВАХ або ВАХ з нормальным випрямлснням (Mayer and Westbrook, 1987, Progr. Neurobiol., 28, 197). Hauii даш ■передбачають, що в цих рецепторах повинна м1ститися субодиниця GluR-B. Однак, не виключено, що може бути знайдена шша субодиниця, що мае под1бж властнвосп. 3 ¡ншого боку, в субпопуляцм культивованих неирошв Нпокампу активованих ка'шатом струм мав яскраве аномальне внпрямлення (lino et al., 1990, J. Physiol. (London), 424, 151). Ui глутаматт рецептори, BÍporúmo, не мають GluR-B. Властивост1 рекомб1'нантних гетером1рних глутаматних рецепторчв (що м1стять GluR-В) подоги до властивостей нативних глутаматних рецепторш не-NMDA типу, наприклад в нейронах Нпокампу. У ш'рамщних нейронах ппокампу щура в дшянщ САЗ ВАХ для niKOBiix значень струму мае меншу кривизну, Н1Ж ВАХ CTanoi складово'1, а Х1Д у 4aci десенсетизацн швидкого струму пнапопчний до такого для гетеромфних G!uR-F/B канал m (12). Збуждений иостсинаптичннй струм (ЗПСС) в пграмщних нейронах дшянок CAI та САЗ також демонструе линйну ВАХ (Sali et al., 1990, J. Physiol. (London), 430, 605). Здаеться шлком niporúimiM, що потеншалозалежш властивосте ЗПСС, ям пропускають не-NMDA рецептори, визначаються субодиницею GluR-B.

Проникшсть АМРА рецепторш для двовалентних катшшв визначаеться редагованою формою субодинищ

Редаговаш та нередаговаш eapiaiimu субодиницг GluR-B

В lerepoMipmix ансамблях ¡з субодиниць АМРА рецептор1В GluR-B субоднниця визначае властивосп проходження моновалентних íohíb завдяки наивное^ apriiiiiiy у визначеному mícuí трансмембранного сегменту ТМ2. Як виявилося, apriuin в uiii позици не кодуеться GluR-B геном, а вводиться шляхом редагування мРНК для GluR-B i замшюе кодований геном глутамш (Sommer et al., 1991, Cell, 67, 11). Анащз сДНК, сконст, уйовано! за допомогою полгмеразно!' ланцюговоУ реакци (ПЛР) по РНК з ембрюнального мозку показав, що це редагування регулюеться bíkobhmh змшами. На painiix стищях розвитку (Е 14 та П 0) невеликий вщеоток GluR-B мРНК не зазнае редагування (Рис. ПА) i,

отже, в ембрюналыюму мозку експресоваш GluR-A, -С та -D субодшшш i вони сшв1снують разом ¡з редагованою формою.

Проникнкть гомолирних АМРА рецепторов для двовалентних iouiä

. Пронцкшсть гомомфких Kananie, утворених ¡з редаговано! та нередаговано? субодиниць GluR-B прошюстрована на Рис. ИВ, Е. На Рис. 11В та 11D подано записи струм^в, активованих глутаматом при мембранному потепииии -60 мВ у "натр1евому" та "калыневому" зовжшшх розчинах. На клтшах, що експресують редаговану GIuR-B(R) субодиницю вхщний струм ресструетьси в "натршвому" розчиш i практично не рееструеться в "кальцквому" (Рис. 11В). В той же час, на клггицах, що експресують нередаговану GluR-B(Q) субодиницю вхщний струм можна зарееструвати як в "натр1евому", так i в "калыневому" розчинах (Рис. 11D). Вщповщно клпзши, що експресують обидва тнпи GluR-B канашв маюгь суттево вшм¡нну проннкшсть для двовалентних KaTioHiB nopiBHHHo до моновалентних капошв. Це видно по pi3Hiiui у зрушеннях потенша/пв реверси струму шелл змнш зовншшього "HarpieBoro" розчнну на ."кальшевин" або "мапиевий". Наприклад, в (йитинах, що експресують GluR-B(R) -субодиницю, потенщ'ал реверей' зрущувався вщ -1,24 ± 1,8 мВ до -50,8 ± 1,9 мВ (п=3) в "калыневому" розчйж i навить до вщ'емшших значень у "магжевому" розчнш (Рис. НС; Таблиця 4), вказуючи на те, що цей гомом1рний канал Mie низьку проннкшеть для двовалентних катюшв гюр1вняно до двовалентних (PCa/PCs : 0,05; PMg/Pcs : 0,018; 0, 025). Навпаки, в клтшах, що експресують roMOMipiiiifi GluR-B(Q) канал i мають ВАХ з подвшннм випрямленням в "натр1евому" розчнш, потенщал реверси зрушувався вщ -9,3 ± 5 мВ (п=7) до +10,3 ± 2,9 мВ (п=б) при замни зовжшнього "натр1евого" розчину на "калыцевий" (Рис. НЕ). Це вказуе на те, що гомомфж капали, утвореш иередагованою субодшшцею GluR-B(Q) характеризуються вищою проникжетю для двовалентних капошв пор!Вняно 1 iipoiinKiiicTio для моновалентних (Pca/^Cs : '>2; PMg/PCs ■' 0,8) (Таблиця 4). По/ибне епшшдношення проникностей спостерпапося в клтшах, що експресувалн roMoviipiii GluR-A i GluR-D капали (Таблиця 4). При цьому введения арпжну зам1сть глутамшу в познцц Q/R сегменту ТМ2 у GluR-D(Q587R) Kanaui повж'стю змшюваю таку поведшку, прпзводячи до зниження проникност1 для двовалентних кат!он]в у муюванш субодшшж (Таблиня 4). Вщповщшсть форми ВАХ, BHMipiiHux у "кальшевому" та "магшевому" розчинах для субодиниць

GIuR-B(Q), GluR-A, GluR-D з одного боку та GIuR-B(R) i GluR-D(Q587R) - 3 другого, п1дтверджуе той факт, що r0M0M¡pni капали, yinopeiii ¡з субодншшь АМРА рсцепторш, i kotpí не мають аргнпну у ГМ2 сегменп, мають високу проникшсть для двовалентних катюжв. laKiiM чином, у глутаматних рецепторах АМРА типу амшокислотний залишок (api iiiíh або глутамш) в поли nil Q/R трансмембранно'1 дшянки ТМ2 е основною детермшантою проникност! для двовалентних катюшв. Пап» дат доповнюють результат!! попередшх po6ÍT, у котрих продсмонстровапо, то в ооцитах струм пропускаемся

гомомфними GluR-A каналами i не проходить через reTepoMipni канали, Koipi мютять субодиннцю GluR-B(R) (Hollmaiin et al., 1991; Science 252, 851; Hume el al., 1991, Science, 253, 1028). Однак, roMOMipni GluR-B капали не були охарактеризован^ окрш того, в ооцитах точне визначешш npoHiiKiiocTi утрулнепе впливом нативного хлорного струму, що активуечься ¡онамп KOTpi проходять через глутамаий рецептори.

Таблицу 4. Потентат реверси активованого гяутаматом (300 мкМ) струму у кальцквому " (110 мМ Са2+) та MaenieeoMV (110 мМ Mg2+) meiiiiufiLx розницах. У nineniHi знаходився внутрЬслШинний розниц (140 тМ Cs+). Не.шчини е середнши значениями ± SME дм кЫъкоспи клтип, зазначено!у дужках. ND - величина не вимфювалася

Потенции! peuepciT Потенции! реверси

(мВ) (мВ)

Субодиииця Ca2+/Cs+ Mg2+/Cs+

GluR-B(R) -50,8± 1,9 (3) ■ -74; -67 (2)

GluR-B(Q) 10,3 ±2,9 (6) 1,9; 5,8.(2)

GluR-A 13,0 ± 5,0 (9) 2,1; 6,4 (2)

GluR-D 12,7 ±2,3 (8) 4,9 ± 0,7 (3)

GluR-D(Q587R) -48,4 (1) -44(1)

GluR-B(R586N) 21,6 ± 1,5 (3) -8,6 ± 3,6 (3)

GluR-D(Q587N) 17,0 ± 2,5 (7) -17,3 ±5,6 (5)

GluR-B(R)/D -50,7 ± 2,6 (8) -51,5 ± 9,8 (4)

GluR- -56,6; -48,9 (2) -55; -48,9 (2)

B(Q)/D(Q587R)

GluR-B(R)/B(Q) -53,4 ± 3,4 (7) ND

I II III

-CZKZJ-O

IV

-О с

edited ...FGIFNSLWFSLGAFMriQG...

unedited ...FGIFNSLWFSLGAFMQQG...

GluR-B

eatly late +

(~ 99%) (>99.99%)

+ +

1%) (< 0.01%)

I'uc. 11. Poiiujiuyudimn no'Jinii Q/R у fM2 ¡.c^ucumi ma euhuniucmt, у tipoeiduocmi i щюпикп:». пи для diuuiu :спг>:пих Kaminaij го\юшрних каншм, утиорашх з редаговапоi GluR-B(R) i нгрсдаговант G!uR-li(Ql суподиниць.

(A) TS'2 i-ei-Mc/im pfdcL'oeuHOi i ncfc'ihsiwci>iot форм субодиницi GiuR-B. Справа псчЪно ссреднш в^Х'оток pt(\l?i>6\!nui i nrpe(h^ti>anoi форм субодиницi GluR-B, виишчений за

7-6 е/2S

допомогою ПЛР анализу мРНК з мозку щура / миш1 д.1Я раннш (Е14 » ПО) та пйньог (118) стадш розвитку.

(B) Записи струме у в/гЗловиЗь па швидке подавання 300 мкМ глутамату у "натриевому" > "ка.1ьцквому" розницах на ¿¿¡тинах, що експресують гомолйрш с1иЯ-В(Я) Канат. Мембранный потенциал -60 мВ.

(C) Проникшеть С1иИ-В(Ю • канаив д.ы двовалентннх катюше нор ¡ваяно з моповалентними. В АХ для ст&ю! сюшдово/ активованих глутаматом (300 мкМ) струм ¡в в "натрквому", "кагьцкваомуп / "магнквому" зовшшни розницах, отримаш за допомогою таконодмноI змти мембранного потешуалу.

На «ставца покашна дияпка ВАХ.у збиьшеному маштаб1. Суциъннми липами эображеш ,полиюмшалън1 функци, що екстранолюють експериментальш крив!. Стрики вказують на штерпольоваш потешуали реверсп для в(дпоа!дних юн ¡а (-67,1 мВ для / 52,6 мВ для

Са2+).

(й) Записи струм'т у иыдпов/дь на швидке пода ванн я 300 мкМ глутамату у "натрквому" I "кальцквому" розницах на кл\тинах, що експресують гомом\рн\ С}иК~В((2) кансии. Ыембранпий потенц\ал -60мВ.

(Е) ВАХ для стала/ складош активотких глутаматом (300 мкМ) cmpyмiв у "натрквому", "ка-гьцквому" / "магпквому" зовш'шн/х розницах для G¡uR-B(Q) канапе, отримаш за допомогою пилкопод\бно! змти мембранного потенщалу. На вставц/ показано д1гянку В,\Х у збиьшеному маштаб'\ Стрики вказують на штерпольоваш нотешиали реверси д.гя в1дпов1дних юп1в (5,8мВ О.гя 2+ / 8,8мВ д. гя Са2+)

Заряд / розлир аминокислотного залишку у позици О/Я сегменту ТМ2 визпачае проникшеть АМРА рецепторов для двовалсипашх капйшив

Для подаЛьшого з'ясування природи катшнно! проникносп гомом1рних глутамагтх рецептор1в ми дослажували властивост! мутованих субодиниць С1иЯ-В або -О, котр| мали в <3/Я позици ТМ2 амшокислоти Л1зин (К), аспарапн (Ы) або глутамшову кислоту (Е). Позитивно заряджений лшш призводив до низько! ироникносп каналу для двовалентних ¡ошв, под1бно1 до ироникност! С1иК-В(К) каналш. Присугшсть нейтрального аспарагшу, котрнй мае на одну СН2 трупу менше, Н1Ж глутамш, в О/Я позици призводила до того, що обидва мутанти С11Ж-В^586М) 1 С1иК-0((2587ГЧ) мали високу кальщеву проникшеть (РСа/РСв : 2,49 1 1,84 вщповишо) (Рнс. 12Л 1 12В). Щ значения трошки бшыш за вщношення для иемутованих 01иК-А 1 йШЯ-П та нередагованих С1иК-В((}) каналов (Таблиця 4). В той же час, проникшеть для ¡ошв була суггево меншою (Рис. 12; Таблиця 4).

Таким чином, аспарапн в позици О/Я виробляе канал, котрий пропускае переважно ¡они кальшю, а не мапмю. Вщношення Рса/^Ся становило .6,4 для GluR-B(R586N) 1 7,7 длЯ ИиЯ- D(Q587N).

Рис. 12. (А) ПАХ для гомоларних GluR-B (R5S6N) канапе у "натриевому", "кагьцквому" i "магниевому" зовн1шних розчинах. Цкля замши аргшшу на аспарагт у субодинищ GluR-B канш иас ВАХз шгрчалышп випрямленням у "натриевому" розчин!, високу ка.1ьц!сву проникнистъ I мёньшу проникниам, для ¡ош'и магшю. Стриками вка иип потентат pceepcii для двова1снтних Ьнш (-5,1 мВ для ifg" i 22,6мЬ для Са1').

'В) BAXiЬя гомомерних GluR-D(Q5i'7.\) кана-tie у "натриевому", "калъцквому" i "магшевому" ювншних розчинах. Строками вказаш пптенцкпиреаерсПдля двовалентних ionie (-13,3 мВ для Mg" i 21,2 мВ для Са"). Зверщтьух агу на практично однакову форму ВАХАгя обохмутоааних <ана.ш.

Введения глутамшовоУ кислоти у Q/R позишю у GluR-B та 31uR-D пригтчувало експрес1Ю функшональнлх каналов.

Таким чипом, ui експерименти показують, що прошшпсть для двовдленгних ioniß по вщношенню до моповалентних у roMOMipnnx AMl'A рецепторах визначасться як зарядом, так i розм1ром ампюкислотного залпшку в Q/R позшш трансмембранного сегменту ГШ. Позитивний заряд арпншу робить канал практично непроннкнпм Для дповалентних ioniß. Той факт, що теля замши ппутамшу на aciiupaiiii ВАХ мае нормальне випрямлення, a nponiiKiiicTb для Са2+ при иьому залишаеться високою, вказуе на те, що BJiacTiiBOOTi випрямлення ВАХ i проиикжеть дтя двовалентних ioHie обумовлеш разними мехашзмами взаемодп ioniß з каналами, Kpi3b ям вопи проходять. OKpiM Юто, обидва ui механпми залежать вш етруктури ТМ2.

Проииктстъ для двовалентних ionie гетеролйрпих глутаматних рецепторов АМРА типу

У багаьох шляпках мочку зпаидеш у ргишх вщпосних юлькостях фанскриПЦИ мРНК для pisHMX субодшшць, в тому числ1 GlllR-B (Keiiiaiieii et al., 1990, Science, 249, 556; Моиуег et al., 1991, Neuron, 6, 799). Виникае питания, чи e капали иативпих нейришв гомогенною популяшею reiepoMipmix канал1в, наприклад, каналами типу GluR-1?(R)/D, чи вони jTBopeni суперпозишею декшькох TiiniB глутаматних pciicniopiB. II¡л час коекнреси сДНК, Що кодують GKiR-B(R) i GluR-D субодиниш, при наявносп biicokoi коицентрацп рекомбшантпих векторш (I мк Г на чарунку культурального посуду) утворюються reTepoMipni капали з новими властивостями. Олтею з таких властивостей е переб\г у waci десенсегизацп акгивоваиого глутаматом струму. Для гетером!рного каналу nepeöir у 4aci спаду niKOBoro струму визначався одшею експонентою 3i сталою часу 14,9 ± 0,7 мс (п=17). Це значения суттево вшрЬнялося вщ значень сталих часу як для GluR-B(R) (32 ± 5,6 мс (п=5), так i для GluR-ü (8 ± 0,7 мс (н=7). На вщмшу вш десенсетизаци струму через rcTepOMipHi GluR-B(R)/D канали, котра вщображас наявшеть нових властивостей, характерних для цього типу каналов, провщшеть i проникнють цих канал1в для двовалентних ionie були практично щентичними до таких для GluR-B(R) канал(в. У клтшах, що експресують reTepoMipni GluR-B(R)/D канали, у "натр1евому" розчиш глутамат актичував як вх1дний, так i вихщжш струми, тод1 як у "кадмиевому" розчнн! активувався тшьки вихщний струм (Рис. 13А).

Рис. 13. Записи ттегралышх струмie у в¡дповгдь па швидку 300 мкМ

глутамату у клгтинах, котрансфектованих векторами субодиниць GluR-B(R) i GluR-D при потетуалах -50 i +50 мВ. Bxiduuu i euxidnuü с тру ми зареестропаш у "натриевому" розчиш. В "калъцквому" розчиш exidnuù струм практично не ресструстъсн. Cm ai i часу десенсетизаци струму в "натрквому" розчиш 13,8 мс (-50 мВ) i 14,3 мс (+50 мВ), в "качьцквому розчин! - 12,3 мс (+50 м В).

(Л) В АХ для комбтацп субодиниць GluR-(D)R/D в "натриевому, "калъцквому" / "магнквому" розчинах. Bidnoeidni потенциалы реверси 1,5 м В, -53,7 м В (позначений стрикою) i -49,8 м В (позначений стрикою).

(С) В.АХ для комбтацп субодиниць GluR-(Q)D(Q587R) в "иатрквому", "кальцквому" : "магнквому" розчинах. Bidnoeidui потенц'юли peeepeiî -0,4 мВ, -58,6 мВ (позначений стрикою) i 55 мВ (позначений стрикою).

Шсля зам i ни "HaTpieBoro" розчину на "кальцгсвий" потеншат реверси струму в клггинах, шо експресують ш капали, зрушувався вщ -1,9 ± 1,9 мВ (п=8) до -50,7 ± 2,6 мВ (n=8) i до -51,5 ± 9,8 мВ (n-4) у "магшевому" розчиш (Рис. 13В; Таблица 4). Таким чином, низька провщшеть i npoHiiKHicTb для двовалентних íohíb гетером)рних GluR-B(R)/D канатов визначасться субодиницею GluR-B(R). Проникшсть для двовалентних íohíb гетерокпрнмх GluR-B(R)/D канал1в може бути низькою тому, шо мРНК ефектившше трансткрибуеться для G!uR-B(R) субодиниш, або тому, що в гетером1рннй канал шкорпоруетъея перевалено ця субодиниця. Щоб з'ясувати, котра з цих причин е визначальною, ми доел {лил и проникнють для двовалентних катюжв в клтшах, шо експресують нередаговану GluR-B(Q) субодиницю i

мутовану субодиницю GluR-D(Q587R). На Рис. IOC показано, що проникнуть для двовалентннх ¡онш в цьому випадку така ж ниэька, як i для гомомфних GluR-B(R) канашв (Таблиия 4). Цеи результат передбачае, що низька проникшего гетером1рних каналш GluR-B(R)/D для двовалентннх юш'в обумовлена не бшьшою кщьюстю субодиниць GluR-B в гетсром1рному ансамбль а ¡мошржше, . вщображае функцюнальне домшування субодшшш, що м1стить аргшш в сегммт ТМ2. •

Таким чином, при ' високш концентращУ BeKTopia для двох субодиниць утворюються гетерохнрш капали з властивостями, що вщр1зняються вщ властивостей гомонирних кашинв, утворенйх 13 складових субодиниць.

Сумкна експреая гомолйрних GluR-D г гетертйрних GluR-B(R)/D tcaiHuie в odniü клтши

У клтшах, трансфектованих ¡з застосуванням меншо'{ концентрацп вектора для субодиниць GluR-B(R) i GluR-D ( 500 нГ або 100 нГ на чарунку), спостерцалася проМ1Жна проникшсть для двовалентних ionie. Серед 35 теетованих клггин приблизно половина демонструвала низьку проникнуть для ionie кальшю (потеншал реверсп в "кальщевому" розчиш -49,9 ± 1,4 мВ (и=19). Однак, в 16 клтшах потеншал реверси коливався в межах вщ -37 мВ до +8 мВ, ¡з середшм значениям -20,4 ± 2,9 мВ (п=16), вказуючн на промену М1Ж гомом1рними субодиницями GluR-B(R) i GluR-D проникшсть для двовалентних ioniB. Наявшсть юи'тин з пром1жною проникнгстю можна пояснити eKcnpeciero rerepoMipnoro канлу нового типу. 3 iuroro боку, це може бути пов'язане з pianiiM ступенем експресп проникних гомом1рних GuR-D канашв i непроникних GluR-B(R) i GluR-B(R)/D канал1в. Для з'ясування внеску GluR-D канал1в у проникшсть для двовалентних ioniB, ми BiiMipiinn nepeöir' у 4aci десенсетизаца активованого глутаматом струму в "кальшевому" розчин! при потеншал! -50 мВ. Рнсунки 14А i 14В илострують експеримент на клппш, що мае пром1жну кальшеву проникшсть (Рис. 14А). Активований глутаматом струм, котрий переноситься ¡онами Са2+, десентизував 3i сталою часу 8± 0,6 мс (п-3) (Рис. I4B). Ця величина практично не шдр1зняеться вщ тако! для клггин, що експресують reMOMipni GluR-D капали (7,4 ± 1,4 мс [п=3|). 3 ¡ншого боку, ви.хщш струми при мембранному потеншаги +50 мВ десенситпзували 3i сталою часу 12 ± 1 мс (п=3), що не вщр1зняеться вщ стало!' часу для reTepoMipniix GluR-B(R)/D каналу за аналопчних

експериментальних умов (12,5 ± 1,2 мс, п=6). Таким чином, нанвфогщшшим пояснениям пром1жно! проникносп у юитинах, трансфектованих двома векторами, може бути факт експресн як Г0М0М1рних 01иЯ-0, так 1 гетером1рних канашв, Причому

гомомфш ОчЯ-О капали вщповщають за пом!Тну проникнуть для двовалентних ¡опт.

Коекспресш редаговапоТ г нередаговако/ форм субодинищ аиЛ-В в одшй КА1Ши111

Для з'ясуваннн базису функционального домшування редаговано! 01иК-П суболшшш за умови прпблнзно однаково! к1пькост1 двох субодшпшь, одна з котрих метить арпнш в ТМ2 сетменп, а в другш гин в!асутнш, ми визначнли прониктсть для двовалентних ¡ошв у клтшах, трансфектованих векторами для СЛиЯ-ВШ) 1 С1иК-В(<3) суобдшшць при однаковш концентрацп вектор!В (1 мкГ або 100 нГ на чарунку). У ве1х тестоваппх клтшах (п=7) калынева проникш'сть була низькою (РСа/РСБ : 0.04) 1 несутгево вшр1знялася вга проникпосп для гомом1рних 01иЯ-В(Я) канал!В (РСа/^Ся :0,05) (Рис. 14С; Габлпця 4). Це передбачае, що кшьюсть гомолирних реиептор1в, лроникнпх для двовалентних ¡ошв, дуже мала, Клтши демонстрували помину кальщеву проникшсть тшьки тод|, коли концентращю ОЬ^-В^) вектора було зменшено у 10 раз1В пор(вняно з С1иК-В(<3) (100 нГ 1 1 мкГ на чарунку вщповшно). Однак, нав1ть при такому, суттево знижепому рп:тС1иК-13(11), тшьки половина клтш (4 з 8 тестованих) мали промшну кальшеву пронпкшсть. Потеншал реверси в "калыневому" розчшн вармвав вш -31 до +6,1 мВ (ссредНЕ значения потеншалу реверси становило -5,2 + 10,1 мВ (п=4), РСа/^Ся : 0,47). На Рис. 140 показаш ВАХ для клтш з пром|жно. кальшевою прониктетю. ВАХ в "натрквому" розчшм по форм! нагадуе таку для клтш, шо експресують гомо-.нрш 01иК-И(Я) капали, тод1 як кальшева проникшсть е промгжною.

В

-50 mV

100 pA

-12G0

50 ms

QluR-B(R)/B(Q) 1:1

I (pA) 600

D

GluR-B(R)/B(Q) 1:10

I (pA) 160

J

100 -100

V(mV) Ca

-600

1,00

V(mV)

-180

Plie. 14. Прилйжна Колычева проникнкть tciimua, трансфектованих векторами д.ш дйох субодшшць, одна з котрих мктить аргш 'м у ТМ2 сегме/tmi.

(A) ВАХ д.ы ictiniuH, трансфектованих векторами, що песуть сДНК для GluR-B(R) i GluR-D субодшшць, y "натровому" i \альцквому" зовшшнЫ розницах. Т1отенц1ал peeepeiï eidnoeiduo -2,2 мВ та -13,9 м В (в казаны и стрыкою).

(B) Записи активованих глута.\штом струлив у miù самш клипиш, що i на (А), а "ка.гъцкбому" powimi при потенщала -50 i +50 мВ. Стая1 часу десснсетизацИ струму 7,2 при -50 мВ i 11,1 при +50 м-В.

(C) ВАХ Лш Kjiimun, трансфектованих однакооою кои центра цкю векторов для GhiR-B(R) i GluR-B(Q) субодшшць (100 нГ на чарунку), в "натрквому" i "кмьцквому" 'soeniumix розницах. Нотенц'тш peeepeiï eidnoeiduo -1,7мВ i -49,6 мВ (вказаний стр'икою).

(D) ВАХ д.гя клгтин, трансфектованих високою концентрацию вектора дм GluR-B(Q) (I м к Г на чарунку) i низькою д.ш GIuR-B(R) субодин иц'1 (¡00 нГ па чарунку) в натрквому" i "калъцквому" зоаншнЫ розницах. Потснц'ши peeepeiï eidnoeiduo -2,3 мВ i -1,1 мВ.

Таким чином, риннй стутнь eKcnpeciï редаговано! субодиниш GluR-B може спричшшш розмаитя форм ВАХ активованих глутаматом струм ¡в i piiiiy проникжеть клшш для двовалентннх ioniB. В бишюсп

iieiiponin експресоваш капали АМРА типу, шо мають ВАХ з нормальним випрямлепням i низьку проникшсть для двовалентних íohíb. Отримаш нами даш передбачають, то це обумовлсно CKcnpecicio редагованоТ формп субодиннш GluR-B. Це пшперджуь гься даними in situ пбридизацп. Однак, субпопуляшя культивованих HciipoHiB з ппокампу щура характеризуемся високою проникшстю для лвовалентних íohíb, що викликасться каТнатом (lino et al., 1990, J.Physiol. (London), 242, 151;. Ozawa et al., 1991, J.NeurophysioL, 66, 2). Хоча ni клтнп загалом мають ВАХ з аномалышм випрямлепням, в д1апазош потеннкиив вщ +10 до + с" мВ е льнянка, що демонструе випрямлення у напрямку вихщного струму. Бшолярж клтпш cítkíbkh саламанлри також мктять АМРА рецептори з високою проникшстю для двовалентних íohíb i ïx ВАХ мае нормальне випрямлепня (Gilherston el al., 1990; Science, 251, 1613). Ui дат узгоджуюгься з поведшкою юитин, трансфектованих з ннзькою KOHnenTpauiera векторт для GluR-B(R) i GluR-D або GluR-B(Q) i можуть свщчити про те, що штегральпии струм в цих клггинах забезпечуеться мозажою пршшкиих i непроникних для íohíb Са2+ канал!в АМРА типу.

АМРА рецептори з високою Са2+ проникшстю n клпинах БергмашвськоТ rjiiï

Нанбтьш наочно роль експресп редаговано'У формн субодиннш GluR-B(R) впявнлася на клггинах БергмашвськоТ тли з мозочка щура. Експерименти in situ пбрндмзацп показали, що в клггинах Бергмажвсько'У гли eKcnpecoBani лльки субодиннш GluR-A i GluR-D та не експресована субоднниця GluR-B. Для з'ясуванпя питания, чи буде така спеииф1чна експресля корелювати з властивостями рекомбщантних KaiianiB, мм приготували культуру ппальних jüiítiíh з мозочка i дослщили характер ВАХ i проникшсть для Са^+ при активацп' ïx спепифгшими aroiiicTaMii глутаматинх pciieiiTopit).

В riepiiiiii cepiï експериментш на ппальних клггинах веретеповидноТ формп ми з'ясупали, чн е Txiri глутаматш рецептори рецепторами АМРА типу. Струми у вщповщь иа шввдке подавання ка'Унату не десенсетизувапн протягом усього часу ап.шкаци, тод1 як подавання АМРА виклнкало струм , Koipiiii швидко десенсетизував до деякого сталого piBHH (Рис. 15А). Виклпкаш каТнатом струми зворотно блокувалися CNQZ, Bii6ipKOBiiM блокатором petxenTopÍB АМРА-каТиатного типу (Рис. 15В). KpiM того, при aaMÍni зовшшнього "натр|'евого" розчину на "кальшевии" при ва'смних мембранннх потепщалах рееструвався активованин каТнатом струм (Рис. 15С), який вказуе на високу

провщшсть глугаматних рецепторю в цих клтшах. Bei ui даш евщчать про те, що naTiiBni глутаматш рецептори в пиальних клггинах веретеновидноУ

форми збудоваш i3 субодипиць АМРАтипу i не мають субодинищ GluR-B.

А

-300 цМ КА

30 цМ АМРА

"""" т ™

J

400 ms

25 pA

В

ЗООцМКА

5 цМ CNQX

2 [im KA

300 цМ KA

100 pA

300 К А

Na

300 цМ KA

400 ms

Рис. 15. Hiacmueocmi глутаматних pei^nmopie АМРА типу в клтинах Бергман1всько1 гл/f

(A) Записи cmpyMie у дальних клтинах у eidnoeidb на швидке подавання 300мкМкатату (КА, хива) i 30 мкМ АМРА (справа). Триваисть подавання агонктш вказана лЫкю над кожним записом. Ki¡тина була eidipeana eid дна камери з метою швидко! злини розните.

(B) Еюкування кашатного струму специфЫним бюкатором рецептор¡в АМРА-кашатного типу CNQX. Ixiea направо подано записи cmpyMie у eidnoeidb на Подавання 300 мкМ кашату, eidnoeiduo, в контрольному розчиш, в приеутноспй 5 мкМ CNQX i через 20 с т'огя вШмивання.

(C) Записи cmpyMie на ышьних клтхинаху eidnoeidb на швидке подавання 300 мкМ кашату в "натрквому " розчин! (140 мМ Na*, з.ива) I в "кальцквому" розчиш (110 мМ Ca2*, справа). В nineyni 140 мМ Cs*. Дгя eeix запиав мембранный потенцш -60 мА.

А

fusiform glial cell

т 800

100

-800

в

granule cell , (pA) T 200

-100

V (mV)

-L -200

Рис. 16. Высока проникшсть для юте глутаматних рецепторов АМРА типу у

г?/альм«х кл¡тинах веретеновиднох формы i низька проникшсть в гранулярных

нейронах. ВАХ для ¿.иальних кг ¡тин (А) / нейрош'в (В) в "натровому" / "кольцевому" зовнгшн1Х розчинах, отримаш при пи-шоподЮши змМ мембранного иотенща/гу. Як аготст ' використовувався катат (300 мкМ). Стрыками вказан1 потенц'юли реверсН в "кольцевому"рознит (13,5мВ / -61 мВ вгдпов/дно в А / В).

Пор1в!1яння стацюнарннх DAX, викиряних у "натр1евому" i "кальщевому" зовН1штх розчняах також евщчить на корпеть пього тверджешь.. В

"натр1евому" розчиш ВАХ актнвованого ка'шатом струму, виьнряна при пилкопод1бшн 3MÍHÍ мембранного потенщалу, мала подвшне випрямлення (Рис. I6A). Потенщал реверси струму при цьому становив 3,5 ± 2,6 мВ (п=4). В "кальщевому" розчиш потенщал реверси зрушувався у позитивному напрямку i становив 13,3 ± 1.9 мВ (п=4) (Таблиця 5). Ц1 дан! передбачають величину вщиошення проникностей PCa/PCs приблизив. 1,44 i вказують на те, що нативш глутаматж рецептори в клтшах Бергмажвсько! rail бьльш проникш для íohíb нЪк для íohíb Cs+. Слщ зазиачши, що naiui дат узгоджуються з результатами, отриманими на культивованих гшальних щнтинах веретеновидно'1 форми, KOTpi демонструвапи вхщ мпеного кальщю 45са2+ в ni клтпш (Ortega.et al., 1991, Neuroscience, 41, 335). Таким чином, характер випрямлення ВАХ i проникжсть для двовалентних íohíb глутаматних рецептор1в в юптинах Бергмажвсько! глп дуже схож1 з аналопчними властивостями каналт рекомбшантних глутаматних рецепторш, утворених з субодиниць GluR-A i GluR-D АМРА-типу, транзиторно експресованих у фзброблати (Таблиця 5).

Отже, форма ВАХ з подвшним випрямлениям i висока Са2+ проникжсть глутаматних рецепторов у веретеновидних ггйалышх шитиках можуть бути ключем для ¡Дентифкацп субодиниць, що складають нативш канали глутаматних рецептор1в у клтшах Бергмашвсько1 глп.

Таблиця 5. Пор1вняння nomenniajiie peeepcti i cmyneiuo випрямлення ВАХ нативних канал\в АМРА типу в кл'ипшшх мозочка i рекомб'шантних глутаматних рецепторов, експресованих у клотшш л'ти НЕК 293. Експеримешпалый умови у ecix. випадках odnaKoei.

Кштина/ субодиниця

пня неирони GluR-A GIuR-D GluR-F/D

Потеншал реверса (мВ)

Ca/Cs 13,3 ± 1,9 (4) -52,4 ± 4,7 (3) 13,0 ± 5,0 (9) 12,7 ±2,3 (8) 3,5 ± 1,5 (6)

G+80/G-80

Ка'шат (300 мкМ)

0,3 ± 0,06 (4) 1,0 ±0,1 (4) 0,21 ± 0,12 (70 0,12 + 0,05(5) 0,12 ± 0,04 (6) _

Отримаж нами дат передбачають, що, BÍporiano, нативш канали глутаматних peuenTopiB в клпинах Бергмажвсько! глн складакпЬся з lOMOMipnnx субодиниць GluR-A i GluR-D або [етром1рних субодиниць GluR-A/D. 1Цоби пересвщчшися в тому, що в культививанпх клтшах

збернасться клтшна спешк|л'т|сть властивостей глутаматиих рецептор1В, ми провели аналопчж експерименти на культивованих гранулярних нейронах. ВАХ глутаматиих penenTopje, активованих кмнатом в "натр!евому" розчиш була практично лппйною з потеншалом реверс» -1,1 ± 3 мВ (Рис. 16В). В "катьш'евому" розчиш потеншал реверси зрушувався у напрямку вгд'емних значень i становнв -52,4 ± 4,7 мВ (п=3) (Таблиця 5). Таке зрушеиня перелбачае величину отношения проникностей' t'cVCs в межах 0,05 i вказуе на низьку проникш'сть глутаматиих рецептор!» в гранулярних нейронах мозочка. Lii даш узгоджуються з опублкованимп ратше результатами (Wyllie et al., 1991, J.Physiol. (London), 432, 235; Wyllie & Cull-Candy, 1992, J.Physiol. (London), 446, 598P) та даними in situ пбридизацп, що вказують на eKcnpeciio субодиниш GluR-B в гранулярних нйронах (Monyer etal., 1991, Neuron, 6, 799). Хоча ми не можемо повш'стга виключити, що композишя субодшшць у каналах глутаматиих penenropiB пнальних юнтин не змшюсться пщ час культпвуваия, одна з властивостей канашв глутаматиих peneniopin, що не мають субодиниш GIuR-B, тобто ВАХ з подвшним шшрямленням, була визначена у кл)тинах БергмашвськоУ глп на ¡нТактних зрпах мозку (Muller et al., 1992, Science, 226, 1563).

Таким чином, наш! даш демонструють чггку кореляшю м1ж пластивостями нативних KanaiiB глутаматиих peueriTopie i peKOM6inaHTinix KanaiiB, що були сконструйоваш ¡з субодиниць, ¡дентифакованих методом in situ пбридизацп.

Детермшанти Са2+ проннкнос-п у ТМ1 i ТМ2 сегментах глутаматиих рецепторш каТнаткого типу : вплнв редагувания мРНК

Pi3iii eapianmu амишкилотпоТ noaiidoenocmi сегменту ТМ1 у GluR-б субодинищ

Анал!з пщснленого за допомогою ПЛР фрагменту сДНК субодиниш GluR-б, що MicTiiTb трансмембранш дшянки ТМ1, ТМ2 i ТМЗ, виявив розб1жност1 м1ж трьома нуклеотидними позишями. В ycix трьох позишях у кодугачш послшовност! зиаходиться аденозин (А) або гуанозин (П). Одна позшня, в котрш вщбуваеться зам1на А на G, вщповщае пщлягаючШ редагуванню Q/R дьтянщ в ТМ2 сегментт субодиниш G|uR-6, а також субодиниць GiuR-B i GluR-5 (Sommer et al., 1991, Cell, 76, 11). Дв) ijimi позици розташоваш в TM1 сегмеыт i

передбачають замшу полейшша I (кодон АТТ) на вшин V (кодон OTT) i тирозина Y (кодон TAC) на цисте'ш С (кодон TGC) (Рис. 17). При цьому мали Micue. bcí moxuhibí комбшаци амшокислотноУ послшовносп сегменту ТМ1, при котрих пщлягапи змшам один, два, чи жоден з кодошв, що вказуе на наявшсть в мозку чотирьох pi3>nix конф1гурацш Т.М1 субодиниш GluR-6. An ал i) геномно'г ДНК виявив, що в амшокИслотшй послщовносп ТМ1 сегменту у замшних позищях знаходяться АТТ (¡золейцин) i TAC (тирозин) кодони (Рис. 17), Таким чином, у цих позицшх, так само як i в Q/R дшянщ ТМ2, наявшсть кодошв, не знайдених у геном! GluR-6, вимагае переходу до вщ А до G. Це вказуе на те, що як i для арпншу в Q/T дшжш, замша амщокислот в ТМ1 субодинищ GluR-й здшснюеться редагуванням РНК.

Tut nii ni i ти<

омы мна i OP-OD-СЭ CD— соон

I" 7~ ] Л

|М пс ест w агс «МАПшитгасякпкпиялсклттскттшксм тмяпег «ОМА* тя ест м *к гн ja» см «erja^n« *n«(íi!wnintmjm,M»eMim«i

• í ► 'u-tS, Т. 'у91-'-.4, СО Jfí -г.. * • f. * ^ i '•?.< f.'f * * *

тес ее* 1л мс roe »r« тдт Art ет» ста ест tac m ю IK нг m m m rrr nt *>n ю мо тгт ш

в t • j^l. * ^gfr У- * ^vr^^-t * * *

ТСС ССТ ОЛТ АТС где AM TAT «rrr етоск OCT TV ТТВ«вТ«К*в113СТтСТСТТГ*ТСАТЬ«СеМвТТТАИ!

• ' • *1 . * » >.- ■ * S1J 'г? ' * * * •

тес CCt в*Т АТС Tee AT« TAT СТТ CT? ста ест T« ТТВ ест «к **Т ÍÍ7 ire С7С fn rtt AT» €С5 AOS ТТГ А*Т

Рис. 17. Пор'шияння кодошв геномноХ i клоновано! ДНК для аммокислотно\ nocaidoaHocmi сегменту ТМ1 cy6oàuisuniGtuR-6. Угорi схематично показана субодиниця GluR-б з чотирма трансмембрашиши сегментами (ТМ1-ТМ4). TSfl, а та кож ТМ2 мають замшт кодони в позищях, позначених поперечники линями. Дшнка, котра кодуе сегмент ТМ1, показана у розгорнутому виглядё унизу i демопструс геномну поелгдовшеть сегменту ТАИ. Два аденозини (А) у цШ nocAidoenocmi, що позначеш стриками, замтюютъея на гуанозин (G) в процеа редагування РНК, що призводить до появи гмшено! nocnidoQHocmi сДНК, котру подана нижче, nid геномною поЫдовнктю. АчЫокислоти, утворем в резулыпат1 редагування РНК, позначенi чортши овалами.

Bicrn eapimimie сДНК субодинищ GluR-6

За наивности трьох мюць в поашдовносп амшокислот ТМ1 i ТМ2, KOTpi п'щлягають редагуванню, можливе ¡снування восьми рпннх BapiaHTiB субодинищ GluR-б. Анал1з генерованих ПЛР сДНК ¡з застосуванням специф1чних н>тслеотид1В виявив, що в мозку щура i миии зустр1чаються yci BiciM BapiaHTiB : один, кодованин геном, i cim, отриманих в результат! кодуваиня РНК. Вспоена частота появи цих BaniaHTiB ( % ) показана на Рис. 18.

NH-,

TM I ТМ2 TV)

с /1 \

GluR-б (X/ У/0) * unedited I Y Q

GluR-6(X,C/0) i Ш Q

GluR-6<V, Г/С) ЛЕ Y Q

GluR-б (V, С/0) * V С' Q

GluR-б {I, J7R) * I Y Ш:

GluR-S {I.c.-Ю \ / i Ш Ш

GlUR-SIV, r;R) > r v; Y

GluR-6 (V, С/Я) * fully edited

•соон

10 % 5 % 10 %

5 % 5 % 65 %

Рис. 18. Вгсш аар!апт:в субодиницI С1иЯ-6, геиерованих редагуванпям ТМ1 / ТМ2

кодонт.

Субодиниця С1иЯ-б схематично падана у ясрхнш частиш рисунку. Замани позици в ТМ] I ТМ2 позначен/ понеречннми ¿¡/няни. ВкЫ вар'шнтЫ субодиниц/ САиК-б, гснероваш редагуванняи РНК, подан/ ннжче. Л.миюкис.ютш залишки у залинних позициях подан/ в дужках. Для кожного з ва/иантт показано локалЬащю цнх залишюв у трансмембранних сегментах. Прачками позначеги субодиншо, котр'1 анал'иувалися в цш робота. Справа подана /н'дносна частота появи кожно! з форм сДНК (у вЮсотках).

Завданням дано!' частпни дослшження було з'ясування питания, чи впливае редагування у О/Я дшянш сегменту ТМ2 субоднниш С1иК-6 на характер юнно! лроникносп канал1в у тш же М]'р1, як це мае мюце в каналах ¡з субоднниць АМРА типу. 1 чп мае функцюнальне значения редагування в сегмент! ТМ1.

На Рис. 19 подаш записи струм1в через капали, утвореш вариантом субодиннш 01иК-6 (V, С; Я), котрий зустр1чаеться найчаспше, редагованим у вЫх позишях, при швидкш аплжацц р1зних аготспв. Глутамат 1 ка'шат викликали струм, котрий швидко десентизувався до нульового р1Бия. У вшповщь на подавання домоату тковий струм спадав до деякого сташонарного р1'вня. Шсдя вщмивання домоату струм досягав нульового р1вня вщносно повшьно. Подавання 1 мМ АМРА не викликало струму, котрий можна було зарееструвати. Аналопчт властивост! спостр1галися при активаци канагив, утворених ¡3 субодиниць С1иЯ-6(У, С; 0), 01и11-6(1, У; О), ОиЯ-бН, У; Я) та 1х гетером1рних комбшацш. У подальших експериментах у якос-п агошспв викоритовували глутамат або домоат у насичуючпх концентращях для вим1рювання ВАХ, вщповщно, для шкових . або стацюнарнгх значень струму.

ОЮИ- 6(0) ТМ1 е.сШвс! ЬдМат^е 1 тМ

200 рА

160 те

Ка^е 300 цМ

1000 рА

150 те

Ротсее 50 ц.М

АМРА1 тМ

Рис. 19. Записи штегральних струм ¡в через капали, утвореш з пиком редаговапоI субодиииц1 С1иЯ-6(КС;Е), експресовано! в к. «/лини лти 293 при швидкому пода ваша 1мЫ глутамату (А), 300 мкМ каигату (В), '50 мкМ домоату (С) / 1 мМ АМРА (В). Значения мембранного потетуалу -60 м В.

Калъщсва пропикшстъ редагованих / персдаговапих каналгв субодиницг (ПиЛ-6

Змиш проникносп для юшв Са2+ впм|рю'-1али при пилкопод1бнш змш мембранного потеишалу пщ час ашпкацп домоату. На Рис. 20А 1 В показаш ВАХ у "натрквому" 1 "калыиевому" розчинах для редагованих у ТМ1 форм С1иЯ-6(У, С; О) \ С1иК-6(У, С; И). Характер випрямлення ВАХ вариовав м1ж О \ Я формами у "натрквому" розчиш так само, як 1 у випадку О 1 Я форм АМРА рецептор1в. Однак, для гомомфнпх 01иК-6(\', С; О) канал1в потеншал реверси в "калыиевому" розчиш зрушувався у б|К вщ'емних потенц(ал1в. Це вказуе на нижче за абсолготним значениям стввганошення проникиостеи Са2+/С5+ пор1вняно з такими для АМРА рецептор!в, що мктнть глутамш у дшянш О/Я. 3 шшого боку, для гомом1рнйх 01иИ-6(\', С; Я) канал!в потешпал реверси в "калыиевому" розчиш зрушувався незначно (Рис. 20В, Таблиця 6). Таким чином, для редаговано! в ТМ1 субодшшш С1иЯ-6 вщношення проникностей Са2+/С5+ е внщим для К форми сегменту 'ГМ2, шж для С} форми, котре е зворотним до спостережуваного у каналах АМРА рецептор1в. Слщ зазначити, що для Я форми вхщний с грум, котрий переноситься юнами Са2+, був бшьшим, шж натрквий струм. Це справедливо як для шкового, так ! для сташонарного комлонеттв (Рис. 20В, вставка). Ранние ми показали, що в гетером1рних АМРА рецепторах характер ВАХ \ пропикшстъ для двовалентних юшв визначаеться такими для субодинпш 01иН.-В. В зв'язку з цим було цжаво подивитися, як щ параметри модиф|куються у гстером!рних каналах, утворених ¡з р1зних форм субодинищ С1иК-6. На. Рис. 20С подаш сташонарш ВАХ при агтЫзци домоату у "натрквому" 1 "кадмиевому" позаклтшних розчинах, зарееетроваш на клггинах, що експесують С1иН,-6(\', С; О) > 01иЯ-6(У, С; Я) субоднниш. ВАХ в "натрквому" розчиш мае нормальне випрямлення, як шби вона домшуеться Я формою сегме!гту ТМ2. Потешпал реверси в "кальшевому" розчшп, однак, був вщ'емшшим, шж потенщали реверси для гомомфннх каналт. Слщ зазначити, що вш приблизно доршновав потенщалу реверси канал1в АМРА рецептор1в, шо мктять аргпйн у О/Я дшянш. Таким чином, щодо Са2+ проникносп, С?/К дшянка в субоднниш С1иИ-6 не е екв1валентом свого гомолога у 01иК-А - 01иЯ-0 субодиниц1ях.

аия- е(У,с,о)

ТМ1 ес^ес!

1(рА) Т 4000

Ся/Ся ,

-100

-4000

160,

/Ыа -160

-6000

Рис. 20. Колычева проникнкть I характер випрямлення ВАХ варианты субодиницI С1иВ-6 1з цЫком редааованим ТМ1 сегментом.

(А) : С1иЯ-6(У,С;<2) гомом1рн1 капали. Стац1онарш ВАХ при аникацИ домоату (50 мкМ) у "натривому " I "кальцквому " поэакл1тинних розчинах. Потенции реверса вЮпов^дно -4,1 мА I -27мА (позиачений строкою). На вставцI показано дЬянку ВАХпоблизу потенц1а.11в реверси у збиыиеному масштабI. ■

(А) : 01иН-б(У, С;Ю гомо.шрк! капали. Стацюнарн'! ВАХ при аплкацИ домоату в "натриевому " I "ка1ьШсвому " позаклтшнних розчипао. Потенции реверсН в1дповЮно -1,5 мА 1 -4,4 мА (позначений стрикою). На вставц! показанI записи струм¡п, активованих домоатом, при потенции -60 мА у "натровому " /' "кашцевому" позаклипинних розчичах. (С) : 01и1{-6(У,С;())/01и11-6(У,С;Ю гетсром1рн! капали. Стацюнарн! ВАХ при ап.икащ! домоату у "натривому"| "ка.1ьщсвому" позакитинних розчинах. Потенщат реверси в1дпов1дно -1.8 у < I -41,6 мА (тшачени строкою).

А

в1иП- б( /,У;0)

ТМ1 ипесШес!

I (рА) 5000

Са/Св

100

V (тУ)

01иИ-6( /,У;Я )

-20 / 1200

УА ■100

Са/Св

100

V (тУ)

100

V (тУ)

-3500

Рис. 21. Колычева проникнктъ Iхарактер випрямлення ВАХвар1ант!в субодиницI С!иЯ-6 з нередагованим ТМ1 сегментом.

(А) : С1иК-60, У;ф гомом!рн! капали. СтацЬнарнI ВАХ при апяЬсацП домоату (50 мкМ) у "натриевому"I "кагьцвевому"позак.11тиннихрозчинао. ПотенщалиревереПв1дпов!дно -1,2мА / -11,1 мА (позначени стрЫкою). ВЫий трикутник вказуе на потенц!ал реверс!! для п1дпов!дно! редагованоГв ТМ1 сегмент! субодиниц!, що подана на Рис. 20А. На ветавц! показано дШнку ВАХ поблизу потенц!ал!в ревереП у^ зб!лыиекому масштаб!.

(А): С1иЯ'6(1, У, В) гомомгрн!.качали. Стац!онарн1 ВАХ при аплЫацН домоату у "натр!свому" / "ка.1ъц!евому" ¡юзаклШинних розчинах. Потентат ревераТ в1'дпов1'дно 2,5 мА ! -5,8 мА (позначени стр!лкою). БшЛ трикутник вказуе на потенщал ревереП дм в!дпов!дноТредагс<аноГ у ТМ1 сегмент! субодиниц!, що подана на Рис. 20А.

(С) : 01иЯ~6(1, У;0)/С1и[1-6([, У;И) гетеромфш капали. Стацшар/и ВАХ при апл'исаци домоату у "натриевому" л "кагьцквому" позаклтинних разчцнах. Потенщали реверси вШцов&ш 1,6 мВ I -21,3 мВ (позначений сгИриисою). Бшй трикутник вказуе на потеищал реверси д.гя комбишцМмдповШца редагованих у ТМ1 сегмент'1 субодиниць, и<а подана на Рис. 20С. '

Щоб з'ясувати валив редагування сегменту ТМ1 на Са^+ проникшсть, ми вимфяли Потенщали реверси ¡ощв Са2+ у каналах, утворених з нередагованих у сегмента ТМ1 форм (ЛиК-6(1,У;(3) \ С1иК-6(1,Як видно з Рис. 21 1 Таблищ 6, редагування в ТМ1 впливае на

приниктсть' ТМ2 0 форми. Вшюсно низька Са2+ проникшсть С1иК-6(У,С;0) каналов збшьшилася у нередаговашй в ТМ1 форм! -С1иК-6(1,У;0) (Рис. 21А). Са2+ проникшсть гомом!рних С[иК-6(У,СД) каналт суггево не змшювалася при редатуванш в ТМ1 (Рис. 21В). Таким чином» в цередагаванш ТМ1 форм!, ефект редагування ТМ2 сутгево послаблюеться. В гетером1рнш комбшацп субодиниць, шо мютить редагований I нередагований ТМ2 сегменти, редагування в ТМ1 також знижуе Са2+ проникшсть (Рис. 21С).

Вщмшностт у проникносп' для р!зних форм субодиниш

С1иИ-6 були знайдеш також Гид час анал1зу ВАХ шкових значень струм1В, активованих швидкою ащикашею глутамату в експериментальшй ситуацц, що моделюе ВПСС (Рис. 22). Потенщали реверсц в "кальщевому" розчиш були аналопчш до вим!ряних по стацюНарних ВАХ- ¡з застосуВаНням домоату.

Таблиця 6. Потенщали реверси струм ¡в, активованих домоатом у клтинахлши 293, що експресуютьраш вар'шнти субодинищ вШИ-б.

Канали Потеншал реверсп (мВ)

Са2+/С5+

С1иа-6(У,С;д) " г24,6± 1,4(8)

С1и11-6*У,С;Я) -4,2 + 0,6(8)

О11Л-б(1,У;"0) -12,5 ±0,8 (9)

С1иК-6(1,У;Ю -5,6 ±2,3 (6)

О1и11-6(У,С;0)/ -42,3 ± 2,3 (3)

с1иа-б(У,сд)

01иК-б(!,У;д)/ -24,2 ±1,9 (5)

01иК-6(1,У;Ю

A GluR-6(V.C;fl)

1 mM l-gk/teffHtt» 1 тМ

С GhjR-СЦ V,C;Q )/( V, С;П )

■ 1 тМ t mM L-ylutemef*

♦го mV

_j 500 Рд «OmW _| I

20 ms

У

■60 mVv go 0 '(PAJ

D '(РА! 2О00

С*/Се 100 ^

100

I Q—«О 1 ° с« -2000 V(fflV)

Pue. 22. ВАХ гйкових значень cmpyuie, активояапих ш иод кою апл!кацкю глутамату для кана.г> в, утчорених з фор и субдиншо GluR-6, що зустр^чаються naunacmiuie, у "натргевочу" i "каящквому" розчинах.

(A) : G!uR-6(V,C;R) roMOAtipui канат. Родина ¡нтегральних струм ¡в, що рссструються у eidnoaidb на a >ui ко ni ю ыутамату трив&истюЮО мс при р'пних мембранних потенциалах у "иатри вому" (xiiea) i "кальцквому" (справа) позаки.пииних розчинах.

(B) : ВАХ пЫових значень струмЫ, показаних в (А), у "натрквому" (чорш кружальця) i в "кальцквому" (6iii кружальця) позакл1типних розницах. Потспщ&ш peeepeiî eidnoeidno 0,4 мВ i -5,4 мВ (позначенни строкою.)

(C) : GluR'6(y,C;Q)/GluR-6(VrC;R) cemcpoMipui капали. Родина ¡нтегральних струмЫ, що рссструються }' eidnoeidb на аплгкащю гяутомату трчвалктю 100 мс при pi3nax мембранних потенц'шлах у "натрквому" (злта) i "кальцквому (справа) позаклтипних розницах.

(D) : ВАХ niKoffiux значень струш'в, показаних в (С), у "натрквому" (чорш кружа.тьця) i "кольца вому" (бш кружальця) позакитинних розчинах. Потспц'юли peeepeiî ciidnoeidno -0,4 мВ i -45 мВ (позначений стрикою).

Таким чином, у субодиниш G!uR-6 три позицп в послщовносп ТМ! i ТМ2 окуповаж амнюкислотнпми залншками, KOTpi не кодуються вшповщними генами. ЦГ амшокислотш залишки буреть участь у контрол! Са^+ проникност! канал1в. Огже, редагування мРНК у сукупноеп з можливктю утворення гетером|рних ансамблш з р|'зних комбшащй субодинипь, може бути використане як мехашзм регуляцн входження юшв калылira в клтшу.

За даними з ф{зюлопчних пластивостей GhiR-6 канал1в можна зробити припущення, що Q/R позишя в сегмент! ТМ2 визначае Характер випрямлення ВАХ таким самим чином, як i в АМРА рецепторах. Олнак, проникшеть для дповалентних ioiiiB у гомом1рних GluR-6 каналах зм1нюсться тд вшитом релагування в ТМ2 сегменп* у протилежному

. 48

напрямку портняно з субодиницею 0|иЯ-В. При цьому, в гетером|рному ансамбл!, шо утворився з О ¡ Я вар!аНтш 01иК-6, проникщсть для дврвалентних юшв виявляеться дуже низькою, меншою за проникшсть для гомомфиих канаЛ1в, утворених кожною субодиницею окремо. В зв'язку з цим щкаво вщзначити, что мутувацня ТМ1 сегменту в субодинищ 01иЯ-0(1,У;В) ¡з родини АМРА рецептов у його "редаговану" форму О|иЯ-Р(У,С;0) не Впливае на Са^+ пррникн1сть. Цей результат I рпний вплив О/Я дшянки на Са^+ проникщсть вказують на вщм|ншсть структуру канатив у АМРА 1 каТнатниХ рецептор1в, незважаючи на те, що субодинищ цих дрох тигрв глутаматних рецепторов мають високий стугйн ь ¡дентичност! амиюкислотних послщовностей, особливо у перебачуваних сегментах ТМ1, ТМ2 1 ТМЗ. Зокрема, щ два типи канал1в можуть матп ргшу топологио. Можна зробити припущення, що амшокислотш залишки сегменту ТМ1 субодинищ СНиЯ-6 беруть участь у формуванщ пори ¡онного каналу. У зв'язку з цим слщ зазначитн, (до два "амгнокцслотних залишки у ТМ1, Що гпдлягають редагуванню, розтащоваш по един б!К ТМ1 сегменту (за умов:', уявлення його вторинно! структури у вигляд! а-гелжеа) ¡з пром)'жком у. один виток один вщ другого.

Контроль 5 2+ проникност! РЧМрА рецепторов

Одшею з найважлив1ших характеристик N М О А рецепторщ е Тхня висока проникшсть для юшв Са2+. Для рецептор!в АМРА i каТнатного типу ми показали, що структурною детермшантою Са^+ проникноеп е дшннка О/Я у передбачуваному трансмембранному сегменп ТМ2. При цьому, для АМРА рецепторщ введения аспарапну до ше! критично! дшянки призводило до утворення каналу з вищою проникшетю для ¡ошв Са2+, к! ж для юшв (див. Рис. 12). Аналп структури клонованих

ЫМОА рецептор1в показав, що для вах субодиниць е характерною напотеть аспарапну у передбачуваному сегменп ТМ2 в дшянш, гомолопчшй до тако'1 для рецептор1в АМРА \ ка'шатного типу (Рис. 23А). Огже було щкаво з'ясуватн, чи Призведе замша аспарапну в цШ позицп до змш Са2+ М62+ проникност! NMDA рецептор1В. Щоб вщповкти на це питания ми провели серпо експериментш у "натровому", "кальшевому" 1 "мапйепому" зовниших розчииах, подтбних до проведених рашше для АМРА 1 ка'щатпих рецептор!в. Для кашипв, утворених комбшашею субодиниць N1?! ] NR2A потенщал реверси струму в "кальшевому" розчиш становив приблнзно 20 мВ (Рис. 23В, позпачений

WR1 DALTLSSAKWFSWGVLIKGGIGEGAP 606 NR2A PSFTIGXAIWLLWOLVFrtNSVPVCi'P 603 NR2C PSFTIGKSVWLLWALVf'NMSVPI ENP 601

GK.R-B NEFGIFNSLWFSLGAFMAQGCDISPR 594

С 1(pA)

NR1(NS9eC 4R2A

Рис. 23. Bi(hiinnocmi i npoeiduocmeu у немутопаних i мутоваиих каналгв NMDA рецепторов.

(A) : угор! подана д'шграма псрвшшоI структуры субодиниць глутаматних рецепторш NMDA типу, на якШ видно взасморозтамування тр чсмембранних диянок. Унизу розкрито nooiidueiiicmb амию кис.лот у сегмент! ТМ2 для субодиниць NMDA рецепторгв i редаговамп та нерсдагованог форм субодипиц1 GluR-B A St РА типу.

(B) : ВАЛ' активоваиого глутаматом струму в "патрквому", "кальцквому" i "магнквому" Joeniwnix розчинах для комбшаци немутооаннх субодиниць NR1-NR2A. Стрикою вказаний потенц ¡ал peeepcii для iouie (22,3 мВ). У "магшсвому" рознит exid/шй струм не ресструвався навть при -100 м В.

(C) : Я АХ активоваиого глутаматом струму у "патрквому" i "кальцквому" зовнш/нЬс розчинах д.гя комбишцп мутованоI NR1(N59SQ) i немутовано1 NR2 субодиниць. Стрыкою вказании потенциал peeepcii для iouie Са2+ (-3 мВ). ■

(D) : BAY активоваиого г.1утаматом- струму у "патрквому" i "магнквому" зовтшнЬс розницах для комбишцп немутованоГ NR1 i мутовано\ NR2A(N595Q) субодиниць. У "магнквому" рознит потенциал peeepcii становив -11 мВ (вказаний стрикою). У ecix експериментах з NMDA рецепторами \атрквий" розниц не мктив iouie магтю. Глутамат (100 мкМ) подавався однонасно з глицином (10 мкМ).

стршкою). В клтшах, Що експресують комбшашю мутованоТ NR1(N598Q) i NR2A субодиниць, потенщал peBepcii зрушувався у серсдньому до -6 мВ (Рис. 23С). BiaMiHHicTb у величши потеншалу реверси для цих двох випадмв вказуе на те, що NfyTOBani капали мають сутгегзо меншу проникшсть i, отже, проникшсть NMDA

рецептор1'в критично залежить вщ аспарапну NR1(N598) у ТМ2 сегменп*. Зменшения Са^+ npoHHKHocTi шсля замени аспарагшу на глутамш в субодинищ NR1 спостер!галося також 'рй KoeKcnpecii мутовано'1 i немутовано? форм ljiei субодтшш i3 субодшишею NR2C (Таблиц* 7).

Дал! ми дослщили, чи мае аспарапн в ромолопчнш позици в субодиницях КИ2 таке саме функцюнальне значения для здщснення . контролю Са2+ проникносп гетером1рного ансамблю. Однак, для NR1-КЯ2А(К5950) 1 т1-КЯ2(№93<3) канх'йв потенщали реверси у "кальщевому" розчиш сугтево не вщрЬнялися вщ таких для немутованих канал1В (Таблиця 7).

На вщмшу вщ мутаци у субодиниш NR1, котра не валивала на низьку проникшсть для ¡ошв' мутащя у субодиницях NR2

призводила до утворення каналов з вищою проникшстю.

Потенщал реверси у "мапиевому" зовшшньому розчиш при цьому становйв -12 мВ (Рис. 230, Таблиця 7). Для немутованих канал!в це значения було вщ'емшшим за -50 мВ (Рис. 23В, Таблиця 7).

Acimpariii у ТМ2 сегмент! контролюе блокування NMDA рецелторт шнами Mg

В нативних каналах NMDA рецептор1в ioni Mg2+ е сильними блокаторами вхщного струму. Вщмшшсть Mg2+ провщносп у мутованих i немутованих каналш може вказувати на рпний ступшь блокування вхщного струму юнами Mg2+. Щоб з'ясувати вплив муташй у ТМ2 сегмент! на характер блокування юнами ми поршняли ВАХ,

отримаш в розчиш, що не MicTiiB двовалентних ioniB, з ВАХ, отриманими в розчиш з

0,1 мМ Mg2+. Результати цих експериментш подаш на Рис. 24. Для немутованих каиалш NR1-NR2A амшитуда струму, вим1ряного при потенщал! -100 мВ у прнсугност1 0,1 мМ Mg2+ стаНовила 9 ± 3 % (п=4) вщ контрольного значения, отриманого в розчиш без двовалентних ¡ошв. Для мутованих каиал1в NR1(N598Q) -NR2A це значения становило 30 ± 6% (п=4) (Рис. 24А,В). 3aMina гомолопчного аспарагшу у ТМ2 сегмент! субодиниш NR2A ще сутгевше зменшила чутлгшсть каналш до блокування юнами

Mg2+ 1 практично

усунула потеншалозалежшсть магшсвого блокування. Амгиитуда струму, вим1ряного при потенщал1 -100 мВ в присутносп 0,1 мМ Mg2+ для канал1В NR1 - NR2A(N595Q), становила 71+4% (п=4) вщ контрольного значения (Рис. 24С). Яккно cxoxi змши в характер! блокуваня юнами спостерпалися в клтшах, шо експресували мутова!Й NR1(N598Q) - NR2C i NR1 - NR2C(N593Q) комбшаци субодиниць.

Рис. 24. [1иЬн1ш:сть у ступен! блокувиипя позаклтиннш могшем каналов, утворсних ¡э мутованих / немутовапих субодшшць.

(A) : капали, що сгсгадаються з субодиницъ N111 / <\'В2А. ВАХ пктивованого глутаматом струму в розчши без двовалситпих /ошв (а) I в розчши з 0,1 м.\{ 1 • + (Ь).

(B) : аналогпш ВАХ для качали т1(№98())^1иА.

(C) : ВАХ для канал!в N№-N¡{^(N5950).

Замша аспарагшу на арпшн у NR1(N598R)-NR2A комбшацп призводила до утворення каналш ¡з ннзькою Са2+" проникшстю (потеншал рсверсИ у "кальщевому" розчнш становив в середньому близько -80 мВ (Рис. 25А,В; Таблиця 7). Окр1м того, в клггинах, шо експресували NR1(N598R)-NR2A рецептори, форма ВАХ активованого глутаматом струму була нечутлива до позаклггинно!' концентраци ¡ошв Мё2+.

Вхщний струм, викнряний у розчиш, що не м1стив двовалентних ¡ошв, не був заблокований шелл додавання 0,5 мМ N^2+ (Рис. 25С). Таким чином, у тому випадку, коли позитивно заряджений арпшн розтащовуеться у критнчнш поз ним ТМ2 субодиниш NR1, двовалентш катюни, в1'роггдно, не можуть утайти до гирла каналу.

А

Ш1{Ы598И)-ЫД2А

В

I ОД 2400

■2400

С

I 1200

•100

уГ ОМф ОСв

Ь: 0.5Мк: ОС»

•120О

Рис. 25. Змсншення проникност/ I ступеню блокування юнами мутованих

кишим з аргштом замкть аспарагту у ТМ2 сегмент< субодиниц! Л'Л/. (у!^ ; записи струм'ш, рчкликаних ап.пкацкю 100 мкМ глутамату при потешуалЬ -60 мВ у "натрквому" розчин1 (вхй1ний струм спрямовапий донизу) / у ''калыисвому" розчши (вих^дний струм скерований догори).

(B) : ВАХ активованого глутаматом струму у "натрквому" I "кальцквому" розницах. Потенциалы реверси в!дпов1дно 01 -87мВ (позначений стрЬкою).

(C) : ВАХ активованого глутаматом струму в розчиш, що не мктитъ двовалентних юшв (а) та в розчши, що мктить 0,5 мМ (Ь). Обиде/ кривI практично ствпадають

Вплив на Са2+ проникшеть та провшшеть замши аспарапну на арпшн або глутамш у трансмембранному сегмент! ТМ2 субодинищ NR1 передбачае, що цей сегмент е частиною пори юнного каналу рецептор1В NМО А типу. Аспарапни в субодиниц!х котр1 розташоваш в

гомолопчшй позици, ¡мов1рно, також беруть участь у формуваиш пори, оскшьки кня замша на глутамш також впливае на магшеву проникшеть 1 блокування канал!в юнами Вплив мутаци на проникшеть 1

блокування каналу дозволяе висловити припущення, що аспарапни двох субодиниць формують, по меншш мф1, частину селективного фшьгру N М О А рецептор'ш для юшв Гомолопчне розташування

аспарапшв у двох субодинидях, виявлене при порншянш амшокислотних послиовностен, однак, не обов'язково евщчить про '¡хне екв!валентне розташування у сформованому канал!. РЬш субодиннц! ЫМЭА рецепторов можуть по-р!зному впливати на властивост!

reTepoMipnoro каналу внаслшок свого асИМетричного розташування, як це мае Micne в шших каналах (Unwin et al., 1988, Cell Biol., 107, 1123).

Таблиця 7. Погпешуали peeepcii активованого глутаматом струму для piiiuix комбмацш иемутоааних / мутованих субодиниць NMDA рецепторов у "калыуевому" ()10 мМ) i "маг/пеоому" (НО мМ) эоепштЫ розчинах. У

ninemifi 140 мМ Cs+.

Комбшашя Vrev (mB) Vrev (MB)

субодиниць Ca2+/Cs+ Mg2+/Cs+

NRI-NR2A 23, 4 ± 1,6 (5) -50 (4)

NR1-NR2C 19,5 ± 0,7 (6) -100 (3)

NR1(N598Q)-NR2A -5,9 ± 1,6 (10) -100 (3)

NR1(N598Q)- 6,6+ 1,0 (3) -100 (1)

NR2C

NR1-NR2A(N595Q) 18,1 ± 1,3 (6) -12,7 ±0,8 (4)

NR!-NR2C(N593Q) 17,6 ± 1,0 (3) -11,0 ±3,9 (3)

NRl(N598Q)- 3,4+1,3(3) -6,4 (1)

NR2A(N595Q)

NR1(N598R)-NR2A -82,5 ± 2,2 (4) ND

Висока кальшева ироникшсть i потенщалозалежне блокування юнаМи як вважають, Bulifpae важливу роль у такШ функЦи NMDA

peuentopiß, як пщтримання тривалих змш у синаптичнШ активно«! клггин, а та кож у цитотоксичному ефеетт глутамату в умовах rinoKcii (Coüingridge and Bliss, 1987, Trends Neurosci. 10. 288; Nicoll et al., 1988, Neuron, 1, 97; Choi. 1988, Neuron, 1, 623). Ми виявили, що i Ca2+ npoHHKHicTb, i блокування ¡онами

Mg2+ критично залежать вщ одного ампюкислотного залишку аспарапну у трансмембранному цегмент! ТМ2 субоднниць NR1 i NR2. Отже, мутапп, KOTpi впливають на Цей залишок у будь-якin iз субодиниць, можуть спричишггн длсфункцн синаппгчНоТ передач! внаслшок порущення потенщалозалежного входу ioniB Са2+ до

ПОСТСИНаПТИЧНО! КЛГГИНИ.

висновки

1. Використовуючи комбшашю метод 1 в реестрацп ¡онних струмш 1 точково'1 мугацп, проведено детельний анал13 функцюнальних характеристик уЫх титв рекомбшантних юнотропних глутаматних рецептор|в. Розроблено класиф1кацно субодиниць глутаматних рецептор1в на основ1 анал1зу структури I функцюнальних характеристик.(1, 2, 4, 5, 7, 18).

2. Виявлено, що субодинищ глутаматних рецептор1в, котр! належать до одного класу, можуть утворювати гетером!рш канали з новими властивостями, що вщр^зняються вщ властивостей складових субодиниць (1, 2, 3. 5. 7). .

3. Виявлено, що передбачуваний трансмембранннй сегмент ТМ2 бере участь у формуваНш юнно? пори каналгв глутаматних рецептор1в (2,3,9,10).

4. 1дентифшовано дишнку в амшокислотнш послщовносп трансмембранного сегменту ТМ2 (О/Я диянка), що вщповщае за контроль ¡онно1 провщносп АМРА рецепторт. Виявлено, що замша одного ашнокислотного залишку у цш позицн спричиняе змшу.потенщалозалежносп ¡онноТ провщносп (2).

. 5. Дослщжено структура! детермшанти проникностт глутаматних рецептор1В для двовалентних юшв. Для рецептор1в АМРА показано, що низька проникшсть для юшв кальцпо визначаеться наявшстю позитивно зарядженого амшокислотного залишку арпншу у О/Я дишнщ, котрий було внесено до шеУ дшянки при редагуванш мРНК на гпзшшш стада розвитку. Показано, що р1зний ступень експресп редаговано\' форми субодинищ С1и11-В визначае Са2+ проникшсть гетером1рних канал1в (3).

6. 1дентифжовано структурну комггозшшо нативних глутаматних рецепторш АМРА типу в титанах ПсргмашвськоТ гли на основ! пор1вняння шпх властивостей ¡з властивостями рекомбшантних глутаматних рецептор1в. Виявлено, що функщональш капали глутаматних рецепторш у цих клптшах

утвореш ¡з субодиниць АМРА типу ОШЯ-А 1 С!иК-0, коттл мають високу кальщеву проникшсть (8, 14).

7. Для субодинищ С1иК-6 показане ¡снування восьми вар1ант1в субодинищ, обумовлене редагуванням мРНК у трансмембранних дишнках ТМ2 1 ТМ1. Внявлено, що редагування у ТМ2 1 ТМ1 е одним з генетичних мехашзмт, що контролюють Са2+ проникшсть глутаматних рецспторш АМРА i кашатиого типу (10, 15, 19).

8. Для ИМОА рецептор1в щентиф1 ковано дишнку у ТМ2, котра вщновщае за контроль кальщевой 1 маппево! проникност! та потенщалозалежного блокування цього типу рецептор!в ¡опами маппго. Показано, що кальщева (магшева) проникшсть, так само як блокування N N10 А рецспторш юнами магнпо, критично залежать вщ одного амшокислотного залищку аспараппу у трансмембранному сегмент! ТМ2 субодиниць N111 I N112 (9, 16, 17, 20).

9. В'результат! дослшження вдалося виявити спитьний для р1зних тшпп глутаматних рецептор!!! елемент первинно? структур» - СУЯ/И дшянку у трансмембранному сегмент! ТМ2, копии"! визначае характеристики гхньоТ юнно! провщность

IlepejiiK po6ÎT, oriy^iiiKOBanHx noreMi AHcepTauiiï

1. Sommer B, Keinanen K, Verdoorn T, Wisden W, Burriashev N,

Herb A, Kohler M, Takagi T, Sakrnann B & Seeburg P (1990). Flip and Flop : A cell-specific functional switch in glutainate-operated channels of the CNS. Science 249: 1580-1585.

2. Verdoorn T, Burnashev N, Monyer H, Seeburg P & Sakmann B

(1991). Structural determinants of ion flow through recombinant glutamate receptor channels. Science 251: 17151718.

3. Bumashev N, Monyer H, Seeburg. P & Sakmann B (1992).

Divalent ion permeability of AMPA receptor channels, is dominated by the edited form of single subunit. Neuron 8: 189198.

4. Sommer B, Burnashev N, Verdoorn T, Keinanen K, Sakmann B

& Seeburg P (1992). Â glutamate receptor chanhel with high affinity for domoate and kainate. EMBO Journal 11: 1651-1656.

5. Herb A, Burnashev N, Werner P, Sakmann B, Wisden W &

Seeburg P (1992). The KA-2 subunit of excitatory amino acid receptors shows widespread expression in brain and forms ion channels with distantly-related subunits. Neuron 8: 775-785.

6. Sommer B, Monyer H, Wisdern W, Verdoorn T, Burnashev N,

Sprengel R, Sakmann B & Seeburg P (1192). Glutamate-gated ion channels in the brain-genetic mechanisms: for generating molecular and functional diversity. Anneimittel-Forschung/Drug research 42-l(N2A): 209-210.

7. Monyer H, Sprengel R, Schoepfer R, Herb A, Higuchi M,

Lomeli H, Burnashev N, Sakmann B & Seeburg P- (1992). Heteromeric NMDA receptors: Molecular and functional distinction of subtyped. Science 256: 1217-1221.

8. Burnashev N, Khodorova A, Jonas P, Helm PJ, Wisden W,

Monyer H, Seeburg P & Sakmann В (1992). Calcium-permeable AMPA-Kainate receptors in fusiform cerebellar glial cells. Science 256 : 1566-1570.

9. Burnashev N, Schoepfer R, Monyer H, Ruppersberg JP, Gunther

W, Seeburg P & Sakmann В (1992). Control by asparagine residues of calcium permeability and magnesium blockase in the NM DA receptor. Science 257: 1415-1419.

10. Koliler M, Burnashev N, Sakmanrt В & Seeburg P (J993). Determinants of Ca2+ permeability in both TM1 and TM2 of high-affinity kainate receptor channels : Diversity by RNA editing. Neuron 10: 491-500.

11. Schoepfer R, Monyer H, Sommer B, Wisden W, Sprengel R, KunerT, Lomeli H, Herb A, Kohler M, Burnashev N, Gunther W, Ruppersberg JP & Seeburg P (1993). Molecular biology of glutamate receptors. Progress in Neurobiology (in press).

12. Jonas P, Burnashev N, Verdoorn T, Wisden W, Seeburg P & Sakmann В (1991). Molecular identification of glutamate receptors in CA3 hippocampal neurons. Pfliigers Archiv 418: upplement I), R15.

13. Verdoorn T, Burnashev N, Jonas P, Seeburg P & Sakmann В (1991). Comparison between the functional properties of

. glutamate receptors native to CA3 hippocampal neurons and recombinant glutamate receptors. Society for Neuroscience Abstracts 17: 335.

14.. Khodorova A & Burnashev N (1992). Glutamate receptor . channels with high Ca2+ permeability in fusiform glial cells in rat cerebellar cultures. Proceedings of the Physiological Society. Journal of Physiology (London) 446: 516P.

15. Burnashev N, Kohler M, Seeburg P & Sakmann В (1992). Conductance rectification and Ca2+ permeability of edited and unedited forms of recombinant glutamate receptor GluR-6

subunit channels. - European Journal of Neuroscience, Supplement 5, 1.71.

16. Burnashev N, Monyer H, Schoepfer R & Seeburg. P (1992). Ca?+ permeability of recombinant NMDA receptor channels. Society for Neuroscience Abstracts 18:395.

17. Schoepfer R, Seeburg P, Kuner T, Burnashev N, Gunther W & Ruppersberg JP (1992). Single channel analysis of mutant NMDA receptor with altered ion-channel properties for magnesium block. Society for Neuroscience Abstracts 18:395.

18. Burnashev N, Sakmann В (1993). Differential desensetization behavior of recombinant AMPA and kainate receptors. Pfliigers Archiv, 442: upplement 1, R42.

19. Kohlèr M, Burnashev N, Sommer В, Sprengel R, Sakmann В & Seeburg P (1993). Functional determinants in TM1 and TM2 of kainate receptor channels : Diversity by RNA editing. Journal of cellular biochemistry, Supplement 17 D.

20. Ruppersberg P, Burnashev N, Gunther W, Kuner N, Monyer H, Sakmann B, Seeburg P, Schoepfer R (1993). Mechanisms of magnesium black identified by single-channel recording from mutated NMDA-receptor channels. Proceedings of Biophysical Society, 37: 115.

21. Burnashev N (1993). Recombinant ionotropic glutamate receptors : Functional distinctions imported by different subunits. Cellular Physiology and Biochemistry (in press).

22. Molecular biology of NMDA receptors. In : The NMDA Receptor, Eds. JC Watkins & GL Collingridge, IRL Press; Oxford University Press, 1993.

Шли. до лруку И . Формат 60>;84'/ю.

Ilanip друк. Ле Спциб друку офсеппш. Умоьн. друк. арк. .

Умоем. фарби-шлб. J.7/ . Oôji -вид. арк. Z.C Тираж /cl . Зам. ЛЬ ¿v.1 V . Ьгш.чаino.

Ф'|рма «BHIOJb 2ГЗ"J 151, Кит, bj.i. Нилннська, GO.