Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и эволюция повторяющихся элементов в гетерохроматине Х-хромосомы DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура и эволюция повторяющихся элементов в гетерохроматине Х-хромосомы DROSOPHILA MELANOGASTER"

£ £

На правах рукописи

ТУЛИН АЛЕКСЕЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

СТРУКТУРА И ЭВОЛЮЦИЯ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ЭЛЕМЕНТОВ В ГЕТЕРОХРОМАТИНЕ Х-ХРОМОСОМЫ ВКОБОРШЬА М К ьл N О О А 8 Т Е1}

(03.00.03)- молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-1997

Работа выполнена в отделе молекулярной генетики животных Института

доктор биологических наук, профессор В. А. Гвоздев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук П. Г. Георгиев кандидат биол. наук Иван Александрович Александров

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардга

Защита диссертации состоится "30" октября 1997 г. В 10 часов на заседании Диссертационного совета Д.053.05.70 в аудитории 536 (Корпус "А").

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета

молекулярной генетики РАН.

Научный руководитель:

МГУ им. М. В. Ломоносова

Автореферат разослан " ¿'с'^с а Л 1997

г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат хим. наук

В. Н. Каграманов

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Гетерохроматические районы составляют в ряде случаев более 50% эука-риотического генома. Несмотря на это, молекулярно-генетический портрет гетеро-хроматина начинает складываться только сейчас. Становится очевидным, что гете-рохроматин содержит ряд специфических генетических локусов, столь же важных, как и эухроматические. Одна из существенных особенностей организации геггеро-хроматина - это сильная обогащенность повторами, которые могут определять транскрипционную активность гетерохроматических генов. Большая часть повторяющихся элементов гетерохроматина собрана в тандемные кластеры, в которые инкорпорированы многочисленные мобильные элементы. Наиболее изученными компонентами гетерохроматина D.melanogaster являются кластер рибосомальных генов (рДНК) и сателлитные ДЕК (сат-ДНК). Однако остаются открытыми вопросы, касающиеся молекулярных механизмов эволюции и поддержания в геноме гетерохроматических тандемных повторов (в том числе рДНК и сат-ДНК). В гетеро-хроматине X хромосомы обнаружены тандемные повторы Stellate, кодирующие белок, сходный с регуляторной субъединицей протеинкиназы СКП. Особенности дивергенции/гомогенизации повторов гетерохроматина, кодирующих белок, никем не исследовались, поэтому представляло интерес выяснить степень внутригеном-ного полиморфизма генов Stellate на молекулярном уровне, принимая во внимание, что закономерности их эволюции могут определяться селективным давлением. Данные об особенностях полиморфизма повторов на уровнб определения нук-леотидных последовательностей, особенно в отношении кластера прерываемого вставками, представляет особый интерес для понимания закономерностей эволюции тандемных повторов.

Отдельный аспект в изучении гетерохроматина составляет эффект положения (ЭГГ) мозаичного типа, заключающийся в мозаичной экспрессии эухроматиче-ских генов, перемещенных к гетерохроматической ДНК. Исследования ЭП продвинулись в основном в плане изучения транс-действующих белковых факторов, модифицирующих действие гетерохроматических блоков на эухроматические гены. Вопрос о природе и специфичности цис-действующих гетерохроматических элементов изучен крайне недостаточно. Представляло интерес подойти к исследованию этого вопроса, используя изученный нами на молекулярном уровне протяженный фрагмент гетерохроматина Х-хромосомы.

Цели и задачи исследования.

Задача работы состояла в описании молекулярной структуры фрагмента гетерохроматина Х-хромосомы, содержащего кластер генов Stellate, кодирующих белок, сходный с Р-субъединицей протеинкиназы CK1I. С целью изучения особенностей молекулярной эволюции тандемных повторов (гомогенизации) необходимо было выяснить уровень полиморфизма повторов Stellate внутри тандемного кластера, сравнивая близлежащие и удаленные гены, интактные и поврежденные вставками. Специальный интерес представлял анализ обнаруженных рядом с генами Stellate фрагментов рДНК, их сравнение с функционирующими генами рДНК. Это могло пролить свет на природу молекулярных процессов, обеспечивающих идентичность повторов рДНК.

С помощью трансформации мух с использованием Р-элемента, представляло интерес исследовать способность фрагментов кластера генов Stellate вызывать эффект положения мозаичного типа.

Новизна результатов исследования.

Показано наличие в гетерохроматине прерываемого вставками тандемного кластера кодирующих белок генов Stellate (с интактными ОРТ), эволюция которых шла под давлением отбора. Показано, что степень дивергенции повторов возрастает с увеличением расстояния между ними, а вставки препятствуют «гомогенизации» повторов. На примере псевдогенов рДНК показано существова-

ние множественных рекомбинационных актов сегментной конверсии, происходящих в гетерохроматине между генами и псевдогенами рДНК. Клонирован и секве-нирован новый ретротранспозон, содержащий длинные концевые повторы (ДКП). Показано, что он сильно амплифицирован в геномах видов группы Оте1апо§а81ег и Б.уакиЬа, а у группы видов О.утНз представлен уникальной последовательностью на гаплоидный геном.

Впервые с помощью трансформации на основе Р-элемента показано, что клонированный фрагмент гетерохроматина известной структуры способен вызывать эффект положения эухроматического гена.

Апробация работы.

Работа апробирована на лабораторном семинаре в отделе молекулярной генетики животных (ОМГЖ) ИМГ РАН и на кафедре Молекулярной биологии в МГУ им. М. В. Ломоносова. Данные, представленные в работе, доложены на пяти международных конференциях.

Публикации.

По материалам работы опубликованы две статьи в международных журналах, данные представлены на 5 конференциях.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из 5 разделов: Общая характеристика работы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Выводы, Список работ, опубликованных по теме диссертации. Работа написана на 144 страницах, содержит 22 иллюстрации, четыре таблицы и четыре приложения.

Материалы и методы

Линии и виды ЛгохоркИа.

В качестве источника при получении геномной библиотеки в искусственной дрожжевой хромосоме использовали линию Батуми. Другие линии 0.те1аж^айег (РЩ^с^с®, ОГ(1)С10 и т. д.) взггы из коллекции ОМГЖ. Линии ОлапМя, О.ШЮгаЦв, 0.1итте1 получены го лаборатории В. Г.

Митрофанова (ИБГ РАН). Линии D.mauritiana, D.yakuba получены из центра Блумингтон (США). Линия Df(l)w"c2"2)v, использовавшаяся в экспериментах по трансформации, получена ш лаборатории М. Б. Евгеньева (ИМБ РАН).

Выделение геномной ДНК. Буфер 1 (Гомогешшционный буфер): 0.1 М NaCl, 0.03 М Tris рН 8.0, 10 шМ EDTA, 10 шМ beta-МЕ, 0.5% Triton Х-100.

Буфер 2 (Экстракционный ): 0.1М Tris рН 8.4, 20 шМ EDTA, 0.1М NaCl.

ДНК из ЮОмух/эмбрионов/личииок помешали в 1.5мл пробирки eppendorf, добавляли ЗООмкл буфера 1 (0°Q я гомогенизировали ручным стеклянным или тефлоиовым пестиком. Добавляли ЗООмкл буфера 1, полученную суспензию тщательно перемешивали на voitex 10'. Ядра осаждали 1иин. центрифугированием. Ресуспевдировали в 500ыкл буфера 2. Осаядали ядра, ресуспсцди-ровали в ЗООмкл буфера 2. Добавляли протеиназу К до 100шсг/мл и саркозила. Осторожно перемешивали, переворачивая, и инкубировали 1час при 50"с. Добавляли ЗООмкл фенола, перемешивала 30', затем ЗООмкл хлороформа, перемешивали 30'. Центрифугировали, водную фазу экстрагировали хлороформом. Добавляли RNase А до 100мкг/мл и инкубировали 1час при 40 - Экстрагировали: феяол/хлороформ и хлороформ. Добавляли 5М NH4OAC до 2М и осаждали ДНК двумя объемами холодного 100% этанола. Перемешивали, переворачивая, пока не сформируется осадок ДНК. Центрифугировали Юмпн при комнатной температуре и промывали 70% этанолом. ДНК растворяли в 20мкл ТЕ.

Стандартные методы молекулярной биологии.

Клонирование, секвенирование, southern-блот гибридизация, получение меченного зовда и т. д. выполняли в соответствии с руководством Fritch, et. al., 1989.

Для клонирования использовался плазмидньщ вектор pTZ19R и штаммы K.coli XLl-blue, TGI, JM109,DH5a.

Компьютерный анализ нуклеотидних последовательностей.

Для анализа нуклеотидных последовательностей использовали программы DNASIS 5.00, PCGENE 3.15 и VOSTORG. Для поиска гомологичных последовательностей в базах данных использовался сервер BLAST Национального центра биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/).

Трансформация эмбрионов Drosophila.

Выполняли в соответствии с руководством Ashbumer, M., Drosophila a laboratoiy handbook. 1989. Использовали систему векторов CaSpeR (Thummel, et al., 1988) с плазмидой-сомошником Turbo Д2-3 (Robertson, et al., 1987).

Результаты и обсуждение

Молекулярная структура клонированного района гетерохроматина

Фрагмент гетерохроматина X хромосомы D.melanogaster линии Батуми, содержащий кластер генов Stellate, был клонирован в искусственной дрожжевой хромосоме (pYAC5) (Коган и др. 1991). Гены Stellate содержат открытую рамку трансляции (ОРТ) для белка, высоко гомологичного ß-субъеденице протеинкиназы СКП D.melanogaster (Livak, 1990) Клон DY8 (размер ~ 90т.п.н.), локализованный в дистальном Х-гетерохроматине, был субклонирован в векторе ÄJ3MBL4. Полученная библиотека скринирована Ste-зондом. Построены рестриктные карты отобранных субклонов (phi, ph3, phl4 и ph34) и, на их основании, восстановлена карта клонированного в DY8 района генома. Дополнительную информацию об окружающих Ste-кластер ДНК удалось получить при скрининге библиотеки фаговых субклонов на рДНК-зонд. Таким способом были отобраны еще три клона (phDl, phD2 и phD3) (Рис.1). Промежуток между рШ2 и phDl был закрыт благодаря клонированию перекрывающегося с ними фрагмента EcoRI/HmdüI (9т.п.н.) в плазми-де рЗ 1 прямо из DY8 (Рис.1).

Промежутки в карте, не перекрывающиеся фаговыми и плазмидными субклонами, анализировались southern-блот гибридизацией с использованием краевых зондов из субклонов. Было показано, что клоны ph34 и phl4 расположены в одном фрагменте Pstl (19т.п.н) (Рис.1), этот же фрагмент несегг основную часть генов Stelate в DY8. С помощью неполной рестрикции было показано, что гены Stellate организованы внутри этого фрагмента в правильный тандемный повтор по крайней мере из 12 генов (предел разрешения метода), то есть доказано отсутствие между ph34 и phl4 вставок, нарушающих правильный тандем.

б

Эухроматин Гетерохромагин

h26 h27 h28 h29 h30 h31 h32 ЬЗЗ Ь34

ЧГС21'288 M'18S TETS

^ ¥=V

Кластер генов Steüate

1 kb

Рис. 1. Молекулярная структура клона DY8 2 гетсрохроматине Х-хромосомы. h26 - Ь34 - гетерохроматические блоки Х-хромосомы по цитологической карге (Gatti, Pimpmclli, 1992), ЯО - ад-рышховый организатор, Цеп-цетромсра. Толстыми темными линиями показаны фаговые субклоны, тонкой - плазмцдный субклон рЗ 1, пунктир - фрагмент рестрикции Pstl, содержащий миникла-стер А целиком. Незакрашенные стрелки обозначают Stellate гены. А, В и С - миникластеры, ограниченные вставками в кластер Stellate. Незакрашенные прямоугольники обозначают анонимные вставки в кластер, темный прямоугольник, фланкированный стрелками, - ретротраяспозон. Серыми стрелками показаны псевдогены рДНК. В нижней части рисунка показана сгрустура левой части клона DY8. 4/1, \|/2, 4/3 обозначают три обнаруженных в исследуемом районе фрагмента рДНК, где 4/I8S, iy28S, vyETS, ц/ЯЫ - поврежденные последовательности генов рРНК, транскрибируемого спейссра и вставка в рибосомалькые гены типа II соответственно. Заштрихованный прямоугольник показывает левое плечо YAC-векгора, прерывающееся клональным NotTcaräoM.. N - Noil, R -EcoRl, H - HinäSO, X -Xba\, Xh-Xhol, G - ügttl, P - Pstl.

Клонированный район содержит протяженный тандемный кластер генов Stellate, разделенный вставками на мшшкластеры А, В и С (Рис. 1). Самая крупная из вставок является ретротранспозоном. Слева от Stellate расположены два псевдогена рДНК: V|/i, прилежащий вплотную к левому плечу вектора YAC5, и \у2; псев-

догены разделены анонимной последовательностью (~10т.п.н) с участками, проявляющими слабую гомологию (58%) с сателлитной ДНК. Третий псевдоген рДНК, 1|Уз, локализован в правой части клона DY8, вблизи правого плеча вектора.

Все рестрикционные фрагменты DY8 обнаруживаются в геномной ДНК D.melanogaster, то есть артефакты клонирования, свойственные YAC-библиотекам, отсутствуют.

Рибосомалыше псеадогелы.

Последовательности секвенированных фрагментов рДНК сравнивали с функционирующим геном pPHK (Tautz, 1988). Два псевдогена рДНК локализованы слева от кластера генов Stellate (Рис.1), этот район полностью секвенирован за исключением фрагмента Xhol/Pstl (7т.п.н.). Больший секвенированный рДНК (vj/j) фрагмент удален от Ste-кластера на Ют.п.н., включает основную часть транскрибируемого спейсера (vj/ETS), 18S рДНК (i|/18S), фрагмент 28S рДНК (v(/28S) и вставку в рибосомальные гены второго типа (v|/RII) (Рис.1). \j/ETS прерывается последовательностью, не обнаружившей гомологии с последовательностями GenBank. Фрагмент 18S рДНК (V|/18S) слит с сильно дивергировавшей последовательностью VJ/28S за счет протяженной делеции, 2396н.п., затрагивающей 3'-область 18S рДНК, 5.8S рДНК и 5'-область 28S рДНК. Делеция 1594н.п., затрагивает Зн.п. 28S рДНК и 5' область RII инсерции, последовательность vj/RTI обрывается левым плечом вектора YAC5 (Рис.1). Другой, фрагмент (510н.п) 18S рДНК (щ) расположен вблизи от основного кластера Stellate (Рис.1). Третий псевдоген (\|/3) локализован в правой части DY8, он несет вставку RII в 28S гене. Рестриктная карта (~10т.п.н.) и частичное секвенирование 350н.п. участка 18S области не выявили отличий от канонического гена рДНК.

Особенности последовательностей псевдогенов 18S рДНК.

V|/j: \|/G1 (vyETS + V|/18S) несет делеции: четыре 1н.п„ две 2н.п., 14н.п. и 40н.п.;

инсерции: 1н.п. и 4н.п.; и 36 нуклеотидных замен. Учитывая такое большое коли-

чесгво повреждений, а. также отсутствие промоторного района, можно говорить о Vj/Gl, как о псевдогене. Основываясь на плотности обнаруживаемых повреждений, его последовательность можно условно разбить на пять участков (А - Е). Два участка (В и D) фактически лишены отличий от канонического варианта 18S, тогда как повреждения сконцентрированы в районах А, С и Е (Рис.2).

I.III III lllllllllll

%

¥28S VR2

Рве. 2. Диаграмма распределения нуклеотидаых замен и повреждений в псевдогенах рДНК. Обозначение псевдогенов и районов А, В, С, О, Е, резко различающихся по плотности повреждений, даны в соответствии с текстам. Цифрами обозначено количество делегированных или инссртнро-ваииых нуклеотидов.

Участок А (492н.п.), включающий V|/ETS и 5'-конец VJ/18S, несет 21 замену и две нуклеотидные делеции, В (821н.п.) содержит лишь одну замену, участок С (206н.п.) насыщен заменами и другими повреждениями, район D (392н.п.) содержит одну замену и «лишний» нуклеотид С (наличие которого, возможно, отражает нормальный полиморфизм функционирующих 18S генов, так как большая часть эукариотических reHOBl8S рДНК несет эту вставку (Neef, et al., 1.990)). Следующий участок Е (277н.п.) по количеству повреждений близок к примыкающей к нему сильно дивергировавшей последовательности 28S рДНК.

Из приведенных данных следует, что последовательность VJ/G1 является мозаичной по характеру распределения повреждений, плотность которых на соседних участках варьирует в 10 - 50 раз. Образоваться подобная структура могла скорее всего в результате нескольких актов рекомбинации между генами и псевдогенами

18S рДНК. По-видимому, события имели характер генной конверсии между удаленным и дивергировавшим псевдогеном и последовательностями основного кластера рДНК.

VJ/2Î 1|/2 представляет собой небольшой фрагмент (510н.п.) 18S рДНК, соответствующий части района В в IJ/G1. Здесь обнаружено 9 замен и инсерция 4н.п. (Рес.З). 6 из 9 замен интересны тем, что соответствующие нуклеотидные позиции встречаются в 18S генах других организмов (Рис.2), в том числе Mosquito, Physantmpolycepkalum и Plasmodium (Neef, et al., 1990). Возможно, V|/2 - это фрагмент 18S гена, который ранее функционировал и сохранился в удалении от кластера как вариант, который потенциально может использоваться для коррекции нормальных генов.

Таким образом, псевдогены рДНК не исключены из рекомбинации, как предполагалось ранее (Brownell, et al., 1983), а могут взаимодействовать с нормальными генами. Среди псеедогенов сохраняются варианты ранее функционировавших последовательностей (своеобразный молчащий генетический банк), которые в результате рекомбинации с функционирующими генами рДНК могут быть источником новых вариантов последовательностей рДНК.

Гетерохроматический кластер генов Stellate.

Гены Stellate в геноме D.melanogaster линии Батуми L.

Количество копий генов Stellate (Ste) на гаплоидный геном сильно варьирует среди линий D.melanogaster (от 5 до 200). Линии, использованные в этой работе, содержат небольшое количество Ste-повторов (30 - 35 на гаплоидный геном).

Гены Stellate, клонированные в DY8, организованы в правильный тандем-ный кластер, состоящий из 22 - 23 повторов (Рис.1). Вставки размером 1.3т.п.н., 4.5т.п.н. (анонимные последовательности, не обнаружившие гомологий в GenBank банке) и ретротранспозон (8.5т.п.н.) разбивают тандем на три миникластера (Рис.1).

Тандемный кластер генов Stellate стал для нас модельным объектом изучения особенностей гомогенизации повторов внутри одного хромосомного локуса. Гены Stellate клонировали в плазмиду и секвенировали..Последовательности сравнивали с ранее опубликованной последовательностью Stellate, локализация которой в геноме неизвестна (pSX83.4) (Livak, 1990). Если нуклеотидная последовательность копии ничем не отличалась от ранее секвенированных, то ее исключали из дальнейшего анализа. Полученные данные схематически представлены на Рис.3. Всего в исследуемом районе секвенировано 12 полиморфных копий: семь из миникластера А, три из миникластера В и две из миникластера С. Большая часть генов района содержит ряд характерных замен («паттерн» замен), отражающих их общее происхождение или гомогенизацию (область сигнала поли-аденилирования, две замены в межгенном спейсере, одна в первом интроне и две замены во втором экзоне, приводящие к аминокислотным заменам Asn -> Ser и Arg —> Gin (Рис.З)). Особенно заметно сходство копий миникластера А, несущих не более 1-2 отличий друг от друга. Выделяются лишь копии, расположенные по краям миникластера (14_4, 34_2): копия 14_4, прерванная вставкой во втором экзоне, больше похожа не на соседние с ней повторы, а на pSX83.4; 34_2, расположенная на левом краю кластера, прервана фланкирующей кластер ДНК, но на оставшихся 212н.п. плотность замен выше, чем у любой другой копии (4 замены и отсутствие свойственной всем генам кластера замены Arg —> Gin). Гены миникластера В имеют общий с генами миникластера А «паттерн» замен (например, в области сигнала полиадснилирования), но уровень полиморфизма у них гораздо выше (6 - 21 индивидуальных отличий на ген). Копии миникластера С, отделенные от остальных вставкой ретротранспозона, между собой различаются лишь тремя заменами, но общий «паттерн замен» у них иной, чем у генов миникластеров А и В (область сигналов полиаденилирования, вставка TT, четыре замены в межгенном спейсере).

Stellate

варианты

Район Нугаеошдные Псншшг ? PSX83.4

14 4

14 1

А 14 S 34 1 34 4 14 15

В 3 3

С 1 8 1 15

В 3_8 3 12

А 34 2<;

PSX8 3.4 варианты

Сигналы полиаденилирования

Интрон 2

-единица секвенирования

1.150 bp Межгенный спейсер__нитрон i

А А

Т А т **А Т G T G Т

**

А Т А **G с

А Т А **G с

А Т А **G с

А Т А **G с А

А Т А **G с

А т А **G с

А IT Г с А G

А TT T с А G

А т А + * G

А т А **G A с

AT G Т G

S

т т

т т с

с с с с с с

С G А Т

Интром 2

■Vе

Asn Агд

А GOG G &

А

G А

G А

G G А

G G А

G А

G G А

G А

G Т А

G Т А

Вставка <*

Вставка ретротранспозона

анонимная последовательность

ТА А

Аминокислотные замены:

lb D N MV G S

E-R-G d-Y-S

R К

a Q

3-

(суммированы)

Рис. 3. Полиморфизм Stellate повторов. Последовательность генов представлена в пермугированном виде в соответствии со стратегией клонирования и секвенирования. Распределение нуклеогидных и аминокислотных замен приведено по длине гена вне масштаба в сравнении с копией (pSX83.4) опубликованной в работе К. Livak (Livak, 1990) - верхняя строчка, »-обозначает делению. Закрашенные и пустые прямоугольники изображают кодирующую и некодирующую части гена соответственно. Общие для всех генов замены заключены в рамку. Буквы в левой части рисунка указывают мн-никластер из которого клонирован повтор, а первое число в названии клонов - номер фагового субклона. G - В gill. Аналогичные аминокислотные замены изображены жирными буквами.

Особо выделяется копия из миникластера В, 3_8, по уровню полиморфизма значительно превосходящая все щученные Ste-варианты (21 замена): в межгенном спейсере на участке примерно в ЮОн.п. содержится 11 Т —> С замен, это позволяет предполагать акт конверсии с другим Ste-содержащим локусом.

Среди проанализированных копий Ste-генов не обнаружено повреждений ОРТ, за исключением двух краевых повторов миникластера А. Из 14 обнаруженных вариантов аминокислотных замен 8 - представлены синонимическими или аналогичными, следовательно изменчивость кодирующих участков генов Stellate находится под контролем естественного отбора.

Полученные данные по А (! р

,, вставки Рвтротрамспоэон

гомогенизации повторов Stellate -------------

представлены на схеме (Рис.4). Тандемный кластер генов Stellate разбит вставками; на три миникластера, в которых гомогенизация идет по-разному. Наи- Рис.4. Структура кластера генов Stellate (стрелки) более эффективно гомогенизи- с указанием предполагаемых «актов гомогениза-руются копии большего миник- ции» и конверсии, ластера А, состоящего из 14 генов. Гены соседнего миникластера В дивергировали сильнее, но сохранили общий с генами миникластера А «паттерн замен», повторы миникластера С, отделенные от остальных вставкой реггеротранспозона, отличаются особым «паттерном замен» и, по-видимому, исключены из гомогенизации. Расположенные вблизи кластера Stellate фрагменты рДНК демонстрируют, насколько интенсивно идет конверсия в данном районе гстерохроматина, по одному псевдогену xj/i рекомбинация прошла минимум 3 раза. Следы конверсионных событий обнаружены и в повторе Stellate миникластера В, это позволяет предположить, что гомогенизация гетерохроматических повторов достигается через конверсию.

Дивершрошмшие копии Каннерсиошый

Ретротранспозон X

Вставка (8.5т.п.н.) в межгенный спейсер кластера генов Stellate, сопровождающаяся дупликацией 5п.н. сайта-мишени (AGAAC), представляет собой ранее не описанный ретротранспозон, ограниченный длинными концевыми повторами (ДКП) по 272н.п. Фрагменты дивергировавших вариантов этого элемента были секвенированы Д. И. Нурминским (Nurminskiy, et al., 1994). Нуклеотидные последовательности обоих ДКП идентичны, следовательно, инсерция ретротранспозона - сравнительно недавнее событие в кластере Stellate.

В геноме линии Батуми L ретротранспозон локализован в основном в гете-рохроматине. Методом гибридизации in situ с хромосомами слюнных желез обнаружено три сайта, содержащих X в прицентромерных эухроматических областях: два в секции 42 и один в 40. Денситометрирование после southern-блот анализа показало, что на гаплоидный геном Батуми L приходится 20 - 25 копий X. Примерно столько же копий обнаружено в геномах других природных и лабораторных линий D.raelanogaster и геномах видов группы melanogaster. Исключение составляет D.mauritiana, в которой X амплифицирован и представлен примерно 30 -35 копиями на геном. Среди видов Drosophila большее всего копий элемента (40 - 50) содержит D.yakuba. Виды группы virilis несут уникальную последовательность, гомологичную телу элемента, но без env-обласги и ДКП.

Длинные концевые позторы протяженностью 272н.п., фланкированные инвертированным повтором TGTT, несут канонический сигнал полиаденилирования и промотор, лишенный «TATA бокса». На 5' конце ДКП расположены 3 невырожденных и 3 вырожденных тандемных повтора последовательности TCACCCGCTG и две палиндромные последовательности (Рис. 5в). К левому ДКП прилежит последовательность (18н.п.) гомологичная 3'-концу tRNATjT, которая, скорее всего, является районом, связывающим праймер при инициации репликации ретротранспозона.

Легкоплавкий ра0он

R 1 R

1=4«

TGTT

Л

В

иг

H X

1 GG

Н Н

В R

Gag

Pol

Сигнал

Предположительный полиаденилирования старт транскрипции ДАТАМ

ATCAGTGTA^\ \

ААСА

PBS

(tRNA7^)

tRNA'

Рис. 5. Структура ретротраиспозона X. А. Общий шин строении регротрансиозона X прямоугольники показывают - ОРТ, стрелки - ДКП. в - П, II - ЕсоШ, X - ХЬсЛ, II - ИМИ, В - Ватт.

B. Сгрунура ДКП. Стрелками изображен тандсмный повтор ТСАСССССГС и палиндромы. Указано вероятное место старта транскрипции (последовательность АТСАОТСЗТА).

C. е-пшилька в ¡'-области ретротранспозопа, содержащая праймер связывающий сайг (РВБ).

Тело элемента содержит протяженную открытую рамку трансляции (ОРТ) длиной 1591а.о. (1741-6454н.п.) для gag и pol полипротеинов (Рйс.5а). В 5' области примерно с 300 по 1800н.п. расположен необыкновенно большой «легкоплавкий район» (А/Т составляют ~ 70%, локально на участках в 100 - 200н.п. - до 95%). 5' область и часть левого ДКП на участке 520н.п. могут образовывать устойчивую шпильку, похожую на б-шпильку ретровирусов, необходимую для взаимодействия с факторами, инициирующими обратную транскрипцию (схематично представлена на Рис.5с).Две обнаруженные в З'-области небольшие ОРТ не имеют гомологий с env белками. Это позволяет считать Х-элемент ретротранспозоном, а не ретрови-русом.

Во второй трети ОРТ (4876-4802и.п.) обнаружен 26н.п. палиндром (GGCTTTTGCGATGCATCGCAAAAGGC), который может формировать в мРНК устойчивую шпильку. Возможно, эта последовательность связана с регуляцией экспрессии pol-области.

На уровне последовательности ДНК не удалось обнаружить достоверных гомологии. Исключение составляет область тандемных повторов в ДКП, сходная на 70% с регуляторной областью гена промежуточного фнламента А улитки Aplysia californica.

На уровне белковых последовательностей Х-элемент дает устойчивую гомологию с ОРТ ретротранспозона BEL D. melanogaster (Davis, et al., 1995) и рет-ротранспозона Telemac D.virilis (Vieira, et. al., 1997). Выявлена также локальная гомология с белками (gag, ревертаза, интеграза) регротранспозонов и ретровирусов.

Тапделшый кластер генов Stellate вызывает эффект положения white "mini-гена".

Фрагмент Ste-кластсра, содержащий шесть генов, а также последовательности, фланкирующие тандем слева, включая 4*2 (Рис. 1,6а), был переклонирован по сайтам BamHI/EcoRI в вектор pCaSpeR-AUG-pgal (Рис.ба). В полученной конструкции white "mini-ген" находится на расстоянии 2т.п.н от кластера Stellate ДНК. Этой конструкцией была трансформировала линия D.melanogaster Df(l)w67c23(2V, лишенная гена white. Во всех 13 линиях трансформантов наблюдалась мозаичная экспрессия гена white, характер которой различен и стабильно наследуется. Один

Мянмласгср А

Рис. 6. Эффект положения гена white, вызванный соседством с кластером генов Stellate. Левую часть кластера, несущую шесть Ste-повторов и псевдогеи 18S, субхлоиировалв из фата в вектор CaSpeR-AUG-p-gal по сайгам BamHI/EcoRI. Инвертированные повторы Р-элемента закрашены частично. Две короткие незакрашенные стрелки показывают вырожденные повторы (70н.п.) фланкируюпще кластер Stellate. У траисформавгов наблюдали мозаичную экспрессию маркерного white «mini-гена». Показан пример картины наблюдаемой мозаичной окраски глаза, затемнены нормально окрашенные участки (white4). G - Bglll, R - £coRI, X - Xbal, H - ЯшсИЦ, В - ВатШ.

из примеров обнаруженной мозаичносги представлен на Рис.бв. Методом гибридизации in situ с политенными хромосомами показана локализация вставок конструкции в различных эухроматических сайтах. С помощью soutHern-блот гибридизации показана стабильность встроившейся конструкции в геноме (Рис.7) (на то-

тапьной ДНК и на ДНК, выделенной из голов), по-крайней мере, в течение 8 поколений. Единственная линия, утратившая часть повторов (осталось менее трех), но сохранившая фрагмент рДНК (левая часть конструкции), фактически не давала мозаичной экспрессии. Следовательно, именно Ste-повторы вызывают эффект положения и сила подавления экспрессии white "mini-гена" прямо коррелирует с количеством повторов. В качестве контроля Df(l)w67c23C)y трансформировали конструкцией, из которой удалены все Ste-повторы, кроме одного. Получено четыре независимых линии-трансформантов и ни в одной не обнаружено мозаичности по white, а интенсивность окраски глаз во всех случаях была сильнее, чем у трансформантов с Ste-тандвмом.

CS--JCqCsl^CSIM<NOOCOK

СО CN СО ^ СОЮ^ О ^ <М <М «ФЮСО ^ ю

Рис.7. БоаЛеш благ гибридизация меченого 51е-зонда с фильтром, несушим ВатНШсоШ-персвары геномной ДНК трансформангов, и плазмиды (К), использованной для трансформации. Фрагмент 8т.п.и. показывает наличие вставки. Вверху - номера линий трансформангов. Разная интенсивность полосы, соответствующей вставке, обусловлена различиями числа гомо- и гетсрозигот по вставке в линиях мух, взятых для выделения ДНК. Показана утрата большей части вставки (стрелка) в линии 46.2.

Выводы

1. Показано наличие в гетерохроматине X хромосомы D.melanogaster протяженного кластера тандемно повторенных генов Stellate, кодирующих белок с высокой гомологией к Р-субъединице протеинкиназы СКП. Кластер прерван вставкой ретротранспозона в межгенный спейсер и двумя анонимными вставками в ОРТ одного из генов. Среди секвенированных 10 генов не обнаружено сбоев рамки трансляции и других существенных повреждений. Показано, что гомогенизация повторов эффективно идет между близлежащими генами. Эффективность резко снижается для краевых и поврежденных вставками Ste-повторов. Обнаружение в одном из повторов Stellate специфического кластера нуклеотидных замен позволяет предполагать возможность конверсионных актов с другими Ste-содвржащими локусами генома.

2. Секвенированы фрагменты рибосомалыюй ДНК (рДНК), находящиеся вне основного кластера и представляющие собой псевдогены. Неравномерная кластеризация нуклеотидных замен по длине псевдогена позволяет сделать вывод о множественных актах сегментной конверсии по уникальной последовательности рДНК псевдогена, удаленного от основного кластера рибосомальных генов.

3. Секвенирована полноразмерная копия нового ретротранспозона с длинными концевыми повторами, локализованного в прицетгромерном и интеркаляр-ном гетерохроматине D.melanogaster. SQuthem-блот анализ выявил единственную копию этого МЭ в геномах D.littoralis и D.lummei, тогда как у видов групп D.melanogaster и D.yakuba он представлен 30 - 50 копиями.

4. С использованием трансформации на основе Р-элемента показано, что небольшой фрагмент гетерохроматина, содержащий шесть повторов гетерохроматических генов Stellate, вызывает эффект положения мозаичного типа по эухрома-тическому гену white. Показана положительная корреляция между количеством повторов и степенью эффекта положения. Обнаружено, что характер распределения пятен мугантной (white) и окрашенной (white4) ткани на поверхности глаза стабильно наследуется и зависит как от количества Ste-повторов в конструкции, так и от сайта локализации вставки в геноме.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Tulin А.V., G. L. Kogan, D. Filipp, M. D, Balakireva and V. A. Gvozdev. 1997. Heterochromatic Stellate gene cluster in Drosophila melanogaster. structure and molecular evolution. Genetics. 146 (1): 253 - 262.

2. Benevolenskaya E. V., G. L. Kogan, A. V. Tulin, D. Philipp and V. A. Gvozdev. 1997. Segmented gene conversion as a mechanism of correction of 18S rRNA pseudogene located outside of рДНК cluster vaD. melanogaster. J. Mol. Evol. 44 (6): 646 - 651.

3. Gvozdev V. A., Kogan G. L., Tulin A.V. Heterochromatic repeats carrying 18S рДНК pseudogenes and Stellate genes in Drosophila melanogaster. Abstracts. 14th International workshop on the cell nucleus. 1995.

4. Gvozdev V. A., Kogan G. L., Tulin A.V., Kalmikova A. I. Stellate genes on the X-chromosome and their Y-linked supressor. 14th European Drosophila research conference. 1995.

5. Kogan G. L., Benevolenskaya E., Tulin A.V., Gvozdev V. A. Segmented gene conversion as a mechanism of 18S rRNA pseudogene correction in Drosophila melanogaster. Abstracts. 37th Annual Drosophila Research Conference. Town and Country Hotel San Diego, California April 27, 1996.

6. Tulin A.V., Kogan G. L., Gvozdev V. A. Tandemly repeated heterochromatic Stellate gene cluster in Drosophila melanogaster: structure and molecular evolution. Abstracts. 37th Annual Drosophila Research Conference. Town and Country Hotel San Diego, California April 27, 1996.