Структура и динамика вольт-сенсорного домена K+ канала KvAP по данным гетероядерной ЯМР-спектроскопии

Парамонов, Александр Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура и динамика вольт-сенсорного домена K+ канала KvAP по данным гетероядерной ЯМР-спектроскопии
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структура и динамика вольт-сенсорного домена K+ канала KvAP по данным гетероядерной ЯМР-спектроскопии"

На правах рукописи

ООЭ4В7531

Парамонов Александр Сергеевич

СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА К+ КАНАЛА КуАР ПО ДАННЫМ ГЕТЕРОЯДЕРНОЙ ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ

Специальность: 03.00.02 — Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва — 2009

003467531

Работа выполнена в лаборатории биомолекулярной ЯМР спектроскопии Учреждения Российской академии наук института биоорганичекой химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и на кафедре биоинженерии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Арсеньев Александр Сергеевич

Официальные оппоненты:

кандидат физико-математических наук Шенкарев Захар Олегович

доктор физико-математических наук Крупянский Юрий Федорович

доктор химических наук, профессор Сергеев Николай Михайлович

Ведущая организация:

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 14 мая 2009 года в 14 ч. 00 мин. на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория "Новая".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 13 апреля 2009 года

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Т.Е. Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследование строения и функций мембранных белков — одна из наиболее актуальных задач современной биофизики. Важным классом мембранных белков являются потенциал-зависимые катнонные (К+, Иа+, Са2+) каналы. Они участвуют во многих жизненно-важных клеточных процессах, включая регуляцию осмотического баланса, возбудимость мембран, передачу нервного импульса, и присутствуют в клетках практически всех организмов — от бактерии и архей до человека. Ключевым структурным элементом в механизме действия потенциал-зависимых каналов являются их вольт-сенсорные домены (ВСД), которые отвечают за потенциал-зависимую активацию, реагируя на изменения трансмембраиного потенциала конформационными перестройками. Изучение структуры катионных каналов и их ВСД интересно но ряду причин. Во-первых, это может помочь в понимании общих принципов протекания потенциал-чувствительных процессов в клетке. Так, структуры, гомологичные ВСД катионных каналов, были обнаружены в белках с принципиально отличной функцией и строением. В частности, потенциал-зависимые протонные каналы млекопитающих функционируют в виде димера субъедшшц, имеющих строение, схожее с ВСД. Потенциал-зависимая фосфатаза, обнаруженная у асцидий, имеет ВСД, ко-валентно связанный с цитоплазматическим ферментативным доменом. Во-вторых, знание структуры ВСД неоходимо для исследований, направленных на создание новых лекарственных препаратов. Известно, что мутации в генах К+, Са2+ каналов являются причиной некоторых наследственных заболеваний человека. ВСД ионных каналов являются мишеныо для различных токсинов животного и растительного происхождения, блокирующих потенциал-зависимую активацию. Это открывает перспективы создания новых лекарственных средств, действие которых направлено па модуляцию процесса потенциал-зависимой активации.

Объектом исследования в данной диссертационной работе являлся вольт-сенсорный домен потенциал-зависимого К+-каиала КуАР (ВСД-КуАР) из термофильной архебактерии Аегоругит регпгх. Имеющиеся на сегодняшний день структурные данные о ВСД-КуАР достаточно противоречивы. Три известные кристаллические структуры, полученные при разных условиях кристаллизации, сильно отличаются друг от друга. Было высказано предположение, что важную роль в стабилизации структуры ВСД-КуАР играет

мембранное окружение — только плоская бислойпая мембрана может обеспечивать нативную конформацию домена. Полученные методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) данные свидетельствуют, что структура изолированного ВСД-KvAP в бислойной мембране близка к структуре ВСД в составе гюлноразмерного канала в открытом состоянии.

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) — один из наиболее мощных методов структурного анализа. Он позволяет определять не только пространственную структуру изучаемых белков, но и их внутримолекулярную динамику. Для изучения мембранных белков этим методом требуется применение сред, моделирующих биологическую мембрану. Используемые в настоящее время мембрапомоделирующие среды (в основном, мицеллы детергентов) не во всех случаях обеспечивают сохранение нативной структуры исследуемого белка. Таким образом, выбор мембраномоделирующей среды является актуальной проблемой для современных ЯМР-исследовапий.

В литературе имеются данные о свойствах принципиально повой среды для солюбшшзацпи мембранных белков — так называемых липид-белковых панодисков (ЛБН). Наиодиски представляют собой фрагмент плоского ли-пидного бислоя (~160 фосфолшшдов), гидрофобные края которого экранированы от растворителя двумя молекулами амфифильного белка MSP (фрагмента аполипонротеина A-I из липопротеинов высокой плотности плазмы крови человека). Ранее ЛБН успешно применялись в исследованиях мембранных белков различными методами. Было показано, что ЛБН по своим свойствам наилучшим образом соответствуют биологической мембране и способны сохранять многие мембранные белки в нативном функциональном состоянии. Однако, примеров использования ЛБН для структурных ЯМР-исследований мембранных белков на сегодняшний день нет. Цели и задачи исследования. Целью работы являлось определение структурных и динамических характеристик изолированного ВСД-KvAP методами ЯМР высокого разрешения. Данная цель подразумевает решение следующих задач:

1. Подбор мембраномоделирующей среды для ЯМР-исследовапий ВСД-KvAP, обеспечивающей наилучшее качество ЯМР-спектров и сохраняющей структуру белка, наиболее близкую к нативной.

2. Получение отнесения сигналов ВСД-KvAP в гетероядериых ЯМР-спектрах.

3. Идентификация элементов вторичной структуры ВСД-КуАР но данным ЯМР.

4. Получение данных о пространственной структуре белка.

5. Определение характеристик внутримолекулярной динамики ВСД-КуАР.

Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в данной диссертационной работе, получены впервые:

1. Показана применимость ЛБЫ, созданных па основе липопротеппов высокой плотности человека, в качестве мембрапомоделирующей среды для ЯМР-исследований мембранных белков и пептидов.

2. Предложен новый метод подбора мембрапомоделирующей среды на основании сравнения спектров ЯМР изучаемого белка в различных средах со спектрами в Л ВН.

3. Показана и исследована зависимость структуры ВСД-КуАР от состава мембрапомоделирующей среды.

4. Получено практически полное отнесение сигналов ЯМР атомов основной цепи и большей части -атомов ВСД-КуАР в-комплексе с мицеллами ДФХ/ЛДАО (2:1).

5. Определена вторичная структура ВСД-КуАР в комплексе с мицеллами ДФХ/ЛДАО (2:1). Получены данные о его пространственной структуре.

С. Определены характеристики внутримолекулярной подвижности ВСД-КуАР в комплексе с мицеллами ДФХ/ЛДАО (2:1). Проведено сравнение существующих моделей потенциал-зависимой активации канала с полученными данными.

В данной работе разработан и успешно применен новый подход к определению пригодности мембраномоделирующнх сред для ЯМР-спектроскоппи мембранных белков, который предполагает сопоставление спектров белка в тестируемых детергентах и в ЛБН. Доказательство сохранения солюбилизи-ровапным белком нативиой структуры является одной из основных проблем в современных исследованиях. Таким образом, данный подход может найти широкое применение в ЯМР-исследованиях мембранных белков.

Полученные в работе значения химических сдвигов сигналов ядер 1Н, 13С, в спектрах ЯМР ВСД-КуАР могут служить отправной точкой при

его дальнейших структурно-динамических исследованиях, например, для получения структуры с высоким разрешением. Кроме того, отнесение сигналов основной цени необходимо для исследования механизмов взаимодействия КуАР с токсинами или для скрининга прототипов лекарственных средств, модулирующих потенциал-зависимую активацию.

Полученные данные о внутримолекулярной динамике ВСД-КуАР позволяют снять некоторые противоречия между разными моделями потенциал-зависимой активации канала КуАР.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались па XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2005" (Москва, 2005), международной практической школе Европейского молекулярно-биологического общества "Многомерный ЯМР в структурной биологии" (Иль-Чокко, Италия 2000), VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), 2-м и 4-м международном симпозиуме и летней школе "ЯМР в конденсированных средах" (Санкт-Петербург, 2005, 2007), XV международном симпозиуме "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Гурзуф, Украина 2007), 33-м конгрессе Европейских биохимических сообществ (Афины, Греция 2008), XX и XXI зимней международной молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва 2008, 2009), Работа также докладывалась на семинарах лаборатории биомолекулярной ЯМР-снектроскопии ИБХ РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 2 работы в реферируемых научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена па_страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав (обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения) а также заключения и

выводов. Работа проиллюстрирована_рисунками, содержит_таблицы.

Библиографический указатель содержит_источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и основные задачи работы, отражены научная новизна и практическая значимость работы.

В Главе 1 представлен литературный обзор, в котором отражены подходы к выбору мембраномоделирующих сред для ЯМР-исследовапий мембранных белков, дано описание свойств ЛБН, изложены современные представления о структуре ионных каналов и механизмах потенциал-зависимой активации, приведены данные о структуре ВСД-КуАР.

ВСД катионпых каналов состоят из спиральных трансмембранпых сегментов, традиционно обозначаемых 81-84. Методом рентгеноструктурного

Рис. 1. Структура ВСД-KvAP, определенная методом РСА. А,В — структуры полноразмерной субъединицы KvAP, полученные при кристаллизации с разными фрагментами антител: Fab (А) и Fv (В). В — кристаллическая структура изолированного ВСД-KvAP. Код в банке данных белковых структур (PDB) указан на рисунке.

анализа (РСА) была установлена структура канала KvAP в 3-х вариантах при различных условиях кристаллизации (Рис. 1). Были показаны значительные искажения в структуре, вызванные эффектом кристаллической упаковки. Было высказано предположение о том, что только плоская мембрана может стабилизировать нативную структуру ВСД-KvAP. Согласно современным представлениям, потенциал-зависимая активация капала происходит за счет перемещения положительно зар*жепных остатков Arg, находящихся в

спирали S4, иод действием электрического поля. Однако детальный механизм этого процесса до конца не изучен.

В Главе 2 изложены основные экспериментальные методики, используемые в работе. Наработка (в E.coli) и выделение ВСД-KvAP и его изотопно-меченных аналогов были проведены совместно со с.u.c. лаборатории инженерии белка ИБХ РАН, к.х.н. JT.H. Шипгаровой. Получение белкового компонента ЛБН (MSP) и сборка ЛБН были осуществлены совместно с u.c. лаборатории инженерии белка ИБХ РАН, к.б.н. E.H. Люкмаповой. 15М-меченный аналог Антиамебипа I был предоставлен заведующей УНЦ ИБХ РАН, к.х.н. Т.В. Овчинниковой.

В Главе 3 изложены основные результаты, полученные в работе.

Анализ мембраномоделирующих сред для ЯМР-исследования ВСД-KvAP

ВСД-KvAP состоит из 155 аминокислотных остатков, включая 6-His-tag на С-конце, и имеет, массу порядка 17.3 кДа. Его аминокислотная последовательность приведена ниже.

10 20 30 40 50

MARFRRGLSD LGGRVRNIGD VMEHPLVELG VSYAALLSVI VWVEYTMQL

60 70 80 90 100

SGEYLVRLYL VDLILVIILW ADYAYRAYKS GDPAGYVKKT LYEIPALVPA

110 120 130 140 150

GLLALIEGHL AGLGLFRLVR LLRFLRILLI ISRGSKFLSA IADAADKRSH6

Подбор мембраномоделирующей среды является одним из ключевых этапов в структурных исследованиях мембранных белков. Применяемая для ЯМР-исследований среда должна способствовать сохранению нативной структуры белка, в то же время обеспечивая стабильность образца и достаточное качество получаемых ЯМР-спектров. В настоящее время наиболее часто используемым мембранным миметиком являются мицеллы детергентов и лшшд-детергентные бицеллы. Нами был проведен анализ широкого ряда мицеллярпых сред на пригодность для солюбилизации ВСД-KvAP. Применимость каждой из исследуемых сред оценивалась по качеству 1H/15N корреляционных ЯМР-спектров HSQC, полученных для 151М-мечепного аналога белка, встроенного в соответствующую среду.

Спектры 1H/15N-HSQC для контроля мембраномоделирующей среды были накоплены на спектрометре DRX-500 (Bruker) с рабочей частотой по протонам 500 МГц при температуре 45°С. Были протестированы мицелляр-

иые среды из детергентов с различными зарядами полярной группы и длинами жприокислотной цепи. Использовались следующие среды:

о анионные лизолиниды — лизональмитоил- (ЛПФГ) и лнзомиристоил-фосфатндилглицерол (ЛМФГ), анионный детергент додецилсульфат натрия (ДСН);

о цвиттерионпые бицеллы, состоящие из дпмирпстоилфосфатидилхолнна и дигексапоилфосфатидилходппа (ДМФХ/ДГФХ, 1:4, q—0.25), цвптте-рионпый детергент додецилфосфохолин (ДФХ);

о незаряженный детергент додецилмальтозид (ДДМ), слабокатионный детергент лаурилдодецпламиноксид (ЛДАО);

о различные смеси детергентов (ДФХ/ЛДАО, ДМФХ/ДГФХ/ДМФГ, ДФХ/ЛМФГ);

о также была протестирована одна из наиболее часто используемых изотропных мембраномодслирующих сред — органический растворитель трпфторэтанол (ТФЭ).

Дополнительно в каждом образце исследовалась зависимость качества спектров от рН среды в диапазоне от 4.5 до 7.0.

В мицеллах анионных лизолинидов наблюдались достаточно качественные ЯМР спектры ВСД-КуАР с однородной шириной липни (Рис. 2 Д). Вид и качество спектров слабо зависели от рН, однако при рН, близких к нейтральным, некоторые сигналы в спектре исчезали. Гидродинамический радиус Стокса (И-я) комплекса мицелла-белок, оцененный но измеренному коэффициенту трансляционной диффузии (Д ~ (1.00±0.03) • при 30°С), составил ~27 А. Полученные данные свидетельствовали о том, что лизолиниды могут быть выбраны в качестве мембраномоделирующей среды для продолжения структурных исследований ВСД-КуАР. Спектры ВСД-КуАР в мицеллах ДСН оказались по качеству значительно хуже, чем в лизолипидах. Возможно, причиной этого является увеличение размера комплекса мицелла/белок (Д ~ (0.81 ± 0.03) • НГ10^, 30°С, что соответствует Ня~34 А), обусловленное тем, что с белком связывается большее количество молекул детергента.

Дальнейшие исследования зависимости качества спектров от среды показали, что в комплексе с мицеллами цвиттерионных, незаряженных и слабо-катиопных детергентов также можно получить спектры ВСД-КуАР удовле-

11 10 9 8 7 11 10 9 8 7 11 10 9 8 7

Рис. 2. Выбор лгембранолгоделирующей среды для исследования ВСД-КуАР. А-Ж — Спектры 'Н/^К-НЭС^С (500 МГц, 45°С) ^-меченного ВСД-КуАР в окружении мицелл детергентов и в ТФЭ. Тип и рН среды указаны на рисунке. 3 — Спектры кругового дихроизма (КД) ВСД-КуАР в различных средах.

творительного качества, однако общий вид спектра в этих средах существенным образом отличался от того, который наблюдался в анионных детергентах. В ДФХ, Л ДАО, ДДМ и бицеллах ДМФХ/ДГФХ спектры ВСД-КуАР оказались схожи друг с другом и характеризовались большей, чем в анионных средах дисперсией сигналов, а также неоднородностью ширины линий, указывающей на наличие процессов коиформационного обмена в молекуле ВСД-КуАР. Зависимость от рН оказалась более выраженной, чем в анионных детергентах. Наилучшие спектры в ДФХ и бицеллах наблюдались при рН, близких к нейтральным. В ЛДАО и ДДМ, напротив, некоторые сигналы, наблюдаемые при рН~5.0 оказались не видны при рН~7.0 (Рис. 2 А,Б).

Из всех мембраномоделирующих сред на основе цвиттерионных и незаряженных детергентов наиболее подходящими для дальнейших структурных исследований по качеству спектров ВСД-КуАР оказались ДФХ при рН~7.0 и ЛДАО при рН~5.0 (Рис. 2 А,В). В этих средах коэффициент трансляционной диффузии Д был в среднем равен (0.95±0.03) • что соответствовало

Т1н~29 А. Однако, в мицеллах ДФХ наблюдались не все ожидаемые (из 13) сигналы в области Иу, а образцы в ЛДАО оказались нестабильными — через 1-2 педели после приготовления белок выпадал в осадок. Качество спектров в бицеллах ДМФХ/ДГФХ и мицеллах ДДМ было значительно хуже, чем в

ДФХ и ЛДАО но соотношению сигнал/шум, что, видимо, было вызвано большим размером комплекса мицелла/белок (масса свободных мицелл ДДМ и бицелл ДМФХ/ДГФХ составляет до 60 кДа и 11я~35 А).

Было показано, что добавление в мицеллы ДФХ как отрицательно заряженного ЛМФГ (до 20%), так ц ЛДАО (до 50%) значительно улучшало качество спектров при рН~5.0, в частности, возрастало количество наблюдаемых сигналов (Рис. 4 В). В бицеллах ДМФХ/ДГФХ при добавлении 20% димирц-стоилфосфатпдилглицерола (ДМФГ) также отмечалось некоторое улучшение спектра и появление ранее не наблюдаемых сигналов.

Для дополнительного контроля среды нами был получен ЯМР спектр 1аМ-мечешюго ВСД-КуАР в органическом растворителе трпфторэтаиоле (ТФЭ). Спектр в данной среде характеризовался невысокой дисперсией сигналов и однородной шириной линий. По этим показателям и общему виду спектр в ТФЭ был более близок к спектрам, наблюдаемым в анионных детергентах (Рис. 2 Ж).

Помимо ЯМР спектров ВСД-КуАР, для контроля среды мы использовали данные о вторичной структуре, полученные пз спектров КД. Значительных различий в спиралыгости белка по данным КД для всех протестированных детергентиых сред не наблюдалось, она составляла в среднем ~60% (это значение согласуется с ожидаемым из кристаллической структуры, ~63%). Следует обратить внимание, что в ТФЭ по данным КД доля спиральных элементов во вторичной структуре была значительно выше (~80%) (Рис. 2 3).

Как известно, спектр 1Н/15К-Н8рС очень чувствителен к структуре белка и отражает вторичную, третичную и четвертичную структуры молекулы. Обобщая полученные при подборе условий данные, можно выделить два типа ЯМР спектров ВСД-КуАР. Один из них наблюдался в окружении анионных детергентов, второй — в мицеллах цвиттерионпых, незаряженных п слабокатионных детергентов и различных смесей на основе цвпттериопных детергентов. Данное различие, очевидно, обусловлено разными конформа-циямп, которые принимает молекула ВСД-КуАР в этих средах. При этом, данные КД-спектросконин говорят о схожести вторичной структуры во всех протестированных средах, за исключением ТФЭ.

Несмотря на очевидные различия по общему виду "анионных" и "цвит-терионных" ЯМР спектров, хорошее качество спектров, достаточное для продолжения структурных исследований, было достигнуто в обоих случаях (на-

пример, в ЛПФГ при рН 5.0 или в ДФХ при рН 7.0). Таким образом, возникла проблема выбора между двумя типами спектров: необходимо было ответить иа вопрос, какой из них отвечает нативной коиформации белка? Зачастую при ЯМР-исследованиях белков для доказательства нативности структуры используются наблюдения за функциональной активностью изучаемого белка в выбранном окружении. К сожалению, природа объекта данного исследования не позволяла провести какие-либо функциональные тесты. Поэтому для окончательного выбора мембраномоделирующей среды мы использовали косвенный метод — наблюдение спектра белка в составе лшшд-белкового мембранного наподиска (ЛБЫ).

Мицеллы детергентов и изотропные бицеллы — наиболее часто применяемые для структурных исследований мембраномодслирующис среды — хотя и обеспечивают в некоторой степени подобие биологической мембраны, на самом деле достаточно сильно отличаются от нее по своим свойствам. Характерные для них практически нулевое латеральное давление и высокая кривизна поверхности могут стать причиной неправильной упаковки и даже полной потери третичной структуры мембранного белка. Альтернативной мембраномоделирующей средой являются ЛБН. Из литературных данных известно, что ЛБН но своим свойствам наилучшим образом соответствуют биологической мембране, сохраняя функциональную активность многих белков. Однако, до настоящего времени в структурных исследованиях методами ЯМР высокого разрешения ЛБН не применялись.

Проведенные в рамках данной работы теоретические расчеты показали, что время корреляции вращательных движений (тд) для дискоидальной частицы с размерами, соответствующими размерам ЛБН (10x4 им), должно составлять ~00 не (45°С). Это соответствует глобулярному белку весом ~150 кДа, что делает ЛБН и встроенные в них белки в принципе наблюдаемыми методом ЯМР при условии использования методов оптимизации релаксации (TROSY) и современных высокопольпых ЯМР спектрометров.

Впервые применение ЛБН для ЯМР-исследований мембранных белков было показано в рамках этой диссертационной работы. В качестве тест-системы был выбран небольшой и хорошо изученный пептидный антибиотик Антиамебин I из гриба Emericellopsis minima.

Исследование Аитиамебина I в комплексе с ЛБН методом ЯМР

Аптшшсбии I (ААМ-1) — мсмбраиоакивпый антибиотик, относящийся к классу пептапболов, продуцируемый грибами из рода Етспсс11ор81$. ААМ-1 представляет собой пептид длиной 1С аминокислотных остатков (Ас-ПЛШСШиОЦЛОиРГ-ОН), включающих в себя ряд нестандартных остатков (и — оамнноизомасляная кислота, Л — Б-нзовалнн («-этилалашш), 0 — Ь-1-транс-гидроксипролин). Пептид плохо растворим в воде и состоит из одной изогнутой спирали, периферически взаимодействующей с мембраной. Наши исследования показали, что в растворителях с низкой полярностью (метанол) Н-концевой фрагмент ААМ-1 совершает быстрые обменные переходы между коиформациями право- и левозакрученной Зю-сппрали. При связывании с поверхностью бицеллы ДМФХ/ДГФХ пептид приобретает жесткую иравозакрученную спиральную конформацию.

Нами было проведено исследование структуры ААМ-1 в комплексе с ЛБН методом ЯМР. 15К-меченный ААМ-1 в виде раствора в ментаноле (малого объема) был добавлен к препарату ЛБН, состоящих из цвиттериониых (ДОФХ, ДПФХ, ПОФХ) и анионных (ДОФГ) лшшдов. В образцах, приготовленных па основе цвиттериониых лшшдов, наблюдалось помутнение раствора, сопряженное с преципитацией пептида. В тоже время, раствор ААМ-1 в комплексе с ЛБН из апиопиого ДОФГ оставался прозрачным. По данным динамического светорассеяния и гель-фильтрации, гидродинамический радиус ЛБН ДОФГ (4.4 им) не изменялся при встраивании молекулы ААМ-1.

^/^М-корреляционные спектры (Рис. 3) 1аМ-меченного ААМ-1 были получены в четырех различных окружениях — ЛБН (ДОФГ), бицеллах ДМФХ/ДГФХ, мицеллах ДСН и ЛМФГ. Положения сигналов ААМ-1 в ЛБН и бицеллах были практически одинаковы, несмотря па то, что ЛБН были сформированы из отрицательно заряженных лшшдов, а бицеллы — из цвиттериониых. В то же время, спектры в анионных детергентах ЛМФГ п ДСН сильно отличались от наблюдаемых в бицеллах и ЛБН. Сигналы ААМ-1 в составе ЛБН оказались значительно шире (полуширина Дг^1Нл' ~40-60 Гц) по сравнению со спектром в бицеллах ( Дг/^ ~30 Гц), что обусловлено большим размером ЛБН по сравнению с мицеллами или бицеллами.

Изучение топологии ААМ-1 в составе ЛБН было проведено с использованием лшшд-растворимого парамагнитного зонда (10-доксилстеарата). Наблюдаемое относительное изменение интенсивностей сигналов ААМ-1 в спек-

о--I ■

§" Ь и 9 ЛБН ДОФГ

¿♦«Г

ЛМФГ"

Н, м.д.

Рис. 3. Данные о структуре Антиамебина-1 (ААМ-1) в комплексе с ЛБН. А—В — Спектры 15М-меченного ААМ-1 в различных средах, полученные при 45°С, 700 МГц, рН 7.0. Черным цветом во всех случаях обозначен 'Н/^К-НЭС^С спектр ААМ-1 в бицеллах ДМФХ/ДГФХ (1:4), красным - 1Н/151*-ТЯ08У спектр АЛМ-1 в ЛБН с ДОФГ, синим и зеленым -'Н/^К-НЗдС спектры в мицеллах ДСН и ЛМФГ соответственно. Г — Топология связывания молекулы ААМ-1 с поверхностью бислоя в ЛБН/ДОФГ. Показано относительное изменение амплитуды сигналов 1НЛГ в спектре 'Н/^К-ТЯОЗУ ААМ-1 в ЛБН/ДОФГ при добавлении 16~доксилстеарата. Также приведено полученное с помощью этих данных положение молекулы ААМ-1 относительно поверхности бислоя; Д — модель комплекса ААМ-1/ЛБН.

трах, вызванное добавлением парамагнитного зонда, позволило установить характер связывания пептида с бислоем. Пептид связывается с поверхностью бислоя параллельно его поверхности, а Г\Г-конец заглублен внутрь вследствие изгиба спирали (Рис. 3 Г). Данный результат согласуется с механизмом действия ААМ-1 на биологические мембраны и, по-видимому, соответствует положению молекулы пептида на мембране в отсутствие трансмембранного потенциала.

Таким образом, полученные нами данные показали, что ЛБН являются перспективной мембрапомоделирующей средой для ЯМР-исследований мембраноактивных пептидов. Их использование позволило сделать вывод о структуре ААМ-1 в составе липидного бислоя и определить топологию связывания пептида с мембраной в отсутствие потенциала.

]0i ; ПО

■A

' 11 »4 . <

■ ■ "»ЯК-

дфх лдао

ii 10 ч к 7 ii 10 9 « 7 ii 10 9 8 7 'н, мл.

Рис. 4. Спектры "H/^N-TROSY (700 МГц, 45°С, рН 7.0) 15К-меченного ВСД-KvAP в комплексе с ЛБН. приготовленными на основе ДМФГ (А) и ДМФХ (Б). Для сравнения приведен спектр в мицеллах ДФХ/ЛДАО рН 4.7 (В). Г, Д — схематическое изображение комплексов ВСД-КуАР /ЛБН (Г) и ВСД-KvAP/мицелла (Д).

ЯМР-исследование ВСД-KvAP в комплексе с ЛБН

1оМ-меченный ВСД-KvAP был встроен в ЛБН различных типов: состоящих из анионных липидов ДМФГ, а также цвиттериопных ДМФХ. По результатам количественного аминокислотного анализа, спектрофотометрии в УФ-диапазоне (А—280 им) и оценки количества липидов по ЯМР спектрам была определена стехиометрия комплексов ВСД-КуАР/МБР/ДМФГ. Полученные значения свидетельствовали, что на один комплекс белок/ЛБН приходилась одна молекула ВСД-KvAP, две молекулы MSP и около 100 молекул ДМФГ. При этом в образце присутствовала незначительная примесь "пустых" ЛБН, не содержащих ВСД-KvAP. и свободного MSP.

Гидродинамические характеристики комплекса ВСД-КуАР/ЛБН были определены по данным гель-фильтрации (R#~48A) и диффузионных ЯМР измерений (Д ~ (0.60 ±0.03) • 10~10^, Ыя~43А). Вращат ельная диффузия ВСД-IvvAP в составе комплекса с ЛБН была охарактеризована с использованием релаксационных данных (константа интерференции релаксационных процессов ядер loN rjxy = 118 с-1, гд~52 не). Результаты, полученные тремя различными методами, соответствовали частице с диаметром ~9.5 нм и хорошо согласовывались друг с другом, указывая на то, что комплекс ВСД-KvAP/ЛБН реориентируется в растворе как единое целое.

Для исследования структурных особенностей ВСД-KvAP в комплексе с ЛБН различных типов (приготовленными на основе ДМФГ н ДМФХ) были получены спектры ^/^N-TROSY белка. Несмотря на различие в зарядах используемых лшшдов, в обоих вариантах ЛБН наблюдались схожие спектры (Рис. 4). Однако, из-за наличия обменных процессов в молекуле, некоторые сигналы ВСД-KvAP в комплексе с ЛБН ДМФХ были значительно уширены, что, видимо, было вызвано более плотной упаковкой мембраны ДМФХ но сравнению с ДМФР По общему виду спектры, наблюдаемые в ЛБН, оказались близки к спектрам в цвиттерионных детергентах. В частности, практически полностью совпадали частоты характерных слабопольных (но 1Н) сигналов. Учитывая близость биофизических свойств фрагментов мембран ЛБН и природных биологических мембран, мы предположили, что именно этот тип 1H/15N спектров соответствует пативпой пространственной структуре ВСД-KvAP. К сожалению, большой размер комплекса ВС Д-К\'АР/ЛБ11, и, как следствие, широкие линии сигналов и низкая чувствительность спектров делали невозможным применение стандартных методов ЯМР для структурных исследований ВСД-KvAP в составе ЛБН.

Исходя из того, что вид ^/^N-HSQC спектра полностью отражает вторичную и третичную структуру белка, мы предположили, что ЛБН можно заменить мембраномоделирующей средой, обеспечивающей спектры схожего вида и, одновременно, достаточного качества для дальнейших структурных исследований. Анализ всех полученных спектров показал, что лучше всего этим условиям удовлетворяют мицеллы смеси детергентов ДФХ и ЛДАО при рН=4.7.

Отнесение сигналов в спектрах ВСД-KvAP

Для отнесения сигналов использовали три образца ВСД-KvAP с разными тинами введения изотопных меток (15N, 2H/13C/loN, 13C/15N). Образцы были приготовлены путем растворения сухой навески белка в водном растворе смеси ДФХ/ЛДАО. Во всех трех образцах конечная концентрация белка составила 1 мМ при молярном соотношении ВСД-KvAP ДФХ: ЛДАО ~1:100:50. Необходимый набор спектров ЯМР был получен на спектрометре Avance-700 (Bruker) с рабочей частотой по протонам 700 МГц, при температуре 42°С.

- 106

- 108

- 110

- 112 . с*

- 114 z

- 116 - 118 ■ 120 - 122

124 126

Рис. 5. Спектр 1H/15N-TROSY (700 МГц, 42°C) 2Н/15К-меченного ВСД-KvAP в мицеллах ДФХ/ЛДАО (2:1), рН 4.7. Обозначено полученное отнесение. Отдельно показан увеличенный участок с сильным перекрыванием сигналов.

Использование дейтерироваипого ВСД-KvAP в сочетании с экспериментальными методиками, оптимизирующими время поперечной релаксации loN (TROSY), позволило значительно обузить линии в спектрах и наблюдать практически все спиновые системы белка в спектре 3D HNCA-TROSY. Однако, в других спектрах тройного резонанса многие сигналы (до 30%) были не ТаблиЧа Результаты отнесения сигналов

видны. Для отнесения мы использовали данные о 1HJV-1HÍV контактах в спектрах NOESY-15N-HSQC и информацию о последовательных контактах, полученную из 3D HNCA-TROSY. Отнесение атомов 13CS проводили по спектру HNCACB-TROSY. Это позволило получить практически полное отнесение для атомов основной цепи и большинства 13С3-атомов (Табл. 1). На Ри-

f^j Л.65 ' S32

* L136 R126

D143 иоепгл

R12J , ' л.ф- Y 54

V- .¡г D20

я Jtüf, ^"V-f VM ñft.ín.iuP"» ' «m

\T -

еГ

,'RS

K136 A144

8.2 8.1

S139

T9o a

O O t

L97 A96

O fl

Ib4 „ L118 1Э4 '3 Mi o o

0° o L121 L1°!

R120 ' L128 c. L113

A104

L115 Q

A140 A142

II, м. i.

Количество ядер Ядро %

всего отнесено

IHJV 145 142 98%

15N 149 142 95%

13Са 149 142 95%

13С. 149 138 93%

13 СР 136 106 78%

сунке 5 приведен 1H/15N-TROSY спектр ВСД-KvAP и указано полученное отнесение кросс-пиков.

Вторичная структура ВСД-KvAP в мицеллах ДФХ/ЛДАО

Полученные в результате отнесения сигналов значения химических сдвигов позволили определить вторичную структуру ВСД-KvAP в мицеллах. Значения вторичных химических сдвигов (Д<5 = 50ь3 — ¿гс)1 Для атомов 13Са и 13С', характерные контакты ЯЭО 1Н^-1НА'в спектрах NOESY и данные о замедленном обмене амидных протонов с растворителем (отсутствие кросс-пиков между и протонами воды в спектрах NOESY) позволили идентифицировать 5 спиральных элементов, соответствующих 4-м спиралям, характерным для ВСД потенциал-зависимых ионных каналов (SI, S2, S3b, S4) и спирали-линкеру с нерегулярной структурой S23 (Рис. 6). Данные элементы вторичной структуры в общих чертах совпадают с присутствующими в структуре изолированного ВСД-KvAP, наблюдаемой в кристалле (код PDB 10RS).

Помимо присутствующих в кристалле спиралей, методом ЯМР было показано наличие короткого сегмента длиной в 4 остатка (Ilel8-VaL22), представляющего собой изолированный виток а-спирали, либо последовательность /3-изгибов. Этот элемент вторичной структуры, получивший название SO, не наблюдался в кристаллографических исследованиях ВСД-KvAP из-за высокой подвижности N-концевой части молекулы. В то же время, спираль SO ранее наблюдалась в некоторых К+ каналах семейства Shaker. Также данные ЯМР свидетельствовали о нарушении регулярности спиральной структуры в области между S23 и S3b (Lys89-Ile94), которая примерно соответствует спирали S3a, наблюдаемой в кристалле. Дополнительно было выявлено наличие гибкого линкера между спиралями S4 и S45, что отличалось от ситуации, наблюдаемой в кристалле, где эти два сегмента формировали одну протяженную спираль. Заметим, что сегмент S45 выполняет роль связки между вольт-сенсорным и норовым доменами в субъединице полноразмерпого канала KvAP.

Данные о пространственной структуре ВСД-KvAP

Значения вторичных химических сдвигов амидных протонов белка (Д^Н^) позволили определить особенности пространственной организации

1 Разница между наблюдаемым хим. сдвигом (<5,,/,.,) и характерным для случайной конформации (дгс)

MARFIШGLSDLGGBVRNIGDVMEHPLVELGVSYAALLSVIWWEYTMQLSGËYLVRLYLVDLЗLVIILWAD!ÍAYRAYKSGDPAGYVKKTLYEIPALVPAGLLALIEGHLAGLGLFRLVRLLRFLR:

Рис. 6. Данные о вторичной структуре ВСД-КуАР. полученные методом ЯМР. А — Спирали, идентифицированные е ВСД-КуАР. Для сравнения приведены данные о вторичной структуре, наблюдаемой в кристалле изолированного ВСД-К и полученные методом ЭПР для полноразмерного канала; Б — Обозначены остатки, для которых в спектрах \OESY на) между 1 \\д и протонами воды: В — Данные о контактах ЯЭО между амидпыми протонами. Показаны относительные между ^ соседних остатков (<Зш(и+1))< а также наличие контактов ЯЭО через один и два остатка ((¡NN(1,1+2) и <1ш(1>' Г — Вторичные химические сдвиги атомов 13Са и 13С' (Дй13Са, Д613С'); Д — Вторичные химические сдвиги амидных I Е — Интенсивности сигналов в спектре НМСО. Звездочкой (*) обозначены сигналы, сильно уширенные вследствие конфо

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140

Рис. 7. Особенности структуры ВСД-КуАР в комплексе с мицеллами. А — Фрагменты кристаллической структуры изолированного ВСД-КуАР (РБВ ЮКЗ). Зеленым цветом обозначены анидные протоны, имеющие сдвиг в слабое поле; Б — Участок кристаллической структуры изолированного ВСД-КуАР в районе межспиральных контактов. Видна связанная молекула воды и солевой мостик Аг^133-Акр62 Красным цветом указаны расстояния между атомами (А), наблюдаемые в кристалле, зеленым — контакты ЯЭО; В — Вторичные химические сдвиги амидпых протонов ВСД-КуАР. Обозначена характерная периодичность Дб)1 ПЛ\ наблюдаемая в спиралях.

ВСД-КуАР. Периодичность значений Д^Н^, хорошо заметная в сегментах Б1, Б2, ЭЗЬ, Б4. и Б45, свидетельствует о наличии изгиба у этих спиралей. Сравнение полученных данных с кристаллической структурой изолированного ВСД-КуАР (код РБВ КЖЭ) показало (Рис. 7 А), что в большинстве спиралей атомы с положительными (в слабое поле) сдвигами Д^Н^ находятся на вогнутых сторонах спиралей. Следовательно, направление изгибов спиралей ВСД-Кг'АР в кристалле и в мицеллах совпадают.

Аномально высокие значения вторичных химических сдвигов некоторых амидпых протонов (¡Д^Н^М м.д.) могут являться следствием электростатических взаимодействий (в том числе участие НЛ -группы в водородной связи) и/или сближенности с ароматическими группами (за счет эффекта кольцевых токов, возникающих в тг-сопряженных системах в магнитном поле). Так, сдвиг в слабое поле у ^ Ьеи26 (1-2.38 м.д.), вероятно, обусловлен образованием водородной связи с боковой ценыо расположенного рядом

Н1э24 и электростатическим потенциалом, вызванным дипольны.м моментом спирали 81. Сдвиги атомов 41^ Тгр70 ( I 1.44 м.д.) и А1а74 ( I 1.02 м.д.) в слабое поле могут быть объяснены близостью к ним ароматических боковых цепей (Тгр70 и Туг75). Анализ кристаллической структуры изолированного ВСД-КуАР подтверждает это предположение, что также говорит о схожести структур ВСД-К/АР в мицеллах и кристалле (Рис. 7 А).

y59 ПМ.1

из

1 Hi'JI

5.0

' .--V - ' Ли

-------------<«------------- --------------------------- ------------■•- - • 7.(i

о 'И L63^ - - ' L) 02

ЗС-

Ж: -I Г"

'HY54. 4.0

'Н G10L

Рис. 8. Двумерные срезы спектра 3D NOESY-15K-HSQC 2Н/ 15К-мечениого ВСД-KvAP (время смешивания 150 мс). Видны контакты ЯЭО амидпых протонов L63 и G101 с протонами воды. Также заметен межспиральный контакт ЯЭО 'H'v Gly 101 и 1Нг Tyr59.

Высокие значения вторичных сдвигов Ad-1HA для AlalOO и GlylOl ( I 1.59 м.д. и I 1.34 м.д. соответственно) не могут быть полностью объяснены дшюлышм моментом спирали S3b из-за ее относительно небольшой длины (12 остатков). По аминокислотной последовательности вблизи этих остатков нет заряженных либо ароматических групп. В то же время, в кристаллической структуре изолированного ВСД-KvAP вблизи амидпых групп AlalOO и GlylOl находятся заряженная боковая груша Asp62 и связанная молекула воды на расстоянии, достаточном для образования сильных водородных связей (Рис. 7 Б). Присутствие молекулы воды в этой области ВСД-KvAP в мицеллах подтверждалось наличием кросс-пиков в спектре NOESY на частоте сигнала воды и амидных протонов Leu63 и GlylOl (Рис. 8). Значительный сдвиг в сильное поле 1НА Val42 также может быть объяснен расположенным рядом положительным зарядом боковой цепи Argl33. Сближенность спиралей S2 и S3b в мицеллах напрямую подтверждалась наличием кросс-пика ЯЭО между амидным протоном GlylOl и ароматическими протонами Туг59 (Рис. 8). Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что в мицеллах сохраняется наблюдаемый в кристалле солевой мостик Asp62-Argl33 (Рис. 7 Б), который считается одним из важных факторов стабилизации ВСД-KvAP.

Для подтверждения соответствия структур ВСД-KvAP в мицеллах и в кристалле мы провели расчет значений химических сдвигов сигналов белка

Наблюдаемые химические сдвиги, м.д.

Рис. 9. Корреляционные диаграммы между наблюдаемыми ( Д<5„ь) и рассчитанными (Д¿сЫс) вторичными химическими сдвигами атомов ВСД-КуАР. Химические сдвиги рассчитаны на основе кристаллических структур изолированного ВСД-КуАР (верхний ряд) и ВСД-КуАР в составе полноразмерной субъединиды (нижний ряд). Приведен коэффициент корреляции (Л) и коэффициент наклона прямой (к), полученный вписыванием прямой вида Дйса1с = к • Ад„ьв + Ь.

на основе кристаллических структур. Для расчета использовали структуру изолированного ВСД-КуАР (код РБВ ЮШЗ) и структуру ВСД-КуАР в составе полноразмерной субъединицы канала (код ЮШЗ). В этих кристаллах конфор-мации вольт-сенсорного домена сильно отличаются друг от друга. Рассчитанные значения сравнивали с наблюдаемыми в мицеллах. Результаты расчета (Рис. 9) показали, что структура ВСД-КуАР в мицеллах ДФХ/ЛДАО лучше соответствует структуре изолированного ВСД-КуАР. Следует отметить, что опубликованные результаты ЭПР-исследоваиий полноразмерного капала и изолированного ВСД указывают на то, что эта структура соответствует нативной структуре ВСД-КуАР в открытом канале.

Внутримолекулярная динамика ВСД-КуАР в мицеллах

Неоднородность ширины линий в спектрах ВСД-КуАР указывает на значительную внутримолекулярную подвижность белка в мицеллярном окружении. Как правило, узкие сигналы наблюдаются в участках молекулы, совершающих "быстрые" (пс-нс) движения, а уширение сигналов свидетельствует о медленных (мкс-мс) коиформационных флуктуациях или о химическом обмене. Степень уширепия сигналов ВСД-КуАР была оценена по ин-тенсивностям кросс-пиков в спектре ЗБ НЫСО. Также в образце 2Н/ 14-меченпого белка были измерены параметры релаксации ядер (скорости продольной — И.1 и поперечной — И.2 релаксации, интенсивности гетероядер-

/ \ * i «1 л

...... /

Номер остатка

Участки быстрых движений (пс-нс)

бзь г"? 83ь 81-321оор

¿4.

N-{ 4} МОЕ < 0.6

!нмсо > 2<!нЫСО>

Участки медленых движений (мкс-мс)

Рис. 10. Внутримолекулярная динамика ВСД-КуАР в мицеллах ДФХ/ЛДАО (2:1). А — Параметры реласкации ядер 1оК ВСД-КуАР (60.8 МГц по 1оГ\т, 45°С). Приведены измеренные скорости продольной и поперечной релаксации, а также величина гетероядериого 1,1 N 1Н ЯЭО и интенсивности сигналов в спектре НКСО (Иь, Яг, ЯЭО и Ьп(Хнксо) соответственно). Также показаны рассчитанные значения К] ■ Кг и эффективное время корреляции вращательных движений для разных остатков (тд); Б, В — кристаллическая структура изолированного ВСД-КуАР, цветом обозначены определенные методом ЯМР участки, совершающие "быстрые" и "медленные" движения.

пого ЯЭО 1оМ-1Н) при напряженности постоянного магнитного поля 14.1 Тл и 45°С. Были получены значения для 99 1эМ-атомов основной цени из 142 имеющих отнесение, что было связано с перекрытием сигналов в двумерных корреляционных спектрах и недостаточной чувствительностью, обусловленной уширепием некоторых сигналов.

Согласно полученным данным, на IV- и С-концах молекулы, а также в районе петли, соединяющей спирали Б1 и Б2, и в спиралях Б23 и БЗа наблюдались быстрые движения с характерными временами в диапазоне пс-нс. Медленные движения отмечены в районах, близких к центрам спиралей Э1 и 82, а также па стыках спиралей БЗа-ВЗЬ, 84-845. (Рис. 10 Б, В). Повышение значений Н^Ял по сравнению с уровнем в 20 с"1 подтвердило наличие обменных флуктуации (мкс-мс) в этих регионах молекулы (Рис. 10 А). Можно

заметить, что локализация мкс-мс флуктуаций в структуре ВСД-КуАР совпадает с областью межспиральных контактов. Количественный анализ данных с использованием модель-независимого подхода подтвердил полученные результаты.

Из отношения Нг/Ит для каждого остатка было рассчитано эффективное время корреляции вращательных движений (Рис. 10 А, тц). Полученные значения тц были неодинаковы для различных остатков, что может быть следствием внутримолекулярной подвижности. Среднее тц было рассчитано для "стабильных" участков (1Н-15^ЯЭО>0.6 и ЯгК2<20 с-1) и составило 18.4 не (при 45°С). Данное значение соответствует вращению частицы с гидродинамическим радиусом 11я=32 А и эффективной массой ~50 кДа. Эти результаты согласуются с полученными данными по трансляционной диффузии (Д ~ (0.90 ± 0.03) • Ю"10 ^ при 30°С, 11н ~31 А). Сопоставляя полученные данные с поперечным размером глобулы ВСД-КуАР (радиус ~10 А) и длиной молекул детергентов (~20 А для ДФХ и Л ДАО), можно сделать вывод о том, что комплекс ВСД-КуАР/мицелла представляет собой молекулу белка с гидрофобным интерфейсом, покрытым слоем молекул детергента, что согласуется с наблюдаемыми ЯЭО контактами между амидными протонами белка и СНз-групиами жирнокислотных цепей ЛДАО.

Заключение

Приведенные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о том, что структуры ВСД-КуАР в мицеллах цвиттерионных (незаряженных) детергентов и в ЛБН близки друг к другу. Использование мембрапомоделиру-ющей среды на основе детергентов ДФХ/ЛДАО позволило получить отнесение сигналов основной цепп ВСД-КуАР и определить его вторичную структуру. Также была охарактеризована пространственная структура белка. Коп-формация ВСД-КуАР в мицеллах оказалась в значительной степени схожа с установленной ранее методом РСА структурой изолированного ВСД-КуАР. Предшествующие ЭПР-исследоваиия полноразмерного КуАР и его изолированного ВСД в составе липндных везикул в отсутствие трансмембраппого потенциала показали, что эта кристаллическая структура соответствует на-тивному ВСД в открытом состоянии капала. Следовательно, динамические характеристики, наблюдаемые методом ЯМР в настоящем исследовании также могут быть экстраполированы и к полноразмерному каналу, что позво-

ляет сделать предположения относительно роли наблюдаемых движении в иотепццал-завпсимой активации.

Так, быстрые движения в пс-ис диапазоне времен характерны для меж-спиралыюй петли 81-82, спиралей Э23 и 845 (Рис. 10). В то же время связка спиралей 83Ь-Э4 относительно стабильна в данном диапазоне времен. Это говорит в пользу модели потенциал-зависимой активации, в которой шпилька 83Ь-84 (так называемая "потенциал-чувствительная лопасть") перемещается относительно других спиралей (81-82), что сопровождается конформацион-пыми перестройками в районе 823-83а. Подвижность 845 возможно обеспечивает изгиб в районе 11е131-А1^133, происходящий при активации канала. В то же время, полученные данные противоречат моделям, в которых перемещение спирали Б4 сопряжено с коиформационными перестройками в ЭЗЬ.

Наиболее интересным свойством внутримолекулярной динамики ВСД-КуАР является наличие медленных (мкс-мс) обменных движений в области контакта спиралей. Эти движения затрагивают все остатки из спиралей 81, 82, БЗ, Э4, находящиеся вблизи межспирального солевого мостика Авр62-А1^133. Эти флуктуации указывают на возможность совершения спиралями высокоамплитудиых скользящих движений относительно друг друга в процессе потенциал-зависимой активации канала.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что лшшд-белковые мембранные наиодиски применимы в качестве мембраномоделирующей среды для ЯМР-исследовапий мембранных белков и пептидов.

2. Результаты анализа корреляционных ЯМР спектров ВСД-КуАР показали, что коиформация изолированного ВСД-КуАР в растворе зависит от состава мембраномоделирующей среды. Структуры ВСД-КуАР в па-иодисках различного состава и в мицеллах цвиттериониых детергентов схожи друг с другом и значительно отличаются от структуры в мицеллах анионных детергентов.

3. Методом ЯМР определена вторичная структура ВСД-КуАР в мицеллах ДФХ/ЛДАО и охарактеризована его пространственная структура. Наблюдаемая в мицеллах коиформация соответствует структуре натив-ного вольт-сенсорпого домена в открытом состоянии канала.

4. Данные по релаксации ядер позволили установить характер внутримолекулярной подвижности ВСД-КуАР в мицеллах. Участки молекулы в районе межспиральной петли 81-82 и спиралей Э23 и Б45 совершают "быстрые" движения в диапазоне пс-нс, спиральная шпилька 83Ь-84 относительно стабильна в этом диапазоне времен. Для всех сегментов белка в регионе межепиральных контактов характерно наличие "медленных" обменных движений в мкс-мс диапазоне.

5. Сопоставление полученных данных о динамике ВСД-КуАР в мицеллах с известными моделями потенциал-зависимой активации катионных каналов показало, что наиболее вероятный характер конформацнониых перестроек при активации канала соответствует модели, в которой спирали 83Ь и 84 перемещаются в мембране как единый структурный элемент.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S.. Nadezhdin K.D., Bocharov E.V., Kudelina I.A., Skladnev D.A., Tagaev A.A., Yakimenko Z.A., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S., Antiamoebin I in methanol solution: rapid exchange between right-handed and left-handed 3(10)-helical conformations. // Chem.Biodivers. 4 (6) (2001) 1219-Щ2.

2. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Paramonov A.S.. Sobol A.G., Ovchinnikova T.V., Chupin V.V., Kirpichnikov M.P., Blommers M.J.J., Arseniev A.S., Lipid-protein nanoscale bilayers: a versatile medium for NMR investigations of membrane proteins and membrane-active peptides // J.Am.Chcm.Soc ISO (7) (2008) 2Ц0-2Ц1

3. Парамонов А.С., Шенкарев 3.0., Арсеньев А.С., Изучение пространственной структуры мембраноактивного антибиотика Антнамебипа в растворе метанола методами гетероядер-ной ЯМР-спектроскопии // Тезисы докладов XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2005" (Москва, 2005) с. 172

4. Paramonov A.S.. Shenkarev Z.O., Arseniev A.S., Spatial structure of membrane-active antibiotic Antiamoebin in methanol solution from homonuclear and heteronuclear J couplings // 2nd International symposium and Summer School "NMR in Condensed Mattersbook of abstracts (Saint Petersburg, 2005) p. 95

5. Paramonov A.S., Shenkarev Z.O., Arseniev A.S., Spatial structure of memrane-active antibiotic Antiamoebin in methanol solution from homonuclear and heteronuclear J couplings // Abstarcts of EMBO practical course "Multidimensional NMR in structural biology" (II Ciocco, Italy 2006)

p. 24

6. Парамонов А.С., Якименко 3.A., Шенкарев 3.O., Тагаев А.А., Складев ДА. Арсеньев А.С. Овчинникова Т.В., Биотехггологическое получение loN- и 13С,15М-меченого каналообразу-ющего антибиотика Аптиамебипа I и исследование его структуры и динамики методом ЯМР // Тезисы докладов VIII чтений, посвященых памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006) с. 67

7. Lyukmanova E.N., Shcnkarev Z.O., Paramonov A.S.. Sobol A.G., Shingarova L.N., Nekrasova O.V., Chupin V.V., Kirpichnikov M.P., Arseniev A.S., Lipid-protein nanodiscs the versatile media for NMR investigation of membrane proteins and membrane-active peptides // ^i/i hiternational symposium and Summer School "NMR in Condensed Matters", hook of abstracts (Saint Petersburg, Russia, 2007) p. 36

8. Paramonov A.S... Shenkarcv Z.O., Yurchenko Y.Y., Lyukmanova E.N., Shingarova L.N., Chupin V.V., Arseniev A.S., NMR investigations of voltage-sensing domain from K+ channel KvAP in several mcmbrane-mimic environments // ^i/t International symposium and Summer School "NMR in Condensed Matters", book of abstracts (Saint Petersburg, Russia, 200'/), p. 1)7.

9. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S.. Nadezhdin K.D., Gagnidze I.E., Yurchenko Y.Y., Lyukmanova E.N., Bocharov E.V., Balashova T.A., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S., Structure and dynamics of channel forming peptide antibiotic Antiamoebin I in several membrane mimicking media /./ International symposium and Summer School "NMR in Condensed Matters", book of abstracts (Saint Petersburg, Russia, 2007) p. 118.

10. Шенкарев 3.O., Парамонов A.C., Надеждин Д.Е., Гагнидзе И.Э., Юрчснко Ю.Ю., Люкма-нова E.H., Овчинникова Т.В., Арсеньев A.C., Структура и динамика каналообразующего пептидного антибиотика Антиамебина I в различных мембрапо-моделирующих средах / / Сборник докладов XV Международного Симпозиума "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Гурзуф, .Украина, 2007), с. 306 -308,

11. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S.. Lyukmanova E.N., Shingarova L.N., Tikhonov RA'., Chupin V.V., Arseniev A.S., NMR study of isolated KvAP voltage-sensing domain: application of lipid-protein nanoscale bilayers in screening of detergent media // 33th FEBS Congress, late abstract book (Aphens, Greece, 2008), p. 16.

12. Шенкарев 3.O., Парамонов A.C., Надеждин К.Д., Лкжманова E.H., Чупин В.В., Шип-гарова Л.Н., Арсеньев A.C., Мембранные нанодиски — новая среда для ЯМР исследований мембранных белков и мембрапоактивных пептидов // Сборник тезисов XX Зхш-ней международной молодежной научной школы "Перспективные направления физухо-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2008), с. 4413. Парамонов A.C., Шенкарев З.О., Люкманова E.H., Шингарова Л.Н., Чупин В.В.. Арсеньев A.C., Исследование пространственной структуры и динамики вольт-сенсорного домена К+-капала KvAP // Тезисы докладов XXI зимней международной молодеэ/сной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", (Москва 2009), с. 26

Отпечатано на полиграфическом участке Учреждения Российской академии наук института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Подписано в печать 10.04.2009 Усл.п.л. 1.5 Тираж 100 экз. Заказ 142

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Парамонов, Александр Сергеевич

Список иллюстраций

Список таблиц

Введение б

Глава 1. Обзор литературы

§ 1. Исследование структуры мембранных белков. Мембран омоделирующие среды.

1.1. Общие сведения о мембранных белках.

1.2. Метод ЯМР н его применение к мембранным белкам

1.3. Свойства различных типов мембранных миметиков

§ 2. Липид-белковые нанодиски.

2.1. Липопротеины плазмы крови млекопитающих

2.2. Структура и свойства ЛБН.

2.3. Использование ЛБН для солюбилизации мембранных белков и пептидов.

2.4. ЛБН в ЯМР-спектроскопии высокого разрешения

§ 3. Потенциал-зависимые ионные каналы.

3.1. Общая схема строения катионных каналов.

3.2. Классификация каналов.

3.3. Принципы потенциал-зависимой активации.

Глава 2. Материалы и методы

§ 1. Полз^чение объектов исследования и реактивы.

1.1. Получение Антиамебина I.

1.2. Наработка и выделение ВСД-КуАР

1.3. Реактивы.

1.4. Получение ЛБН в комплексе с ВСД-КуАР и ААМ I

§ 2. Экспериментальные методики.

2.1. Подбор условий для структурных ЯМР-исследований ВСД-КуАР.

2.2. Исследование ААМ I и ВСД-КуАР в комплексе с ЛБН

2.3. Анализ размера частиц.

2.4. Структурные исследования ВСД-КуАР.

2.5. Определение динамических характеристик ВСД-КуАР

2.6. Расчет химических сдвигов.

Глава 3. Результаты и обсуждение

§ 1. Подбор мембраномоделирующей среды.

§ 2. ЛБН в качестве мембраномоделирующей среды

2.1. Исследование ААМ-1 в комплексе с ЛБН методом ЯМР

2.2. ЯМР-исследование ВСД-КуАР в комплексе с ЛБН

§ 3. Структура ВСД-КуАРв мицеллах.

3.1. Отнесение сигналов

3.2. Вторичная структура ВСД-КуАР в мицеллах.

3.3. Данные о пространственной структуре ВСД-КуАР

3.4. Расчет химических сдвигов.

3.5. Выводы о структуре ВСД-КуАР в мицеллах ДФХ/ЛДАО

§ 4. Внутримолекулярная динамика ВСД-КуАР в мицеллах

ДФХ/ЛДАО

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура и динамика вольт-сенсорного домена K+ канала KvAP по данным гетероядерной ЯМР-спектроскопии"

Изучение структуры катионных каналов и их ВСД интересно по ряду причин. Во-первых, это может помочь в понимании общих принципов протекания потенциал-чувствительных процессов в клетке [4]. Так, структуры, гомологичные ВСД катионных каналов, были обнаружены в белках с принципиально отличной функцией и строением. В частности, потенциал-зависимые протонные каналы млекопитающих функционируют в виде димера субъединиц, имеющих строение, схожее с ВСД [5]. Потенциал-зависимая фосфатаза, обнаруженная у асцидий, имеет ВСД, ковалентно связанный с цитоплазматическим ферментативным доменом [б]. Во-вторых, знание структуры ВСД необходимо для исследований, направленных на создание новых лекарственных препаратов. Известно, что мутации в генах К+, Са2+ каналов являются причиной некоторых наследственных заболеваний человека [7]. ВСД ионных каналов являются мишенью для различных токсинов животного и растительного происхождения, блокирующих потенциал-зависимую активацию [8]. Это открывает перспективы создания новых лекарственных средств, действие которых направлено на модуляцию процесса потенциал-зависимой активации [9].

Объектом исследования в данной диссертационной работе являлся вольт-сенсорный домен потенциал-зависимого К+-канала КуАР (ВСД

KvAP) из термофильной архебактерии Aeropyrum pernix. Имеющиеся на сегодняшний день структурные данные о ВСД-KvAP достаточно противоречивы. Три известные кристаллические структуры, полученные при разных условиях кристаллизации, сильно отличаются друг от друга [10,11]. Было высказано предположение, что важную роль в стабилизации структуры ВСД-KvAP играет мембранное окружение — только плоская бислойная мембрана может обеспечивать нативную конформацию домена [11]. Полученные методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) данные свидетельствуют, что структура изолированного ВСД-KvAP в бислойной мембране близка к структуре ВСД в составе полноразмерного канала в открытом состоянии [12,13].

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) — один из наиболее мощных методов структурного анализа. Он позволяет определять не только пространственную структуру изучаемых белков, но и их внутримолекулярную динамику [14]. Для изучения мембранных белков этим методом требуется применение сред, моделирующих биологическую мембрану [15]. Используемые в настоящее время мембраномоделирующие среды (в основном, мицеллы детергентов) не во всех случаях обеспечивают сохранение нативной структуры исследуемого белка. Таким образом, выбор мембраномоделирующей среды является актуальной проблемой для современных ЯМР-исследований [16].

В литературе имеются данные о свойствах принципиально новой среды для солюбилизации мембранных белков — так называемых липид-белковых нанодисков (JIBH) [17]. Нанодиски представляют собой фрагмент плоского липидного бислоя (~160 фосфолипидов), гидрофобные края которого экранированы от растворителя двумя молекулами амфифильного белка MSP (фрагмента аполипопротеина A-I из липопротеинов высокой плотности плазмы крови человека). Ранее JIBH успешно применялись в исследованиях мембранных белков различными методами. Было показано, что ЛБЫ по своим свойствам наилучшим образом соответствуют биологической мембране и способны сохранять многие мембранные белки в нативном функциональном состоянии [18]. Однако, примеров использования ЛБН для структурных ЯМР-исследований мембранных белков на сегодняшний день нет.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось определение структурных и динамических характеристик изолированного ВСД-КуАР методами ЯМР высокого разрешения. Данная цель подразумевает решение следующих задач:

1. Подбор мембраномоделирующей среды для ЯМР-исследований ВСД-КуАР, обеспечивающей наилучшее качество ЯМР-спектров и сохраняющей структуру белка, наиболее близкую к нативной.

2. Получение отнесения сигналов ВСД-КуАР в гетероядерных ЯМР-спектрах.

3. Идентификация элементов вторичной структуры ВСД-КуАР по данным ЯМР.

4. Получение данных о пространственной структуре белка.

5. Определение характеристик внутримолекулярной динамики ВСД-КуАР.

1. Показана применимость ЛБН, созданных на основе липопротеинов высокой плотности человека, в качестве мембраномоделирующей среды для ЯМР-исследований мембранных белков и пептидов.

2. Предложен новый метод подбора мембраномоделирующей среды на основании сравнения спектров ЯМР изучаемого белка в различных средах со спектрами в ЛБН.

3. Показана и исследована зависимость структуры ВСД-КуАР от состава мембраномоделирующей среды.

4. Получено практически полное отнесение сигналов ЯМР атомов основной цепи и большей части -атомов ВСД-КуАР в комплексе с мицеллами ДФХ/ЛДАО (2:1).

6. Определены характеристики внутримолекулярной подвижности ВСД-КуАР в комплексе с мицеллами ДФХ/ЛДАО (2:1). Проведено сравнение существующих моделей потенциал-зависимой актива^ ции канала с полученными данными.

В данной работе разработан и успешно применен новый подход к определению пригодности мембраномоделирующих сред для ЯМР-спектроскопии мембранных белков, который предполагает сопоставление спектров белка в тестируемых детергентах и в ЛБН. Доказательство сохранения солюбилизированным белком нативной структуры является одной из основных проблем в современных исследованиях. Таким образом, данный подход может найти широкое применение в ЯМР-исследованиях мембранных белков.

Полученные в работе значения химических сдвигов сигналов ядер 1Н, 13С, 15К в спектрах ЯМР ВСД-КуАР могут служить отправной точкой при его дальнейших структурно-динамических исследованиях, например, для получения структуры с высоким разрешением. Кроме того, отнесение сигналов основной цепи необходимо для исследования механизмов взаимодействия КуАР с токсинами или для скрининга прототипов лекарственных средств, модулирующих потенциал-зависимую активацию.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Парамонов, Александр Сергеевич

Выводы

1. Показано, что липид-белковые мембранные нанодиски применимы в качестве мембраномоделирующей среды для ЯМР-исследований мембранных белков и пептидов.

2. Результаты анализа корреляционных ЯМР спектров ВСД-КуАР показали, что конформация изолированного ВСД-КуАР в растворе зависит от состава мембраномоделирующей среды. Структуры ВСД-КуАР в нанодисках различного состава и в мицеллах цвиттерионных детергентов схожи друг с другом и значительно отличаются от структуры в мицеллах анионных детергентов.

3. Методом ЯМР определена вторичная структура ВСД-КуАР в мицеллах ДФХ/ЛДАО и охарактеризована его пространственная структура. Наблюдаемая в мицеллах конформация соответствует структуре нативного вольт-сепсорного домена в открытом состоянии канала.

4. Данные по релаксации ядер позволили установить характер внутримолекулярной подвижности ВСД-КуАР в мицеллах. Участки молекулы в районе межспиральной петли 81-82 и спиралей Э23 и 845 совершают "быстрые" движения в диапазоне пс-нс, спиральная шпилька 83Ь-84 относительно стабильна в этом диапазоне времен. Для всех сегментов белка в регионе межспиральных контактов характерно наличие "медленных" обменных движений в мкс-мс диапазоне.

5. Сопоставление полученных данных о динамике ВСД-КуАР в мицеллах с известными моделями потенциал-зависимой активации кати-онных каналов показало, что наиболее вероятный характер конфор-мационных перестроек при активации канала соответствует модели, в которой спирали ЭЗЪ и Э4 перемещаются в мембране как единый структурный элемент.

Благодарности

Хочу выразить искреннюю признательность и благодарность своим научным руководителям Арсеньеву A.C. и Шенкареву 3.0. за помощь и поддержку, неустанное благожелательное внимание на протяжении всего времени моей работы в лаборатории.

Благодарю весь коллектив лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН за помощь в проведении экспериментов и плодотворные обсуждения.

Также хочу поблагодарить сотрудников лаборатории инженерии белка Шингарову JI.H., Люкманову E.H. и руководителя УНЦ ИБХ РАН Овчинникову Т.В. за проделанный ими большой труд по получению образцов для исследования, без которых выполнение данной работы было бы невозможным.

Благодарю сотрудников отдела структурной биологии Соболя А.Г., Самсонову О.В., Чупина В.В. за помощь в проведении дополнительных экспериментов.

Выражаю свою благодарность сотрудникам кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ и ИБХ РАН Долгих Д.А., Шайтану К.В. и Ефремову Р.Г. за содействие и доброжелательное отношение во время моего обучения в аспирантуре.

Работа выполнена при поддержке РФФИ и гранта Президента РФ.

Заключение

Приведенные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о том, что структуры ВСД-КуАР в мицеллах цвиттерпонных (незаряженных) детергентов и в ЛБН близки друг к другу. Использование мембрано-моделирующей среды на основе детергентов ДФХ/ЛДАО позволило получить отнесение сигналов основной цепи ВСД-КуАР и определить его вторичную структуру. Также была охарактеризована пространственная структура белка. Коиформацня ВСД-КуАР в мицеллах оказалась в значительной степени схожа с установленной ранее методом РСА структурой изолированного ВСД-КуАР. Предшествующие ЭПР-исследования полноразмерного КуАР и его изолированного ВСД в составе липидных везикул в отсутствие трансмембранного потенциала показали, что эта кристаллическая структура соответствует нативному ВСД в открытом состоянии канала. Следовательно, динамические характеристики, наблюдаемые методом ЯМР в настоящем исследовании также могут быть экстраполированы и к полноразмерному каналу, что позволяет сделать предположения относительно роли наблюдаемых движений в потенциал-зависимой активации.

Так, быстрые движения в пс-нс диапазоне времен характерны для межспиральной петли 81-82, спиралей Э23 и Э45 (Рис. 26). В то же время связка спиралей 83Ь-84 относительно стабильна в данном диапазоне времен. Это говорит в пользу модели потенциал-зависимой активации, в которой шпилька 83Ь-84 (так называемая "потенциал-чувствительная лопасть") перемещается относительно других спиралей (81-82), что сопровождается конформационпыми перестройками в районе 823-83а. Подвижность Э45 возможно обеспечивает изгиб в районе 11е131-А^133, происходящий при активации канала. В то же время, полученные данные противоречат моделям, в которых перемещение спирали Э4 сопряжено с конформационными перестройками в ЭЗЬ.

Наиболее интересным свойством внутримолекулярной динамики ВСД-КуАР является наличие медленных (мкс-мс) обменных движений в области контакта спиралей. Эти движения затрагивают все остатки из спиралей Б1, Э2, БЗ, Б4, находящиеся вблизи межспирального солевого мостика Авр62-А^133. Эти флуктуации указывают на возможность совершения спиралями высокоамплитудных скользящих движений относительно друг друга в процессе потенциал-зависимой активации канала.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Парамонов, Александр Сергеевич, Москва

1. B. Hille, 1.n channels of Excitable Membranes, Sinauer, Sunderland, MA, 2001.

2. C. Derst, A. Karschin, Evolutionary link between prokaryotic and eukaryotic K-f- channels, J.Exp. Biol. 201 (Pt 20) (1998) 2791-2799.

3. S. I. Borjesson, F. Blinder, Struct ure, function, and modification of the voltage sensor in voltage-gated ion channels, Cell. Biochem. Biophys. 52 (3) (2008) 149-174.

4. K. J. Swartz, Sensing voltage across lipid membranes, Nature 456 (7224) (2008) 891-897.

5. I. S. Ramsey, M. M. Moran, J. A. Chong, D. E. Clapham, A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain, Nature 440 (7088) (2006) 1213-1216.

6. Y. Murata, H. Iwasaki, M. Sasaki, K. Inaba, Y. Okamura, Phosphoinositide phosphatase activity coupled to an intrinsic voltage sensor, Nature 435 (7046) (2005) 1239-1243.

7. F. M. Ashcroft, Ion channels and disease, Academic Press, 2000.

8. Y. Li-Smerin, K. J. Swartz, Gating modifier toxins reveal a conserved structural motif in voltage-gated Ca2+ and K+ channels, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 95 (15) (1998) 8585-8589.

9. A. A. Alabi, M. I. Bahamonde, H. J. Jung, J. I. Kim, K. J. Swartz, Portability of paddle motif function and pharmacology in voltage sensors, Nature 450 (7168) (2007) 370-375.

10. Y. Jiang, A. Lee, J. Chen, V. Rata, M. Cadene, B. T. Chait, R. MacKinnon, X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel, Nature 423 (6935) (2003) 33-41.

11. S.-Y. Lee, A. Lee, J. Chen, R. MacKinnon, Structure of the KvAP voltage-dependent K+ channel and its dependence on the lipid membrane, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102 (43) (2005) 15441-15446.

12. L. G. Cuello, D. M. Cortes, E. Perozo, Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer, Science 306 (5695) (2004) 491-495.

13. S. Chakrapani, L. G. Cuello, D. M. Cortes, E. Perozo, Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer, Structure 16 (3) (2008) 398-409.

14. J. Cavanagh, W. J. Fairbrother, A. G. Palmer, N. J. Skelton, M. Ranee, Protein NMR spectroscopy: principles and practice, Academic Press, 2007.

15. G. D. Henry, B. D. Sykes, Methods to study membrane protein structure in solution, Methods. Enzymol. 239 (1994) 515-535.

16. C. R. Sanders, F. Sonnichsen, Solution NMR of membrane proteins: practice and challenges, Magn. Reson. Chem. 44 Spec No (2006) S24-S40.

17. Т. H. Bayburt, Y. V. Grinkova, S. G. Sligar, Self-Assembly of Discoidal Phospholipid Bilayer Nanoparticles with Membrane Scaffold Proteins, Nano Letters 2 (8) (2002) 853-856.

18. A. Nath, W. M. Atkins, S. G. Sligar, Applications of phospholipid bilayer nanodiscs in the study of membranes and membrane proteins, Biochemistry 46 (8) (2007) 2059-2069.

19. P. Геинис, Биомембраны: Молекулярная структура и функции, М.:Мир, 1997.

20. М. G. Paulick, С. R. Bertozzi, The glycosylphosphatidylinositol anchor: a complex membrane-anchoring structure for proteins, Biochemistry 47 (27) (2008) 6991-7000.

21. S. H. White, W. C. Wimley, Membrane protein folding and stability: physical principles, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28 (1999) 319365.

22. K. Seshadri, R. Garemyr, E. Wallin, G. von Heijne, A. Elofsson, Architecture of beta-barrel membrane proteins: analysis of trimeric porins, Protein. Sci. 7 (9) (1998) 2026-2032.

23. E. Wallin, G. von Heijne, Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms, Protein. Sci. 7 (4) (1998) 1029-1038.

24. R. B. Russell, D. S. Eggleston, New roles for structure in biology and drug discovery, Nat. Struct. Mol. Biol. 7 Suppl (2000) 928-930.

25. H. Michel, International Tables for Crystallography, Vol. F, Kluwer Academic Publishers, 2001, Ch. 4.2, pp. 94-100.

26. N. Grigorieff, T. A. Ceska, K. H. Downing. J. M. Baldwin. R. Henderson, Electron-crystallographic refinement of the structure of bacteriorhodopsin, J. Mol. Biol. 259 (3) (1996) 393-421.

27. M. S. Weiss, G. E. Schidz, Structure of porin refined at 1.8 A resolution, J. Mol. Biol. 227 (2) (1992) 493-509.

28. S. H. White, The progress of membrane protein structure determination, Protein. Sci. 13 (7) (2004) 1948-1949.

29. K. Wüthrich, NMR of proteins and nucleic acids, Wiley-Interscience, 1986.

30. M. Sattler, J. Schleucher, C. Griesinger, Heteronuclear multidimensional NMR experiments for the structure determination of proteins in solution employing pulsed field gradients, Prog. NMR. Spcct. 34 (2) (1999) 93-158.

31. B. T. Farmer, R. A. Venters, Assignment of aliphatic side-chain 1HN/15N resonances in perdeuterated proteins, J. Biomol. NMR. 7 (1) (1996) 59-71.

32. K. H. Gardner, L. E. Kay, The use of 2H, 13C, 15N multidimensional NMR to study the structure and dynamics of proteins, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 27 (1998) 357-406.

33. D. S. Wishart, B. D. Sijkes, Chemical shifts as a tool for structure determination, Methods. Énzymol. 239 (1994) 363-392.

34. P. Güntert, C. Mumenthaler, K. Wüthrich, Torsion angle dynamics for NMR structure calculation with the new program DYANA, J. Mol. Biol. 273 (1) (1997) 283-298.

35. N. Tjandra, J. G. Omichinski, A. M. Gronenborn, G. M. Clore, A. Bax, Use of dipolar 1H-15N and 1H-13C couplings in the structure determination of magnetically oriented macromolecules in solution, Nat. Struct. Mol. Biol. 4 (9) (1997) 732-738.

36. C. Hilty, G. Wider, C. Fernández, K. Wüthrich, Membrane protein-lipid interactions in mixed micelles studied by NMR spectroscopy with the use of paramagnetic reagents, Chembiochcm 5 (4) (2004) 467-473.

37. K. Pervushin, R. Riek, G. Wider, K. Wüthrich, Transverse Relaxation-Optimized Spectroscopy (TROSY) for NMR Studies of Aromatic Spin Systems in 13C-Labeled Proteins, J. Am. Chem. Soc. 120 (25) (1998) 6394-6400.

38. R. Riek, G. Wider, K. Pervushin, K. Wüthrich, Polarization transfer by cross-correlated relaxation in solution NMR with very large molecules, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 96 (9) (1999) 4918-4923.'

39. R. H. Fillingame, 0. Y. Dmitriev, Structural model of the transmembrane Fo rotary sector of H+-transporting ATP synthase derived by solution NMR and intersubunit cross-linking in situ, Biochim. Biophys. Acta. 1565 (2) (2002) 232-245.

40. G. G. Privé, Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins, Methods 41 (4) (2007) 388-397.

41. R. Kakehashi, T. Takeda, H. Maeda, Effects of micellar charge density on the coefficient of the Corrin-Harkins relation, J. Colloid. Interface. Sci. 253 (1) (2002) 238-240.

42. Y. Imaishi, R. Kakehashi, T. Nezu, H. Maeda, Dodecyldimethylamine Oxide Micelles in Solutions without Added Salt, J. Colloid. Interface. Sci. 197 (2) (1998) 309-316.

43. A. Helenius, D. R. McCaslin, E. Fries, C. Ta,nford, Properties of detergents, Methods. Enzymol. 56 (1979) 734-749.

44. J. C. Steele, C. Tanford, J. A. Reynolds, Determination of partial specific volumes for lipid-associated proteins, Methods. Enzymol. 48 (1978) 11-23.

45. K. R. MacKenzie, J. H. Prestegard, D. M. Engelman, A transmembrane helix dimer: structure and implications, Science 276 (5309) (1997) 131— 133.

46. J. Lauterwein, C. Bosch, L. R. Brown, K. Wiithrich, Physicochemical studies of the protein-lipid interactions in melittin-containing micelles, Biochim. Biophys. Acta. 556 (2) (1979) 244-264.

47. A. L. Parrill, Lysophospholipid interactions with protein targets, Biochim. Biophys. Acta. 1781 (9) (2008) 540-546.

48. P. Huang, Q. Liu, G. A. Scarborough, Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, Anal. Biochem. 259 (1) (1998) 8997.

49. R. S. Prosser, F. Evanics, J. L. Kitevski, M. S. Al-Abdul-Wahid, Current applications of bicelles in NMR studies of membrane-associated amphiphiles and proteins, Biochemistry 45 (28) (2006) 8453-8465.

50. C. R. Sanders, B. J. Hare, K. Howard, J. H. Prestegard, Magneticlly oriented phospholipid micelles as tool for the study of membrane-associated molecules, Prog. NMR. Spect. 26 (1994) 421-444.

51. C. Tribet, R. Audebert, J. L. Popot, Amphipols: polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions, Proc. Natl. Acad. Sei. U S A 93 (26) (1996) 15047-15050.

52. M. Zoonens, L. J. Catoire, F. Giusti, J.-L. Popot, NMR study of a membrane protein in detergent-free aqueous solution, Proc. Natl. Acad. Sei. U S A 102 (25) (2005) 8893-8898.

53. C. R. Babu, P. F. Flynn, A. J. Wand, Preparation, characterization, and NMR spectroscopy of encapsulated proteins dissolved in low viscosity fluids, J. Biomol. NMR. 25 (4) (2003) 313-323.

54. Z. Shi, R. W. Peterson, A. J. Wand, New reverse micelle surfactant systems optimized for high-resolution NMR spectroscopy of encapsulated proteins, Langmuir 21 (23) (2005) 10632-10637.

55. S. M. Yu, D. T. McQuade, M. A. Quirin, C. P. Hackenberger, M. P. Krebs, A. S. Polans, S. H. Gellman, An improved tripod amphiphile for membrane protein solubilization, Protein. Sei. 9 (12) (2000) 2518-2527.

56. M. J. Theisen, T. B. Potocky, D. T. McQuade, S. H. Gellman, M. L. Chiu, Crystallization of bacteriorhodopsin solubilized by a tripod amphiphile, Biochim. Biophys. Acta. 1751 (2) (2005) 213-216.

57. Z. Wu, AI. A Wagner, L. Zheng, J. S. Parks, J. M. Shy, J. D. Smith, V. Gogonea, S. L. Hazen, The refined structure of nascent HDL reveals a key functional domain for particle maturation and dysfunction, Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (9) (2007) 861-868.

58. P. J. Dolphin, Lipoprotein metabolism and the role of apolipoproteins as metabolic programmers, Can. J. Biochem. Cell. Biol. 63 (8) (1985) 850869.

59. J. P. Segrest, M. K. Jones, A. E. Klon, G. J. Sheldahl, M. Hellinger, H. D. Loof, S. C. Haruey, A detailed molecular belt model for apolipoprotein AI in discoidal high density lipoprotein, J. Biol. Chem. 274 (45) (1999) 31755-31758.

60. A. E. IQon, M. K. Jones, J. P. Segrest, S. C. Harvey, Molecular belt models for the apolipoprotein A-I Paris and Milano mutations, Biophys. J. 79 (3) (2000) 1679-1685.

61. R. J. Cushley, M. Okon, NMR studies of lipoprotein structure, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31 (2002) 177-206.

62. D. P. Rogers, L. M. Roberts, J. Lebowitz, G. Datta, G. M. Anantharamaiah, J. A. Engler, C. G. Brouillette, The lipid-free structure of apolipoprotein A-I: effects of amino-terminal deletions, Biochemistry 37 (34) (1998) 11714-11725.

63. D. W. Borhani, D. P. Rogers, J. A. Engler, C. G. Brouillette, Crystal structure of truncated human apolipoprotein A-I suggests a lipid-bound conformation, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 94 (23) (1997) 12291-12296.

64. R. T. Nolte, D. Atkinson, Conformational analysis of apolipoprotein A-I and E-3 based on primary sequence and circular dichroism, Biophys. J. 63 (5) (1992) 1221-1239.

65. V. Koppaka, L. Silvestro, J. A. Engler, C. G. Brouillette, P. H. Axelsen, The structure of human lipoprotein A-I. Evidence for the "belt" model, J. Biol. Chem. 274 (21) (1999) 14541-14544.

66. W. S. Davidson, G. M. Hilliard, The spatial organization of apolipoprotein A-I on the edge of discoidal high density lipoprotein particles: a mass specrometry study, J. Biol. Chem. 278 (29) (2003) 2719927207.

67. R. A. G. D. Silva, G. M. Hilliard, J. Fang, S. Macha, W. S. Davidson, A three-dimensional molecular model of lipid-free apolipoprotein A-I determined by cross-linking/mass spectrometry and sequence threading, Biochemistry 44 (8) (2005) 2759-2769.

68. M. J. Thomas, S. Bhat, M. G. Sorci-Thomas, The use of chemical cross-linking and mass spectrometry to elucidate the tertiary conformation of lipid-bound apolipoprotein A-I, Curr. Opin. Lipidol. 17 (3) (2006) 214220.

69. S. E. Panagotopulos, E. M. Horace, J. N. Maiorano, W. S. Davidson, Apolipoprotein A-I adopts a belt-like orientation in reconstituted high density lipoproteins, J. Biol. Chem. 276 (46) (2001) 42965-42970.

70. D. D. 0. Martin, M. S. Budamagunta, R. O. Ryan, J. C. Voss, M. N. Oda, Apolipoprotein A-I assumes a "looped belt" conformation on reconstituted high density lipoprotein, J. Biol. Chem. 281 (29) (2006) 20418-20426.

71. H. Li, D. S. Lyles, M. J. Thomas, W. Pan, M. G. Sorci-Thomas, Structural determination of lipid-bound ApoA-I using fluorescence resonance energy transfer, J. Biol. Chem. 275 (47) (2000) 37048-37054.

72. Y. Li, A. Z. Kijac, S. G. Sligar, C. M. Rienstra, Structural analysis of nanoscale self-assembled discoidal lipid bilayers by solid-state NMR spectroscopy, Biophys. J. 91 (10) (2006) 3819-3828.

73. C. E. Matz, A. Jonas, Micellar complexes of human apolipoprotein AI with phosphatidylcholines and cholesterol prepared from cholate-lipid dispersions, J. Biol. Chem. 257 (8) (1982) 4535-4540.

74. I. G. Denisov, Y. V. Grinkova, A. A. Lazarides, S. G. Sligar, Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size, J. Am. Chem. Soc. 126 (11) (2004) 3477-3487.

75. T. H. Baybnrt, S. G. Sligar, Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers, Protein. Sci. 12 (11) (2003) 2476-2481.

76. A. Y. Shih, I. G. Denisov, J. C. Phillips, S. G. Sligar, K. Schulten, Molecular dynamics simulations of discoidal bilayers assembled from truncated human lipoproteins, Biophys. J. 88 (1) (2005) 548-556.

77. T. H. Bayburt; Y. V. Grinkova, S. G. Sligar, Assembly of single bactcriorhodopsin trimers in bilayer nanodiscs, Arch. Biochem. Biophys. 450 (2) (2006) 215-222.

78. A. J. Leitz, T. H. Bayburt, A. N. Barnakov, B. A. Springer, S. G. Sligar, Functional reconstitution of Beta2-adrenergic receptors utilizing self-assembling Nanodisc technology, Biotechniques 40 (5) (2006) 601-2, 604, 606, passim.

79. T. H. Bayburt, S. G. Sligar, Singlc-molecule height measurements on microsomal cytochrome P450 in nanometer-scale phospholipid bilayer disks, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 99 (10) (2002) 6725-6730.

80. B. J. Baas, I. G. Denisov, S. G. Sligar, Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment, Arch. Biochem. Biophys. 430 (2) (2004) 218-228.

81. T. Boldog, S. Grimme, M. Li, S. G. Sligar, G. L. Hazelbauer, Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 103 (31) (2006) 11509-11514.

82. A. L. Hodgkin, A. F. Huxley, A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve, J. Physiol. 117 (4) (1952) 500-544.

83. M. Noda. T. Ikeda, H. Suzuki, H. Takeshima, T. Takahashi, M. Kuno, S. Numa, Expression of functional sodium channels from cloned cDNA, Nature 322 (6082) (1986) 826-828.

84. T. Tanabe, H. Takeshima, A. Mikarni, V. Flockerzi, H. Takahashi, K. Kangawa, M. Kojima, H. Matsuo, T. Hirose, S. Numa, Primary structure of the receptor for calcium channel blockers from skeletal muscle, Nature 328 (6128) (1987) 313-318.

85. B. L. Tenvpel, D. M. Papazian, T. L. Schwarz, Y. N. Jan, L. Y. Jan, Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila, Science 237 (4816) (1987) 770-775.

86. D. A. Doyle, J. M. Cabral, R. A. Pfuetzner, A. Kuo, J. M. Gulbis, S. L. Cohen, B. T. Chait, R. MacKinnon, The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity, Science280 (5360) (1998) 69-77.

87. F. H. Yu, W. A. Catterall, The VGL-chanome: a protein superfamily specialized for electrical signaling and ionic homeostasis, Sci. STKE 2004 (253) (2004) rel5.

88. Y. Kubo, T. J. Baldwin, Y. N. Jan, L. Y. Jan, Primary structure and functional expression of a mouse inward rectifier potassium channel, Nature 362 (6416) (1993) 127-133.

89. R. Mannikko, F. Elinder, H. P. Larsson, Voltage-sensing mechanism is conserved among ion channels gated by opposite voltages, Nature 419 (6909) (2002) 837-841.

90. M. Noda, S. Shimizu, T. Tanabe, T. Takai, T. Kayano, T. Ikeda, H. Takahashi, H. Nakayama, Y. Kanaoka, N. Minamino, Primary structure of Electrophorus electricus sodium channel deduced from cDNA sequence, Nature 312 (5990) (1984) 121-127.

91. H. R. Guy, P. Seetharamulu, Molecular model of the action potential sodium channel, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 83 (2) (1986) 508-512.

92. W. A. Catterall, Molecular properties of voltage-sensitive sodium channels, Annu. Rev. Biochem. 55 (1986) 953-985.

93. Z. Lu, A. M. Klem, Y. Ramu, Coupling between voltage sensors and activation gate in voltage-gated K-f- channels, J. Gen. Physiol. 120 (5) (2002) 663-676.

94. Z. Lu, A. M. Klem, Y. Ramu, Ion conduction pore is conserved among potassium channels, Nature 413 (6858) (2001) 809-813.

95. S. C. Kohout, M. H. Ulbrich, S. C. Bell, E. Y. Isacoff, Subunit organization and functional transitions in Ci-VSP, Nat. Struct. Mol. Biol. 15 (1) (2008) 106-108.

96. S.-Y. Lee, R. MacKinnon, A membrane-access mechanism of ion channel inhibition by voltage sensor toxins from spider venom, Nature 430 (6996) (2004) 232-235.

97. F. Tombola, M. H. Ulbrich, E. Y. Isacoff.\ The voltage-gated proton channel Hvl has two pores, each controlled by one voltage sensor, Neuron 58 (4) (2008) 546-556.

98. P. M. Vassilev, T. Scheuer, W. A. Catterall, Identification of an intracellular peptide segment involved in sodium channel inactivation, Science 241 (4873) (1988) 1658-1661.

99. D. E. Patton, J. W. West, W. A. Catterall, A. L. Goldin, Amino acid residues required for fast Na(+)-channel inactivation: charge neutralizations and deletions in the III-IV linker, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 89 (22) (1992) 10905-10909.

100. L. J. Hayward, R. H. Broiun, S. C. Cannon, Slow inactivation differs among mutant Na channels associated with myotonia and periodic paralysis, Biophys. J. 72 (3) (1997) 1204-1219.

101. J. F. Zhang, P. T. Ellinor, R. W. Aldrich, R. W. Tsien, Molecular determinants of voltage-dependent inactivation in calcium channels, Nature 372 (6501) (1994) 97-100.

102. L. Heginbotham, Z. Lu, T. Abramson, R. MacKinnon, Mutations in the K+ channel signature sequence, Biophys. J. 66 (4) (1994) 1061-1067.

103. C. Charlier, N. A. Singh, S. G. Ryan, T. B. Lewis, B. E. Reus, R. J. Leach, M. Leppert, A pore mutation in a novel KQT-like potassium channel gene in an idiopathic epilepsy family, Nat. Genet. 18 (1) (1998) 53-55.

104. C. M. Armstrong, F. Bezanilla, Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels, Nature 242 (5398) (1973) 459-461.

105. N. E. Schoppa, K. McCormack, M. A. Tanouye, F. J. Sigworth, The size of gating charge in wild-type and mutant Shaker potassium channels, Science 255 (5052) (1992) 1712-1715.

106. S. K. Aggarwal, R. MacKinnon, Contribution of the S4 segment to gating charge in the Shaker K+ channel, Neuron 16 (6) (1996) 1169-1177.

107. C. A. Ahem, R. Horn, Specificity of charge-carrying residues in the voltage sensor of potassium channels, J. Gen. Physiol. 123 (3) (2004) 205216.

108. Y. Li-Smerin, D. H. Hackos, I(. J. Swartz, alpha-helical structural elements within the voltage-sensing domains of a K(+) channel, J. Gen. Physiol. 115 (1) (2000) 33-50.

109. S. A. Seoh, D. Sigg, D. M. Papazian, F. Bezanilla, Voltage-sensing residues in the S2 and S4 segments of the Shaker K+ channel, Neuron 16 (6) (1996) 1159-1167.

110. V. Ruta, R. MacKinnon, Localization of the voltage-sensor toxin receptor on KvAP, Biochemistry 43 (31) (2004) 10071-10079.

111. S. B. Long, X. Too, E. B. Campbell, R. MacKinnon, Atomic structure of a voltage-dependent K+ channel in a lipid membrane-like environment, Nature 450 (7168) (2007) 376-382.

112. S. B. Long, E. B. Cam,pbell, R. Mackinnon, Crystal structure of a mammalian voltage-dependent Shaker family K+ channel, Science 309 (5736) (2005) 897-903.

113. S. B. Long, E. B. Campbell, R. Mackinnon, Voltage sensor of Kvl.2: structural basis of electromechanical coupling, Science 309 (5736) (2005) 903-908.

114. V. Ruta, Y. Jiang, A. Lee, J. Chen, R. MacKinnon, Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel, Nature 422 (6928) (2003) 180-185.

115. G. Yellen, The voltage-gated potassium channels and their relatives, Nature 419 (6902) (2002) 35-42.

116. M. Vamvouka, J. Cieslak, N. V. Eps, W. Hubbell, A. Gross, The structure of the lipid-embedded potassium channel voltage sensor determined by double-electron-electron resonance spectroscopy, Protein. Sci. 17 (3) (2008) 506-517.

117. M. Laine, M. chin A Lin, J. P. A. Bannister, W. R. Silverman, A. F. Mock, B. Roux, D. M. Papazian, Atomic proximity between S4 segment and pore domain in Shaker potassium channels, Neuron 39 (3) (2003) 467-481.

118. D. M. Papazian, X. M. Shao, S. A. Seoh, A. F. Mock, Y. Huang, D. H. Wainstock, Electrostatic interactions of S4 voltage sensor in Shaker K+ channel, Neuron 14 (6) (1995) 1293-1301.

119. N. Yang, R. Horn, Evidence for voltage-dependent S4 movement in sodium channels, Neuron 15 (1) (1995) 213-218.

120. D. M. Starace, E. Stefani, F. Bezanilla, Voltage-dependent proton transport by the voltage sensor of the Shaker K+ channel, Neuron 19 (6) (1997) 1319-1327.

121. S. Sokolov, T. Scheuer, W. A. Catterall, Ion permeation through a voltage- sensitive gating pore in brain sodium channels having voltage sensor mutations, Neuron 47 (2) (2005) 183-189.

122. D. Schmidt, Q.-X. Jiang, R. MacKinnon, Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors, Nature 444 (7120) (2006) 775-779.

123. V. Jogini, B. Roux, Dynamics of the Kvl.2 voltage-gated K-f- channel in a membrane environment, Biophys. J. 93 (9) (2007) 3070-3082.

124. Z. A. Sands, M. S. P. Sansom, How does a voltage sensor interact with a lipid bilayer? Simulations of a potassium channel domain, Structure 15 (2) (2007) 235-244.

125. J. A. Freites, D. J. Tobias, G. von Heijne, S. H. White, Interface connections of a transmembrane voltage sensor, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102 (42) (2005) 15059-15064.

126. Y. Ramu, Y. Xu, Z. Lu, Enzymatic activation of voltage-gated potassium channels, Nature 442 (7103) (2006) 696-699.

127. R. B. Darnian, A. A. Ivy, V. Ketty, R. O. Blaustein, Constraints on voltage sensor movement in the shaker K+ channel, J. Gen. Physiol. 128 (6) (2006) 687-699.

128. L. D. Islas, F. J. Sigworth, Electrostatics and the gating pore of Shaker potassium channels, J. Gen. Physiol. 117 (1) (2001) 69-89.

129. L. R. Phillips, M. Milescu, Y. Li-Smerin, J. A. Mindell, J. I. Kim, K. J. Swartz, Voltage-sensor activation with a tarantula toxin as cargo, Nature 436 (7052) (2005) 857-860.

130. M. Milescu, J. Vobecky, S. H. Roh, S. II. Kim, H. J. Jung, J. I. Kim, K. J. Swartz, Tarantula toxins interact with voltage sensors within lipid membranes, J. Gen. Physiol. 130 (5) (2007) 497-511.

131. B. Chanda, 0. K. Asamoah, R. Blunck, B. Roux, F. Bezanilla, Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement, Nature 436 (7052) (2005) 852-856.

132. Y. Jiang, V. Ruta, J. Chen, A. Lee, R. MacKinnon, The principle of gating charge movement in a voltage-dependent K+ channel, Nature 423 (6935) (2003) 42-48.

133. V. Ruta, J. Chen, R. MacKinnon, Calibrated measurement of gating-eharge arginine displacement in the KvAP voltage-dependent K+ channel, Cell 123 (3) (2005) 463-475.

134. N. Yang, A. L. George, R. Horn, Molecular basis of charge movement in voltage-gated sodium channels, Neuron 16 (1) (1996) 113-122.

135. F. V. Campos, B. Chanda, B. Roux, F. Bezanilla, Two atomic constraints unambiguously position the S4 segment relative to SI and S2 segments in the closed state of Shaker K channel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (19) (2007) 7904-7909.

136. G. M. Clayton, S. Altieri, L. Heginbotham, V. M. Unger, J. H. Morais-Cabral, Structure of the transmembrane regions of a bacterial cyclic nucleotide-regulated channel, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 105 (5) (2008) 1511-1515.

137. R. D. Keynes, F. Elinder, The screw-helical voltage gating of ion channels, Proc. Biol. Sci. 266 (1421) (1999) 843-852.

138. D. Papazian, F. Bezanilla, How Does an Ion Channel Sense Voltage?, News. Physiol. Sci. 12 (5) (1997) 203-210.

139. A. Cha, G. E. Snyder, P. R. Selvin, F. Bezanilla, Atomic scale movement of the voltage-sensing region in a potassium channel measured via spectroscopy, Nature 402 (6763) (1999) 809-813.

140. B. Chanda, O. K. Asamoah, R. Blunck, B. Roux, F. Bezanilla, Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement, Nature 436 (7052) (2005) 852-856.

141. B. E. Cohen, M. Grabe. L. Y. Jan, Answers and questions from the KvAP structures, Neuron 39 (3) (2003) 395-400.

142. J. E. Masse, R. Keller, AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic, J. Magn. Reson. 174 (1) (2005) 133151.

143. D. H. Wu, A. D. Chen, C. S. Johnson, An Improved Diffusion-Ordered Spectroscopy Experiment Incorporating Bipolar-Gradient Pulses, J. Magn. Reson. 115 (1) (1995) 260-264.

144. C. S. Johnson, Diffusion ordered nuclear magnetic resonance spectroscopy: principles and applications, Prog. NMR. Spect. 34 (3-4) (1999) 203-256.

145. J. J. Chou, J. L. Baber, A. Bax, Characterization of phospholipid mixed micelles by translational diffusion, J. Biomol. NMR. 29 (3) (2004) 299-308.

146. D. Lee, C. Hilty, G. Wider, K. Wiithrieh, Effective rotational correlation times of proteins from NMR relaxation interference, J. Magn. Reson. 178 (1) (2006) 72-76.

147. S. Grzesiek, A. Bax, Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31 kDa protein, J. Magn. Reson. 96 (2) (1992) 432-440.

148. L. E. Kay, G. Y. Xu, T. Yamazaki, Enhanced-Sensitivity Triple-Resonance Spectroscopy with Minimal H20 Saturation, J. Magn. Reson. 109 (1) (1994) 129-133.

149. D. R. Muhandiram, L. E. Kay, Gradient-Enhanced Triple-Resonance Three-Dimensional NMR Experiments with Improved Sensitivity, J. Magn. Reson. 103 (3) (1994) 203-216.

150. M. Salzmann, G. Wider, K. Pervushin, K. Wiithrich, Improved sensitivity and coherence selection for 15N,1H.-TR0SY elements in triple resonance experiments, J. Biomol. NMR. 15 (2) (1999) 181-184.

151. T. Diercks, M. Coles, H. Kessler, An efficient strategy for assignment of cross-peaks in 3D heteronuclear NOESY experiments, J. Biomol. NMR. 15 (2) (1999) 177-180.

152. R. Harris, E. Becker, S. C. de Menezes, R. Goodfellow, P. Granger, NMR Nomenclature: Nuclear Spin Properties and Conventions for Chemical Shifts. IUPAC Recommendations 2001, Solid State Nucl. Magn. Reson. 22 (4) (2002) 458-483.

153. J. M. Kneller, M. Lu, C. Bracken, An effective method for the discrimination of motional anisotropy and chemical exchange, J. Am. Chem. Soc. 124 (9) (2002) 1852-1853.

154. G. Lipari, A. Szabo, Model-free approach to the interpretation of nuclear magnetic resonance relaxation in macromolecules. 1. Theory and range of validity, J. Am. Chem. Soc. 104 (17) (1982) 4546-4559.

155. P. Dosset, J. G. Hus, M. Blackledge, D. Marion, Efficient analysis of macromolecular rotational diffusion from heteronuclear relaxation data, J. Biomol. NMR. 16 (1) (2000) 23-28.

156. Y. Shen, А. Вал:, Protein backbone chemical shifts predicted from searching a database for torsion angle and sequence homology, J. Biomol. NMR. 38 (4) (2007) 289-302.

157. A. Ortega, J. G. de la Torre, Hydrodynamic properties of rodlike and disklike particles in dilute solution, J. Chem. Phys. 119 (18) (2003) 99149919.

158. H. Duclohier, H. Wroblewski, Voltage-dependent pore formation and antimicrobial activity by alamethicin and analogues, J. Membr. Biol. 184 (1) (2001) 1-12.

159. A. 0. O'Reilly, B. A. Wallace, The peptaibol antiamoebin as a model ion channel: similarities to bacterial potassium channels, J. Pept. Sci. 9 (1112) (2003) 769-775.

160. L. R. Brown, C. Bosch, K. Wiithrich, Location and orientation relative to the micelle surface for glucagon in mixed micelles with dodecylphosphocholine: EPR and NMR studies, Biochim. Biophys. Acta. 642 (2) (1981) 296-312.

161. T. Asakura, K. Taoka, M. Demura, M. P. Williamson, The relationship between amide proton chemical shifts and secondary structure in proteins, J. Biomol. NMR. 6 (3) (1995) 227-236.

162. C. E. Johnson, F. A. Bovey, Calculation of Nuclear Magnetic Resonance Spectra of Aromatic Hydrocarbons, J. Chem. Phys. 29 (5) (1958) 10121014.

163. D. A. Case, Calibration of ring-current effects in proteins and nucleic acids, J. Biomol. NMR. 6 (4) (1995) 341-346.

Информация о работе

Парамонов, Александр Сергеевич
кандидата физико-математических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Структура и динамика вольт-сенсорного домена K+ канала KvAP по данным гетероядерной ЯМР-спектроскопии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы