Исследование и оптимизация бесклеточных систем экспрессии для производства рекомбинантных белков

Копеина, Гелина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование и оптимизация бесклеточных систем экспрессии для производства рекомбинантных белков
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование и оптимизация бесклеточных систем экспрессии для производства рекомбинантных белков"

На правах рукописи

Копеина Гелина Сергеевна

ИССЛЕДОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ БЕСКЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ ЭКСПРЕССИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ

Специальность: 03.01.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

004614169

2 5 НОЯ 2010

Москва-2010

004614169

Работа была выполнена в лаборатории биоинженерии белка Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и на кафедре биоинженерии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: к.б.н. E.H. Люкманова

Официальные оппоненты: доцент, д.х.н. В.В. Чупин

профессор, д.б.н. C.B. Машко

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Центр "Биоинженерия» РАН

Защита состоится «25» ноября 2010 г. в 14 ч. на заседании диссертационного совета Д.501.001.96 при кафедре биофизики Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан «22» октября 2010 г.

Ученный секретарь диссертационного совета, профессор, к.б.н.

М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Мембранные белки (МБ) составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Эти белки играют основную роль в процессах передачи сигналов, как на уровне отдельной клетки, так и на уровне целого организма. МБ обуславливают функционирование нервной, иммунной и эндокринной систем в качестве различных рецепторов, передающих сигналы через клеточную мембрану, а также в качестве ионных каналов, ответственных, за распространение импульсов вдоль нервных волокон. С прикладной точки зрения МБ представляют огромный интерес как мишени для создания новых фармакологических препаратов и в качестве объектов для биотехнологических разработок. В отличие от глобулярных водорастворимых белков, МБ остаются малоизученными, а примеры их удачного использования в области фармакологии и биотехнологии чрезвычайно редки. Основные трудности в исследовании и применении МБ обусловлены особенностями их пространственной организации. Большинство МБ представляют собой связки из нескольких трансмембранных (ТМ) спиралей. Так как ТМ спирали гидрофобны, МБ может иметь нативную структуру только в присутствии биологической мембраны или подходящей мембраномоделирующей среды. Это значительно затрудняет как получение достаточных количеств препаратов МБ в функционально-активной форме, так и их дальнейшие структурно-функциональные исследования и биотехнологическое применение.

В последнее время для продукции мембранных белков все большую популярность приобретают сопряженные бесклеточные системы синтеза (СБСС). На сегодняшний день выходы целевых белков в этих системах достигают нескольких миллиграммов с миллилитра трансляционной смеси (ТС), что дает возможность получать белковые препараты в количествах, необходимых для биологических, биохимических и биофизических исследований. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции. Во-первых, в такой системе синтезируется в основном целевой продукт, во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также агентов, позволяющих удерживать синтезируемый полипептид в нативной конформации. Для продукции МБ в ТС добавляют мембраномоделирующие компоненты, поддерживающие МБ в растворимой форме, такие как мицеллы детергентов, липосомы или липопротеиновые частицы (липид-белковые нанодиски, ЛБН). Кроме того, СБСС позволяют легко получать белковые препараты, селективно меченные стабильными изотопами, что в ряде случаев облегчает проведение структурных исследований белков методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Таким образом, разработка новых методов эффективной бесклеточной продукции МБ является актуальной задачей молекулярной биологии, биотехнологии и биофизики и открывает широкие перспективы для структурно-функциональных исследований и практического применения этих белков.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось исследование возможности применения СБСС на основе экстракта S30 из Е. coli для продукции МБ и их доменов в нативной конформации для дальнейшего изучения их структурных и функциональных свойств. В качестве объектов исследования были выбраны: внеклеточный домен никотинового ацетилхолинового рецептора человека а7 типа (а7ВД), ß-структурный белок, содержащий лиганд-связывающий участок; бактериородопсин из Exiguobacterium sibiricum (БР-ES), - фотоактивируемый протонный насос психротолерантных бактерий, состоящий из семи ТМ спиралей, структурный прообраз мембранных рецепторов, сопряженных с G-белками (рецепторов семейства GPCR); и вольт-сенсорный домен потенциалозависимого К+-канала KvAP из археи Aeropynim pernix (ВСД-KvAP), - структурный гомолог вольтсенсорных доменов потенциалозависимых Na+-, K+-, Са2+- и Н+-каналов млекопитающих, состоящий из четырех ТМ спиралей.

Данная цель подразумевает решение следующих задач:

1. Оптимизация бесклеточной системы синтеза на основе клеточного экстракта S30 из Е. coli для максимального увеличения выхода целевых белков;

2. Разработка эффективной системы бесклеточной продукции а7ВД, подбор условий выделения и очистки рекомбинантного белка в нативной конформации в количествах, достаточных для физико-химических и биологических исследований;

3. Исследование физико-химических свойств и биологической активности полученного препарата а7ВД;

4. Разработка эффективной системы бесклеточной продукции БР-ES, подбор условий получения белка в функционально-активной форме в количествах, достаточных для физико-химических и биологических исследований;

5. Разработка эффективной системы бесклеточной продукции ВСД-KvAP в нативной конформации в количествах, достаточных для физико-химических и биологических исследований;

6. Исследование возможности получения селективно меченых мембранных белков в бактериальной бесклеточной системе для структурных исследований методом ЯМР-спектроскопии на примере ВСД-KvAP.

Научная новизна и значимость работы. Все результаты, изложенные в данной диссертационной работе, получены впервые.

1. Впервые разработана эффективная система бесклеточного синтеза а7ВД в виде осадка ТС. Подобраны условия ренатурации этого белка из осадка ТС.

2. Проведен анализ физико-химических и биологических свойств а7ВД. Методами ЯМР-спектроскопии показано, что белок, ренатурированный из осадка ТС, демонстрирует селективность по отношению к а-нейротоксинам яда змей длинного и короткого типов, что свидетельствует о наличии у домена структуры, близкой к нативной.

3. Впервые разработана эффективная система бесклеточного синтеза БР-ES в растворимой форме с использованием липид-белковых нанодисков в качестве мембраномоделирующего компонента ТС. Наличие функциональной активности у МБ, встроенного в ЛБН, свидетельствует о наличии структуры БР-ES, близкой к нативной.

4. Впервые разработана эффективная система бесклеточного синтеза ВСД-KvAP в виде осадка ТС. Подобраны условия синтеза селективно меченого белка, а также условия его ренатурации из осадка ТС. Методами ЯМР-спектроскопии показано, что ренатурированный 15М-А1а-ВСД-КуАР имеет пространственную структуру, близкую к нативной.

В ходе данного исследования были разработаны и успешно применены эффективные методы бесклеточного синтеза для продукции ряда мембранных белков и их доменов. Методами ЯМР-спектроскопии и с помощью функциональных тестов для всех исследуемых белков было показано наличие пространственной структуры, близкой к нативной, что указывает на универсальность выбранного подхода. Таким образом, разработка систем бесклеточного синтеза открывает новые возможности для структурно-функциональных исследований не только никотинового ацетилхолинового рецептора, потенциалозависимого К+ канала KvAP и бактериородопсина из Exiguobacterium sibiricam, но может найти широкое применение в исследованиях и других мембранных белков.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на 33-м Конгрессе европейских биохимических сообществ (Афины, Греция, 2008), XVI Международном симпозиуме «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Украина, 2008), XX Зимней международной молодежной научной школе «Перспективы направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2008), 4-ой Международной конференции европейского нейрохимического общества «Успехи в изучении молекулярных механизмов неврологических заболеваний» (Лейпциг, Германия, 2009), Заочной электронной конференции Российской академии естествознания «Технологии живых систем» (2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии (Москва, Россия, 2009), Международной конференции «Евромар-2010» (Флоренция, Италия, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 2 статьи в отечественных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из Введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение), а также Заключения и Выводов. Работа проиллюстрирована 24 рисунками. Библиографический указатель содержит 166 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении рассмотрена актуальность темы диссертации, сформулированы цели и основные задачи работы, обоснованы практическое применение результатов, а также научная новизна и значимость работы.

В Главе 1 представлен литературный обзор, в котором рассмотрены принципы работы бесклеточных систем транскрипции-трансляции (сопряженных бесклеточных систем синтеза), история их открытия, основные методы их оптимального использования для получения рекомбинантных белков. Бесклеточные системы транскрипции-трансляции работают на основе содержимого клеток (клеточного экстракта). Клеточные экстракты содержат рибосомы, факторы инициации, элонгации и терминации, они способны синтезировать различные белки, как про-, так и эукариотического происхождения. Синтез белка инициируется добавлением компонентов, необходимых для биосинтеза белка (аминокислоты, нуклеозидтрифосфаты, Т7-полимераза, пируваткиназа, плазмидная ДНК, содержащая ген целевого белка). Аналитический вариант бесклеточной системы, часто применяемый для тестовых экспериментов (так называемая bateh-система), представляет собой находящуюся в одном объеме смесь клеточного экстракта, ферментов, матрицы и низкомолекулярных компонентов, таких как аминокислоты, нуклеозидтрифосфаты, соли. Однако для продукции белков в препаративных количествах используется другой вариант бесклеточной системы, - система диализного типа CECF (continuous exchange cell-free). Принцип ее работы заключается в том, что трансляционная смесь (ТС), содержащая высокомолекулярные компоненты, отделена от питающего раствора полупроницаемой мембраной (Рис. 1). Объем питающего раствора в 10-20 раз превосходит объем трансляционной смеси, поэтому концентрация низкомолекулярных веществ, необходимых для синтеза белка (аминокислоты, нуклеотиды, энергетические компоненты), остается достаточно высокой на протяжении многих часов. Данная система способна синтезировать целевой белок в течение всего времени инкубации (десятки часов), и выход продукта может составить несколько миллиграммов с одного миллилитра трансляционной смеси.

Рис. 1. Схема организации работы бесклеточной системы диализного типа.

Субстраты:

аминокислоты,

нуклеозидтрифосфаты

'X „

Побочные продукты: АМФ, АДФ, фосфаты

Питающий раствор

Кроме того, в литературном обзоре описаны разнообразные современные способы решения проблемы агрегации белка, с которой часто сталкиваются исследователи как при продукции рекомбинантных белков в клетках, так и с использованием бесклеточных систем. Кроме того, дано описание объектов исследования, их основных структурных и функциональных особенностей, а также их научной и практической значимости.

В Главе 2 рассмотрены экспериментальные методики, примененные в работе. Структурные исследования методами спектроскопии ЯМР проводились совместно с Шенкаревым 3.0. и Парамоновым A.C., сотрудниками лаборатории биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН.

В Главе 3 изложены основные результаты, полученные в ходе работы.

Продукция внеклеточного домена а7нАХР (а7ВД) в бесклсточной системе на основе бактериального экстракта S30 из Е. coli

Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР) являются лигандозависимыми ионными каналами, встроенными в постсинаптические мембраны нейронов. Эти рецепторы состоят из пяти гомологичных субъединиц, трансмембранные части которых образуют ионопроводящую пору, а внеклеточные jV-концспыс домены содержат сайты связывания лигандов (Рис. 2). Одним из широко распространенных в нервной системе млекопитающих является гомопентамер нАХР а 7 типа (а7нАХР), с дисфункциями которого связано развитие ряда тяжелых заболеваний нервной и эндокринной систем. Исследования нАХР и разработка препаратов для лечения подобных заболеваний требуют наличия высокоэффективных систем продукции отдельных субъединиц и доменов рецептора, создание которых затруднено из-за склонности этих белков к агрегации.

На сегодняшний день для бесклеточной продукции белковых препаратов наиболее часто применяют бесклеточную систему транскрипции-трансляции, основанную на использовании бактериального клеточного экстракта, так как эта система является наиболее продуктивной из существующих бесклеточных систем. В данной работе была исследована возможность применения бесклеточной системы на основе экстракта S30 из Е. coli для получения белков, содержащих дисульфидные связи, на примере внеклеточного домена никотинового ацетилхолинового рецептора а7 типа (а7ВД), содержащего две дисульфидные связи и один неспаренный остаток цистеина.

На основе полноразмерного гена а7нАХР человека (любезно предоставленного проф. Дж. Линдстромом, США) были получены последовательности генов а7ВД и его мутантной формы (a7B/]/DTES), содержащей замены, приводящие к повышению растворимости и стабильности домена (Рис. 2). Неспаренный остаток цистеина в положении 116 был заменен на остаток серина. Также была введена замена четырех гидрофобных аминокислотных остатков (Trpl34-Phe-Pro-Phel37) на гидрофильные Asp-Thr-Glu-Ser по аналогии с ацетилхолин-связывающим белком (АХСБ) из моллюска Lymnaea stagnalis. АХСБ - водорастворимый белок, состоящий из пяти одинаковых субъединиц, имеет 25% гомологии по

аминокислотной последовательности с а7ВД, является структурным гомологом внеклеточной части нАХР и взаимодействует с такими лигандами нАХР, как ацетилхолин, а-конотоксины и а-нейротоксины (Вге}с ег а1„ 2001). При анализе модели а7ВД, предложенной в работе (РтскаП-СаШап^ еГ а1., 2002), было замечено, что фрагмент (134-137)а7ВД имеет гидрофобную природу и, возможно, контактирует с мембранным окружением рецептора. В то же время гомологичный участок молекулы АХСБ содержит только гидрофильные аминокислотные остатки Авр-ТИг-Ии-Зег (Рис. 2). Было выдвинуто предположение, что замена четырех гидрофобных аминокислотных остатков фрагмента (134-137)а7ВД на остатки гомологичного участка АХСБ будет способствовать увеличению растворимости и стабильности а7ВД.

Гены а7ВД и а7ВД/ОТЕЯ с дополнительными последовательностями, кодирующими 6 остатков His на С-конце молекулы домена, были клонированы в плазмиды на основе коммерческого вектора рЕТ22Ь(+). Предварительные эксперименты показали, что при бесклеточной продукции практически весь препарат а7ВД накапливался в виде нерастворимого осадка ТС, в то время как -20% синтезированного препарата a7B,U/DTES оставалось в растворе. Поэтому дальнейшая работа была продолжена с мутантным вариантом a7B/VDTES.

Оптимизация бесклеточной системы для продукции аУВД/DTES

Для эффективной работы бесклеточной системы и увеличения выхода целевого продукта необходимо было определить оптимальные концентрации ионов Mg2+ и К+, а также плазмидной ДНК, содержащей последовательность a7B/tyDTES. Для подбора наилучших условий последовательно анализировали выход белка, синтезированного при разных концентрациях ацетата магния (от 7 мМ до 12 мМ) и ацетата калия (от 100 мМ до 180 мМ) и, определив оптимальные концентрации ионов магния и калия, подбирали концентрацию плазмидной ДНК (Рис. 3). Выход белка в каждом из экспериментов оценивали с помощью электрофоретического анализа продуктов трансляции в 12% ПААГ (Трис-трициновая буферная система с 0,1% SDS) с последующим денситометрическим анализом геля с помощью

Модель пространственной структуры нАХР. Сравнение модели субъединицы а7ВД и АХСБ. Схема введения мутаций в последовательность а7ВД. Розовыми стрелками показано расположение лиганд-связывающих участков.

Рис. 2.

программы OptiQuant Version 3. В результате анализа эффективности синтеза a7B/]/DTES было установлено, что оптимальными концентрациями ионов магния, калия и плазмидной ДНК являются 9 мМ, 120 мМ и 0,3 мг/мл, соответственно (Рис. 3). Общее количество синтезированного препарата a7B/VDTES при оптимальных условиях составило 1,53 мг с 1 мл трансляционной смеси.

1.R 1,8 1,4 1,2 1,0 0,8 0.8 0,4 0.2 0,0

1Л 1*

1,4 1,2 1J3 0,8 0,8 0,4 05 0,0

9 10 11 [Mg(OAc)J, мМ

140 180 [КОАс], мМ

1.8

1.6 ■

1,4

1.2

с 1.0

% "С 0.8

г 0.6

0,4

0,2

0,0

0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,5 [реТ22Ь|+)/а7вДО"ге31

Рис. 3. Анализ эффективности синтеза общего количества а7ВДЛ}ТЕБ в зависимости от концентрации ионов магния (А), ионов калия (Б), вектора рЕТ-22Ь(+)/сс7ВД/ОТЕ8 (В). Каждое значение получено на основе усреднения результатов двух повторных экспериментов, системная ошибка составляет не более 14%. Количественное содержание а7ВД/ОТЕ8 оценивали по сравнению с количеством очищенного препарата а7ВДЯЗТЕ8.

Синтез а7ВДЮТЕ5 в растворимой форме

Причиной преципитации и агрегации внеклеточного домена, возможно, служили неправильное формирование пространственной структуры, связанной с неправильным замыканием дисульфидных связей, и стремление домена рецептора к самопроизвольной пентамеризации, присущей а7ВД. Для решения проблем преципитации и агрегации мы применили несколько описанных в литературе подходов: подбор окислительно-восстановительных условий для правильного замыкания дисульфидных связей, синтез целевого белка в присутствии лиганда и синтез целевого белка в присутствии «мягкого» детергента. Для подбора оптимальных, условий синтеза а7ВДЯЗТЕ8 в растворимой форме в ТС добавляли смесь восстановленной (ввН) и окисленной форм (вБвО) глутатиона в разных соотношениях (от 1:1 до 1:10), низкомолекулярный агонист нАХР карбамоилхолин (КБМХ) с концентрацией от 10 до 100 мМ и «мягкий» неионный детергент бридж-35 с концентрацией до 1%. Было показано, что добавление в трансляционную смесь С8Н и ОЗЭО с концентрацией 0,1 мМ и 0,5 мМ, соответственно, повышало долю I растворимой фракции а7ВД/ЭТЕ8 до 50% (Рис. 4,11). Присутствие в ТС 20 мМ КБМХ также приводило к увеличению доли растворимой фракции домена до 50% (Рис. 4, III). Совмещение этих двух подходов не вызвало дополнительного

увеличения выхода растворимого белка (Рис. 4, IV). Добавление в ТС детергента бридж-35 в концентрации 0,5% как агента, препятствующего самопроизвольной пентамеризации, привело к синтезу практически полностью растворимого белка (Рис. 4, V-VI1I). Однако при дальнейшей очистке a7Bfl/DTES из растворимой фракции ТС с помощью металл-аффинной хроматографии происходила полная преципитация целевого белка. Поэтому были подобраны условия ренатурации a7Bfl/DTES из осадка ТС.

123123123 123 123 123 123123

116

66 И Ü

45 Л S

35 ш Я * i «: 1

18 *i i* Ж » Ц ш 1 i

14 Щ 9

II III IV V VI VII VIII

Рис. 4. Анализ с помощью электрофореза в 12% ПААГ синтеза а7ВД/ОТЕ8 в различных условиях: I - контроль; II- синтез в присутствии 0,1 мМ GSH/0,5 мМ GSSG; III - синтез в присутствии 20 мМ КБМХ; IV - синтез в присутствии смеси глутатионов и КБМХ; V - синтез в присутствии 0,5% бридж-35; VI - синтез в присутствии смеси глутатионов и детергента; VII - синтез в присутствии КБМХ и детергента; VIII - синтез в присутствии смеси глутатионов, КБМХ и детергента. 1 - трансляционная смесь, 2 - растворимая фракция ТС, 3 -нерастворимая фракция ТС.

Ренатурагцш а7ВДЮТЕ8 из осадка трансляционной смеси

Были опробованы различные подходы для солюбилизации осадка ТС, включая как использование 8 М мочевины, 6 М гуанидингидрохлорида, так и 1% раствора «жесткого» анионного детергента лаурилсаркозипа натрия (JIC). Наибольшая эффективность солюбилизации а7ВДЛЭТЕ8 из осадка ТС была достигнута при использовании смеси 4М мочевины и 1% JIC в присутствии дитиотрейтола (ДТТ). Ренатурацию a7Bfl/DTES осуществляли с помощью металл-аффинной хроматографии в результате промывки белкового препарата a7B,H/DTES, иммобилизованного на смоле Ni2+-Sepharose (GE Healthcare), буфером, содержащим смесь GSH/GSSG, с градиентным понижением концентрации мочевины и ЛС. После этого ренатурированный белок элюировали ступенчатым градиентом имидазола (100 мМ и 500 мМ). Однако полученный белковый препарат a7Bfl/DTES обладал низкой стабильностью в растворе. Тогда был использован вариант ренатурации, в котором 1% JIC постепенно заменяли 0,2% раствором (3-додецилмальтозида (ДДМ) или 0,2% додецилфосфохолина (ДФХ). После промывки смолы с иммобилизованным белковым препаратом буфером, содержащим соответствующий детергент и смесь GSH/GSSG, белок элюировали буфером со

ступенчатым градиентом имидазола 100 мМ и 500 мМ, также содержащим соответствующий детергент.

В результате были получены стабильные (более 1 месяца при +4 °С) белковые препараты с конечным выходом 0,6 мг белка с 1 мл трансляционной смеси. Препараты а7ВДШТЕ5 в ДДМ и ДФХ были проанализированы с помощью гель-фильтрации (Рис. 5 А). Было показано, что в случае использования ДДМ белок находился преимущественно в виде растворимых высокомолекулярных агрегатов (Рис. 5 А). Использование ДФХ позволило получить гомогенный (>90%) препарат а7ВДД}ТЕ8 с диаметром частиц около 7 нм, что соответствует размеру мономера внеклеточного домена нАХР (диаметр ~5 нм) в комплексе с мицеллой ДФХ (диаметр ~4 нм). Анализ вторичной структуры а7ВДЮТЕ8 в растворе ДФХ методом КД-спектроскопии выявил преобладание р-структуры, что соответствует теоретически рассчитанным данным (Рис. 5 Б).

35.5

диаметр Стокса, нм 22.8 14.6 9.4 6.0

! 10 " I

5 -

Эксп. Теор.

а-струстура 10.4% 8%

ß-струиура 58.4 % 47%

неуп. струи: 31.2% 45%

2.0 2.5 объем элюции, мл

200

220

длина волны,нм

240

Рис. 5. (А). Анализ препарата a7B/]/DTES в растворе детергентов ДФХ и ДЦМ с помощью гель-фильтрации на смоле Superdex-200 (колонка Tricorn 5/200, GE Healthcare). (Б). КД-спектр a7Bfl/DTES в растворе детергента ДФХ.

Способность a7Bfl/DTES в растворе детергента ДФХ взаимодействовать со специфическими лигандами нАХР была исследована методом одномерной ЯМР-спектроскопии с использованием 151Ч-меченого аналога химерного нейротоксина NTII/NTI, a-нейротоксина длинного типа, и 1 ^-меченого аналога нейротоксина NTII из яда Naja oxiana, a-нейротоксина короткого типа (Рис. 6). Растворы нейротоксинов в мицеллах детергента ДФХ титровали раствором домена рецептора в ДФХ и по ослаблению сигналов токсинов в ID 15N-HSQC спектрах ЯМР судили о взаимодействии токсинов с a7Bfl/DTES (Рис. 6). Описание изотермы связывания проводили с помощью уравнения Хилла, что позволило оценить коэффициент кооперативное™ п и эффективную константу взаимодействия нейротоксинов с внеклеточным доменом. Было показано, что каждая молекула домена специфически связывает две молекулы нейротоксина NTII/NTI с эффективной константой связывания ~ 4,8 ± 0,5 мкМ и сравнительно большой кооперативностью (коэффициент Хилла 1,8). Взаимодействие a7Bfl/DTES с NTII происходило с константой связывания - 229 ±15 мкМ, что свидетельствует о селективности взаимодействия полученного препарата внеклеточного домена нАХР по

отношению к а-нейротоксинам короткого и длинного типов, что соответствует биологическим свойствам природного рецептора.

Таким образом, была разработана новая эффективная система бесклеточной продукции внеклеточного домена а7нАХР, обладающего структурными и функциональными свойствами, близкими к свойствам природного рецептора. Применение детергента ДФХ в процессе ренатурации домена из осадка ТС способствовало стабилизации белка в растворе, что позволило получить внеклеточный домен в биологически активной форме. Разработка данной системы бесклеточного синтеза открывает новые перспективы для структурно-функциональных исследований взаимодействия нАХР с его лигандами.

ЛI vXVAWV I

"Г

.......ф............. .............

—•— NTII/NTI

-■a— NTII

---- разведение

■ 1 1 1 1 1 1

H, М.Д.

a7Bfl/DTES, mkM

Рис. 6. (A). ID N-HSQC спектры ЯМР токсина NTII/NTI в присутствии мицелл детергента ДФХ при возрастающей концентрации (iTBfl/DTES. (Б). Полученные изотермы связывания а-нейротоксинов NTII/NTI (показана черными точками) и NTII (показана незаполненными квадратами). Кривая разведения показана пунктирной линией.

Получение бактериородопсина из Exiguobacterhun sibiricum (БР-ES) в

бесклеточной системе на основе бактериального экстракта S30 из Е. coli

Бактериородопсин - мембранный светочувствительный белок, который осуществляет перенос протона через плазматическую мембрану. Каждая молекула бактериородопсина состоит из двух компонентов: белка-опсина, имеющего в своем составе семь ТМ спиралей, и хромофора ретиналя. Бактериородопсин из Е. sibiricum был впервые описан в (Petrovskaya et al., 2010). Этот белок состоит из 252 а.о. и имеет характерный спектр поглощения в видимой области с максимумом при длине волны 534 им. Препараты БР-ES в нативной конформации имеют пурпурную окраску, что значительно упрощает идентификацию функционально-активной фракции белка при рекомбинантной продукции. БР-ES является структурным прообразом рецепторов семейства GPCR, которые рассматриваются как наиболее перспективные фармакологические мишени для разработки новых биомедицинских препаратов. Таким образом, разработка системы рекомбинантной продукции БР-ES является необходимым этапом для структурно-функциональных исследований самого бактериородопсина и имеет большое значение для исследования рецепторов семейства GPCR.

В данной работе была использована генетическая конструкция на основе коммерческого вектора рЕТ32а(+), содержащая ген БР-ЕБ с дополнительной гексагистидиновой последовательностью на С-конце молекулы, любезно предоставленная сотрудницей лаборатории биоинженерии белка ИБХ РАН Петровской Л.Е.

БР-ЕБ синтезировали в бесклеточной системе в течение 20 часов в присутствии а//-/га/г.9-ретиналя, после чего растворимую и нерастворимую фракции ТС анализировали с помощью электрофореза и иммуноблотинга. Было показано, что большая часть синтезированного белка (~ 80%) формирует нерастворимый осадок ТС. Как и в случае а7ВД/Т)ТЕ8, для увеличения выхода БР-ЕБ была проведена оптимизация бесклеточной системы по концентрации ионов магния, калия, а также плазмиды. Было выявлено, что оптимальными концентрациями для синтеза БР-ЕБ являются 8 мМ \^(ОАс)2, 70 мМ КОАс и 0,25 мг/мл плазмидной ДНК. Оптимизация бесклеточной системы позволила увеличить общее количество синтезированного белка до 1,64 мг/мл ТС.

Синтез БР-ЕБ в растворимой форме в присутствии детергентов

Для бесклеточной продукции мембранных белков в растворимой форме наиболее часто применяют подход, основанный на добавлении в трансляционную смесь мицелл неионных детергентов, таких как бридж-35, бридж-58, бридж-78, бридж-98, тритон-ХЮО, твин-20. Для синтеза БР-ЕБ в растворимой форме были опробованы все эти детергенты, а также цвиттеррионный детергент ДФХ, наиболее часто используемый детергент для структурных исследований мембранных белков методами ЯМР-спектроскопии, и неионный детергент ДДМ, способный поддерживать нативную структуру бактериородопсина, выделенного из мембран бактерий. Кроме того, во всех случаях в трансляционную смесь добавляли аИАгат-ретиналь до конечной концентрации 100 мкМ. Долю растворимого белка определяли с помощью денситометрического анализа после проведения гель-электрофореза и иммуноблотинга растворимой и нерастворимой фракций ТС (Рис. 7 А).

Было показано, что использование детергентов бридж-35, бридж-58, бридж-78 и бридж-98 приводило к значительному повышению доли растворимого БР-ЕБ, составляющей 65,2%, 73,2%, 63,8% и 70,7%, соответственно, от общего количества синтезированного белка. Добавление в ТС мицелл детергентов тритон-ХЮО и твин-20 не приводило к заметному увеличению количества растворимого белка, в то время как добавление в ТС детергентов ДФХ и ДДМ существенно подавляло синтез белка (Рис. 7 А).

Несмотря на высокое содержание растворимой формы БР-ЕБ, синтезированного в присутствии мицелл детергентов семейства бридж, ни в одном из экспериментов не наблюдалось изменения окраски ТС, что свидетельствовало об отсутствии функциональной активности у синтезированного белка. Видимо, молекулы БР-ЕБ в присутствии мицелл этих детергентов не принимали нативной конформации и не взаимодействовали с а//-/гаш'-ретиналем, что было подтверждено спектрофотометрическим анализом.

• общее количество синтезированного белка □ количество белка, ассоциированного с ЛБН □ количество белка в растворимой форме □ количество функционально активного белка

Рис. 7. Подбор условий бесклеточного синтеза БР-ES в растворимой форме в присутствии различных мембраномоделирующих компонентов и (¡/¡-irans-ретиналя. (А). Синтез в отсутствие и в присутствии мицелл различных детергентов. (Б). Синтез в присутствии ЛБН разного липидного состава. Количество белка, ассоциированного с ЛБН, рассчитывалось для фракций, элюированных буфером, содержащим 250 мМ имидазола, в результате очистки растворимой фракции ТС с помощью металл-афинной хроматографии. Каждое значение получено на основе усреднения результатов двух повторных экспериментов, системная ошибка составляет не более 13%. Количественное содержание БР-ES оценивали по сравнению с количеством очищенного препарата БР-ES в присутствии мицелл детергента бридж-98. В контрольном эксперименте ТС не содержала каких-либо мембраномоделирующих компонентов.

Синтез БР-ES в присутствии липид-белковых нанодисков

Альтернативным подходом для синтеза мембранных белков в растворимой форме является использование липопротеиновых частиц или липид-белковых нанодисков (ЛБН) в качестве мембраномоделируюшего компонента ТС (Katzen et al„ 2008). Каждый ЛБН представляет собой фрагмент бислойной мембраны дискоидальной формы (-150-200 молекул липидов), боковая поверхность которого экранирована от раствора двумя молекулами аполипопротеина (в этой работе использовали фрагмент (42-243) аполипопротеина AI человека, так называемый MSP) (Рис. 8 А). Препараты липид-белковых нанодисков были любезно предоставлены лабораторией биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН.

Для продукции БР-ES в растворимой форме был опробован подход, основанный на добавлении в ТС ЛБН. Были использованы ЛБН различного липидного состава, содержащие в качестве липидов либо димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ), либо димиристоилфосфатидилглицерол (ДМФГ), либо пальмитоил-олеилфосфатидилхолин (ПОФХ), либо смесь (4:1) ПОФХ и диолеилфосфатидилглицерола (ДОФГ). Во всех случаях в трансляционную смесь кроме ЛБН добавляли a/Z-fra/к-ретиналь до конечной концентрации 100 мкМ. Было показано, что в присутствии ЛБН, независимо от их липидного состава, при синтезе БР-ES происходило окрашивание ТС в характерный пурпурный цвет (Рис. 8 Б). Спектрофотометрический анализ окрашенных

растворимых фракций ТС выявил пик поглощения с максимумом при длине волны 534 нм (Рис. 8 В), что в свою очередь свидетельствовало о синтезе БР-Е5 в функционально-активной форме.

400

450

500 550 600 длина волны, нм

650

700

Рис. 8. (А). Схема организации липид-белковых нанодисков, содержащих мембранный белок. Желтым и розовым цветом показаны молекулы липидов, молекулы аполипопротеина показаны в виде фиолетового тора, мембранный белок, встроенный в ЛБН, показан зеленым цветом. (Б) -фотография растворимой фракции ТС после синтеза БР-Е5 в присутствии ЛБН-ДМФХ, демонстрирующая характерную пурпурную окраску. (В). Спектрофотометрический анализ растворимых фракций ТС, содержащих синтезированный БР-ЕБ в присутствии ЛБН различного липидного состава.

Денситометрический анализ гелей и мембран, полученных после гель-электрофореза и иммуноблоттинга растворимой и нерастворимой фракций ТС показал, что наибольший выход растворимого белка достигается при использовании ЛБН, состоящих из ненасыщенных липидов ПОФХ или из смеси липидов ПОФХ/ДОФГ (Рис. 7 Б). При использовании ЛБН, состоящих из насыщенных липидов ДМФХ, выход растворимого белка был несколько ниже, чем в случае использования ЛБН, сформированных на основе ненасыщенных липидов. Самый низкий выход растворимого белка наблюдался при использовании ЛБН, состоящих из насыщенных заряженных липидов ДМФГ. При этом необходимо отметить, что использование любого из четырех типов ЛБН обеспечивало сравнительно высокий выход активной формы БР-ES: от 0,4 мг/мл до 0,9 мг/мл ТС (Рис. 7 Б).

С помощью металл-афинной хроматографии было проведено аналитическое выделение БР-ES из растворимой фракции ТС. Электрофорез очищенных фракций показал, что большая часть БР-ES выделяется совместно с MSP, входящим в состав ЛБН, что указывает на ассоциацию бактериородопсина с мембраной ЛБН в процессе трансляции. Во всех случаях больше половины очищенных комплексов BP-ES/ЛБН содержалось во фракциях, элюированных буфером, содержащим 250 мМ имидазола. При этом содержание БР-ES в этих фракциях составляло от 0,3 до 0,5 мг/мл ТС (Рис. 7 Б). Оставшаяся часть комплексов BP-ES/ЛБН содержалась во фракциях, элюированных более высокой концентрацией имидазола (500 мМ), что

указывает на возможное встраивание нескольких копий молекул бактериородопсина в мембрану ЛБН.

С целью определения размеров комплексов БР-ES/JIEH методом гель-фильтрации был проведен анализ фракций, элюированных 250 мМ имидазола (Рис. 9). Анализ с помощью гель-фильтрации показал, что только в случае использования ЛБН, состоящих из насыщенных липидов ДМФХ или ДМФГ, размер комплексов BP-ES/ЛБН незначительно увеличивается по отношению к размеру «пустых» нанодисков (10 нм), что соответствует литературным данным о размерах комплексов МБ/ЛБН. При использовании ЛБН, состоящих из ненасыщенных липидов ПОФХ или смеси ПОФХ/ДОФГ, размеры комплексов BP-ES/ЛБН заметно превосходят размеры «пустых» ЛБН, причем в этих случаях хроматографические профили содержат дополнительные пики, соответствующие мономеру MSP (Рис. 9 Б). Вероятно, при встраивании БР-ES в ЛБН, сформированных на основе ненасыщенных липидов, происходит частичное разрушение изначальной структуры нанодисков с высвобождением молекул аполипопротеина и образованием более крупных мембранных комплексов, содержащих бактериородопсин. При этом стоит особо отметить, что до 80% очищенного бактериородопсина находится в функционально активной форме, независимо от липидного состава ЛБН, использованного при синтезе белка (Рис. 7 Б).

Таким образом, была разработана эффективная система бесклеточной продукции бактериородопсина из Е. sibiricum в растворимой форме. Было показано, что использование липид-белковых нанодисков, состоящих из насыщенных липидов ДМФХ и ДМФГ, позволяет получить препараты BP-ES/ЛБН, содержащие целевой белок в функционально-активной форме с выходом до 0,4 мг/мл ТС.

Рис. 9. Хроматографический анализ (с помощью гель-фильтрации на смоле Superdex-200) ЛБН разного липидного состава до (А) и после (Б) синтеза БР-ES:

1 - ЛБН-ДМФХ,

2 - ЛБН-ДМФГ,

3 - ЛБН-ПОФХ,

4 - ЛБН-ПОФХ/ДОФГ. Стрелками показан пик хроматографического профиля, соответствующий мономеру MSP.

диаметр Стокса, т диаметр Стокса, нм

Получение вольт-сенсорного домена К+-канала КуАР из Аегоругит ретЬс в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта 830 из Е. соИ

Потенциалозависимые каналы активируются при изменении ТМ электрического потенциала и играют ключевую роль в распространении нервных

импульсов вдоль мембран нейронов, в возбуждении мышечных клеток, а также участвуют в поддержании осмотического баланса клетки. Большинство потенциалозависимых катионных каналов (Н+, К+, Na+ и Са2+) имеют в своем составе гомологичные вольт-сенсорные домены (ВСД), состоящие из четырех ТМ спиралей. Правильное функционирование этих доменов необходимо для жизни большинства животных, и именно ВСД являются мишенями для многих токсинов из ядов змей, моллюсков и членистоногих. Нарушение работы ВСД приводит к возникновению ряда нервных, мышечных и кардиологических заболеваний. В настоящее время аспекты структурной организации вольт-сенсорных доменов и механизмы их потенциалозависимой активации остаются малоизученными. Исследования ВСД актуальны для создания новых терапевтических средств, направленных на лечение судорожных расстройств и аритмий.

Получение селективно меченого аналога ВСД-KvAP

Получение белков, селективно меченных стабильными изотопами 13С и l5N, имеет большое значение для современных структурных исследований МБ методами ЯМР-спектроскопии. Использование систем клеточной продукции для этой цели малоэффективно из-за возможного перераспределения меченых субстратов в процессе жизнедеятельности клетки. Поэтому для получения селективно меченых белков все большей популярностью пользуются бесклеточные системы. Возможность получения селективно меченых мембранных белков в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта S30 из Е. coli была изучена на примере вольт-сенсорного домена потенциалозависимого К+ канала KvAP из археи Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP). Плазмидная конструкция на основе коммерческого вектора рЕТ28а(+), содержащая ген, кодирующий последовательность ВСД-KvAP с дополнительной гексагистидиновой последовательностью на С-конце молекулы, была любезно предоставлена сотрудницей лаборатории биоинженерии белка ИБХ РАН Шингаровой JLH. ВСД-KvAP синтезировали в бактериальной бесклеточной системе в течение 20 часов. Анализ продуктов трансляции с помощью гель-электрофореза и иммуноблотинга показал, что в процессе синтеза большая часть целевого белка образует нерастворимый осадок. Была проведена оптимизация бесклеточного синтеза ВСД-KvAP, и было показано, что оптимальными концентрациями ионов магния, калия и плазмиды являются 9 мМ, 110 мМ и 0,3 мг/мл, соответственно. Выход белка в оптимальных условиях составил 1,4 мг/мл ТС.

Селективно меченый вариант ВСД-KvAP был получен путем замены в ТС и питающем растворе аминокислоты аланин на 15М-меченый аналог аланина. Для проверки селективности включения изотопной метки по остаткам аланина синтезированный в виде осадка ТС препарат 15Ы-Л1а-ВСД-К\'АР был проанализирован методом гетероядерной 'H,'5N ЯМР-спектроскопии (Рис. 10). Белковый осадок ТС растворяли в трифторэтаноле (ТФЭ) и анализировали 'Н,15Ы-корреляционный ЯМР-спектр солюбилизированного белка. В спектре присутствовало 15 сигналов, соответствующих 15-ти остаткам аланина (Рис. 10). Сравнение ЯМР-спектров 15М-А1а-мсченого ВСД-KvAP со спектром тотально 15N-

меченого белка, полученного в результате экспрессии в Е. coli и также растворенного в ТФЭ, выявило полное совпадение химических сдвигов для наблюдаемых кросс-пиков остатков аланина (Рис. 10), что свидетельствует о селективном включении изотопной метки l5N. Таким образом, было подтверждено, что в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта можно получать препараты мембранных белков, меченные стабильными изотопами по определенным аминокислотным остаткам.

область молекулы, доступная растворителю

Рис. 10. (А). Схематическое изображение молекулы ВСД-KvAP. (Б). 2D 'H,15N-HSQC ЯМР-спектры ВСД-KvAP, растворенного в трифторэтаноле (ТФЭ). Красными контурами обозначен спектр 151Ч-А1а-ВСД-КуАР, полученного в бесклеточной системе, черными контурами - спектр |5Ы-ВСД-КуАР, полученного в результате экспрессии в Е. coli. Спектры были получены на ЯМР-спектрометре с рабочей частотой 700 МГц, при 45 °С.

Синтез ВСД-KvAP в растворимой форме в присутствии детергентов

Для синтеза ВСД-KvAP в растворимой форме были протестированы детергенты, которые использовались для получения БР-ES: ДФХ, ДДМ, бридж-35, бридж-58, бридж-78, бридж-98, тритон-ХЮО, твин-20. В ТС и питающий раствор добавляли детергенты до конечной концентрации 1%. Распределение продуктов трансляции между растворимой и нерастворимой фракциями ТС анализировали с помощью гель-электрофореза и иммуноблоттинга с последующим денситометрическим анализом. Было показано, что как и в случае с БР-ES детергенты ДФХ и ДДМ ингибировали синтез целевого белка, а использование детергентов твин-20 и тритон-ХЮО не способствовало синтезу домена в растворимой форме. Использование мицелл детергентов бридж-58, бридж-78, бридж-98 в качестве мембраномоделирующего компонента ТС приводило к повышению доли растворимого белка до 50%. В присутствии мицелл детергента бридж-35 синтезировалось наибольшее количество ВСД-KvAP в растворимой форме (0,9 мг/мл), что составляло 79,5% от общего количества синтезированного

белка (Рис. 11 А). Таким образом, для синтеза ВСД-К\'АР в растворимой форме оптимальным является использование детергента бридж-35.

общее количество синтезированного белка О количество белка, ассоциированного с ЯБН о количество белка в растворимой форме

1.61.41.21.0-

I 0.82

0.60.40.20.0-

J' JS^ # JP JP /Р ДМФХ ДМФГ ПОФХ ПОФХ/ДОФГ

* V / ^ / / J- J~

to<f й? «jO липидныи состав ЛБН

Рис. 11. Подбор условий синтеза ВСД-KvAP в растворимой форме. (А). Синтез в отсутствие и в присутствии мицелл различных детергентов. (Б). Синтез в присутствии ЛБН различного липидного состава. Количество белка, ассоциированного с ЛБН, рассчитывалось для фракций, элюированных буфером, содержащим 250 мМ имидазола, в результате очистки растворимой фракции ТС с помощью металл-афинной хроматографии. Каждое значение получено па основе усреднения результатов двух повторных экспериментов, системная ошибка составляет не более 16%. Количественное содержание ВСД-KvAP оценивали по сравнению с количеством очищенного препарата ВСД-KvAP, полученного из Е. coli.

Препаративный синтез 15Ы-А1а-меченого ВСД-KvAP был осуществлен в присутствии бридж-35. Синтезированный белок выделяли из растворимой фракции ТС с помощью металл-аффинной хроматографии. Анализ с помощью электрофореза в 12% ПААГ очищенного белка показал, что большая часть препарата ВСД-KvAP представляет собой высокомолекулярные водорастворимые агрегаты (Рис. 12 А). Анализ ,5М-А1а-ВСД-КуАР методом гетероядерной 'Н,1^ ЯМР-спектроскопии и сравнение 'H,I5N-HSQC ЯМР-спектра этого белка со спектром тотально 15М-меченого домена в смеси детергентов ДФХ/ЛДАО, выделенного в нативном состоянии из мембран Е. coli, подтвердил, что белок находится в неструктурированном состоянии (Рис. 12 Б, В). На это указывает отсутствие в спектре селективно меченого белка сигналов остатков аланина 72, 96 и 100, имеющих характерное положение в спектрах ВСД-KvAP с нативной структурой (Shenkarev et. al., 2010).

Таким образом, было показано, что молекулы ВСД-KvAP в результате бесклеточного синтеза в растворимом виде в присутствии мицелл детергента не принимают нативной конформации. Поэтому для продукции вольт-сенсорного домена в растворимой форме были опробованы липид-белковые нанодиски, которые были успешно применены для синтеза растворимого БР-ES в фукционалыю-активной форме.

------------------d | ... '.___ ____

"У'г^П'йГ .... 1 1—1 тНт

116 -

66 —

45 ш к

35 -I

25 -1

И Л»

А 1 2 3

U м.д. 7 11

,sN-BCA-KvAP/fl®XmflAO Б ' , ,sN-Ala-BCfi-KvAPI6p»fl!K-35 В

• . iL'

110

115_

1Л 120~

Рис. 12. (А). Электрофоретический анализ ВСД-KvAP, синтезированного в присутствии мицелл детергента бридж-35. 1- маркер молекулярных масс, 2- препарат очищенного с помощью металл-афинной хроматографии ВСД-KvAP, 3- препарат ВСД-KvAP, выделенного из мембран Е. coli. (Б). 2D 'H,15N-HSQC ЯМР-спектр 15N-BCfl-KvAP в мицеллах ДФХ/ЛДАО, выделенного из мембран Е. coli в нативиой конформации. Кружочками обведены сигналы остатков аланина 72, 96 и 100, имеющие характерное положение в спектрах домена с нативной пространственной структурой. (В). 2D 'H,i5N-HSQC ЯМР-спектр I5N-Ala-BCfl-KvAP в мицеллах бридж-35. Спектры получены на ЯМР-спектрометре с рабочей частотой 700 МГц, при 45 °С, pH 5,0.

Синтез ВСД-KvAP в присутствии липид-белковых нанодисков

Как и в случае с БР-ES, для синтеза ВСД-KvAP в растворимой форме в трансляционную смесь в качестве мембраномоделирующего компонента добавляли ЛБН разного липидного состава: содержащие либо насыщенные липиды ДМФХ или ДМФГ, либо ненасыщенные липиды ПОФХ, или смесь ненасыщенных липидов ПОФХ/ДОФГ. Анализ продуктов трансляции с помощью гель-электрофореза и иммуноблоттинга с последующим денситометрическим анализом показал, что в присутствии любого из четырех типов ЛБН ВСД-KvAP синтезируется преимущественно в растворимой форме, при этом выход растворимого белка составляет до 1 мг/мл ТС (Рис. 11 Б).

Для оценки количественного выхода синтезированного белка, ассоциированного с ЛБН, проводили аналитическое выделение ВСД-KvAP из растворимой фракции ТС с помощью металл-афинной хроматографии. Очищенные фракции были проанализированы методом гель-электрофореза. Как и в случае с EPES лишь ~ 50% от общего количества синтезированного белка было ассоциировано с аполипопротеином и содержалось во фракциях, элюированных 250 мМ имидазола (Рис. 12 Б). Эти фракции, содержащие ВСД-KvAP и MSP, были проанализированы с помощью гель-фильтрации (Рис. 13). Было показано, что только в случае использования ЛБН, состоящих из насыщенных липидов, размер комплексов ВСД-KvAP/ЛБН был близок к размеру, ожидаемому для комплексов МБ/ЛБН (~ 10 нм). Использование ЛБН, сформированных на основе ненасыщенных липидов, как и в случае бактериородопсина, приводило к высвобождению молекул аполипопротеина и формированию более крупных мембранных комплексов, содержащих целевой белок (Рис. 13). Таким образом, для синтеза в препаративных количествах

селективно меченого ВСД-KvAP в растворимой форме были выбраны ЛБН, состоящие из насыщенных липидов ДМФХ и ДМФГ. Стоит отметить, что согласно данным гель-электрофореза в отличие от препарата ВСД-КуАР/бридж-35 в препаратах ВСД-КуАР/ЛБН практически отсутствовали агрегаты домена.

Рис. 13. Хроматографический анализ (с помощью гель-фильтрации на смоле Superdex-200) ЛБН разного липидного состава до (А) и после (Б) синтеза ВСД-KvAP:

1 - ЛБН-ДМФХ,

2 - ЛБН-ДМФГ,

3 - ЛБН-ПОФХ,

4 - ЛБН-ПОФХ/ДОФГ. Стрелками показан пик хроматографического профиля, соответствующий мономеру MSP.

Препараты 15N-Ala-ВСД-KvAP, синтезированные в присутствии ЛБН/ДМФХ и ЛБН/ДМФГ и очищенные с помощью металл-афинной хроматографии, были проанализированы методом спектроскопии ЯМР (Рис. 14). Были получены 'H-15N-TROSY ЯМР-спектры 15N-Ala-BCfl-KvAP, ассоциированного с ЛБН/ДМФХ и ЛБН/ДМФГ. Сравнение этих спектров со спектром тотально меченого 151Ч-ВСД-KvAP в мицеллах ДФХ/ЛДАО, выделенного в нативном состоянии из мембран Е. coli, выявило отсутствие в спектрах селективно меченого домена сигналов остатков аланина, характерных для структурированного белка (Рис. 14).

диаметр Стокса, нм диаметр Стокса, им

кДа

1Н. м.д. 7 11

А 116 - _ "N-BQIl-KvAP/AOXfflflAO Б •• g ,sN-Ala-BCfl-KvAP/flBHfflM®X

66 —

45 —• 35 — ' •• 'iL' f

MSP 25 —

18 —

ВСД-KvAP ■ •

14 — • *

1 2 ®

105 110

1151

12о"

125 130

Рис. 14. (А). Электрофоретический анализ N-Ala-BCfl-KvAP, синтезированного в присутствии ЛБН/ДМФХ. 1 - маркер молекулярных масс, 2- препарат очищенного с помощью металл-афинной хроматографии ВСД-КуАР/ЛБН/ДМФХ. (Б). 2D 'H,15N-HSQC ЯМР-спектр ,5N-BCfl-KvAP в мицеллах ДФХ/ЛДАО, выделенного из мембран Е. coli в нативной конформации. Кружочками обведены сигналы остатков аланина 72. 96 и 100, имеющие характерное положение в спектрах домена с нативной пространственной структурой. (В). 2D 'H,15N-TROSY ЯМР-спектр 151Ч-А1а-ВСД-КуАР в составе ЛБН/ДМФХ. ЯМР-спектры 15N-Ala-ВСД-KvAP в составе ЛБН/ДМФГ и ЛБН/ДМФХ практически полностью совпадали. Спектры получены на ЯМР-спектрометре с рабочей частотой 700 МГц, при 45 °С, pH 5,0 (Б) и pH 7,0.

Видимо, нативная структура ВСД-Кл/АР не формировалась при встраивании молекулы домена в ЛБН. Это можно объяснить особенностями пространственной организации ВСД-КуАР (Рис. 10 А). Дело в том, что молекула домена содержит значительное количество заряженных аминокислотных остатков, которые стабилизируют пространственную структуру домена (связку из четырех ТМ спиралей) путем образования солевых мостиков (Рис. 10 А). Вероятно, именно заряженные группы ВСД-КуАР препятствуют встраиванию спиралей домена в мембрану ЛБН в ТМ ориентации, оставляя спирали домена в поверхностно-связанном состоянии.

Ренатурспщя ВСД-Кл'АР из осадка трансляционной смеси

Альтернативным подходом для бесклеточной продукции МБ в нативной конформации является синтез белка в виде осадка ТС в отсутствие каких-либо . мембраномоделирующих компонентов с последующей ренатурацией. Для растворения осадка ТС, сформированного из синтезированного ВСД-Кл'АР, были опробованы мочевина и такие денатурирующие детергенты как додецилсульфат натрия (ДСН) и лаурилсаркозин натрия (ЛС). Ренатурацию проводили во всех случаях по одной схеме: сначала осадок ТС, содержащий синтезированный ВСД-КуАР, растворяли с помощью того или иного денатурирующего детергента с добавлением или без добавления хаотропного агента. Дальнейшую ренатурацию проводили с помощью металл-афинной хроматографии: белок в денатурированном состоянии связывали со смолой №2+-8ер11аго8е, затем постепенно понижали концентрацию мочевины, промывая смолу буфером, содержащим только денатурирующий детергент. После этого происходила постепенная замена денатурирующего детергента на ДФХ в результате промывки смолы буфером, содержащим ДФХ. Ренатурированный ВСД-КуАР элюировали в присутствии 0,2 % ДФХ ступенчатым градиентом имидазола (100 мМ, 300 мМ и 500 мМ).

Анализ препаратов ВСД-КуАР после ренатурации методом гель-электрофореза показал, что одновременное применение для растворения осадка ТС 8М мочевины и 2% ДСН являлось необходимым условием для получения ренатурированного белка в гомогенном виде (Рис. 15). Выход ренатурированного продукта составил 0,6 мг/мл ТС.

Рис. 15. Электрофоретический анализ в 12% ПААГ препаратов ВСД-К.уАР, ренатурированных из осадка ТС. 1-препарат ренатурированного ВСД-КуАР, растворение осадка ТС осуществляли в 2% ЛС; 2- препарат ренатурированного ВСД-КуАР, растворение осадка ТС осуществляли в 2% ДСН; 3- препарат ренатурированного ВСД-КлАР, растворение осадка ТС осуществляли в смеси 8М мочевины и 2% ЛС; 4-лрепарат ренатурированного ВСД-КуАР, растворение осадка ТС осуществляли в смеси 8М мочевины и 2% ДСН.

«б » 66 » 45 т

35 * 25

«« «К »*;

14 — кДа 12 3 4

Для анализа конформационного состояния ВСД-KvAP, ренатурированного в подобранных условиях, был синтезирован селективно |5Н-меченый по остаткам аланина белок. Было проведено сравнение 'H,15N-HSQC ЯМР-спектров I5N-Ala-ВСД-KvAP, ренатурированного из осадка ТС в присутствии мицелл ДФХ, со спектром 15М-ВСД-КуАР в мицеллах ДФХ/ЛДАО, выделенного из мембран Е. coli в нативном состоянии (Рис. 16). Практически полное совпадение химических сдвигов HN-групп остатков аланина в тотально и селективно меченых препаратах белка подтвердило успешную ренатурацию ВСД-KvAP. Однако, в отличие от спектров, наблюдаемых в ТФЭ, в спектрах ренатурированного селективно меченого белка присутствовало более 15-ти сигналов. Эти дополнительные сигналы не наблюдались в спектрах тотально меченого белка и, вероятно, соответствовали частично денатурированному состоянию ВСД-KvAP. Полученные результаты указывают на то, что часть молекул ВСД-KvAP в процессе ренатурации не перешла в нативную конформацию. Сравнение интенсивностей сигналов для двух форм ВСД-KvAP показало, что эффективность ренатурации составила ~ 70%.

Таким образом, была разработана успешная процедура ренатурации ВСД-KvAP из осадка ТС. Применение ДФХ в процессе ренатурации позволило получить домен в мономерной растворимой форме со структурой, близкой к нативной, что было подтверждено методом ЯМР-спектроскопии.

105

110 . Ч

115i 120"

130

Рис. 16. (А). 2D 'H,15N-HSQC ЯМР-спектр "N-BQZJ-KvAP в мицеллах ДФХ/ЛДАО, выделенного из мембран Е. coli в нативной конформации. Красными точками отмечены сигналы остатков аланина. (Б). 2D 'H,'5N-HSQC ЯМР спектр l5N-Ala-BQq-KvAP, ренатурированного из осадка, в присутствии мицелл ДФХ/ЛДАО. Отнесение сигналов в спектре 151Ч-А1а-ВСД-КуАР выполнено по аналогии со спектром тотально меченого домена. Спектры получены на ЯМР-спектрометре с рабочей частотой 700 МГц, при 45 °С, pH 5,0.

11 ю

1н, М.Д. 7 11 10

15М-ВСД-КУАР/ДФХ/ЛДАО

,»...

|5М-А1а-ВСД-КуАР/ДФХ/ЛДАО

A3fc\ <S> А"5 ®А «Т »

выводы

1. Разработана эффективная система бесклеточной продукции внеклеточного домена нАХР человека а7 типа с выходом 0,6 мг с 1 мл трансляционной смеси. Показано, что применение детергента додецилфосфохолина в процессе ренатурации домена из осадка трансляционной смеси способствует стабилизации домена в растворе и сохраняет его вторичную структуру. Показано, что ренатурированный внеклеточный домен нАХР обладает биологическими свойствами природного рецептора, а именно селективностью по отношению к а-нейротоксинам змей короткого и длинного типов.

2. Разработана эффективная система бесклеточной продукции бактериородопсина из Exigllobactehlm яШпсит в растворимой форме. Показано, что использование липид-белковых нанодисков, состоящих из насыщенных липидов ДМФХ и ДМФГ, позволяет получить препараты БР-ЕБ/ЛБН, содержащие бактериородопсин в функционально-активной форме с выходом до 0,4 мг с 1 мл трансляционной смеси.

3. Разработана эффективная система бесклеточной продукции вольт-сенсорного домена К+-канала КлАР в виде осадка трансляционной смеси. Показана возможность синтеза селективно-меченого препарата вольт-сенсорного домена. Селективное включение изотопной метки подтверждено методами гетероядерной спектроскопии ЯМР.

4. Разработана эффективная система ренатурации вольт-сенсорного домена из осадка трансляционной смеси. Применение детергента додецилфосфохолина в процессе ренатурации позволило получить домен в мономерной растворимой форме со структурой, близкой к нативной, что было подтверждено методами ЯМР-спектроскопии. Показано, что эффективность разработанного метода ренатурации составляет ~ 70%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи:

1. Хабибуллина Н. Ф., Люкманова Е. Н., Копеина Г. С., Шенкарев 3. О., Арсеньев А. С., Долгих Д. А., Кирпичников М. П. Разработка и оптимизация сопряженной бесклеточной системы синтеза трансмембранного домена рецепторной тирозинкиназы ЕгЬВЗ. Биоорганическая химия. 2010, 36(5), 654660

2. Люкманова Е. Н., Копеина Г. С., Шулепко М. А., Шенкарев 3. О., Арсеньев А. С., Долгих Д. А., Кирпичников М. П. Бесклеточная продукция внеклеточного домена никотинового ацетилхолинового рецептора. Acta Naturae. 2009, 1, 96-98.

Тезисы докладов:

3. Lyukmanova E.N., Kopeina G.S., Khabibullina N.F., Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Mineev K.S., Arseniev A.S., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Cell-Free Production of Membrane Proteins for NMR Studies. Euromar and 17'h ISMAR Conference. Florence, Italy. 2010, Сборник тезисов, с. 211.

4. Shulepko М.А., Lyukmanova E.N., Kopeina G.S., Shenkarev Z.O., Dolgikh D.A-, Kasheverov I., Tsetlin V.I., Kirpichnikov M.P.. High level production of extracellular domain of nicotinic acetylcholine receptor in active pentameric form. J. Neurochem. 2009, 1 lO(suppl.l): 81.

5. Копеина Г.С.. Люкманова E.H., Шингарова Л.Н., Парамонов А.С., Шенкарев З.О., Арсеньев А.С., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Получение селективно меченого вольт-сенсорного домена потенциалозависимого ионного канала KvAP в бактериальной бесклеточной системе. Успехи современного естествознания. 2009,12: 24.

6. Копеина Г.С.. Люкманова Е.Н., Шулепко М.А., Шенкарев З.О., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Бактериальная и бесклеточная продукция внеклеточного домена никотинового ацетилхолинового рецептора. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологгш. Москва. 2009, Сборник тезисов, с. 247 — 249.

7. Kopeina G.S., Lyukmanova E.N., Shirokov V.A., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Cell-free expression for production of eukaryotic proteins in a soluble form. 33rd FEBS Congress and II"' IUBMB Conference. Athens, Greece. FEBS J. 2008, 275 (supp 1): 409.

8. Копеина Г .С., Люкманова E.H., Шулепко М.А., Шенкарев З.О., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Продукция в бесклеточной системе внеклеточного домена никотинового ацетилхолинового рецептора. XVI международный симпозиум «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Гурзуф, Украина. 2008, Сборник тезисов, с. 233-234.

9. Люкманова E.H., Шенкарев З.О., Шулепко М.А., Копеина Г.С., Кашеверов И.Е., Крюкова Е.В., Лесовой Д.М., Бочаров Э.В., Косинский Ю., Цетлин В.И., Долгих Д.А., Арсеньев A.C., Кирпичников М.П. Нейротоксины яда змей и никотиновый ацетилхолиновый рецептор: исследование лиганд-рецепторных взаимодействий. XX Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективы направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва. 2008, Сборник тезисов, с. 21.

Принято к исполнению 18.10.09 Исполнено 20.10.09 Заказ № 945 Тираж 100 экз. Типография "Аллапринт" Москва, Волховский пер., д. 2.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Копеина, Гелина Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бесклеточные системы синтеза белка.

1.1.1. История создания бесклеточных систем синтеза белка.

1.1.2. Развитие технологии бесклеточных систем синтеза белка.

1.1.3. Эффективность синтеза белка в прокариотических и эукариотических бесклеточных системах.

1.2. Формирование нативной структуры белка.

1.3.Способы решения проблемы агрегации белка в БСС.

1.3.1. Использование шаперонов для решения проблемы агрегации синтезированного белка.

1.3.2. Подбор условий для правильного замыкания дисульфидных связей.

1.3.3. Бесклеточная продукция рекомбинантных белков в виде гибридных полипептидов.

1.3.4. Бесклеточный синтез белков в присутствии специфичных лигандов.

1.3.5. Бесклеточный синтез белков в присутствии мицелл детергентов.

1.3.6. Использование липидсодержащих частиц для бесклеточного синтеза мембранных белков

1.4. Ренатурация белков.

1.5. Структурные и функциональные особенности объектов исследования.

1.5.1. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор.

1.5.2. Бактериородопсин.

1.5.3. Потенциалозависимый К+ канала KvAP из Aeropyriimpernix.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Реактивы и ферменты.

2.1.2. Штаммы.

2.1.3. Плазмидные векторы.

2.1.4. Питательные среды для роста бактериальных культур.

2.1.5. Синтетические олигонуклеотиды.

2.2. Методы.

2.2.1. Общие молекулярно-генетические методы.

2.2.2. Получение генетических конструкций.

2.2.3. Синтез белка в бесклеточной системе на основе фракции S30 Е. coli.

2.2.3.1. Выделение экстракта S30 из Escherichia coli.

2.2.3.2. Синтез белка в сопряженной бесклеточной системе на основе экстракта S30 из Е. coli.

2.2.4. Гель-электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН.

2.2.5. Иммуноблотинг.

2.2.6. Гель-фильтрация.

2.2.7. Анализ белковых препаратов методом КД-спектроскопии.

2.2.8. Ренатурация мутантного варианта внеклеточного домена нАХР (a7B,Z]/DTES) из осадка ТС

2.2.9. Исследование биологической активности a7B,D/DTES.

2.2.10. Выделение белка, ассоциированного с липид-белковыми нанодисками.

2.2.11. Выделение ВСД-KvAP из трансляционной смеси.

2.2.12. Ренатурация ВСД-KvAP из осадка ТС.

2.2.13. Получение ЯМР-спектров ВСД-KvAP.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Продукция внеклеточного домена а7нАХР в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта S30 из Е. coli.

3.1.1. Мутагенез внеклеточного домена нАХР а7 типа.

3.1.2. Оптимизация бесклеточной системы для продукции a7B,D/DTES.

3.1.3. Синтез a7B,H/DTES в растворимой форме.

3.1.4. Ренатурация a7B/VDTES из осадка трансляционной смеси.

3.1.5. Исследование биологической активности a7Bfl/DTES.

3.2. Получение бактериородопсина из Exiguobacterium sibiricum в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта S30 из Е. coli.

3.2.1. Синтез БР-ES в растворимой форме в присутствии детергентов.

3.2.1. Синтез БР-Е8 в присутствии липид-белковых нанодисков.

3.3. Получение вольт-сенсорного домена К+канала КуАР из Аегоругитрегтх в бесклеточной системе на основе бактериального экстракта БЗО из Е. соИ.

3.3.1. Получение селективно меченого аналога ВСД-КуАР.

3.3.2. Синтез ВСД-КуАР в растворимой форме в присутствии детергентов.

3.3.2. Синтез ВСД-КуАР в присутствии липид-белковых нанодисков.

3.3.3. Ренатурация ВСД-КуАР из осадка трансляционной смеси.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование и оптимизация бесклеточных систем экспрессии для производства рекомбинантных белков"

Актуальность темы. Мембранные белки (МБ) составляют около 20% от общего количества белковых компонентов клетки. Эти белки играют основную роль в процессах передачи сигналов, как на уровне отдельной клетки, так и на уровне целого организма. МБ обеспечивают функционирование нервной, иммунной и эндокринной систем в качестве различных рецепторов, передающих сигналы через клеточную мембрану, а также в качестве ионных каналов, ответственных за распространение импульсов вдоль нервных волокон. С прикладной точки зрения МБ представляют огромный интерес как мишени для создания новых фармакологических препаратов и в качестве объектов для биотехнологических разработок. В отличие от глобулярных водорастворимых белков, МБ остаются малоизученными, а примеры их удачного использования в области фармакологии и биотехнологии чрезвычайно редки. Основные трудности в исследовании и применении МБ обусловлены особенностями их пространственной организации. Большинство МБ содержит несколько трансмембранных (ТМ) спиралей. Так как ТМ спирали гидрофобны, МБ может иметь нативную структуру только в присутствии биологической мембраны или подходящей мембраномоделирующей среды. Это значительно затрудняет как получение достаточных количеств препаратов МБ в функционально-активной форме, так и их дальнейшие структурно-функциональные исследования и биотехнологическое применение.

В последнее время для продукции мембранных белков все большую популярность приобретают сопряженные бесклеточные системы синтеза (БСС) транскрипции-трансляции. На сегодняшний день выходы целевых белков в этих системах достигают нескольких миллиграммов с миллилитра трансляционной смеси (ТС), что дает возможность получать белковые препараты в количествах, необходимых для биологических, биохимических и биофизических исследований. Бесклеточные системы имеют несколько преимуществ перед системами, основанными на клеточной продукции. Во-первых, в такой системе синтезируется в основном целевой продукт, во-вторых, эти системы открыты для внесения каких-либо веществ, взаимодействующих с белком, например, кофакторов, ингибиторов, лигандов, а также агентов, позволяющих удерживать синтезируемый полипептид в нативной конформации. Для продукции МБ в трансляционную смесь добавляют мембраномоделирующие компоненты, поддерживающие МБ в растворимой форме, такие как мицеллы детергентов, липосомы, или липопротеиновые частицы (липид-белковые нанодиски, ЛБН). Кроме того, БСС позволяют легко получать белковые препараты, селективно меченные стабильными изотопами, что в ряде случаев облегчает проведение структурных исследований белков методами спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось исследование возможности применения БСС на основе экстракта S30 из Е. coli для продукции МБ и их доменов в нативной конформации для дальнейшего изучения их структурных и функциональных свойств. В качестве объектов исследования были выбраны: внеклеточный домен никотинового ацетилхолинового рецептора человека а7 типа (а7ВД) - ß-структурный белок, содержащий лиганд-связывающий участок; бактериородопсин из Exigiiobacterium sibiricum (БР-ES) - фотоактивируемый протонный насос психротолерантной бактерии, состоящий из семи ТМ спиралей, структурный аналог мембранных рецепторов, сопряженных с G-белками (рецепторов семейства GPCR); и вольт-сенсорный домен потенциалозависимого К+ канала KvAP из археи Aeropyrum pernix (ВСД-KvAP) - структурный гомолог вольтсенсорных доменов потенциалозависимых Na+-, K+-, Са2+- и ЬГ^-каналов млекопитающих, состоящий из четырех ТМ спиралей.

Данная цель подразумевает решение следующих задач:

3. Исследование физико-химических свойств и биологической активности полученного препарата а7ВД;

3. Впервые разработана эффективная система бесклеточного синтеза БР-Е8 в растворимой форме с использованием липид-белковых нанодисков в качестве мембраномоделирующего компонента ТС. Наличие функциональной активности у МБ, встроенного в ЛБН, свидетельствует о наличии структуры БР-ЕБ, близкой к нативной.

4. Впервые разработана эффективная система бесклеточного синтеза ВСД-КуАР в виде осадка ТС. Подобраны условия синтеза селективно меченого белка, а также условия его ренатурации из осадка ТС. Методами ЯМР-спектроскопии показано, что ренатурированный 1А1а-В С Д- К у АР имеет пространственную структуру, близкую к нативной.

В ходе данного исследования были разработаны и успешно применены эффективные методы бесклеточного синтеза для продукции ряда мембранных белков и их доменов. Методами ЯМР-спектроскопии и с помощью функциональных тестов для всех исследуемых белков было показано наличие пространственной структуры, близкой к нативной, что указывает на универсальность выбранного подхода. Таким образом, разработка систем бесклеточного синтеза открывает новые возможности для структурно-функциональных исследований не только никотинового ацетилхолинового рецептора, потен циалозависимого К+ канала КуАР и бактериородопсина из Ехг^оЬаМепит яШпсит, но может найти широкое применение в исследованиях и других мембранных белков.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Копеина, Гелина Сергеевна

выводы

2. Разработана эффективная система бесклеточной продукции бактериородопсина из Ех1^оЬаМепит яйтсит в растворимой форме. Показано, что использование липид-белковых нанодисков, состоящих из насыщенных липидов ДМФХ и ДМФГ, позволяет получить препараты БР-Е8/ЛБН, содержащие бактериородопсин в функционально-активной форме с выходом до 0,4 мг с 1 мл трансляционной смеси.

3. Разработана эффективная система бесклеточной продукции вольт-сенсорного домена К+-канала КуАР в виде осадка трансляционной смеси. Показана возможность синтеза селективно меченого препарата вольт-сенсорного домена. Селективное включение изотопной метки подтверждено методами гетероядерной спектроскопии ЯМР.

БЛАГОДАРНОСТИ

Хочу выразить глубокую благодарность и искреннюю признательность своему научному руководителю к.б.н., с.н.с. лаборатории инженерии белка ИБХ РАН Екатерине Назымовне Люкмановой. Хочу поблагодарить заведующего лабораторией инженерии белка ИБХ РАН д.б.н. Дмитрия Александровича Долгих, а также заведующего отделом биоинженерии и декана Биологического факультета МГУ, академика Михаила Петровича Кирпичникова за обеспечение возможности выполнения настоящей диссертационной работы, всевозможную помощь и внимание на протяжении всего времени моей работы в лаборатории.

Выражаю свою глубокую благодарность сотрудникам лаборатории биомолекулярной ЯМР спектроскопии ИБХ РАН к.ф-м.н. Захару Олеговичу Шенкареву и к.ф-м.н. Александру Сергеевичу Парамонову, а также руководителю лаборатории профессору, д.х.н. Александру Сергеевичу Арсеньеву за неоценимую помощь в исследовании полученных белков методами ЯМР-спектроскопии и за предоставление препаратов липид-белковых нано дисков.

Выражаю свою искреннюю признательность за помощь и ценные советы к.б.н., с.н.с. инженерии белка ИБХ РАН Ладе Евгеньевне Петровской и к.х.н., с.н.с. инженерии белка ИБХ РАН Людмиле Николаевне Шингаровой. Также хочу поблагодарить всех сотрудников лаборатории инженерии белка ИБХ РАН за внимание и поддержку.

Выражаю свою искреннюю благодарность к.б.н., с.н.с. лаборатории механизмов биосинтеза белка Института белка РАН Владимиру Анатольевичу Широкову за неоценимую помощь и советы при выполнении работы, а также хочу поблагодарить заведующего лабораторией механизмов биосинтеза белка, академика Александра Сергеевича Спирина за предоставленную возможность выделять экстракт S30 из Е. coli на базе его лаборатории.

Отдельную благодарность хочу выразить сотрудникам кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ и ее руководителю д.ф-м.н. Константину Вольдемаровичу Шайтану за своевременную помощь и внимание, оказанное во время выполнения диссертационной работы.

Хочу поблагодарить своих родных и друзей за участие, поддержку и сопереживание, без которых мне трудно было бы выполнить эту работу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты диссертационной работы демонстрируют возможность получения различных белковых объектов с применением сопряженной бесклеточной системы синтеза. В ходе исследования были разработаны системы экспрессии генов таких белков, как внеклеточный домен никотинового ацетилхолинового рецептора человека тип а7, бактериородопсин из ЕхщиоЬас1гпит $1Ьтсит и вольт-сенсорный домен потенциалозависимого К+ канала. На примере ВСД-КуАР была исследована возможность бесклеточного синтеза селективно изотопно-меченых вариантов мембранных белков. Высокая эффективность этого метода была подтверждена с помощью гетероядерной ЯМР-спектроскопии. В случае а7ВД и ВСД-КуАР была разработана эффективная процедура ренатурации из осадка трансляционной смеси с использованием детергента додецилфосфохолина в качестве мембраномоделирующей среды. Методами спектроскопии ЯМР было показано, что ренатурированный внеклеточный домен нАХР обладает биологическими свойствами природного рецептора, а именно селективностью по отношению к а-нейротоксинам из яда змей короткого и длинного типов. Эффективность ренатурации вольт-сенсорного домена оценивали по наличию в -спектрах 1М-А1а-ВСД-КуАР сигналов, характерных для правильно свернутой формы белка. Также в качестве мембраномоделирующего компонента ТС были опробованы липид-белковые нанодиски, использование которых обеспечило необходимые условия для правильного сворачивания молекулы БР-Е8 в процессе синтеза, что позволило получить белок в растворимой функционально-активной форме.

Таким образом, было показано, что бесклеточная система синтеза является перспективной технологией получения мембранных белков и их отдельных доменов (в том числе и их селективно меченых аналогов) для дальнейших структурных и функциональных исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Копеина, Гелина Сергеевна, Москва

1. Borsook H., Deasy C.L., Haagensmit A.J., Keighley G., Lowy P.H. Incorporation in vitro of labeled amino acids into rat diaphragm proteins. J. Biol. Chem., 1950. 186(1): 309-315.

2. Keller E.B., Zamechnik P.C., Loftfield R.B. The role of microsomes in the incorporation of amino acids into proteins. J. Histochem. Cytochem., 1954. 2(5): 378-386.

3. Winnick T. Studies on the mechanism of protein synthesis in embryonic and tumor tissues. I. Evidence relating to the incorporation of labeled amino acids into protein structure in homogenates. Arch. Biochem., 1950. 27(1): 65-74.

4. Lamborg M.R., Zamechnik P.C. Amino acid incorporation into protein by extracts ofE. coli. Biochim. Biophys. Acta, 1960. 42206-211.

5. Tissieres A., Schlessinger D., Gros F. Amino acid incorparated into proteins by E. coli ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1960. 46(11): 14501463.

6. Nirenberg M.W., Matthaei J.H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1961. 471588-1602.

7. Marcus A., Efron D., Weeks D.P. The wheat embryo cell-free system. Methods Enzymol., 1974. 30(0): 749-754.

8. Pelham H.R., Jackson R.J. An efficient mRNA-dependent translation system from reticulocyte lysates. Eur. J. Biochem., 1976. 67(1): 247-256.

9. Efron D., Marcus A. Efficient synthesis of rabbit globin in a cell-free system from wheat embryo. FEBS Lett., 1973. 33(1): 23-27.

10. Shimizu Y., Kuruma Y., Ying B.W., Umekage S., Ueda T. Cell-free translation systems for protein engineering. FEBS J., 2006. 273(18): 41334140.

11. Fischer I., Moldave K. Preparation and characterization of a cell-free system from Chinese hamster ovary cells that translates natural messenger ribonucleic acid and analysis of intermediary reactions. Anal. Biochem., 1981. 113(1): 13-26.

12. De Vries J.K., Zubay G. DNA-directedpeptide synthesis. II. The synthesis of the alpha-fragment of the enzyme beta-galactosidase. Proc. Natl. Acad. Sci., 1967. 57(4): 1010-1012.

13. Schweiger M., Gold L.M. DNA-dependent in vitro synthesis of bacteriophage enzymes. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 1969. 34763-766.

14. Zubay G., Lederman M., De Vries J.K. DNA-directed peptide synthesis. 3. Repression of beta-galactosidase synthesis and inhibition of repressor by inducer in a cell-free system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1967. 58(4): 16691675.

15. Zubay G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu. Rev. Genet., 1973. 7267-287.

16. Gold L.M., Schweiger M. Synthesis of phage-specific alpha- and beta-glucosyl transferases directed by T-even DNA in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1969. 62(3): 892-898.

17. Spirin A.S. Cell-Free Translation System. Springer Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, 2002.

18. Baranov V.I., Morozov I.Y., Ortlepp S.A., Spirin A.S. Gene expression in a cell-free system on the preparative scale. Gene, 1989. 84(2): 463-466.

19. Craig D., Howell M.T., Gibbs C.L., Hunt Т., Jackson R.J. Plasmid cDNA-directed protein synthesis in a coupled eukaryotic in vitro transcriptiontranslation system. Nucleic Acids Res., 1992. 20(19): 4987-4995.

20. Scheele G., Blackburn P. Role of mammalian RNase inhibitor in cell-free protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979. 76(10): 4898-4902.

21. Chekulayeva M.N., Kurnasov O.V., Skirokov V.A., Spirin A.S. Continuous-exchange cell-free protein-synthesizing system: synthesis of HIV-l antigen Nef Biochem. Biophys. Res. Coramun, 2001. 280(3): 914-917.

22. Kigawa T., Yokoyama S. A continuous cell-free protein synthesis system for coupled transcription-translation. J. Biochem., 1991. 110(2): 166-168.

23. Spirin A.S. High-throughput cell-free systems for synthesis of functionally active proteins. Trends Biotechnol., 2004. 22(10): 538-545.

24. Spirin A.S., Baranov V.I., Ryabova L.A., Ovodov S.Y., Alakhov Y.B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science, 1988. 242(4882): 1162-1164.

25. Endo Y., Oka T., Ogata K., Natori Y. Production of dihydrofolate reductase by an improved continuous flow cell-free translation system using wheat germ extract. Tokushima J. Exp. Med., 1993. 40(1-2): 13-17.

26. Kim D.M., Kigawa T., Choi C.Y., Yokoyama S. A highly efficient cell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 1996. 239(3): 881-886.

27. Klammt C., Lohr F., Schafer B., Haase W., Dotsch V., Ruterjans H., Glaubitz C., Berahard F. High level cell-free expression and specific labeling of integral membrane proteins. Eur. J. Biochem., 2004. 271(3): 568-580. '

28. Klammt C., Schwarz D., Lohr F., Schneider B., Dotsch V., Bernhard F. Cell-free expression as an emerging technique for the large scale production of integral membrane protein. FEBS J., 2006. 273(18): 4141-4153.

29. Vinarov D.A., Lytle B.L., Peterson F.C., Tyler E.M., Volkman B.F., Markley J.L. Cell-free protein production and labeling protocol for NMR-basedstructuralproteomics. Nat. Methods, 2004. 1(2): 149-153.

30. Yokoyama S. Protein expression systems for structural genomics and proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol., 2003. 7(1): 39-43.

31. Kim D.M., Swartz J.R. Prolonging cell-free protein synthesis by selective reagent additions. Biotechnol. Prog., 2000. 16(3): 385-390.

32. Nakano H., Tanaka T., Kawarasaki Y., Yamane T. An increased rate of cellfree protein synthesis by condensing wheat-germ extract with ultrafiltration membranes. Biosci. Biotechnol. Biochem., 1994. 58(4): 631-634.

33. Kozak M. Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene, 1999. 234(2): 187-208."

34. McCarthy J.E., Brimacombe R. Prokaryotic translation: the interactive pathway leading to initiation. Trends Genet., 1994. 10(11): 402-407.

35. De Boer H.A., Comstock L.J., Hui A., Wong E., Vasser M. Portable Shine-Dalgarno regions; nucleotides between the Shine-Dalgarno sequence and the start codon affect the translation efficiency. Gene Amplif. Anal., 1983. 3103-116.

36. Olins P.O., Rangwala S.H. A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1989. 264(29): 16973-16976.

37. De Smit M.H., van Duin J. Secondary structure of the ribosome binding site determines translational efficiency: a quantitative analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990. 87(19): 7668-7672.

38. Hatfield G.W., Roth D.A. Optimizing scaleup yield for protein production: Computationally Optimized DNA Assembly (CODA) and Translation Engineering. Biotechnol. Annu. Rev., 2007. 1327-42.

39. Marintchev A., Wagner G. Translation initiation: structures, mechanisms and evolution. Q. Rev. Biophys., 2004. 37(3-4): 197-284.

40. Kaminski A., Hunt S.L., Gibbs C.L., Jackson R.J. Internal initiation of mRNA translation in eukaryotes. Genet. Eng (NY), 1994. 16115-155.

41. Jackson R.J., Hunt S.L., Gibbs C.L., Kaminski A. Internal initiation of translation of picornavirus RNAs. Mol. Biol. Rep., 1994. 19(3): 147-159.

42. Jang S.K. Internal initiation: IRES elements of picornaviruses and hepatitis с virus. Virus Res., 2006. 119(1): 2-15.

43. Danthinne X., Seurinck J., Meulewaeter F., Van M.M., Cornelissen M. The 3' untranslated region of satellite tobacco necrosis virus RNA stimulates translation in vitro. Mol. Cell Biol., 1993. 13(6): 3340-3349.

44. Fletcher L., Corbin S.D., Browning K.S., Ravel J.M. The absence of a m7G cap on beta-glob in mRNA and alfalfa mosaic virus RNA 4 increases the amounts of initiation factor 4F required for translation. J. Biol. Chem., 1990. 265(32): 19582-19587.

45. Rospert S. Rib о some function: governing the fate of a nascent polypeptide. Curr. Biol., 2004. 14(10): R386-R388.

46. А.Финкельштейн A.B., Птицын О.Б. Физика белка. Книжный Дом Университет: Москва, 2002.

47. А.Колб В.А. Котрансляциоиное сворачивание белков. Молекулярная биология, 2001. 35(4): 682-690.

48. Kolb V.A., Makeyev E.V., Spirin A.S. C.o-translational folding of an eukaryotic midtidomain protein in a prokaryotic translation system. J. Biol. Chem., 2000. 275(22): 16597-16601.

49. Komar A.A., Kommer A., Krasheninnikov I.A., Spirin A.S. Cotranslational folding of glob in. J. Biol. Chem., 1997. 272(16): 10646-10651.

50. А.Рубин А.Б. Биофизика. Изд-во МГУ: Москва, 2004.

51. Haber Е., Anfmsen С.В. Regeneration of enzyme activity by air oxidation of reduced subtilisin-modified ribonuclease. J. Biol. Chem., 1961. 236422-424.

52. А.Спирин А.С. Молекулярная биология: структура рибосомы и биосинтез белка. Высшая школа: Москва, 1986.

53. Frydman J., Nimmesgern Е., Olitsuka К., Hartl F.U. Folding of nascent polypeptide chains in a high molecular mass assembly with molecular chaperones. Nature, 1994. 370(6485): 111-117.

54. Thomas J.G., Ayling A., Baneyx F. Molecular chaperones, folding catalysts, and the recovery of active recombinant proteins from E. coli. To fold or to refold. Appl. Biochem. Biotechnol., 1997. 66(3): 197-238.

55. Macario A.J., Conway de M.E. Molecular chaperones: multiple functions, pathologies, and potential applications. Front Biosci., 2007. 122588-2600.

56. Reckel S., Sobhanifar S., Durst F., Lohr F., Shirokov V.A., Dotsch V., Bernhard F. Strategies for the cell-free expression of membrane proteins. Methods Mol. Biol., 20i0. 607187-212.

57. Traviglia S Expression of soluble murine endostatin with the RTS system. In Cell-Free Translation System (ed. Spirin A. S.). Springer Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, 2002. p: 149-156.

58. Nishihara K., Kanemori M., Yanagi H., Yura T. Overexpression of trigger factor prevents aggregation of recombinant proteins in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 2000. 66(3): 884-889.

59. Ryabova L.A., Desplancq D., Spirin A.S., Pluckthun A. Functional antibody production using cell-free translation: effects of protein disulfide isomerase and chaperones. Nat. Biotechnol., 1997. 15(1): 79-84.

60. Kim D.M., Swartz J.R. Efficient production of a bioactive, multiple disulfide-bonded protein using modified extracts of Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng., 2004. 85(2): 122-129.

61. Frey S., Haslbeck M., Hainzl O., Buchner J. Synthesis and characterization of a functional intact IgG in a prokaryotic cell-free expression system. Biol. Chem., 2008. 389(1): 37-45.

62. Nemetz C., Wessner S., Krupka S., Watzele M., Mutter W. Cell-free expression of soluble human erythropoietin. In Cell-Free Translation System (ed. Spirin S. A.). Springer Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, 2002. p: 157-163.

63. Schraml M., Ambrosius D., Stracke J., Lanzendorfer M. Sequence specific biotinylation and purification of proteins expressed in the RTS 500 system.

64. Cell-Free Translation System (ed. Spirin A. S.). Springer Veglar: Berlin, Heidelberg, New York., 2002. p: 227-234.

65. Mouat M.F. Dihydrofolate influences the activity of Escherichia coli dihydrofolate reductase synthesised de novo. Int. J. Biochem. Cell Biol., 2000. 32(3): 327-337.

66. Lehmann D, Wedekind F Optimization of cell-free of FAD-dependent D-amino acid oxidase. In Cell- Free Protein Expression (ed. Swartz J. R.). Springer-Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, 2003. p: 159-164.

67. А.Воюцкий С.С. Курс коллоидной химии. Химия: Москва, 1975.

68. Klammt С., Schwarz D., Eifler N., Engel A., Piehler J., Haase W., Halm S., Dotsch V., Bernhard F. Cell-free production of G protein-coupled receptors for functional and structural studies. J. Struct. Biol., 2007. 158(3): 482-493.

69. Wuu J.J., Swartz J.R. High yield cell-free production of integral membrane proteins without refolding or detergents. Biochim. Biophys. Acta, 2008. 1778(5): 1237-1250.

70. Hovijitra N.T., Wuu J.J., Peaker В., Swartz J.R. Cell-free synthesis of functional aquaporin Z in synthetic liposomes. Biotechnol. Bioeng., 2009. 104(1): 40-49.

71. Bayburt Т.Н., Grinkova Y.V., Sligar S.G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters, 2002. 853-856.

72. Civjan N.R., Bayburt Т.Н., Schuler M.A., Sligar S.G. Direct solubilization of heterologously expressed membrane proteins by incorporation into nanoscale lipid bilayers. Biotechniques, 2003. 35(3): 556-3.

73. Leitz A.J., Bayburt Т.Н., Barnakov A.N., Springer B.A., Sligar S.G. Functional reconstitution of Beta2-adrenergic receptors utilizing self-assembling Nanodisc technology. Biotechniques, 2006. 40(5): 601-2, 604, 606, passim.

74. Wright P.E., Dyson H.J., Lerner R.A. Conformation ofpeptide fragments of proteins in aqueous solution: implications for initiation of protein folding. Biochemistry, 1988. 27(19): 7167-7175.

75. Lilie H., Schwarz E., Rudolph R. Advances in refolding of proteins produced in E. coli. Curr. Opin. Biotechnol., 1998. 9(5): 497-501.

76. Burgess R.R. Purification of overproduced Escherichia coli RNA polymerase sigma factors by solubilizing inclusion bodies and refolding from Sarkosyl. Methods Enzymol., 1996. 273145-149.

77. Stockel J., Doring K., Malotka J., Jahnig F., Dornmair K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC.) molecules. Eur. J. Biochem., 1997. 248(3): 684-691.

78. De Bernárdez C.E., Schwarz E., Rudolph R. Inhibition of aggregation side reactions during in vitro protein folding. Methods Enzymol., 1999. 309217236.

79. Singh S.M., Panda A.K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J. Biosci. Bioeng., 2005. 99(4): 303-310.

80. Singh S.M., Eshwari A.N., Garg L.C., Panda A.K. Isolation, solubilization, refolding, and chromatographic purification of human growth hormonefrom inclusion bodies of Escherichia coli cells: a case study. Methods Mol. Biol., 2005. 308163-176.

81. Buchner J., Pastan I., Brinkmann U. A method for increasing the yield of properly folded recombinant fusion proteins: single-chain immunotoxins from renaturation of bacterial inclusion bodies. Anal. Biochem., 1992. 205(2): 263-270.

82. Fischer B., Perry B., Sumner I., Goodenough P. A novel sequential procedure to enhance the renaturation of recombinant protein from Escherichia coli inclusion bodies. Protein Eng, 1992. 5(6): 593-596.

83. Maeda Y., Koga H., Yamada H., Ueda T., Imoto T. Effective renaturation of reduced lysozyme by gentle removal of urea. Protein Eng., 1995. 8(2): 201205.

84. West S.M., Chaudhuri J.B., Howell J.A. Improved protein refolding using hollow-fibre membrane dialysis. Biotechnol. Bioeng., 1998. 57(5): 590-599.

85. Muller C., Rinas U. Renaturation of heterodimeric platelet-derived growth factor from inclusion bodies of recombinant Escherichia coli using size-exclusion chromatography. J. Chromatogr. A, 1999. 855(1): 203-213.

86. Fahey E.M., Chaudhuri J.B., Binding P. Refolding and purification of a urokinase plasminogen activator fragment by chromatography. J. Chromatogr. B Biomed. Sei. Appl., 2000. 737(1-2): 225-235.

87. Werner M.H., Clore G.M., Gronenborn A.M., Kondoh A., Fisher R.J. Refolding proteins by gel filtration chromatography. FEBS Lett., 1994. 345(2-3): 125-130.

88. Wang S.S., Chang C.K., Liu H.S. Effect of sample loop dimension on lysozyme refolding in size-exclusion chromatography. J. Chromatogr. A., 2007. 1161(1-2): 56-63.

89. Suttnar J., Dyr J.E., Hamsikova E., Novak J., Vonka V. Procedure for refolding and purification of recombinant proteins from Escherichia coli inclusion bodies using a strong anion exchanger. J. Chromatogr. B Biomed. Appl., 1994. 656(1): 123-126.

90. Negro A., Onisto M., Grassato L., Caenazzo C., Garbisa S. Recombinant human TIMP-3 from Escherichia coli: synthesis, refolding, physico-chemical and functional insights. Protein Eng, 1997. 10(5): 593-599.

91. Zouhar J., Nanak E., Brzobohaty B. Expression, single-step purification, and matrix-assisted refolding of a maize cytokinin glucoside-specific beta-glucosidase. Protein Expr. Purif., 1999. 17(1): 153-162.

92. Cho T.H., Alm S.J., Lee E.K. Refolding of protein inclusion bodies directly from E. coli homogenate using expanded bed adsorption chromatography. Bioseparation., 2001. 10(4-5): 189-196.

93. Vuillard L., Rabilloud T., Goldberg M.E. Interactions of non-detergent sulfobetaines with early folding intermediates facilitate in vitro protein renaturation. Eur. J. Biochem., 1998. 256(1): 128-135.

94. Vuillard L., Braun-Breton C., Rabilloud T. Non-detergent sulphobetaines: a new class of mild solubilization agents for protein purification. Biochem. J., 1995. 305 (Pt 1)337-343.

95. Hucho F., Weise C. Ligand-Gated Ion Channels. Angew. Chem., 2001. 403100-3116.

96. Decker M.W., Brioni J.D., Bannon A.W., Arneric S.P. Diversity of neuronal nicotinic acetylcholine receptors: lessons from behavior and implications for CNS therapeutics. Life Sei., 1995. 56(8): 545-570.

97. Levin E.D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J. Neurobiol., 2002. 53(4): 633-640.

98. Newhouse P., Singh A., Potter A. Nicotine and nicotinic receptor involvement in neuropsychiatrie disorders. Curr. Top. Med. Chem., 2004. 4(3): 267-282.

99. Paterson D., Nordberg A. Neuronal nicotinic receptors in the human brain. Prog. Neurobiol., 2000. 61(1): 75-111.

100. Ripoll N., Bronnec M., Bourin M. Nicotinic receptors and schizophrenia. Curr. Med. Res. Opin., 2004. 20(7): 1057-1074.

101. Shytle R.D., Silver A.A., Lukas R.J., Newman M.B., Sheehan D.V., Sanberg P.R. Nicotinic acetylcholine receptors as targets for antidepressants. Mol. Psychiatry, 2002. 7(6): 525-535.

102. Egleton R.D., Brown K.C., Dasgupta P. Angiogenic activity of nicotinic acetylcholine receptors: implications in tobacco-related vascular diseases. Pharmacol. Tlier., 2009. 121(2): 205-223.

103. А.Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. Мир: Москва, 1994.

104. Eisenman G., Dani J.A. An introduction to molecular architecture and permeability of ion channels. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 1987. 16205-226.

105. Wilson G., Karlin A. Acetylcholine receptor channel structure in the resting, open, and desensitized states probed with the substituted-cysteine-accessibility method. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001. 98(3): 1241-1248.

106. Tsetlin V.I., Hucho F. Snake and snail toxins acting on nicotinic acetylcholine receptors: fundamental aspects and medical applications. FEBS Lett., 2004. 557(1-3): 9-13.

107. Albuquerque E.X., Pereira E.F., Alkondon M., Rogers S.W. Mammalian nicotinic acetylcholine receptors: from structure to function. Physiol Rev., 2009. 89(1): 73-120.

108. Tank D.W., Huganir R.L., Greengard P., Webb W.W. Patch-recorded single-channel currents of the purified and reconstituted Torpedo acetylcholine receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 1983. 80(16): 51295133.

109. Hille B. Ion channels of Excitable Membranes, 3rd ed. Sinauer Associates Inc: Sunderland, MA, 2001.

110. Le Novere N., Corringer P.J., Changeux J.P. The diversity of subunit composition in nAChRs: evolutionary origins, physiologic and pharmacologic consequences. J. Neurobiol., 2002. 53(4): 447-456.

111. Hogg R.C., Raggenbass M., Bertrand D. Nicotinic acetylcholine receptors: from structure to brain function. Rev. Physiol Biochem. Pharmacol., 2003. 1471-46.

112. Jensen A.A., Frolund B., Liljefors T., Krogsgaard-Larsen P. Neuronal nicotinic acetylcholine receptors: structural revelations, target identifications, and therapeutic inspirations. J. Med. Chem., 2005. 48(15): 4705-4745.

113. Galzi J.L., Changeux J.P. Neuronal nicotinic receptors: molecular organization and regulations. Neuropharmacology, 1995. 34(6): 563-582.

114. Unwin N. Refined structure of the nicotinic acetylcholine receptor at 4A resolution. J. Mol. Biol., 2005. 346(4): 967-989.

115. Millar N.S. A review of experimental techniques used for the heterologous expression of nicotinic acetylcholine receptors. Biochem. Pharmacol., 2009. 78(7): 766-776.

116. Oesterhelt D., Stoeckenius W. Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium. Nat. New Biol., 1971. 233(39): 149152.

117. Khorana H.G. Bacteriorhodopsin, a membrane protein that uses light to translocate protons. J. Biol. Chem., 1988. 263(16): 7439-7442.

118. Lanyi J.K. X-ray crystallography of bacteriorhodopsin and its photointermediates: insights into the mechanism of proton transport. Biochemistry (Mosc.), 2001. 66(11): 1192-1196.

119. Edmonds B.W., Luecke H. Atomic resolution structures and the mechanism of ion pumping in bacteriorhodopsin. Front Biosci., 2004. 91556-1566.

120. De la Torre Jr., Christianson L.M., Beja O., Suzuki M.T., Karl D.M., Heidelberg J., DeLong E.F. Proteorhodopsin genes are distributed among divergent marine bacterial taxa. Proc. Natl. Acad. Sci., 2003. 100(22): 12830-12835.

121. Gomez-Consaraau L., Gonzalez J.M., Coll-Llado M., Gourdon P., Pascher T., Neutze R., Pedros-Alio C., Pinhassi J. Light stimulates growth of proteorhodopsin-containing marine Flavobacteria. Nature, 2007. 445(7124): 210-213.

122. Sabehi G., Massana R., Bielawski J.P., Rosenberg M., DeLong E.F., Beja O. Novel Proteorhodopsin variants from the Mediterranean and Red Seas. Environ. Microbiol., 2003. 5(10): 842-849.

123. Kouyama T., Kanada S., Takeguchi Y., Narusawa A., Murakami M., Ihara K. Crystal structure of the light-driven chloride pump halorhodopsin from Natronomonas pharaonis. J. Mol. Biol., 2010. 396(3): 564-579.

124. Sasaki J., Spudich J.L. Signal transfer in haloarchaeal sensory rhodopsin-transducer complexes. Photochem. Photobiol., 2008. 84(4): 863-868.

125. Hampp N. Bacteriorhodopsin as a Photochromic Retinal Protein for Optical Memories. Chem. Rev., 2000. 100(5): 1755-1776.

126. Ballesteros J., Palczewski K. G protein-coupled receptor drug discovery: implications from the crystal structure of rhodopsin. Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 2001. 4(5): 561-574.

127. Mizobe T., Maze M., Lam V., Suryanarayana S., Kobilka B.K. Arrangement of transmembrane domains in adrenergic receptors. Similarity to bacteriorhodopsin. J. Biol. Chem., 1996. 271(5): 2387-2389.

128. Filmore D. It's a GPC.R world. Modern Drug Discovery, 2004. p: 24-28.

129. Borjesson S.I., Elinder F. Structure, function, and modification of the voltage sensor in voltage-gated ion channels. Cell Biochem. Biophys., 2008. 52(3): 149-174.

130. Alabi A.A., Bakamonde M.I., Jung H.J., Kim J.I., Swartz K.J. Portability of paddle motif function and pharmacology in voltage sensors. Nature, 2007. 450(7168): 370-375.

131. Bosmans F., Martin-Eauclaire M.F., Swartz K.J. Deconstructing voltage sensor function and pharmacology in sodium channels. Nature, 2008. 456(7219): 202-208.

132. Zhang M.M., Han T.S., Olivera B.M., Bulaj G., Yoshikami D. Mu-conotoxin KIIIA derivatives with divergent affinities versus efficacies in blocking voltage-gated sodium channels. Biochemistry, 2010. 49(23): 4804-4812.

133. Ashcroft F.M. Ion channels and disease. Academic Press: San Diego, CA, 2000.

134. Long S.B., Campbell E.B., MacKinnon R. Crystal structure of a mammalian voltage-dependent Shaker family K+ channel. Science, 2005. 309(5736): 897-903.

135. Long S.B., Tao X., Campbell E.B., MacKinnon R. Atomic structure of a voltage-dependent K+ channel in a lipid membrane-like environment. Nature, 2007. 450(7168): 376-382.

136. Doyle D.A., Morais C.J., Pfiietzner R.A., Kuo A., Gulbis J.M., Cohen S.L., Chait B.T., MacKinnon R. The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science, 1998. 280(5360): 69-77.

137. Heginbotham L., Lu Z., Abramson T., MacKinnon R. Mutations in the K+ channel signature sequence. Biophys. J., 1994. 66(4): 1061-1067.

138. Long S.B., Campbell E.B., MacKinnon R. Voltage sensor of KvJ.2: structural basis of electromechanical coupling. Science, 2005. 309(5736): 903-908.

139. Jiang Y., Lee A., Chen J., Ruta V., Cadene M., Chait B.T., MacKinnon R. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature, 2003. 423(6935): 33-41. '

140. Ruta V., Jiang Y., Lee A., Chen J., MacKinnon R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature, 2003. 422(6928): 180-185.

141. Li-Smerin Y., Hackos D.H., Swartz K.J. alpha-helical structural elements within the voltage-sensing domains of a K(+) channel. J. Gen. Physiol, 2000. 115(1): 33-50.

142. Lee S.Y., Lee A., Chen J., MacKinnon R. Structure of the KvAP voltage-dependent K+ channel and its dependence on the lipid membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005. 102(43): 15441-15446.

143. Seoh S.A., Sigg D., Papazian D.M., Bezanilla F. Voltage-sensing residues in the S2 and S4 segments of the Shaker K+ channel. Neuron, 1996. 16(6): 1159-1167.

144. Ruta V., MacKinnon R. Localization of the voltage-sensor toxin receptor on KvAP. Biochemistry, 2004. 43(31): 10071-10079.

145. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol., 1983. 166(4): 557-580.

146. Spirin S.A. and Swartz J.R. Cell-free Protein Synthesis. Springer Verlag: Berlin, Heidelberg, New York, 2003.

147. Schagger H., von Jagow G. Tri cine-sodium dodecyl sulfate-po ly aery lam ide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem., 1987. 166(2): 368-379.

148. Keller R Optimizing the process of nuclear magnetic resonance spectrum analysis and computer aided resonance assignment. PhD thesis ETH Zurich Switzerland (ETH Nr. 15947), http://www. nmr. ch, 2005.

149. Brejc K., van Dijk W.J., Klaassen R.V., Schuurmans M., van der Oost J., Smit A.B., Sixma Т.К. Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the ligand-binding domain of nicotinic receptors. Nature, 2001. 411(6835): 269-276.

150. Wells G.B., Anand R., Wang F., Lindstrom J. Water-soluble nicotinic acetylcholine receptor formed by alpha7 subunit extracellular domains. J. Biol. Chem., 1998. 273(2): 964-973.

Информация о работе

Копеина, Гелина Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Исследование и оптимизация бесклеточных систем экспрессии для производства рекомбинантных белков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы