Структура гена CD4-рецептора и изучение антивирусного действия рекомбинантных форм CD4

Зверев, Виталий Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура гена CD4-рецептора и изучение антивирусного действия рекомбинантных форм CD4
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура гена CD4-рецептора и изучение антивирусного действия рекомбинантных форм CD4"

рг-е. и«

г ь дп?

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

научно-исследовательский институт вирусных препаратов

На правах рукописи

ЗВЕРЕВ Виталий Васильевич

структура гена с1)4.рецепт0ра и изучение антивирусного действия рекомбинантных форм си4

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биологи»

ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискомие ученой степени доктора биологических наук

Москва 1995

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

академик РАН, доктор химических наук, профессор А. А. Краевский

доктор биологических наук В. 3. Тарантул

доктор медицинских наук, профессор Л. 6. Урываев

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф, Гамалеи РАМН

Защюодиссертации состоится "/ S -_1995г..

в " ' /* часов на заседании специализированного cotera Д 001.20.01 при НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН

Автореферат разослан " ' "_' 1995г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук.

Н. П. Коаксоеа

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Одним из наиболее опасных я быстрораспростран« г>ч w ua в последнее время вирусных заболеваний является инфекция, вызываемая вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекция), получившая в фазе клинических проявлений название СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита). Развитие этого заболевания, связанного с преимущественным поражением иммунной системы организма и сопровождающегося присоединением оппортунистических инфекций и неопластических заболеваний, неизбежно приводит к летальному исходу. Со времени появления этого заболевания число заболевших, по официальным данным на 1994 год, составляло более 3 миллионов человек, а число инфицированных ВИЧ превышало 15 миллионов человек-

Этиологический агент СПИД - вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), относящийся к семейству ретровирусов (подсемейство Lentivirinae), был открыт в 1983 году (Montagnier et al., 1983). Специфической мишенью для этого вируса служат хелперные Т-лимфоциты, в которых происходит размножение вируса (Klatzman et al., 1984; Daigliesh et al.,1984). Кроме того, показано, что моноциты и макрофаги также могут быть инфицированы ВИЧ (Gartner et al., 1986; Growe et al., 1987).

Рецептором для ВИЧ на чувствительных к вирусу клетках служит СВ4-диференцировочный антиген (CD4-рецептор), с которым взаимодействует поверхностный гликопротеид gpl20 ВИЧ (Sattentau et al., 1984).

Зрелая молекула CD4-рецептора имеет молекулярную массу 55 кД и состоит из внеклеточного сегмента (372 аминокислоты), представляющего собой четыре тандемно расположенных иммуноглобулннводобных домена, трансмембранного (23 аминокислоты) и цитоплазматнчеекого (38 аминокислот) участков (Maddon et al., 1985). Кроме того, как большинство мембранных белков, CD4-penenrop имеет лидерный пептид размером 23 аминокислоты. Ключевая роль в процессе взаимодействия С04-рецептора с . gpl20 ВИЧ принадлежат первым двум иммуноглобулинподобным доменам CD4 (Harrison et al., 1988). Первый иммуяоглобулинподобный домен CD4

(vl) имеет окало 40% гомологии с вариабельными участками легких цепей иммуноглобулинов и аналогичную пространственную структуру (Maddon et al., 1986).

CD4-pen,eirrop экспрессируется на поверхности хелперных Т-лимфоцитов (50-70% всех циркулирующих лимфоцитов), моноцитов и макрофагов (Ledbetter et al., 1981; Gartner et al., 1986). Этот гликопротеид играет важнейшую роль в антигеюависимой Т-клеточной активации, участвуя, таким образом, в формирования клеточного иммунного ответа (Biddison et al., 1984). Одним из главных свойств Т-лвмфоцитов, экспресси-рующих СВ4-рецептор, является способность взаимодействовать с мишенями, несущими молекулы 11-го класса главного комплекса гисгосовместимо-ств (ГКГС) (Meuer et al., 1982). Предполагается, что молекулы CD4-рецептора, обладая адгезивными свойствами, связывают неполиморф ный участок антигенов П-го класса н, таким образом, стабилизируют комплекс между молекулами класса Q ГКГС, несущими или не несущими пептидный антиген, в рецептором Т-клепси (Sette et al., 1987). До недавнего времени 'считалось, что Т-клетки, экспрессирующие СС4-рецегггор, могут выполнять в иммунной системе либо хелперную, либо индуцирующую функции, то есть либо проводить сигналы активации к В-лимфоцитам, либо индуцировать Т-лимфоциты, несущие CDS-дифференцировочный антиген, для выполнения последними цитотоксической функции. Сейчас функции CD-рецептора представляются более широкими, так как обнаружены цитоток-сические CD4+ клетки, которые могут играть регуляторную роль в иммунной системе. В настоящее время можно говорить о следующих свойствах молекул CD4: способность связываться с комплексом CDS/Ti; комоду лиро-вакие с комплексом рецептора Т-клеток; активирование Т-клеток в системе специфического лиганда, как например, комплекс антиген-молекула ГКГС П-го класса; прямое участие в запуске активации Т-клеток (Habeshaw et al., 1989). Поскольку, моноклональные антитела на различные участки молекулы СБ4-рецептора по разному влияют на все эти функции, можно говорить о том, что CD4-рецептор играет полифункциональную роль в иммунной системе, помимо взаимодействия с молекулами ГКГС П-го класса.

Кроме того, как уже говорилось, молекула CD4 служит рецептором для ВИЧ, в взаимодействие вирусного гликопротеида gpl2Q и CD4 является ключевым моментом в патогенезе ВИЧ-инфекции. Высокий аффинитет связывания вирусного белка с СБ4-рецептором обусловливает прикрепление и проникновение вирусных частиц в клетку и индуцирует дисфункцию и истощение неинфицированных CD4+ Т-лимфоцитов через широкий круг различных механизмов.

Если аминокислотная последовательность и структура самого CD 4-рецептора, относящегося к суперсемейству иммуноглобулинподобных белков, известна и достаточно хорошо изучена, то в мировой литературе, до последнего времени, не было никаких данных о нуклеотидной последовательности и структурной организации гена, ответственного за синтез этого белка. Получение такой информации могло бы дать новые сведения об эволюции и механизмах экспрессии гена CD4-peiienropa, в частности, и всего суперсемейства иммуноглобулинподобных белков в целом. Исходя из этого, нами были проведены попытки клонирования и изучения структуры гена, ответственного за синтез CD4-peiierrropa.

Способность С04-рецептора связывать ВИЧ теоретически предполагает возможность его использования в качестве противовирусного агента при ВИЧ-инфекции. Впервые возможность такого использования CD4 была показана в системе in vitro в 1988 г. несколькими группами авторов (Fisher et al., 1988; Deen et al., 1988). В этих работах использовались раз-, личные растворимые формы рекомбннантного белка CD4, выделенные как из про- так и эукариотических клеток. Однако, при клинических испытаниях таких препаратов значительного противовирусного эффекта достигнуто не было. Тем не менее, следует подчеркнуть, что в настоящее время не существует подхода к созданию лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфекции, который мог бы претендовать на монополию. Скорее всего, как н для ряда других инфекционных заболеваний, эффективная терапия ВИЧ-инфекции будет заключаться в применении комплексного подхода, когда в зависимости от стадии или формы проявления заболевания будут использоваться сочетания лекарственных средств с разными механизмами действия или их различные комбинации. Поскольку, сколько-нибудь

надежных препаратов внгибируюздих стада» взаимодействии ВИЧ с чувст-вятельвьшв клетками сока нет, дальнейшее изучение возможности нс-пользования для этих целей различных рекомбинантных производных CD4, не представляется бесперспективным.

Кроне того, различные рекамбинаяткые производные СБ4-рецептора могут и уже успешно применяются в различных моделях для изучения механизмов взаимодействия ВИЧ с чувствительными клетками, для очистки и изучения вирусных белков gpl20 в gpl60. Исходя из этого, вами проводилась работа по получению мутакпшх и других рекомбинантных форм С1)4-рецептора, которые можно было бы использовать для этих целей.

Настоящая работа выполнялась в рамках исследований Государственной научно-технической программы "Борьба с наиболее распространенными заболеваниями" по проблеме СПИД (темы № 70,133,313,424).

Цели и задачи исследования.

Основными целями настоящего исследования были: 1)изучение особенностей структуры и экспрессии гена, ответственного за синтез CD4-pe-цептора, 2) поиск препаратов на основе различных рекомбинантных форм CD4-рецептора, эффективно ингибирующих ВИЧ-инфекцию, 3) изучение возможности использования СЯМ-рецептора для направленной доставки антивирусных препаратов в клетки, зараженные ВИЧ.

Для достижения поставленных целей в ходе работы было необходимо решить следующие задачи:

1. Клонировать участки гена СБ4-рецептора и определить нуклео-тидную последовательность клониров&ных фрагментов этого гена. -

2. Провести компьютерный анализ нуклеогидной последовательности и сравнительный анализ с имеющимися последовательностями генов иммуноглобулинподобных белков.

3. Клонировать «ДНК (ДМ-рецепТора и сконструировать реком-бинантные дладмидк, способные обеспечить в бактериях EscbericMa coli синтез растворимых форм СШ-рецептора.

4. Синтезировать мутантные формы СЯ)4-рецептора с мутациями в участке взаимодействия с гликопротевдом gpl20 ВИЧ.

5. Сконструировать рекомбинантные плазмиды, обеспечивающие в бактериальных клетках синтез гибридных белков, состоящих из участка С04-редептора, ответственного за связывание, с ВИЧ и функциональных субъединиц токсинов бактериальной природы.

6. Получить конъюгаты CD4-рецептора с препаратами ингиби-рующими размножение ВИЧ в инфицированных ВИЧ клетках.

7. Изучить в системе in. vitro способность полученных рекомбивант-ных форм СБ4-рецептора. ингибировать репродукцию ВИЧ и возможность их использования для аффинной очистки вирусспецифическнх белков.

Научная новизна работы

В результате выполнения настоящих исследований получены новые данные, имеющие как теоретическое, так и практическое значение.

Получена геномная библиотека ДНК и клонированы участки гена ответственного за синтез С04-рецептора Т-лимфоцитов человека. Впервые определена нуклеотидная последовательность 5'-концевого участка гена СБ4.рецептора, включающего в себя три первых экзона и нитрона гена СБ4-рецептора, получены данные о структуре этого участка гена.

Идентифицирован новый, ранее на описанный LTR эндогенного рет-ровируса HERV-K; Впервые установлено, что Alu-повторяющиеся последовательности могут встраиваться в LTR эндогенных ретровирусов. Показано, что интроны гена CD4 содержат открытые рамки считывания в участки альтернативного сплайсинга для близкородственных белков. Предложена новая вторичная структура Alu-повторов ДНК.

Клонирована »ДНК гена СС4-рецептора и получены рекомбинант-ные плазмиды, экспрессируждцие в клетках E.coli рекомбинантные производные CD4.

Получены рекомбинантные- вммунотоксины, состоящие из CD4-рецептора и функциональных участков, дифтерийного токсина и токсина Pseudomonas. В системе in vitro изучена их антивирусная активность. Вы-' явлен новый препарат L-лизяноксидаза, ингибирующий ВИЧ-инфекцию, и получены конъюгаты этого препарата с CD4-рецептором, увеличивающие специфичность и эффективность препарата.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Стратегия клонирования участка геномной ДНК Т-лимфодитов человека (13,1 Т.П.В.), включающего в себя б'-концевой фрагмент гена CD4-рецептора и определение его нуклеотидной последовательности.

2. Анализ нуклеотидной последовательности клонированного участка гена CD4-рецептора, включающего в себя первый, второй и третий экзо-ны; первый, второй иятроны и часть третьего янтрона этого гена. Установлено, что первые три экзона гена С04-рецептора кодируют нетранслируе-мый участок мРНК, лидерный пептид и большую часть первого иммуног-лобулинподобного домена С04-рецещх)ра.

3. Анализ структуры экзонов гена С04-рецептора. Обнаружено, что нуклеощдная последовательность, кодирующая первый иммуноглобулин-подобный домен СБ4-рецептора, прерывается интроном, что крайне нехарактерно для белков иммуноглобулинового суперсемейства и дает новые представления об эволюции иктрокоа вообще.

4. Анализ структуры ингронов гена СШ-рецептора. Установлено, что интроны гена С04-рецептора содержат 14 Alu-повторов ДНК в прямой и обратной ориентации, которые могут принимать участие в эволюционных процессах и регуляции генов иммуноглобулишюдобных рецеторных белков. В нитронах гена СБ4-рецептора обнаружен новый HERV-K элемент и рамка считывания для белков с высокой степенью гомологии с белком BCGF и белками DAF и С0М5 из-системы комплемента, с участками альтернативного сплайсинга.

б. Стратегия клонирования кДНК (Л)4-рецептора, определение ее нуклеотидной последовательности в получение растворимых рекомбинант-ных форм С04-рецептора, эффективно взаимодействующих с рекомбияанг-ным и нативным гликопрогеидоде gpl20 ВИЧ и ингибирующих в системе in vitro репродукцию вируса.

. 6. Получение и характеристика рекомбинантных иммунотоксинов, состоящих из участка С04-рецешора, ответственного за связывание с ВИЧ и различных каталитических доменов токсинов бактериальной природы. Изучение их стабильности и антивирусных свойств.

7. Синтез мутантных производных CD4-penenvopa для изучения механизмов взаимодействия CD 4 с gpl20 ВИЧ и получение клеток бактерий, экспрессирующих мутантные белки.

8. Показано, что СВ4-рецептор, копыогированный с ингибитором ВИЧ-лизиноксидазой, позволяет снизить в несколько десятков раз дозы ингибитора при подавлении репродукции ВИЧ в системе in vitro.

Практическая ценность роботы

По материалам диссертации получено 3 авторских свидетельства на изобретения и 8 патентов Российской Федерации.

Полученные рекомбинантные формы С1)4-могут применяться для аффинной очистки вирусных антигенов gpl20 и gpl60 ВИЧ из вирусных лизатов для приготовления диагностических тест систем и возможных вакцинных препаратов. Полученные в результате работы моноклональные антитела могут использоваться для очистки рекомбинантных и нативных белков ВИЧ для создания различных препаратов как для диагностики, так и для профилактики СПИД.

Полученные во время выполнения работы рекомбинантные плазми-ды, защищенные патентами Российской Федерации и авторскими свидетельствами, высокоэффективно экспрессирующие участки генома ВИЧ 1 и ВИЧ2, могут быть использованы и частично используются для разработки диагностических препаратов.

Лизиноксидаза, антивирусные свойства которой изучались в настоящей работе, может быть использована в клинике для лечения вирусных заболеваний, в том числе ВИЧ-инфекции.

Апробация работы

Основные экспериментальные материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на ЬХП сессии общего собрания Академии медицинских наук (Москва, 1991), на Бюро отделения профилактически медицины РАМН (Москва, 1993), на VI, VTO, IX, X Международных конференциях по проблемам СПИД (Сан-Франциско, 1990; Амстердам, 1992; Берлин, 1993; Иокагама, 1994), на советско-австралийском

симпозиуме по проблемам "Профилактики и лечения СПИДа" (Москва, 1990), на 1и 2 Международных конференциях "СПИД, рак и регровиру-сы человека" (Санкт-Петербург, 1992, 1993), Международной конференции "Молекулярао-биологические аспекты диагностики в терапии СПИД" (Новосибирск, 1992), на Международной конференции "Молекулярная биология на рубеже XXI века" (Москва, 1994) в ряде других международных конференций.

Публикация работ

Основные положения диссертации отражены в 3 авторских свидетельствах, 8 патентах РФ, и 30 опубликованных научных работах.

Работа выполнена в плане научных исследований НИИ вирусных препаратов РАМН (директор - академик РАМН О. Г. Анджапаридзе) в лаборатории экспериментальной иммунологии. Основные результаты получены в соавторстве с сотрудниками НИИ ВП РАМН: Малюшовой В. В., Сидоровым А. В., Пугачем А. В., Анджапаридзе О. Г., Шухминой Н. Р., Пилле Э. Р., Мельниковой Н. Л., Зайцевым И. 3., Гольцовым В. А., Алексеевым С. Б., Сухановой Л. Л., Алаторцевой Г. И.; Института молекулярной биологии РАН: Недоспасовым С. А.; НПО "Вектор": Блиновым В. М.; ВНИИГевети-ка: Здановским А. Г.; Института вирусологии им. Ивановского: Кущ А. А. Своим коллегам и соавторам проведенных исследований автор приносит искреннюю благодарность.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

В работе применяли молекулярно-биологические, вирусологические, биохимические, химические и иммунологические методы исследования. В работе использовали перевиваемые человеческие клеточные линии Н9, МТ4, U937, MOLT4, Hut-78. Вирусы иммунодефицита человека • штаммы ВИЧ1/ШШ, BH41/SF4, ВИЧ/CBL, BH42/R0D были получены из музеев вирусных штаммов Института им. Д. И. Ивановского РАМН, НИИ ВП РАМН, Института Пауля Эрлиха, Франкфурт на Майне, ФРГ. В работе применяли ферменты рестрикции в модификации фирм Boehringer Mannheim GmbH

(Германия) я Fermentas (Литва). При работе со всеми ферментами использовала буферные растворы в условия, рекомендованные фирмами изготовителями. Препарат лизиноксидазы получен от академика РАМН Т.Т.Ве-резова. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили при помощи пакета программ "PC/GENE" (RELISE 90), используя банки данных EMBL 34 и GENE PROT 25.

Описание ряда методов, условий постановки экспериментов, состав питательных сред и растворов приводится при изложении полученных результатов.

1. Клонирование и определение структуры ^-концевого участка гена СМ-рецептора

Перед началом настоящей работы в литературе имелись данные только о нуклеотидной последовательности мРНК СБ4-рецептора. Данных о нуклеотидной последовательности гена, кодирующего этот белок не было. Однако, было известно, что этот ген, так же как и ген мыши для белка L3T4 (аналог человеческого CD4-рецептора) имеет протяженность около 33 т.п.н. (Maddon et al., 1987). Поэтому, для идентификации клонированных участков гена CD4 нами было синтезировано 8 пар олигонуклеотидов, комплементарных различным участкам мРНК СБ4-рецептора.

1.1 Клонирование фрагментов гена CD4-peuemopá

Из крови здорового донора по обычной методике была получена фракция периферических лейкоцитов. Из этой клеточной фракции феноль-ным методом была выделена суммарная клеточная ДНК ДНК была обработана рестриктазой Sau3A в условиях неполного гидролиза и полученные фрагменты очищены в градиенте сахарозы. Очищенные фрагменты ДНК, размером 10-25 т.п.н., клонировали в бактериофаг EMBL, обработанный рестриктазой BamHL Полученную библиотеку геномной ДНК использовали для поиска и клонирования различных генов, в том числе и для гена (ЛМ-рецептора. Для поиска фрагментов гена СВ4-рецептора использовали клонированную нами кДНК этого гена и набор синтетических олигонуклеотидов, комплементарных отдельным участкам кДНК. В результате скрининга был отобран ряд клонов, имевших гомологию с синтетическими

олигонуклеотидами и кДНК CD4-peaenropa. Нас, в первую очередь, интересовал 5'-концевой участок гена CD4-peflenropa, кодирующий участок С04-рецептора, взаимодействующий с гликопрсггеидом gpl20 ВИЧ и, возможно, несущий некоторые регуляторные элементы гена. Поэтому, для определения нуклесггидной последовательности был отобран клон, названный CDG26, содержащий вставку ДНК размером около 15 т.п.н., которая гибридизовалась с кДНК и синтетическими олигонуклеотидами, комплементарными участкам кДНК, кодирующими лидерный пептид и первый иммуноглобулинподобный домен CD4-peaenropa.

1.2 Определение нукле отидной последовательности клонированного участка гена С04-реиептора

Рестрикционная карта и схема определения нуклеотидной последовательности вставки геномной ДНК из клона CDG25 показаны на рис.1. Для определения нуклеотидной последовательности клонированная ДНК была субклонирована на ряд более мелких фрагментов, обозначенных заглавными буквами на рис.1. Нуклеотидная последовательность фрагментов А, В, С, D и F была определена методом Максама-Гилберта. Рестрик-цяокные фрагменты для определения нуклеотидной последовательности метились с двух кондов соответствующим [a-32P]dNTP, при помощи фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, разрезались соответствующей рестрик-тазой и очищались PAGE. На рис. 1 показаны точки начала и направление определения нуклеотидной последовательности. Фрагмент Е CDG25 был очищен и инкубирован с нуклеазой ЕхоЩ в течении 0, 30, 60, 90 и 120 сек. После обработки S1 нуклеазой, в стандартных условиях, полученные фрагменты ДНК, размером 650, 900, 1300, 1650, 1850 и 2159 нуклеотидов, были клонированы в Smal сайт векторной плазмиды pUC19. Нуклеотид-ную последовательность полученных фрагментов определяли методом Сэн-гера с использованием универсальных олигонуклеотидных праймеров. Фрагмент G был субклонирован на 4 субфрагмента, как показано на рис.1. Все 4 субфрашента после обработки фрагментом Кленова ДНК-

В.г11» И1*41П »«Ш МШ НМП1 1мН| й|<аш 1а11

4-5-i-1__:_I_I_к_I

•"I Н1|»и а»| хм! г»м>1 >.иЯ1 н1»|111

_» . > М_К. > . .П_1_1_I

Н1пЛ)1> N00] Е*р1 Им) И1»Р11 МмГ Н1МШ

А_.. ■* . . . .....I

ЩкЭ»

1 1 4 _< I II

М1П

Пса! Н1паШ I Тлч! И«м»1

_>_' I_!_Л_

1 Ь П I I

Рис. I. Рестрикциокная карта и схема определения нуклеотидной последовательности участка гена СП4-рецептора,

В верхней части рисунка С 1X52.5 - фрагмент гена СЫ-реиептора: Л&С.О.ЕР.С - субклонироеанные фрагменты гена ССМ-реиептора: горизонтальным» стрелками показано направление определения нуклеотидной последовательностк вертикальными стрелками показаны часткн узнавании ферментов рестрикции; цифрами показан размер рогмеигов гена С04-рецегтгора I нуклео гидах.

полимеразы I была клонированы в плазмиды риС18 и риС19 в Бта1 сайт Нуклеотидную последовательность клонированных субфрагментов опреде ляли Методом Сэнгера с использованием универсальных праймеров. Полу ченную нуклеотидную последовательном. вводили в компьютер для обра ботки и полной сборки. Полученная нуклеогидная последовательность б' концевого участка гена СВ4-рецептора приведена на рис.2.

1.3. Структура 5 -концевого участка гена С04-рецептора

Структура секвенированного участка гена СС4-рецептора схематично приведена на рис.3. При анализе нуклеотидной последовательности установлено, что она включает в себя первые три экзона н первые два

1 S I

! ä 5 1 I ! § i i i 1 i S 1 i 3 g 1 1 1 i 1 3 I I ! ! 5 I

iiiiliii! i i I i lililí III Ii

a в

Е с 3

i S-

s * s

« s

Q. о

ai X

. S X

л9 О Ф

CL X CP

О *

H- 3 >> С x\o

O) <D О

J X

О-

a. X о

«чг О О

О «э и о ч

Гв О и X It- ас

О CL«e а» о о ? о аз

0) 2 -0 ГУ X V-X Ф U О < О

* а» X

«. -О <

(Л С dl

-0 лЗ t- X £0

и<о

О < X 3 0) л а. <

< о о О) к о

V- m с

«3 о

« с «

о i

< э X й) г- н-

<<с о и < о ... и с s s £ * а « о fl í •X £ S

< ra £ s ал í-

о з ...

Ф X И

< а» >■>

* -з ч. >> «

X i а

о а» • °

о о с

О з S X CL. О ,

§ с

интрона гена CD4, а так же часть третьего интрона н прилегающий к первому экзону участок геномной ДНК.

Первый экзон гена СБ4-рецептора (456-465 нуклеотиды на рис.2) содержит 11 нуклеотидов из нетранслируемого участка мРНК С04-рецепто-ра. Второй экзон (10869-10983 нуклеотиды), размером 114 нуклеотидов, содержит 66 нуклеотидов нетранслируемого участка мРНК и 48 нуклеотидов, кодирующих первые 16 аминокислот лидерного пептида С04-рецептора (рис.2). Размер первого интрона гена, таким образом, составляет 10404 нук-леотида. Третий экзон гена СБ4-рецептора (11112-11277 нуклеотиды) отделен от второго экзока интроном размером 119 нуклеотидов и содержит последовательность (21 нуклеотид), которая кодирует последние 7 аминокислот лидерного пептида и 144 нуклеотида кодирующих первые 48 аминокислот первого иммуноглобулннподобного домена CD4-peuenropa. Нуклеотид-ная последовательность первого иммуноглобулинподобного домена прерывается третим нитроном протяженностью по крайней мере 1815 нуклеотидов. Аналогичный интрон в свое время был обнаружен и в гене, кодирующем L3T4 рецептор мыши (Maddon et al., 1987). Наличие интрона в середине последовательности иммуноглобулинподобного домена нехарактерно для белков этого типа. До сих пор не обнаружено ни одного гена иммуноглобулинов и иммуноглобулинподобных белков, имеющих интрон в этой позиции. Все нммуноглобулиновые функциональные домены кодируются всегда одним экзоном, размером около 300 нуклеотидов (Hood et al., 1985). Высокий уровень гомологии между CD4-рецептором, L3T4 и другими иммуноглобулинами говорит о том, что гены этих белков появились в результате дупликации, которая произошла относительно позже в эволюции суперсемейства иммуноглобулинов. Очень трудно объяснить наличие этого нехарактерного интрона, используя общепринятую гипотезу о том, что нитроны эволюционно остаточны и формируются перемещением экзонов (Doolittle et al., 1978,1993). Согласно этой гипотезе, ген С04-рецептора должен был бы иметь родовой домен, из которого эволюционировали все гены суперсемейства иммуноглобулинподобных белков и терял бы нитрон.

Repeats LT R - Esons

ExonI (™¿>n5 H EJRV HUI

I-!-!-:-'-:-'-i-i-1-!-

Aiu __5__ ^ 10 kb 1Ш

repeats! 2 3456 7 8 9l6l2~Í4

Puc. J. Структура S'-концевагоучастка гена CD4 (схема).

Показан размер ыонирсаанного участка гене 8 экэоны обозначены знаком Q и пронумерованы римскилш цифрами: AJu-noBTOpu обозначены сплошными стрелками м пронумерованы; ITR HSHV-K обозначен прерывистой стрелкой; Gata-повторы показаны авоинымм стрелками.

Поэтому, более вероятным событием представляется ннсерция интро-на в экэон иммуноглобулинподобного домена во время эволюции CD4, до процесса дивергенции человек • грызуны. Это может быть важным для понимания отдельных этапов эволюции как генов этого суперсемейства в частности, гак и интронов в целом.

1.3. ¡.Анализ промоторной области гена С04-рецепюра

Предварительно было показано, что промотор гена СБ4-рецептора мыши локализуется на расстоянии 90-60 нуклеотидов от первого экзона по направлению к Б'-концу гена (-90 область) (Nakayama et al., 1993). Этот участок связывался со специфическим ядерным белком, названным NF-CD4 и запускал транскрипцию. Анализ нуклеотидной последовательности области, соответствующей промоторному участку гена CD4-рецептора, показал, что в районе основного промотора гена произошла потеря классического "TATA бокса" и сохранился только участок посадки ДНК-полимеразы Ц (331-340 нуклеотиды, рис.2). Тем не менее, согласно нашим предварительным данным и данным некоторых авторов (Salmon et al., 1993), именно участок отстоящий на 100-120 нуклеотидов от первого экзона отвечает за эффективную транскрипцию этого гена. В этой области (321-331 нуклеотиды, рис.2) рядом с участком связывания с ДНК-полимеразой П, находится нуклеотидная последовательность полностью гомологичная консенсусу

»( t

ETS, связывающаяся со специфическим белком, активно экспресси-рующимся в CD4+ клетках. Эти данные могут говорить о том, что ETS специфические транскрипционные факторы миуг играть главную роль в контроле экспрессии гена С04-рецептора связываясь с классическим участком связывания в промоторной области гена.

Кроме того, в промоторном участке гена СЮ4-рецептора обнаружен целый ряд тканеспецифических детерминант регуляции, т.е. функциональных участков для ДНК-связывающих белков, участвующих регуляции транскрипции и определяющих ее тканеспецифичность (TCFl, LBP1, TCF2, NF-IL6, GATA, LVa, АР2, NF-uEl, Е2а, Т-антиген). Поскольку CD4-рецегггор экспрессируется в различных типах клеток, это может иметь важное значение для регуляции транскрипции его гена в различных тканях при различных условиях.

1.3.2. Характеристика ретротранспозона. локализованного в гене С04-рецептора

Внутри первого внтрона гена СВ4-рецептора мы обнаружили последовательность, соответстветствующую LTR HERV-K элементу (human endogenous retroviral element) (8199-9475 нуклеотиды, рис.2), который находится в ориентации обратной гену CD4. Эта последовательность не содержит ни открытых рамок считывания для ретровирусных белков, ни пу-ринбогатого участка на 5'-фланкирующей последовательности З'-LTR, ни тРНК связывающего участка, т.е. является отдельным LTK. Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности обнаруженного LTR HERV-К элемента с другими, имеющимися в международном банке аналогичными последовательностями, показал, что это новый, ранее не описанный з литературе элемент, относящийся к HERV-K подсемейству.

Сравнительный анализ имеющихся нуклеотидных последовательностей LTR различных HERV-элементов приведен на рис.4. Характерной особенностью обнаруженного нами LTR HERV-K, является встраивание в него ■ Alu-повторяющегося элемента (224-516 нуклеотиды, рис.4), что является пока уникальным, ранее не описанным, событием. Роль HERV элементов в геноме человека до конца не выяснена, однако, известно, что они могут экс-

го

ERVX

:MH|RVK

GAfiAÇCt jT£CSúAA^A^AC^4TCtóA^STTA£TSTGTCTATSTAGAAAM^G(

: г : : : : : : ы :

i.A... • (•■

..........V............

..........î............

.......................

i...----..6............

ERYK А£ЛСАТАА£ДААСТ»ССАТП V

DJHERYK

C04HERVK up-ärev

iStftVKoZ

«»«■'»3t

§uy

iSf^'.Viä

1 J.-in ikA

CAAGGCCGCAGSWCCCTGCCCGpAtóCCTWKTAnSTCC^GSTTTCCCCCCKT

5» ••.,♦•♦•» ,wb «••••• ••••••••••• & .m»« *i

¡c:::::::

GáGACAíCCTGASATATGGCCTCpimGGGAAA^CTT^^CCCCCC^C^y:

* ' îc:JC:

••к*..............ь.¡..

i • )ti (Л

i* |i •

....................'!••!'

• • ».................

TTCAWTAAGAGGAA£GCATCJGTCTCCTGCTCG^CCJ|GG-AATGGWTG

КС

к::::

• • « c» •

• •••••• y» *•••••«» 1* ,1

ICJ^ATC ATA- С АТТСТАТТ^- -.

........$::::

fïiii:

cX::

CTTATG

ATTÏ! К !

'A! * i». . .................

¡{■••••S-.....>

±— -......

fÄ •«•• f«««««« flO» ry • • # • * J.

ÇRVK

AEGÇGAÇACATCATGGCGGCWACTGCTCTÇTTACTCTTTACTACACTGAfiATGTTTGT

.............V £::::::::r.

.....kJ::S

•¡••'t's! - i— «-f.

..A.

..A. ..A. ..A. ..A. ..A.

.....vi-""

...A.

...A. »...

........ A. • -

.......Ï.A.--

CTGS

стшАтеАСАСА^-тстктсАТАТЕТПпствстелгетстсстсАСф

-ягг р- ЦИП

к: ¡:

г-

У).1"" ......

■ ■ у< А* •• Ъ • • • > у »•»•••••• !••«• • ■■ ^ - --

. ^б.. .««V (••»•• !••••««•♦•«•«»«♦• е.

• »..,.*».^««»»»«м.......¡^

«УК

I» •

4»- >

...Т...СТ...

А..........Т..СПС...ТА

******

! АСССТАТ/ЙССССКСАСАТ7СССС-ТС0СС11ИАТКТАААСАТАСТ£АТСААТЛААТ

Е№

Ш1

• *»•*»• »• • ^ (а]

Т*.••• ^ гЭД»,»,

••••• к.......

.::: с-. ТБС— А. САС

¡НЕМ АС7й^ейААСТС^АСАССАаС^С5СТ1ХАСеТССТ-№рСТ^СС6С^ОСТССС

ТСТС1С-ТС7СПАТТТСШТСТС«

........»V*

. .. .........«.....

.......*......*.........

Рис.4. Сравнительный анализ нуклеаггшдних последошателъностей ЦГН НЕЯУ

-' Показаны замены нуклеотлов: юмолопа обозначена знаком (./; лелеиии ■ П; глхзгокоргикоидзависимый элемент ¡ОЧВ) и энхансор обведены рамкой; "ТАТА-бокс" - (И): участок полиаленилирования ('/; показаны 113/й и НАЛ области. Нуклеотнлная последовательность Ми-повтора £ встроенною в СМ НЕМ № не приведена.

прессироваться в клетках различных опухолей. В некоторых случаях они могут принимать участие в перестройках генома, являясь одной из движущих сил эволюции, а так же в регуляции экспрессия ряда генов (Kato et al., 1990; Feuchter et al., 1992). Анализ нуклеоггидной последовательности обнаруженного нами LTR HERV-K доказал, что он содержит целый ряд генетических элементов, которые теоретически могут принимать участие а эс-прессии клонированного нами гена. Так, на расстоянии 87 • 94 нуклеотида от начала ретротранспозона находится энхансер, к которому примыкает последовательность определяющая зависимость транскрипция от глюкокор-тикоидов (GRE) (рис.4). Трудно сказать насколько эти последовательности функциональны, однако известно, что в некоторых линиях опухолевых клеток экспрессия HERV элементов стимулируется стероидными гормонами (Ono et al.,1987). Так же, как и все другие HERV элементы CD4HERV-K содержит ТАТАА бокс и классический сигнал полиаденилирования (рис.4). Кроме того, последовательность обнаруженного LTR HERV-K содержит еще целый ряд участков связывания с белками, принимающими самое активное участие в регуляции экспрессии генов в тканеспецифичности этого процесса. Это прежде всего, последовательность, участвующая в связывании белка р53 (158-166 нуклеотиды, рис.4), фактора ингибирующего развитие опухолей и обладающего свойствами как активатора, так и ингибитора транскрипции; ETSl-последовательность (195-205 нуклеотиды); участки связывания NF-IL6; АР2; Т-антигена и др. Мы ае проводили эксперименты по изучению функциональной активности генетических элементов, обнаруженных в L.TR HERV-K элементе и поэтому, не можем сока говорить о их роли в регуляции экспрессии клонированного нами гена. Однако, интересен уже сам факт такой высокой концентрации регуляторных элементов в гене CD4-рецептора.

1.3.3. Анализ А/и-повторяющихся элементов а гене С04-реиептора

Внутри секвенированного фрагмента гена (Л!)4-рецептора мы обнаружили 14 Alu-повторяющихся элементов, 8 из которых кластеризованы в два локуса. Все Alu-повторы локализуются в нитронах (рис.3) и составляют более 50% всей нуклеоггидной последовательности клонированного участка

гена CD4-penßjrropa. Такой концентрация Alu-повторов до сих пор не обнаруживалось ни в одной гене. Трн Alu-повтора, обозначенные на рис.2,3 под номерами 2, 7 и 10 находятся в прямой ориентации, остальные 11 в обрат-вой, так называемой, транскрибируемой ориентации. Гомология меяаду обнаруженными Alu-повторами в последовательностью Alu-консенсуса составляет от 70 до 90К. Роль Alu-повторов в геноме человека в настоящее время до конца не выяснена. В литературе имеются данные об участии этих генетических элементов в гомологичной рекомбинации, в результате которой происходят делеции генетического материала между Alu-повторами и перестройки самих повторов (Marcus et al., 1993; Ii et al., 1993). Кроме того, показано, что некоторые гены (например, ген орнитин-Р-аминотрансфера-зы может экспрессироваться в дефектной форме за счет встраивания между экзонами Alu-повтора в использования участков альтернативного сплайсинга, находящихся внутри Alu-повтора (Mitchell et al., 1991). В этом отношения, крайне интересны обнаруженные вами в некоторых Alu-повторах открытые рамки считывания для белков с высокой степень» гомологии с белками BC6F (фактор роста В-лнмфоцвтов), СОМ5 (пятый компонент системы Комплемента) в DAF (dekay accelerating factor), также относящийся к системе Комплемента. Рамки считывания этих гипотетических белков находятся внутри инвертированных Alu-повторов, обозначенных на рис.3 под номерами 4, б, 8,9 в 11.

«CSF IXXERLUL6PVAXTYNRSTlGGkGGUITRGQEFKT$lAI0IVEPCLY*

Alu« K..1DICP.T...AC......«в.....L...IE..... I.K.Y.." А

Alu 9 ----TT»..»...АС...А.........С....CI......К.»..*

OAF SSSWaAO«IICWSStOS-«TPqFaSFHFSl.l>SSUY»Wl

Alu í t.CJ.A...W.t.LC..W....TPfSa......«... Б '

Alu 11 I.SSl...rva...Le....PP-.n..S.S.l......о...

саб TSGWSUtLsmECttUlVWXUtJraSDSPAUmUlTCrKHIMPr

Alu 3 FFUW....I.....S.V..А..«.................E.,BVS....U

Alu а . FFUi...........S.A..А..а.С____RH......I...Т..AI...III В

Alu 11 FFUR.C.V.....0.S.V..A..».».....Ю.Т.......T..N____RH

Рис. 5. Сравнительный анализ открытых рамок считывания из А1и-поеторов с ВССР (А); ДАТ (Б) и СОМ5 (В) Аминокислотном последовательность дана * олнобуаенном годе.* Буквами показаны аминокислотные замены; Г)- терминирующий колон: 1-) - отсутствие аминокислоты: (.} - совпадающие аминокислоты

На рис. б представлены данные сравнительного анализа гомологии между белками из открытых рамок считывания Alu-повторов и белками BCGF, DAF, и СОМ5. Открытые рамки считывания для белков гомологичных DAF и С0М5 распологаются на той же нити ДНК, что и ген CD4-pe-цептора, а рамки для белка гомологичного BCGF на комплементарной нити ДНК. Как видно из рисунка, процент гомологии очень высок и составляет: для белка BCGF 65% и 74% гомологии с белками из Alu4- и А1и9-по-второв, соответственно; для белка DAF 53% и 57% гомологии с белками из Alu8- н Alu 11-повторов, соответственно; для белка СОМб 70%, 66% и 64% гомологии с белками из Alu5-, Alu8- и Alull-повторов, соответственно. Причем, в белке BCGF и гипотетических белках из Alu-повторов 4 и 9, также как и В А1и8 и DAF, совпадают терминирующие кодоны. Интересно, что А]и8-повтор, который локализуется внутри LTR HERV-K элемента содержит две открытые рамки считывания для белков гомологичных DAF и СОМ5. Кроме того, этот Alu-повтор содержит несколько участков альтернативного сплайсинга, которые теоретически могут участвовать в переключении синтеза мРНК для одного белка, на мРНК для другого белка. То, что некоторые Alu-повторы могут содержать открытые рамки

--F--F--1--R--0--S--1--A--1--S—P--R--L--E--C--S--G--A--I . TTTTTTTTTTGAGACAGAGTCTTGCTCTGTCGCCCAGCCTGGAGTGCAGTGGCGCGATC -E--S--C--S--V--A--0--A--6--V--0--U--R--D---S--A--H--C--H--I.--C--L--P--C--S--R--II--S--P--A--S--A--S-TCGGCTCACTGCCACCTCTGCCTCCCGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTGAGCCTCC L--G*-S--L--f'--P--l--P--P-*G--F--T--P--F--S--C--L--S--L--

-R--V--A--G--T*"T--G--A-"R"-H--H--A--R--L*-I--Í CGAGTAGCTGGAACTACAGGCGCCCGCCACCACGCCCGGCTAATTTTT 170 Р--S--S- -u--M--r--R--R--P--P--P- -R--P--A-»-

Рис. 6. Локализация открытых рамок считывания в AluS-noemopc гена CD^-рецептора

COM5CD и DAFCD - белки гомологичные COMÍ и ОАР.Соогеетсгвенно: {*! - погенииальные учасгки сплансинпх (- термннирукхиий колон цифрами показан порялковьм номер нуклеотиАа в Alu-noarope.

считывания дяя белка высокогомологичного С-концевому домену белка С0М5 нет ничего удивительного, т.к. известно, что нуклеотидная последовательность, кодирующая этот домен в нормальном гене человеческого белка С0М5 также располагается внутри Alu-повтора (Lundwall et al., 1985). Ген белка DAF, как показано, может синтезировать два белка (DAFln DAF2) по механизму альтернативного сплайсинга, сайты для которого находятся внутри Alu-последовательности (Caras et al., 1987). На каких хромосомах локализуется этти гены до сих пор не известно, поэтому, в нашем случае можно предполагать не только случайную гомологию или "молча-

СОН5СО

AluS

DAFCD

ССК5

AluS

DAF

CCS5 Alu! DAF

щне" измененные в процессе эволюция копии генов, но и возможность их полиморфизма, тем более, что все элементы, необходимые для эффективной транскрипции этого участка генома присутствуют в LTR HERV-K элементе, в который включен AluS-оовтор. Что касается белка BCGF, то до сих порне было данных о том, что экэоны этого гена могут локализоваться в ре-тропозонах, tjc. его нуклеотидная и аминокислотная последовательность определена по последовательности кДНК. Несмотря на высокий уровень гомологии между гипотетическими белками из Alu-повторов и BCGF ничего нельзя сказать о какой-либо их функциональной активности. Тем не менее, наличие внутри Alu-повторов регуляторкых элементов и фрагментов генов, .и и 111 н и ft рал подтверждает гипотезу о том, что мобильные генетические элементы меняющие свою локализацию, активно участвуют как в эволюционных перестройках генома так и его экспрессии. За это говорят и данные о том, что Alu-повторы ДНК могут связываться с нуклеосомами в процессе транскрипции некоторых генов. Для такого взаимодействия ДНК Alu-повтора должна иметь определенную яшилькообразную вторичную структуру с участками, доступными для связывания с белками, входящими в вуклеосому. Такие структуры ранее предлагались, однако, они могли быть использованы только для некоторых подсемейств Alu-повторов. Мы предлагаем свою гипотетическую структуру Alu-повтора, которая содержит четыре шпилечных структуры, по две в каждом из мономеров Alu-повтора (рис.7). Особенностью этой структуры является то, что нанесение всех иук-леоггидных замен из других известных Alu-повторов не приводит к изменению самой структуры, так как практически все замены носят компенсаторный характер. Насколько функциональна такая структура, сказать в настоящее время невозможно, однако, все исследованные нами Alu-повторы, принадлежащие х различным субгруппам, могут иметь такую структуру.

Высокая концентрация Alu-повторов и наличие LTR HERV-K элемента в первом и втором иятронах гена СБ4-рецептора представляют большой интерес еще и потому, что эти элементы являются наиболее предпочтительными участками для встраивания провирусной ДНК при ВИЧ-инфекции (Stevens etal.,1994).

6Чат

Г* •

щЬ

3' -сб^ТеАДАСССГССеСсЧАТЫТГГТТАТСТТТПлА1

II.

¿1

I II

5' - &ё*ёасттгебса№ссб*етастлааадтасааааатт*дстс11бсасбс'

Рис.7. Возможная втсричная структура АЫ-псжтора 5* прямой (I) и обратной (Л) ориентация!

Стрелками показан промотор ¿ля РНК-полимеразы № знаком ("I обозначены взаимодействующие нуклеогиды.

Кроме Alu-повторов и LTR HERV-K элемента, в первом нитроне гена CD4-редептора, между ALuï и А1иб мы обнаружили кластер GATA-последова-тельносгей. Отдельные GATA-участки встречаются внутри промоторной области и внутри HEKV-элемевта. Однако, только повтор А1иЗ фланкирован с каждой стороны тринадцатью тандемно расположенными GATA-участка-ми. Всего же в этой области GATA-участков более 100. Показано, что участки GATA играют важную роль в транскрипции ряда генов, кодирующих белки иммунной системы. Эти последовательности служат участком связывания для белков, специфически активирующих энхансеры, а значит и экспрессию генов, в клетках, не относящихся к Т-популякки (Henkel et al.,1994). Однако, для выполнения этой функции достаточно одного GATA-участка. Наличие же целого кластера этих элементов может на наш взгляд лишний раз свидетельствовать о высокой транскрипционной активности клонированного участка гена.

1.4. Локализация гена С04-рецепторо на хромосомах клеток ллоноцитоидной линиии U9 37

Изучение Т-лимфобластоидных и моноцитоидных клеток, инфицированных ВИЧ в культуре, показало, что чувствительность этих клеток к ВИЧ определяется уровнем экспрессии гена CD4 (Asjo et al., 1987). Различия, выявляемые на фенотипическом уровне, могут быть результатом нескольких событий, в том числе, изменения дозы гена рецептора или изменения его локализации в результате хромосомных нарушений. Нами изучались два клона линии моноцитоидных клеток человека XJ937 - U937/16 и U937/4, характеризующиеся максимальной и минимальной чувствительностью к ВИЧ1 и содержащих по две 12-х хромосомы, на которой локализуется ген CD4 (Dean et al., 1991). Используя фрагменты гена СБ4-рецептора в качестве зонда была исследована локализация гена CD4 в хромосомах сравниваемых клонов. После гибридизации ДНК хромосом двух клонов in situ было обнаружено, что зерна серебра локализуются в районе pll-pl2 хромосомы 12. Ни для одной другой хромосомы двух клонов не обнаружено превышения зерен серебра над уровнем фона, что свидетельствует о том, что короткое плечо хромосомы 12 не участвовало в перестройках хромосом.

Как в высокочувствительном, так и в низкочувствительном клоне, доля клеток, содержащих метку в районе pll-pl2, существенно не различалась (73,2 и 70,2%, соответственно). Таким образом, результаты гибридизации ДНК in situ говорят о том, что различная чувствительность клонов к ВИЧ не определяется разной локализацией гена (Л)4-рецептора или разной дозой гена. Гибридизация позволила уточнить расположение этого гена на 12-й хромосоме, между участками 12р11и 12р12.

2. Клонирование и экспрессия кДНК CD4-peuerrropa 2.1. Клонирование кАНК С04-реиептора Для выделения и клонирования кДНК СБ4-рецептора была использована библиотека кДНК из стимулированных ФГА человеческих Т-лимфоцитов фирмы "Clontech laboratories, Inc." (США) в бактериофаге Xgtll. В качестве зонда для скрининга библиотеки использовали два синтетических 20- и 18-звенных олигонуклеотида, гомологичных последовательности 5'-концевого участка мРНК гена СБ4-рецептора: 5'-AGGGAAACAAAGTGGTGCTG-3' и 5,-TTTTTTGCCCAGCACCAC-3\ которые имеют на З'-концах комплементарные друг другу участки ДНК длиной 9 нуклеотидов. В результате трех раундов скрининга был выделен клон, со-

Pue.S. Структура ruuaMudpNS 12 u pCDZ24S

Цифрами показан размер ллазмид а нуклео гидах; показаны участки узнавания рестриктазами: B-BomHI. E-EcoRV. H-HindM. Но-НаеШ. N-Nhel Naa-Nael, P-Pvull. R-Rsal. S-Sacl: Amp-ген устойчивости к ампициллину; Stap-термннируюший колон: клонированные фрагменты кАНК CD4-реиепторо заштрихованы.

держащий участок ДНК Т-лимфоцитов, ограниченный участками узнаваний рестриктазой ЕсоМ, размером 2,8 т.п.н. Этот ЕсоЫ-фрагмент ДНК имел один участок узнавания рестриктазой ВатНГ, которая делила его на фрагменты размером 1,0 и 1,8 т.п.н. Гибридизация фрагментов ДНК с зондом на кДНК С04-рецеш»ра дала положительный результат только в случае фрагмента размером 1,8 т.п.н. Этот ЕсоШ-ВатН1 фрагмент ДНК был клонирован в плазмиду рйЕМЗ по ЕсоИ - ВатН1 сайтам, в результате чего была получена плазмида рКЭ12, содержащая вставку ДНК 1,8 т.п.н. (рис.8).

2.2. Определение нуклеотидной последовательности клонированной кАНК гена С04-реиептора

Рестрикционная карта ЕсоМ-ВатН1 фрагмента ДНК полностью соответствовала опубликованной ранее (Мас1<1оп еЬ а1., 1985). Используя метод Максама-Гнлберта была определена нукяеотидная последовательность клонированного фрагмента. Схема определения нутслеотидной последовательности приведена на рис.9. На рис.10 приведена нуклеотидная последовательность кДНК, и соответствующая ей аминокислотная последовательность СБ4-рецептора. Она практически полность соответствовала нуклео-тидной я аминокислотным последовательностям, опубликованным ранее (Ма<Моп еЬ а1., 1985). Исключения составили следующие позиции нуклео-тидов: 45 и 51 - вставка б; 57 ■ замена Т на в; 155 - замена С на в; 336 - замена Т на С; 838 - замена Т на С. Последние три нуклеотидные замены приводят и к изменению аминокислотной последовательности СБ4-рецеп-тора: аспарагина (Ю на лизин (10, триптофана (\У) на аргинин (И) и фени-лаланнка (Б)на серин (8), соответственно.

ЕсоШ _ , _ „РУи11 . , „, , ВатШ

Лва! Вс11 вас! ЯШ

ЕсоШ . _ „РуцИ _ , Кэа! Вс11 Бас!

ШпаШ Иёе!

ГТ

300

600

900

1200 С

Рис.9. Схема определения нуклеотидной последовательности кДНК С04-рецептора

А- фрагмент плазмиды рЖ 12. содержащий кДНК; В- фрагмент плазллиды рСОИ4£ с участком кДНК: С - размер АНС > нуклеогидак показаны участки узнавания отдельными рестриктазами: стрелками показан старт и направление прочитывання нуклеотидной последовательности.

2.3. Экспрессия в клетках Е&епсЫа сой рекомбинантных форм С04-реиегттора

Известно, что в процессе связывания гликопротеида др120 ВИЧ главная роль принадлежит первым двум иммуноглобулинподобным доменам СВ4-рецептора (1-180 аминокислота) (Юаитапа е1 а1., 1984). Для клонирования этого участка кДНК в вектор экспрессии рЕХ1 плазмида рН812 была обработана рестриктазой НаеШ. Фрагмент ДНК размером 700 нуклео-тидов, содержащий участок кДНК и кодирующий первые 182 аминокислоты и лидерный пептид С04-рецептора, был выделен из агарозного геля и клонирован по тупым концам в плазмиду рЕХ1, обработанную рестриктазой БтаГ, в рамку считыванияР-галактозидазы Е.соН (рис.8). Полученными рекомбинантными ДНК трансформировали штамм Е.соН РОР2136. В

СААйСССА БАБ ССС ТЕС САТ ПС ТЕТ СТС АБС ТСС СТА СТС ИТ СА6 С« ССТ - 56

ОСС ТСС СТС БЕС ААО ССС АСА да ¿АС ^ Щ ОД рСТ Щ Щ £АС £76 ^П - ПО

Ей № Ей ЕЙ ЕЙ ехе № № № - 164

ЕЙ № № № № Й5 Ш ШЕЙ № $ № Йсг № $ № ■218

№ т ^ № № № ЙЙ № «1 Я1Е2Э № -272

еде тсс пс па йст ааа сет сса тсс дао рте дат еат свс дет длс тса аба - зге

БТу 5ег Рпе £еи Тпг 1у5 иТу Рго 5ег С уз Сеи Акп «р ягд ДТа мр 5ег Агд

АйА А£С СП Свб ОАС САА 2ЕА {АС ПС ССС СТЕ А1С АТС ААЕ ААТ СТТ ААС АТА - 380

Агд ьег Сеи Агд А$р ь1п ьТу Ьп РИе Рго Сеи Пе Пе а5п Сеи 1у$ Пе

^ $ ш №Р № # т <&т ем ^ $ §к ^ а^ ш -434

В§ ЕЙ № № № В5 Ш № ^ Ш № Ш ЕЙ ЕЙ Ш -488

§ег ЕЙ Ей Йи ^ № ВД № № № ЕЮ 1$ -542

ва Ш1 из ш ^ ^ № ^ ^ ^ га ЕЙ Ш Ш Ш -596

Е1и Ей ^ $ № т ® Щ Ш № Ли № е^ ^ -650

^ Ш № № № N1 Е1иА т № ^ ¡1СГ 704

№ ^ ^ ^ № № ^п5 Ш № РсгоА Ей Ш '758

е ш ^ ей ^ е^ ЕЙ ^ ^ т -812

ТСС ТСС ТСС ААЗ ТСТ Кб АТС АСС 1СТ <5АС СТС АА(5 ААС ААБ Ш БТС тст £ТА - 866

5ег ьег ьег 1уз ъег 1гр Пе Тпг $ег «р Сеи ЬуБ Азп 1у$ ь1и уаТ 5ег Уа1

^ ^ Ш ^ №1 ^ ЕЙ № № № Ей Ей ^ -920

СТС АСС СТй ССС САЙ дсс Ив ССТ САБ 1АТ ЕСТ БЕС ТСТ е?А МС СТС АСС СТО - 974

Сеи Тпг Сеи Рго Бт АТа 1еи Рго Б1п Т>г ДТа БГу ьег игу А£П Сеи Тпг Сеи

№ ей № ^ ^ ^ йи6 ш ^ ей № ш т ■1038

^ № ЕЙ ^ ^ ^ 1ТЙ № Ш Щ ЙС0 1ег -1092

ССТ ААЕ СТй АГ? СТв АЗС ТТв ААА СТ6 ДО ААС АА& 6№ БСА ААЗ БТС ТСС Ш, - 1146

Рго 1у$ [ей МЕТ Сеи 5ег Сеи ^ Сеи и(и А5п ь1и АТа 1у5 УаТ Бег

^ № № ЕЙ ^ № № № Б25 -5200

ей $ ^ не ей ^ т т ш ей е ■1254

?гЕР ¡сесг Гг № № № № ЕХВ Ш ЕЙ ^ т № ~1308

ЕЙ ЕЙ ЕЙ № № № Ееи № № № № ^гд Хгд

айс с6с саа бса до сбе ат1} тст до атс ааб айа стс стс айт вас ААв ААЕ - 1416

Агд Агд ЕГп ДТа Е1и лгд НЕТ 5ег е1п Пе 1у5 Агд Сеи Сеи 5ег Е1и Ьуэ

?£сг ^ ^ ш ^сгот ьщ т ^ Ш лсе -1470

еде

- 1754

Рис.10. И.уклеошидная последовательность хДНК СЫ-рецептора

Цифрами показан размер ЛИК < нухлеотн&ах; аминокислотная последовательность С04-рецепторо ¿она к трехбуквенном коле.

плазмиде рЕХ ген ^-галактозидазы находится под термоиндуцибельным промотором, поэтому, выросшие после трансформации клетки выдерживала несколько часов при повышенной температуре, лизяровали ультразвуком и полученные белковые лизаты исследовали в 10% ПААГ. Отбирали клоны синтезирующие слитный с (З-галактозидазой белок. Из таких клонов выделяли плазмидную ДНК и проводили ее рестрикционный анализ. В результате был отобран клон, содержащий плазмиду рЕХ1 со вставкой ДНК, соответствующей клонированному фрагменту кДНК СБ4-рецептора в рамке считывания ¡5-галактоз ид азы в правильной ориентации. Плазмида была названа pCDZ245 (рис. 8).

Из клеток E.coli слитный с (3-галактозцдазой белок, содержащий первые 182 аминокислотных остатка С1)4-рецептора, выделялся в виде гелец включения и очищался на колонке с Sephacryl S-300 ("Pharmacia", Швеция). Очищенный белок исследовали на способность связываться с моно-клональными антителами к СВ4-рецептору. Известно, что моноклональ-ные антитела ОКТ4А и Leu3A конкурируют с гликопротеидом gpl20 ВИЧ за связывание с СБ4-рецептором (Hassey et al., 1988). Мы показали, что и в

-.-Г 2-3. i '¿Ш

1 «Ли» ** т

. ] Ы •

Й7-' I

i. - ; 1

г 43 :

20 /;.

20,1' -14,4 -

Рис.11. Взаимодействие рекамбинантнъа форм CD4-penenmopa с моноклинальными антителами ОКТ4А и Leu3A

А - электрофорез: 1-лизат клеток РОР2136, 2- ^галектозидазо. 3- рекомбинантныи белок из клеток, содержащих плазльнлу рС02245. Б • иммуноблогинг с моноклональными антителами ЬеиЗА (1.2) и СКТ4А 13.41: 1.3-рС04, 2,4- р-галаползшаза. Слева цифрами показана молекулярная масса маркерных белков в кЛ.

кммуноблоптикге (рве. 11), в в непрямой иммуноферментной реакции, слитный с Р-галактозидаэой рекомбинантный СБ4-рецептор, -выделенный из бактериальных клеток, связывается с моноклональаымв антителами 0КТ4А в ЬеиЗА, т.е. по своим иммунологическим свойствам близок к на-тивному белку СБ4. Полученный белок, сорбированный ва колонку, эффективно связывался с рекомбинаитным в ватввяым ер 120 (рис 12) в использовался для аффинной очистки глвкопротеидов ер 120 в ер160 ВИЧ из вирусных лизатов.

Для изучения антивирусной активности полученного рекомбияант-ного белка было необходимо отделить от слитного белка (З-галактозидазу. Известен целый ряд химических веществ, расщепляющих белки в строго определенных аминокислотных последовательностях. Для выбора химических веществ, способных отщепить рекомбинантный СВ4 от Э-галактозида-зы, в при этом ве нарушить его целостность, аминокислотная

Г-"' '• —

1 2 3 4

Рис. 1!. Взаимодействие pCD4 с рекамвинантным и вирусным белкам gp 120 ВИЧ

pCD4 наносили на мембрану и тнбрилизовали с реколлбинантнымдр!20 (11:

лизатом клетокMU, зараженных ВИЧ I. штамм HILV-ШВ ¡2) и лизатом

клеток Ни(78 зараженных ВИЧ I. штамм тот же (3). Фильтры обрабатывали

сывороткой больною, содержащей антитела к др 120 ВИЧ и проявляли

как 9 обычном иммуноблотинге. В качестве контроля использовали pCD4 обработан

ный лизатом клеток MU и сывороткой больного (4}.

последовательность слитного белка была подвергнута компьютерному анализу в пакете компьютерных программ PC/GENE, Был проведен поиск участков специфического расщепления для 18 широко известных в доступ-кыххимических веществ к ферментов. Наиболее приемлииым для поставленных целей реагентом оказался бромциан, который, опцепляя целиком рекомбинантный белок CD4 от (J-галактозидазы, разрезает последнюю на-множество мелких фрагментов, которые затем легко отделяются от основного искомого белка методами колоночной хроматографии. Для получения очищенного рекомбикангного белка CD4, 150 мг слитного белка обрабатывали бромцианом в 70% муравьиной кислоте в течение 26 часов. Получен-нуюсмесь пептидов освобождали от бромциана гель-фильтрацией на сефа-дексе G-10 ("Pharmacia", Швеция), используя в качестве элюента 30%уксусную кислоту. Разделение смеси пептидов проводили гель-фильтрацией на фрактогеле HW50F ("Merck", ФРП- Белок диализовали против ТЕ-буфера (рН 6,5) и исследовали в 12% ПААГ с SDS. Результаты электро-форетического исследования приведены на рис. 13. Пептид, представляющий собой первые два нммуноглобулинподобных домена СБ4-рецептора, имеет наибольшую молекулярную массу (26 кД) и хорошо отделяется от остальных небольшого размера пептидов, представляющих собой участки р-

UJ.1.

43 : '

зо L

iaim ir i г 11 I' :i'i«nlim

12 3 4

Рис.13. Электрофорез рекомБинаитных форм CDi-рецептора

I - pCD4 слитный с Дгалактозклазой; 2 - ДгалактозидОэа: 3 - ^-тлактозклаэа обработанная бромцианол^* 4 - слитный С Дгалаетозндозой pCD4 обработанный бромцианом. Слева цифрами показана молекулярна« масса белко! • кД.

1 2 3 4

галактоз ид азы. Полученный в результате расщепления бромцианом пептид, так же как и слитный белок, в иммуноблотинге и непрямой иммуно-ферментной реакции связывал моноклоналоные антитела к CD4-peneirro-ру - ОКТ4А и ЬеиЗА, т.е. сохранял свойства слитного белка.

2.4. Изучение влияния растворимого рекомбинантного CD4-peaerrropa на репролукцию ВИЧ

В настоящее время оценку противовирусного действия препаратов, обладающих потенциальной анти-ВИЧ активностью проводят на культурах зараженных ВИЧ клеток несколькими методами: подавление вирусинду-цкроваиного образования синцитий, изучение уровня выживаемости зараженных ВИЧ клеток, измерение уровня активности обратной транскркпта-зы (Ш*)ВИЧ в культуральиой жидкости и определение уровня синтеза вирусного белка р24. Для изучения антивирусного действия полученного нами препарата растворимого рекомбинантного СБ4-рецептора (pCD4), мы использовали все вышеперечисленные методы. В качестве положительного контроля был использован применяемый при лечении ВИЧ-инфекции и хорошо изученный препарат - АЗТ (Sigma, США), в качестве отрицательного контроля - 0-галактозядаза E.coli, выделенная из штамма экспрессирую-щего вектор pEXl, обработанная и очищенная теми же методами, что и ре-комбинангный исследуемый СВ4-рецептор (pCD4).

Ингкбирование вирусиндуцированного образования синцитий проводили на клетках МТ4 или Н9. Инфицированные ВИЧ клетки выдерживали с различными концентрациями полученного pCD4-рецептора в течении 3 часов. Обработанные таким образом инфицированные клетки разводили свежей культурой клеток (концентрация 500000 кл./мл) в соотношении 1:3 -1:6 и оставляли на ночь при 37°С. На следующий день смесь клеток отмывали и помещали в свежую кулыуральную среду, и на третий день определяли количество синцитий на 100 живых клеток. На рис. 14,а представлены данные, полученные при изучении подавления pCD4 индуцированного ВИЧ синцитиеобразования. Показано, что даже в концентрации 1 мкг/мл pCD4 практически полностью подавляет вирусиццуцированное образование синцитий.

После обработки рСБ4 инфицированных ВИЧ клеток МТ4, изменяется также и число выживших при инфекции ВИЧ клеток, определяемое методом подсчета живых и мертвых клеток с использованием витального красителя трпланового синего. Добавление рС1>4 в концентрациях от 1 до 10 мгаУмл резко повышает число выживших клеток в культурах инфицированных ВИЧ1 лимфоцитов (рис. 14,6).

и »

Рис.14. Изучение антивирусной активности рекамбинантных форм СП4-рецептора

А - влитие рСО-4 на сннаитнальный эффект, инлуиированный ВИЧ. 1-опыг, 2-контроль. По оси ординат - количество синцигиев на 100 живых клеток: по оси абсцисс - доза рС04 в мкг/мл. Б - трафик выживаемости клеток МТ4. зараженных ВИЧ I. 1-контроль. 2.3-рССМ лозы 1 и 10 мкг/мл. соответственно. По оси ординат - число выживших клеток а %: по оси абсцисс - врели после добавлении рСС4 а дни. В - уровень синтеза обратной транскриптазы ВИЧ. I-контроль. 2-рС04 (10 мкг/мл). По оси ординат - активность Ю ВИЧ я кульгуральной среле (&1д орт!мл): по оси абсцисс - дни. а которые проводили измерения. Г - влияние рСЫ на уровень синтеза р24 антигена ВИЧ. По оси ординат - концентрация р24 а кульгуральной среле в пкг/мл: по оси абсцисс - концентрация рС04 в мкг/мл.

Одним из показателей ВИЧ-ингибирующего действия препаратов является

также уменьшение уровня синтеза антигена р24 и активности ИТ ВИЧ. В

ваших экспериментах уровень синтеза р24 антигена определяли с использованием тест-системы фирмы "Dupont" (США) на б-й день после внесения препарата рС04 по рекомендациям фирмы изготовителя. Результаты представлены ва рис.14,г. Как видно из графика, добавление рекомбинантного белка в концентрации 1 мят/ил в 400 раз снижает уровень р24 антигена, а при концентрации pCD4 б мкхУмл р24 антиген практически не определяется. Аналогичные результаты были получены в при исследовании активности ВТ ВИЧ. pCD4, добавленный в концентрации 1 мкг/мл снижает уровень обратной тр&нскриптазы более чем на 60% (данные не показаны), а концентрация pCD4 от 5 до 10 мкг/мл полностью подавляет продукцию этого фермента (рве. 14, в).

Таким образом, можно говорить о том, что полученный нами реком-бииавтный белок, состоящий вз первых двух иммуноглобулинподобных доменов СШ-рецептора, выделенный из клеток E.coli, ингибирует репродукцию ВИЧ-1 в культуре человеческих Т-лимфоцитов в оказывает выраженное противовирусное действие в системе in vitro.

2.5 Получение коньюгата рС04 с ингибитором ВИЧ - L-лизин-а-оксидазой

В предварительных экспериментах вамв было показано, что L-ли-зин-а-оксидаза • фермент, выделенный из гриба Trichoderma harzianum Rifai, в концентрации 1мкг/мл резко ингибирует репродукцию вируса в культуре клеток МТ4 (патент РФ Ns 482338/13/040363). Нами так же было показано, что этот, белок в более низких концентрациях ингибирует репродукцию других вирусов н бактерий (международный патент PTC/RU94/00012), т.е. является неспецифаческим ингибитором вирусной инфекции. Поэтому, для того, чтобы направленно включать этот препарат в клетки, зараженные ВИЧ, и, соответственно, уменьшить дозу препарата, нами была предпринята попытка получить коньюгат этого белка с растворимой формой CD4-penenropa. Известно, что L-лизин-а-оксидаза, состоящая из двух субъединиц по 52кД, так же как и СВ4-рецептор, содержит в своем аминокислотном составе цистеияы и, поэтому, существует возможность связать оба белка дисульфидными мостиками. Для этого pCD4 был

обработав SMFT (К-еукдшпшилял-оксикарбонил-а-метилтолуолом). Для этого, к 1мл pCD4 (концентрация 1мг/мл) добавляли 30 мкл SMPT, охлаждали во льду, и наносили на колонку с Sephadex G-25 ("Pharmacia", Швеция), уравновешенную фосфатным буфером с 0,003М EDTA, рН 7,6. Белковую фракцию собирали, концентрировали при помощи концентратора "Centriprep-10" ("Amicon", США) (конечная концентрация белка 0,6 кг/мл) и помещали в лед. К 2 мл очищенной L-лизин-а-оксидазы (концентрация 0,5 мг/мл) добавляли 10 мкл DTT (7,7 мг/мл) в инкубировали 1 час при комнатной температуре в темноте. Смесь охлаждали, обрабатывали в концентрировали так же, как и pCD4 (конечная концентрация белка 0,2 мг/мл). Обработанные таким образом белки смешивали в соотношении 2:3 и оставляли на 48 часов при комнатной температуре. Полученный хонъюгат наносили на колонку Blue-Sepharose CL-4B (Tharmacia", Швеция),уравновешенную фосфатным буфером. При промывке колонки тем же буфером, с нее элюировались остатки не связавшегося pCD4 (26 кД) и некоторое количество свободной лизиноксидазы (52 кД) (рис.15). Остальные белки элюиро-вали с колонки 0,5М NaCl в фосфатном буфере. Элюат концентрировали, как описано выше,, и наносили на колонку с Sephacryl S-200 ("Pharmacia", Швеция). Элюцию проводили 0,15М NaCl. В результате получали два

Рис.15. Электрофоретический анализ кокыогата СВ4~лизиноксидаза

I-маркеры мол. масс: 2-рСО*; З-лизимоксидоэа: 4-конъюгат С04-лнзиноксилаза: слева показаны молекулярные массы маркерных белкоа • гиладальтонах.

белковых пика. Первый содержал конъюгат рСВ4 с Ь-лизин-а-оксид азой (75 кД), а второй - не связавшуюся с рСБ4 лизиноксидазу (рис.15). Полученный конъюгат был сконцентрирован (1мг/мл) и простерилизован фильтрацией через фильтр 0,22р..

2.6. Изучение антивирусных свойств коньюгата рС04-лизиноксидаза

Мы изучили способность полученного коньюгата рС04-лизиноксида-за ингибировать вирусиндуцированное образование синцитий и влиять на выживаемость клеток МТ4, зараженных ВИЧ. В качестве контроля были использованы препараты рСБ4 и лизиноксидазы. Предварительно мы показали, что полученный конъюгат, так же как рСТ)4 и лизиноксидаза не обладает токсичностью для клеток МТ4 даже в концентрациях 100-200 мкг/мл. В работе использовали концентрации препаратов от 0,01 до 1,0 мкг/мл. Результаты экспериментов суммированы в табл. 1 и 2.

лизиноксидаза рСБ4 конъюгат

А Б А Б А В

Клетки, не 95 95 94 95 92 95

МрАЖбЕВЫв

ВИЧ

Клетка, зара- 30 32 30 35 34 32

женные ВИЧ

Дозы препаратов в мкг/мл

0,01 35 35 30 30 70 74

0,05 40 42 38 40 74 79

0,1 60 73 60 76* 87 94

0,5 75 00 к-* 68 83 87 93

1,0 75 88 92 94 92 95

Тайл.1. Изучение антивирусного действия рСВ4 и его коньюгата с лизиноксидазой.

Показано число выживших клеток в процентах А - внесение исследуемых препаратов после 24 часов инкубации с ВИЧ В - внесение препарата перед инкубацией с ВИЧ

исследуемые концентрации в imУмл

Препарат 0,01 0,05 0,10 0.5 1,0

лизпносидаза 5 40 56 78 95

pCD4 10 40 50 80 95

конъюгат 75 95 100 100 100

Табл.2. Процент подавления синтицийюбразоеания pCD4 и кокыогатам рСБ4'Л\13инокС11даза

Как видно из таблиц, полученный конъюгат уже в дозах 0,01 мкг/мл подавляет вирусиндуцированное образование синцитий и резко повышает выживаемость зараженных вирусом клеток МТ4, т.е. действует значительно эффективнее каждого из двух его составляющих. В настоящее время очень трудно говорить о перспективах использования такого препарата в клинике, однако показана принципиальная возможность получения и использования таких белковых конъюгатов для подавления ВИЧ-инфекции.

3. Получение и характеристика рекомбинантных рецепторотоксинов на основе CD4-peuemopa и токсинов бактериальной природы

Ранее было показано, что белки, состоящие из рекомбинантного CD4-рецептора и А-субъединицы токсина Pseudomonas, в системе in vitro ннги-бируют репликацию ВИЧ, специфически связываясь с клетками зараженными ВИЧ и экспрессирующими на своей поверхности гликопротеин gpl20 ВИЧ (Berger Е. et al., 1989). Поэтому, перед тем как конструировать плаз-миды, экспрессирующие рекомбинантные рецепторотоксины на основе дифтерийного токсина и CD4, мы вначале попытались воспроизвести эти результаты для того, чтобы убедиться в принципиальной возможности такого подхода.

3.1. Получение и характеристика рецепторотоксинов на основе экзотоксина Pseudomonas

Последовательность, кодирующую II а Ш функциональный домен экзотоксина Pseudomonas (250-613 а.к.), отвечающих за транслокацию через мембрану и токсическое действие токсина, клонировали яз плазмцды

pLA7, содержащей полную последовательность гена токсина. Участки гена СС4-рецешора клонировали из плазмиды pCDZ245. Поскольку, первые два иммуноглобулинпсщобных домена С04-рецептора, ответственные за связывание с ВИЧ, находятся на N-конце молекулы CD4, а II и Ш домены экзотоксина на С-конце молекулы, мы конструировали химерные плазмиды таким образом, чтобы клонированные участки CD4 располагались на 5'-концевом участке ДНК Были сконструированы две плазмиды, экспресси-рующие рекомбинантные редепторотоксины под контролем Lac-промотора. Плазмида pLCDPA5 синтезировала рекомбинантный белок, состоящий из первых 178 аминокислот CD4-pesenropa и 250-613 аминокислот токсина Pseudomonas и плазмида pCDPA5, которая дополнительно синтезировала лидерный пептид С04-редептора (рис.16). Как показали дальнейшие исследования, оба рекомбинактных белка взаимодействовали с монокло-нальными антителами ЬеиЗА. В обоих случаях рекомбинантные белки выделялись из бактериальных клеток и не проникали в периплазму.

CD4

pLCDPAö

ТЕЗ—

Рис.16. Структура тйиамидpLCDPAS и pCDPAS

Показаны участки узнавания рестриктазами. Условные обозначение: CD4 - фрагмент гена С04-реиептора: ETA - фрегмент гена токсина Pseudomonas: S - участок гена CD4-peuemopa колирующий лилерный пептил: Р - промотор: Атр - ген устойчивости к ампициллину.

3.2. Изучение антивирусных свойств рецепторотоксинов на основе экзотоксина Pseudomonas

Для предварительного изучения антивирусного действия полученных рекомбинантных белков, лизаты клеток Е.соН, экспрессирующих соот-

ветствующий белок, добавляли в различных разведениях к клеткам Hut78, инфицированным ВИЧ1 или ВИЧ2. Клетки предварительно разводили средой RPMI-1640 без аминокислот Phe, Val и Пе. Недостающие аминокислоты, меченные по изотопу углерода "С, добавляли после 8 часового инкубирования и через 4 часа определяли процент включения метки. Наиболее эффективно полученные рецепторотоксины убивали клетки, инфицированные ВИЧ2 (штамм LAVII, Родезия) (рис.17 А,В). Лизат клеток, экспрес-сирующих рекомбкнантный токсин Pseudomonas (плазмнда pLA7), не действовал на ВИЧ-инфицированные клетки (рис.17,С). Таким образом, можно говорить о том, что рекомбинантный рецепторотоксин, состоящий из N-концевого фрагмента С04-рецептора и токсина Pseudomonas, лишенного узнающего рецептор домена, обладает противовирусным действием в системе in vitro.

Рис. 17. Изучение антивирусного действия рекомбинантного рецепторотоксина на основе токсина Pseudomonas

По оси абсцисс - Ig разведение клеточных лмзатов. по оси ординат % включения метки в клетки, зараженные вирусом. Л- лизат клеток содержащих плазмиДу pCDPA J; 8 • лизат клеток содержащих плазмиду pLCDPAS; С - лизат клеток, содержащих гслазллидур£А7.С-клетки. зараженные ВИЧ: F - клетки, не зараженные ВИЧ.

3.3. Получение рекомбинантных рецепторотоксинов но основе дифтерийного токсина

Дифтерийный токсин (ДТ, 435 аминокислотных остатков, мол. м. 58342 дальтон) принадлежит к группе токсинов, способных инактивиро-

вать белоксинтезирухшщй аппарат эукариотической клетки. В молекуле ДТ можно выделить три функциональных домена. Центральная область полипептидной цепи ДТ участвует в процессе транслокации каталитического домена токсина из эндоцитозной везикулы в цитоплазму эукариотнческой клетки. Каталитической активностью обладает К-концевая часть молекулы • А-фрагмент, а за взаимодействие с клеточными рецепторами отвечают аминокислотные остатки, локализующиеся на С-концевом участке молекулы.

Рис.18. Конструирование плазмид содержащих фрагмент гена СИ4

Обведены колирующие последовательности и регуляторные элементы: Р1ас и кэсГ промотор и 1ас!а кодирующая последовательность: сс!4. сс!4' и ссИ" последовательности кодирующие целый белок С04. 152 Ы-концевых аминокислот С04 и область от 10-152 аминокислоты, соответственно. 5-последовательность кодирующая сигнальный пептид С04: ф 10-510 и Тф - фрагменты бактериофага 77. содержащие промотор, участок инициации трансляции и терминатор транскрипции, соответственно.

3.2.1. Конструирование ллазмнл, экспрессируюших фрагменты человеческого С04-рецептора

Как известно, за связывание с й>120 ВИЧ отвечают первые 113 аминокислот от N. конца молекулы (ЛЭ4. Поэтому, мы субклонировали ВарШ-ЕсПЗбП фрагмент (530 нуклеотидов) из п да амиды рКЭ12 в вектор рЧС19 (рис.18). Полученная плазмида рЬС02 кодировала химерный белок, состоящий из лидерного пептида, 152 Я-концевых аминокислот СБ4 и Ьас2а. Так как сигнальный пептид СВ4 был не нужен, фрагмент плазмида рЬСБ2, кодирующий с 10-ой по 152 аминокислоту был амплифицирован ПЦР и клонирован в риС19 (рЬСБТацб) (рис.18). Анализ

} :ахЛ { ^ слл- | т»

1 ?ГГАВС05

Рис. 13. Конструирование плазмид, кодирующих гибридные токсины с ВТ фрагментом на N-конце молекулы

;охА. )ох8' и 1ох&"- последовательности кодирующие фрагмент А и фрагмент В без 47 или 51 аминокислот от С-кониа ¿Т. соответственно. Остальные символы те же. что и на рис. 13.

нуклеотидной последовательности полученной плазмиды показал, что она кодирует искомые 142 аминокислоты СБ4-рецептора в нужной ориентации. Для трансляции необходимого участка СВ4 BgШ-EcoШ фрагмент плазмиды pCDTaq6 был клонирован в плазмиду рТ219й, а фрагмент В^Ш-

ВатН! был субклонирован в плазмиду рЕТЗЬ. Новые полученные плазми-

ды былн названы рТЙСБб и рТгСЮЗ, соответственно, и использовались в дальнейших экспериментах (рис. 18)

3.2.2. Конструирование рекомбинантных рецепторотоксинов

СБ4-ДТ конструкция подразумевает, что (Л)4-фрагмент рекомбинан-тного белка может быть как на N.. так и на С-концевом участке белковой молекулы. Поскольку и участок СБ4, ответственный за связывание с 0р12О, и энзиматический домен ДТ находятся на Ы-концах соответствующих белков, было неясно, какая из ориентаций будет наиболее удачной для экспрессии рекомбинаягного белка.

Рис. 20. Конструирование плазмид, кодирующих гибридные белки с фрагментам С04 на ЛГ-хонце молекулы

рИ-бомиисм правый промотор бактериофага ; саТ-ген хАорамфениколааетиАтрансферазы; остальные символы как но рис.18 и 19.

Мы сконструировали оба типа гибридных генов:

а) плазмиду pTZABCD17 (рис.19), кодирующую гибридный белок с молекулярной массой 82 ifla, в котором фрагмент ДТ находится на N-конце, а фрагмент CD4-peneirropa на С-конце молекулы.

б) плазмиду pTZCDAB7 (рис.20), кодирующую гибридный полипептид, в котором фрагмент ДТ находится на С-конце.

Однако, в последнем случае мы не могли обнаружить гибридный белок в лизатах клеток E.coli TGI и BL21, несущих мутацию в Ion гене.

Мы так же попытались увеличить экспрессию гибридных белков заменой регуляторных элементов lacZ' на регуляторные элементы бактериофага Т7. В результате, были получены плазмяды pETABCD5 и pETCDAB5 (рис.19, 20).

Рис. 21. Конструирование плазмид.кодирующих гибридные белки с иммуноглобулинсвязывающим участком белка А З.аигеиз

¡рА'-фрагмент белка А: остальные символы как на рис.18.19.20.

. 3.2.3. Стабильность рекомбинантных реиепторотоксинов

На рве. 22 в 23 представлены данные, показывающие, что штамм Е.соЦ, содержащий плазмиду рЕТАВСБб, зкспрессируег рекомбинантный белок с массой 79 кД, который связывается как с антителами к ДТ, так и с антителами к СБ4-редептору. Клетки, содержащие плазмиду рЕТС0АВ5, экспрессировали только фрагмент гибридного белка, взаимодействующий только с антителами х ДТ, что предполагает низкуюстабильность этого белка. Сравнение стабильности гибридных белков, кодируемых плазмида-ми рТгАВСШ7, рЕТАВСБб, рЕТ2СБАВ7 и рЕТСБАВб, позволяет нам предположить, что расположение участка СС4-рецептора на М-молекулы ведет в резкому снижению стабильности белка. Если структура, узнаваемая эндогенными протеазами, находится внутри С04, то все химерные белки, содержащие СЮ4 на №конце молекулы, должны быть нестабильными в клетках Е.соН. Если такая структура находится в участке ДТ, то гибрид СВ4 с каким либо другим белком, в том асе положении, должен быть более стабильным, чем кодируемый плазмидами рТ2СБАВ7

и рЕТСЮАВб. Для того, чтобы изучить обе эти возможности мы сконструировали плазмиду рЕТЭАШ, которая кодирует иммуноглобулинсвязываю-щий участок белка А стафилококка, и плазмиду рЕТСББАиб, которая ко-

I I I « I I т

Рис. 22. Экспрессия гибридных генов « клетках Е.соН

(иммуноблотинг с лошадиной сывороткой к ДТ)

1-полноразмерный дифтерийный токсин А и В его фрагменты:

2-Е.соИТС11рПт1:3-ТСЦрШ]91:*-Тв1 ¡рТглйС0171: 5- ГО 11РПСОАВ71:6-ва 11р£ТАВС051; 7-02\[р&СОАЁ5].

дирует слитный белок, состоящий из CD4 и того же участка белка А (рис. 21). Мы показали, что клетки, содержащие плазмиду pETCDSAU6, не накапливают полноразмерный гибридный белок, в то время, как клетки, содержащие плазмиду pETSAU3, продуцируют полноразмерный белок, связывающийся с антителами (рис. 23). Эти данные позволяют нам предположить, что участок CD4, использованный в работе, содержит последовательность или структуру, которая узнается протеолитической системой E.coli.

Интересно, что использованный нами фрагмент гена CD4-рецептора содержит на С-конце аминокислотную последовательность RSPRG. Эта последовательность очень похожа на последовательность RQPRG в экзотоксине А, которая узнается и протеолитически расщепляется внутри эукарио-тнческих клеток (Ogata et al., 1992). В нативном CD4-pe4enrope так же, как в экзотоксине А, область, находящаяся выше этой последовательности, вовлечена в петлю, соединенную дисульфидным мостиком. Фрагмент CD4, использованный в настоящей работе, не содержал С-концевой участок этой

•' а

<1)41171 1 I ] < I I I (

□

в Г ( I 4 3 t 1

I 2 3 * S • Г »

™ « "4J - i

!Г

Рис. 23. Экспрессия гибридных генов в клетках E.coli BL21

Электрофорез в 0.1%SDS-12% ПААГ (AJ.

Иммуноблотинг с кроличьими антителами к овальбумину (В), кроличьими антителалли к CD4 (С), лошадиными антителами к дифгерийному токсину (DJ. I-рЕТЗЬ. 2- рЕТС03, 3- PETCDAB5.

4- pETASCDS. 5- pETSAU3. &■ pETCDSAUi. 7- маркеры молекулярных масс; 3- дифтерийный токсин (AT}.

петли. Возможно, что отсутствие этого участка дестабилизирует петлю, и делает ее более доступной для протеолитического расщепления.

3.2.4. Антивирусная активность рекомбинантных рецепторотоксинов-на основе ДГ и СО-реиептора

Рецепторотхжсин; в котором фрагмент СБ4-редептора находился на Ы-конце молекулы, так же как и очищенный дифтерийный токсин, практически не действовал на инфицированные ВИЧ1 и ВИЧ2 клетки МТ4 и Ни178, что коррелирует с результатами иммуноблотинга. Антивирусную активность рекомбинанпюго рецепторотоксина (ДТ-СБ4), кодируемого плазмидой рЕТАВСББ, изучали следующим образом. По 2 мл клеток МТ4 (0,3*10® клеток/мл), зараженных и не зараженных ВИЧ1, разделяли на две равные части. Одну часть инкубировали в течении 4 дней с различными концентрациями рекомбинантного рецепторотоксина, другую, с тем же количеством очищенного лвзата клеток Е.соН,

Рис. 24. Противовирусные свойства рекомбинантных рецепторотоксинов на основ« Сй4-рецептора иДТ

почищенный ДГ;6-аюог клеток ГО I (рСАВ^.ч-ГО! ¡рПСОА&Ц Г-ГО1 [рТ2АВС017]. 1-неинфицироаанные клетки НШ& 2-клетки ММ инфицированные НПУ№ 3-клетки Ни178 инфицированные'

(!ос1еёа. По оси ординат - % включения метки а инфицированные клетки; по оси абсцисс - десятичный логарифм разведения лизатоа клеток экспрессирующих или не экспрессирующих рекомбинонтные реиепторотоксмны.

содержащих векторную плазмиду и не экспрессирующих ДТ-СБ4 (контроль). После этого, определяли процент выживших, по сравнению с контролем, клеток. Результаты экспериментов представлены на рис.24. Как видно из рисунка, рекомбинантный ДТ-СБ4 уже в концентаций 0,1мюУмл практически полностью блокирует репродукцию зараженных ВИЧ1 клеток МТ4 и не оказывает никакого влияния на жизнеспособность клеток МТ4, не зараженных вирусом. Аналогичные результаты были получены и в клетках Hut78, зараженных ВИЧ2. Кроме того, мы установили, что предварительная обработка рекомбинангного ДТ-С04 моноклональ-ными антителами Leu3A и поликлональными сыворотками к CD4-рецептору полностью снимает его токсическое действие на клетки МТ4, зараженные ВИЧ1. Таким образом, можно говорить о том, что полученные нами рекомбинантные рецепторотоксины избирательно и эффективно убивают клетки, зараженные ВИЧ. В настоящее время трудно говорить о каких либо перспективах использования полученных препаратов в клинике, однако полученные рекомбинантные белки уже сейчас можно было бы использовать для изучения механизмов проникновения различных белковых молекул в инфицированные ВИЧ клетки для создания новых антивирусных средств и выбора стратегии лечения ВИЧ-инфекции.

4. Получение мутантных форм CD4-peuerrropa

Известно, что специфичность узнавания антигена иммуноглобулинами, главным образом, определяется структурой регионов, определяющих комплементарносгь внутри вариабельных участков легких цепей Ig: так называемые CDR1, CDB2, и CDR3. Эти участки, в совокупности, и образуют поверхность, комплементарную таковой у антигена. Такие участки имеются и в структуре первого Ig-подобного домена молекулы CD4-penenropa, причем сайт взаимодействия с gpl20 ВИЧ находится в CDR2-области рядом с белковой последовательностью RADS, почти гомологичной, а по вторичной структуре идентичной, участку адгезии - EGDS. Вторичная структура этого участка в (Л}4-рецепторе мыши (который, как известно не взаимодействует с gpl20 ВИЧ) сильно изменена заменой аланина на фенила-ланин. Поскольку, в литературе имеются данные, что этот участок CD4-

рецептора может участвовать во взаимодействии с gpl20 ВИЧ, мы для проверки этого предположения получили несколько мутантных форм гена CDi-рецептора, в которых, в одном случае, последовательность RADS была заменена на канонический участок адгезии (RGBS), а в другом • на последовательность мышиного аналога CD4 (RFDS). Для этого, ВвиВП-фрагмент гена CD4-penenropa, длиной 624 пары оснований, кодирующий первые два Ig-подобных домена, клонировали в векторную ДНК RF фага М13тр9 по S mal-сайту. Для создания каждой из мутаций, одноцепочечную матричную ДНК (ss M13CD4) отжигали с 21-членными олигонуклеотидами, содержащими единичную (CI) или двойную (С2) мутации в участке последовательности, соответствующей RADS-области первого Ig-подобного домена С04-рецептора:

ДНКcd4-peuenropo 5'...ст tga gtc agc gcg atc... олиго Np (cl) ga act cag tgg cgc tag taa g 5"

олиго Np (C2) ga act cag ttt cgc tag TAA g 5 •

Нуклеотидная последовательность полученных мутантных форм гена CD4-рецептора была определена методом Максама-Гилберта. Мутантные копии гена были клонированы в векторы экспрессии и было показано, что клетки синтезируют белки с ожидаемой молекулярной массой, взаимодействующие с моноклональными антителами Leu3A. Полученные рекомбинантные мутантные белки могут использоваться в экспериментах по изучению меха- ■ низмов взаимодействия ВИЧ с чувствительными клетками.

ВЫВОДЫ

1. Клонирована хромосомная копия гена CD4-рецептора Т-лимфоцитов человека. Уточнена локализация этого гена на 12-й хромосоме в районе 12р12-12р11.

2. Впервые определена нуклеотидная последовательность б'-концевого участка гена CD4-рецептора, включающая промогорную область, три первых экзона и интрона гена.

3. Показано, что последовательность, кодирующая первый иммуноглобу-линлодобный домен С04-рецептора, прерывается протяженным интроном, что является исключением для белков этого типа.

4. Описаны регуляторные элементы промотор ной области гена CD4-рецептора и локализован участок ETS, предположительно участвующий в тканеспецифической экспрессии этого гена.

5. Описан новый LTE HERV-K элемента, интегрированный в первый инт-рон гена С1)4-рецептора и локализованы его участки, способные участвовать в регуляции транскрипции.

6. Впервые показано, что Alu-повторы ДНК могут включаться в LTR человеческих эндогенных ретровирусов.

7. В первом и третьем интроне гена CD4-рецептора описано 14 Alu-повторяющихся элементов ДНК. Показано, что некоторые Alu-повторы содержат гипотетические открытые рамки считывания и участки альтернативного сплайсинга для белков с высокой степенью гомологии с белками DAF, С0М5 и BCGF.

S4 '

8. Предложена новая модель вторичной структуры ДНК Alu-повторяющихся элементов, общая для всех их классов и теоретически способная взаимодействовать с нуклеосомами.

9. Клонирована кДНК (Л)4-рецептора и получены рекомбинантные растворимые формы этого белка, обладающие выраженным противовирусным действием в системе in vitro.

10. Получены рекомбинантные рецепторотоксаны на основе СБ4-рецептора и экзотоксина Pseudomonas, специфически блокирующие размножение вируса в ВИЧ-зараженных клетках.

11. Сконструированы плазмиды, экспрессирующие рекомбинантные рецеп-торотоксины на основе CD4-peixeirropa и дифтерийного токсина. Показано, что стабильность таких рекомбянантных белков в бактериальных клетках зависит от взаимной локализации в рекомбинантной молекуле CD4 и дифтерийного токсина. Показано, что сконструированные рекомбинантные рецепторсггоксины специфически блокируют репродукцию ВИЧ в зараженных ВИЧ клетках.

12. Получены коныогаты рекомбинантного СБ4-рецептора с неспецифическим ингибитором ВИЧ-инфекции, L-лизиноксидазой, и показано, что такие кокьюгаты в несколько десятков раз увеличивают ВИЧ-ингибирующее действие препарата.

13. Синтезированы мутантные формы гена CD4-peqenropa и получены рекомбинантные белки, несущие мутации в участке связывания с gpl20 ВИЧ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Зайцев И. 3., Зверев В. В.. Алексеев С. 6„ Суханова А А, Карасева £ а, Амиантова И. И.. Ирич В. Ю. Гибридизация нуклеиновых кислот.// Заявка на изобретение N»41 i3512/28-13/175997. Авторское свидетельство Na 1412307 от 22.03.1988г.

2. Zverev v.. Malushova Sidorov A., Zdanovsky A.. BUnov V_ Korneeva M., Pugach A., YonkovsJcy N.. Andjapahdie O. Inhibition of the Wectivity of HIV by different recombinant forms of CD4.//Abstracts of the Sixth international conference on AIDS. San Francisco. USA. 1990 (20-24 June) .V.I. Th.A.252. P.181.

3. Timoteev I. V., Peiminova N. G.. BUnov V. Usova £. V„ VasHenko N. V.. Kushch A.A.. Tugizov Sh.M.. Zverev V.V. Experimental confirmation of molecular mimicry of human immunodeficiency virus proteins // The First АН-Union Conference "Human Genome". Pereslavl-Zalessky. October, 8-12.1990. P. 184.

4. Зверев а В.. Шахов A. H.. Недоспасов С. А., Пугач А. В., Сидоров A. a, Малюшово a a. Анджапаридзе О. Г. Клонирование и экспрессия а клетках.Е.соВ фрагментов гена С04-рецептора Т-лимфоцитов человека //Мол.генетика. микробиология и вирусология, -1991. N 1.С. 14-18.

5. Zverev V., Molushovo V_ Sidorov A., Zdanovsky A., BUnov V., Pugach A., Yankovsky N.. Anjaparidze O. Inhbition of HIV infecfivity by different recombinant forms of CD4. // Int. Conference on medical biotechnology, immunization and AIDS. Leningrad. Russia. 12-18 June. 1991. P.21.

6. Zverev v.. Malushova V.. Sidorov A.. Zdanovsky A., Bfinov V.. Pugach A.. Yankovsky N.. Anjaparidze O. Inhbition of the infecfivity of HIV1 and HIV2 by different recombinant forms of CD4.// Int. Conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS. Novosibirsk:. Russia. 1-5 July. 1991. P.6.

7. Гольцов а А.. Яковлев А. Г., Сазонов А. Э.. Полетаева H. H.. Карасева Е. а. Суханова Л. А. Зверев а а Рекомбинантная плазмидная ДНК р6Е2. кодирующая синтез гибридного белка ВИЧ2. //Заявка на изобретение Ns 4892433. Авторское свидетельство Ne 1792101 от 10.06.9lr.

8. Vmofeev L V.. Perrrinovo N. G.. Kazankov N. G„ BUnov V. M.. Zverev V. V. The study of the possible use of recombinant CD4 protein as a potential vaccine preparation against HIV.// The International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS. Leningrad. June. 12-18.1991. P. 22.

9. Pugach A.. Shuchmina N.. Zverev v., Andjaparidzo O. Monoclonal antibodies to products of ENV, GAG and NEF genes of HIVland HIV2V/ Vlll International Conference on AIDS. Amsterdam. The Netherlands. 19-24 July. 1992. V.3. PuA 4134. P33.

10. Zverev V.. Sidorov A., Zdanovsky A.. Malushova V.V.. Zdanovska M„ Shukhmina N.. Andjaparidze O.. Pille £. Melnikova N. Inhibition of the infecfivity of HIV by different forms of CD4-diphteria recombinant immunotoxines. // Vlll International Conference on AIDS. Amsterdam. The Netherlands. 19-24 July. 1992. V.3. PuA 6204. P.45.

11. Зверев a E Перспективу использования рекомбинантных форм CD4-рецептора е качестве лекарственных препаратов против ВИЧ-инфекции.// Итоги науки и техники. Иммунология. Москва, 1992г. т.29. С. 104-114.

12. Шумай Е. П.. Воробьев С At. Макарова Н. £„ Тупаов Ш. М.. Зверев В. а. Куш А. А. Иммуноферментное выявление антигена ВИЧ1 с помощью моноклональ-ных антител к белку р24. // Вопросы вирусологии. 1992. N5-6. С.229-232.

13. Гольцов а А.. Зайцев И. 3.. Анджапаридзе О. Г., Суханова Л. А. Полетаева Н. Н„ Зверев В. а, Носково О. В., Звонарев А. Ю- Карасева £ а. Сазонов К Э- Ало-торцево Г- И., Амиантова И. И. Набор для определения антител к вирусу иллмуно-дефицита человека первого и второго типов. // Заявка на патент РФ N» 5025679/13 1000756) От 05.01.92. Решение о выдаче от 06.07.92r.

14. Зайцев И. 3- Звонарев А Ю„ Суханова Л А. Сазонов А Э.. Карасева Е. а, Алаторцева Г. И.. Амиантова И. И„ Зверев В. а. Гольцов а А. Анджапаридзе О. Г-Полетаева Н. Н.. Блинов В. М.. Титаев А а Полипептид Е117. предназначенный для определения антител к ВИЧ1, фрагмент ДНК НЕ117. рекомбинантная плазмидная ДНК рНЕ117, штамм-продуцент. // Заявка на патент РФ № 5029952/13/010055/ от 28.02.92. Решение о выдаче от 14.09.92г.

15. Зайцев И. 3., Суханова Л. Л_ Сазонов А. Э.. Карасева £ В., Алогорцево Г. И.. Гольцов Е К. Анлжапарилзе О. Г„ Гринев Л Л.. Зверев В. Е. и др. Полипептнд Е204. предназначенный для определения антител к ВИЧ2. фрагмент ДНК HE2Q4. ре-комбинантная плазмидная ДНК рНЕ206. штамм-продуцент. // Заявка на патент РФ Ns 5029951/13/010053/ от28.02.92г. Решение о выдаче от 14.09.92г.

16. Зайцев И. 3~ Суханова Л. Л, Алаторцева Г. И, Гольцов & А.. Алаторцев В. £.. Зверев В. Е. Полетаева Н. Н.. Блинов В.М.. Гринев А. А. Красных В. Н. Полипептид 1106. предназначенный для определения антител к ВИЧ1, фрагмент ДНК HI104. ре-комбинантная плазмидная ДНК рН1104. штамлл-продуцент. // Заявка на патент РФ № 5029949/13 (010054) от 28.02.92r. Решение о выдаче от 14.10.92г.

17. Зайцев И. 3., Суханова А Л., Алаторцева Г. И.. Гольцов Е А.. Гринев А А. Алаторцев & £., Зверев Е Е. Полетаева Н. И.. Блинов Е М.. Носкова О. Е. Лобанова А. Л- Покровский Е Е. Суворова 3. Бураацова Е. Е. Красных Е Н. Полипептид Р102. предназначенный для определения антител к ВИЧ1. фрагмент ДНК НР102. рекомби-мантная плазмидная ДНК рНР102. штамм-продуцент. // Заявка на патент РФ № 5029950/13/010051/ от 28.02.92r. Решение о выдаче от 25.09.92г.

t8.Зайцев И. 3- Звонарев А. Ю„ Суханова А Л, Сазонов А Э.. Карасева Е. Е. Алаторцево Г. И.. Амиантова И. И., Голшов В. А.. Анджапаридзе О. Г.. Алаторцев Е Е.. Зверев Е Е. Полетаева Н.Н., Блинов Е М.. Гигоев А. Е Полипептид G103. предназначенный для определения антител к вирусу иммунодефицита человека первого типа, фрагмент ДНК ЯЭ103. кодирующий полипептид G103. рекомбинантная плазмидная ДНК pHG103. кодирующая полипептид G103. штамм бактерий Е. соВ-продуцент полипептида G103. // Заявка на патент РФ № 5030014/13/009998/ от 28.02.92r. Решение о выдаче от 15.09.92г.

19. Zverev V_ Bffnov V„ Nedospasov S.. Malushova V. Nucleotide sequence and structure of the gene of CD4-receptor. // International conference on AIDS, cancer and human retroviruses. St.-Petersburg. Russia. 18-22 Nov., 1992, P.21.

20. Zaitsev L. Goltsov v_ Zvonarev a, Suchanova L. Zverev v„ Karaseva E-. Pdeiaeva N.. AJalorceva G„ Titaev A EIA on the basis of separate HIV antigens. // International conference on AIDS, cancer and human retroviruses. St.-Petersburg. Russia. 16-22 Nov.. 1992. P. 39.

21. BCnov V„ Denisov 5.. Resenchuk S.. Zverev V.. Karamov E., Ktsselev O. HIV-gpl20 can block CD2-LFA3 mediated adhesion. // International conference on AIDS, cancer and human retroviruses. St.-Petersburg. Russia. 18-22 Nov„ 1992, P. 58.

22. Zverev V.. Blinov v., Nedospasov S.. Malushova V_ Sidorov A.. Andjaparidze O. Nucleotide sequence, structure and expression of the gene of human CD4-receptor. // IX International Conference on AIDS. 4-11 June. 1993. Berlin. V.2. P. 144.

23. Blinov v., Denisov S.. Resenchuk S.. Karamov £.. Zverev V. New Bgand receptor interaction between gpl20 HIV and cellular receptor CD2. // IX International Conference on AIDS. 4-11 June. 1993, Berlin. V.2. P.I37.

24. Usova E„ BCnov V„ Goltsov V. Nosik D-. Shukchmina N.. Zverev V. inhibition of HIV reproduction by membranotropic compounds. // IX International Conference on AIDS. 4-11 June. 1993. Berlin. V.2. P.234.

25. Пугач A. E. Зверев E E. Лилле Э. P.. Шухмина H. P.. Мельникова H. А. Носик Д. H„ Малюшова & Е, Анджапаридзе О. Г. Получение и характеристика монокло-нальных антител к рекомбинантным белкам ВИЧ1 и ВИЧ2 • продуктам генов env и gag. И Вопросы вирусологии. 1993. N4. С.253-256.

24. Zverev v.. Nedospasov S.. Udalovo L Sidorov A. Malushova V.. BBnov V. Nucleotide sequence and structure of the 5'-end part of the gene of CD4-receptar.// 2nd International conference on AIDS, cancer and human retroviruses. St.-Petersburg. Russia, 29 Nov.-ОЗ Dec. 1993. P.12.

27. Pashkova T„ Kevasova E.. Sidorov A. Zverev V„ Karamov E. CD4-receptor as a marker of cell suscebitty to HIV1. // 2-nd International conference on AIDS, cancer and human retroviruses. St.-Petersburg. Russia. 29 Nov.-03Dec.. 1993. P-36.

28. Usova E„ Osetev O.. Bisenicb E„ Nosik D.. Shuchrrina N.. Zverev V., Chupakhin O. Tetrahydrofuroquinoxaine derivatives os Inhibitors of influenza virus type A and HIV1 replication. I 12-nd Intemqtonaf conference on AIDS, cancer and human retroviruses. St.-Petersburg. Russia. 29 Nov.-03 Dec. 1993. РЛ7.

29. Полетаева Н. Я. Гольцов В. А., Суханова А Л. Карасе ва £ а. Алаториева Г. И. Амйантова И. И., Алексеев С. Б.. Сазонов А. Э.. Зайцев И. 3.. Незнанов Н. С. Макарова И. В.. Зверев В.В. Рекомбинантная плазллидная ДНК p8PN, кодирующем синтез гибридного белка Nef ВИЧ1. // Заявка на изобретение N« 4848394/13(074379). А«-торское свидетельство Ns 1838442 от 30.12.93r.

30. Сидоров А В.. Зверев В. В.. Здановский А. Г.. Пугач А В.. Малюшова 8. В.. Анджапарилжзе О.Г. Противовирусное действие рекомбинантных реиепторотокси-нов на основе дифтерийного токсина и С04-рецептора Т-лимфоикгов человека. II Вопросы вирусологии. 1994. Nsl. С.6-10.

31. Зверев В. В.. Малюшова В. В.. Сидоров А. В.. Пугач а В.. Шухмина Н. Р.. Пил-ле Э. Р-. Мельникова Н. А. Анлжапарилзе О.Г. Противовирусное действие рекомбинантных форм CD4-peuerrropa Т-лимфоиитов человека. // Вопросы вирусологии. 1994. №2. С.54-59.

32. Березин А. А.. Алексеев С. Б.. Зверев В. В.. Степанова А Г.. Анлжапарилзе О. Г. Ингибитор вируса иммунодефицита человека. // Заявка на патент РФ Nt 482338/13(040343). Решение о выдаче от 25.01.94г.

33. Zdanovsky A. G.. 2danovskaia М. v.. 3/dorov A. v., Maiushova V. v.. Zverev V. V., Andzhaparidze О. G.. Debabov V. G. Construction and expression in Eeoi of hybrid genes composed of sequences encoding diphtheria toxin and human CD4 receptor. // Gene. 1994. V.I 39. P.77-82.

34. Сидоров А. В.. Здановский А. Г.. Зверев 8. 3., Пугач A. ¡L Малюшова В. 8. Гибридный полипептид S304, фрагмент ДНК NS304, антивирусная активность полипептида. //Заявка на патент РЧ> Ns 94022843/13(021581 J от 14.04.94.

35. Blinov V. М.. Zverev V. V.. Nedospasov S. A. Highly repetitive Alu and HERV-K L7R in human CD4 gene. // International Conference "Molecular Biology at the Border of XXI century. Genome Structure and Functional Analyst. Moscow. Russia. June 17-22. 1994. P. 9.

34. Blinov V.. Resenchuk S.. Chirikova G., Denisov 5., Zverev V. Possible role of UTPase analog л compositional divergency. // X international Conference on AIDS. Yokohama. Japan. 7-12 August 1994. P.l IS.

37. Blinov v.. Resenchuk S.. Chirikova G.. Denisov S.. Zverev V. Molecular mimicry of HIV gpl20 protein to voltage-dependent С a" channel receptor. // X International conference on AIDS. Yokohama. Japan. 7-12 August 1994. P.90.

38. Blinov V., Resenchuk S.. Chirikova G.. Denisov 1. Zverev V. Passible role of pregnancy-specific giicoprotein (PSG) in mother-child HIV infection transfer, // X International Conference on AIDS. Yokohama. Japan. 7-12 August 1994. V. P. 139.

39. Blinov V.. Resenchuk $.. Denisov S.. Chirikova G., Zverev V. Possible role of HiV gpl20 in CD2/LFA-3 activation pathway. // X International Conference on AIDS. Yokohama. Japan. 7-12 August 1994. V. P.100.

40. S/inov V.. Grinev A.. Zverev V. Sjogren's syndrome: HIV !gE-!ke binding proteins cause the autoimmune disease. // X International Conference on AIDS. Yokohama. Japan. 7-12 August 1994. P.93.

41. Blinov V., Zverev V.. Nedospasov S. Retroviral integration into highly repetitive Alu and HERV-K elements in human CD4 gene (13.1 kflobases) locus. // X International Conference on AIDS. Yokohama, Japan. 7-12 August 1994. P.9.

42. Karamov E.. Blinov V., Zverev V., Korn!aeva G.. Turgiev A.. Tatarintsev A. Integrin-medtated HIV-cell Interaction. II X International Conference On AIDS. Yokohama. Japan. 7-12 August 1994, P.99.

43. Глухоаа А А.. Кущ А. А., Мамаева С. E.. Зверев В. В.. Цветкова Г. Г., Ляпунова Н.А. Локализация гена рецептора CD4 в хромосомах клеток клонов моноцито-идной линии U-937. характеризующихся различной чувствительностью к ВИН. // Цитология. 199-4. Т.36. Ns 1. С.71-74.

44. Blinov V.. Zverev V.. Nedospasov S. HERV-K elements and highly repetitive Alu in CD4 gene. // Molecular biology of human genetic disease. 17-20 November 1994. Monte Carlo. Monaco. V.2. SU14.

45. Алексеев С. Б.. Смирнова И. П.. Березов Т. Т.. Веса 8. С., Зверев В. В.. Анджапаридзе О. Г.. Гольцоз 8. А.. Диордица С. В.. Згурский А. А.. Степанова А Г. Штамм Trichaderma horaanum Rifai. способ получения L-лизин-а-оксидазы, применение

1-лизижхчзксид.азы • качестве ингибитора вирусной и бактериальной активности, и/лмуноллодулдтора и стимулятора заживлений поражений кожи. // Заявка на европейский патент РСТ/Ш?4/00012.

Зверев & а. Сидоров А. &. Недоспасоа С. А.. Маиошова а В.. Удалова И. А.. Анджапаридзе О. Г.. Блинов В. М. Нуклеотидная последовательность двух экзонов гена С04-рецептора Т-лимфоиитоа человека. // Вопросы вирусологии. 1995. № 3, С.243-251.

47. Сидоров А. Злоноаский А. П. Шухмина Н. Р.. Зверев 8. &. Анджапаридзе О. Г. Стабильность и вирусингибирующее действие рекомбинантных рецептороток-синов на основе С04-рецептора Т-лимфоиитов человека и дифтерийного токсина. II Вопросы вирусологии. 1995. Ы» 3. С.272-275.

Информация о работе

Зверев, Виталий Васильевич
доктора биологич. наук
Москва, 1995
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы