Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия в клетках E. coli рекомбинантных производных CD4-рецептора, обладающих анти - ВИЧ активностью

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия в клетках E. coli рекомбинантных производных CD4-рецептора, обладающих анти - ВИЧ активностью"

РГб од

2 if ДПР 1SC3

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Hi правах рукописи

МАЛЮШОВА Вера Васильевна

ЭКСПРЕССИЯ В КЛЕТКАХ Е. col i РЕКОМБИНАМТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ С04- РЕЦЕПТОРА, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИ-ВИЧ АКТИВНОСТЬЮ.

Специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: кандидат биологических наук В. 6. ЗВЕРЕВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ доктор биологических наук, А. Ф. БОБКОВ

доктор биологических наук, А Е. ГОРБАЛЕНЯ

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Институт молекулярной генетики РАН

■ ¿Г. <?Г ,с

Защиту диссертации состоится ________.1995 г.,

в "т*1/ '' часов на заседании специализированного совета Д 001.20.01 при НИИ вирусологии инД И. Ивановского РАИН по адресу: 123098, Носква, ул Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии ич Д. И. Ивановского РАМН

Автореферат разослан " "_________1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор медицинских наук К П. КОСЯКОВА.

I I

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), селективно инфицируя человеческие моноциты, макрофаги и Т-лимфоциты, экспрессирующие на своей поверхности С04-дифференцировочный антиген (рецептор).

Процесс связывания и проникновения ВИЧ в чувствительные клетки обусловлен специфическим взаимодействием наружной субьединицы гликопротеина вирусной оболочки ВИЧ - gpl20 и CD4-рецептора на поверхности клетки-мишени.

Способность CD4-рецептора связывать ВИЧ предполагает возможность его использования в качестве противовирусного агента при ВИЧ-инфекции. Впервые возмохность такого использования СД4 была показана в системе In vitro несколькими группами авторов. В этих работах использовались различные растворимые формы рекомбинантного белка СД4, выделенные как из про- так и эукариотических клеток. Однако, при клинических испытаниях таких препаратов сколько-нибудь значительного противовирусного эффекта достигнуто не была Тем не менее, следует подчеркнуть, что в настоящее время не существует подхода к созданию лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфекции, который мог бы претендовать на монополию. Скорее всего, как и для ряда других инфекционных заболеваний, эффективная терапия ВИЧ-инфекции будет заключаться в применении комплексного системного подхода, когда в зависимости от стадии или формы проявления заболевания будут использоваться лекарственные средства с разными механизмами действия и их различные комбинации. Поскольку, надежных препаратов, ингибирующих стадию взаимодействия ВИЧ с чувствительными клетками пока нет, дальнейшее изучение возможности использования для этих целей различных рекомбинантных производных CD4- рецептора не представляется бесперспективным.

Кроме того, различные рекомбинантные. производные С04-рецептора могут и успешно применяются в различных моделях для изучения механизмов взаимодействия ВИЧ с чувствительными клетками, для очистки и изучения вирусных белков gpl20 и gpl60.

г

Исходя из этого, нами проводилась работа по получению мутантных и др. рекомбииантных форм CD4-рецептора, которые можно было бы использовать для этих целей. Мы также пытались получить коныогаты растворимых форм CD4-рецептора с веществами белковой природы, ингибирующими ВИЧ-инфекцию в системе in vitro, для направленной доставки таких веществ в ВИЧ-инфицированные клетки.

Цели и задачи исследования

Основными целями настоящей работы были: клонирование и экспрессия в бактериальной системе кДНК гена CD4-рецептора Т-лимфоцитов человека и получение рекомбииантных растворимых форм С04-рецептора,. способных связывать ВИЧ и вирусный гликопротеин gpl20 и подавлять репродукцию вируса.

В связи с этим, в задачи исследования входило:

1. Конструирование рекомбииантных плазмид. содержащих полнораэмернув копию кДНК гена CD4-рецептора Т- лимфоцитов человека.

2. Субклонирование фрагментов гена CD4-рецептора в бактериальных векторах экспрессии.

3. Получение растворимых рекомбииантных форм CD4-рецептора (рС04).

4. Выделение и очистка рекомбииантных гибридных белков производных CD4-рецептора из бактериальных клеток.

5. Характеристика иммунологических свойств и антивирусной активности полученных рекомбииантных белков в системе 1n vitro.

6. Изучение возможности использования рекомбииантных форм CD4-рецептора для аффинной очистки вирусспецифических белков.

7. Получение мутантных форм С04-рецептора, несущих мутации в участке узнавания гликопротеина gpl20 ВИЧ

8. Получение конъюгатов CD4-рецептора с веществами, ингибирующими репродукцию ВИЧ

Основные положения, выносимые на защиту

1. Стратегия клонирования кДНК гена С04-рецептора и определение ее нуклеотидной последовательности.

2. Получение растворимых рекомбинантных форм CD4-рецептора, эффективно взаимодействующих с др]20 ВИЧ и ингибирующих в системе in vitro репродукцию вируса.

3. Синтез мутантных производных CD4- рецептора для изучения механизмов взаимодействия CD4 с gpl20 ВИЧ и получение клеток бактерий, экспрессирущих мутантные белки.

4. Получение коньюгата CD4-рецептора с ингибитором БИЧ L-лизиноксидазой, что позволило значительно снизить дозы ингибитора при подавлении репродукции ВИЧ а системе in vitro.

Научная новизна работы

ß результате проведенных исследований, из библиотеки кДНК ФГА-стимулированных Т- лимфоцитов человека была клонирована кДНК гена С04-рецептора Т-лимфоцитов человека и определена его нуклеотидная последовательность. Анализ нуклеотидной последовательности позволил обнаружить пять нуклеотидных замен, три из которых приводят к изменении аминокислотной последовательности.

Получены рекомбинантные плазмиды, содержащие полную копио гена С04-рецептора (pNS12) и участок гена, кодирующий первые два иммуноглобулинподобных домена СС4-рецептора ¡pCDZ245). С помощью химического агента бромциана получена растворимая рекомбинантная форма С04-рецептора (pCD4), содержащая первые 150 аминокислот с N-конца молекулы.

Показано, что подобно нагивному белку. pCD4 взаимодействует с монсклональными антителами к С04 -и обладает выразимой антивирусной активностью в опытах in vitro.

Полученные мутантные производные CD4- рецептора могут бль использованы в экспериментах по изучению механизмов патогенеза БИЧ- инфекции.

Показано, что С04-рецептор, конъюгированный с - ингибитором ВИЧ-инфекции белковой природы эффективно связывается с инфицированными ВИЧ клетками и ингибирует репродукцию вируса.

Практическое значение работы

Практическое значение работы заключается в получении рекомбинантной плазмиды на основе вектора экспрессии рЕХ1, содержащей фрагмент гена СС4-рецептора, детерминирующий синтез гибридного белка СС4-бета-галактозидаза.

Полученные нами рекомбинантные, формы С04-реиептора могут использоваться для дальнейших экспериментов по разработке препаратов с аиитвирусным действием. Полученные белки могут также быть полезны для выделения и очистки гликопротеинов ВИЧ др120 и др160, а такхе в экспериментах по изучении биологии ВИЧ и механизмов взаимодействия ВИЧ с чувствительными клетками.

Публикация результатов исследования и апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано 14 работ и получено два патента. Результаты исследований представлены и обсуждены на VI, VIII, IX, X Международных конгрессах по проблемам СПИД (Сан-Франциско, 1990; Амстердам, 1992; Берлин, 1993; Иокагама, 1994), на советско- австралийском симпозиуме по проблемам "Профилактики и лечения СПИДа" (Москва, 1990), на 1 и 2 Международных конференциях "СПИЛ рак и ретровирусы человека" (Санкт-Петербург, 1992, 1993), Международной конференции " Молекулярно-биологические аспекты диагностики и терапии СПИД" (Новосибирск, 1992).

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Обьем работы составляет 121 стр. машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 8 таблицами и 25 рисунками. Список литературы включает 187 наименований. -

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовались молекулярно-биологические, вирусологические, биохимические, химические и иммунологические методы исследования В работе использовались перевиваемые человеческие клеточные линии Н9, МТ4, U937, MOLT4, Hut-78. Вирусы иммунодефицита человека - штаммы ВИЧ/BRU, BH41/SF4, ВИЧ/CBL, ВИЧг/ROO были получены из музеев вирусных штаммов Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, НИИ ВП РАМН, института Пауля Эрлиха, Франкфурт на Майне, ФРГ. В работе использовались ферменты рестрикции и модификации фирм Boehringer Mannhein, GrcbH (Германия) и Fermentas (Литва). При работе со всеми ферментами использовались буферные растворы и условия рекомендованные фирмами изготовителями. Препарат лизиноксидазы получен от акад. РАМН Т. Т. Березова. Компьютерный • анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили при помощи пакета программ "PC GENE" (RELISE 90) используя банки данных EMBL 34 и GENE PROT 25.

Описание ряда методов, условий постановки экспериментов, состав питательных сред и растворов приводится при излохении полученных результатов.

1. КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ кДНК С04-РЕЦЕПТОРА.

1.1. Клонирование кДНК CD4-рецептора.

Как ухе упоминалось, гликопротеин С04 является рецептором вирусов иммунодефицита человека I и II типов. Зрелая молекула CD4 имеет молекулярную массу 55 кД и состоит из наружного участка (372 аминокислоты), представляющего собой четыре тандемно расположенных иммуноглобулинподобных домена, трансмембранного домена, цитоплазматического участка и лидерного пептида (рис.1). Исследования показали, что ключевую роль в связывании и узнавании гликопротеина gpl20 ВИЧ играют первые два иммуноглобулинподобных домена (VI и V2) (Klatzmann et al., 1984).

б

ь VI J V2 VI «4 T с

L,SJ L-J UJ

П-1-1-1-г

-м 1 1вв зм зав «8В

Рис. 1. Структур» CD4-рецептора Т-лимфоцитов человека.

L - лидерный пептид; VI-V4 • иммуноглобулииподобные домены; Т трансмембранный домен: С - цитоплазматический домен; S-S - дисульфидные связи. На икале внизу указан размер молекулы в аминокислотных остатках.

Для выделения и клонирования кДНК CD4-рецептора нами была использована библиотека кДНК из ФГА- стимулированных человеческих Т-лимфоцитов ("Clonotech Laboratories Inc*., США) в бактериофаге gtll. В качестве зонда для скрининга были взяты два синтетических 20- и 18-звенных олигодезоксирибоиуклеотида, гомологичных известной последовательности 5'-концевого участка, гена CD4: 5' - AGGGAAACAAAG7GG7GCTG- 3! и 5'-7TTTnGCCCAGCACCAC-3', имеющие на 3'-концах, комплементарные друг другу участки ДНК длиной 9 нуклеотидных остатков. Зонд метили реакцией ник-трансляции с фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I и дбзоксииуклеозидтрифосфатами, меченными 32 Р в альфа-положении. Удельная активность полученного зонда составила 10 имп/мии.

Скрининг фаговой библиотеки проводили методом молекулярной гибридизации на нитроцеллвлозных фильтрах В результате трех раундов скрининга был отобран клон, содержащий участок ДНК Т-лимфоцитов, ограниченный EcoRI-сайтами, размером 2,8 т.ан. Этет EcoRI-фрагмент ДНК содержал один участок узнавания рестриктазой ВакМ, которая делила его на два фрагмента размерами 1,8 и 1,0 т. п. а Гибридизация выделенных фрагментов с зондом на ген CD4-рецептора дала положительный результат ливь в случае фрагмента размером 1,8 т. п. н.. Этот фрагмент был клонирован в плазмиду pGEM3 no EcoRI-BamHI сайтам, в результате чего была

Рис. 2. Структура плазмид pNS12 и pCQZ245 Цифрами показан размер плазмид в нуклеогидах; показаны участки узнавания рестриктаэамк В-ВаиШ, E-EcoRV, H-HlndHI, Ha-HaeIII, N-Nhel, Naa-Nael, P-PvuII, R-Rsal, S-SacI; Amp-ген устойчивости к ампициллину, Stop- терминирующий колон; клонированные фрагменты кДНК CD4-рецептора заитрихованы.

получена плазмида pNS12 (рис.2 ), содержащая вставку ДНИ размером 1,8 т. ни.. Рестрикционный анализ плазмиды pNSl2 (рис2,) показал, что рестрикционная карта этой плазмиды соответствует рестрикционным картам гена С04-рецептора и плазмиды рбЕМЗ, опубликованным ранее ( Maddon et al., 1985). Таким образом, можно утверждать, что клонированный нами фрагмент генома из Т-лимфоцитов человека содержит кДНК CD4-рецептора.

1.2. Экспрессия участков гена С04-рецептора в бактериальной системе

Как уже упоминалось, в процессе связывания гликопротеина др!20 ВИЧ, главную роль играют первые два иммуноглобулинподобных домена С04-рецептора (1-180 аминокислоты). Для субклонирования данного участка, представляющего наибольший интерес с практической точки зрения, в вектор экспрессии, в качестве исходного обьекта нами была йэята полноразмерная кДНК CD4-рецептора, клонированная в плазмиде pGEH3 (pNSl2)- Из плазмиды pNSl2 с помощью рестриктазы НаеШ вылепляли $рагмечт размером 0,7 т. П.Н., содержащий участок гена CD»-рецептора, кодирующий первые два иммуноглобулинподобных домена. Этот

2-3 4 5 6

п

ШШУ

■ Рис. 3. Анализ белковых лизатов ампициллин-устойчивых

трансформантов £. coli. 1 - маркеры молекулярных масс; 2-4 - лизаты клеток Р0Р2136, содержащих плазмиды рШ-3, соответственно; 5,6 лизаты клеток РОР2136 содержащие рекомбинантные плазмиды.

фрагмент препаративно выделяли из агарозного геля и клонировали по тупьм концам s плазмиду рЕХ1, обработанную рестриктазой Smal, в рамку считывания бета-галактозидазы (рис. 2). Полученной смесью рекомбинатных плазмид трансформировали клетки Е.соИ РОР2136. Векторы экспрессии семейства рЕХ (рЕХ1-3) представляет собой делеционные производные плазмиды pCL19, которая, в свою очередь является продуктом слияния генов Cro-lacZ. Плазмида рЕХ1 содержит полилинкер с уникальными сайтами для рестриктаз PstI, Sali, BairHI, Smal на 3'- конце LacZ, а также * сигналы термикации

транскрипции и трансляции фага fd. Поскольку, указанный фрагмент ДНК был клонирован в рамке считывания бета-галактозидазы Е.coll, продукт трансляции гена представлял собой гибридный белок, содержащий как бактериальную, так и эукариотическув последовательности.

В плазмиде рЕХ1 ген бета-галактозидазы находится под термоиндуцибельным промотором, поэтому трансформированные клетки выращивали при 30 С, затем индуцировали синтез гибридного белка повышением температуры до 37 град, С Выросшие колонии лизировали, лизат исследовали в 10% ПААГ и отбирали клоны по наличие гибридного белка с молекулярной массой, превышающей таковую у бета -галактозидаэы (рис.3 ). Выделенную из отобранных клонов ДНК подвергали рестрикционному анализу. В результате скрининга был отобран клон, содержащий плазмиду рЕ XI с НаеШ-вставкой ДНК, содержащей клонированный участок гена CD4-рецептора в рамке считывания бета-галактозидазы в правильной ориентации. Полученная плазмида была названа pCDZ245 (рис.2).

1.3. Определение нуклеотидной последовательности клонированного участка гена CD4-рецептора.

Нуклеотмдную последовательность определяли по методу Максама- Гилберта в модификации Чувпило и Кравченко. Кроме того, нуклеотидная последовательность N-концевого участка гена CD4 (1-400 нуклеотиды) была определена методом Сэнгера, при клонировании гена в бактериофаг №3 и использовании специфических олигонуклеотидных затравок. Схема определения нуклеотидной последовательности гена CD4-рецептора по методу Максама-Гилберта приведена на рис. 4.

В качестве исходного материала использовали плазмиды pCÓZ245 и pNSl2. Плазмиды линеаризовали подходящими рестриктазами и метили альфа-32 P-dNTP в реакции с фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I. Дальнейшие операции проводили по стандартной методика Электрофоретический анализ продуктов расщепления проводили в 6% ПААГ с 50% мочевины. Гели радиографировали а течение 3-х дней с усиливающим экраноч

Нуклеотидная последовательность клонированного участка гена CD4-рецептора практически полностью совпала с опубликованной

EcoRI

Pvull

Rsal Bell

вас!

StuI

l__l_II

BcllPVUl1 Sacl HindI" NdeI

U

BamHI

J

900 1200 С

(—i-1 I

300 600

Рис. 4. Схема определения нуклеотидной последовательности кДНК С04-рецептора. А- фрагмент плазмиды рН312, содержащий кДНК; В- фрагмент плазмиды рС02245, с участком «.ДНК; С • размер ДНК в нухлеотидах; показаны

участки узнавания отдельными рестриктазами; стрелками показан старт и направление прочитьюания нуклеотидной последовательности.

ранее (Май<1оп ег а1., 1985). Исключения составили следующие позиции нуклеотидов: 45 и 51 - вставка С; 57 - замена Т на 155 - замена С на 6; 336 - гамет Т на С и 838 - замена Т на С. Последние три нуклеотидные замены приводят и к изменении аминокислотной последовательности СМ- рецептора: аспарагина (N5 на лизин (К), триптофана (и) на аргинин ((!) и фенилаланина (Г) на серии (Б), соответственно. О наличии аналогичных нуклеотидных замен было указано такхе в одной из предыдущих работ по клонированию гена С04-рецептора (Оееп ег »1., 1988), однако, посчитав их результатом аллельного полиморфизма авторы с помощью сайт-специфического мутагенеза привели цуклеотидную последовательность в соответствие с опубликованной ранее. С учетом наших данных можно предположить, что е работе (Ма(1с1оп е1 а!., 1985) были допущены овибки в определении нуклеотидной

СААБСССА вДв ССС ТвС САТ ТТС ТБТ БББ СТС АББ ТСС СТА СТБ СБТ САБ ССБ ССТ - 56 (ЮС ТСС СТС ББС ААБ 6СС АСА ^ ^АС ^ рСТ Щ £ББ £АС |ГТС рТТ - 110

Ей Ей ЕМ Ей № Ей Ей № й? № Ш Й С§ $ Ш И¥"164

ЕЙ т № т $ № т ею ЕЙ ч& &т ш т & ^ ^ ^ -218

^ № Ш ЯЧ ^ № № ^ ^ Егё № № № Ей Лй -272

ББС ТСС ТТС ТТА АСТ ААА ЕБТ ССА ТСС ААБ СТБ ААТ БАТ ССС ССТ БАС ТСА АБА - 326 йТу $ег РЬе ¿ей ТКг 1.уг йТу Рго $ег 1уз Сеи А5П Д$р Дгд ДТа &р 5ег Агд

АБА АБС СТТ ССС 5АС САА ББА ААС ТТС ССС СТБ АТС АТС ААБ ААТ СТТ ААБ АТА - 380 ■ Агд 5ег Сей Агд А$р Б1п БТу Абп Рпе Рго Сей Пе Пе Суз Агп Сеи 1у$ Пе

ею $ эд ш ^ га ¿51 ею §?§ $ ^ $ ею ею ш ш -434

В5 ЕЙ № 1тет5 Ш Ш ^ Ш ^ № ЕЙ ЕЙ ЕЮ е?5 ЕЮ -488

АБС СТБ АСС СТБ АСС ТТЙ БАБ АБС ССС ССТ БЕТ АБТ АБС ССС ТСА СТС САА ТОТ - 542 5ег Сеи Тпг Сеи ТКг Сеи БСи 5ег Рго Рго ЙТу 5ег 5ег Рго 5ег УаТ Б1п. Сух

щ ш- ^ ^ ад $ ^ ею е?§ е?^ $ № ей ^ ш ею -596

СТБ ЙАБ СТС САБ САТ АБТ БЕС АСС К в АСА ТБС АСТ БТС ТТБ САБ ААС САБ ААБ - 650 Сеи 21и Сеи Й1п ир 5ег ЙТу ТКг Тгр ТКг Суз ТКг УаТ |.еи К1п Азп 51 п 1у$

Ш № Ш № № ^ № Ш № Е1иА № ^ 1^сг §1сг"704 № № ^ ^ Щ Ш ЯСе № ^ £¡5 Ш"758

№ Ш ^ ЕЙ № е?су № ^ ЕЙ 1Щ № -812

ТСС ТСС ТСС ААБ ТСТ 1ББ АТС АСС ТСТ САС СТБ ААБ ААС ААБ СЛА БТЙ ТСТ СТА - 866 5ег 5ег Зег 1у5 5ег Тгр Не ТКг 5ег Дгр Сеи 1уз Аэп ЬуБ Б1и \/аТ 5ег 7аI

^ Ш № ^ РЙ ^ ЕЙ е ^ № ЕЙ Рсг§ ЕЙ -920

СТС АСС СТБ ССС САБ БСС ТТБ ССТ САБ ТАТ БСТ ББС ТСТ СБА ААС СТС АСС СТБ - 974 Сеи Тпг Сеи Рго Б1п ДТа Сеи Рго 21 п Туг ДТа ЕТу 5ег СТу Азп Сеи Тпг Сеи

од Ееи ею т № № де ЙЙ ею ш ^ ЕЙ ек ш т -1038

АБА

...... БСС АСТ САБ СТС САБ ААА ААТ ТТБ £СС ТБТ БАБ ЕТЕ КБ ОБА ССС ДСС ТСС - 1С92

Агд ДТа Тпг С1п Сеи Б1п 1.у5 Абп Сеи Тпг Су$ 21и УаТ Тгр БТу Рго Тпг 5ег

ССТ ААБ СТБ АТБ СТБ АБС ТТБ ААА СТБ БАБ ААС ААБ БАБ БСА ААБ БТС ТСБ ААБ - 1146 Рго Суз Сеи МЕТ Сеи Бег 1.еи 1у5 Сеи В1и Агп 1у5 Е1и ДТа 1уз УаТ $ег 1у$

^ т № ш ей ^ РЙ ега т е ^ ем 1% Еет§ -1200 ■

СТБ АБТ БАС ТСБ ББА САБ БТС СТБ СТБ БАА ТСС ААС АТС ААБ ПТТ СТБ ССС АСА - 1254 Сеи 2ег Дгр 5ег ЕТу Б1п УаТ Сеи Сеи Б1и 5ег Азп 11е Уа1 Сеи Рго Тпг

^ & ?пссг РсГОа т ей т ш ЕЙ ш е?сУ -1308

ЕЙ ЕЙ Ее! Ж № № ЕЙ Й?су Ш Ш № Щ Ш ^ Ш ^ йдА -1362 ^ Ш ^ № Ш ^ ^ кЦ Ей ЕЙ ^ № '1416

^ Рсгот Ш № Щ ¥г Ш АС<5 - 1470

ШтеШШГСОТ^ 1754

Рис. 5. Нуклеотидная последовательность кДНК С04- рецептора. Цифрами показан размер ДНК 8 нуклеотидах;. аминокислотная последовательность С04-рецептора дана в трехбуквенном коде.

и

последовательности этого фрагмента гена.

Нуклеотидная последовательность HaeIH-фрагмента гена CD4-рецептора и соответствующая ей аминокислотная последовательность представлены на рис. 5.

1.4. Выделение и очистка слитного белка CD4-6eTa- галактозидаза.

Известно, что белки, слитые с С-концом бета- галактоэидазы, не секретируются в культуральную среду, а накапливаются в цитоплазме Е.coli в нерастворимой форме в виде "телец включения". С помощью денситометрического сканирования геля после проведения электрофореза было найдено, что количество гибридного белка CD4-бета- галактозидаза, продуцируемого клетками, несущими рекомбинантную плазмиду pCDZ245, составляет около 20% от суммарного количества экстрагируемого клеточного белка. Этот уровень синтеза соответствует литературным данным для слитых с бета- галактозидазой белков, экспрессируемых в векторах семейства рЕХ. Как ухе упоминалось выше, гибридный белок продуцируется рекомбинантными плазмидами главным образом в агрегированной нерастворимой форме и оседает в цитоплазме клеток в виде 'телец включения". Это значительно облегчает его очистку и предохраняет от протеолиза клеточными ферментами.

Из клеток Е. coli Р0Р2136 слитный с бета-галактозидазой белок, содержащий первые 180 аминокислот CD4-рецептора выделяли и дополнительно очищали на колонке с Sephacryl S-300.

1.5. Иммунологические свойства рекомбинантного слитного белка CD4-бета-галактозидаза

N-концевой фрагмент CD4- рецептора (1-183 а. к.) был выделен в виде гибридного белка с бета-галактозидазой из цитоплазмы Е. col i и очищен с помощью гель- фильтрации на колонке с "Sephacryl S-300". Полученный продукт был охарактеризован в реакциях иммуноферментного анализа, иммуноблотинга и шмунопреципитации.

На рис.6 представлены результаты связывания рекомбинантного слитного белка с моноклональными антителами к С04-рецептору в иммуноблотинге. Известно, что моноклональные антитела ОКТ4А и

Рис. 6. Взаимодействие рекомбинантных форм СС4- рецептора с моноклональньми антителами ОКТ4А и 1еиЗА. А - электрофорез: 1- лизат клеток РОР2136, 2- е-галактозидаза, 3- рекомбинантный белок из клеток содержащих плазмиду рС02245.

Б - иммуноблотинг с моноклональными антителами 1еиЗА (1,2) и 0КТ4А (3,4); 1,3-рС04, 2,4- е-галактолзидаза. Слева цифрами показана мол. масса маркерных белков в кЛ

!.еиЗа конкурируют с белком др120 ВИЧ за связывание с С04-рецептором. Мы показали, что в ИОД и иммуноблоганге гибридный белок, выделенный из бактериальных клеток связывается с указанными моноклональньми антителами, т. а. по своим иммунологическим свойствам близок к белку, получаемому в эукариотических системах

С целью подтверждения сохранения антигенной активности полученного рекомбинантного производного С04- рецептора проводили непрямой иммуноферментный анализ с моноклональными антителами ЦеиЗа и 0КТ4 (узнающими эпитоп в третьем или четвертом иммуноглобулинподобном домене). В качестве коныогата использовали кроличьи антимышиные 1дБ, коньюгированные с пероксидазой хрена, а качестве отрицательных контролей - 0КТ4 и сыворотку неиммунизированной мыши.

1.6. Получение N-концевого фрагмента рекомбинантногс CD4-рецептора в растворимой форме

Для изучения антивирусной активности полученного рекомбинактного белка и механизмов связывания с гликопротеином gpl 20 ВИЧ необходимо Было отделить от рекомбинантногс CD4 бета-галактозмдазу.' В настоящее время известен целый ряд вецесте, расцеплявцих белки в строго определенных местах Для выбора химических реагентов, способных отцепить рекомбинантный CD4 от бет»-галактозидазы и при этом не нарушить его целостность, аминокислотная последовательность CD4-рецептора была проанализирована в пакете программ "PC GfNE*. Был проведен поиск сайтов специфического расцепления для 10 доступных химических агентов. Результаты анализа приведены в табл. 1.

Таблица 1.

Участки химического расцепления CD4-рецептора химическими агентами и протеазами.

Расцепляющий агент

Кол-во участков местоположение расцепления участков расцепления {N а. к. о.)

Трипсин

62

1,3,9,33 и т. д.

2. Кисл. гидролиз 2

3. 2-нитро- 5-тиобензоловая к-та 12

4. Клострипаин 17

5. Бромциан 7

6. N-бромсукцинммид 19

7. BNPS-скатол 10

269. 453

40,10В, 154,183, 327, 369, и т. д. 3, 8,79, 83,156

и т. д, 1,274,317, 339, 367,397,432 9,52,87,107,132,

и т.д. 53, 67,182,239, и т. Д,

2

3 4

94

67

Рис 7. Электрофорез рекомбинантных форм CD4-рецептора.

1 - рС04 слитный с в-галактозидазой; 2 - в-галактозидаза;

3 - в- галактозидаза обработанная бромцианом; 4 - слитный с в- галактозидазой рС04 обработанный бромцианом Слева цифрами показана молекулярная масса белков в кД.

Наиболее приемлимл для поставлен)«« целей реагентом оказался бромциан, который, отцепляя целиком рекомбинаитный белок CD4 от е-галактозидазы, разрезает последнее на множество мелких фрагментов, которые затем легко отделяется от основного искомого белка методами колоночной хроматографии. Для получения очищенного рекочбинантного белка CD4 150 мг слитного белка обрабатывали бромцианом в 70% муравьиной кислоте в течение 26 часов Полученную смесь пептидов освобождали от бромциана гель-фильтрацией на сефадексе G-10 ("Pharmacia", Швеция) используя в качестве элюента 30% уксусную кислоту. Разделение смеси пептидов проводили ^ельфильтрацией на фрактогеле HW50F ("Merck", ФРГ). Белок диалиэовали против ТЕ-буфера (рН 6,5) и исследовали в 12% ПААГ с SDS. Результаты электрофоретического исследования приведены на рис. 7. Пептид, представляющий собой первые два иммуноглобулинподобных домена CD4-рецептора, имеет наибольшую молекулярную массу (26 кД) и хорошо отделяется от остальных

небольшого размера пептидов, представляющих собой участки в-галактозидазы. Полученный 8 результате расцепления бромцианом пептид, так хе как и слитный белок, в иммуноблотинге и непрямой иммуноферментной реакции связывал моноклоналоные антитела к С04- рецептору - ОКТ4А и leu ЗА, т. е. сохранял свойства слитного белка.

2.4. Изучение влияния растворимого рекомбинантного CD4-рецептора на репродукцию ВИЧ.

В настоящее время оценку противовирусного действия препаратов, обладающих потенциальной анти-ВИЧ активностью проводят на культурах эарахенных ВИЧ клеток несколькими методами, в том числе: подавление вирусиндуцированного образования синцитий, изучение уровня выхиваемости зараженных ВИЧ клеток, измерение уровня активности обратной транскриптазы (RT) ВИЧ в культуральной жидкости и определение уровня синтеза вирусного белка р24. Для изучения антивирусного действия полученного нами препарата растворимого рекомбинантного С04-рецептора (pCD4) мы использовали все вышеперечисленные методы. В качестве положительного контроля был использован применяемый при лечении ВИЧ-инфекции и хорошо изученный препарат - АЗТ (Sigma, США), в качестве отрицательного контроля в-галактозидаза Е. coli, выделенная из втажа экспрессирувщего вектор р£Х1, обработанная и очищенная теми же методами, что и рекомбинантный исследуемый CD4-рецептор (pCD4).

Ингибирование, вирусиндуцированного образования синцитий проводили на клетках НТ4. или Н9. Инфицированные ВИЧ клетки выдерживали с различными концентрациями полученного pCD4-рецептора в течении 3 часов. Обработанные таким образом инфицированные клетки разводили свежей культурой клеток (концентрация 500000 кл./мл) в.саотно^ении 1:3 - 1:5 и оставляли на ночь при 37 градус. . Наследующий день смесь клеток отмывали помещали в свежую куд^туралыыув, среду и на третий день определяли количество синцитий..на .100.. живых клеток. На рис 14,. а представлены данные, полученные. при, изучении подавления рС04 индуцированного ВИЧ синцитиеобразования. Показано; что даже в коцентрации 1 мхг/мл рС04 практически полностью подавляет

Рис.8. Изучение антивирусной активности рекомбинантных форм С04- рецептора. А. - влияние рС04 на синцитиальный эффект, индуцированный ВИЧ.

1-опыт, 2-контроль. По оси ординат - количество синцитиев на 100 живых клеток; по оси абсцисс - доза рС04 в мкг/мл. Б. - график выживаемости клеток МТ4, зарахенных ВИЧ1. 1-контроль, 2,3-рС04, дозы 1 и 5 мкг/мл, соответственно. По оси ординат - число выживших клеток в % ; по оси абсцисс - время после добавления рС04 в днях. В. - уровень синтеза обратной транскриптазы ВИЧ. 1-контроль, 2-рС04.(5 мкг/мл). По оси ординат - активность 1!Т ВИЧ в культуральной среде (в 1д срш/мл); по оси абсцисс - дни в которые проводили измерения Г. - влияние рС04 на уровень синтеза р24 антигена ВИЧ По оси ординат - концентрация р24 в культуральной среде в пкг/мл; по оси абсцисс - концентрация рС04 в мкг/мл.

вирусиндуцированное образование синцитий (рис.8, а).

. После обработки рСР4 инфицированных ВИЧ клеток МТ4 число выживших при инфекции ВИЧ клеток, подсчета живых и мертвых клеток с витального красителя трипанового синего.

изменяется также и определяемое методом использованием

Добавление рСй4 в концентрациях 1-10 мкг/мл повышает число выживших клеток в инфицированных ВИЧ лимфоцитах (рис.8,б).

Одним из показателей ВИЧ-ингибирующего действия препаратов

является также уменьшение уровня синтеза антигена р24 и активности RT ВИЧ. В наших экспериментах уровень синтеза р24 антигена определяли с использованием тест-системы фирмы "Dupont" (США) на 5-й день после внесения препарата рС04 по рекомендациям фирмы изготовителя. Результаты представлены на рис. 8, г. Как видно из графика, добавление рекомбинантного белка в концентрации 1 мкг/мл в 400 раз снижает уровень р24 антигена, а при концентрации pCD4 5 мкг/мл р24 антиген практически не определяется. Аналогичные результаты были получены и при исследовании активности RT ВИЧ рС04 добавленный в концентрации 1 хкг/мл снижает уровень обратной транскриптазы более чем на 60% (данные не показаны), а концентрация рС04 от 5 до 10 мкг/мл полностью подавляет продукцию этого фермента (рис. 8, в).

Таким образом, можно говорить о том, что полученный нами рекомбинангный . белок, состоящий из первых двух

иммуноглобулинподобных доменов CD4-рецептора, выделенный из *

клеток Е.coli, ингибирует репродукцию- ВИЧ-1 в культуре человеческих Т- лимфоцитов и оказывает выраженное противовирусное действие в системе in vitro.

Полученный рекомбинантный CD4-рецептор так же эффективно связывался с рекомбинантным и нативным гликопротеидом gpl20 ВИЧ и использовался для их аффинной очистки ( рис. 9).

Рис 9. Взаимодействие рС04 с рекомбинантным

и вирусным белком gpl20 ВИЧ рС04 наносили на мембрану и гибридизовали с рекомбинантным gpl20 (1); лизатом клеток МТ4 зараженных БИЧ1, штамм HTLV-1IIB (2) и лизатом клеток Hut78 зараженных ВИЧ1, штамм тот же (3). Фильтры обрабатывали сывороткой больного, содержащей антитела к gpl20 ВИЧ и проявляли как 8 обычном иммуноблотинге. В качестве контроля использовали pCD4 обработанный лизатом клеток МТ4 и сывороткой больного (4).

2.5 Получение конъюгата pCD4 с ингибитором ВИЧ -L- лизин- а- оксидаэой.

В предварительных экспериментах нами было показано, что L-лизин-а-'оксидаза - фермент выделенный из гриба Trichoderma harzianum R1fat в концентрации 1мкг/мл резко ингибирует репродукцию вируса в культуре клеток МТ4 (патент РФ N482338/13/ 040363). Нами так же было показано, что этот белок в более низких концентрациях ингибирует репродукцию других вирусов и бактерий (международный патент PTC/RU94/00012), т.е. является неспецифическим ингибитором вирусной инфекции. Поэтому, для того, чтобы направленно включать этот препарат в клетки зарахенные ВИЧ и, соответственно, уменьпить дозу препарата нами была предпринята попытка получить хонъюгат этого белка с растворимой формой С04-рецептора. Известно, что L-лизин-а-оксидаза, состоящая из двух субъединиц по 52 к Д так же как и CD4-рецептор, содержит в своем аминокислотном составе цистеины и поэтому существует возможность связать оба белка дисульфидными мостиками. Для этого pCD4 был обработан SMPT (N-сукцинимидил-оксикабонил-а-метилтолуолом). Для этого, к 1мл рС04 (концентрация 1мг/мл) добавляли 30 мкл SMPT охлаждали во льду и наносили на колонку с Sephadex G-25 уравновешенную фосфатным буфером с 0.003М ЕОТА, pH 7,5. Белковую фракцию собирали, концентрировали при помощи концентратора "Centriprep-10" (конечная концентрация белка 0,5 мг/мл) и помещали в лед. К 2 мл очищенной L-лизин- а-оксидазы (концентрация 0,5 мг/мл) добавляли 10 мкл OTT (7,7 мг/мл) и инкубировали 1 час при комнатной температуре в темноте. Смесь охлаждали, обрабатывали и концентрировали так же, как и pCD4 (конечная концентрация белка 0,2 мг/мл). Обработанные таким образом белки смешивали в соотношении 2:3 и оставляли на 48 часов при комнатной температуре. Полученный коиъюгат наносили на колонку Blue-Sepharose CL-4B уравновешенной фосфатным буфером. При промывке колонки тем же буфером с нее элюировались остатки не связавшегося pCD4 (26 кД) и некоторое количество свободной лизиноксидазы (52 к А) (рис.8). Остальные белки элюировали'с колонки 0,5N NaCl в фосфатном буфере. Элюат концентрировали как описано выше и наносили на колонку с Sephacryl S-200. Злюцию проводили 0.15М NaCl. В результате получали два белковых пика.

1 2 3 4

ш

Рис.10. Электрофоретический анализ коньюгата С04-лизиноксидаза.

1-маркеры мол. масс; 2-рС04; 3-лизиноксидаза; 4-коныогат С04-лизиноксидаза; слева показаны мол. массы маркерных белков в килодальтонах.

Первый содержал коныогат рС04 с Ь-лизин-а-оксидазой (75 кД), а второй не связавшуюся с рСй4 лизиноксидазу (рис. 8). Полученный конъюгат был сконцентрирован (1мг/мл) и простерилизован фильтрацией через фильтр 0, 22мт.

2.6. Изучение антивирусных свойств конъюгата рС04-лизиноксидаза.

Иы изучили способность полученного коньюгата рС04- лизиноксидаза ингибировать вирусиндуцированное образование синцитий и влиять на выживаемость клеток НТ4, зараженных ВИЧ. В качестве контроля были использованы препараты рС04 и лизиноксидазы- .Предварительно мы показали, что полученный конъюгат, так же как рС04 и лизиноксидаза не обладают токсичностью для клеток ИТ4 даже в концентрациях 100-200 мкг/мл. В работе использовались концентрации препаратов от 0,01 до 1,0 мкг/мл. Результаты экспериментов суммированы в табл. 2 и 3. Как видно из таблиц полученный коныогат ухе в дозах 0,01 мкг/мл подавляет вирусиндуцированное образование синцитий и резко

Табл. 2

Изучение антивирусного действия рС04 и его конъвгата с лиэиноксидазой Показано число еыхивших клеток в %

лизиноксидаз а Р СИ4 кoнv пгат

А Б А Б А 5

клетки не зараженные ВИЧ 95 95 94 95 92 95

клетки зараженные ВИЧ 30 32 " 30 35 34 32

дозы препаратов в мкг/мл 0,01 35 35 30 30 70 74

0,05 40 42 38 40 74 79

. 0,1 60 73 60 75 87 54

0,5 75 81 68 83 87 93

1,0 75 88 92 94 92 95

А - внесение исследуемых препаратов после 24 часов инкубации с ВИЧ Б - внесение препарата перед инкубацией с ВИЧ

Табл. 3

Процент подавления синцитий-образования рС04 и конъюгатом рС04-лизиноксидаза

Препарат

исследуемые концентрации в мкг/мл

0,01 0,05 0,10 0,5 1,0

лизинохсидаза 5 40 56 ' 78 95

рСС4 10 40 50 ВО «5

конъюгат 75 55 100 100 ¡СО

«

гг

повышает выживаемость зараженных вирусом клеток МТ4, т. е. действует значительно эффективнее каждого из двух его составляющих. В настоящее время очень трудно говорить о перспективах использования такого препарата в клинике, однако показана принципиальная возможность получения и использования таких белковых конъюгатов для подавления ВИЧ-инфекции.

4. Получение мутантных форм (04-рецептора.

Известно, что специфичность узнавания антигена иммуноглобулинами, главным образом, определяется структурой регионов, определяющих комплементарность внутри вариабельных участков легких цепей Ig: т. к CDRI, CDR2, и CDR3. Эти участки в совокупности и образуют поверхность, комплементарную таковой у антигена. Такие участки имеются и в структуре первого иммуноглобулинподобного домена молекулы CD4- рецептора, причем сайт взаимодействия с gpl 20 ВИЧ находится в CDR2-области рядом с белковой последовательностью RADS, почти гомологичной, а по вторичной структуре идентичной участку адгезии - RGDS. Вторичная структура этого участка в CD4-рецепторе мыши (который, как известно не взаимодействует с gpl20 ВИЧ) сильно изменена заменой аланина на фенилаланин. Поскольку, в литературе имеются данные, что этот участок С04-рецептора может участвовать во взаимодействии с gpl20 ВИЧ мы для проверки этого предположения получили несколько мутантных форм гена CD4-рецептора в которых в одном случае последовательность RADS была заменена на канонический участок адгезии (RGDS), а в другом на последовательность мышиного аналога С04 (RF0S). .Для этого, BsuRII -фрагмент гена CD4-рецептора, длиной 624 пары оснований, кодирующий первые два иммуноглобулинподобных домена клонировали в векторную ДНК RF фага ЮЗгсрЭ по Sinai-сайту. Для создания каждой из мутаций, одноцепочечную матричную ДНК (ss H13CD4) отжигали с 21 - членными олигонуклеотидами, содержащими единичную (Cl) или двойную (С2) мутации в участке ДНК соответствующему RADS- области первого lg-подобного домена CD4-рецептора: ДНК CD4-рецептора 5'... CT TGA GTC AGC GCG АТС... олиго Np (Cl) GA ACT CAG TGG CGC TAG TAA G 5'

олиго Np (C2) GA ACT CAG TTT CGC TAG TAA G 5'

Нуклеотидная последовательность полученных мутантных форм гена СМ- рецептора была определена методом Максама- Гилберта. Иутантные копии гена были клонированы в векторы экспрессии и было показано, что клетки синтезируют белки с ожидаемой молекулярной массой. Полученные рекомбимантные мутаитные белки могут использоваться в экспериментах 'по изучению механизмов взаимодействия ВИЧ с чувствительными клетками.

ВЫВОДЫ

1. Клонирована кДНК гена С04-рецептора Т-лимфоцитов человека.

2. Получены растворимые рекомбинантные формы CD4-рецептора, сохраняюцие свойства нативного белка и взаимодействующие с гликопротеином др120 ВИЧ.

3. Показано, что растворите рекомбинантные формы СМ-рецептора ингибируют репродукцию ВИЧ в системе in vitro.

4. Получены коньюгаты рекомбинантного CD4-рецептора с неспецифическим ингибитором ВИЧ-инфекции, L-лизиноксидазой, и показано, что такие конъюгаты в несколько десятков раз увеличивают ВИЧ-ингибируюцее действие препарата.

5. Синтезированы мутантные формы гена CD4-рецептора и получены рекомбинантные белки несущие мутации в участке связывания с gpl20 ВИЧ

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1. Малюшова В. а, Сидоров А. В., Пугач А. В. Здановский А. Г. Экспрессия 8 клетках Е. col i рекомбинантных форм С04-рецептора. Т-лимфоцитов человека, обладающих аити-ВИЧ активностью.// Тез. докладов Всесоюзной школы-семинара "Молекулярная биология и медицина". Л., 1990. С. 4.

2. Zverev V., Halushova V.. Sidorov A., Zdanovsky А., Blinov V., Korneeva Я , Pugach A., Yankovsky N., Andjaparidze 0. Inhibition of the infectivity of HIV by different recombinant forms of C04.// Abstracts of the Sixth international conference on AIDS, San Francisco. USA. 1990 (20-24 June). V.l. Th.A. 252, P. 181.

3. Зверев В. В., Шахов A R , Недоспасов С. A., Пугач А. В., Сидоров А 8., Малюшова В. В., Анджапаридзе 0. Г. Клонирование и экспрессия в клетках. Е. coli фрагментов гена CD4-рецептора Т- лимфоцитов человека. // Мол. генетика, микробиология и вирусология. - 1991. N 1. С. 16-18.

4. Zverev V., Malushova V., Sidorov A, Zdanovsky A, Blinov V., Pugach A, Yankovsky N., An japan dze 0. Inhibition of HIV infectivity by different recombinant forms of CD4. // [nt. Conference on medical biotechnology, i immunization and AIDS. Leningrad, Russia. 12-18 June. 1991. P.21.

5. Zverev V., Halushova V., Sidorov A, Zdanovsky A, 81inov V., Pugach A, Yankovsky N., Anjaparidze 0. Inhibition of the infectivity of HIV by different racomoinant forra of CD4. // Int. Conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS. Novosibirsk, Russia. 1-5 July, 1991. ?. S.

6. Zverev V., Sidorov A, Zdanovsky A, Malushova V. V., Zdanovska M., Shukhmina N., Andjaparidze 0.. Pi lie E., Velnikova N. Inhibition of the infecti vi ty of HIV by different forms of CD4-di phteri a recombinant iпзи/notoxines. - VIII International Conference on AIDS. Amsterdam, The Netherlands. 19-24 July. 1392. V. 3, PuA 5204, P. 45.

7. Зайцев И. 3., Суханова АЛ., Сазонов A3., Каеасвза £. В., Алаторцева Г. И., Гольцов 8. А , Андхапари^зе 0. Г. . -Гг-г-еа А А . Зверев В. В. . Малюшова ' В. В. >< Ар. Г!ол»г-.гптиА ?/С5, предназначенный для определения антител к 5'.'Ч2. ioar.^e-.r А",'

НЕ206, рекомбинантная плазмидная ДНК рНЕ20б, втамм- продуцент. //Заявка на патент РФ N5029951/13/010053/ от 28.02.92г.. Решение о выдаче от 14.09.92г.

8. Zverev V., Blinov V., Nedospasov S., Malushova V. Nucleotide sequence and structure of the gene of C04-receptor// International conference on AIDS, cancer and human retroviruses. St.-Petersburg, Russia, 18-22 Nov., 1992, P. 21.

9. V. Zverev, V. Blinov, S. Nedospasov, V. Malushova, A Sidorov, 0.Andjaparidze.. Nucleotide sequence, structure and expression of the gene of human CD4-receptor. //IX International Conference on AIDS. 6-11 June, 1993, Berlin. V. 2. P.146.

10. Пугач А. В., Зверев В. а, Пилле Э. P., Шухмина R P., Мельникова H. Л., Носик Д Н. , Малюшова 8. В., Анджапаридзе 0. Г. Получение и зарактеристика моноклональных антител к рекомбинантным белкам ВИШ и ВИЧ2 - продуктам генов env и gag. //Вопросы вирусологии. 1993. N6, С. 253-256.

11. Zverev V., Nedospasov S., Udalova I., Sidorov A., Malushova V., Blinov V. Nucleotide sequence and structure of the 5'-end part of the gene of CD4-receptor. // 2-nd International conference on AIOS, cancer and human retroviruses.

. St.-Petersburg, Russia, 29 Nov.-03 Dec. 1993. P.12.

12. Сидоров А. В., Зверев В. В., Здановский А Г., Пугач А В., Малюшова В. В., Анджапариджзе 0. Г. Противовирусное действие рекомбинантных рецепторотоксинов на основе дифтерийного токсина и С04- рецептора Т- лимфоцитов человека. //Вопросы вирусологии. 1994. N1. С. 6-10.

13. Зверев В. В., Малюшова В. В., Сидоров А. В., Пугач А. В., Шухмина Н. Р., Пилле Э. Р., Мельникова Н. Л., Анджапаридзе 0. Г. Противовирусное действие рекомбинантных форм CD4- рецептора Т-лимфоцитов человека. //Вопросы вирусологии. 1994. N2. С. 56-59.

14. AG. Zdanovsky, М. V. Zdanovskaia, А V. Sidorov, V.V. Malushova, V.V. Zverev, O.G. Andzhapari dze, V.G. Debabov. Construction and expression in E.coli of hybrid genes composed of sequences encoding diphtheria toxin and human CD4 receptor. // Gene. 1994. V. 139. P. 77-82.

15. Зверев В. В., Сидоров А. В., Недоспасов С. А., Малюшова В. В., Уда лова НА, Анджапаридзе 0. Г., Блинов В. М Нуклеотидная последовательность двух экзонов гена CD4-рецептора