Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура аппарата инфицирования бактериофага T4

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура аппарата инфицирования бактериофага T4"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАВУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им АКАДЕМИКОВ М. М. ШЕМЯКИНА И Ю. А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

Костюченко Виктор Анатольевич

СТРУКТУРА АППАРАТА ИНФИЦИРОВАНИЯ БАКТЕРИОФАГА Т4

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Месянжинов Вадим Викторович. Научный консультант:

профессор Россман Майкл (Rossmann Michael). Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Доброе Евгений Николаевич; доктор химических паук, профессор Донцова Олыа Анаюльсвна.

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгсльгардта РАН.

Защита состоится 13 октября 2004 года в 10 ч на заседании Диссертационного совета Д002.019.01 в Институте биооргаиической химии им. ак. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу: 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институте биоорганической химии им. ак. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан " " сентября 2004 г.

Д002.019.01

доктор химических наук, профессор

Ученый секретарь диссертационного совета

В. А. Несмеянов.

*

Актуальность проблемы

Знание структуры вирусов и особенностей их формирования необходимо для разработки новых эффективных подходов в борьбе с вирусными инфекциями. Вирусы также являются удобной экспериментальной модельной системой для изучения механизмов ассоциации белковых субъединиц, которая может помочь в понимании процессов формирования сложных биологических структур клетки, таких как ядерные поры, центриоли, жгутики, компоненты мышечных филаментов и др

Бактериофаг Т4, инфицирующий Escherichia col:, является одним из основных модельных объектов молекулярной и структурной биологии [7] Частица фага Т4 (Рис I) состоит из двух основных частей — капсида ("головки"), содержащего геномную ДНК размером около 172 тысяч пар оснований, и "хвоста", который присоединен к капсиду через специальный портал на одной из вершин с симметрией 5-го порядка. Капсид является икосаэдром, удлинённым вдоль оси 5 порядка [5], имеет размеры 860 А в поперечнике и 1200 А длиной, и построен из 930 копий белка продукта гена (пг) 23, 55 копий пг24, 155 копий белка hoc ("highly antigenic outer capsid protein") и 810 копий белка soc ("small outer capsid protein") Портал содержит 12 копий белка пг20 Сократимый хвост состоит из трех частей "шейки", хвостового стержня, на котором собран сократимый хвостовой чехол, и базальной пластинки К шейке, построенной из гексамеров пг15, пг13 и/или пг14, присоединены "воротничок" и "бакенбарды", состоящие из тримеров белка фибритина (пг-wac), воротничок, возможно, содержит также один из белков пг13 или пг14 Основную часть хвоста занимает сократимый хвостовой чехол и расположенный внутри него хвостовой стержень Чехол построен из 138 копий пг18, стержень состоит из пг!9, которого, видимо, 138 копий Завершает хвост базальная пластинка — многокомпо-

Рис. 1: Бактериофаг Т4 .

а) криоэлектронная микрофотография; б) схематическая модель Рисунок взят из [19].

|"»Ч»ОК\ЛЫ1АЯ

>.ОТЕ\А < |1»г\ орг . у, ) .У^яч

нентная молекулярная структура диаметром около 520 А и высотой в 270 А, состоящая из 16 различных белков, почти каждый из которых является олигомером. В состав базальной пластинки входят пг5, пгб, пг7, пг8, пг9, пгЮ, пг1 1, пг12, пг25, пг26, пг27, пг28, пг29, пг48, пг53, и пг54. К базальной пластинке присоединены длинные фибриллы, построенные из пг34, пг35, пгЗб и пг37. Таким образом, в сборке частицы фага участвуют более тридцати различных белков, и это не не считая белков, связанных с ДНК внутри капсида, вспомогательных скаффолд-белков и белков-шаперонов.

С помощью электронной микроскопии с применением негативного контрастирования ранее удалось представить общее строение вируса. Хвостовой чехол бактериофага Т4 в растянутом (нативном) состоянии явился первой биологической структурой, для которой была проведена трёхмерная реконструкция [20]. Также была выполнена трёхмерная реконструкция сокращённого [1] хвоста и предложена двумерная модель базальиой пластинки [4]. Разрешение этих моделей было довольно низким, около 40 А. Получить с высоким разрешением пространственную реконструкцию вирусной частицы целиком удавалось, в основном, лишь для сравнительно простых в устройстве икосаэдрических вирусов, поскольку отсутствовали необходимые вычислительные мощности и не были до конца разработаны методы реконструкции. В настоящее время, с совершенствованием методов электронной криомикроскопии и развитием компьютерных технологий, цель реконструировать частицу бактериофага Т4 с околоатомным разрешением представляется осуществимой.

Цель работы

Пространственная реконструкция такого сложного и большого вируса, каким является бактериофаг Т4 (размеры вируса примерно 2500 х 1000 х 1000 А, молекулярная масса частицы около 300 МДа) требует особого подхода, поскольку даже при использовании современной вычислительной техники необходимый объём данных и вычислений выходит за рамки осуществимого с помощью стандартных методов и программ. Поэтому, в данной работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать компьютерную программу для пространственной реконструкции больших объектов с различной симметрией по изображениям электронной криомикроскопии;

2. Провести пространственную реконструкцию комплекса базальной пластинки и хвостового стержня бактериофага Т4 (масса комплекса 8,8 МДа) и определить расположение и взаимодействие в нём белковых субъединиц, атомная структура которых ранее определена в нашей лаборатории: пг5, пг9, пг1 1, пг12 (фрагмент), пг27, а так же определить вероятную форму и расположение остальных белковых составляющих базальной пластинки;

3. На основании полученных результатов предложить механизм действия аппарата инфицирования бактериофага Т4, включающего хвостовой чехол и базалъную пластинку.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, четырёх глав, выводов, заключения и списка литературы. Объем диссертации составляет 105 страниц, включая 27 рисунков и 3 таблицы. Список цитируемой литературы содержит 110 наименований.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые получена детальная пространственная картина важного функционального компонента сложного вируса — базальной пластинки бактериофага Т4, и предложено механистическое объяснение процесса заражения вирусом хозяйской клетки. Разработана компьютерная программа для получения реконструкций асимметричных, или имеющих низкую степень симметрии объектов, что позволит в будущем получить модели строения других вирусов и надмолекулярных биологических структур, представляющих научный и практический интерес. Полученные результаты и сведения структурного характера можно использовать, например, при конструировании молекулярных механизмов в нанотехнологии.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на Гордоновской конференции по дифракционным методам в биологии в США (Diffraction Methods in Molecular Biology Gordon Conference; Proctor Academy, Andovcr, New Hampshire, USA, 1998); на конференциях Медицинского института Говарда Хыоза в 2000, 2001, 2002 и 2004 гг (Howard Hughes Medial Institute Meeting of International Research Scholars, USA, 2000; Canada, 2001; Australia, 2002; Estonia, 2004); на конференции по сборке вирусов (XVIII Biennial Conference on Phage/Virus Assembly, USA, 2003).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 6 статей и 6 тезисов докладов.

Депонированные структурные данные

Депонированы в банк данных белковых структур PDB следующие структуры:

пг5/пг27 - коды 1К28, 1PDJ, 1PDL;

пг8 - коды 1N7Z, 1N80, 1N8B, 1PDM;

пг9 - коды 1QEX, 1S2E, 1PDP;

пг11 - коды 1EL6, IPDF;

пг12 - код 1PDI;

Реконструкция комплекса базальной пластинки и хвостового стержня депонирована в банк электронномикроскопических реконструкций (EMDB), код 1048.

Содержание диссертации

Обзор литературы посвящен принципам и методам пространственной реконструкции биологических объектов по изображениям электронной криомикроскопии. Рассмотрены как общие теоретические положения метода, так и алгоритмы практической его реализации.

Электронная криомикроскопия — один из методов электронной микроскопии, позволяющий получать изображения молекулярных объектов в аморфном льду, таких, как вирусы, клеточные органеллы и даже отдельные белки, особым образом замороженных в растворе, т.е. до заморозки находившихся в условиях, близких к естественным. Полученные изображения не содержат артефактов, возникающих при негативном контрастировании или оттеиснии объектов напылённым металлом, и передают мелкие детали объектов. С полученных изображений методами пространственной (трёхмерной) реконструкции можно получить объёмную модель исследуемого объекта с довольно высокой степенью детализации, определяемой как разрешение реконструкции.

В обзоре литературы изложены принципы формирования изображения в электронном микроскопе, представлена применяемая на практике математическая модель. Влияние волновой природы электронного пучка на получаемое изображение и учет искажений, вызываемых физическими параметрами электронного микроскопа, описывается математически посредством контрастно-частотной характеристики, учёт и компенсация влияния которой необходимы для получения реконструкций с высоким разрешением.

После съемки, оцифровки и оценки качества микрофотографий производится выделение отдельных изображений исследуемого объекта, создание исходной модели и определение параметров ориентации для каждой из выбранных проекций. В обзоре литературы описан математический аппарат одного из популярных методов трехмерной реконструкции — итерационного метода, и дан алгоритм процесса реконструкции и уточнения получаемой модели. Также описана методика встраивания атомных структур белков в реконструированные модели их комплексов, позволяющая определить с высокой точностью расположение белка в составе биологической структуры.

В заключении обзора обобщены последние достижения и обсуждаются дальнейшие возможности методов пространственной реконструкции биологических объектов по изображениям электронной криомикроскопии.

Во второй главе рассмотрены детали экспериментальной части выполненной работы. Описана процедура получения препарата комплекса базальной пластинки и хвостового стержня бактериофага Т4 для электронной криомикроскопии, оценка качества и отбор полученных изображений, подходящих для трехмерной реконструкции. Из 50 снимков только 14 были признаны годными для дальнейшей работы. Из этих 14 снимков в реконструкции применялись 5. Из отобранных микрофотографий были выделены 945 исходных проекций исследуемого комплекса. Параметры использованных микрофотографий приведены в таблице 1.

Была построена исходная модель, изображавшая базальную пластинку как плоский шестиугольник диаметром зооА и толщиной 50 (размеры были оценены по изображениям комплекса на микрофотографиях), в центре которой находился хвостовой стержень в виде

цилиндра диаметром 100 А и длиной около 500 А (хвостовой стержень был изображён не полностью, поскольку область поиска была ограничена базальной пластинкой, а вклад ди-сталыюй части хвостового стержня в формирование изображения в этой области минимален), а в вершинах шетиугольника находились цилиндрические "шипы" 100 А длиной и 30 А в диаметре. Эта модель была использована для примерной оценки параметров ориентации исходных проекций, что позволило реконструировать комплекс базальной пластинки и хвостового стержня с невысокой точностью. Результат этой реконструкции был использован как исходная модель для следующей итерации более точной оценки параметров ориентации. После примерно 20 циклов уточнения с использованием собственной компьютерной программы реконструкции получаемые параметры и модель перестали существенно изменяться, поэтому полученная реконструкция была признана окончательной, и оценка результата показала, что достигнуто разрешение 12

Поскольку были известны атомные структуры части белков (пг5, пг8, пг9, пг11, фрагмент пг12, пг27), входящих в состав базальной пластинки, было проведено встраивание их структур в полученную модель.

В третьей главе представлены полученные результаты: описан внешний вид и строение базальной пластинки и указано расположение встроенных в неё белков с известной атомной структурой.

Реконструкция показала, что базальная пластинка представляет собой отличную от существовавших ранее представлений [4] структуру, похожую на ажурный шатер (Рис 4). Он примерно 270 в высоту и 520 в диаметре вокруг основания. В центре шатра, вдоль его оси имеется иглообразная структура 105 длиной и 38 в диаметре, идентифицированная как пг5 (на рис 4 выделен сине-зелёным цветом). Обод шатра образован шестью симметричными, напоминающими стрелы фибриллярными белками, около 340 А длиной и 40 А толщиной — короткими фибриллами (фиолетовый цвет), каждая из коротких фибрилл огибает один из доменов пг! 1 (голубой), находящихся в основании "опор", составленных из пг! 0 (жёлтый) и пг7 (красный), атомные структуры которых пока не известны, но биохимические данные отводят им место именно там. Верхняя часть "шатра" содержит пг8 (синий), рядом с ним расположен пг9 (зелёный). Ещё три белка — пгб, пг25 и пг53, — выделены бежевым цветом, их структура пока не известна, и их не удалось различить в общем комплексе. В центре "крыши" находятся пг27 (бирюзовый), а так же пг48 и пг54 (сиреневый), которые также не удалось отличить друг

Таблица I: Параметры КЧХ, определённые для микрофотографий, использованных в реконструкции. Колонка "разрешение" указывает максимально возможное пространственное разрешение, при котором полезный сигнал с изображения еще наблюдается.

Код Кол-во частиц Дефокус, мкм Разрешение, А

1507 235 2,93 6,25

3183 183 2,31 7,52

3163 219 2,66 7,29

1459 183 2,62 8.62

3167 219 2,88 7,57

от друга. Спиральный хвостовой стержень, построенный из пг19 (розовый цвет), вытянут на 940 А от вершины базальной пластинки и имеет внешний диаметр 96 А и внутренний 43 А . Встраивание атомных структур белков в реконструированную модель базальной пластинки показало, что практически все они не претерпевают больших структурных изменений, во всяком случае, заметных при достигнутом разрешении.

Белок пг11 (Рис 2) необходим для присоединения коротких хвостовых фибрилл к базальной пластинке. Кристаллическая структура рекомбинантного nrl 1, активного при in vitro комплементации, была определена с разрешением в 2,0 А [13]. Атомная модель nrll содержит 208 из 218 оснований (Serl2-Ala219) Активный nrl 1 представляет собой гомотри-мер с приблизительными размерами 78 х 78 х 72 А. Место встраивания nrll в основании "опор" шатра базальной пластинки нашлось благодаря характерной форме белка. Тример белка образует нечто вроде трёхпальцевого цангового захвата, его N-концевой и пальцевый домены участвуют во взаимодействии с другим белковым компонентом, который принадлежит, по-видимому, пг10 [17]. Также один из пальцевых доменов и С-концсвой домен участвуют в присоединении коротких фибрилл, которые огибают один из пальцевых доменов nrll. Таким образом, nrll участвует в присоединении коротких фибрилл, позволяя им фиксироваться в необычном сложенном состоянии.

Структура пг9 (Рис 3) была определена с разрешением 2,3 А [12]. Пг9 — это структурный белок базальной пластинки фага Т4, к которому присоединяются длинные фибриллы [3]. Присутствие пг9 в составе базальной пластинки стабилизирует весь комплекс, не давая базальной пластинке необратимо переходить в конформацию "звезда", возникающую в процессе заражения клетки вирусм. Ещё одна функция, приписываемая пг9, заключав! ся в контроле движения длинных фибрилл в зависимости от внешних условий. Когда длинные фибриллы уже прикреплены к базальной пластинке, они могут принимать две различные конфигурации, обозначаемые как "вверх" и "вниз" [8]. В положении "вниз" длинных фибрилл способны взаимодействовать с рецепторами клеточной стенки и начинать инфицирование. При кислом рН или низкой температуре длинные фибриллы отводятся в положение "вверх" и прижимаются к хвостовому чехлу вирусной частицы. В этом случае вирус неинфекционен.

Рекомбинантный пг9, экспрессированный в клетках Е. coli, функционально активен и способен встраиваться в пг9-дефективныс частицы, превращая их в инфекционные in vitro. Функционально активный белок является SDS-устойчивым тримером.

Рис. 2: тример nrl I

Рис. З: тример пг9

Рис. 4: Комплекс БПХС, виц сбоку (стерео). Нижняя часть рисунка представляет собой комплекс в разрезе. Хвостовой стержень укорочендля экономии места. Части БПХС, соответствующие разным белкам, окрашены: сине-зелёный — пг5; красный—пг7; синий — пг8; зелёный —пг9; желтый—пгЮ; голубой—пг11; фиолетовый—пг12; бирюзовый—пг27; сиреневый— пг48/пг54; розовый—пг19; бежевый - пг6/пг25/пг53 (см текст)

Рис. 8: Изображение частей базальной пластинки, ассоциированных с пг10 (жёлтый цвет) и пг7 (красный). Также изображены атомные структуры пг8 и пг11. Плотность, соответствующая пг9, коротким фибриллам, хвостовому стержню и центральной части базальной пластинки удалена.

I / 1 < I I < \ I

«иииииццмыцмцммиу«

Рис. 9: Схематическое изображение этапов процесса инфицирования клетки фагом Т4. ф) фаг в активном состоянии, длинные фибриллы осциллируют свободно; (Ь) длинные фибриллы присоединены к поверхности хозяйской клетки, и создаваемое ими напряжение двигает весь вирус к поверхности клетки;

(ф базалышя пластинка приняла форму звезды, КХФ присоединились к поверхности, хвостовой стержень проведён внутрь клетки, происходит введение вирусной ДНК.

Рентгеноструктурные данные показывают, что пг9 представляет собой полипептидную цепь из 288 аминокислотных остатков, с общими размерами 60 х 60 х 130 А, образуя тример с тремя различными доменами: N-концевой (остатки Metl-Gln59, в котором остатки Thr2O-А1а40 образуют структуру coiled coil с двумя остатками Phe в гидрофобном коре), средний (Пе60-Рго164) и С-концевой (Alal75-Gln288).N-koHu.eBan последовательность (Met 1-Не 19) не имеет фиксированной вторичной структуры и уложена вдоль а-спиральной части. Большая часть полипептидной цепи, Ala41-Gln59, уложена таким образом, что позволяет N-концевому домену двигаться относительно остальной части белка. Средний домен является семице-почечным /^-сэндвичем. Он представляет собой уникальный белковый фолд, но не играет важной роли во взаимодействии мономеров в тримере. С-концевой домен состоит из 8 антипараллельных тяжей, по топологии укладки напоминающих структуру капсидных белков, обнаруженных в вирусах растений и животных. Остатки Metl67-Serl73 соединяют средний домен с С-концсвым доменом, образуя водородные связи между рядом лежащими мономерами и. позволяют обеспечивать подвижность доменов относительно друг друга. N-концевой и средний домены находятся на одной стороне оси третьего порядка тримера. Однако, С-концевой домен повернут вокруг оси вращательной симметрии тримера на 120° и находится под средним доменом соседнего мономера в тримере. В состав последнего домена входит кластер отрицательно заряженных аминокислотных остатков: Glu243-Thr-Glu-Glu-Asp-Glu, образующих петлю, которая, возможно, важна для связывания длинных фибрилл с пг9.

Встроить пг9 в электронную плотность базальной пластинки удалось лишь предположив, что белок в БПХС находится в нефиксированном состоянии, а значит, в реконструкции его форма будет размытой (Рис 7). Эта гипотеза подтвердилась более поздними исследованиями структур базальной пластинки в форме звезды и базальной пластинки в составе целой частицы фага.

Белок пг8 (Рис 10) является компонентом клина ба-зальной пластинки [9]. Мономер пг8 состоит из 334 остатков [14]. На стадии сборки клиньев пг8 связывается с комплексом белков (11)з • (10)з • 7, создавая сайт связывания для пгб. Порядок сборки строго определен и пг8 не формирует комплекс с пгЮ в отсутствии пг7 [18]. Структура пг8 с.разрешением 2.0 А демонстрирует двухдоменный белок, образующий димер, в котором каждый мономер состоит из трехслойного сэндвича с двумя петлями, каждая из которых содержит а-спираль на противоположной стороне сэндвича. Структуру мономера можно разделить на два домена: остатки Metl-Asp87 и Thr246-Phe334, образую- Р "е - 10: " м е Р п г 8

щие домен I и остатки Ala88-Asn245 формирующие домеи II. Поиск гомологии не показал наличия заметного сходства ни с какой структурой из банка данных PDB. Встроить белок в модель базальной пластинки было не очень сложно, он занимает место в верхней части базальной пластинки.

Короткие фибриллы - это утолщённые на конце гибкие молекулы длиной примерно 340 А [15]. В реконструкции присутствуют шесть фибриллярных структур, похожих на стрелы, растянутые вокруг вокруг обода шатра. Они похожи на изображения отдельных коротких фибрилл, опубликованные ранее Маховым и сотр [15], и в них легко встраивается атомная структура С-концевой части коротких фибрилл (Рис 5). Каждая из "стрел" согнута в середине почти под прямым углом, оборачиваясь вокруг одного из пальцевых доменов пг11, и переплетаясь друг с другом в своеобразный венок. При отсутствии коротких фибрилл базальная пластинка легко переходит в состояние "звезда" [4], принимаемое базальной пластинкой во время инфекции, поэтому их присутствие необходимо для поддержания стабильности базаль-ной пластинки. ,

Белки пг5 и пг27 (Рис 11) входят в состав центральной втулки базальной пластинки [10]. Активность лизо-цима домена пг5 базальной пластинки фага Т4 необходима для локального разрушения пептидогликанового слоя клеточной стенки на начальной стадии инфицирования. Структура комплекса пг5-пг27 отражает способ его функционирования. Тримерный комплекс пг5-пг27 формирует центральную втулку шестиугольной ба-зальной пластинки: цилиндр пг27 продолжает хвостовой стержень, затем следуют ^концевые домены пг5 и длинная заостряющаяся трехгранная призма, образованная -спиралью. Три лизоцимовых домена окружают -спираль и неактивны до начала инфицирования.

Известно [9], что в состав базальной пластинки входят, по меньшей мере, 14 различных белков. На данный момент известны атомные структуры только 6 из них, поэтому нет возможности полностью воссоздать модель базальной пластинки полностью из атомных структур. Тем не менее, основываясь на биохимических данных [21], а так же данных иммуноэлектронной микроскопии [22], можно выделить участки в структуре базальной пластинки, которые должны соответствовать тем или иным белкам.

В модели на каждой вершине имеется несоотнесенная с известными белками электронная плотность, идущая от вершины купола рядом с пг9, контактирующая с пг8, и затем идущая к пг11 (Рис 8). Части этой плотности, имеющей в поперечном сечении вид треугольника, можно отнести к тримеру пг10. Этот предполагаемый домен пг10 взаимодействует с тремя пальцевыми доменами пг11, ^концом одной молекулы короткой фибриллы и С-концевой "стрелой" другой короткой фибриллы. Область неидентифицированной плотности имеет размер примерно 280 кДа, и ее можно соотнести с тремя копиями пгЮ и одной копией пг7.

Белки пг54 (35 кДа) и пг48 (40 кДа) необходимы для сборки хвостового стержня и

ы

Рис. 11: тримеры пг5 и пг27

чехла [10]. Присоединение пг48 происходит раньше, чем присоединение пг54 к базальной пластинке [11]. Известно, что пг48 формирует платформу диаметром около 100 А на вершине базальной пластинки, тогда как прикрепление пг54 к базальной пластинке не изменяет ее морфологии согласно электронномикроскопическим данным [11]. Таким образом, плотность на вершине и на внешней поверхности купола в месте присоединения хвостового стержня и чехла к базальной пластинке, может быть отнесена к пг54 и пг48 (Рис 4). Объём плотности позволяет предположить, что ассоциированные мономеры должны иметь размер около 33 кДа, что вполне согласуется с наличием или пг48, или пг54. Этот белок связывает конец хвостового стержня с вершиной цилиндра, образованного пг27.

Белки, не вписанные в базальную пластинку: пгб (молекулярная масса 74 kDa, 6 или 12 копий на базальную пластинку), пг25 (молекулярная масса 5.1 kDa, 6 копий на базальную пластинку) и пг53 (молекулярная масса 23 kDa, 6 копий на базальную пластинку). Вычитание плотности всех известных белков из реконструкции базальной пластинки дает общий объем, соответствующий молекулярной массе в 166 кДа на одну асимметрическую часть. Различить отдельные белки в этом объёме не представлается возможным. Неинтерпретированные белки, в частности, формируют платформу на вершине базальной пластинки, похожую на слой субъединиц хвостового чехла, образуя сайт сборки хвостового чехла.

Хвостовой стержень - это цилиндрическая полая спиральная структура, имеющая симметрию 6 порядка и состоящая из 23 колец толщиной 40,8 А, повёрнутых на 17,7° относительно друг друга [16]. Это количество субъединиц пг19 отличается от принятого ранее — 24 [2].

В четвертой главе обсуждаются полученные результаты и предлагается модель инфицирования фагом Т4 бакгериальной клетки.

Использование в работе собственной компьютерной программы реконструкции и созданного в лаборатории компьютерного кластера дало возможность более тонко и эффективно управлять процессом реконструкции. Эта программа будет незаменима при реконструкции ещё более сложных структур, таких, как целая частица бактериофага Т4, где, помимо внушительных размеров, есть сочетание субъединиц с различной внутренней вращательной симметрией — 5 порядка у капсида и 6 порядка у хвоста. С помощью этой программы нами уже выполнена реконструкция нативного (растянутого) хвоста целого бактериофага Т4, осуществленная на основе реконструированной базальной пластинки. Данная реконструкция подтверждает, в частности, верность выбранного положения и ориентации пг9 в общей структуре базальной пластинки.

Крайне полезными для интерпретации полученной модели ПБХС оказалось наличие атомных структур части её белковых компонентов — пг5, пг8, пг9, nrl 1, пг12, пг27. Возможность определить их расположение в общей структуре и сведения биохимического характера, полученные за долгую историю изучения бактериофага Т4, позволили нам предложить механизм инфицирования данного вируса, который, по-видимому, во многом сходен с принципом работы инфицирующих аппаратов многих ДНК-содержащих бактериофагов.

Инфицирование начинается с распознавания длинными фибриллами фага липополисаха-ридных рецепторов на поверхности клетки, специфичных для Е. coli (Рис 9). При контакте

с рецепторами происходит обратимое связывание дистальных частей длинных фибрилл. После того, как минимум три фибриллы из шести нашли рецепторы, сигнал об их связывании передаётся в базальную пластинку [6], причем важную роль в передаче этого сигнала играет пг9, присоединяющий длинные фибриллы к базальной пластинке. По-видимому, сигналом является механическое напряжение в базальной пластинке, создаваемое зафиксированными на поверхности клетки длинными фибриллами и передаваемое через гибкую структуру пг9 (Рис 9,Ь).

После получения этого сигнала происходит разворачивание венка коротких фибрилл внизу базальной пластинки и вытягивание их С-концевых доменов в направлении поверхности клетки, которое происходит вместе с "раскрыванием" базальной пластинки на манер зонтика Тримсры nrl 1, удерживавшие короткие фибриллы, поднимаются вверх и, по-видимому, связываются с длинными фибриллами (Рис 9,с) Дистальныс С-концевые домены коротких фибрилл связываются с липополисахаридными рецепторами клетки и фиксируют вирус в примерно 300 А от поверхности (Рис 9,с), В результате расширения и фиксации базальная пластинка становится практически плоской и более широкой, около 600 А. В результате расширения базальной пластинки происходит, во-первых, сокращение хвостового чехла, который сжимается, подобно пружине, и толкает хвостовой стержень сквозь базальную пластинку; во-вторых, от базальной пластинки отделяется центральная втулка (пг5-пг27-пг48-пг54), в результате чего возникает отверстие, сквозь которое проходит хвостовой стержень. В процессе сокращения чехол скручивается, проворачивая хвостовой стержень относительно базальной пластинки примерно на один оборот против часовой стрелки. Полученная система напоминает "буровую установку": под давлением, создаваемым сокращающимся чехлом, хвостовой стержень и находящийся на его конце иглоподобный комплекс пг5-пг27 проникает сквозь клеточную стенку, затем домены лизоцима пг5 расщепляют пептидогликановый слой, после чего диссоциируют с хвостового стержня, который сквозь пептидогликановый слой подводится к клеточной мембране. Далее, вероятно, гидрофобное кольцо,' образованное тримером пг27, внедряется в мембрану, образуя таким образом канал для введения ДНК вируса из капсида в цитоплазму инфицируемой клетки.

Такое механистическое описание процесса инфицирования и полученная структурная информация могут быть проверены генетическими исследованиями для подтверждения принципов и уточнения деталей работы машины инфицирования бактериофага Т4

Цитируемая литература

1. Atas L, KLg A Thmdimmacricl mage leccnsliucticns cf Ihe contractile tail cf T4 baclcncphap J Md Ed,r1S75 - Ш 99. - P. 51-64

2 GCcmts D, Arrëka F. T4 lai structure and finclOn /Mdeofer bioCgy cfbactercphage T4. -Wftgm, DG, 1994^ P. 259-281.

3. Crowther R. A. Mutants ofbacteriophagp T4 that produce infective fbreless particles. Ill Mcl Biol. - 1980. - Vol. 137. - P. 159-74.

4. Crowther R. A., Lenk E. V, Kikuchi Y, King J. Molecular reorganization in the hexagon to star transition ofthe baseplate ofbacteriophage T4. Ill Mol Biol. - 1977. - Vol. 116. - P. 489-523.

5. Fokine A., Chipman P., Leiman P., Mesyanzhinov V, Rao V, Rossmann M Molecular architecture of the prolate head of bacteriophage T4. //Proc Natl Acad Sci USA.- 2004. -Vol. 101.-P. 6003-8.

6. Goldberg E., Grinius L., Letellier L Recognition, attachment, and injecton Molecular biology ofbacteriophage T4. - Washington, D. C, 1994, - P. 347-356.

7. Karam J. D., editor. Molecular biology ofbacteriophage T4 - Washington, DC, 1994.

8. Kellenberger E., Bolle A., Boy de la Tour E., Epstein R. H., Franklin N. C, Jerne N. K., Reale-ScaM A., Sechaud J., Bendet I., Goldstein D., Laufler M A. Function and properties related to the tail fibers ofbacteriophage T4. //Virology. - 1965. - Vol. 26. - P. 419-440.

9. Kikuchi Y, King J. Assembly of the tail of bacteriophage T4. Ill Supramol Struct. -1975.

- Vol. 3. - P. 24-38.

10. Kikuchi Y, King J. Genetic control ofbacteriophage T4 baseplate morphogenesis. III. Formation ofthe central plug and overall assembly pathway. Ill Mol Biol. -1975. - Vol. 99. - P. 695-716.

11. King J. Bacteriophage T4 tail assembly: four steps in core formation. Ill Mol Biol. - 1971.

- Vol. 58. - P. 693-709.

12. Kostyuchenko V A., Navruzbekov G. A., Kurochkina L P., Strelkov S. V, Mesyanzhinov V V, Rossmann M. G. The structure ofbacteriophage T4 gene product 9: the trigger for tail contraction. //Structure Fold Des. - 1999. - Vol. 7. - P. 1213-22.

13. Leiman P. G., Kostyuchenko V A., Shneider M M., Kurochkina L P., Me^anzhinov V. V, Rosmann M G. Structure ofbacteriophage T4 gene product 11, the interface between the baseplate and short tail fibers. Ill Mol Biol. - 2000. - Vol. 301. - P. 975-85.

14. Leiman P., Shneider M., Kostyuchenko V, Chipman P., Mesyanzhinov V, Rosmiann M. Structure and location of gene product 8 in the bacteriophage T4 baseplate. Ill Mol Biol. -2003. -Vol. 328.-P. 821-33.

15. Makhov A., Trus B., Conway J., Simon M., Zurabishvili T., Mesyanzhinov V, Steven A. The short tail-fiber ofbacteriophage T4: molecular structure and a mechanism for its conformational transition. //Virology. - 1993. - Vol. 194. - P. 117-27.

16. Moody M., Makowski L. X-ray difraction study of tail-tubes Horn bacteriophage T2L. Ill Mol Biol. - 1981. - Vol. 150. - P. 217-44.

17. Plishker M., Bcrget P. Isolation and characterization of precursors in bacteriophage T4 baseplate assembly. III. The carboxyl termini of protein PI 1 are required for assembly activity. Ill Mol Biol. - 1984. - Vol. 178. - P. 699-709.

18. Plishker M., Rangwala S., Beget P. Isolation of bacteriophage T4 baseplate proteins P7 and P8 and in vitro formation of the P10/P7/P8 assembly intermediate. //J Virol. - 1988. - Vol. 62. -P. 400-6

19. Rossmann M , Mesyanzhnov V, Arisaka F, Leiman P. The bacteriophage T4 DNA injection machine. //Curr Opin Struct Biol. - 2004. - Vol. 14. - P. 171-80.

20. Smith P., Aebi U. Studies of the structure of the T4 bacteriophage tail sheath. I. The recovery of three-dimensional structural information fom the extended sheath. Ill Mol Biol. - 1976. -Vol. 106. -P. 243-71.

21. Watts N., Coombs D. Structure ofthe bacteriophage T4 baseplate as determined by chemical cross-lmking. Ill Virol. - 1990.' - Vol. 64. -P.' 143-54.

22. Watts N.. Hainfeld J., Coombs D. Localization of the proteins gp7, gp8 and gplO in the bacteriophage T4 baseplate with colloidal gold; F(ab)2 and undecagold: Fab' conjugates. Ill Mci Biol. - 1990. - Vol. 216. - P. 315-25.

Список опубликованных статей по теме диссертации

1. Kostvuchcnko У. A.. Leiman P. G., Chipman P. R., Kanamaiu S., van Raaij M.J., Aiisaka R, Mesyanzhinov V. V., Rossmatm M. G. Three-dimensional stiucture ofbactciiophagc T4 baseplate //Nat Struct Biol. - 2003. - Vol. 10. - P. 688-693.

2. Leiman P.G., Shneider M.M., Kostyuchenko VA.. Chipman P.R., Mesyanzhinov VV, Rossmann M.G. Structure and location of gene product 8 in the bacteriophage T4 baseplate IIJMol Biol.

- 2003. - Vol. 328. - P. 821-833.

3. Kanamaru S., Leiman P.G., Kostvuchenko VA.. Chipman P.R., Mesyanzhinov W, Arisaka F., Rossmann, M.G. Structure of the cell-puncturing device ofbacteriophage T4 //Nature. — 2002. - Vol. 415. - P. 553-557.

4. Leiman P.G., Kostvuchenko VA.. Shneider M.M., Kurochkina L.P., Mesyanzhinov VV, Rossmann, M.G. Structure ofbacteriophage T4 gene product 11, the interface between the baseplate and short tail fibers. IIJMol Biol. - 2000. - Vol. 301. - P. 975-985.

5. Наврузбеков ГА, Курочкина Л. П., Косгюченко В. А.. Зурабишвили Т. Г., Веньяминов С. Ю. Месянжинов В. В. Структура и фодпинг продукта гена 9 бактериофага Т4, контролирующего процесс инфицирования. I. Получение и свойства рекомбинантного белка. //Биохимия. - 1999. - том 64. - С. 1266-1272.

6. Kostyuchenko VA. Navruzbekov GA, Kurochkina L.P., Strelkov S.V., Mesyanzhinov VV, Rossmann, M.G.(1999). The structure ofbacteriophage T4 gene product 9: the trigger for tail contraction. //Structure FoldDes. - 1999. - Vol. 7. - P. 1213-1222.

Отпечатано в »эпицентре Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stpiint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел. 939-3338 Заказ № 44 тираж 100 экз. Подписано в печать 28.06.2004 г.

Рукопись и макет автореферата подготовлены с помощью программных пакетов ЬуХ и КПвХ2£.

Выводы диссертации

1. Разработана компьютерная программа для трёхмерной реконструкции сложных надмолекулярных объектов по данным изображений электронной криомикроскопии, позволяющая реконструировать большие комплексы.

2. Осуществлена пространственная реконструкция комплекса базалыюй пластинки и хвостового стержня бактериофага Т4 (молекулярный вес 8,8 МДа) с разрешением 12 А. Базальная пластинка построена из 15 продуктов генов, и имеет форму ажурного шатра, 270 А высотой и диаметром 520 А в основании. Хвостовой стержень представляет собой трубку 940 А длиной, внешний диаметр 96 А и внутренний 43 А. Стержень построен из 23 колец гексамеров пг19 40.8 А высотой, с относительным поворотом между соседними кольцами в 17,7°.

3. Определено расположение белковых компонентов базальной пластинки с известной атомной структурой: пг5, пг8, пг9, пгЮ, nrll, пг12 и пг27. Предложены вероятные места нахождения и форма белков с не известной на данный момент структурой: пг7 и пгЮ. Отмечено, что в базальной пластинке структуры белковых компонентов не претерпевают заметных изменений по сравнению с их кристаллическими структурами, и что, по-видимому, регуляция сборки комплекса осуществляется за счёт последовательного возникновения новых сайтов взаимодействующих субъединиц.

4. На основании полученных структурных данных предложена модель инициации инфицирования бактериофагом Т4 хозяйской клетки Escherichia coli.

Р 163 1 i

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Костюченко, Виктор Анатольевич

1 Введение

1.1 Актуальность проблемы

1.2 Цели и задачи работы.

1.3 Научная новизна и практическая ценность работы

2 Обзор литературы

2.1 Методы пространственной реконструкции.

2.2 Подготовка и съёмка образцов в ЭКМ

2.3 Формирование изображения в электронном микроскопе

2.4 Предварительная обработка и оценка качества получен пых данных .21)

2.5 Подготовка исходных проекций.V)

2.6 Определение параметров ориентации проекций

2.7 Реконструкция.М

2.8 Разрешение. Оценка качества реконструкции.виду

2.9 Встраивание атомных структур субъединиц в реконструированную модель.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура аппарата инфицирования бактериофага T4"

1.1 Актуальность проблемы

Знание структуры вирусов и особенностей их формирования необходимо для разработки новых эффективных подходов в борьбе с вирусными инфекциями. Вирусы также являются удобной экспериментальной модельной системой для изучения механизмов ассоциации белковых субъединиц, которая может помочь в понимании процессов формирования сложных биологических структур клетки, таких как ядерные поры, цептриоли, жгутики, компоненты мышечных филами пои н др. Вирусы разделяют на группы в соответствии со способом хранения генетической информации, например, одно- или двунитевая ДНК или РНК, и их устройством: палочкообразные, нитчатые, сферические, сложные с хвостом, сферические с внешней липидной оболочкой и внутренним белковым нуклеокапсидом и так далее [9]. Простейшие вирусы типа сателлитного вируса некроза табака (СВНТ), геном которого кодирует всего один белок [105], имеют икосаэдрическую форму и сравнительно маленькие размеры — диаметр капсида СВНТ всего 180 А [32].

Одними из самых сложных по строению вирусов являются шк называемые хвостатые бактериофаги — представители отряда Ccnul<>vii\ilcs фаги, имеющие способный сокращаться хвост, относятся к еемисшу 1 4

500 Л

1 \ tell \ \

КЛг! \ la I :jzc

4 Т 4 -i.HSttplfjte

- Tüll sheath

Рис. I : Бактериофаг Т4 . а) криоэлектронная микрофотография; б) схематическая модель. Рисунок взят из [78].

Myoviridae. Один из них, бактериофаг Т4 [36], инфицирующий бактерию Escherichia coli, является одним из основных модельных объектов молекулярной биологии. Частица бактериофага Т4 (рис. I) состоит из двух основных частей — капсида (головки), содержащего двух цепочечную геномную ДНК размером 172 тысячи пар оснований [63], и хвоста, который присоединён к камсиду через специальный портал на одной из вершин с симметрией 5-го порядка. Капсид фага Т4, около 850 Л в поперечнике и 1150 Л длиной, удлинён вдоль оси, проходящей через хвост и портал, и построен из большого числа копий белков пг23 (930 копий), пг24 (55 копий), hoc (от "highly antigenic outer capsid", 155 копий) и soc (от "small outer capsid", 810 копий) [24]. Портал содержит 12 копий белка пг20[20].

Сократимый хвост состоит из трёх частей: шейки, хвостового с тержня, па котором собран сократимый хвостовой чехол, и базальной пластинки. К шейке, построенной из гексамеров пг15, пг13 и/или пг14, присоединены "воротничок" и "бакенбарды", состоящие из тримеров белка фибритина (птос); воротничок по-видимому, содержит также один из белков пг13 или пг14.

Основную часть хвоста занимает сократимый хвостовой чехол и расположенный внутри него хвостовой стержень. Чехол построен из пг18, а стержень из пг19. Завершает хвост базальная пластинка - многокомпонентная молекулярная структура диаметром около 520А и высотой в 270 а, состоящая из 16 различных белков, практически каждый из которых является олигомером. В состав базальной пластинки входят пг5, пгб, пг7, пг8, пг9, пгЮ, пг11, пг12, пг25, пг26, пг27, пг29, пг48, пг53, и пг54. К базальной пластинке присоединены длинные хвостовые фибриллы, построенные из пг34, пг35, пгЗб и пг37. Таким образом, одних только структурных белков в частице фага имеется более тридцати, не считая белков, связанных с упакованной внутри капсида ДНК, вспомогательных скаффолд-белков и белков-шаперонов (табл. 1 на с. И).

Процесс сборки частицы бактериофага Т4 — достаточно сложный, многостадийный процесс [23, 40-43]. Сборка капсида с последующей упаковкой в него геномной ДНК происходит независимо от сборки хвоста. Постройка хвоста (рис. 2) начинается с образования базальной пластинки, которая, в свою очередь, формируется из семи субъединиц: шести клиньев и центральной втулки, собирающихся одновременно и независимо друг от друга. Сборка клина начинается с формирования комплекса белков 7 — Юз — Из, к которым присоединяются белки пгб и пг8 [68-70]. Затем присоединяются белки пг53 и пг25 [91]. Центральная втулка образуется из тримеров пг5, пг27 и пг29 с помощью вспомогательных белков пг26 и пг28. Шесть клиньев собираются вокруг центральной втулки, образуя предшественник базальной пластин

Head

Initiation Complex

Membrane«»« « •

930x gp23

9P31i ^ 55 * gp24 \ (flp20),ä ' [0P401 ? gp21,ep22,gp67.gp68: IP1 1PII, 1PW, 8P alt u 4 v\> ар,0Ь gp7 (ЯР®)» sp2s ys-.^рг

9Р» V"

-w:

Tail f- . N

3*gp28 !gp26. flp28, flpST] вр1вИ9р)7), ОЫА

Ч У

-tV - #

ЗШ- у дв

Prohead protege acKvatkm: gp21—-T4 PPaw Cleavage of prohead proteins Dissociation from membrane

3*Qpl2[gp57AI i Short tail fiber \6

J e*gp48 îsÎpf 6 » gp54 y m» NI

Head capsid f'/^i I ' ь t ■ i - • '« tSS xepftoc (ДО24"),

810*gpsoe gphoc ••

V OP soc ^ (зргзг : 11 ^ Expansion вРШЦвр.^-'.еГр ' CepieUgpUL AOP + P.

DNA.

9P2C)u -SP2, SP4. flplî, OPl* gp й-лс) '

0p24"V-BP Лос gp soc (SP23-), 4 i j je? •'¿2-*'"

ЫИ»йй» Na

S.ÎÏ A».««

8P83J ■ v t'l;.^ t/y ' < «s

Long tail fiber

Long tail fibers t.-3xflp34 [gpSJAJ

3 хдрЗТ t9p38. gp57A) 3 x gp36-^ rflp3s;

Рис. 2: Порядок сборки вирусной частицы. Рисунок взят из [78] ки. На этом этапе, по-видимому, в базальную пластинку встраиваются пг9 (сайты присоединения длинных фибрилл) и пг12 (короткие фибриллы). Затем добавляются шесть копий пг48 и пг54, образующие сайт инициации сборки хвостового стержня и чехла. Стержень образуется из молекул пг19, полимеризующихся, как считается, вокруг пг29, задающего длину собранного стержня. Вместе со стержнем идёт сборка хвостового чехла из пг18, для которого стержень служит матрицей, вынуждающей пг18 принимать конформацию, соответствующую растянутому состоянию чехла. На вершине хвостового стержня располагается фиксирующий его кольцеобразный гексамер пгЗ, взаимодействующий, по-видимому, с пг29 [99]. К пгЗ присоединяется гексамер пг15, образующий шейку [107]; затем к пг15 присоединяются пг13, пг14 и фибритин [6, 88], образующие воротничок и бакенбарды [10].

Сборка капсида начинается с образования на клеточной мембране специального комплекса инициации, состоящего из прикреплённого к мембране вспомогательного белка пг40, к которому прикрепляется портал, образованный белком пг20 [20]. Далее на портале выстраивается прокапсид, содержащий комплекс белков пг21 (зимоген протеиназы), пг22, пг67, пг68 и некоторых других, образующих внутреннее ядро, вокруг которого собирается прокапсид из белков пг23 (основной белок капсида) и пг24, формирующий пентамерные вершины. Затем происходит активация протеолитической активности пг21 [30, 39], приводящая к полному расщеплению внутреннего ядра, а пг23 и пг24 подвергаются частичному протеолизу, образуя белки пг23* и пг24% что индуцирует увеличение объёма капсида [31]. Далее капсид диссоциирует с клеточной мембраны и к порталу присоединяется комплекс белков пг16 и пг17, представляющих собой специальный аппарат для упаковки ДНК в собранный капсид [53]. Процесс упаковки сопровождается гидролизом одной молекулы АТР до АДР на каждую пару оснований упаковываемой ДНК и завершается при полном заполнении капсида. Затем капсид покрывается сеткой белков hoc и soc, взаимодействующих с пг23*. К капсиду с упакованной ДНК прикрепляется хвост, к которому затем присоединяются длинные фибриллы, завершающие сборку вирусной частицы, способной инфицировать клетку.

С помощью электронной микроскопии с применением негативного контрастирования удалось, в общих чертах, представить строение вируса. Хвостовой чехол бактериофага Т4 в растянутом состоянии явился первой биологической структурой, для которой была проведена трёхмерная реконструкция [17]. Затем были получены трёхмерная реконструкция сокращённого хвоста [3] и растянутого хвоста с данных ЭКМ [84], а также была предложена двухмерная модель базальной пластинки [15]. Но выполнить пространственную реконструкцию вирусной частицы целиком удавалось, в основном, лишь для сравнительно простых сферических вирусов, поскольку отсутствовали необходимые вычислительные мощности и не были до конца разработаны методики реконструкции. В настоящее время, с совершенствованием электронно-микроскопической техники и доступностью высокопроизводительных компьютерных систем, задача реконструировать частицу бактериофага Т4 с околоатомным разрешением представляется выполнимой.

Таблица 1: Белки в составе частицы бактериофага Т4 (по данным из

36] с поправками). продукт гена размер, а/о Кол-во копий Расположение

3 176 6 шейка

5 575 3 центральная втулка

6 660 6 или 12 базальная пластинка

7 1032 6 базальная пластинка

8 334 12 базальная пластинка

9 288 18 базальная пластинка

10 602 18 базальная пластинка

11 219 18 базальная пластинка

12 527 18 базальная пластинка

13 309 неизвестно воротничок/бакенбарды

14 256 неизвестно воротничок/бакенбарды

15 272 6 шейка

18 659 138 хвостовой чехол

19 163 138 хвостовой стержень

20 524 12 капсид

23 521 930 капсид

24 427 55 капсид

25 132 6 базальная пластинка

27 391 3 центральная втулка

29 590 — регулятор длины хвоста

34 1289 18 длинные фибриллы

35 275 6 длинные фибриллы

36 221 18 длинные фибриллы

37 1026 18 длинные фибриллы

48 364 6 базальная пластинка

53 196 6 базальная пластинка

54 320 6 базальная пластинка

SOC 80 810 капсид hoc 376 155 капсид wac 486 18 воротничок/бакенбарды

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Костюченко, Виктор Анатольевич

Выводы

1. Разработана компьютерная программа для трёхмерной реконструкции сложных надмолекулярных объектов по данным изображений электронной криомикроскопии, позволяющая реконструировать большие комплексы.

2. Впервые осуществлена пространственная реконструкция комплекса базальной пластинки и хвостового стержня (молекулярный вес 8,8 МДа) бактериофага Т4 с разрешением 12 а. Базальная пластинка, построенная из 15 продуктов генов, имеет форму ажурного шатра, 270 а высотой и диаметром 520 а в основании шатра. Хвостовой стержень — канал для введения ДНК вируса в клетку, — представляет собой трубку 940 а длиной и имеет внешний диаметр 96 а и внутренний 43 а. Трубка построена из 23 колец — гексамеров пг19, — 40.8 а высотой, с относительным поворотом между последовательными кольцами в 17,7 градусов.

3. Определено расположение белков базальной пластинки с известной атомной структурой: пг5, пг8, пг9, пгЮ, пг11, пг12 и пг27. Предложены вероятные места нахождения и форма белков с не известной на данный момент структурой: пг7 и пгЮ. В базальной пластинке структуры белковых компонентов не претерпевают заметных изменений по сравнению с их кристаллическими структурами, и, по-видимому, регуляция сборки комплекса осуществляется за счёт последовательного создания новых сайтов взаимодействия субъединиц.

4. На основании полученных структурных данных предложена модель инициации инфицирования бактериофагом Т4 хозяйской клетки Escherichia coli.

Благодарности

Выражаю искреннюю признательность и благодарность моему научному руководителю Вадиму Викторовичу Месянжинову за внимание, помощь и поддержку в осуществлении данной работы. I am very grateful to Dr. Michael Rossmann for advice and support. Я признателен Петру Лейману за помощь на всех стадиях нашей совместной работы, в частности, за его огромный вклад в создание иллюстративного материала диссертации. Благодарю Евгения Тищенко за помощь в оформлении диссертации.

Рукопись диссертации подготовлена с помощью программных па кетов LyX и

Заключение

Изучение функционирования сложных биологических объектов, таких, как бактериофаг Т4, как и научные исследования вцелом — непрерывно эволюционирующий процесс, где, казалось бы установленные факты постоянно проверяются, уточняются, подтверждаются или опровергаются, либо объясняются по-новому.

Изучение генома бактериофага Т4 Escherichia coli, основного модельного объекта молекулярной биологии и одного из самых распространенных генетических доменов биосферы являлось исходным предметом исследований лаборатории молекулярной биоинженерии ИБХ РАН, где выполнялась данная диссертационная работа. В лаборатории были впервые определены последовательности ДНК большого региона поздних генов (гены 6, 7, 8, 9, 10, И, 12, wac, 13, 14, 15, 20, 22) [60, 61, 71-73, 80-82], кодирующих структурные белки частицы Т4. Дальнейшей целью этих исследований является выяснение структурных основ формирования сложных биологических структур и вирусов, а также молекулярных механизмов инфекционности вируса.

На следующем этапе, в котором я принял участие, были начаты структурные исследования, и были установлены кристаллические структуры нескольких белков базальной пластинки [35, 47, 51, 52].

Представленная в данной работе детальная пространственная структура аппарата инфицирования — базальной пластинки [46], — включает в себя практически все накопленные структурные данные, и позволяет выйти на новый уровень — с помощью дальнейших генетических и структурных исследований подтвердить или опровергнуть предложенный механизм инфицирования бактериофага Т4.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Костюченко, Виктор Анатольевич, Москва

1. Abuladze N. K., Gingery M., Tsai J., Eiserling F. A. Tail length determination in bacteriophage T4. //Virology. - 1994. - Vol. 199.- P. 301-10.

2. Adrian M., Dubochet J., Lepault J., McDowall A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. //Nature. 1984. - Vol. 308. - P. 32-36.

3. Amos L., Klug A. Three-dimensional image reconstructions of the contractile tail of T4 bacteriophage. //J Mol Biol. 1975. - Vol. 99.-P. 51-64.

4. Baker T., Olson N., Fuller S. Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs. //Microbiol Mol Biol Rev. 1999.- Vol. 63. P. 862-922, table of contents.

5. Booth C. R., Jiang W., Baker M. L., Zhou Z. H., Ludtke S. J., Chiu W. A 9 A single particle reconstruction from CCD captured images on a 200 kV electron cryomicroscope. //Journal of Structural Biology. -2004. Vol. 147. - P. 116-127.

6. Boudko S., Strelkov S., Engel J., Stetefeld J. Design and crystal structure of bacteriophage T4 mini-fibritin NCCF. //J Mol Biol. -2004. Vol. 339. - P. 927-35.

7. Caspar D. L. D., Klug A. Physical Principles in the Construction of Regular Viruses. //Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1962.- Vol. 27. P. 1-24.

8. Chacon P., Wriggers W. Multi-resolution contour-based fitting of macromolecular structures. //J Mol Biol. 2002. - Vol. 317. - P. 37584.

9. Chiu W., Burnett R. M., Garcea R. L. Structural Biology of Viruses- Oxford University Press, 1997.

10. Conley M., Wood W. Bacteriophage T4 whiskers: a rudimentary environment-sensing device. //Proc Natl Acad Sci USA.- 1975.- Vol. 72. P. 3701-5.

11. Conway J., Cheng N., Zlotnick A., Wingfield P., Stahl S., Steven A. Visualization of a 4-helix bundle in the hepatitis B virus capsid by cryo-electron microscopy. //Nature. 1997. - Vol. 386. - P. 91-4.

12. Conway J., Duda R., Cheng N., Hendrix R., Steven A. Proteolytic and conformational control of virus capsid maturation: the bacteriophage HK97 system. //J Mol Biol. 1995. - Vol. 253. - P. 86-99.

13. Conway J. F., Steven A. C. Methods for reconstructing density maps of "single"particles from cryoelectron micrographs to subnanometer resolution. //J Struct Biol. 1999. - Vol. 128. - P. 106-18.

14. Coombs D., Arisaka F. T4 tail structure and function /Molecular biology of bacteriophage T4. Washington, DC, 1994, - P. 259-281.

15. Crowther R. A., Lenk E. V., Kikuchi Y., King J. Molecular reorganization in the hexagon to star transition of the baseplate of bacteriophage T4. //J Mol Biol. 1977. - Vol. 116. - P. 489-523.

16. Crowther R. A. Mutants of bacteriophage T4 that produce infective fibreless particles. //J Mol Biol. 1980. - Vol. 137. - P. 159-74.

17. DeRosier D., Klug A. Reconstruction of three-dimensional structures from electron micrographs. //Nature. 1968. - Vol. 217. - P. 130-134.

18. DeRosier D., Moore P. Reconstruction of three-dimensional images from electron micrographs of structures with helical symmetry. //J Mol Biol. 1970. - Vol. 52. - P. 355-69.

19. Dong W., Baird T., Fryer J., Gilmore C., MacNicol D., Bricogne G., Smith D. J., O'Keefe M., Hovmollerm S. Electron microscopy at 1-a resolution by entropy maximization and likelihood ranking. //Nature.- 1992. Vol. 355. - P. 605-609.

20. Driedonks R., Caldentey J. Gene 20 product of bacteriophage T4. II. Its structural organization in prehead and bacteriophage. //J Mol Biol.- 1983. Vol. 166. - P. 341-60.

21. Duda R. L., Gingery M., Eiserling F. A. Potential length determiner and DNA injection protein is extruded from bacteriophage T4 tail tubes in vitro. //Virology. 1986. - Vol. 151. - P. 296-314.

22. Edgar R., Lielausis I. Some steps in the assembly of bacteriophage T4. //J Mol Biol. 1968. - Vol. 32. - P. 263-76.

23. Ferguson P., Coombs D. Pulse-chase analysis of the in vivo assembly of the bacteriophage T4 tail. //J Mol Biol. 2000. - Vol. 297. -P. 99-117.

24. Fokine A., Chipman P., Leiman P., Mesyanzhinov V., Rao V., Rossmann M. Molecular architecture of the prolate head of bacteriophage T4. //Proc Natl Acad Sci USA.- 2004. Vol. 101.- P. 6003-8.

25. Frank J., Radermacher M., Penczek P., Zhu J., Li Y., Ladjadj M., Leith A. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. //J Struct Biol. 1996. -Vol. 116. - P. 190-9.

26. Frank J. Electron microscopy of functional ribosome complexes. //Biopolymers. 2003. - Vol. 68. - P. 223-33.

27. Gabashvili I., Agrawal R., Spahn C., Grassucci R., Svergun D., Frank J., Penczek P. Solution structure of the E. coli 70S ribosome at 11.5 A resolution. //Cell. 2000. - Vol. 100. - P. 537-49.

28. Goldberg E., Grinius L., Letellier L. Recognition, attachment, and injecton. /Molecular biology of bacteriophage T4. Washington, D. C., 1994,-P. 347-356.

29. GrigoriefF N. Resolution measurement in structures derived from single particles. //Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000. -Vol. 56 ( Pt 10). - P. 1270-7.

30. Hintermann E., Kuhn A. Bacteriophage T4 gene 21 encodes two proteins essential for phage maturation. //Virology. 1992. - Vol. 189.- P. 474-82.

31. Jardine P., Coombs D. Capsid expansion follows the initiation of DNA packaging in bacteriophage T4. //J Mol Biol. 1998. - Vol. 284. -P. 661-72.

32. Jones T., Liljas L. Structure of satellite tobacco necrosis virus after crystallographic refinement at 2.5 A resolution. //J Mol Biol. 1984.- Vol. 177. P. 735-67.

33. Jones T., Zou J., Cowan S., Kjeldgaard . Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. //Acta Crystallogr A. 1991. - Vol. 47 ( Pt 2). -P. 110-9.

34. Kanamaru S., Gassner N., Ye N., Takeda S., Arisaka F. The C-terminal fragment of the precursor tail lysozyme of bacteriophage T4 stays as a structural component of the baseplate after cleavage. //J Bacteriol.- 1999. Vol. 181. -P. 2739-44.

35. Kanamaru S., Leiman P., Kostyuchenko V., Chipman P., Mesyanzhinov V., Arisaka F., Rossmann M. Structure of the cell-puncturing device of bacteriophage T4. //Nature. 2002. - Vol. 415.- P. 553-7.

36. Karam J. D., editor. Molecular biology of bacteriophage T4 -Washington, DC, 1994.

37. Kellenberger E., Stauffer E., Haner M., Lustig A., Karamata D. Mechanism of the long tail-fiber deployment of bacteriophages T-even and its role in adsorption, infection and sedimentation. //Biophys Chem. 1996. - Vol. 59. - P. 41-59.

38. Keller B., Bickle T. The nucleotide sequence of gene 21 of bacteriophage T4 coding for the prohead protease. //Gene. 1986.- Vol. 49. P. 245-51.

39. Kikuchi Y., King J. Assembly of the tail of bacteriophage T4. //J Supramol Struct. 1975. - Vol. 3. - P. 24-38.

40. Kikuchi Y., King J. Genetic control of bacteriophage T4 baseplate morphogenesis. III. Formation of the central plug and overall assembly pathway. //J Mol Biol. 1975. - Vol. 99. - P. 695-716.

41. Kikuchi Y., King J. Genetic control of bacteriophage T4 baseplate morphogenesis. II. Mutants unable to form the central part of the baseplate. //J Mol Biol. 1975. - Vol. 99. - P. 673-94.

42. Kikuchi Y., King J. Genetic control of bacteriophage T4 baseplate morphogenesis. I. Sequential assembly of the major precursor, in vivo and in vitro. //J Mol Biol. 1975. - Vol. 99. - P. 645-72.

43. King J., Mykolajewycz N. Bacteriophage T4 tail assembly: proteins of the sheath, core and baseplate. //J Mol Biol. 1973. - Vol. 75.- P. 339-58.

44. King J. Bacteriophage T4 tail assembly: four steps in core formation. //J Mol Biol. 1971. - Vol. 58. - P. 693-709.

45. Kostyuchenko V., Leiman P., Chipman P., Kanamaru S., van Raaij M., Arisaka F., Mesyanzhinov V., Rossmann M. Three-dimensional structure of bacteriophage T4 baseplate. //Nat Struct Biol. 2003. - Vol. 10. - P. 688-93.

46. Kostyuchenko V. A., Navruzbekov G. A., Kurochkina L. P., Strelkov S. V., Mesyanzhinov V. V., Rossmann M. G. The structure of bacteriophage T4 gene product 9: the trigger for tail contraction. //Structure Fold Des. 1999. - Vol. 7. - P. 1213-22.

47. Leapman R., Kocsis E., Zhang G., Talbot T., Laquerriere P. Three-dimensional distributions of elements in biological samples by energy-filtered electron tomography. //Ultramicroscopy. 2004. - Vol. 100. -P. 115-25.

48. Leiman P., Chipman P., Kostyuchenko V., Mesyanzhinov V., Rossmann M. Three-dimensional rearrangement of proteins in the tail of bacteriophage t4 on infection of its host. //Cell. 2004. -Vol. 118.-P. 419-429.

49. Leiman P., Kanamaru S., Mesyanzhinov V., Arisaka F., Rossmann M. Structure and morphogenesis of bacteriophage T4. //Cell Mol Life Sci. 2003. - Vol. 60. - P. 2356-70.

50. Leiman P., Shneider M., Kostyuchenko V., Chipman P., Mesyanzhinov V., Rossmann M. Structure and location of gene product 8 in the bacteriophage T4 baseplate. //J Mol Biol. 2003. - Vol. 328. - P. 82133.

51. Leiman P. G., Kostyuchenko V. A., Shneider M. M., Kurochkina L. P., Mesyanzhinov V. V., Rossmann M. G. Structure of bacteriophage T4gene product 11, the interface between the baseplate and short tail fibers. //J Mol Biol. 2000. - Vol. 301. - P. 975-85.

52. Lin H., Rao V., Black L. Analysis of capsid portal protein and terminase functional domains: interaction sites required for DNA packaging in bacteriophage T4. //J Mol Biol. 1999. - Vol. 289.- P. 249-60.

53. Li B., Wang H., Yang J., Hou J. High-resolution scanning tunneling microscopy for molecules. //Ultramicroscopy. 2004. - Vol. 98.- P. 317-34.

54. Ludtke S., Baldwin P., Chiu W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. //J Struct Biol. 1999.- Vol. 128. P. 82-97.

55. Ludtke S., Chen D., Song J., Chuang D., Chiu W. Seeing GroEL at 6 A Resolution by Single Particle Electron Cryomicroscopy. //Structure (Camb). 2004. - Vol. 12. - P. 1129-36.

56. Makhov A., Trus B., Conway J., Simon M., Zurabishvili T., Mesyanzhinov V., Steven A. The short tail-fiber of bacteriophage T4: molecular structure and a mechanism for its conformational transition. //Virology. 1993. - Vol. 194. - P. 117-27.

57. Marabini R., Herman G., Carazo J. 3D reconstruction in electron microscopy using ART with smooth spherically symmetric volume elements (blobs). //Ultramicroscopy. 1998. - Vol. 72. - P. 53-65.

58. Marabini R., Masegosa I., San Martin M., Marco S., Fernandez J., de la Fraga L., Vaquerizo C., Carazo J. Xmipp: An Image Processing

59. Package for Electron Microscopy. //J Struct Biol. 1996. - Vol. 116.- P. 237-40.

60. Marusich E., Mesyanzhinov V. Nucleotide and deduced amino acid sequences of bacteriophage T4 gene 22. //Nucleic Acids Res. 1989.- Vol. 17. P. 8865.

61. Marusich E., Mesyanzhinov V. Nucleotide and deduced amino acid sequences of bacteriophage T4 gene 20. //Nucleic Acids Res. 1989. -Vol. 17.-P. 7514.

62. McRee D. E. XtalView/Xfit A Versatile Program for Manipulating Atomic Coordinates and Electron Density. //J. Struct Biol. - 1999. -Vol. 125.-P. 156-165.

63. Miller E., Kutter E., Mosig G., Arisaka F., Kunisawa T., Ruger W. Bacteriophage T4 genome. //Microbiol Mol Biol Rev. 2003. -Vol. 67. - P. 86-156.

64. Moody M., Makowski L. X-ray diffraction study of tail-tubes from bacteriophage T2L. //J Mol Biol. 1981. - Vol. 150. - P. 217-44.

65. Nakagawa H., Arisaka F., Ishii S. Isolation and characterization of the bacteriophage T4 tail-associated lysozyme. //J Virol. 1985. - Vol. 54.- P. 460-6.

66. Penczek P., Zhu J., Frank J. A common-lines based method for determining orientations for N > 3 particle projections simultaneously. //Ultramicroscopy. 1996. - Vol. 63. - P. 205-18.

67. Penczek P., Radermacher M., Frank J. Three-dimensional reconstruction of single particles embedded in ice. //Ultramicroscopy.- 1992. Vol. 40.-P. 33-53.

68. Plishker M., Berget P. Isolation and characterization of precursors in bacteriophage T4 baseplate assembly. III. The carboxyl termini of protein Pll are required for assembly activity. //J Mol Biol. 1984.- Vol. 178. P. 699-709.

69. Plishker M., Rangwala S., Berget P. Isolation of bacteriophage T4 baseplate proteins P7 and P8 and in vitro formation of the P10/P7/P8 assembly intermediate. //J Virol. 1988. - Vol. 62. - P. 400-6.

70. Prilipov A., Mesyanzhinov V., Aebi U., Kellenberger E. Cloning and sequencing of bacteriophage T4 genes between map positions 128.3130.3. //Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18. - P. 3635.

71. Prilipov A., Selivanov N., Efimov V., Marusich E., Mesyanzhinov V. Nucleotide sequences of bacteriophage T4 genes 9, 10 and 11. //Nucleic Acids Res. 1989. - Vol. 17. - P. 3303.

72. Prilipov A., Selivanov N., Nikolaeva L., Mesyanzhinov V. Nucleotide and deduced amino acid sequence of bacteriophage T4 gene wac. //Nucleic Acids Res. 1988. - Vol. 16. - P. 10361.

73. Prince F., Buttle K. Mitochondrial structure in steroid-producing cells: Three-dimensional reconstruction of human Leydig cell mitochondriaby electron microscopic tomography. //Anat Rec. 2004. - Vol. 278A.- P. 454-61.

74. Rossmann M., Bernai R., Pletnev S. Combining electron microscopic with x-ray crystallographic structures. //J Struct Biol. 2001. -Vol. 136. - P. 190-200.

75. Rossmann M., Blow D. The detection of subunits in the crystallographic asymmetric unit. //Acta Crystallographica. 1962. -Vol. 15. - P. 24-31.

76. Rossmann M., Johnson J. Icosahedral RNA virus structure. //Annu Rev Biochem. 1989. - Vol. 58. - P. 533-73.

77. Rossmann M., Mesyanzhinov V., Arisaka F., Leiman P. The bacteriophage T4 DNA injection machine. //Curr Opin Struct Biol. -2004. Vol. 14. - P. 171-80.

78. Rossmann M. Fitting atomic models into electron-microscopy maps. //Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000. - Vol. 56 ( Pt 10).- P. 1341-9.

79. Selivanov N., Prilipov A., Efimov V., Marusich E., Mesyanzhinov V. Cascade of overlapping late genes in bacteriophage T4. //Biomed Sci.- 1990. Vol. 1.-P. 55-62.

80. Selivanov N., Prilipov A., Mesyanzhinov V. Nucleotide and deduced amino acid sequence of bacteriophage T4 gene 12. //Nucleic Acids Res. 1988. - Vol. 16. - P. 2334.

81. Selivanov N., Prilipov A., Mesyanzhinov V. Nucleotide sequences of bacteriophage T4 genes 13, 14 and 15. //Nucleic Acids Res. 1989. - Vol. 17. - P. 3583.

82. Skoglund U., OfVerstedt L., Burnett R., Bricogne G. Maximum-entropy three-dimensional reconstruction with deconvolution of the contrast transfer function: a test application with adenovirus. //J Struct Biol. 1996. - Vol. 117. - P. 173-88.

83. Smith P., Aebi U. Studies of the structure of the T4 bacteriophage tail sheath. I. The recovery of three-dimensional structural information from the extended sheath. //J Mol Biol. 1976. - Vol. 106. - P. 243-71.

84. Sorzano C., Marabini R., Boisset N., Rietzel E., Schroder R., Herman G., Carazo J. The effect of overabundant projection directions on 3D reconstruction algorithms. //J Struct Biol. 2001. - Vol. 133. -P. 108-18.

85. Squyres J. M., Lumsdaine A. A Component Architecture for LAM/MPI. //.Proceedings, 10th European PVM/MPI Users' Group Meeting, number 2840 in Lecture Notes in Computer Science, -P. 379-387, Venice, Italy, September / October 2003. Springer-Verlag.

86. Stowell M., Miyazawa A., Unwin N. Macromolecular structure determination by electron microscopy: new advances and recent results. //Curr Opin Struct Biol. 1998. - Vol. 8. - P. 595-600.

87. Strelkov S., Tao Y., Shneider M., Mesyanzhinov V., Rossmann M. Structure of bacteriophage T4 fibritin M: a troublesome packing arrangement. //Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1998. - Vol. 54 ( Pt 5). - P. 805-16.

88. Subramaniam S., Hirai Т., Henderson R. From structure to mechanism: electron crystallographic studies of bacteriorhodopsin. //Philos Transact Ser A Math Phys Eng Sci. 2002. - Vol. 360. - P. 859-74.

89. Suzuki H., Yonekura K., Namba K. Structure of the rotor of the bacterial flagellar motor revealed by electron cryomicroscopy and single-particle image analysis. //J Mol Biol. 2004. - Vol. 337.- P. 105-13.

90. Szewczyk В., Bienkowska-Szewczyk K., KozlofF L. Identification of T4 gene 25 product, a component of the tail baseplate, as a 15K lysozyme. //Mol Gen Genet. 1986. - Vol. 202. - P. 363-7.

91. Tao Y., Zhang W. Recent developments in cryo-electron microscopy reconstruction of single particles. //Curr Opin Struct Biol. 2000.- Vol. 10. P. 616-22.

92. Toyoshima C., Unwin N. Contrast transfer for frozen-hydrated specimens: determination from pairs of defocused images. //Ultramicroscopy. 1988. - Vol. 25. - P. 279-91.

93. Unger V. Electron cryomicroscopy methods. //Curr Opin Struct Biol. -2001. Vol. 11.-P. 548-54.

94. Vianelli A., Wang G. R., Gingery M., Duda R. L., Eiserling F. A., Goldberg E. B. Bacteriophage T4 self-assembly: localization of gp3 and its role in determining tail length. //J Bacteriol. 2000. - Vol. 182.- P. 680-8.

95. Watts N., Coombs D. Analysis of near-neighbor contacts in bacteriophage T4 wedges and hubless baseplates by using a cleavable chemical cross-linker. //J Virol. 1989. - Vol. 63. - P. 2427-36.

96. Watts N., Coombs D. Structure of the bacteriophage T4 baseplate as determined by chemical cross-linking. //J Virol. 1990. - Vol. 64.- P. 143-54.

97. Watts N., Hainfeld J., Coombs D. Localization of the proteins gp7, gp8 and gplO in the bacteriophage T4 baseplate with colloidal gold: F(ab)2 and undecagold: Fab' conjugates. //J Mol Biol. 1990. -Vol. 216. - P. 315-25.

98. Wood W., Conley M. Attachment of tail fibers in bacteriophage T4 assembly: role of the phage whiskers. //J Mol Biol. 1979. - Vol. 127. -P. 15-29.

99. Wriggers W., Milligan R., McCammon J. Situs: A package for docking crystal structures into low-resolution maps from electron microscopy. //J Struct Biol. 1999. - Vol. 125. - P. 185-95.

100. Ysebaert M., van Emmelo J., Fiers W. Total nucleotide sequence of a nearly full-size DNA copy of satellite tobacco necrosis virus RNA. //J Mol Biol. 1980. - Vol. 143. - P. 273-87.

101. Zhao L., Kanamaru S., Chaidirek C., Arisaka F. P15 and P3, the tail completion proteins of bacteriophage T4, both form hexameric rings. //J Bacteriol. 2003. - Vol. 185. - P. 1693-700.

102. Zhou Z., Dougherty M., Jakana J., He J., Rixon F., Chiu W. Seeing the herpesvirus capsid at 8.5 A. //Science. 2000. - Vol. 288. - P. 877-80.

103. Zhu P., Chertova E., Bess J., Lifson J., Arthur L., Liu J., Taylor K., Roux K. Electron tomography analysis of envelope glycoprotein trimers on HIV and simian immunodeficiency virus virions. //Proc Natl Acad Sci USA.- 2003. Vol. 100. - P. 15812-7.