Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стохастическая модель динамики неконъюгативных бактериальных плазмид с учетом особенностей клеточного цикла бактерий

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Стохастическая модель динамики неконъюгативных бактериальных плазмид с учетом особенностей клеточного цикла бактерий"

Ои344634У

Стохастическая модель динамики неконъюгативных бактериальных плазмид с учетом особенностей клеточного

цикла бактерий

03 00 02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико - математических наук

Красноярск - 2008

2 2 СЕН 2003

003446349

Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН

Научный руководитель доктор биологических наук

Брильков А. В

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук

Садовский М. Г кандидат биологических наук Межевикин В В

Ведущая организация Институт математических проблем

биологии РАН

Защита состоится 2008 г в на заседании

диссертационного совета Д 003 007 01 при Институте биофизики СО РАН по адресу

660036, г. Красноярск, Академгородок тел +7(3912)431579, e-mail ibp@ibp ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН

Автореферат разослан ^ » ^^ 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Франк J1 А

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В настоящее время значительный интерес в микробиологии и биотехнологии представляет исследование плазмид-содержащих штаммов микроорганизмов с точки зрения сохранения их свойств при длительном культивировании В многочисленных экспериментальных исследованиях было показано, что нестабильность плазм ид-содержащих штаммов резко возрастает при низких скоростях роста в хемостате Одной из причин этого феномена может быть возрастание эффективности экспрессии плазмидных генов при снижении скорости роста за счет снятия катаболитной репрессии промоторов клонированных генов при лимитировании роста источниками углерода и энергии Однако, существует целый ряд экспериментальных данных, свидетельствующих о возрастании селективного коэффициента даже при постоянной экспрессии Поэтому, изучение внутриклеточных механизмов приводящих к такого рода динамике, является необходимым и весьма актуальным для поиска путей повышения стабильности генно-инженерных плазмидсодержащих штаммов

В случае патогенных бактерии до сих пор единственным методом снижения резистентности является поиск новых форм антибактериальных препаратов, к которым еще не существует соответствующих резистив-ных плазмид Однако, этот подходы к проблеме плазмид-об> словленной резистентности не решает проблему ее снижения (или элиминации) у соответствующих штаммов микроорганизмов Поэтому, представляется актуальным изучение механизмов популяционной и внутриклеточной динамики плазмид с целью прогнозирования путей повышения антибиоти-кочувствительности популяции патогенных бактерии

Целью работы является разработка стохастической модели популяционной динамики неконъюгативных бактериальных плазмид с учетом особенностей клеточного цикла бактерий для оценки стоимости плазмид при изменении селективных условий

Методы исследования В работе использовалось математическое

моделирование на основе вероятностных подходов к описанию конкурирующих систем Построены математические модели клеточного цикла на основе методов комбинаторного анализа, обыкновенных дифференциальных уравнений и теории вероятностей Для исследования популяци-онной динамики плазмид использовалась аппроксимация одношаговым процессом с последующим выводом уравнения Фоккера-Планка Для решения этого уравнения вблизи стационарного состояния был применен подход Бюргесса Основные результаты расчетов были сравнены с соответствующими экспериментальными данными

Научная новизна.

1. Предложен вероятностный подход, который впервые связывает метаболическую нагрузку плазмид с определенным клеточным механизмом - динамикой белка, инициирующего репликацию хромосомы Данный подход позволяет исследовать влияние числа плазмидных белок -кодирующих генов и эффективности их экспрессии на продолжительность клеточного цикла плазмидсодержащих клеток

2. Модель впервые позволила объяснить эффект возрастания селективного преимущества бесплазмидных клеток в случае низких скоростей роста при неизменной эффективности экспрессии плазмидных генов

3. Построенная модель динамики плазмид в популяции впервые позволила связать макроскопически наблюдаемый эффект стабильности плазмид с внутриклеточными причинами метаболической нагрузки этих молекул Показано, что время элиминации плазмид из популяции зависит от отношения числа молекул-ингибиторов и молекул-инициаторов репликации плазмид

Положения, выносимые на защиту.

1. Возрастание селективного преимущества бесплазмидных штаммов при низких скоростях роста бактерий в хемостате (возрастание популя-ционной стоимости плазмид) является следствием наличия в этом случае дополнительного (предрепликативного) периода клеточного цикла бактерий

2. При кратковременном изменении уровня селективного фактора, система, описывающая поведение плазмидсодержащей популяции бактерий, возвращается к изначальному состоянию в виде процесса Орнштей-на - Уленбека Время релаксации к стационарному состоянию пропорциональна отношению числа молекул-ингибиторов и молекул-инициаторов репликации плазмид Изменение инициирующего уровня БпаА в клетках плазмидсодержащих бактерий влияет на скорость релаксации возмущенной системы Увеличенная концентрация молекул-ингибиторов инициации репликации плазмид увеличивает скорость элиминации плазмид из бактериальной популяции

Практическая ценность. Результаты исследования, касающиеся увеличения селективного преимущества бесплазмидных клеток могут быть использованы при культивировании рекомбинантных штаммов микроорганизмов с целью отбора или создания стабильных вариантов Данные исследования динамики плазмид при кратковременном изменении селективного фактора могут быть востребованы в медицине при поиске новых методов терапии инфекционных заболевании, вызванных резистентными штаммами микроорганизмов

Апробация работы. Результаты работы докладывались на

1 XXXV Научной конференции студентов, аспиранюв и молодых ученых-физиков (Красноярск, 2006),

2. XIII Международном симпозиуме «Сложные системы в экстремальных условиях» (Красноярск, 2006),

3. I Международной конференции «Математическая биология и биоинформатика» (Пущино, 2006),

4. на конференциях молодых ученых в институте биофизики СО РАН

Публикации По результатам работы опубликовано 8 работ Из них 3 статьи в центральных журналах, 5 тезисов докладов на конференциях

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения 4 глав, включающих заключение с выводами и списка литературы Работа

изложена на 101 странице машинописного текста Список литературы включает 102 источника

Основное содержание работы

Плазмиды представляют собой экстрахромосомные молекулы ДНК, чаще всего кольцевидной формы Они наделяют клетку рядом дополнительных функций, отсутствующих у бесплазмидных вариантов, например, устойчивостью к антибиотикам Так же плазмиды широко применяются в биотехнологии для создаггая рекомбинантных штаммов, продуцирующих биологически активные вещества Размер их варьирует в широком диапазоне значений - от нескольких тысяч до нескольких сот тысяч пар оснований Плазмидам нужны ресурсы клетки-хозяина для экспрессии их генов Прежде всего это белоксинтезирующая система -рибосомы и тРНК (Maal0e & Kjeldgaard, 1966) Поэтому, поддержание в клетке дополнительного генетического материала приводит к энергетическим и структурным затратам Эта «метаболическая» нагрузка на плазмидсодержащую клетку, при отсутствии селектирующего фактора среды приводит к потере неконъюгативных плазмид из популяции из-за более медленной скорости роста плазмидсодержащих штаммов относительно бесплазмидных (Zund & Lebek, 1980, Brilkov & Ganusov, 2002) Поддержание определенного числа плазмид обеспечивается специфическим механизмом, который заключается в конкуренции двух видов молекул за места связывания в ori-сайтах плазмид - ингибитора и инициатора репликации (Ehrenberg, 1996, Ehrenberg & Paulson, 1998)

С другой стороны, для стабильного наследования плазмиды должны успеть реплицироваться достаточное количество раз за время клеточного цикла Поэтому, время генерации клетки является основным параметром клетки-хозяина, определяющим временные рамки при рассмотрении репликации плазмид на протяжении одного клеточного цикла Клеточный цикл является ключевой характеристикой при описании закономерностей развития клеточных популяций Он разделяется на три периода (Cooper, 1968) С - репликативный, D - пострепликативный и необяза-

тельный В - предрепликативпыи Репликативныи период начинается с процесса инициации репликации хромосомы в опС-сайте Для этого необходимо наличие «репликатора» (опС-сайта) и достаточного количества молекул «инициатора» (белка БпаА) На протяжении пострепликатив-ного периода происходит расхождение прореплицировавшихся хромосом и последующее деление клетки В случае, если продолжительности С и Т) периодов достаточно, чтобы накопилось пороговое количество молекул БпаА, наступает следующий цикл Если накопление происходит медленно и суммарной продолжительности недостаточно, то после деления, дочерней клетке (С- и Б-периоды конечны независимо от скорости роста и скорости накопления инициирующего белка (МюЬекеп et а1 2003)) необходимо накопить необходимое количество БпаА на протяжении следующего, предрепликативного периода

Настоящее исследование можно условно разделить на две части - исследование клеточных механизмов, влияющих на стабильность плазмид и на непосредственное исследование динамики плазмид на популяцион-ном уровне В основу первой части положено предположение о конкуренции хромосомных и плазмидных мРНК за рибосомы Данный механизм реализуется через моделирование динамики БпаА- при наличии в клетке плазмид, конкуренция за рибосомы сильнее, чем в их отсутствие, и, как следствие, скорость накопления инициирующего белка (БпаА) плаз-мидсодержащей клеткой должна быть меньше, чем бесплазмидной, а, значит, инициирующий уровень БпаА в такой клетке достигается позже Так как время накопления этого уровня сильно коррелированно с продолжительностью клеточного цикла, можно найти взаимосвязь удлинения времени генерации илазмидсодержащей клетки с числом плазмид и с эффективностью экспрессии их белок-кодирующих генов Найденная в первой части продолжительность клеточного цикла, далее используется для исследования стабильности плазмидсодержащих штаммов с учетом конкуренции молекул-ингибиторов и иннициаторов репликации плазмид за оп-сайты этих молекул

«w 1sхЗ \i/

ö(p

Псы

rguRp Rehr + Rpl

Рис 1 Процесс синтеза БпаА в бесплазмидпой и плазмидсодер-жащей клетках В присутствии в клетке плазмид, конкуренция мРНК за рибосомы усиливается, что приводит к увеличению времени накопления БпаА до порогового уровня

Конкурентная модель накопления DnaA

rd r 1 Процесс связывания "Z^ мРНК с рибосомами в терминах теории вероятностей можно опи-П сать следующим обра-

$ § S I ф0113* зом (Рис 1} Пусть

Rehr - число белок-кодирующих генов хромосомы Число транскрибированных мРНК будет пропорционально этому параметру (общее количество мРНК) Эти мРНК случайным образом распределяются по г рибосомам При этом из Rchr мРНК Rd являются «особыми» - те, что кодируют DnaA В этом случае мы имеем классическую ситуацию распределения Rchr шаров (мРНК), Rd из которых «особые», по г ящикам (рибосомам) При наличии плазмидных белок-кодирующих генов, по тем же г ящикам будет распределяться уже число мРНК, равное сумме хромосомных и плазмидных молекул Rch-r -Ь Rpi (также на рисунке обозначены /х - скорость роста бактериальной клетки, ß - эмпирическая константа) Такая ситуация может быть описана посредством гипергеометрического распределения В процессе исследования было показано, что ввиду особенностей моделируемого процесса (г —> оо, Rd/Rehr 0), связывания мРНК с рибосомами можно олиииъ с помощью нормального распределения

р(к, t) = N (m(t)А±, y/m{t)A±(l + А*))

(1)

Здесь pik, t) - плотность вероятности синтеза к молекул DnaA за время t, m(t) - параметр, характеризующий интенсивность связываний мРНК с рибосомами, а Х^ - среднее число синтезируемых при связывании молекул DnaA в плазмидсодержащей (+) или в бесплазмидной (-) клетке

Модель продолжительности клеточного цикла плазмидсо-держащих и бесплазмидных клеток

Время накопления порогового количества DnaA определяет время генерации клетки (Boye & Nordst/om, 2003) Поэтому, зная вероятность накопления порогового уровня DnaA (S) и вероятность инициации репликации на этом пороговом уровне, можно найти и время генерации В ходе исследования было показано, что вероятность инициации репликации хромосомы при накоплении DnaA до порогового уровня может быть описана с помощью распределения в виде функции Хэвисайда

р(к) = е(к- s) (2)

Вероятность инициации репликации во время i, было найдено посредством свертки вероятности того, что ко времени t накопится к молекул DnaA (1) с вероятностью того, что это количество вызовет инициацию репликации хромосомы (2) (здесь и далее индекс + будет использоваться для плазмидсожержащих клеток, а — для бесплазмидных)

Pft)* = J™ N (mit) А=\ y/m(t) Л±(1 + А±)) • в (к - S)dk, (3)

Рис 2 Распределение плотности вероятности времени накопления инициирующего белка p(t) = 3,P(i) у бесплазмидного (сплошная линия) и плазмидсодержащего штаммов Е coli для 2-х типов плазмид При наличии в клетке плазмид происходит сдвиг распределения в сторону ббльших значений t, пропорциональный количеству плазмидных генов, кодирующих белок (N Rpi) Rpi -число белок-кодирующих генов в плазмиде, N - число плазмид, а = 390

Расчет «стоимости» плазмид

К одному из преимуществ представленного в данной работе подхода можно отнести возможность оценки метаболической нагрузки плазмид, основываясь на определенном клеточном механизме В частности, метаболическая нагрузка оценивается преимущественно по значению коэффициента селективности а = ^ , где и fi~ - скорости роста плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов соответственно К настоящему времени уже существует множество свидетельств возрастания селективного коэффициента при замедлении скорости роста клеток (скорости протока среды в хемостате) (Godwin & Slater, 1979) Настоящий подход позволяет оценить это явление, основываясь на особенностях накопления инициирующего белка на протяжении различных периодов клеточного цикла

При исследовании было показано, что в терминах средних величин, синтез DnaA может быть описан как

■tbchr

где = г ¡5 ц Здесь N - число плазмид, 7 - эмпирический параметр, кр - скорость элонгации полипептидной цепи, d - размер молекулы DnaA (число аминокислот) Особого внимания заслуживает параметр / - эффективность экспрессии плазмидных белок-кодирующих генов В данной работе под эффективностью экспрессии понимается отношение числа плазмидных мРНК к хромосомным f{p) = Оно сильно

варьирует в зависимости от вида плазмиды, находящейся в клетке и от условий, в которых эта клетка существует Эти значения специфичны и должны рассчитываться для каждого вида плазмид с учетом конкретных промоторов плазмидных генов Поэтому, в работе использовались экспериментальные данные для учета изменения параметра

Важно различать случаи быстрого и медленного роста клеток При быстром росте (время удвоения tdoub < клеточный цикл состоит

только из С и Б периодов. Максимальные их продолжительности в среднем составляют Стах = 40[тт] и Отах = 20[тгп]. Если клетка не успевает накопить пороговое количество БпаА (Р±) за время этих периодов, она делится и входит в В период, который продолжается пока пороговый уровень не будет достигнут. В данном случае имеет место случай медленного роста {Ь^иЪ >

Быстрый рост клетки (t¿oub < 1[

300

* 250

(1)

ir 200

U-

+ 150

<

ra г 100

О

50

С D ,

/ ,

//

//

//

/ У

/У At

/у

Л

/У

у?

2V„

<

1.2 1.4

При отсутствии плазмид, клетка достигает порогового уровня DnaA = 5 ко времени, равном времени генерации tgen = Плазмид-

содержащая клетка не сможет достичь это-

Рис. 3: Накопление DnaA (на графике DnaA + ATPinew)) бес- pg ПОРОГОВОГО уровня плазмидной (сплошная линия) и плазмидсодержащей (пунктир)

клетками на протяжении клеточного цикла при быстром росте. За ТО Же самое Время

Каждая клетка накапливает белок до порогового уровня. Из-за ^

более медленного накопления, это значение достигается плазмид- И3-3а ООЛее Медленной содержащей клеткой с запозданием Д4, которое зависит от числа СЮТООСТИ накопления

плазмидных белок-кодирующих генов, присутствующих в клет- "

ке. V(t) - объем клетки. Поэтому процесс на-

копления того же количества инициирующего белка займет большее время (t~en + At). Ввиду этого имеем:

0.2 0.4 0.6 0.Í t[h]

ДD

^(W+aí) _ i) = Zifi)^- (2^ - l) ;

Rehr + f N Rp

Решая это уравнение относительно Аt и подставляя это значение в (р — А(х)(igen + Аt) = 1, получаем:

a fast

In 1 + fNR„ i 2 R

In 2 + fNRvi' R

(4)

Из (4) следует, что селективный коэффициент a fast не зависит от ß

при условии постоянства эффективности экспрессии плазмидных генов. Такал ситуация маловероятна в реальных исследованиях. Подставляя / = /(м) в виДе функции, возрастающей при замедлении скорости роста (катаболитная репрессия) мы получаем возрастание селективного коэффициента при снижении скорости роста. Таким образом, изменение эффективности экспрессии плазмидных генов относительно хромосомных с изменением скорости роста может быть одним из механизмов, отвечающих за «стоимость» плазмид и ее возрастание при увеличении времени генерации. Однако, такой механизм является не единственной причиной этого явления. Ниже будет показано, что при медленных скоростях роста селективный коэффициент возрастает даже при / = const.

Медленный рост клетки (tdoub > Ш])

300 ^250

s

g 200 ST

И 150 <

+

< 100 (0

о 50

В С D , ■

Threshold level

/ //

At х: /У

* —»

у/

0.5

1.5

2у В случае медленного роста клетки, динамика инициирующего белка будет иметь более сложный характер из-за наличия дополнительного (предре-пликативного) периода цикла, следующего за делением по происшествии Стах и Отах

<

V,

Рис. 4: Накопление DnaA (на графике DnaA + ATP{new)) бес-плазмидной (сплошная линия) и плазмидсодержащей (пунктир) клетками на протяжении клеточного цикла при медленном росте (tjaub > 1[Ч). Динамика объема клетки показана разряженным иериоДОВ В терминах штнктипом. После инициэпии ШаА начинает накапливаться со * скоростью, пропорциональной скорости роста клеточного объе- обозначенных ма, но из-за низкой скорости накопления, уровень этого белка не успевает достигнуть порогового (на графике Threshold level) Процесс в течение максимальных продолжительностей С и D периодов. После деления инициирующий белок продолжает накапливаться с низкой скоростью, начиная с уровня, равного половине от накопленного во время Стах + Dmax — l[7i] периодов, пока не достигнет порогового значения.

выше, накопления, обозначенный на (Рис. 4), можно описать как:

Rl

Rd

i ~¿r~

i+^mai)

-1 +

,+At)

- 1

'Rchr + fNRpl

Следует учесть, что сумма длительности всех периодов составляет время накопления: Стах + Dmax + te = tdoub = ln 2 tgen = ln 2//¿. Используя тот же подход, что и в случае быстрого роста, получим asiow — Дд/yU из уравнения (¡л — Д/л)(1//г + Дt) = 1:

In

&slovj

1 +

fNRP,

Rehr

1

21-t"M( Стаж+Dmai)g-(ln 2)¿ l-(-2/i(Cmaa:-,-í>Tntíx)

In

2 + 2

fNRpl

1 -

(5)

ЯеЬг V 1+2 «(Ст^+Отат)

Сравнение селективных коэффициентов при различных скоростях роста (Рис. 5) показывает, что при низких скоростях этот параметр возрастает даже если положить эффективность экспрессии плазмидных генов постоянной. Кроме того, оба селективных коэффициента демонстрируют возрастание, пропорциональное увеличению числа плазмидных генов в клетке.

0.1

0.08

о.ое

0.04

Slow growth Fast growtn

2

1

0.5

i

1.5

Рис. 5: Зависимость селективных коэффициентов от скорости роста бесплазмидной клетки при быстром (4) и медленном (5) росте. Первоначально постоянный (а/0л), селективный коэффициент начинает расти с уменьшением скорости роста (ая10ги) даже при условии, что изменение эффективности экспрессии плазмидных генов не учитывается (/ = 1). 1 - ЛЛр! — 500, 2 - = 1000.

Модель динамики плазмид в популяции бактерий.

Стабильность плазмидсодержащих штаммов, резистентных к антибиотикам является одним из наиболее значимых вопросов в медицинской микробиологии Особо остро эта проблема стоит в случае невозможности заменить группу антибиотика в силу особенностей заболевания (например, при наличии у больного аллергической реакции на другие группы бактерицидных препаратов) До настоящего времени подобные проблемы изучаются преимущественно на популяционном уровне, без учета внутриклеточных механизмов устойчивости (Creager, 2007) Предполагается, что представленная ниже модель, будучи основанной на динамике инициирующего белка БпаА, будет полезна для понимания стабильности резистентных штаммов

В популяции будет всегда существовать распределение клеток по количеству плазмид поскольку существует распределение времени, при котором возможны репликации (т е времени клеточного цикла (3)) Поэтому, каждая бактерия может развиваться от цикла к циклу по одному из двух возможных путей потеря плазмид или увеличение их количества В первом приближении будем считать, что количество плазмид с каждым шагом увеличивается или уменьшается на одну Поэтому, мы будем описывать эту динамику в виде одношагового процесса (Рис б)

Рис 6 Представление динамики плазмид в виде одношагового процесса X - количество плазмид в данном состоянии, г(х) - вероятность потери одной копии плазмиды, д(х) - вероятность увеличения количества плазмид на 1 Переход осуществляется через дискретные промежутки времени - время между двумя последовательными делениями

В ходе исследования было показано, что вероятность увеличения числа плазмид может быть описана в виде экспоненциальной функции-д(х) = е~к*х Из условия нормировки д(х) + r{x) = 1 получаем вероятность уменьшения числа плазмид r{x) = 1 — е~кдХ Параметр кд,

физический смысл которого можно охарактеризовать как способность связывания молекулы-ингибитора репликации с соответствующим сайтом плазмиды, имеет ключевое значение в дальнейшем исследовании Он представляет собой отношение числа молекул-ингибиторов репликации плазмид Rj к числу молекул-инициаторов этого процесса R//

Схеме, показанной на (Рис 6) соответствует уравнение Фоккера-Планка для одношаговых процессов

= [В1Шх> *)] + [D2(x)p(x, t)] (6)

Здесь р(х, t) распределение вероятности нахождения х плазмид в клетке во время t, Di (х) = 2ё~кяХ — 1 является коэффициентом дрейфа (сноса) распределения, а £>2 (я) = 1 коэффициентом диффузии

Множитель /х-1 представляет среднее время генерации плазмидсодер-жащей клетки, которое может быть найдено из полученного ранее соотношения (3) как

roo

/Г1 = {{tgen)+) = / dtP(t)+ tdt JO

При решении полученного уравнения (6) использовался подход, заключающийся в поиске решения поведения системы около положения равновесия, найденное из условия равенства в этой точке функций увеличения и уменьшения числа плазмид g(xeq) = r(xeq) В итоге было показано, что система, будучи выведенной из положения равновесия на некоторую величину в (те число плазмид изменится на в копий), воз-ращается обратно согласно закону Орнштейна-Уленбека (Рис 7)

Однако, для практических целей необходимо иметь количественную оценку временных масштабов, на которых происходит релаксация При этом существует дополнительное условие — не всегда возможно исключить само присутствие селективного фактора К примеру, при лечении воспалительных заболеваний, в случае возникновения резистентности и, как следствие перехода заболевания из острой формы в хроническую, можно лишь заменить группу антибиотиков (возможно менее эффективную в этом случае), но не прекратить лечение вовсе Это означает,

что в дальнейшем мы не будем учитывать присутствие бесплазмидных клеток, так как в этом случае их не будет.

За меру времени ре; лаксации выберем вре-0.4 ■ I мя, при котором вели-0 : /л чина первоначального

смещения уменьшается в е раз то = (кд ¡л)~х. Параметр кд = к-^ ( «

эмпирическая констан--20 -ю о ю 20 ч

в та) является определя-

Рис. 7: Релаксация плотности вероятности нахождения + 0 ЮЩИМ При релаксации

плазмид в клетке во времени р[в, 4) к стационарному значению в системы К ПОЛОЖеНИЮ х'л = 0 (отмечено пунктиром).

равновесия.

Данные расчетов при различных скоростях роста плазмидсодержащих клеток в зависимости от числа молекул-ингибиторов (Рис. 8) и молекул

-инициаторов репликации плазмид показывают различную динамику времени релаксации при варьировании каждого из этих параметров. Такое

раздельное рассмотре-0 100 200 300 400 500

я ние данных величин

„ „ , . обусловлено, прежде

Рис. 8: Время релаксации (в сутках) первоначального смещения ^

с во Д,о в = 90/е в зависимости от числа молекул-ингибиторов всего, ПОПЫТКОЙ Пред-репликации плазмид при различных скоростях роста плазмид-

содержащей клетки. 1 - ц = 1[Л-1], 2 - у. = 0.5[А-1], 3 - ЛОЖИТЬ Практический М = О.Ц/Г1].

путь к снижению стабильности резистентных к антибиотикам штаммов микроорганизмов посредством ускорения элиминации плазмиднесущих клеток. Можно предположить, что, изменяя число Л/, например, блокируя их синтез

или ускоряя распад, существует возможность влиять на стабильность резистентных штаммов в популяции

Кроме этого, необходимо учесть дискретность делений клеток, а также тот факт, что само изменение числа копий плазмид может происходить только за промежуток времени, равный времени генерации клетки Разбив все время на величину времен генерации, получим число генераций Тогда (W - число генераций)

рос

Р(в)= / p(6,tgm = t/w) dtP{t)+dt Jo

будет вероятностью смещения в за W генераций К наиболее значимому

преимуществу такого метода расчетов можно отнести взаимосвязь клеточных механизмов с популяци-онной устойчивостью плазмид Например, (Рис 9) данные расчетов показывают, что

100 125 150 175 W

Рис 9 Вероятность смещения на величину в = 5 от первоначаль- При изменении ПОрОГО-ного ва = 20 при различных значениях порогового уровня белка

БпаА (на графике соответственно = 400 ~2 = 300) Мень- ВОГО /Р°ВНЯ ЬНИЦИаЦЬИ ший пороговый уровень инициации приводит к более быстрому рецлИКаЦИИ Время СМв-возвращенига к стационарному состоянию

щения изменяется

Несмотря на то, что величина Н = БпаА/оггС является относительно постоянной величиной, существует возможность искусственного изменения данного параметра в эксперименте Таким образом, можно предположить, что изменяя инициирующий уровень БпаА можно влиять на стабильность плазмидсодержащего штамма

Заключение

В настоящей работе предложен новый подход к исследованию стабильности плазмидсодержащих клеток В первой части работы было предложено объяснение метаболической нагрузки на основе вероятностной модели, описывающей конкуренцию хромосомных и плазмидных мРНК за рибосомы Адекватность такой модели была подтверждена посредством сравнения с экспериментами Это позволяет предложить ряд дальнейших экспериментов для исследования метаболической нагрузки плазмид

Необходимость клеточных механизмов в описании популяционной динамики плазмид была продиктована самой структурой стохастической модели Определенные при этом параметры обретают более ясный физический смысл, и поддаются экспериментальной проверке При исследовании был использован подход, основанный на моделировании малых смещений из стационарного состояния К практической значимости второй части работы можно отнести возможность применения в медицине где различные методы антибактериального лечения пока не имеют достаточного теоретического обоснования

Результаты и выводы

1. Показано, что конкуренция плазмидных и хромосомных мРНК удлиняет время накопления белка, ответственного за инициацию репликации хромосомы, и, как следствие, время генерации клетки, содержащей плазмиды, увеличивается Степень этого увеличения зависит от общего числа белок-кодирующих генов плазмид и относительной эффективности их экспрессии

2. С помощью математической модели впервые показано, что возрастание селективного коэффициента при низких скоростях роста бактерий (то есть возрастание популяционной стоимости плазмид) является следствием наличия в этом случае дополнительного (предрепликативного) периода клеточного цикла Представленный подход позволил объяснить возрастание селективного преимущества независимо от эффективности экспрессии плазмидных генов

3. Показано, что после выведения системы из равновесного состояния импульсным воздействием, система возвращается в первоначальное стационарное состояние в виде процесса Орнштейна-Уленбека Время релаксации при этом зависит от отношения молекул-ингибиторов и молекул-инициаторов репликации плазмид Для расчетов, относящихся к плазми-дам резистентности к антибиотику число копии плазмид уменьшается в е раз за период времени, равный нескольким суткам

4. С помощью подхода, учитывающего популяционный и клеточный уровни показано, что стабильность плазмидсодержащих штаммов зависит от таких внутриклеточных параметров как величина уровня ОпаА, необходимая для инициации репликации хромосомы и количество молекул-ингибиторов репликации плазмид

Автор выражает глубокую признательность и благодарность научному руководителю доктору биологических наук Брилькову Анатолию Васильевичу за предложенную тематику исследования, ценные советы постоянное внимание к работе и Ганусову Виталию Владимировичу за помощь в исследованиях

Работы автора

1 Шуваев А Н , Брильков А В (2006) Математическая модель эволюционной динамики бактериальных плазмид -В сб XXXV конференции студентов, аспирантов и молодых ученых-физиков -Красноярск Изд-во КрасГУ-С 70

2 Шуваев А Н , Брильков А В Стохастическая модель динамики бактериальных плазмид//Вестник КГУ, серия ф -м науки -2006 -по 7 -С 45-49

3 Шуваев А Н , Брильков А В (2006) Модель динамики бактериальных плазмид при изменении внешних условий существования бактериальной популяции -В сб XIII Междунар симп «Сложные системы в экстремальных условиях» -Красноярск Изд-во КНЦ -С 36

4 Шуваев А Н , Ганусов В В (2006) Оценка изменения времени ини-

1У

циации репликации ДНК у плазмидсодержащих и бесплазмидных штаммов бактерий -В сб XIII междунар симп «Сложные системы в экстремальных условиях» -Красноярск Изд-во КНЦ -С 104

5 Шуваев А H , Брильков А В (2006) Стохастическая модель внутриклеточной динамики бактериальных R-плазмид при малых изменениях концентрации антибиотика-В сб I междунар конф «Математическая биология и биоинформатика» -М Макс-пресс -С 91-92

6 Шуваев А H , Ганусов В В , Брильков А В (2006) Оценка попу-ляционной стоимости бактериальных плазмид с помощью математической модели внутриклеточной динамики белка DnaA -В сб I междунар конф «Математическая биология и биоинформатика» -M Макс-пресс-С 93-94

7 Шуваев А H, Брильков А В Стохастическая модель внутриклеточной динамики многокопийных бактериальных плазмид с учетом контроля репликации// Математическая биология и биоинформатика - 2007 - Vol 2, no.l - С 66-72 Электронный журнал, http //www matbio.org Учредитель ИМПБ РАН № гос регистрации 0420800049

8 Шуваев А H , Брильков А В Моделирование продолжительности клеточного цикла бактерий на основе динамики DnaA с оценкой популяционной стоимости бактериальных плазмид//Доклады академии наук -2007 -Vol 416, no 1 -С 119-122

Шуваев Андрей Николаевич

Стохастическая модель динамики неконъюгативных бактериальных плазмид с учетом особенностей клеточного цикла бактерий

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать Формат 60 х 84J/16 Гарнитура «Times» Печать оперативная Уел печ л 1,25 Тираж 100 экз Заказ № У 066

Отпечатано в ИПК СФУ 660041 Красноярск, пр Свободный, 79

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Шуваев, Андрей Николаевич

Введение

1 Динамика плазмид в бактериальных популяциях

1.1 Плазмиды как молекулярная структура клетки.

1.2 Математическое моделирование популяциоштой динамики плазмид

1.3 Моделирование внутриклеточной динамики плазмид с учетом контроля репликации

1.4 Клеточный цикл Escherichia coli.

1.4.1 Основные периоды. Роль белка, инициирующего репликацию хромосомы - DnaA.

1.4.2 Математические модели динамики DnaA.

1.5 Взаимосвязь продолжительности клеточного цикла с количеством плазмид (идея модели).

2 Математическая модель клеточного цикла плазмидсодержащих бактерий

2.1 Конкурентная модель накопления DnaA.

2.1.1 Параметр Л. Различия в динамике накопления DnaA плазмидсодержащими и бесплазмидными клетками.

2.1.2 Определение интенсивности связываний рибосом с мРНК

- параметр m(t).

2.2 Модель продолжительности клеточного цикла плазмидсодержащих и бесплазмидных клеток Е. coli

2.3 Расчет «стоимости» плазмид.

2.3.1 Быстрый рост клетки {ЬаоиЪ <

2.3.2 Медленный рост клетки (¿¿оиъ >

3 Стохастическая модель динамики плазмид в популяции бактерий. Описание процесса посредством уравнения Фоккера

Планка

3.1 Построение стохастической модели.

3.1.1 Определение вероятностей перехода д(х) и г(х)

3.2 Вывод уравнения Фоккера-Планка.

3.3 Решение уравнения Фоккера-Планка в случае малых изменений числа копий плазмид.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Стохастическая модель динамики неконъюгативных бактериальных плазмид с учетом особенностей клеточного цикла бактерий"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В настоящее время значительный интерес в микробиологии и биотехнологии представляет исследование плазмидсо-держащих штаммов микроорганизмов с точки зрения сохранения их свойств при длительном культивировании. Несмотря на длительный период исследований в этой области, целый ряд аспектов остается невыясненным.

В случае патогенных бактерий до сих пор единственным методом снижения резистентности является поиск новых форм антибактериальных препаратов, к которым еще не существует соответствующих резистивных плаз-мид. Существует специальная группа антибиотиков (так называемая группа резерва), применение препаратов из которой сильно ограничено. Такой шаг направлен на удлинение времени эффективного применения данных бактерицидных веществ (до возникновения соответствующего резистентного штамма). Однако, эти подходы к проблеме плазмид-обусловленной резистентности не решают проблему ее снижения (или элиминации) у таких штаммов микроорганизмов. Поэтому, представляется актуальным изучение механизмов по-пуляционной и внутриклеточной динамики плазмид с целью прогнозирования путей повышения антибиотикочувствительности популяции патогенных бактерий.

В многочисленных экспериментальных исследованиях было показано, что нестабильность плазмидсодержащих штаммов резко возрастает при низких скоростях роста в хемостате. Причем этот эффект наблюдается при любых типах лимитирования роста бактерий, для различных плазмид (в том числе и с клонированными генами) и до сих пор не получил приемлемого объяснения. Одной из причин этого феномена может быть возрастание эффективности экспрессии плазмидных генов при снижении скорости роста за счет снятия катаболитной репрессии промоторов клонированных генов при лимитировании роста источниками углерода и энергии. Однако, существует целый ряд экспериментальных данных, свидетельствующих о возрастании селективного коэффициента даже при постоянной экспрессии. Таким образом, изучение внутриклеточных механизмов, приводящих к такого рода динамике, является необходимым и весьма актуальным для поиска путей повышения стабильности генно-инженерных плазмидсодержащих штаммов.

ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы является разработка стохастической модели популяционной динамики неконъюгативных бактериальных плазмид с, учетом особенностей клеточного цикла бактерий для оценки стоимости плазмид при изменении селективных условий.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработать математическую модель клеточного цикла плазмидсодер-жащей клетки на основе оценки времени накопления белка БпаА, которое определяет момент начала инициации репликации хромосомы.

2. С помощью разработанной модели провести анализ влияния метаболической нагрузки, количества и размеров плазмид, а также эффективности экспрессии их генов па продолжительность клеточного цикла плазмидсодержащих клеток в сравнении с бесплазмидными.

3. Разработать математическую модель динамики неконъюгативных бактериальных плазмид при кратковременном изменении активности селективного фактора среды с учетом особенностей их клеточного цикла и контроля репликации плазмид.

4. Проанализировать динамику числа плазмид при импульсном изменении условий существования плазмидсодержащей популяции. Исследовать влияние параметров, определяющих продолжительность клеточного цикла на стабильность плазмидсодержащего штамма.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе использовалось математическое моделирование на основе вероятностных подходов к описанию конкурирующих систем. Построены математические модели клеточного цикла на основе методов комбинаторного анализа, обыкновенных дифференциальных уравнений и теории вероятностей. Для исследования популяционной динамики плазмид использовалась аппроксимация одношаговым процессом с последующим выводом уравнения Фоккера-Планка. Для решения этого уравнения вблизи стационарного состояния был применен подход Бюргесса. Основные результаты расчетов были сравнены с соответствующими экспериментальными данными.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

1. Предложен вероятностный подход, который впервые связывает метаболическую нагрузку плазмид с определенным клеточным механизмом - динамикой белка, инициирующего репликацию хромосомы. Данный подход позволяет исследовать влияние числа плазмидных белок - кодирующих генов и эффективности их экспрессии на продолжительность клеточного цикла плазмидсодержащих клеток.

2. Модель впервые позволила объяснить эффект возрастания селективного преимущества бесплазмидных клеток в случае низких скоростей роста при неизменной эффективности экспрессии плазмидттых генов.

3. Построенная модель динамики плазмид в популяции впервые позволила связать макроскопически наблюдаемый эффект стабильности плазмид с внутриклеточными причинами метаболической нагрузки этих молекул. Показано, что время элиминации плазмид из популяции зависит от отношения числа молекул-ингибиторов и молекул-инициаторов репликации плазмид.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Возрастание селективного преимущества бесплазмидных штаммов при низких скоростях роста бактерий в хемостате (возрастание популяци-оиной стоимости плазмид) является следствием наличия в этом случае дополнительного (предрепликативного) периода клеточного цикла бактерий.

2. При кратковременном изменении уровня селективного фактора, система, описывающая поведение плазмидсодержащей популяции бактерий, возвращается к изначальному состоянию в виде процесса Орнштейпа - Уленбека. Время релаксации к стационарному состоянию пропорциональна отношению числа молекул-ингибиторов и молекул-инициаторов репликации плазмид. Изменение инициирующего уровня БпаА в клетках плазмидсодержащих бактерий влияет на скорость релаксации возмущенной системы. Увеличенная концентрация молекул-ингибиторов инициации репликации плазмид увеличивает скорость элиминации плазмид из бактериальной популяции.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Результаты исследования, касающиеся увеличения селективного преимущества бесплазмидных клеток могут быть использованы при культивировании рекомбинантных штаммов микроорганизмов с целыо отбора или создания стабильных вариантов. Данные исследования динамики плазмид при кратковременном изменении селективного фактора могут быть востребованы в медицине при поиске новых методов терапии инфекционных заболеваний, вызванных резистентными штаммами микроорганизмов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы докладывались на:

• XXXV Научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых-физиков (Красноярск, 2006);

• XIII Международном симпозиуме «Сложные системы в экстремальных условиях» (Красноярск, 2006);

• I Международной конференции «Математическая биология и биоип-форматика» (Пущино, 2006);

• на конференциях молодых ученых в институте биофизики СО РАН.

ПУБЛИКАЦИИ. По результатам работы опубликовано 8 работ. Из них 3 статьи в центральных журналах. 5 тезисов докладов на конференциях.

БЛАГОДАРНОСТИ. Автор выражает благодарность научному руководителю Брилькову А. В. за научную и психологическую поддержку и Гану-сову В.В. за помощь в исследованиях.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Шуваев, Андрей Николаевич

4 Заключение

В настоящей работе предложен новый подход к исследованию стабильности плазмидсодержащих клеток. Условно всю работу можно разделить на две части - исследование клеточных механизмов, влияющих на стабильность плазмид и на непосредственное исследование динамики плазмид на популя-ционном уровне. В первой части было предложено объяснение метаболической нагрузки, вызванной экстрахромосомными молекулами на основе предположения о конкуренции хромосомных и плазмидных мРНК за рибосомы. Данный механизм реализуется через моделирование динамики БпаА - белка, инициирующего репликацию хромосомы (он также может участвовать в инициации репликации некоторых плазмид, таких как Со1Е1). Адекватность такой модели была подтверждена посредством сравнения с экспериментами. Это позволяет предложить ряд дальнейших экспериментов для исследования метаболической нагрузки плазмид. В частности, для уточнения меры вероятностного пространства, использованного нами для определения параметра А (см. разд. 2.1.1) можно предложить исследование накопления БпаА с плазмидами равными по числу белок-кодирующих генов, но разными по величине.

Необходимость клеточных механизмов в описании популяционной динамики плазмид была продиктована самой структурой стохастической модели. Определенные при этом параметры обретают более ясный физический смысл, и поддаются экспериментальной проверке. При исследовании был использован подход, основанный на моделировании малых смещений из стационарного состояния. К практической значимости второй части работы можно отнести возможность применения в медицине, где метод лечения в виде «ударных» доз антибиотика в начале терапии пока не имеет достаточного теоретического обоснования.

1 Результаты и выводы

1. Показано, что конкуренция плазмидных и хромосомных мРНК удлиняет время накопления белка, ответственного за инициацию репликации хромосомы, и, как следствие, время генерации клетки, содержащей плазмиды, увеличивается. Степень этого увеличения зависит от общего числа белок-кодирующих генов плазмид и относительной эффективности их экспрессии.

2. С помощью математической модели впервые показано, что возрастание селективного коэффициента при низких скоростях роста бактерий (то есть возрастание популяционной стоимости плазмид) является следствием наличия в этом случае дополнительного (предрепликативного) периода клеточного цикла. Представленный подход позволил объяснить возрастание селективного преимущества независимо от эффективности экспрессии плазмидных генов.

3. Показано, что после выведения системы из равновесного состояния импульсным воздействием, система возвращается в первоначальное стационарное состояние в виде процесса Орнштейна-Уленбека. Время релаксации при этом зависит от отношения молекул-ингибиторов и молекул-инициаторов репликации плазмид. Для расчетов, относящихся к плаз-мидам резистентности к антибиотику число копий плазмид уменьшается в е раз за период времени, равный нескольким суткам.

4. С помощью подхода, учитывающего популяционный и клеточный уровни показано, что стабильность плазмидсодержащих штаммов зависит от таких внутриклеточных параметров как величина уровня БпаА, необходимая для инициации репликации хромосомы и количество молекул-ингибиторов репликации плазмид.

4.2 Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шуваев А.Н., Брильков A.B. (2006) Математическая модель эволюционной динамики бактериальных плазмид.-В сб.: XXXV конференции студентов, аспирантов и молодых ученых-физиков.-Красноярск: Изд-во КрасГУ.-С.70.

2. Шуваев А.Н., Брильков A.B. Стохастическая модель динамики бактериальных илазмид//Вестник КГУ, серия ф.-м. нау ки.-2006.-по.7.-С Л5-49.

3. Шуваев А.Н., Брильков A.B. (2006) Модель динамики бактериальных плазмид при изменении внешних условий существования бактериальной популяции.-В сб.: XIII Междунар. симп. «Сложные системы в экстремальных условиях».-Красноярск: Изд-во КНЦ.-С. 36.

4. Шуваев А.Н., Ганусов В.В. (2006) Оценка изменения времени инициации репликации ДНК у плазмидсодержащих и бесплазмидных штаммов бактерий.-В сб.: XIII междунар. симп. «Сложные системы в экстремальных условиях».-Красноярск: Изд-во КНЦ.-С. 104.

5. Шуваев А.Н., Брильков A.B. (2006) Стохастическая модель внутриклеточной динамики бактериальных R-плазмид при малых изменениях концентрации антибиотика.-В сб.: I междунар. конф. «Математическая биология и биоинформатика».-М: Макс-пресс.-С. 91-92.

6. Шуваев А.Н., Ганусов В.В., Брильков A.B. (2006) Оценка популяцион-ной стоимости бактериальных плазмид с помощью математической модели внутриклеточной динамики белка DnaA.-B сб.: I междунар. конф. «Математическая биология и биоинформатика».-М: Макс-пресс.-С. 9394.

7. Шуваев А.Н., Брильков A.B. Стохастическая модель внутриклеточной динамики многокопийных бактериальных плазмид с учетом контроля репликации// Математическая биология и биоинформатика\ - 2007. -Vol.2, no.l. - С.66-72.

8. Шуваев А.Н., Брильков A.B. Моделирование продолжительности клеточного цикла бактерий на основе динамики DnaA с оценкой популя-ционной стоимости бактериальных плазмид//Доклады академии наук-2007.-Vol.416, no.l.-C.119-122.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Шуваев, Андрей Николаевич, Красноярск

1. Баев, А. Новые направления биотехнологии // Биотехнология. 1985.- Т. 2. С. 8-14.

2. Баев, А., Быков, В. Биотехнология союз науки и производства. - М., Сов. Россия, 1987. - С. 128.

3. Базыкин, А.Д. Математическая биофизика взаимодействующих популяций. М., Наука, 1985. - С. 181.

4. Воронин, A.M., Филонов, А.Е. Стабильность плазмид биодеградации нафталина npl-1 и npl-41 в популяциях Pseudomonas putida в условиях непрерывного культивирования // Микробиология. 1985. - Т. 54. № 4. - С. 610-615.

5. Брода, П. Плазмиды. М.; Мир, 1982. - С. 224.

6. Бельков, В. В. Нестабильность рекомбинантных молекул // Генетика.- 1983. Т. 19, № 10. - С. 1575-1581.

7. Маделунг, Э. Математический аппарат физики. М.,Физ.-мат. лит. 1961. - С. 618.

8. Печуркин, Н. С. Популяционная микробиология. Новосибирск. Наука, 1978. - С. 278.

9. Феллер, У. Введение в теорию вероятностей и ее приложения (в 2 томах).- М., Мир. 1964.

10. Andersson D., Levin В. The biological cost of antibiotic resistance // Curr Opin Microbiol 1999. - Vol. 2, no. 5. - Pp. 489-493.

11. Antisense RNA regulation by stable complex formation in the Enterococcus faecalis plasmid pADl par addiction system / K. Weaver, E. Ehli, J. Nelson, S. Patel //J Bacteriol 2004. - Vol. 186, no. 19. - Pp. 6400-6408.

12. Ataai M., Shuler M. Mathematical model for the control of ColEl type plasmid replication // Plasmid. 1986. - Vol. 16, no. 3. - Pp. 204-212.

13. Bergstrom C, Lipsitch M., Levin B. Natural selection, infectious transfer and the existence conditions for bacterial plasmids // Genetics. 2000. - Vol. 155, no. 4. - Pp. 1505-1519.

14. Bouma J., Lenski R. Evolution of a bacteria/plasmid association // Nature.- 1988. Vol. 335, no. 6188. - Pp. 351-352.

15. Boye E., Ltfbner Olesen A., Ska.rstad K. Limiting DNA replication to once and only once // EMBO Rep. 2000. - Vol. 1, no. 6. - Pp. 479-483.

16. Boye E., Nordstrom K. Coupling the cell cycle to cell growth // EMBO Rep.- 2003. Vol. 4, no. 8. - Pp. 757-760.

17. Brendel V., Perelson A. Quantitative model of ColEl plasmid copy number control // J Mol Biol. 1993. - Vol. 229, no. 4. - Pp. 860-872.

18. Brenner M., Tomizawa J. Quantitation of ColEl-encoded replication elements // Proc Natl Acad Sci USA. 1991. - Vol. 88, no. 2. - Pp. 405-409.

19. Browning S., Castellanos M., Shuler M. Robust control of initiation of prokaryotic chromosome replication: essential considerations for a minimal cell // Biotechnol Bioeng. 2004. - Vol. 88, no. 5. - Pp. 575-584.

20. Burgess R. The statistics of charge carrier fluctuations in semiconductors // Proc Phys Soc B. 1956. - Vol. 69. - Pp. 1020-1027.

21. Campbell J., Kleckner N. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork // Cell. 1990. - Vol. 62, no. 5. - Pp. 967-979.

22. Chiaramello A., Zyskind J. Expression of Escherichia coli dnaA and mioC genes as a function of growth rate // J Bacteriol. 1989. - Vol. 171, no. 8.- Pp. 4272-4280.

23. Control of initiation of pMBl replication: purified Rop protein and RNA I affect primer formation in vitro / R. Lacatena, D. Banner, L. Castagnoli, G. Cesareni // Cell. 1984. - Vol. 37, no. 3. - Pp. 1009-1014.

24. Control of replication and segregation of R plasmid Rtsl / Y. Terawaki, K. Ishizu, S. Horiuchi, N. Goto, R. Nakaya // J Bacteriol 1976. - Vol. 128, no. 3. - Pp. 693-700.

25. Cooper S., Helmstetter C. Chromosome replication and the division cycle of Escherichia coli B/r // J Mol Biol 1968. - Vol. 31, no. 3. - Pp. 519-540.

26. Creager A. Adaptation or selection? Old issues and new stakes in the postwar debates over bacterial drug resistance / / Stud Hist Philos Biol Biomed S ci- 2007. Vol. 38, no. 1. - Pp. 159-190.

27. Dahlberg C., Chao L. Amelioration of the cost of conjugative plasmid carriage in Eschericha coli K12 // Genetics. 2003. - Vol. 165, no. 4. -Pp. 1641-1649.

28. The datA locus predominantly contributes to the initiator titration mechanism in the control of replication initiation in Escherichia coli / T. Ogawa, Y. Yamada, T. Kuroda et al. // Mol Microbiol. 2002. - Vol. 44, no. 5. - Pp. 1367-1375.

29. DeNap J., Hergenrother P. Bacterial death comes full circle: targeting plasmid replication in drug-resistant bacteria // Org Biomol Chem. 2005. - Vol. 3, no. 6. - Pp. 959-966.

30. Donachie W. Relationship between cell size and time of initiation of DNA replication 11 Nature. 1968. - Vol. 219, no. 5158. - Pp. 1077-1079.

31. Donachie W., Blakely G. Coupling the initiation of chromosome replication to cell size in Escherichia coli. // Curr Opin Microbiol 2003. - Vol. 6, no. 2. - Pp. 146-150.

32. Dong H., Nilsson L., Kurland C. Gratuitous overexpression of genes in Escherichia coli leads to growth inhibition and ribosome destruction //J Bactenol. 1995. - Vol. 177, no. 6. - Pp. 1497-1504.

33. Ederth J., Isaksson L., Abdulkarim F. Origin-specific reduction of ColEl plasmid copy number due to mutations in a distinct region of the Escherichia coli RNA polymerase // Mol Genet Genomics. 2002. - Vol. 267, no. 5. -Pp. 587-592.

34. Ehrenberg M. Hypothesis: Hypersensitive plasmid copy number control for ColEl 11 Biophys J. 1996. - Vol. 70, no. 1. - Pp. 135-145.

35. Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method / L. Simonsen, D. Gordon, F. Stewart, B. Levin // J Gen Microbiol 1990. - Vol. 136, no. 11. - Pp. 2319-2325.

36. The evolution of a conjugative plasmid and its ability to increase bacterial fitness / F. Dionisio, I. Conceicao, A. Marques et al. // Biol Lett. 2005. -Vol. 1, no. 2. - Pp. 250-252.

37. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria / C. Rang, J. Galen, J. Kaper, L. Chao // Can. J. Microbiol 2003. - Vol. 49, no. 9. - Pp. 531-537.

38. Ganusov V., Brilkov A. Estimating the instability parameters of plasmid-bearing cells. I. Chemostat culture // J Theor Biol 2002. - Vol. 219. no. 2. - Pp. 193-205.

39. Gerhart E., Wagner H., Nordstrom K. Structural analysis of an RNA molecule involved in replication control of plasmid R1 // Nucleic Acids Res. 1986. - Vol. 14, no. 6. - Pp. 2523-2538.

40. Gitelzon I., Pechurkin N., Brilkov A. Population Problems in the Biology of Unicellular Organisms. London, Harwood Academic Publ. GmbH (United Kingdom), 1989.

41. Godwin D., Slater J. The influence of the growth environment on the stability of a drug resistance plasmid in Escherichia coli K12 //J Gen Microbiol. 1979. - Vol. Ill, no. 1. - Pp. 201-210.

42. Green fluorescent protein as a marker for gene expression / M. Chalfie, Y. Tu, G. Euskirchen et al. // Science. 1994. - Vol. 263, no. 5148. - Pp. 802-805.

43. Greenfield T., Weaver K. Antisense RNA regulation of the pADl par post-segregational killing system requires interaction at the 5' and 3' ends of the RNAs // Mol Microbiol 2000. - Vol. 37, no. 3. Pp. 661-670.

44. Gustafsson P., Nordstrom K. Random replication of the stringent plasmid R1 in Escherichia coli K-12 // J Bacteriol. 1975. - Vol. 123, no. 2. - Pp. 443-448.

45. Hansen F., Hansen E., Atlung T. The nucleotide sequence of the dnaA gene promoter and of the adjacent rpmH gene, coding for the ribosomal protein L34, of Escherichia coli // EMBO J. 1982. - Vol. 1, no. 9. - Pp. 1043-1048.

46. Herrick J., Bensimon D. Gene regulation under growth conditions. A model for the regulation of initiation of replication in Escherichia coli // J Theor Biol 1991. - Vol. 151, no. 3. - Pp. 359-366.

47. In situ detection of Escherichia coli cells containing ColEl-related plasmids by hybridization to regulatory RNA II / S. Juretschko, W. Schonhuber, S. Kulakauskas et al. // Syst Appl Microbiol 1999. - Vol. 22, no. 1. - Pp. 1-8.

48. Initiator (DnaA) protein concentration as a function of growth rate in Escherichia coli and Salmonella typhimurium / F. Hansen, T. Atlung, R. Braun et al. // J Bacteriol 1991. Vol. 173, no. 16. - Pp. 5194-5199.

49. Is green fluorescent protein toxic to the living cells? / II. Liu. M. Jan, C.

50. Chou et al. // Biochemical and Biophysical Research Communications. -1999. Vol. 260, no. 3. - Pp. 712-717.

51. Isolation of a dnaA mutant of Bacillus subtilis defective in initiation of replication: amount of DnaA protein determines cells' initiation potential / S. Moriya, K. Kato, H. Yoshikawa, N. Ogasawara // EMBO J. 1990. -Vol. 9, no. 9. - Pp. 2905-2910.

52. Kato J., Katayama T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli // EMBO J. 2001. - Vol. 20, no. 15. -Pp. 4253-4262.

53. Keasting J., Palsson B. ColEl plasmid replication: a simple kinetic description from a structured model // J Theor Biol 1989. - Vol. 141. no. 4. - Pp. 447-461.

54. Keasling J., Palsson B. On the kinetics of plasmid replication //J Theor Biol. 1989. - Vol. 136, no. 4. - Pp. 487-492.

55. Levin B., Stewart F. The population biology of bacterial plasmids: a priori conditions for the existence of mobilizable nonconjugative factors // Genetics. 1980. - Vol. 94, no. 2. - Pp. 425-443.

56. Lundquist P., Levin B. Transitory derepression and the maintenance of conjugative plasmids // Genetics. 1986. - Vol. 113, no. 3. - Pp. 483-497.

57. Maal0e O., Kjeldgaard N. Control of Macromolecule Synthesis; A Study of

58. DNA, RNA, and Protein Synthesis in Bacteria. New York, W.A. Benjamin Inc., 1966. - P. 284.

59. Mahaffy J., Zyskind J. A model for the initiation of replication in Escherichia coli // J Theor Biol. 1989. - Vol. 140, no. 4. - Pp. 453-477.

60. Marr A. Growth rate of Escherichia coli // Microbiol Rev. 1991. - Vol. 55, no. 2. - Pp. 316 333.

61. Merlin S., Polisky D. Assessment of quantitative models for plasmid ColEl copy number control // J Mol Biol. 1995. - Vol. 248, no. 2. - Pp. 211-219.

62. Messer W. The bacterial replication initiator DnaA. DnaA and oriC, the bacterial mode to initiate DNA replication // FEMS Microbiol Rev. 2002. - Vol. 26, no. 4. - Pp. 355-374.

63. Messer W., Weigel C. DnaA initiator also a transcription factor // Mol Microbiol. - 1997. - Vol. 24, no. 1. - Pp. 1-6.

64. A model of antibiotic-resistant bacterial epidemics in hospitals / G. Webb, E. D'Agata, P. Magal, S. Ruan // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. - Vol. 102, no. 37. - Pp. 13343-13348.

65. Modelling the spatial dynamics of plasmid transfer and persistence / S. Krone, R. Lu, R. Fox et al. // Microbiology. 2007. - Vol. 153, no. 8. -Pp. 2803-2816.

66. Mott M., Berger J. Dna replication initiation: mechanisms and regulation in bacteria // Nat Rev Microbiol. 2007. - Vol. 5, no. 5. - Pp. 343-354.

67. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein / R.

68. Kitagawa, T. Ozaki, S. Moriya, T. Ogawa // Genes Dev. 1998. - Vol. 12, no. 19. - Pp. 3032-3043.

69. Nordstrom, K., Austin S. Cell-cycle-specific initiation of replication // Mol Microbiol. 1993. - Vol. 10, no. 3. - Pp. 457-463.

70. Nordstrom K., Dasgupta S. Copy-number control of the Escherichia coli chromosome: a plasmidologist's view // EMBO Rep. 2006. - Vol. 7, no. 5.- Pp. 484-489.

71. Nordstrom M., Nordstrom K. Control of replication of FII plasmids: comparison of the basic replicons and of the copB systems of plasmids R100 and Rl // Plasmid. 1985. - Vol. 13, no. 2. - Pp. 81-87.

72. A novel DnaA protein-binding site at 94.7 min on the Escherichia coli chromosome / R. Kitagawa, H. Mitsuki, T. Okazaki, T. Ogawa // Mol Microbiol. 1996. Vol. 19, no. 5. - Pp. 1137-1147.

73. Olsson J. Control of Chromosome and Plasmid Replication in Escherichia coli: Ph.D. thesis / Uppsala University. 2003.

74. Origin and sequence of chromosome replication in Escherichia coli / R. Bird, J. Louarn, J. Martuscelli, L. Caro // J Mol Biol 1972. - Vol. 70. no. 3. -Pp. 549-566.

75. Overexpression of the dnaA gene in Escherichia coli B/r: Chromosome and minichromosome replication in the presence of rifampin / O. Pierucci. C. Heimstetten M. Rickert et al. // J Bacteriol 1987. - Vol. 169, no. 5. - Pp. 1871-1877.

76. Paulsson J. Multileveled selection on plasmid replication // Genetics. 2002.- Vol. 161, no. 4. Pp. 1373-1384.

77. Paulsson J., Ehrenberg M. Trade-off between segregational stability and metabolic burden: a mathematical model of plasmid ColEl replication control // J Mol Biol. 1998. - Vol. 279, no. 1. - Pp. 73-88.

78. Paulsson J., Nordstrom K., Ehrenberg M. Requirements for rapid plasmid ColEl copy number adjustments: a mathematical model of inhibition modes and RNA turnover rates // Plasmid. 1998. - Vol. 39, no. 3. - Pp. 215-234.

79. The population biology of bacterial plasmids: A hidden markov model approach / J. Ponciano, L. Gelder, E. Top. P. Joyce // Genetics. 2007. -Vol. 176, no. 2. Pp. 957-968.

80. The population genetics of antibiotic resistance / B. Levin, M. Lipsitch, V. Perrot et al. // Clin Infect Dis. 1997. - Vol. 1. - Pp. S9-16.

81. Precise determinations of C and D periods by flow cytometry in Escherichia coli K-12 and B/r / O. Michelsen, M. de Mattos, P. Jensen, F. Hansen // Microbiology. 2003. - Vol. 149, no. Pt 4. - Pp. 1001-1010.

82. Protein associations in DnaA-ATP hydrolysis mediated by the Hda-replicase clamp complex / M. Suetsugu, T. Shimuta, T. Ishida et al. //,/ Biol Chem. 2005. - Vol. 280, no. 8. - Pp. 6528-6536.

83. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli / K. Kurokawa, S. Nishida, A. Emoto et al. // EMBO J. 1999. - Vol. 18, no. 23. - Pp. 6642-6652.

84. Riber L., Ltibner Olesen A. Coordinated replication and sequestration of oriC and dnaA are required for maintaining controlled once-per-cell-cycle initiation in Escherichia coli //J Bacterial. 2005. - Vol. 187, no. 16. - Pp. 5605-5613.

85. Risken H. The Fokker-Planck equation. Methods of solution and applications. 2nd edition. - Springer-Verlag, Berlin New York Heidelberg, 1989. - P. 472.

86. R.obicsek A., Jacoby G., Hooper D. The worldwide emergence of plasmid-mediated quinolone resistance // Lancet Infect Dis. 2006. - Vol. 6, no. 10. - Pp. 629-640.

87. Roth A., Messer W. High-affinity binding sites for the initiator protein DnaA on the chromosome of Escherichia coli // Mol Microbiol. 1998. - Vol. 28, no. 2. - Pp. 395-401.

88. Stewart F., Levin B. The population biology of bacterial plasmids: A priori conditions for the existence of conjugationally transmitted factors // Genetics. 1977. - Vol. 87: no. 2. - Pp. 209-228.

89. Summ,ers D. The biology of plasmids. 2nd edition. - Blackwell science, 1996. - P. 157.

90. Teich M. Role of the doubly stochastic Neyman type-A and Thomas counting distributions in photon detection // Applied Optics. 1981. - Vol. 20, no. 14. - Pp. 2457-2467.

91. Tomizawa J. Control of ColEl plasmid replication: The process of binding of RNA I to the primer transcript // Cell 1984. - Vol. 38, no. 3. - Pp. 861-870.

92. Tomizawa J. Control of ColEl plasmid replication: binding of RNA I to RNA II and inhibition of primer formation // Cell. 1986. - Vol. 47, no. 1.- Pp. 89-97.

93. Tomizawa J., Itoh T. Plasmid ColEl incompatibility determined by interaction of RNA I with primer transcript // Proc Natl Acad Sei U S A. 1981. - Vol. 78, no. 10. - Pp. 6096-6100.

94. Tomizawa J., Som T. Control of ColEl plasmid replication: enhancement of binding of RNA I to the primer transcript by the Rom protein // Cell. -1984. Vol. 38, no. 3. - Pp. 871-878.

95. Weinberger M., Helmstetter C. Chromosome replication and cell division in plasmid-containing Escherichia coli B/r //J Bacteriol 1979. - Vol. 137, no. 3. - Pp. 1151-1157.

96. Wrobel B., Wegrzyn G. Replication regulation of ColEl-like plasmids in amino acid-starved Escherichia coli // Plasmid. 1998. - Vol. 39, no. 1.- Pp. 48-62.

97. Zund P., Lebek G. Generation time-prolonging R plasmids: correlation between increases in the generation time of Escherichia coli caused by R plasmids and their molecular size // Plasmid. 1980. - Vol. 3, no. 1. - Pp. 65-69.