Стимуляция ангиогенеза с помощью генетически модифицированных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, гиперэкспрессирующих фактор роста эндотелия сосудов

Шевченко, Евгений Константинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Стимуляция ангиогенеза с помощью генетически модифицированных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, гиперэкспрессирующих фактор роста эндотелия сосудов
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Стимуляция ангиогенеза с помощью генетически модифицированных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, гиперэкспрессирующих фактор роста эндотелия сосудов"

На правах рукописи

4859530

ШЕВЧЕНКО ЕВГЕНИЙ КОНСТАНТИНОВИЧ

Стимуляция ангиогенеза с помощью генетически модифицированных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, гиперэкспрессирующих фактор роста эндотелия сосудов

03.01.04 - Биохимия 03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О НОЯ 2011

Москва - 2011 г.

4859530

Работа выполнена в Лаборатории ангиогенеза НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс»

Минздравсоцразвития Российской Федерации и на Факультете фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Парфенова Елена Викторовна

кандидат биологических наук Сысоева Вероника Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ширинский Владимир Павлович

доктор биологических наук, профессор Белушкина Наталья Николаевна

Ведущая организация:

Биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится

_на заседании

диссертационного совета Д 208.4373.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития Российской Федерации (121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Российский Кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития Российской Федерации.

Автореферат разослан

2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

В.Е.Синицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ишемические заболевания, такие как ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, ишемический инсульт и хроническая ишемия нижних конечностей продолжают лидировать в списке причин смертности населения развитых стран. Медикаментозное лечение таких заболеваний недостаточно эффективно, а существующие хирургические и эндоваскулярные методы не всегда применимы и не обеспечивают полноценного восстановления кровоснабжения тканей у тяжелых категорий больных. Поэтому на сегодняшний день имеется острая необходимость внедрения в клиническую практику новых методов лечения этих заболеваний. Альтернативным подходом является терапевтический ангиогенез. Суть метода, основанного на современных представлениях о молекулярных и клеточных механизмах формирования и поддержания стабильности сосудистой сети, заключается в экзогенной стимуляции роста и развития сосудов в ишемизированной ткани путем создания в ней повышенной концентрации ангиогенных факторов роста [Gupta, 2009].

Тактика терапевтического ангиогенеза развивается в трех направлениях: использование экзогенных факторов роста в виде рекомбинантных белков, генетических конструкций с генами этих факторов и стволовых и прогениторных клеток, секретирующих эти факторы. По всем трём направлениям были достигнуты значительные успехи в экспериментальных работах [Yla-Herttuala, 2007; Haider, 2006]. Однако контролируемые клинические испытания показали, что как использование рекомбинантных факторов роста, так и их генов не дало однозначных результатов и ожидаемой эффективности при лечении хронической ишемии нижних конечностей и ишемической болезни сердца [Gupta, 2009]. Что касается клеточной терапии, то в большинстве контролируемых испытаний получены достоверные, но весьма скромные результаты, касающиеся эффективности этого подхода в улучшении кровоснабжения. миокарда и нижних конечностей [Losordo, 2010]. Применение рекомбинантных факторов роста ограничено их высокой стоимостью, необходимостью длительного и многократного введения для стимуляции роста сосудов, опасностью их системной диссеминации и нежелательной стимуляции ангиогенеза в латентных опухолях [Yla-Herttuala, 2007]. При обсуждении причин недостаточной эффективности генной и клеточной терапии при заболеваниях ишемического генеза указывают в случае генной терапии на низкую эффективность трансфекции тканей человека и недостаточную длительность экспрессии трансгена при использовании безопасных плазмидных конструкций, а также иммунные реакции и опасность инсерционного мутагенеза, ограничивающие использование эффективных вирусных конструкций [Gupta, 2009; Ishikawa, 2011; Shimamura, Morishita, 2011]. Наиболее существенной проблемой клеточной терапии является гибель значительного количества клеток после трансплантации в поврежденную, ишемизированную ткань и снижение регенеративных свойств клеток у пожилых больных с длительно существующим патологическим процессом [El-Ftes¡, 2009; Huang, 2010; Katsara, 2011; Madonna, 2011; Sun, 2011].

Поэтому в настоящее время интенсивно разрабатываются способы повышения эффективности генной и клеточной терапии. Одним из таких подходов является увеличение терапевтических свойств клеток за счёт генетического модифицирования [Myers, 2010; Hodgkinson, 2010]. Клетки, полученные из организма пациента, модифицируют in vitro генетическими конструкциями, несущими гены биологически

активных факторов, наращивают до необходимого количества и затем ретрансплантируют. Поскольку стимуляция роста сосудов при трансплантации стволовых и прогениторных клеток осуществляется в значительной степени за счет секреции ими широкого спектра ангиогенных факторов [Mirotsou, 2011], модификация клеток с помощью генетических конструкций, кодирующих гены этих факторов, позволит увеличить паракринные эффекты трансплантируемых клеток и повысить их терапевтические свойства. Трансплантация клеток, модифицированных вирусными конструкциями, не вызывает такого сильного иммунного ответа организма, как в случае с использованием некоторых вирусных векторов in vivo [Griffin, 2010]. Кроме того генетическая модификация позволяет повысить выживаемость клеток при трансплантации и значительно уменьшить необходимое для эффективной терапии количество клеток [Iwaguro, 2002].

Перспективы клеточной терапии многих заболеваний связывают с использованием мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (МСК), получаемых из костного мозга и жировой ткани [Boyle, 2010; Mathiasen, 2010;Volarevic, 2011]. Причем МСК из жировой ткани, обладая теми же свойствами, как и МСК из костного мозга, значительно легче получить из-за доступности жировой ткани в достаточно большом количестве при малоинвазивной и безболезненной процедуре ограниченной липосакции. Для обозначения этой популяции мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток широко используется термин стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ) (Adipose stromal cells), который мы также использовали в данной работе. Сегодня МСК жировой ткани рассматриваются как наиболее перспективный тип стволовых клеток взрослого организма для аутологической трансплантации [Madonna, 2009; Murohara, 2009; Bailey, 2010; Gimble, 2011].

Цель работы: получить генетически модифицированные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека, гиперпродуцирующие фактор роста сосудистого эндотелия VEGF165, и оценить эффективность стимуляции роста сосудов при трансплантации этих клеток на моделях ангиогенеза у экспериментальных животных.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

1. Оценить эффективность трансфекции СКЖТ человека плазмидной конструкцией и вирусной транедукции с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса.

2. Получить СКЖТ человека, гиперсекретирующие фактор роста сосудистого эндотелия VEGF165.

3. Исследовать влияние генетического модифицирования на пролиферацию, выживаемость, адгезионные свойства, их способность к адипогенной, остеогенной и эндотелиальной дифференцировке;

4. Исследовать влияние генетической модификации на экспрессию ангиогенных факторов СКЖТ.

5. Изучить способность СКЖТ человека, гиперсекретирующих VEGF165, стимулировать ангиогенез на модели подкожной имплантации матригеля у иммунодефицитных мышей.

6. Изучить влияние трансплантации СКЖТ человека, гиперсекретирующих VEGF165, на восстановление кровотока и формирование сосудистой сети в ишемизированных конечностях у иммунодефицитных мышей.

7. Оценить выживаемость модифицированных СКЖТ человека и длительность экспрессии трансгена после трансплантации в ишемизированные скелетные мышцы мыши.

Научная новизна. В представленной работе впервые показано, что с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса, одного из наиболее безопасных для человека, можно с высокой эффективностью осуществить генетическое модифицирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека. Исследовано влияние генетического модифицирования СКЖТ человека на их пролиферативную активность и адгезионные свойства, выживаемость и способность к дифференцировкам. Впервые показано увеличение экспрессии фактора стабилизации сосудов ангиопоэтина-1 в модифицированных СКЖТ человека, гиперэкспрессирующих VEGF165. Получены данные о более эффективном восстановлении кровотока, развитии сосудистой сети и уменьшении доли некроза мышцы на модели ишемии задней конечности у иммунодефицитных мышей после внутримышечной трансплантации модифицированных СКЖТ человека, гиперэкспрессирующих VEGF165, по сравнению с немодифицированными клетками.

Практическая значимость работы. Разработанный метод генетической модификации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса может быть использован в научно-исследователькой работе для получения модифицированных мезенхимальных стромальных клеток. Полученные в работе данные об ангиогенном терапевтическом потенциале модифицированных СКЖТ человека, гиперсекретирующих VEGF, могут быть положены в основу разработки клинически пригодного метода терапевтического ангиогенеза, основанного на трансплантации в ишемизированные ткани модифицированных СКЖТ для лечения больных с критической ишемией нижних конечностей.

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития РФ и Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М. В. Ломоносова и ФГУ и используются в педагогической деятельности Факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова при чтении курса лекций по молекулярной медицине.

Часть работы выполнена в рамках Государственного контракта № 02.740.11.0307 от 7 июля 2009 года по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

Апробация диссертации состоялась 18 июля 2011 года на заседании межлабораторного семинара НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ «РКНПК» Минздравсоцразвития РФ. Результаты диссертационной работы были представлены на отечественных и международных конференциях: б1 1FATS Meeting (Тулуза, Франция, 2008), World conference on regenerative medicine (Лейпциг, Германия, 2011), ISSCR 8th Annual Meeting (Сан-Франциско, США, 2010), Advanced symposium and EMBO practical course «Viral vectors in gene therapy: applications & novel production methods» (Куопио, Финляндия, 2010), Всероссийская научная школа-конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010), 4th International

Meeting on Angiogenesis. «Therapeutic angiogenesis in skeletal muscle: combining gene and cell therapy for gene delivery» (Амстердам, Нидерланды, 2011).

Публикации. Результаты работы представлены в 4 статьях и в 11 тезисах докладов.

Структура работы. Диссертация представлена на страницах; состоит из введения, обзора литературных данных, описания методов и материалов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит рисунков и таблицы. Список литературы включает источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Молекулярные и биохимические методы

Конструирование плазмиды pAAB-hVEGF. Ген VEGF165 человека был вырезан с помощью рестриктаз Hind 3 и EcoRl (обе, Fermentas, Латвия) из плазмиды pcDNA3-hVEGF, полученной ранее в лаборатории. Также из плазмиды pCMV-Luc-КЕВ (предоставленной ООО «Мона», РФ) с помощью рестриктаз EcoRl и Xhol (Fermentas, Латвия) был вырезан участок ДНК, который не содержит сайтов инициации трансляции и сайтов РНК-терминации. В дальнейшем VEGF165 и участок буферной ДНК в результате лигирования были клонированы в вирусный вектор pAAV-MCS (Stratagene, США), линеаризованный с помощью рестриктаз Hind 3 и Xhol. Встраивание наряду с VEGF дополнительной последовательности ДНК было необходимо для увеличения размера трансгенной вставки, что необходимо для правильной инкапсидации рекомбинантного вируса [Grimm, 1999].

Электрофорез в агарозном геле и экстракция ДНК. Электрофоретическое разделение плазмидной ДНК проводили в 1% агарозном геле (Sigma Aldrich, США), содержащем 0,1% этидиум бромида, при напряжении 100 В. Необходимый фрагмент ДНК вырезали из геля и проводили процедуру экстракции, используя набор реагентов DNA Extraction Kit (Fermentas, Латвия) в строгом соответствии с протоколом производителя.

Лигирование фрагментов ДНК. Для проведения лигазной реакции в пробу вносили экстрагированные из геля рестриктные фрагменты плазмид, 10-кратный лигазный буфер, содержащий АТФ (Fermentas, Латвия), Т4-ДНК-лигазу (Fermentas, Латвия). Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 16 часов. После окончания реакции половину объема лигазной пробы использовали для трансформации клеток DH5a.

Трансформация Е. Coli. Получение компетентных клеток DH5a и их трансформацию лигазной смесью проводили по методике Inoue Н. с соавт. [Inoue, 1990].

Выделение и очистка плазмидной ДНК. Выделение и очистку плазмидных конструкций из бактериальных клеток осуществляли при помощи набора Maxi Endofree Kit (Qiagen, США) в строгом соответствии с протоколом производителя.

Выделение РНК. Выделение РНК проводили при помощи набора RNase Miniprep Kit (Qiagen, США) по протоколу, рекомендованному производителем. Концентрацию РНК в полученном образце определяли на спектрофотометре (Eppendorf, США) при длине волны 260 нм. Выделенную РНК хранили при температуре -70°С.

Реакция обратной транскрипции и полимеразная цепная реакция в реальном времени. Выделенную РНК использовали для синтеза кодирующей ДНК при помощи набора RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Латвия) по протоколу, рекомендованному производителем. Далее при помощи ПЦР в реальном времени проводили количественный анализ экспрессии генов ANGPT1, HGF, иРА и FGF2, используя уникальные комплементарные пары олигодезоксинуклеотидов к анализируемым генам. Для проведения ПЦР в реальном времени использовали набор реагентов с красителем SYBR Green I (Синтол, РФ). Измерение накопления продукта ПЦР осуществляли при помощи прибора IQ5 (BioRad, США). Образцы стандартизировали по среднему уровню сигнала, получаемого для кДНК бета-актина и глицерилальдегид-3-фосфатдегидрогеназы GAPDH.

Электрофорез белков. Иммуноблоттинг. Белки, содержащиеся в среде культивирования клеток, разделяли при помощи электрофореза в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия по методу Лэммли [Laemml¡,1970.], используя прибор Mini Protean II (BioRad, США). В качестве положительного контроля использовали рекомбинантный VEGF165 человека (BD Biosciences, США). Электроперенос осуществляли на поливинилидендифлуорид-мембрану (Immobilon-P Transfer Membrane, Millipore, США) в приборе Trans-blot SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad, США). Иммуноблоттинг проводили с использованием первичных моноклональных антител к VEGF165 человека (BD Biosciences, США) и вторичных антител козы к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch, США). Детекцию белков осуществляли с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL™ (Amersham Biosciences, США).

Определение VEGF165 человека методом твердофазного иммуноферментиого анализа (ИФА). Количественный анализ накопления VEGF165 в среде культивирования клеток проводили с использованием соответствующих наборов реагентов Human VEGF Quantikine Kit (R&D Systems, США) в строгом соответствии с протоколом производителя.

Цитологические методы

Культивирование эукариотических клеток. В работе использовали следующие типы эукариотических клеток: первичная культура СКЖТ человека 0-4 пассажа; линия клеток эмбрионального почечного эпителия человека НЕК-293Т. Клетки культивировали на чашках Петри в инкубаторе при температуре 37°С и 5% СОг. Для культивирования клеток линии НЕК-293Т использовали среду DMEM (Gibco, США), содержащую 100 ед/мл пенициллина, 100ед/мл стрептомицина и 10% фетальную бычью сыворотку ФБС (Gibco, США). СКЖТ культивировали в среде Advance stem (AS) для недифференцированных мезенхимальных клеток человека (Advance stem basal medium for human undifferentiated mesenchymal stem cells, HyClone, США), содержащей 10% ростовых факторов (Advance stem cell growth supplement (GS), HyClone, США), 100 ед/мл пенициллина, 100ед/мл стрептомицина. Клетки пассировали, промывая раствором Версена (Панэко, РФ) и обрабатывая реагентом HQtase (HyClone, США).

Выделение СКЖТ человека. СКЖТ человека выделяли из материала интактной подкожной жировой ткани, отсекаемой при проведении абдоминальных хирургических операций (удаление грыжи передней брюшной стенки, миомы матки) от пациентов 35-55 лет без сопутствующей патологии. Кусочки жировой ткани измельчали до размера 1 -2 мм, после чего к полученной суспензии добавляли равные

объемы растворов коллагеназы I типа (200 ед/мл, Sigma Aldrich, США) и диспазы (30 ед/мл, Invitrogen, США). Полученную смесь инкубировали в течение одного часа при 37°С и постоянном перемешивании. Далее суспензию центрифугировали в течение 10 минут при 200g, после чего осадок ресуспендировали в среде DMEM/10% ФБС и фильтровали через нейлоновый фильтр с порами 100 мкм (BD Biosciences, США). Полученную суспензию центрифугировали, клеточный осадок ресуспендировали в среде культивирования и наносили на культуральные чашки.

Плазмидная трансфекция клеток. СКЖТ культивировали в стандартных условиях. При достижении клетками 80-90% конфлюэнтного монослоя проводили процедуру трансфекции тремя методами: с использованием реагента LipofectAmine 2000 (Invitrogen, США), реагента Fugene 6 (Roche Applied Science, Швейцария) и кальций-фосфатным методом. Трансфекцию с использованием LipofectAmine 2000 и Fugene 6 проводили по протоколу производителя, варьируя при этом соотношение количества плазмидной ДНК к объёму реагента (1:1, 1:2, 1:3 и 1:6 мкг/мкл), а также количество GS (0%, 2% и 10%) в среде культивирования AS в течение 24 часов после трансфекции. При кальций-фосфатном методе трансфекции 10 мкг ДНК смешивали с раствором 0,3 М СаС12 и по каплям добавляли к раствору 2xHBS (280 мМ NaCl, 1,5 мМ Na2HP04, 50 мМ HEPES, pH 7,10). Инкубировали трансфекционную смесь в течение 2 минут и аккуратно наносили на клетки. Для оценки выживаемости СКЖТ после трансфекции клетки окрашивали красителем трипановый синий и подсчитывали их число в камере Горяева.

Продукция рекомбинантного аденоассоциированного вируса и трансдукция клеток. В работе была использована система переноса генов на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса, серотипа 2 - AAV Helper-Free System (Stratagene, США). Продукцию вируса осуществляли в клетках линии НЕК-293 Т. Для получения вируса, кодирующего GFP, клетки ко-трансфицировали плазмидами pAAV-RC, pHelper и pAAV-hrGFP (Stratagene, США). Для получения вируса, несущего ген VEGF165, вместо плазмиды pAAV-hrGFP использовали клонированную нами плазмиду pAAV-hVEGF. Трансфекцию осуществляли при помощи кальций-фосфатного метода. Через 50-54 часа после трансфекции клетки лизировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) подвергая четырем раундам заморозки в жидком азоте и размораживания на водяной бане (37°С). Далее к лизату клеток добавляли фермент бензоназу (Merck, Германия) из расчета 50 единиц активности/мл и инкубировали полученную смесь в течение 30 мин на водяной бане (37°С). После этого центрифугировали клеточный лизат и отбирали надосадочную жидкость, содержащую вирусные частицы. Аликвоты вирусного препарата хранили при температуре -80°С. Один миллилитр вирусного препарата соответствовал количеству вируса, продуцированному клетками линии НЕК-293Т при их культивировании на одной чашке Петри диаметром 100мм.

СКЖТ человека культивировали в стандартных условиях. При достижении клетками 60-70% конфлюэнтного монослоя среду заменяли на AS/1%GS и добавляли вирусный препарат из расчета 1-2 мл вирусного препарата на 400-600 тыс. клеток. Инкубировали клетки в течение 90-120 мин, перемешивая среду каждые 30 мин. Далее к СКЖТ в среде AS/l%GS/BHpycHbtö препарат добавляли равный объём среды AS/20%GS и культивировали клетки без смены среды не менее 48 часов.

Оценка пролиферативной активности СКЖТ. Клетки культивировали в стандартных условиях. Через каждые 48 часов производили подсчет количества клеток в камере Горяева. Пролиферативную активность клеток оценивали как

функцию их количества от времени культивирования. Среднее время удвоения популяции Td считали по формуле 7c/=(!og22)*//[log2(A7M'ö)J, где ! - время прироста популяции, Nt- количество клеток через время t, N0 - исходное количество клеток.

Оценка распределения СКЖТ по фазам клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии. Клетки фиксировали ледяным 70% этанолом и инкубировали с раствором йодистого пропидия, содержащем РНКазу А (Invitrogen, США). Данные анализировали при помощи программы для математического анализа распределения клеток по фазам клеточного цикла ModFit LT 3.2 (Verity Software House, США). Для анализа клеточного цикла использовали одномерные гистограммы распределения клеток по интенсивности флуоресценции йодистого пропидия в диапазоне длин волн 600-625 нм (при длине волны возбуждения 488 нм).

Анализ частоты спонтанного апоптоза СКЖТ. Клетки культивировали в среде AS, содержащей 1% GS в течение 48 часов, после чего оценивали частоту спонтанного апоптоза в культуре при помощи набора Annexin-V FITC Apoptosis Kit (Invitrogen, США) по протоколу, предложенному производителем.

Адипогенная, остеогенная и эндотелиальная дифференцировка СКЖТ. Адипогенную и остеогенную дифференцировку СКЖТ осуществляли при помощи наборов Mesenchymal Stern Cell Adipogenesis Kit и Mesenchymal Stern Cell Osteogenesis Kit (Chemicon, США) по протоколу, рекомендованному производителем. Детекцию адипоцитов в культуре СКЖТ проводили окрашиванием цитологическим красителем Oil Red О (Chemicon, США). Кальцификацию внеклеточного матрикса оценивали при помощи окрашивания культуры клеток красителем Alizarine Red С (Chemicon, США). Для эндотелиальной дифференцировки СКЖТ культивировали в среде EGM-2 (Lonza, Швейцария) в течение 14 дней. Далее определяли экспрессию эндотелиальных антигенов на поверхности СКЖТ, окрашивая клетки специфическими антителами. В качестве отрицательного контроля во всех случаях использовали клетки, культивируемые в стандартной среде культивирования.

Анализ клеточной адгезии. Лунки культурального планшета покрывали растворами следующих адгезионных субстратов: коллаген I типа (ИМТЕК, Россия), витронектин (Sigma Aldrich, США), фибронектин (ИМТЕК, Россия), ламинин (Sigma Aldrich, США). Наносили суспензию клеток в среде DMEM, не содержащей ФБС. Для построения калибровочной кривой клеточную суспензию вносили также в «калибровочные лунки» (без адгезионных субстратов) в разведениях 1:5, 1:2, и без разведения (100% клеток). Через 40 минут инкубации лунки промывали буфером ФСБ, фиксировали клетки в 4% формальдегиде и окрашивали 0,1% раствором кристаллического фиолетового. Клетки в «калибровочных лунках» фиксировали, не отмывая. После этого растворяли краситель, обрабатывая клетки 10% раствором уксусной кислоты. Измеряли оптическую плотность при 570 нм на планшетном спектрофотометре Multiscan Ascent (Thermo Fisher Scientific, США). Строили калибровочную кривую, используя данные измерений «калибровочных лунок», и определяли количество клеток, прикрепившихся на специфические матриксы, в процентах от общего числа.

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток, образцов мышечной ткани и матригелей. Фиксацию, окрашивание СКЖТ, криосрезов мышечной ткани и матригеля проводили по стандартному протоколу с использованием специфических антител к соответствующим антигенам. Для окрашивания клеток использовали первичные антитела мыши против CD31 человека (BD Biosciences, США), vWf человека (Sigma Aldrich, США) и вторичные антитела Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor

594 (Invitrogen, США). Препараты мышечной ткани и матригелей окрашивали первично-мечеными антителами против гладкомышечного актина мыши (SMA) (FITC-SMA, Sigma-Aldrich, США) и немечеными антителами крысы против CD31 мыши (BD Biosciences, США). В качестве вторичных антител использовали Alexa Fluor 594 (Invitrogen, США). Ядра клеток докрашивали красителем DAPI. После окрашивания клетки и криосрезы заключали в среду Aqua polymount (Polysciences, США) и накрывали покровными стёклами.

Проточная цитофлуориметрия. Экспрессию рецепторов VEGF, антигенов CD31 и CD 138 на поверхности СКЖТ оценивали окрашиванием клеток следующими специфическими антителами: hVEGFR 1 /FLT1 -РЕ (R&D Systems, США) hVEGFR2/KDR-APC (R&D Systems, США), CD31-FITC (BD Biosciences, США)! CD138-PE (DAKO, США). Анализ экспрессии антигенов проводили на клеточном сортере MoFlo («DakoCytomation», Дания) или на проточном цитофлуориметре BD FACS CantoTM II («BD Pharmingen», США).

Эксперименты на животных

Экспериментальные животные. В данной работе использовали самцов иммунодефицитных мышей линии Balb/c NUDE (безтимусные мыши с дефицитом по Т-клеткам) (питомник «Пущино» ФИБХ, РФ) в возрасте 8-10 недель. Все манипуляции с животными выполняли в соответствии с внутренними «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утверждёнными в ФГУ «РКНПК» Минздравсоцразвития РФ.

Имплантация клеток в матригеле. Для проведения эксперимента мышам линии BALB/c NUDE подкожно в область паха проводили инъекцию 400 мкл матригеля (BD Biosciences, США), смешанного со 100 мкл ФСБ или 100 мкл суспензии клеток (5x105 клеток). Через 14 дней после начала эксперимента, извлекали имплантаты матригелей, помещали в кюветы со средой О.С.Т. Tissue-Tek (Sakura, Япония) и замораживали в жидком азоте.

Модель ишемии задней конечности. Мышей линии BALB/c NUDE вводили в наркоз с помощью интраперитонеальной инъекции 300 мкл 2,5% раствора авертина, после чего в левой бедренной области выполняли разрез по линии проекции а. femoralis. Бедренную артерию выделяли на протяжении ее дистальной части и перевязывали шелковой нитью 6-0 проксимальнее точки подколенной бифуркации с сохранением интактных v. femoralis и п. ischiadicus. Рану ушивали атравматической иглой (шелк 4-0) непрерывным швом.

Лазерная допплерография. Для оценки восстановления подкожного кровотока на подошвенной поверхности задних лап мышей использовали лазер-допплеровский сканер (Laser Doppler Imaging System, Moor, Великобритания). Перед сканированием животное анестезировали в камере при помощи изофлюрана, после чего поддерживали глубину наркоза с помощью дыхательной маски, в которую подавали смесь кислорода и 1-2% изофлюрана. Измерения проводили сразу после операции индукции ишемии и затем каждые 4 дня вплоть до 20-х суток. В обработку включали данные, полученные при условии, что разница в результатах трёх последовательных измерений, проведенных с интервалом в 5 минут, не превышала 10%. Для исключения влияния внешних факторов данные обрабатывали в виде отношения условных значений кровотока в ишемизированной конечности к кровотоку в интактной лапе.

Модель эксплантной культуры скелетной мышцы. Подготовку эксплантной культуры т. tibialis anterior мыши выполняли по методу Jang с соавт. [Jang, 2004]. Мышечные экспланты культивировали на чашках Петри, покрытых матригелем, в среде М199 (Gibco, США), содержащей 2% ФБС.

Гистологические методы

Подготовка тканей. Образцы мышц и имплантантов матригелей замораживали в жидком азоте в среде О.С.Т. Tissue-Tek (Sakura, Япония). Образцы хранили при температуре -70°С. Гистологический анализ проводили на замороженных срезах толщиной 7-10 мкм.

Окрашивание мышечной ткани на коллаген при помощи пикросириуса красного. Для данного эксперимента использовали метод окраски коллагена, предложенный Н. Puchtier с соавт. [Puchtier, 1973].

Окрашивание мышечной ткани гематоксилин-эозином. Криосрезы мышечной ткани фиксировали в 4% формальдегиде. Далее препараты инкубировали в гематоксилине Караччи (Carazzi's Hematoxylin, OpticA, Италия). Промывали срезы водопроводной водой и инкубировали в эозине Б (Electronic Microscopy Sciences, США). Окрашенные препараты последовательно обезвоживали в 70%, 96% и абсолютном этаноле заключали в среде Cytoseal-60.

Микроскопический анализ

Препараты анализировали при помощи микроскопа Axiovert 200М («Zeiss», Германия). Документирование изображений и последующую их обработку производили с помощью цифровой видеокамеры Axiocam HRC (Zeiss, Германия) в программах Axiovision 3.1 (Zeiss, Германия), MetaMorph 7.1.0.0 (Universal Imaging Corporation, США). Для каждого среза т. tibialis anterior и образцов матригеля с помощью цифровой фотокамеры получали серию случайных снимков, охватывающих более 80% поверхности среза, на которых проводили морфомерические исследования с последующей статистической обработкой данных.

Статистическая обработка данных

Данные представлены в формате среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическую обработку результатов выполняли при помощи пакета Statsoft Statistica 6.0 (Statsoft, США). Использовали t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна-Уитни для выборок с Гауссовым или непараметрическим распределением величин соответственно. Различия считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ эффективности плазмидной трансфекции СКЖТ человека. Весьма существенной вопросом при использовании генетически модифицированных клеток является выбор оптимального с точки зрения эффективности и безопасности вектора для модификации клеток. На данный момент именно плазмидные векторы считаются наиболее безопасными, что показано в многочисленных клинических исследованиях и длительных наблюдениях [Gupta, 2009]. Для того чтобы оценить возможность использования плазмидных векторов для генетического модифицирования СКЖТ человека, были проведены эксперименты по трансфекции клеток плазмидой, кодирующей ген зелёного флуоресцентного белка GFP. В качестве трансфицирующих

агентов использовали коммерчески доступные реагенты 1лроГес1атте 2000 и р1щепе 6, а также кальций-фосфатный метод трансфекции. Были протестированы различные соотношения плазмиды и трансфицирующих агентов в трансфекционной смеси. Кроме того, в период инкубации клеток после трансфекции варьировали содержание ростовых факторов в среде культивирования СКЖТ. Процентное содержание СРР+ клеток в культуре, оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии. Максимальное количество (11% СИР-позитивных клеток) было получено при использовании в качестве трансфицирующего реагента ЫроГейатте 2000 (Рис. 1). Данный результат был достигнут при использовании соотношения ДНК/трансфицирующий реагент равного 1:2 (мкг/мл) и 10% содержанием ростовых факторов в среде культивирования. ЫроГейашпе 2000, однако, обладал довольно сильным цитотоксическим действием, вызывая гибель 35% клеток. р1щепе 6 не оказывал негативного влияния на выживаемость СКЖТ (более 95% жизнеспособных клеток), но был абсолютно неэффективен (менее 1% ОРР-позитивных клеток) для трансфекции данной культуры клеток (Рис. 1). Кальций-фосфатная трансфекция позволяла получить до 5% ОРР-позитивных клеток (Рис. 1), при выживаемости 85% клеток. Экспрессию вРР после трансфекции мы наблюдали уже на второй день после начала эксперимента. Однако дальнейшее культивирование трансфицированных СКЖТ приводило к резкому снижению процента вРР+ клеток, вплоть до полного их исчезновения к 14 дню после трансфекции.

Генетическое модифицирование СКЖТ человека с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса. Как видно из представленных данных, все использованные методы трансфекции оказались малоэффективными для доставки генов в СКЖТ человека. Поэтому далее была проведена оценка эффективности модифицирования этих клеток с помощью вирусной трансдукции на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса 2 серотипа.

70-1 6050403020-ю-0-1

* Р с 0,05

% СРР + клеток

* Р < 0,05

Ри§епеб

ч_

Фосфат Ьфс&сШтте рААВ-6РР кальция

2000;

—V—

ПЛАЗМИДНАЯ ТРАНСФЕКЦИЯ ВИРУСНЫЙ ВЕКТОР

Рисунок I. Эффективность различных способов модифицирования СКЖТ человека.

Интенсивность флуоресценции

Фоновая флуоресценция клеток

_ Флуоресценция клеток, окрашенных специфическими антителами

Рисунок 2. Трансдукция СКЖТ с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса.

А.Экспрессия гепарансулъфат протеогликана на поверхности СКЖТ человека Б. Количество йРР клеток в популяции СКЖТ на 5 день после вирусной трансдукции с помощью рААВ-СЕР (метод проточной цитофлуориметрии). В. Микрофотография б-ГР СКЖТ, трансдуцированных рААВ-йЕР.

Р<0.01

7000

6000

5000

1 4000

* с 3000

2000

1000

п= 10

СКЖТ

GFP-СКЖТ VEGF-СЮКТ VEGF-СКЖТ 7 день 30 день

Рисунок 3. Увеличение секреции VEGF модифицированными СКЖТ. СКЖТ человека 1-ого пассажа трансдуцировали pAAB-VEGF. Количественную оценку секреции VEGF проводили с помощью Р1ФА, собирая кондш{ионированные среды на 7 и 30 день культивирования после трансдукции. СКЖТ - немодифгщированные клетки; GFP-СКЖТ - клетки, модифицированные с помощью pAAB-GFP; VEGF-СКЖТ-клетки, модифицированные с помощью pAAB-VEGF.

Выбор данного типа вирусного вектора был основан на следующих соображениях. Рекомбинантные векторы на основе аденоассоциированного вируса считаются самыми безопасными по сравнению с другими вирусными векторами. Не выявлено ни одной болезни человека, ассоциированной с заражением этими вирусами. Рекомбинантный вектор (рААВ) не содержит вирусные белки. При использовании рААВ in vivo не наблюдается столь сильного иммунного ответа, как в случае с аденовирусом. С помощью рААВ можно трансдуцировать как пролиферирующие, так и покоящиеся клетки. В отличие от вируса дикого типа рААВ

не интегрирует в клеточный геном, вероятность спонтанной интеграции очень низкая, вирус существует в клетке в эписомальном состоянии [Gray, 2008], при этом характеризуется длительной экспрессией трансгена, вплоть до нескольких лет, например, после внутримышечной инъекции человеку [Jiang, 2006].

Различные серотипы аденоассоциированного вируса обладают ярко выраженным тропизмом к определённому типу клеток. Это связано с экспрессией на поверхности клеток определённых рецепторов, через которые происходит связывание того или иного серотипа вируса с клеткой. Ранее этот тип вируса никогда не использовался для модификации СКЖТ. В данной работе мы использовали аденоассоциированный вирус серотипа 2. Клеточным рецептором для данного серотипа является гепарансульфат протеогликан (ГСПГ) [Summerford 1998], поэтому прежде чем использовать рААВ для трансдукции СКЖТ, мы проверили экспрессию ГСПГ на поверхности клеток. Для этого клетки окрашивали моноклональными антителами к ГСПГ и оценивали экспрессию рецептора с помощью проточной цитофлуориметрии. Было установлено, что 70-80% СКЖТ человека экспрессируют на своей поверхности ГСПГ (Рис. 2).

Для оценки эффективности вирусной трансдукции СКЖТ человека мы получили и использовали рААВ, кодирующий ген GFP (pAAB-GFP). Уже на второй день после трансдукции СКЖТ мы наблюдали экспрессию флуоресцентного белка клетками в культуре, которая достигала максимума к 4-5 дню после трансдукции (Рис. 2). Количество флуоресцирующих клеток определяли с помощью проточной цитофлуориметрии, и на четвертый день после трансдукции оно составляло в среднем 65% от общего числа клеток (Рис. 1, 2), что значительно превышало эффективность трансфекции СКЖТ плазмидными векторами. Экспрессию GFP модифицированными клетками наблюдали, по крайней мере, в течение месяца, однако количество клеток, экспрессирующих этот белок, снижалось. Если на 4 день после трансдукции в культуре обнаруживалось 65+3% флуоресцирующих клеток, то на 15 и 30 день их было уже 45+2% и 25+1,5 соответственно (п=5). Таким образом, экспрессия трансгена сохранялась, по крайней мере, в течение 30 дней, в отличие от временных рамок, характерных для экспрессионной активности плазмид в клетках.

Секреция VEGF модифицированными СКЖТ человека. Для получения СКЖТ человека, продуцирующих ангиогенный фактор роста, был создан вирусный вектор, кодирующий ген VEGF165 человека (pAAB-VEGF) - основного регулятора ангиогенеза в эмбриональном и постнатальном периоде развития организма [Koch, 2011]. На Рис. 3 представлены результаты измерений концентрации VEGF в средах культивирования модифицированных и немодифицированных СКЖТ человека. Как видно из этих данных, уровень секреции VEGF в популяции VEGF-СКЖТ возрастал в среднем в 45-50 раз (4,5±1,8нг/мл/105клеток) по сравнению с немодифицированными клетками (0,1 ± 0,02 н г/м л/105 кл сто к) и клетками, модифицированными pAAB-GFP (0,09±0,02нг/мл/105клеток). При этом через месяц после трансдукции экспрессия VEGF модифицированными клетками сохранялась, хотя её уровень снижался на треть (2,9±1,1нг/мл/105клеток), оставаясь в среднем в 30 раз выше, чем в контроле (0,09±0,02нг/мл/105клеток). Таким образом по результатам этой части исследования разработан вектор, который эффективно увеличивает уровень секреции VEGF в СКЖТ человека. В дальнейшем мы провели исследование возможного влияния как генетической модификации, так и гиперэкспрессии VEGF на различные функциональные свойства СКЖТ.

Влияние генетического модифицирования СКЖТ на их пролиферативный статус и частоту спонтанного апоптоза. Для того чтобы оценить пролиферативный статус модифицированных СКЖТ, проводили подсчёт клеток в процессе их культивирования и рассчитывали время удвоения популяции. Было обнаружено, что пролиферативная активность VEGF-СКЖТ и GFP-СКЖТ была снижена по сравнению с немодифицированными клетками. Среднее время удвоения популяции СКЖТ было равно 61,3±7 часам, в то время как для GFP-СКЖТ и VEGF-СКЖТ оно составляло 116,9±11 и 145,4±12 часов, соответственно (п=5) (р<0,01) (Рис. 4). При этом частота спонтанного апоптоза не отличалась у всех трёх популяций и составляла 2±0,5% от общего числа клеток.

В дальнейшем было проанализировано распределение популяций СКЖТ, GFP-СКЖТ и VEGF-СКЖТ по фазам клеточного цикла путём окрашивания клеток раствором йодистого пропидия и последующего анализа методом проточной цитофлуориметрии. Оказалось, что число клеток, находящихся на стадиях S-G2 клеточного цикла, в популяциях GFP-СКЖТ и VEGF-СКЖТ было в 1,5-1,8 раз меньше (16±4% и 13%±6% клеток, соответственно, п=5), чем в популяции немодифицированных СКЖТ (25±3% клеток) (р<0,05)(Рис. 4).

Влияние генетического модифицирования на адгезионные свойства СКЖТ. При трансплантации клеток для их выживания и интеграции в ткань реципиента важнейшую роль играет взаимодействие с внеклеточным матриксом. Для оценки влияния генетической модификации клеток на их адгезионные свойства было проведено исследование их способности прикрепляться к культуральному пластику, покрытому следующими белками внеклеточного матрикса человека: коллагену 1типа, витронектину, фибронектину и ламинину. Как видно из Рис. 5, СКЖТ прикреплялись на коллаген 1типа - основной гликопротеин внеклеточного матрикса, а также на витронектин и фибронектин, в то время как к покрытому ламинином культуральному пластику клетки не прикреплялись. При этом мы не обнаружили статистически значимых отличий в адгезионных свойствах популяций СКЖТ, GFP-СКЖТ и VEGF-СКЖТ.

Влияние генетического модифицирования СКЖТ на их способность к адипогенной, остеогенной и эндотелиальной дифференцировке in vitro. Как

мультипотентные мезенхимальные клетки СКЖТ способны к адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференцировке [Zuk, 2001]. Для исследования влияния генетического модифицирования на способность СКЖТ к адипогенной дифференцировке клетки культивировали 14 дней в адипогенной среде и затем окрашивали для идентификации липидных отложений реагентом Oil Red О. Во время микроскопического анализа уже на 7 день культивирования в адипогенных условиях мы наблюдали накопление жировых капель в цитоплазме клеток. При подсчёте окрашенных красителем Oil Red О клеток в группах «СКЖТ», «GFP-СКЖТ» и «VEGF-СКЖТ» не было обнаружено значимых различий в процентном соотношении адипоцитов к общему числу клеток. Аналогичные результаты были получены и относительно влияния генетического модифицирования на способность СКЖТ к остеогенной дифференцировке. В этом случае эффект дифференцировки определяли окрашиванием клеток реагентом Alizarin Red С, являющимся маркером минерализации межклеточного матрикса. При культивировании СКЖТ, GFP-СКЖТ, VEGF-СКЖТ в остеогенной среде, начиная с 14-го дня культивирования, обнаруживалось специфическое окрашивание клеток реагентом Alizarin Red С, а к 21-

ому дню уровень кальцификации матрикса значительно возрастал как для модифицированных, так и для немодифицированных клеток.

Время удвоения популяции СКЖТ

Время, час

200 150 100 50

Р<0.01

Доля клеток, находящихся в 5-02 фазах клеточного цикла

Р<0,05

СКЖТ СРР-СКЖТ УББР-СЮКТ

СКЖТ СРР-СКЖТ УЕСР-СКЖТ

Рисунок 4. Оценка пролиферативной активности модифицированных СКЖТ.

СКЖТ, СРР-СКЖТ, УЕСР-СКЖТ культивировали в стандартных условиях. Каждые 48 часов проводили подсчёт количества клеток в камере Роряева и определяли время удвоения популяции. Окрашивали СКЖТ раствором йодистого пропидия и определяли распределение клеток в популяции по фазам клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии.

0.3

05 0.15

О 0.О5

□ СКЖТ

К - Исходное

(БОА) количество ьлеток

I ОКР-СКЖТ

I \"ЕСтР-СКЖТ

«т

фноронекпгн вихронекпш лоьашлш

Рисунок 5. Адгезия модифицированных СКЖТ к белкам внеклеточного матрикса. СКЖТ, СРР-СКЖТ, УЕСР-СКЖТ высевали на кулътуральный пластик, покрытый коллагеном 1 типа, фибронектином, витронектином или ламинином. Через 20 минут промывали лунки ФСБ и определяли долю прикрепившихся клеток микроскопическим анализом и по оптической плотности после окрашивания кристаллическим фиолетовым.

В нескольких работах показана способность СКЖТ к эндотелиальной дифференцировке при культивировании в специальных средах, содержащих ангиогенные факторы [Fischer, 2009; Yang, 2011]. Поскольку VEGF165 один из важнейших ангиогенных факторов и сильнейший митоген для эндотелиальных клеток, мы исследовали влияет ли повышенная секреция данного ростового фактора модифицированными VEGF-СКЖТ на способность этих клеток к эндотелиальной дифференцировке. Дифференцировку в эндотелиальном направлении мы оценивали по экспрессии маркеров эндотелиальных клеток CD31 и VEGFR2. По данным литературы свежевыделенная популяция СКЖТ человека может содержать до 30% клеток, экспрессирующих на своей поверхности эндотелиальные антигены (CD31, CD144 и VEGFR2), однако уже после 1 пассажа их число резко падает, а продолжительное культивирование ведёт к постепенному снижению доли эндотелиальных клеток, вплоть до полного их исчезновения к пассажу 3-4. После первого пассажа СКЖТ были трансдуцированы pAAB-GFP и pAAB-VEGF. На пассаже 2 был проведен иммуноцитохимический анализ содержания клеток, экспрессирующих антигены CD31 и VEGFR2 в каждой из полученных популяций. Эксперименты были повторены три раза с использованием клеток, полученных от трех разных доноров. Оказалось, что во всех трёх популяциях СКЖТ для каждого донора менее 1% клеток несут на своей поверхности эти рецепторы. Когда клетки пассажа 2 достигли 100% конфлюэнтного монослоя, стандартную среду культивирования заменили на среду EGM-2, поддерживающую эндотелиальную дифференцировку. СКЖТ культивировали в среде EGM-2 в течение 14 дней. В конце эксперимента снова провели анализ на экспрессию CD31 и VEGFR2 с помощью проточной цитофлюориметрии, который показал, что процентное содержание клеток, несущих CD31 и VEGFR2, не изменилось и после культивирования в среде EGM-2 и не превышало 1% во всех анализируемых популяциях: СКЖТ, GFP-СКЖТ, VEGF-СКЖТ. Таким образом повышенная секреция VEGF не индуцировала дифференцировку этих клеток в эндотелиальном направлении и не вызывала пролиферации эндотелиальных клеток, присутствующих в очень небольшом количестве в популяции СКЖТ.

Влияние генетического модифицирования СКЖТ на экспрессию ими ангиогенных факторов. В настоящее время считается, что именно секреторная активность СКЖТ определяет их терапевтическую эффективность при трансплантации [Rehman, 2004; Rubina, 2009]. Мы исследовали влияние гиперсекреции VEGF модифицированными VEGF-СКЖТ на экспрессию ими ряда ангиогенных факторов, таких как гепатоцитарный фактор роста (HGF), фактор роста фибробластов (FGF2), ангиопоэтин 1 (ANGPT1) и урокиназа (uPA). HGF и FGF2 являются митогенами и хемоаттрактантами как для эндотелиальных так и муральных клеток сосудистой стенки и принимают непосредственное участие в стимуляции роста новых капилляров (ангиогенезе) и развитии коллатеральных сосудов (артериогенезе). ANGPT1 - фактор стабилизации сосудов, обеспечивающий формирование зрелой функциональной сосудистой сети. Урокиназа - ключевой регулятор внеклеточного протеолиза, обеспечивающий протеолитическую активацию факторов роста и миграцию эндотелиальных клеток в процессе ангиогенеза.

Анализ экспрессии HGF, FGF2, ANGPT1, uPA проводили методом количественного ПЦР в реальном времени. Как следует из данных, представленных на рис. 6, мы не наблюдали изменения экспрессии FGF2 и HGF в клетках GFP-СКЖТ и VEGF-СКЖТ по сравнению с немодифицированными СКЖТ. В тоже время мы

обнаружили увеличение экспрессии урокиназы и ангиопоэтина 1 в популяции УЕСР-СКЖТ, которое было статистически значимым только для АЫСРТ1, уровень экспрессии которого в УЕСР-СКЖТ был в 5,3±0,6 раз выше, чем в немодифицированных клетках и йРР-СКЖТ (п=6) (р<0,05).

0,01 0,008 0,006 0,004 0,002 0

0,06 0,04 0,02 0

ANGPT1

* Р<0.05

l± IÉ

FGF2

0,004 0,003 0,002 0,001 0

0,00003 0,000025 0,00002 0,000015 0,00001 0,000005 0

UPA

'Р=0.09

HGF

Él

□ СКЖТ DGFP-CIOKT «VEGF-СКЖТ

Рисунок 6. Анализ экспрессии ангиогенных факторов ANGPT1, FGF2, иРА и HGF модифицированными СКЖТ. Экспрессию мРНК каждого из ангиогенных факторов определяли методом количественного ПЦР. Уровень экспрессии выражали как отношение экспрессии исследуемого фактора к среднему уровню экспрессии бета-актина и GAPDH. Данные представлены как М±т при п-6..

Влияние генетически модифицированных СКЖТ на васкуляризацию имплантатов матригеля у иммунодефицитных мышей. Для анализа ангиогенного потенциала модифицированных VEGF-СКЖТ in vivo, была использована модель имплантации клеток в матригеле под кожу мыши. Помещенные в матригель клетки за счет своей паракринной активности создают градиент ангиогенных факторов, что способствует прорастанию в «матригелевую бляшку» сосудов мыши из окружающих тканей. Поскольку в матригель помещали СКЖТ человека, работу проводили на бестимусных мышах линии Balb/c NUDE для снижения вероятности отторжения имплантата организмом реципиента. Животные были разделены на 4 группы по 10 в каждой. Контрольная группа получила инъекцию матригеля с ФСБ. В опытных группах под кожу мышам вводили матригель, смешанный с СКЖТ; GFP-СКЖТ; VEGF-СКЖТ.

\ " V '

}1 >

■ V 1 •

* >

СКЖТ ЮОмкм VEGF-СКЖТ ^ООики

— -

Синий - DAPI

Красный - CD31 Зеленый - SMA

Капилляры

Р-=0.05

90 7560453015-

Р<0.01

Артериолы

ЯШ 2.0-

1 1.5 -

1.0-

0.5-

— о-'

Р<0,05

1ФСЕ О СКЖТ ■ GFP-СКЖТ ■ VEGF-СКЖТ

Рисунок 7. Влияние модифицированных СКЖТ на васкуляризацию имплантатов матригеля. 5X105 СКЖТ, GFP-СКЖТ или VEGF-СКЖТ были смешаны с матригелем и введены под кожу мыши на 14 дней. На рисунке представлены микрофотографии срезов матригеля из групп «СКЖТ» и «VEGF-СКЖТ», окрашенных антителами против CD31 и SMA, и результаты подсчёта количества капилляров и артериол в имплантатах матригеля га групп: ФСБ «ФСБ», «СКЖТ», «GFP-СКЖТ» и « VEGF-СКЖТ» (количество сосудов на поле зрения).

Через 14 дней трансплантаты выделяли и проводили иммуногистохимический анализ. В контрольном матригеле с введением ФСБ («ФСБ») были обнаружены лишь единичные мелкие сосуды, в то время как в матригелях из групп «СКЖТ», «GFP-СКЖТ» и «VEGF-СКЖТ» выявлено выраженное развитие сосудистой сети. При подсчёте сосудов, окрашенных на маркер эндотелия CD31. было обнаружено, что их количество в группе «VEGF-СКЖТ» (88,1 ± 10,4 сосудов на поле зрения) было почти в три раза больше, чем в группах «GFP-СКЖТ» (31,3 ± 6,2 сосудов на п.з.) и «СКЖТ» (34.5 ± 11,6 на п.з.) (Рис. 7). Количество артериол, имеющих гладкомышечную оболочку и поэтому окрашивающихся на гладкомышечный альфа-актин (SMA) также было выше в 2,5 раза в группе «VEGF-СКЖТ» (1,7 ± 0,24 сосудов на п.з.) по сравнению с группами «GFP-СКЖТ» (0,7 ± 0,3 сосудов на п.з.) и «СКЖТ» (0,7 ± 0,2 сосудов на п.з.).

Влияние внутримышечного введения модифицированных СКЖТ на восстановления кровотока в ишемизированной конечности мыши. Оценку терапевтического потенциала СКЖТ. гиперсекретирующих VEGF165, мы проводили на модели ишемии задней конечности у иммунодефицитных мышей линии Balb/c NUDE.

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

*Р<0,05 " Р<0,05

время, день

Рисунок 8. Влияние модифицированных СКЖТ на восстановление кровотока в ишемизированной конечности мыши. У мышей линии BALB/c Nude индуцировали ишемию нижней конечности. Внутримышечно вводили 5x10: клеток из популяций СКЖТ, GFP-СКЖТ, VEGF-СКЖТ. Проводили измерение кровотока в конечности каждый 4 день вплоть до 20-х суток после операции с помощью лазерной допплерографии. На рисунке представлены: изображения, полученные с помощью лазер-допплеровского сканера при измерении кровотока у мышей из групп «СКЖТ» и «VEGF-СКЖТ» на 4, 12 и 20-ый день после операции; сводные данные по динамике реперфузии в ишемизированной конечности мыши после введения клеток. Данные обработаны в виде отношения условных значений кровотока в ишемизированной конечности к кровотоку в интактной лапе (* - СКЖТ, GFP-СКЖТ против ФСБ; ** -VEGF-СКЖТ против СКЖТ, GFP-СКЖТ).

4 день

12 день

20 день

♦VEGF-СКЖТ (п=10) Л СКЖТ (н=9) ♦GFP-СКЖТ (п=9) -■-ФСБ (п=8)

Животные были разделены на 4 группы. Непосредственно после процедуры перевязки бедренной артерии, тремя инъекциями по 50 мкл в т. tibialis anterior, т. gastrocnemius и т. biceps femoris вводили ФСБ (группа «ФСБ», контрольная) либо суспензию клеток в ФСБ - 5x105 СКЖТ (группа «СКЖТ»), либо СКЖТ, экспрессирующих GFP (группа «GFP-СКЖТ») либо СКЖТ, гиперсекретирующих VEGF (группа «VEGF-СКЖТ»). В дальнейшем с помощью лазерной допплерографии проводили измерение кровотока в конечности каждый 4-й день после операции вплоть до 20-х суток.

На Рис. 8 представлена динамика восстановления перфузии конечности. Как видно из этих данных, в контрольной группе «ФСБ» естественное восстановление перфузии было очень слабо выражено, и кровоток к 20-му дню не превышал 30% от уровня в интактной лапе. При этом в трёх группах мышей, получивших инъекцию клеток, наблюдался явный прирост кровоснабжения в ишемизированной конечности. Уровень кровотока в группах «СКЖТ» и «GFP-СКЖТ» к 20-му дню достигал в среднем 50% и 55% от уровня в интактной лапе. В тоже время восстановление перфузии конечности после введения клеток, продуцирующих VEGF, было значительно эффективнее. Уже к 12-му дню уровень кровотока в группе «VEGF-СКЖТ» на 15-20% достоверно превышал данный показатель в группах «СКЖТ» и «GFP-СКЖТ», а к моменту окончания эксперимента достигал 80-90% от уровня перфузии здоровой конечности. Таким образом, трансплантация генетически модифицированных СКЖТ, продуцирующих VEGF 165, в ишемизированные мышцы конечности приводила к более эффективному восстановлению кровотока в конечности по сравнению с трансплантацией немодифицированных клеток или клеток, модифицированных вирусом с маркерным геном.

Оценка выживаемости клеток и длительности экспрессии трансгена в мышечной ткани после трансплантации. По результатам ряда экспериментальных работ на животных моделях известно, что для эффективной стимуляции ангиогенеза и восстановления ишемизированной ткани необходима длительная экспрессия терапевтического фактора. При введении VEGF-СКЖТ в ишемизированную мышцу нами не было отмечено снижение перфузии в течение эксперимента, которое часто наблюдается при введении плазмид и некоторых вирусных векторов, для которых характерна временная экспрессионная активность трансгена [Gounis, 2005; Gupta, 2009]. Такой эффект можно объяснить присутствием в ткани в течение всего времени эксперимента живых функционально активных СКЖТ, продуцирующих VEGF.

Для оценки выживаемости клеток после трансплантации в ишемизированную мышцу был проведен микроскопический анализ образцов т. tibialis anterior, взятых у мышей из группы «GFP-СКЖТ» на 7 день после индукции ишемии и введения клеток. В мышце детектировали распределённые по ткани, экспрессирующие GFP клетки (Рис. 9 А).

Для доказательства присутствия функционально активных и продуцирующих VEGF человека клеток в мышцах в ходе всего эксперимента был проведен анализ мышечных эксплантов т. tibialis anterior, взятых у мышей на 3 и 21 день после введения клеток. В образцах среды культивирования эксплантов мышц из группы «VEGF-СКЖТ», взятых на 3 день после введения клеток, концентрация VEGF 165 человека, определённая с помощью иммуноферментного анализа, составила 2,86 ± 0,21 нг/мл. При этом в эксплантной культуре, полученной на 21 день после введения VEGF-СКЖТ, это значение было ожидаемо ниже и составило 0,145 ± 0,015 нг/мл (Рис. 9Б). Однако в контрольных группах «GFP-СКЖТ» и «СКЖТ» содержание VEGF

было ниже порога чувствительности ИФА и на 3-й и на 21 день. Таким образом, мы показали, что к моменту окончания эксперимента трансплантированные УЕОР-СКЖТ сохраняют свою функциональную активность и экспрессируют трансген. Снижение количества продуцируемого УЕйР, скорее всего, обусловлено как гибелью части клеток, так и уменьшением экспрессии УЕОР.

А Б

3 дня 21 день

Рисунок 9. Оценка выживаемости СКЖТ человека и длительности продукции ими VEGF после введения в ишемизированную мышцу мыши.

А. Микрофотография, полученные со срезов т. tibialis anterior из группы «GFP-СКЖТ», на которых видны GFP+ клетки. Б. Иммуноферментный анализ секреции VEGF165 человека в среду культивирования мышечных эксплантов мыши из группы «VEGF-СКЖТ», полученных на 3 и 21 день после введения клеток. Данные ИФА в группах «СКЖТ» и «GFP-СКЖТ» не приведены, ввиду того, что значения концентрации VEGF в этих группах были ниже порога чувствительности метода.

Влияние трансплантации СКЖТ, продуцирующих VEGF165 на размер некроза и развитие сосудистой сети в ишемизированной мышце. Гистологический анализ образцов ишемизированной т. tibialis anterior, взятых у мышей на 20 день после индукции ишемии и трансплантации клеток, показал, что введение в мышцы СКЖТ, гиперсекретирующих VEGF 165, способствовало достоверному уменьшению доли некроза в мышце (25% некротической ткани) по сравнению с группами «СКЖТ» и «GFP-СКЖТ» (45-55% некротической ткани) (р<0,05) (Рис. 10). У животных, получивших инъекцию ФСБ доля некроза достигала 85%. Тканепротективный эффект и восстановление кровотока в группах мышей, получивших инъекцию клеток, может быть опосредован стимуляцией ангиогенеза. Подсчет количества капилляров и артериол на срезах т. tibialis anterior показал, что в группах, получивших инъекции СКЖТ и GFP-СКЖТ, как плотность капилляров, так и плотность артериол была одинаковой, составляя 129±11 и 125±14 кап. в поле зрения и 1,35±0,12 и 1,35+0,09 артериол в поле зрения соответственно (рис.11). В тоже время в группе, получившей инъекцию клеток, гиперсекретирующих VEGF, плотность капилляров составила 189+19 в п/зр. (р<0,05), а плотность артериол - 3,1+0,2 в п/зр. (р<0,01). При этом соотношение артериолы/капилляры было одинаковым во всех группах и даже несколько выше в группе «VEGF-СКЖТ», что свидетельствует о развитии стабильных зрелых сосудов наряду с формированием капиллярной сети.

Необходимо особо подчеркнуть, что ни в одном случае при введении VEGF-СКЖТ не отмечено образования ангиом.

I ~ Зона некроза

ФСБ СКЖТ GFP-СКЖГ VEGF-СКЖТ

Рисунок 10. Влияние трансплантации модифицированных СКЖТ на развитие некроза в ишемизированной мышце. Через 20 дней после индукции ишемии и введения клеток выделячи образцы т. tibialis anterior. На рисунке представлены: микрофотографии срезов мышцы, окрашенных гематоксилином-эозином: сводные данные по доле некроза в мышце в группах «ФСБ», «СКЖТ», «GFP-СКЖТ'», «VEGF-СКЖТ» (площадь некротической ткани относительно площади среза, в процентах).

Синий - DAPI Красный - CD31 Зелёный - SMA

: у - .

• Л. < . '- - • . ..

< ' : 1

v.J.'!,.'' ■ sr.■^¿¡^Ък

дтшгашаия t v'Tv - • 'v; '. ^VEGF-СКЖТ 200miw 'j *-—

Капилляры

250 200 -150 100 50

JMWJ5 р<006

Артериолы

лм\

□ СКЖТ

в GFP-СКЖТ и VEGF-СКЖТ

□ интактная мышца

Рисунок 11. Влияние трансплантации СКЖТ, продуцирующих VEGF165, на развитие сосудов в ишемизированной мышце. СКЖТ, GFP-СКЖТ, VEGF-СКЖТ трансплантировали в ишемизированные мышцы мыши. Через 20 дней после операции выделяли т. tibialis anterior и подсчитывали количество сосудов в ткани. На рисунке представлены: микрофотографии срезов мышцы из групп «СКЖТ» и «VEGF-СКЖТ», окрашенных антителами против Сй31(красньш) и 8МА(зеленый); результаты подсчёта количества капилляров и артериол на срезах мышцы (на поле зрения).

VEGF является важнейшим ангиогенным фактором, увеличивающим сосудистую проницаемость, активирующим пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, что способствует появлению новых сосудов. Однако новые капилляры представляют собой первичные высокопроницаемые сосудистые структуры. Они нестабильны, функционально неполноценны и разрушаются в отсутствии VEGF. Под действием других ангиогенных факторов, таких как ангиопоэтин 1 или тромбоцитарный фактор роста (PDGF), происходит стабилизация первичных сосудистых структур за счет уменьшения сосудистой проницаемости и привлечения перицитов и гладкомышечных клеток в зону роста капилляра, что приводит к формированию многослойной сосудистой стенки (Carmeliet, 2000; Yamamoto, 2009.). Стабилизированные сосуды обладают большей пластичностью и более устойчивы к регрессии (Jain, 2003). Несмотря на повышенную секрецию VEGF модифицированными VEGF-СКЖТ, мы не обнаружили сдвига в сторону формирования преимущественно нестабильных, диссоциирующих капилляров. В ишемизированной мышце после трансплантации VEGF-СКЖТ пропорционально возрастало количество артериол. Вероятно, это обусловлено способностью СКЖТ секретировать широкий набор ангиогенных факторов, включающий и факторы стабилизации сосудов, такие как ANGPT1, TGF-бета, PDGF [Rehman, 2004; Rubina, 2009]; которые действуют в синергизме с VEGF, гиперпродуцирующимся этими клетками за счет генетической модификации. Существенную роль для стабилизации сосудов имеет и длительность повышения концентрации VEGF в тканях, которая в нашем случае составляет более 3-х недель. Помимо этого обнаруженное увеличение экспрессии ANGPT1 в СКЖТ, гиперпродуцирующих VEGF 165, может являться важным фактором, способствующим формированию функционально активной стабильной сосудистой сети.

выводы

1. Стромальные клетки жировой ткани человека могут быть эффективно модифицированы с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса 2 серотипа; трансдукция СКЖТ человека этим вирусом позволяет получить в среднем 65% модифицированных клеток в культуре с сохранением высокой жизнеспособности клеток и экспрессии трансгена не менее месяца.

2. Стромальные клетки жировой ткани человека, модифицированные с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса 2 серотипа, несущего ген УЕОП65, секретируют в 50 раз больше УЕОР165, чем немодифицированные клетки или клетки, модифицированные этим вектором, несущим маркерный ген зеленого флуоресцентного белка (СЕР); повышенная продукция УЕСР165 сохраняется в течение месяца.

3. Генетическое модифицирование СКЖТ человека рекомбинантным аденоассоциированным вирусом 2 серотипа, несущим ген ОРР или УЕОР165, не влияет на частоту спонтанного апоптоза, способность к остеогенной и адипогенной дифференцировке, адгезионную активность клеток, однако снижает их пролиферативную активность.

4. В генетически модифицированных СКЖТ, продуцирующих \^ЕСР 165, более чем в пять раз возрастает уровень мРНК фактора стабилизации сосудов ангиопоэтина-1, есть тенденция к увеличению экспрессии урокиназы, но достоверно не изменяется экспрессия таких ангиогенных факторов, как гепатоцитарный фактор роста и фактор роста фибробластов-2.

5. Трансплантация модифицированных СКЖТ человека, продуцирующих УЕСП65, подкожно в матригеле иммунодефицитным мышам дополнительно стимулирует васкуляризацию трансплантата по сравнению с использованием немодифицированных клеток или модифицированных клеток, экспрессирующих вРР.

6. Локальная трансплантация СКЖТ человека, продуцирующих УЕСР165, в ишемизированные мышцы задней конечности иммунодефицитной мыши способствует более эффективному восстановлению кровотока, стимуляции ангио-и артериогенеза, уменьшению доли некроза в ишемизированной мышце по сравнению с трансплантацией интактных СКЖТ или СКЖТ, экспрессирующих вБР; модифицированные СКЖТ человека выживают после трансплантации и продуцируют УЕОР165, по крайней мере, в течение 20 дней.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

Шевченко Е.К., Макаревич П.И., Цоколаева З.И., Ратнер Е.И., Парфенова Е.В. Эффективная трансдукция стромальных клеток жировой ткани человека с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, том V, №1,2010, С 60-64 Шевченко Е.К.. Талицкий К.А., Парфенова Е.В. Перспективы повышения эффективности генной и клеточной терапии сердечно-сосудистых заболеваний: генетически модифицированные клетки. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, том V, №2, 2010, С 19-28

Шевченко Е.К., Макаревич П.И., Парфёнова Е.В. Генетическая модификация прогениторных клеток как способ повышения эффективности генной и клеточной терапии ишемических заболеваний. Кардиологический вестник, №1 Том VI (XVIII), 2011, С 59-67

Шевченко Е.К., Макаревич П.И., Цоколаева З.И., Сысоева В.Ю., Шевелев А.Я., Каширина Н.М., Власик Т.Н., Парфенова Е.В. Восстановление кровотока в ишемизированной конечности мыши с помощью плазмидных конструкций и генетически модифицированных стромальных клеток жировой ткани. Молекулярная медицина, №4, 2011, С 23 - 28

Тезисы конференций:

Шевченко Е.К. Стромальные клетки жировой ткани человека в качестве вектора для генной терапии. V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2008 г., электронное приложение к журналу "Вестник РАМН", №6, С 480-481

Eugeniv Shevchenko: Pavel Makarevich; Zoya Tsokolaeva; Yelena Parfyonova. Human Adipose Stromal Cells Expressing Vascular Endothelial Growth Factor Following Recombinant Adeno-Associated Viral Vector-Mediated Gene Transfer Stimulate Angiogenesis in a Murine Model. 6th IF ATS Meeting, Toulouse, France, October, 24-26, 2008, Сборник тезисов, № 71

Шевченко E.K.. Цоколаева З.И., Сысоева В.Ю., Парфёнова Е.В. Генетически модифицированные стромальные клетки жировой ткани, секретирующие VEGF, стимулируют ангиогенез in vivo. Всероссийская научная школа-конференция для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования», Москва, 23-25 сентября 2009 г., Сборник тезисов, С 81-82 Шевченко Е.К.. Цоколаева З.И., Сысоева В.Ю., Парфёнова Е.В. Стромальные клетки жировой ткани, секретирующие VEGF, стимулируют ангиогенез in vivo. 1-я Международная научная школа Нано-2009. «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах», Ступино, 29 июня - 4 июля 2009 г., Сборник тезисов, С 382-383.

Shevchenko Е.; Tsokolaeva Z„ Sysoeva V., Parfyonova Ye., Tkachuk V. Gene modified human adipose stromal cells overexpressing vascular endothelial growth factor stimulate angiogenesis in vivo. World Conference on Regenerative Medicine, Leipzig, Germany, October, 28 - 31, 2009, Regenerative Medicine 2009 4(6), (Suppl.2) S284

Shevchenko E.. Tsokolaeva Z., Makarevich P., Sysoeva V., Parfyonova Ye., Tkachuk V. Vascular endothelial growth factor gene-modified human adipose stromal cells stimulate growth of stable vessels in vivo. ISSCR 8th Annual Meeting, San Francisco, USA, June 16 - June 19, 2010, Сборник тезисов, № тезиса - 45 Shevchenko, Evgeny, Makarevich, Pavel, Tsokolaeva, Zoya, Parfyonova, Yelena. Human adipose stromal cells overexpressing human VEGF165 via AAV-transduction increase reperfusion of ischemic limb in BALB-c nude mice. Advanced symposium and EMBO practical course «Viral vectors in gene therapy: applications & novel production methods», Kuopio, Finland, August 26 - September 4, 2010, Сборник тезисов, № тезиса - 34

Шевченко Е.К.. Макаревич П.И., Цоколаева З.И., Сысоева В.Ю., Парфёнова Е.В. Стромальные клетки жировой ткани, гиперэкспрессирующие VEGF, стимулируют восстановление кровотока в ишемизированной конечности иммунодефицитных мышей. Всероссийская научная школа-конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина», Москва, 25 - 28 октября 2010 г., Сборник тезисов, № тезиса - 23

Pavel 1. Makarevich. Evgeny К. Shevchenko. Zoya I. Tsokolaeva, Veronika Yu. Sysoeva, Alexander Ya. Shevelev Tatyana N. Vlasik, Yelena V. Parfyonova. Therapeutic angiogenesis in skeletal muscle: combining gene and cell therapy for gene delivery. 4th International Meeting on Angiogenesis, Amsterdam, The Netherlands, 2011, Angiogenesis 2011 (14), p. 103

PI Makarevich, EK Shevchenko. ZI Tsokolaeva, VYU Sysoeva, AYA Shevelev, TN Vlasik, YEV Parfyonova, VA Tkachuk. Therapeutic angiogenesis in ischemic muscle: gene and cell therapy for gene delivery. European Society of Gene and Cell Therapy British Society for Gene Therapy Collaborative Congress 2011, Brighton, United Kingdom, October 27-31, 2011, Сборник тезисов, С 127

Pavel Makarevich, Evgeny Shevchenko. Zoya Tsokolaeva, Veronika Sysoeva, Alexander Shevelev, Tatyana Vlasik, Yelena Parfyonova. Combining Gene and Cell Therapy for Stimulation of Vascularisation in Ischemic Skeletal Muscle. World Conference on Regenerative Medicine, Leipzig, Germany, November, 2 - 4, 2009, Сборник тезисов, № тезиса - OP-075

Заказ № 96-а/10/2011 Подписано в печать 28.10.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru;e-maiUinfo@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шевченко, Евгений Константинович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ФОРМИРОВАНИЕ И ПОДДЕРЖАНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ СОСУДИСТОЙ СЕТИ В ПОСТНАТАЛЬНЫЙ ПЕРИОД.

1.1. Ангиогенез.

1.3. Артериогенез. Коллатеральный кровоток.

1.4. Постнатальный васкулогенез.

2. ФАКТОР РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ: РОЛЬ В ПОСТНАТАЛЬНОЙ ВАСКУЛЯРИЗАЦИИ.

2.1. Характеристика семейства УЕОБ.

2.2. Рецепторы УЕОБ.

2.3. Роль УЕОБ в эмбриональном и постнатальном периоде развития организма.

3. ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ АНГИОГЕНЕЗ ПРИ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА И НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ.

3.1. Рекомбинантные ангиогенные факторы в терапевтическом ангиогенезе

3.2. Генная терапия в терапевтическом ангиогенезе.

3.3. Клеточная терапия в терапевтическом ангиогенезе.

4. МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ЖИРОВОЙ ТКАНИ.

4.1. Выделение, антигенная характеристика и пластичность СКЖТ.

4.2. Ангиогенный и регенеративный потенциал СКЖТ.

5. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ МОДИФИЦИРОВАНИЕ КЛЕТОК КАК СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕННОЙ И КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ.

5.1. Актуальность генетического модифицирования клеток.

5.2. Системы доставки генетического материала в клетки и ткани.

5.2.1. Невирусные системы доставки.

5.2.2. Перенос генов с помощью рекомбинантных вирусных векторов.

5.2.2.1. Онкоретровирусы и лентивирусы.

5.2.2.2. Аденовирусы.

5.2.2.3. Вирус простого герпеса.

5.2.2.4. Аденоассоциированный вирус.

5.2.2.5. Бакуловирусы.

5.2.2.6. Вирусоподобные частицы.

5.3. Генетическое модифицирование клеток с целью повышения их паракринной активности.

5.3.1. Предшественники эндотелиальных клеток.

5.3.2. Скелетные миобласты.

5.3.3. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга.

5.4. Генетическое модифицирование клеток для улучшения их хоуминга и выживаемости после трансплантации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Стимуляция ангиогенеза с помощью генетически модифицированных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, гиперэкспрессирующих фактор роста эндотелия сосудов"

Ишемические заболевания, такие как ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, ишемический инсульт и хроническая ишемия нижних конечностей продолжают лидировать в списке причин смертности населения развитых стран. Медикаментозное лечение таких заболеваний недостаточно эффективно, а существующие хирургические и эндоваскулярные методы не всегда применимы и не обеспечивают полноценного восстановления кровоснабжения тканей у тяжелых категорий больных. Поэтому на сегодняшний день имеется острая необходимость внедрения в клиническую практику новых методов лечения этих заболеваний. Альтернативным подходом является терапевтический ангиогенез. Суть метода, основанного на современных представлениях о молекулярных и клеточных механизмах формирования и поддержания стабильности сосудистой сети, заключается в экзогенной стимуляции роста и развития сосудов в ишемизированной ткани путем создания в ней повышенной концентрации ангиогенных факторов роста [Gupta, 2009].

Тактика терапевтического ангиогенеза развивается в трех направлениях: использование экзогенных факторов роста в виде рекомбинантных белков, генетических конструкций с генами этих факторов и стволовых и прогениторных клеток, секретирующих эти факторы. По всем трём направлениям были достигнуты значительные успехи в экспериментальных работах [Yla-Herttuala, 2007; Ye, 2006]. Однако контролируемые клинические испытания показали, что как использование рекомбинантных факторов роста, так и их генов не дало однозначных результатов и ожидаемой эффективности при лечении хронической ишемии нижних конечностей и ишемической болезни сердца [Gupta, 2009; Mac Gabhann, 2010; Beohar, 2010]. Что касается клеточной терапии, то в большинстве контролируемых испытаний получены достоверные, но весьма скромные результаты, касающиеся эффективности этого подхода в улучшении кровоснабжения миокарда и нижних конечностей [Lavu, 2010; Lawall, 2011; Wang, 2011]. Применение рекомбинантных факторов роста ограничено их высокой стоимостью, необходимостью длительного и многократного введения для стимуляции роста сосудов, опасностью их системной диссеминации и нежелательной стимуляции ангиогенеза в латентных опухолях [Yla-Herttuala, 2007]. При обсуждении причин недостаточной эффективности генной и клеточной терапии при заболеваниях ишемического генеза указывают в случае генной терапии на низкую эффективность трансдукции тканей человека и недостаточную длительность экспрессии трансгена при использовании безопасных плазмидных конструкций, а на также иммунные реакции и опасность инсерционного мутагенеза, ограничивающие использование эффективных вирусных конструкций [Gupta, 2009; Ishikawa, 2011; Shimamura, 2011]. Наиболее существенной проблемой клеточной терапии является гибель значительного количества клеток после трансплантации в поврежденную, ишемизированную ткань и снижение регенеративных свойств клеток у пожилых больных с длительно существующим патологическим процессом [El-Ftesi, 2009; Huang, 2010; Katsara, 2011; Madonna, 2011; Sun, 2011].

Поскольку стимуляция роста сосудов при трансплантации стволовых и прогениторных клеток осуществляется в значительной степени за счет секреции ими широкого спектра ангиогенных факторов [Mirotsou, 2011], модификация клеток с помощью генетических конструкций, кодирующих

10 гены этих факторов, позволит увеличить паракринные эффекты трансплантируемых клеток и повысить их терапевтические свойства. Трансплантация клеток, модифицированных вирусными конструкциями, не вызывает такого сильного иммунного ответа организма, как в случае с использованием некоторых вирусных векторов in vivo [Griffin, 2010]. Кроме того генетическая модификация позволяет повысить выживаемость клеток при трансплантации и значительно уменьшить необходимое для эффективной терапии количество клеток [Iwaguro, 2002].

Перспективы клеточной терапии многих заболеваний связывают с использованием мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (МСК), получаемых из костного мозга и жировой ткани [Boyle, 2010; Mathiasen, 2010;Volarevic, 2011; Madonna, 2010]. Причем МСК из жировой ткани, обладая теми же свойствами, как и МСК из костного мозга, значительно легче получить из-за доступности жировой ткани в достаточно большом количестве при малоинвазивной и безболезненной процедуре ограниченной липосакции. Для обозначения этой популяции мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток широко используется термин стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ), который мы также использовали в данной работе. Сегодня МСК жировой ткани рассматриваются как наиболее перспективный тип стволовых клеток взрослого организма для аутологичной трансплантации [Madonna, 2010; Murohara, 2009].

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

1. Оценить эффективность трансфекции СКЖТ человека плазмидной конструкцией и вирусной трансдукции с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса.

2. Получить СКЖТ человека, гиперсекретирующие фактор роста сосудистого эндотелия УЕОР165.

3. Исследовать влияние генетического модифицирования СКЖТ на их пролиферацию, выживаемость, адгезионные свойства, способность к адипогенной, остеогенной и эндотелиальной дифференцировке;

4. Исследовать влияние генетической модификации на экспрессию ангиогенных факторов СКЖТ.

5. Изучить способность СКЖТ человека, гиперсекретирующих УЕОР165, стимулировать ангиогенез на модели подкожной имплантации матригеля у иммунодефицитных мышей.

6. Изучить влияние трансплантации СКЖТ человека, гиперсекретирующих УЕОР165, на восстановление кровотока и формирование сосудистой сети в ишемизированных конечностях у иммунодефицитных мышей.

Научная новизна. В представленной работе впервые показано, что с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса, одного из наиболее безопасных для человека, можно с высокой эффективностью осуществить генетическое модифицирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека. Исследовано влияние генетического модифицирования СКЖТ человека на их пролиферативную активность и адгезионные свойства, выживаемость и способность к дифференцировкам. Впервые показано увеличение экспрессии фактора стабилизации сосудов ангиопоэтина-1 в модифицированных СКЖТ человека, гиперэкспрессирующих УЕОР165. Получены данные о более эффективном восстановлении кровотока, развитии сосудистой сети и уменьшении доли некроза мышцы на модели ишемии задней конечности у иммунодефицитных мышей после внутримышечной трансплантации модифицированных СКЖТ человека, гиперэкспрессирующих УЕОР165, по сравнению с ^модифицированными клетками.

Практическая значимость работы. Разработанный метод генетической модификации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса может быть использован в научно-исследователькой работе для получения модифицированных мезенхимальных стромальных клеток. Полученные в работе данные об ангиогенном терапевтическом потенциале модифицированных СКЖТ человека, гиперсекретирующих УЕОБ, могут быть положены в основу разработки клинически пригодного метода терапевтического ангиогенеза, основанного на трансплантации в ишемизированные ткани модифицированных СКЖТ для лечения больных с критической ишемией нижних конечностей.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шевченко, Евгений Константинович

выводы

2. Стромальные клетки жировой ткани человека, модифицированные с помощью рекомбинантного аденоассоциированного вируса 2 серотипа, несущего ген УТЮГ 165, секретируют в 50 раз больше УЕОР165, чем немодифицированные клетки или клетки, модифицированные этим вектором, несущим маркерный ген зеленого флуоресцентного белка (ОРР); повышенная продукция УЕОР165 сохраняется в течение месяца.

3. Генетическое модифицирование СКЖТ человека рекомбинантным аденоассоциированным вирусом 2 серотипа, несущим ген вРР или УЕОР165, не влияет на частоту спонтанного апоптоза, способность к остеогенной и адипогенной дифференцировке, адгезионную активность клеток, однако снижает их пролиферативную активность.

4. В генетически модифицированных СКЖТ, продуцирующих УЕОР165, более чем в пять раз возрастает уровень мРНК фактора стабилизации сосудов ангиопоэтина-1, есть тенденция к увеличению экспрессии урокиназы, но достоверно не изменяется экспрессия таких ангиогенных факторов, как гепатоцитарный фактор роста и фактор роста фибробластов-2.

5. Трансплантация модифицированных СКЖТ человека, продуцирующих УЕОР165, подкожно в матригеле иммунодефицитным мышам дополнительно стимулирует васкуляризацию трансплантата по сравнению с использованием немодифицированных клеток или модифицированных клеток, экспрессирующих СТР.

6. Локальная трансплантация СКЖТ человека, продуцирующих УЕСТ 165, в ишемизированные мышцы задней конечности иммунодефицитной мыши способствует более эффективному восстановлению кровотока, стимуляции ангио- и артериогенеза, уменьшению доли некроза в ишемизированной мышце по сравнению с трансплантацией интактных СКЖТ или СКЖТ, экспрессирующих ОБР; модифицированные СКЖТ человека выживают после трансплантации и продуцируют \ТЮР165, по крайней мере, в течение 20 дней.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время интенсивно разрабатываются подходы к повышению эффективности генной и клеточной терапии. Экспериментальные работы показывают, что перспективным подходом для этого может быть генетическое модифицирование стволовых/прогениторных клеток, которое позволяет существенно усилить их терапевтический потенциал и открывает новые перспективы для разработки методов лечения заболеваний ишемического генеза. Важными аспектами в разработке клинически пригодного метода использования генетически модифицированных клеток являются выбор типа клеток и наиболее безопасного и эффективного вектора для их модифицирования.

В данном исследовании был разработан метод генетической модификации стромальных клеток жировой ткани, представляющих собой относительно легко получаемый в достаточном количестве тип постнатальных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека. В качестве модифицирующего вектора был выбран наиболее безопасный и достаточно эффективный вирусный вектор на основе аденоассоциированного вируса 2 серотипа, в который был встроен ген важнейшего ангиогенного фактора VEGF. Было установлено, что более 70% СКЖТ человека экспрессируют на своей поверхности гепарансульфат протеогликан, рецептор, через который происходит связывание вируса с клеткой. Эффективность генетического модифицирования СКЖТ с помощью рААВ коррелировала с процентным содержанием клеток, экспрессирующих гепарансульфат протеогликан, и составляла в среднем 65%. Длительность экспрессии трансгена (не менее месяца) значительно превысила время экспрессионной активности плазмидной конструкции в СКЖТ.

Модифицированные клетки продуцировали (секретировали в среду культивирования) в 30-50 раз больше VEGF, чем немодифицированные СКЖТ, и повышенная секреция этого фактора сохранялась клетками in vitro не менее месяца. Генетическое модифицирование не влияло на такие функциональные свойства клеток, как способность адипогенной и остеогенной дифференцировке, способность к адгезии на различные типы матриксов, а также не индуцировало дифференцировку СКЖТ в эндотелиальном направлении и не влияло на пролиферацию минорной популяции эндотелиальных клеток, присутствующей в СКЖТ. Генетически модифицированные клетки, продуцирующие УЕОБ, хуже пролиферировали, что проявлялось как в увеличении времени удвоения популяции, так и в уменьшении числа клеток, находящихся в фазах 8-С2 клеточного цикла, однако частота спонтанного апоптоза при генетическом модифицировании не изменялась.

В модифицированных СКЖТ, гиперсекретирующих \ТЮР, отмечено изменение профиля экспрессии других ангиогенных факторов. Так было обнаружено пятикратное усиление экспрессии фактора стабилизации сосудов ангиопоэтина-1, а также тенденция к увеличению почти в три раза уровня экспрессии урокиназы. При этом количество мРНК генов РОР2 и НвР не изменялось.

Способность модицифированных УЕОБ-СКЖТ человека стимулировать рост сосудов первоначально была показана на модели васкуляризации подкожно имплантированного матригеля с клетками у иммунодефицитных мышей. Было обнаружено, что в матригелях с клетками, гиперсекретирующими УЕОБ, формируется более плотная сосудистая сеть, состоящая как из капилляров, так и из артериол, чем в матригелях с ^модифицированными СКЖТ или СКЖТ, гиперэкспрессирующими маркерный ген ОБР.

На модели ишемии задней конечности у этой же линии мышей было показано эффективное восстановление кровотока в ишемизированной мышце при внутримышечной трансплантации СКЖТ, гиперсекретирующих УЕОБ.

На 20 день после введения УЕОР-СКЖТ перфузия конечности достигала

85% от перфузии здоровой контр латеральной конечности, тогда как при

127 введении контрольных клеток данный показатель не достигал 60%. Кроме того, продуцирующие VEGF клетки обладали большим тканепротективным эффектом по сравнению с введением интактных СКЖТ или GFP-СКЖТ, что проявлялось в почти двукратном уменьшении доли некроза в мышце. По-видимому, именно восстановление кровотока и препятствовало развитию некроза мышц, так как мы наблюдали значимое увеличение плотности сосудов в мышцах, в которые вводили модифицированные СКЖТ. Причем, как и в случае с васкуляризацией матригелей при использовании VEGF-СКЖТ отмечено формирование зрелой сосудистой сети с пропорциональным увеличением количества как капилляров, так и артериол. Ни в одном случае мы не обнаружили формирования ангиом при трансплантации модифицированных клеток, несмотря на высокую продукцию ими VEGF, что, по-видимому, обусловлено продукцией этими клетками стабилизирующих сосуды факторов.

Используя метод культивирования мышечных эксплантов, мы показали, что трансплантированные клетки более 20 дней сохраняют свою функциональную активность и секретируют VEGF.

Полученные в работе данные демонстрируют возможность существенного повышения эффективности клеточной терапии мезенхимальными стромальными клетками, направленной на стимуляцию роста сосудов при ишемии тканей, с помощью генетического модифицирования клеток аденоассоциированной вирусной конструкцией, экспрессирующей VEGF.

Разработка на основе полученных результатов клинически пригодной технологии клеточной терапии в будущем позволит преодолеть проблему недостаточной эффективности генной и клеточной терапии самых распространенных заболеваний человека - ишемической болезни сердца, ишемического инсульта и ишемии нижних конечностей. Однако разработке клинических протоколов оценки эффективности этой технологии должны предшествовать исследования по оптимизации условий ex vivo экспансии и

128 модифицирования СКЖТ, использованию регулируемых и тканеспецифичных промоторов для экспрессии трансгена, а также изучение возможных побочных эффектов на длительных сроках после трансплантации клеток.

Помимо этого, генетически модифицированные СКЖТ могут быть использованы в тканевой инженерии для создания сосудистых трансплантатов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шевченко, Евгений Константинович, Москва

1. Ефименко А.Ю., Старостина Е.Е., Рубина К.А. и др. Влияние гипоксии и воспалительных факторов на жизнеспособность и ангиогенную активность мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани и костного мозга. Цитология. 2010; 52(2): 144-154.

2. Парфенова Е.В., Цоколаева З.И., Трактуев Д.О. и др. Поиск новых «инструментов» для терапевтического ангиогенеза. Молекулярная медицина. 2006; 2: 10-23.

3. Парфенова Е.В., Плеханова О.С., Меньшиков М.Ю. и др. Регуляция роста и ремоделирования кровеносных сосудов: уникальная роль урокиназы. Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. 2009; 95(5):442-464.

4. Трактуев Д.О., Марч К.Л., Ткачук В.А., и др. Стромальные клетки жировой ткани мультипотентные клетки с высоким терапевтическим потенциалом для стимуляции ангиогенеза при ишемии тканей. Кардиология. 2006; 5: 69-85.

5. Abraham M.R., Henrikson С.А., Tung L., et al. Antiarrhythmic engineering of skeletal myoblasts for cardiac transplantation. Circ Res. 2005; 97(2): 159-67.

6. Airenne K.J., Makkonen K.E., Mahonen A.J., et al. Baculoviruses mediate efficient gene expression in a wide range of vertebrate cells. Methods Mol Biol. 2011; 737: 279-301.

7. Amalfitano A. Next-generation adenoviral vectors: new and improved. Gene Ther. 1999; 6(10): 1643-5.

8. Armulik A., Abramsson A., Betsholtz C. Endothelial/pericyte interactions. Circ Res. 2005; 97(6): 512-23.

9. Asahara Т., Takahashi Т., Masuda H., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. EMBO J. 1999; 18(14): 3964-72.

10. Attanasio S., Snell J. Therapeutic angiogenesis in the management of critical limb ischemia: current concepts and review. Cardiol Rev. 2009; 17(3): 115-20.

11. Bagatolli L.A., Ipsen J.H., Simonsen A.C., et al. An outlook on organization of lipids in membranes: searching for a realistic connection with the organization of biological membranes. Prog Lipid Res. 2010; 49(4): 378-89.

12. Ball S.G., Shuttleworth C.A., Kielty C.M. Vascular endothelial growth factor can signal through platelet-derived growth factor receptors. J Cell Biol. 2007; 177(3): 489-500.

13. Bantel-Schaal U., Stohr M. Influence of adeno-associated virus on adherence and growth properties of normal cells. J Virol. 1992; 66(2): 773-9.

14. Barleon В., Siemeister G., Martiny-Baron G., et al. Vascular endothelial growth factor up-regulates its receptor fms-like tyrosine kinase 1 (FLT-1) and a soluble variant of FLT-1 in human vascular endothelial cells. Cancer Res. 1997; 57(23): 5421-5.

15. Bartlett J.S., Wilcher R., Samulski R.J. Infectious entry pathway of adenoassociated virus and adeno-associated virus vectors. J Virol. 2000; 74(6): 2777-85.133

16. Bashir R., Vale P.R., Isner J.M., et al. Angiogenic gene therapy: pre-clinical studies and phase I clinical data. Kidney Int. 2002; 61(1 Suppl): 110-4.

17. Benjamin L.E., Hemo I., Keshet E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 1998; 125(9): 1591-8.

18. Beohar N., Rapp J., Pandya S., et al. Rebuilding the damaged heart: the potential of cytokines and growth factors in the treatment of ischemic heart disease. J Am Coll Cardiol. 2010; 56(16): 1287-97.

19. Bhakta S., Hong P., Koc O. The surface adhesion molecule CXCR4 stimulates mesenchymal stem cell migration to stromal cell-derived factor-1 in vitro but does not decrease apoptosis under serum deprivation. Cardiovasc Revasc Med. 2006; 7(1): 19-24.

20. Blasi F. Proteolysis, cell adhesion, chemotaxis, and invasiveness are regulated by the u-PA-u-PAR-PAI-1 system. Thromb Haemost. 1999; 82(2): 298304.

21. Bobik A., Tkachuk V. Metalloproteinases and plasminogen activators in vessel remodeling. Curr Hypertens Rep. 2003; 5(6): 466-72.

22. Borselli C., Storrie H., Benesch-Lee F., et al. Functional muscle regeneration with combined delivery of angiogenesis and myogenesis factors. Proc Natl Acad Sci USA. 2010; 107(8): 3287-92.

23. Boyle A.J., McNiece I.K., Hare J.M. Mesenchymal stem cell therapy for cardiac repair. Methods Mol Biol. 2010; 660: 65-84.

24. Bundy B.C., Franciszkowicz M.J., Swartz J.R. Escherichia coli-based cellfree synthesis of virus-like particles. Biotechnol Bioeng. 2008; 100(1): 28-37.

25. Burton E.A., Fink D.J., Glorioso J.C. Gene delivery using herpes simplex virus vectors. DNA Cell Biol. 2002; 21(12): 915-36.

26. Buschmann I.R., Hoefer I.E., van Royen N., et al. GM-CSF: a strong arteriogenic factor acting by amplification of monocyte function. Atherosclerosis. 2001; 159(2): 343-56.

27. Cao Y., Sun Z., Liao L., et al. Human adipose tissue-derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascularization in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 332(2): 370-9.

28. Cao Y. Monotherapy versus combination therapy of angiogenic and arteriogenic factors for the treatment of ischemic disorders. Curr Mol Med. 2009; 9(8): 967-72.

29. Cao Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits? Discov Med. 2010; 9(46): 179-84.

30. Calderon D., Planat-Benard V., Bellamy V., et al. Immune response to human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors and adipose-derived stromal cells. J Cell Mol Med. 2011; in press.

31. Campos S.K., Barry M.A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 2007; 7(3): 189-204.

32. Carmeliet P., Ferreira V., Breier G., et al. Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single VEGF allele. Nature. 1996; 380(6573): 435-9.

33. Carmeliet P., Jain R.K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 2011; 473 (7347): 298-307.

34. Casteilla L., Planat-Benard V., Cousin B., et al. Plasticity of adipose tissue: a promising therapeutic avenue in the treatment of cardiovascular and blood diseases? Arch Mai Coeur Vaiss. 2005; 98(9): 922-6.

35. Cervelli T., Palacios J.A., Zentilin L., et al. Processing of recombinant AAV genomes occurs in specific nuclear structures that overlap with foci of DNA-damage-response proteins. J Cell Sci. 2008; 121(Pt 3): 349-57.

36. Chalothorn D., Faber J.E. Strain-dependent variation in collateral circulatory function in mouse hindlimb. Physiol Genomics. 2010; 42(3): 469-79.

37. Check E. Sanctions agreed over teenager's gene-therapy death. Nature. 2005; 433(7027): 674.

38. Chen X.S., Casini G., Harrison S.C., et al. Papillomavirus capsid protein expression in Escherichia coli: purification and assembly of HPV 11 and HPV 16 LI. J Mol Biol. 2001; 307(1): 173-82.

39. Chen H.Z., Wu C.P., Chao Y.C., et al. Membrane penetrating peptides greatly enhance baculovirus transduction efficiency into mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 2011; 405(2): 297-302.

40. Cheng T., Xu C.Y., Wang Y.B., et al. A rapid and efficient method to express target genes in mammalian cells by baculovirus. World J Gastroenterol. 2004; 10(11): 1612-8.

41. Cockrell A.S., Kafri T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 2007; 36(3): 184-204.

42. Condreay J.P., Witherspoon S.M., Clay W.C., et al. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sei USA. 1999; 96(1): 127-32.

43. Conrad C.K., Allen S.S., Afione S.A., et al. Safety of single-dose administration of an adeno-associated virus (AAV)-CFTR vector in the primate lung. Gene Ther. 1996; 3(8): 658-68.

44. Couffmhal T., Silver M., Zheng L.P., et al. Mouse model of angiogenesis. Am J Pathol. 1998; 152(6): 1667-79.

45. Coultas L., Chawengsaksophak K., Rossant J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 2005; 438(7070): 937-45.

46. Datta S.R., Brunet A., Greenberg M.E. Cellular survival: a play in three Akts. Genes Dev. 1999; 13(22): 2905-27.

47. Deyle D.R., Russell D.W. Adeno-associated virus vector integration. Curr Opin Mol Ther. 2009; 11(4): 442-7.

48. Dimmeier S., Aicher A., Vasa M., et al. HMG-CoA reductase inhibitors (statins) increase endothelial progenitor cells via the PI 3-kinase/Akt pathway. J Clin Invest. 2001; 108(3): 391-7.

49. Distler J.H., Hirth A., Kurowska-Stolarska M., et al. Angiogenic and angiostatic factors in the molecular control of angiogenesis. Q J Nucl Med. 2003; 47(3): 149-61.

50. Dokka S., Toledo D., Shi X., et al. Oxygen radical-mediated pulmonary toxicity induced by some cationic liposomes. Pharm Res. 2000; 17(5): 521-5.

51. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8(4): 315-7.

52. Dong C., Goldschmidt-Clermont P.J. Endothelial progenitor cells: a promising therapeutic alternative for cardiovascular disease. J Interv Cardiol. 2007; 20(2): 93-9.

53. Dor Y., Djonov V., Abramovitch R., et al. Conditional switching of VEGF provides new insights into adult neovascularization and pro-angiogenic therapy. EMBO J. 2002; 21(8): 1939-47.

54. Dropulic B. Lentiviral vectors: their molecular design, safety, and use in laboratory and preclinical research. Hum Gene Ther. 2011; 22(6): 649-57.

55. Du B., Wu P., Boldt-Houle D.M., et al. Efficient transduction of human neurons with an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 1996; 3(3): 254-61.

56. Duan D., Yue Y., Engelhardt J.F. Dual vector expansion of the recombinant AAV packaging capacity. Methods Mol Biol. 2003; 219: 29-51.

57. Efimenko A., Starostina E., Kalinina N., et al. Angiogenic properties of aged adipose derived mesenchymal stem cells after hypoxic conditioning. J Transl Med. 2011; 9: 0.

58. El-Ftesi S., Chang E. I., Longaker M. T., et al. Aging and diabetes impair the neovascular potential of adipose-derived stromal cells. Plast Reconstr Surg. 2009; 123(2):475-85.

59. Ewert K.K., Ahmad A., Evans H.M., et al. Cationic lipid-DNA complexes for non-viral gene therapy: relating supramolecular structures to cellular pathways. Expert Opin Biol Ther. 2005; 5(1): 33-53.

60. Ferrara N., Henzel W.J. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 1989; 161(2): 851-8.

61. Ferrara N., Gerber H.P., LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 2003; 9(6): 669-76.

62. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocr Rev. 2004; 25(4): 581-611.

63. Filipowicz W., Bhattacharyya S.N., Sonenberg N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nat Rev Genet. 2008; 9(2): 102-14.

64. Fischer L.J., Mcllhenny S., Tulenko T., et al. Endothelial differentiation of adipose-derived stem cells: effects of endothelial cell growth supplement and shear force. J Surg Res. 2009; 152(1): 157-66.

65. Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat Med. 1995; 1(1): 27-31.

66. Frontini M.J., Nong Z., Gros R., et al. Fibroblast growth factor 9 delivery during angiogenesis produces durable, vasoresponsive microvessels wrapped by smooth muscle cells. Nature Biotechnology. 2011; 29(5): 421-427.

67. Fuh G., Li B., Crowley C., et al. Requirements for binding and signaling of the kinase domain receptor for vascular endothelial growth factor. J Biol Chem. 1998; 273(18): 11197-204.

68. Fujita R., Matsuyama T., Yamagishi J., et al. Expression of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus genes in mammalian cells and upregulation of the host beta-actin gene. J Virol. 2006; 80(5): 2390-5.

69. Fynan E.F., Webster R.G., Fuller D.H., et al. DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations. Proc Natl Acad Sei USA. 1993; 90(24): 11478-82.

70. Galibert L., Merten O.W. Latest developments in the large-scale production of adeno-associated virus vectors in insect cells toward the treatment of neuromuscular diseases. J Invertebr Pathol. 2011; 107 Suppl: S80-93.

71. Germani A., Di Carlo A., Mangoni A., et al. Vascular endothelial growth factor modulates skeletal myoblast function. Am. J. Pathol. 2003; 163(4): 1417-28.

72. Germani A., Di Campli C., Pompilio G., et al. Regenerative therapy in peripheral artery disease. Cardiovasc Ther. 2009; 27(4): 289-304.

73. Ghosh A., Yue Y., Lai Y., et al. A hybrid vector system expands adeno-associated viral vector packaging capacity in a transgene-independent manner. Mol Ther. 2008; 16(1): 124-30.

74. Giannotti G., Doerries C., Mocharla P.S., et al. Impaired endothelial repair capacity of early endothelial progenitor cells in prehypertension: relation to endothelial dysfunction. Hypertension. 2010; 55(6): 1389-97.

75. Gleiter S., Lilie H. Cell-type specific targeting and gene expression using a variant of polyoma VP1 virus-like particles. Biol Chem. 2003; 384(2): 247-55.

76. Gnecchi M., He H., Liang O.D., et al. Paracrine action accounts for marked protection of ischemic heart by Akt-modified mesenchymal stem cells. Nat Med. 2005; 11(4): 367-8.

77. Godbey W.T., Mikos A.G. Recent progress in gene delivery using non-viral transfer complexes. J Control Release. 2001; 72(1-3): 115-25.

78. Golzio M., Mora M.P., Raynaud C., et al. Control by osmotic pressure of voltage-induced permeabilization and gene transfer in mammalian cells. Biophys J. 1998; 74(6): 3015-22.

79. Gong B., Liang D., Chew T.G., et al. Characterization of the zebrafishvascular endothelial growth factor A gene: comparison with vegf-A genes inmammals and Fugu. Biochim Biophys Acta. 2004; 1676(1): 33-40.139

80. Gospodarowicz D., Abraham J.A., Schilling J. Isolation and characterization of a vascular endothelial cell mitogen produced by pituitary-derived folliculo stellate cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1989; 86(19): 7311-5.

81. Gounis M.J., Spiga M.G., Graham R.M., et al. Angiogenesis is confined to the transient period of VEGF expression that follows adenoviral gene delivery to ischemic muscle. Gene Ther. 2005; 12(9): 762-71.

82. Grant C.A., Ponnazhagan S., Wang X.S., et al. Evaluation of recombinant adeno-associated virus as a gene transfer vector for the retina. Curr Eye Res. 1997; 16(9): 949-56.

83. Gray S.J., Samulski R.J. Optimizing gene delivery vectors for the treatment of heart disease. Expert Opin Biol Ther. 2008; 8(7): 911-22.

84. Grieger J.C., Choi V.W., Samulski R.J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 2006; 1(3): 1412-28.

85. Griffin M., Greiser U., Barry F., et al. Genetically modified mesenchymal stem cells and their clinical potential in acute cardiovascular disease. Discov Med. 2010; 9(46): 219-23.

86. Grimm D., Kern A., Rittner K., Kleinschmidt J.A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther. 1998; 9(18): 2745-60.

87. Grimm D., Kleinschmidt J.A. Progress in adeno-associated virus type 2 vector production: promises and prospects for clinical use. Hum Gene Ther. 1999; 10(15): 2445-50.

88. Grines C.L., Watkins M.W., Helmer G., et al. Angiogenic Gene Therapy (AGENT) trial in patients with stable angina pectoris. Circulation. 2002; 105(11): 1291-7.

89. Grines C.L., Watkins M.W., Mahmarian J.J., et al. A randomized, doubleblind, placebo-controlled trial of Ad5FGF-4 gene therapy and its effect on myocardial perfusion in patients with stable angina. J Am Coll Cardiol. 2003; 42(8): 1339-47.

90. Gronthos S., Franklin D.M., Leddy H.A., et al. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J Cell Physiol. 2001; 189(1): 54-63.

91. Grunewald M., Avraham I., Dor Y., et al. VEGF-induced adult neovascularization: recruitment, retention, and role of accessory cells. Cell. 2006; 124(1): 175-89.

92. Gupta R., Tongers J., Losordo D.W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 2009; 105(8): 724-36.

93. Hagikura K., Fukuda N., Yokoyama S., et al. Low invasive angiogenic therapy for myocardial infarction by retrograde transplantation of mononuclear cells expressing the VEGF gene. Int J Cardiol. 2010; 142(1): 56-64.

94. Halbert C.L., Alexander I.E., Wolgamot G.M., et al. Adeno-associated virus vectors transduce primary cells much less efficiently than immortalized cells. J Virol. 1995; 69(3): 1473-9.

95. Hattan N., Kawaguchi H., Ando K., et al. Purified cardiomyocytes from bone marrow mesenchymal stem cells produce stable intracardiac grafts in mice. Cardiovasc Res. 2005; 65(2): 334-44.

96. Hattori K., Dias S., Heissig B., et al. Vascular endothelial growth factor andangiopoietin-1 stimulate postnatal hematopoiesis by recruitment of vasculogenicand hematopoietic stem cells. J Exp Med. 2001; 193(9): 1005-14.141

97. Heeschen C., Lehmann R., Honold J., et al. Profoundly reduced neovascularization capacity of bone marrow mononuclear cells derived from patients with chronic ischemic heart disease. Circulation. 2004; 109(13): 1615-22.

98. Heil M., Schaper W. Influence of mechanical, cellular, and molecular factors on collateral artery growth (arteriogenesis). Circ Res. 2004; 95(5): 449-58.

99. Heil M., Ziegelhoeffer T., Mees B., et al. A different outlook on the role of bone marrow stem cells in vascular growth: bone marrow delivers software not hardware. Circ Res. 2004; 94(5): 573-4.

100. Henry T.D., Annex B.H., McKendall G.R., et al. The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis. Circulation. 2003; 107(10): 1359-65.

101. Henry T.D., Grines C.L., Watkins M.W., et al. Effects of Ad5FGF-4 in patients with angina: an analysis of pooled data from the AGENT-3 and AGENT-4 trials. J Am Coll Cardiol. 2007; 50(11): 1038-46.

102. Hodgkinson C.P., Gomez J.A., Mirotsou M., et al. Genetic engineering of mesenchymal stem cells and its application in human disease therapy. Hum Gene Ther. 2010; 21(11): 1513-26.

103. Holmes D.I., Zachary I. The vascular endothelial growth factor (VEGF) family: angiogenic factors in health and disease. Genome Biol. 2005; 6(2): 209.

104. Hormann M., Mey L., Kharip Z., et al. Vascular endothelial growth factor confers endothelial resistance to apoptosis through poly(ADP-ribose) polymerase. J Thromb Haemost. 2011; 9(7): 1391-403.

105. Houck K.A., Leung D.W., Rowland A.M., et al. Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms. J Biol Chem. 1992; 267(36): 26031-7.

106. Howe S.J., Mansour M.R., Schwarzwaelder K., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 2008; 118(9): 3143-50.

107. Hsu C.S., Ho Y.C., Wang K.C., et al. Investigation of optimal transduction conditions for baculovirus-mediated gene delivery into mammalian cells. Biotechnol Bioeng. 2004; 88(1): 42-51.

108. Hsu C.C., Li H.P., Hung Y.H., et al. Targeted methylation of CMV and E1A viral promoters. Biochem Biophys Res Commun. 2010; 402(2): 228-34.

109. Hu Y.C. Baculovirus vectors for gene therapy. Adv Virus Res. 2006; 68: 287-320.

110. Hu X., Yu S.P., Fraser J.L., et al. Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis. J Thorac Cardiovasc Surg. 2008; 135(4): 799808.

111. Hu Y.C. Baculovirus: a promising vector for gene therapy? Curr Gene Ther. 2010; 10(3): 167.

112. Huang L.E., Bunn H.F. Hypoxia-inducible factor and its biomedical relevance. J Biol Chem. 2003; 278(22): 19575-8.

113. Huang Z., Elkin G., Maloney B.J., et al. Virus-like particle expression and assembly in plants: hepatitis B and Norwalk viruses. Vaccine. 2005; 23(15): 18518.

114. Huang S.C., Wu T.C., Yu H.C., et al. Mechanical strain modulates age-related changes in the proliferation and differentiation of mouse adipose-derived stromal cells. BMC Cell Biol. 2010; 11-18.

115. Huttner N.A., Girod A., Perabo L., et al. Genetic modifications of the adeno-associated virus type 2 capsid reduce the affinity and the neutralizing effects of human serum antibodies. Gene Ther. 2003; 10(26): 2139-47.

116. Ikeda Y., Fukuda N., Wada M., et al. Development of angiogenic cell and gene therapy by transplantation of umbilical cord blood with vascular endothelial growth factor gene. Hypertens Res. 2004; 27(2): 119-28.

117. Inoue H., Nojima H., Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 1990; 96(1): 23-8.

118. Ishikawa K., Tilemann L., Fish K., et al. Gene delivery methods in cardiac gene therapy. J Gene Med. 2011; 13(10): 566-72.

119. Iwaguro H., Yamaguchi J., Kalka C., et al. Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration. Circulation. 2002; 105(6): 732-8.

120. Jain R.K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 2003; 9(6): 685-93.

121. Jang H.S., Kim H.J., Kim J.M., et al. A novel ex vivo angiogenesis assay based on electroporation-mediated delivery of naked plasmid DNA to skeletal muscle. Mol Ther. 2004; 9(3): 464-74.

122. Jiang H., Pierce G.F., Ozelo M.C., et al. Evidence of multiyear factor IX expression by AAV-mediated gene transfer to skeletal muscle in an individual with severe hemophilia B. Mol Ther. 2006; 14(3): 452-5.

123. Jiang M., Wang B., Wang C., et al. In vivo enhancement of angiogenesis by adenoviral transfer of HIF-1 alpha-modified endothelial progenitor cells (Ad-HIF-1 alpha-modified EPC for angiogenesis). Int J Biochem Cell Biol. 2008; 40(10): 2284-95.

124. Jordan M., Wurm F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 2004; 33(2): 136-43.

125. Jun E.S., Lee T.H., Cho H.H., et al. Expression of telomerase extends longevity and enhances differentiation in human adipose tissue-derived stromal cells. Cell Physiol Biochem. 2004; 14(4-6): 261-8.

126. Kaikkonen M.U., Yla-Herttuala S., Airenne K.J. How to avoid complement attack in baculovirus-mediated gene delivery. J Invertebr Pathol. 2011; 107 (Suppl): S71-9.

127. Kaiser J. Gene therapy. Seeking the cause of induced leukemias in X-SCID trial. Science. 2003; 299(5606): 495.

128. Kalka C., Masuda H., Takahashi T., et al. Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization. Proc Natl Acad Sei USA. 2000; 97(7): 3422-7.

129. Kam N.W., O'Connell M., Wisdom J.A., et al. Carbon nanotubes as multifunctional biological transporters and near-infrared agents for selective cancer cell destruction. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102(33): 11600-5.

130. Kang S.K., Lee D.H., Bae Y.C., et al. Improvement of neurological deficits by intracerebral transplantation of human adipose tissue-derived stromal cells after cerebral ischemia in rats. Exp Neurol. 2003; 183(2): 355-66.

131. Kang S.W., Lim H.W., Seo S.W., et al. Nanosphere-mediated delivery of vascular endothelial growth factor gene for therapeutic angiogenesis in mouse ischemic limbs. Biomaterials. 2008; 29(8): 1109-17.

132. Katz A.J., Tholpady A., Tholpady S.S., et al. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 2005; 23(3):412-23.

133. Kawamoto A., Gwon H.C., Iwaguro H., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 2001; 103(5): 634-7.

134. Kern S., Eichler H., Stoeve J., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 2006; 24(5): 1294-301.

135. Khare R., Chen C.Y., Weaver E.A., et al. Advances and future challenges in adenoviral vector pharmacology and targeting. Curr Gene Ther. 2011; 11(4): 24158.

136. Khurana R., Simons M. Insights from angiogenesis trials using fibroblast growth factor for advanced arteriosclerotic disease. Trends Cardiovasc Med. 2003; 13(3): 116-22.

137. Kinnaird T., Stabile E., Burnett M.S., et al. Bone-marrow-derived cells for enhancing collateral development: mechanisms, animal data, and initial clinical experiences. Circ Res. 2004; 95(4): 354-63.

138. Klein D., Hohn H.P., Kleff V., et al. Vascular wall-resident stem cells. Histol Histopathol. 2010; 25(5): 681-9.

139. Koch S., Tugues S., Li X., et al. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Biochem J. 2011; 437(2): 169-83.

140. Koerber J.T., Jang J.H., Yu J.H., et al. Engineering adeno-associated virus for one-step purification via immobilized metal affinity chromatography. Hum Gene Ther. 2007; 18(4): 367-78.

141. Kost T.A., Condreay J.P., Jarvis D.L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat Biotechnol. 2005; 23(5): 567-75.

142. Kuai R., Yuan W., Li W., et al. Targeted Delivery of Cargoes into a Murine Solid Tumor by a Cell-Penetrating Peptide and Cleavable Poly(ethylene glycol) Comodified Liposomal Delivery System via Systemic Administration. Mol Pharm. 2011; in press

143. Kube D.M., Ponnazhagan S., Srivastava A. Encapsidation of adeno-associated virus type 2 Rep proteins in wild-type and recombinant progeny virions: Rep-mediated growth inhibition of primary human cells. J Virol. 1997; 71(10): 7361-71.

144. Kwon I., Schaffer D.V. Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Pharm Res. 2008; 25(3): 489-99.

145. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259): 680-5.

146. Lapidot T. Mechanism of human stem cell migration and repopulation of NOD/SCID and B2mnull NOD/SCID mice. The role of SDF-1/CXCR4 interactions. Ann N Y Acad Sci. 2001; 938: 83-95.

147. Lavu M., Gundewar S., Lefer D.J. Gene therapy for ischemic heart disease. J Mol Cell Cardiol. 2011; 50(5): 742-50.

148. Lawall H, Bramlage P, Amann B. Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy. J Vase Surg. 2011; 53(2): 445-53.

149. Lee R.H., Kim B., Choi I., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 2004; 14(4-6): 311-24.

150. Lehrman S. Virus treatment questioned after gene therapy death. Nature. 1999; 401(6753): 517-8.

151. Lendahl U., Lee K.L., Yang H., et al. Generating specificity and diversity in the transcriptional response to hypoxia. Nat Rev Genet. 2009; 10(12): 821-32.

152. Leri A., Kajstura J., Anversa P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 2005 Oct; 85(4): 1373-416.

153. Lesch H.P., Turpeinen S., Niskanen E.A., et al. Generation of lentivirus vectors using recombinant baculoviruses. Gene Ther. 2008; 15(18): 1280-6.

154. Li B., Zeng Q., Wang H., et al. Adipose tissue stromal cells transplantation in rats of acute myocardial infarction. Coron Artery Dis. 2007A; 18(3): 221-7.

155. Li W., Ma N., Ong L.L., et al. Bcl-2 engineered MSCs inhibited apoptosis and improved heart function. Stem Cells. 2007B; 25(8): 2118-27.

156. Lin Y., Weisdorf D.J., Solovey A., et al. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 2000; 105(1): 71-7.

157. Lin Y., Chen X., Yan Z., et al. Multilineage differentiation of adipose-derived stromal cells from GFP transgenic mice. Mol Cell Biochem. 2006; 285(1-2): 69-78.

158. Liu Y.P., Berkhout B. miRNA cassettes in viral vectors: Problems and solutions. Biochim Biophys Acta. 2011; 1809(11-12): 732-45.

159. Locke M., Feisst V., Dunbar P. R. Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need. Stem Cells. 2011; 29(3): 404-11.

160. Lu H., Xu X., Zhang M., et al. Combinatorial protein therapy of angiogenic and arteriogenic factors remarkably improves collaterogenesis and cardiac function in pigs. Proc Natl Acad Sci USA. 2007; 104(29): 12140-5.

161. Lyon A.R., Sato M., Hajjar R.J., et al. Gene therapy: targeting the myocardium. Heart. 2008; 94(1): 89-99.

162. Mac Gabhann F., Annex B.H., Popel A.S. Gene therapy from the perspective of systems biology. Curr Opin Mol Ther. 2010; 12(5): 570-7.

163. Mac Gabhann F., Peirce S.M. Collateral capillary arterialization following arteriolar ligation in murine skeletal muscle. Microcirculation. 2010; 17(5): 33347.

164. Madonna R., De Caterina R. Adipose tissue: a new source for cardiovascular repair. J Cardiovasc Med (Hagerstown). 2010; 11(2): 71-80.

165. Madonna R., Renna F. V., Cellini C., et al. Age-dependent impairment of number and angiogenic potential of adipose tissue-derived progenitor cells. Eur J Clin Invest. 2011; 41(2): 126-33.

166. Malboeuf C.M., Simon D.A., Lee Y.E., et al. Human papillomavirus-like particles mediate functional delivery of plasmid DNA to antigen presenting cells in vivo. Vaccine. 2007; 25(17): 3270-6.

167. Mangi A.A., Noiseux N., Kong D., et al. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts. Nat Med. 2003; 9(9): 1195-201.

168. Manso A.M., Kang S.M., Ross R.S. Integrins, focal adhesions, and cardiac fibroblasts. J Investig Med. 2009; 57(8): 856-60.

169. Mathiasen A.B., Haack-Sorensen M., Kastrup J. Mesenchymal stromal cells for cardiovascular repair: current status and future challenges. Future Cardiol. 2009; 5(6): 605-17.

170. Matsumoto R., Omura T., Yoshiyama M., et al. Vascular endothelial growth factor-expressing mesenchymal stem cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2005; 25(6): 1168-73.

171. Matsuoka H., Sisson T.H., Nishiuma T., et al. Plasminogen-mediated activation and release of hepatocyte growth factor from extracellular matrix. Am J Respir Cell Mol Biol. 2006; 35(6): 705-13.

172. McCarty D.M., Young S.M. Jr., Samulski R.J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annu Rev Genet. 2004; 38: 819-45.

173. Meliga E., Strem B.M., Duckers H.J., et al. Adipose-derived cells. Cell Transplant. 2007; 16(9): 963-70.

174. Menasche P., Hagege A.A., Vilquin J.T., et al. Autologous skeletal myoblast transplantation for severe postinfarction left ventricular dysfunction. J Am Coll Cardiol. 2003; 41(7): 1078-83.

175. Menasche P. Cardiac cell therapy trials: chronic myocardial infarction and congestive heart failure. J Cardiovasc Transl Res. 2008; 1(3): 201-6.

176. Merdan T., Kopecek J., Kissel T. Prospects for cationic polymers in gene and oligonucleotide therapy against cancer. Adv Drug Deliv Rev. 2002; 54(5): 715-58.

177. Meuillet E.J., Mahadevan D., Vankayalapati H., et al. Specific inhibition of the Aktl pleckstrin homology domain by D-3-deoxy-phosphatidyl-myo-inositol analogues. Mol Cancer Ther. 2003; 2(4):389-99.

178. Mias C., Trouche E., Seguelas M.H., et al. Ex vivo pretreatment with melatonin improves survival, proangiogenic/mitogenic activity, and efficiency of mesenchymal stem cells injected into ischemic kidney.Stem Cells. 2008; 26(7): 1749-57.

179. Miranville A., Heeschen C., Sengenes C., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 2004; 110(3): 349-55.

180. Mirotsou M., Jayawardena T.M., Schmeckpeper J., et al. Paracrine mechanisms of stem cell reparative and regenerative actions in the heart. J Mol Cell Cardiol. 2011; 50(2): 280-9.

181. Mitchell J.B., Mcintosh K., Zvonic S., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 2006; 24(2): 376-85.

182. Moon M.H., Kim S.Y., Kim Y.J., et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve postnatal neovascularization in a mouse model of hindlimb ischemia. Cell Physiol Biochem. 2006; 17(5-6): 279-90.

183. Muller-Ehmsen J., Peterson K.L., Kedes L., et al. Rebuilding a damaged heart: long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function. Circulation. 2002; 105(14): 1720-6.

184. Murasawa S., Llevadot J., Silver M., et al. Constitutive human telomerase reverse transcriptase expression enhances regenerative properties of endothelial progenitor cells. Circulation. 2002; 106(9): 1133-9.

185. Murohara T., Shintani S., Kondo K. Autologous adipose-derived regenerative cells for therapeutic angiogenesis. Curr Pharm Des. 2009; 15(24):2784-90.

186. Muruve D.A. The innate immune response to adenovirus vectors. Hum Gene Ther. 2004; 15(12): 1157-66.

187. Musina R.A., Bekchanova E.S., Sukhikh G.T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 2005; 139(4): 504-9.

188. Myers T.J., Granero-Molto F., Longobardi L., et al. Mesenchymal stem cells at the intersection of cell and gene therapy. Expert Opin Biol Ther. 2010; 10(12): 1663-79.

189. Nakagami H., Morishita R., Maeda K., et al. Adipose tissue-derived stromal cells as a novel option for regenerative cell therapy. J Atheroscler Thromb. 2006; 13(2): 77-81.

190. Niagara M.I., Haider H.Kh., Ye L., et al. Autologous skeletal myoblasts transduced with a new adenoviral bicistronic vector for treatment of hind limb ischemia. J. Vasc.Surg. 2004; 40(4):774-85.

191. Niagara M.I., Haider H.Kh., Jiang S., et al. Pharmacologically preconditioned skeletal myoblasts are resistant to oxidative stress and promote angiomyogenesis via release of paracrine factors in the infarcted heart. Circ Res. 2007; 100(4): 545-55.

192. Nishishita T., Lin P.C. Angiopoietin 1, PDGF-B, and TGF-beta gene regulation in endothelial cell and smooth muscle cell interaction. J Cell Biochem. 2004; 91(3): 584-93.

193. Nowak D.G., Woolard J., Amin E.M., et al. Expression of pro- and anti-angiogenic isoforms of VEGF is differentially regulated by splicing and growth factors. J Cell Sci 2008; 121: 3487-3495.

194. Nyberg P., Xie L., Kalluri R. Endogenous inhibitors of angiogenesis. Cancer Res. 2005; 65(10): 3967-79.

195. Oelrichs R. B., Reid H. H., Bernard O., et al. NYK/FLK-1: a putative receptor protein tyrosine kinase isolated from E10 embryonic neuroepithelium is expressed in endothelial cells of the developing embryo. Oncogene. 1993; 8: 11-18

196. Okada T., Nonaka-Sarukawa M., Uchibori R., et al. Scalable purification of adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) and AAV8 vectors, using dual ionexchange adsorptive membranes. Hum Gene Ther. 2009; 20(9): 1013-21.

197. Otterbein L.E., Choi A.M. Heme oxygenase: colors of defense against cellular stress. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000; 279(6): LI029-37.

198. Pasha Z., Wang Y., Sheikh R., et al. Preconditioning enhances cell survival and differentiation of stem cells during transplantation in infarcted myocardium. Cardiovasc Res. 2008; 77(1): 134-42.

199. Pearlman J.D., Hibberd M.G., Chuang M.L., et al. Magnetic resonance mapping demonstrates benefits of VEGF-induced myocardial angiogenesis. Nat Med. 1995; 1(10): 1085-9.

200. Pearlman J.D., Laham R.J., Simons M. Coronary angiogenesis: detection in vivo with MR imaging sensitive to collateral neocirculation—preliminary study in pigs. Radiology. 2000; 214(3): 801-7.

201. Peden C.S., Burger C., Muzyczka N., et al. Circulating anti-wild-type adeno-associated virus type 2 (AAV2) antibodies inhibit recombinant AAV2 (rAAV2)-mediated, but not rAAV5-mediated, gene transfer in the brain. J Virol. 2004; 78(12): 6344-59.

202. Perin E.C., Dohmann H.F., Borojevic R., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 2003; 107(18): 2294-302.

203. Perrin R.M., Konopatskaya O., Qiu Y., et al. Diabetic retinopathy is associated with a switch in splicing from anti- to pro-angiogenic isoforms of vascular endothelial growth factor. Diabetologia. 2005; 48(11): 2422-7.

204. Pesce M., Orlandi A., Iachininoto M.G., et al. Myoendothelial differentiation of human umbilical cord blood-derived stem cells in ischemic limb tissues. Circ Res. 2003; 93(5): 51-62.

205. Pipp F., Boehm S., Cai W.J., et al. Elevated fluid shear stress enhancespostocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb.

206. Arterioscler Thromb Vase Biol. 2004; 24(9): 1664-8.152

207. Pittenger M.F., Martin B.J. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics. Circ Res. 2004; 95(1): 9-20.

208. Planat-Benard V., Menard C., Andre M., et al. Spontaneous cardiomyocyte differentiation from adipose tissue stroma cells. Circ Res. 2004; 94(2): 223-9.

209. Planat-Benard V., Silvestre J. S., Cousin B., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 2004; 109(5): 656-63.

210. Pleger S.T., Most P., Koch WJ. Recent findings into the potential of gene therapy to reverse heart failure. Expert Opin Biol Ther. 2007; 7(12): 1781-4.

211. Pluta K., Kacprzak M.M. Use of HIV as a gene transfer vector. Acta Biochim Pol. 2009; 56(4): 531-95.

212. Prunet-Marcassus B., Cousin B., Caton D., et al. From heterogeneity to plasticity in adipose tissues: site-specific differences. Exp Cell Res. 2006; 312(6): 727-36.

213. Puchtler H., Waldrop F.S., Valentine L.S. Polarization microscopic studies of connective tissue stained with picro-sirius red FBA. Beitr Pathol. 1973; 150(2): 174-87.

214. Qiao C., Koo T., Li J., et al. Gene therapy in skeletal muscle mediated by adeno-associated virus vectors. Methods Mol Biol. 2011; 807: 119-40.

215. Qing K., Mah C., Hansen J., et al. Human fibroblast growth factor receptor 1 is a co-receptor for infection by adeno-associated virus 2. Nat Med. 1999; 5(1): 717.

216. Reffelmann T., Kloner R.A. Intracoronary blood- or bone marrow-derived cell transplantation in patients with ischemic heart disease. Regen Med. 2009; 4(5): 709-19.

217. Rehman J., Traktuev D., Li J., et al. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation. 2004; 109(10):1292-8.

218. Renault M.A., Losordo D.W. Therapeutic myocardial angiogenesis. Microvasc Res. 2007; 74(2-3): 159-71.

219. Rey S., Semenza G.L. Hypoxia-inducible factor-1-dependent mechanisms of vascularization and vascular remodelling. Cardiovasc Res. 2010; 86(2): 236-42.

220. Ribatti D., Leali D., Vacca A., et al. In vivo angiogenic activity of urokinase: role of endogenous fibroblast growth factor-2. J Cell Sei. 1999; 112 (23): 4213-21.

221. Richardson T.P., Peters M.C., Ennett A.B., et al. Polymeric system for dual growth factor delivery. Nat Biotechnol. 2001; 19(11): 1029-34.

222. Robinson C.J., Stringer S.E. The splice variants of vascular endothelial growth factor (VEGF) and their receptors. J Cell Sei. 2001; 114(5): 853-65.

223. Roldao A., Mellado M.C., Castilho L.R., et al. Virus-like particles in vaccine development. Expert Rev Vaccines. 2010; 9(10): 1149-76.

224. Rubina K., Kalinina N., Efimenko A., et al. Adipose stromal cells stimulate angiogenesis via promoting progenitor cell differentiation, secretion of angiogenic factors, and enhancing vessel maturation. Tissue Eng Part A. 2009; 15(8): 2039-50.

225. Sadoun E., Reed M.J. Impaired angiogenesis in aging is associated with alterations in vessel density, matrix composition, inflammatory response, and growth factor expression. J Histochem Cytochem. 2003; 51(9): 1119-30.

226. Saksela O., Rifkin D.B. Release of basic fibroblast growth factor-heparan sulfate complexes from endothelial cells by plasminogen activator-mediated proteolytic activity. J Cell Biol. 1990; 110(3): 767-75.

227. Sardesai N.Y., Weiner D.B. Electroporation delivery of DNA vaccines: prospects for success. Curr Opin Immunol. 2011; 23(3): 421-9.

228. Schierling W., Troidl K., Mueller C., et al. Increased intravascular flow rate triggers cerebral arteriogenesis. J Cereb Blood Flow Metab. 2009; 29(4): 726-37.

229. Scholz D., Ito W., Fleming I., et al. Ultrastructure and molecular histologyof rabbit hind-limb collateral artery growth (arteriogenesis). 2000; 436(3): 257-70.154

230. Schott J.W., Galla M., Godinho T., et al. Viral and Non-Viral Approaches for Transient Delivery of mRNA and Protein. Curr Gene Ther. 2011; in press.

231. Seeger F.H., Haendeler J., Walter D.H., et al. p38 mitogen-activated protein kinase downregulates endothelial progenitor cells. Circulation. 2005; 111(9): 118491.

232. Semenza G.L. Vasculogenesis, angiogenesis, and arteriogenesis: mechanisms of blood vessel formation and remodeling. J Cell Biochem. 2007; 102: 840-847.

233. Semenza G.L. Oxygen homeostasis. WIREs Syst Biol Med. 2010; 2: 33661.

234. Sena-Esteves M., Saeki Y., Fraefel C., et al. HSV-1 amplicon vectors-simplicity and versatility. Mol Ther. 2000; 2(1): 9-15.

235. Senger D.R., Galli S.J., Dvorak A.M., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 1983; 219(4587): 983-5.

236. Shi Y. Y., Nacamuli R. P., Salim A., et al. The osteogenic potential of adipose-derived mesenchymal cells is maintained with aging. Plast Reconstr Surg. 2005; 116(6): 1686-96.

237. Shimamura M., Morishita R. Naked plasmid DNA for gene therapy. Curr Gene Ther. 2011; 11(6), in press.

238. Shujia J., Haider H.K., Idris N.M., et al. Stable therapeutic effects of mesenchymal stem cell-based multiple gene delivery for cardiac repair. Cardiovasc Res. 2008; 77(3): 525-33.

239. Shweiki D., Itin A., Soffer D., et al. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 1992; 359(6398): 843-5.

240. Shyu K. G., Chang H., Isner J. M. Synergistic effect of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor on neoangiogenesis in hypercholesterolemic rabbit model with acute hindlimb ischemia. Life Sci. 2003; 73(5): 563-79.

241. Simpson D.L., Boyd N.L., Kaushal S., et al. Use of human embryonic stem cell derived-mesenchymal cells for cardiac repair. Biotechnol Bioeng. 2012; 109(1): 274-83, in press.

242. Sisson T.H., Nguyen M.H., Yu B., et al. Urokinase-type plasminogen activator increases hepatocyte growth factor activity required for skeletal muscle regeneration. Blood. 2009; 114(24): 5052-61.

243. Six I., Kureishi Y., Luo Z., et al. Akt signaling mediates VEGF/VPF vascular permeability in vivo. FEBS Lett. 2002; 532(1-2): 67-9.

244. Springer M.L. A balancing act: therapeutic approaches for the modulation of angiogenesis. Curr Opin Investig Drugs. 2006; 7(3): 243-50.

245. Stilwell J.L., Samulski R.J. Role of viral vectors and virion shells in cellular gene expression. Mol Ther. 2004; 9(3): 337-46.

246. Stolzing A., Jones E., McGonagle D., et al. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: consequences for cell therapies. Mech Ageing Dev. 2008; 129(3): 163-73.

247. Storkebaum E., Lambrechts D., Carmeliet P. VEGF: once regarded as a specific angiogenic factor, now implicated in neuroprotection. Bioessays. 2004; 26(9): 943-54.

248. Strem B.M., Zhu M., Alfonso Z., et al. Expression of cardiomyocytic markers on adipose tissue-derived cells in a murine model of acute myocardial injury. Cytotherapy. 2005; 7(3): 282-91.

249. Subczynski W.K., Wisniewska A. Physical properties of lipid bilayer membranes: relevance to membrane biological functions. Acta Biochim Pol. 2000; 47(3): 613-25.

250. Summerford C., Samulski R.J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 1998; 72(2): 1438-45.

251. Summerford C., Bartlett J.S., Samulski R.J. AlphaVbeta5 integrin: a co-receptor for adeno-associated virus type 2 infection. Nat Med. 1999; 5(1): 78-82.

252. Sun Y., Li W., Lu Z., et al. Rescuing replication and osteogenesis of aged mesenchymal stem cells by exposure to a young extracellular matrix. FASEB J. 2011; 25(5): 1474-85.

253. Suzuki K., Brand N.J., Smolenski R.T., et al. Development of a novel method for cell transplantation through the coronary artery. Circulation. 2000; 102(19 Suppl 3): 111359-64.

254. Suzuki K., Murtuza B., Smolenski R.T., et al. Cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction using vascular endothelial growth factor-expressing skeletal myoblasts. Circulation. 2001; 104(12 Suppl 1): 1207-12.

255. Suzuki R., Oda Y., Utoguchi N., et al. Progress in the development of ultrasound-mediated gene delivery systems utilizing nano- and microbubbles. J Control Release. 2011; 149(1): 36-41.

256. Svenson S. Dendrimers as versatile platform in drug delivery applications. Eur J Pharm Biopharm. 2009; 71(3): 445-62.

257. Tkachuk V., Stepanova V., Little P.J., et al. Regulation and role of urokinase plasminogen activator in vascular remodelling. Clin Exp Pharmacol Physiol. 1996; 23(9): 759-65.

258. Takahashi T., Kalka C., Masuda H., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 1999; 5(4): 434-8.

259. Tang Y.L., Tang Y., Zhang Y.C., et al. Improved graft mesenchymal stem cell survival in ischemic heart with a hypoxia-regulated heme oxygenase-1 vector. J Am Coll Cardiol. 2005; 46(7): 1339-50.

260. Tang J., Xie Q., Pan G., et al. Mesenchymal stem cells participate in angiogenesis and improve heart function in rat model of myocardial ischemia with reperfusion. Eur J Cardiothorac Surg. 2006; 30(2): 353-61.

261. Tani H., Limn C.K., Yap C.C., et al. In vitro and in vivo gene delivery byrecombinant baculoviruses. J Virol. 2003; 77(18): 9799-808.157

262. Tepper O.M., Galiano R.D., Capla J.M., et al. Human endothelial progenitor cells from type II diabetics exhibit impaired proliferation, adhesion, and incorporation into vascular structures. Circulation. 2002; 106(22): 2781-6.

263. Tieleman D.P. The molecular basis of electroporation. BMC Biochem. 2004; 5: 10.

264. Tirlapur U.K., Konig K. Femtosecond near-infrared laser pulses as a versatile non-invasive tool for intra-tissue nanoprocessing in plants without compromising viability. Plant J. 2002; 31(3): 365-74.

265. Tokcaer-Keskin Z., Akar A.R., Ayaloglu-Butun F., et al. Timing of induction of cardiomyocyte differentiation for in vitro cultured mesenchymal stem cells: a perspective for emergencies. Can J Physiol Pharmacol. 2009; 87(2): 14350.

266. Touze A., Coursaget P. In vitro gene transfer using human papillomavirus-like particles. Nucleic Acids Res. 1998; 26(5): 1317-23.

267. Traktuev D.O., Prater D.N., Merfeld-Clauss S., et al. Robust functional vascular network formation in vivo by cooperation of adipose progenitor and endothelial cells. CircRes. 2009; 104(12): 1410-20.

268. Tsai C.T., Chuang C.K., Hu Y.C. Baculovirus-mediated gene transfer into mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 2009; 515: 339-51.

269. Urabe M., Ding C., Kotin R.M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Hum Gene Ther. 2002; 13(16): 1935-43.

270. Urbich C., Dimmeler S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ Res. 2004; 95(4): 343-53.

271. Vaessen S.F., Veldman R.J., Comijn E.M., et al. AAV gene therapy as a means to increase apolipoprotein (Apo) A-I and high-density lipoproteincholesterol levels: correction of murine ApoA-I deficiency. J Gene Med. 2009; 11(8): 697-707.

272. Vasa M., Fichtlscherer .S, Aicher A., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ Res. 2001; 89(1): 1-7.

273. Verma I.M., Weitzman M.D. Gene therapy: twenty-first century medicine. Annu Rev Biochem. 2005; 74: 711-38.

274. Viola J.R., El-Andaloussi S., Oprea I.I., et al. Non-viral nanovectors for gene delivery: factors that govern successful therapeutics. Expert Opin Drug Deliv. 2010; 7(6): 721-35.

275. Vitt U.A., Hsu S.Y, Hsueh A.J. Evolution and classification of cystine knot-containing hormones and related extracellular signaling molecules. Mol Endocrinol. 2001; 15(5): 681-94.

276. Volarevic V., Ljujic B., Stojkovic P., et al. Human stem cell research and regenerative medicine—present and future. Br Med Bull. 2011; 99: 155-68.

277. Wang Z., Zhu T., Qiao C., et al. Adeno-associated virus serotype 8 efficiently delivers genes to muscle and heart. Nat Biotechnol. 2005; 23(3): 321-8.

278. Wang J., Liao L., Tan J. Mesenchymal-stem-cell-based experimental and clinical trials: current status and open questions. Expert Opin Biol Ther. 2011; 11(7): 893-909.

279. Watanabe D. Medical application of herpes simplex virus. J Dermatol Sci. 2010; 57(2): 75-82.

280. Wicki A., Rochlitz C., Ritschard R., et al. Targeting tumor-associated endothelial cells: anti-VEGFR2-immunoliposomes mediate tumor-vessel disruption and inhibit tumor growth. Clin Cancer Res. 2011; in press.

281. Xiao X., Li J., Samulski R.J. Efficient long-term gene transfer into muscle tissue of immunocompetent mice by adeno-associated virus vector. J Virol. 1996; 70(11): 8098-108.

282. Xu Y.F., Zhang Y.Q., Xu X.M., et al. Papillomavirus virus-like particles as vehicles for the delivery of epitopes or genes. Arch Virol. 2006; 151(11): 2133-48.

283. Yau T.M., Kim C., Li G., et al. Enhanced angiogenesis with multimodal cell-based gene therapy. Ann Thorac Surg. 2007; 83(3): 1110-9.

284. Ye L., Haider H.Kh., Jiang S., et al. Improved angiogenic response in pig heart following ischaemic injury using human skeletal myoblast simultaneously expressing VEGF165 and angiopoietin-1. Eur. J. Heart .Fail. 2007; 9(1): 15-22.

285. Yi Y., Noh M.J., Lee K.H. Current advances in retroviral gene therapy. Curr GeneTher. 2011; 11(3): 218-28.

286. Yla-Herttuala S., Rissanen T.T., Vajanto I., et al. Vascular endothelial growth factors: biology and current status of clinical applications in cardiovascular medicine. J Am Coll Cardiol. 2007; 49(10): 1015-26.

287. Yu J.X., Huang X.F., Lv W.M., et al. Combination of stromal-derived factor-1 alpha and vascular endothelial growth factor gene-modified endothelial progenitor cells is more effective for ischemic neovascularization. J Vase Surg. 2009; 50(3): 608-16.

288. Zentilin L., Marcello A., Giacca M. Involvement of cellular double-stranded DNA break binding proteins in processing of the recombinant adeno-associated virus genome. J Virol. 2001; 75(24): 12279-87.

289. Zhang D. Z., Gai L. Y., Liu H. W., et al. Transplantation of autologous adipose-derived stem cells ameliorates cardiac function in rabbits with myocardial infarction. Chin Med J. 2007; 120(4): 300-7.

290. Zhang D., Fan G.C., Zhou X., et al. Over-expression of CXCR4 on mesenchymal stem cells augments myoangiogenesis in the infarcted myocardium. J Mol Cell Cardiol. 2008; 44(2): 281-92.

291. Zhang J., Cao R., Zhang Y., et al. Differential roles of PDGFR-alpha and PDGFR-beta in angiogenesis and vessel stability. FASEB J. 2009A; 23(1): 153-63.

292. Zhou C., Yang Q., Trempe J.P. Enhancement of UV-induced cytotoxicity by the adeno-associated virus replication proteins. Biochim Biophys Acta. 1999; 1444(3): 371-83.

293. Zhu M., Kohan E., Bradley J., et al. The effect of age on osteogenic, adipogenic and proliferative potential of female adipose-derived stem cells. J Tissue Eng Regen Med. 2009; 3(4): 290-301.

294. Zolotukhin S., Byrne B.J., Mason E., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 1999; 6(6): 973-85.

295. Zou Z., Zhang Y., Hao L., et al. More insight into mesenchymal stem cells and their effects inside the body. Expert Opin Biol Ther. 2010; 10(2): 215-30.

296. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001; 7(2): 211-28.

Информация о работе

Шевченко, Евгений Константинович
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Стимуляция ангиогенеза с помощью генетически модифицированных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, гиперэкспрессирующих фактор роста эндотелия сосудов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы