Стехиометрия минорных последовательностей и гетероплазмия митохондриального генома Beta vulgaris

Брагин, Антон Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Стехиометрия минорных последовательностей и гетероплазмия митохондриального генома Beta vulgaris
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Стехиометрия минорных последовательностей и гетероплазмия митохондриального генома Beta vulgaris"

На правах рукописи

004609077

БРАГИН АНТОН ГЕННАДЬЕВИЧ

СТЕХИОМЕТРИЯ МИНОРНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И ГЕТЕРОПЛАЗМИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА BETA VULGARIS

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискании учёной степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН 2010

Новосибирск 2010

004609077

Работа выполнена в лаборатории структуры генома Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Дымшиц Г.М.

Институт цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Першина Л. А.

Институт цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Гуляева Л.Ф.

Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение:

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита диссертации состоится «3 о»,

_2010 г. на утреннем заседании

диссертационного совета Д 003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: проспект акад. Лаврентьева 10, г. Новосибирск, 630090, тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@,bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан <«£>» 2010 г,

Учёный секретарь . / \

диссертационного совета, 11

доктор биологических наук I Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Митохондриальные геномы растений обладают рядом уникальных черт среда которых большие размеры, наличие протяженных некодирующих областей и комплексная организация, заключающаяся в прис утствии в составе митохондриальной фракции ДНК конкатемеров, о-структур, субгеномных кольцевых и линейных вариантов, стехиометрия которых может варьировать в том числе и для разных особей одного вида (Dale et al., 1981; Mikami et al. 1984; Dudareva et al., 1988; Ivanov et al., 2004). Традиционное представление геномов митохондрий растений в форме «основной хромосомы» - кольцевой молекулы, включающей все последовательности, полученные методом секвенирования мтДНК отдельного плазмотипа, - как правило не отражает их состояние in vivo, так как не учитывает отличия стехиометрии отдельных последовательностей в составе митохондриальной ДНК и возможность присутствия низкокопийных и рекомбиногенных вариантов. В настоящее время известно, что проявление ряда фенотипических признаков растений непосредственно связано с организацией митохондриальной ДНК, одним из примеров подобных признаков является цитоплазматическая мужская стерильность.

Признак цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) связан с присутствием в митохондриях особого типа генома, проявляется при наличии особого ядерного окружения и заключается в неспособности растения производить фертильную пыльцу. Для ряда видов растений молекулярная детерминанта ЦМС установлена, в то время как для сахарной свёклы (Beta vulgaris) она остаётся неизвестной, несмотря на многолетнюю историю исследования вопроса (Owen, 1945; Бузанов, 1968; Малецкий и др., 1991; Satoh et al., 2004; Matsuhira et al., 2007; Cheng et al., 2009). К настоящему времени полностью секвенированы два варианта «основной хромосомы» митохондриального генома В. vulgaris - обеспечивающий образование фертильной пыльцы (N-тип) и митохондриальный геном Svulg-типа, присутствие которого связано с ЦМС Оуэновского типа (Kubo et al., 2000; Satoh et al., 2004). Однако большое количество уникальных для каждого из геномов областей не позволяют связать ЦМС с утратой или приобретением какой-то отдельной последовательности. Анализ трансляционных спектров N и Svulg митохондрий также не позволил однозначно установить детерминанту ЦМС на белковом уровне (Ducos et al., 2001).

Для ряда видов растений показана роль увеличения (путём рекомбинации или избирательной амплификации) дозы отдельных химерных последовательностей мтДНК в развитии ЦМС (Dale et al., 1981; Mikami et al. 1984; Bailey-Serres et al., 1987); для фасоли (Phaseolus vulgaris) показана связь признака с избирательной амплификацией отдельных субгеномных вариантов (Arrieta-Montiel et al., 2001). Вероятно, что проявление признака ЦМС у В. vulgaris обеспечивается не только присутствием генома («основной хромосомы») определенного типа, но и составом и стехиометрией субгеномных вариантов. В этом случае, установление связи между ЦМС и структурой генома митохондрий у этого вида требует количественного анализа гетероплазматического состояния мтДНК в цитоплазмах мужскостерильных и фертильных растений. Важно отметить, что стехиометрия отдельных последовательностей, входящих в состав генома

митохондрии, может отличаться более чем в 1000 раз, что приводит к необходимости использования высокочувствительных методов с широким диапазоном детекции и тщательной их оптимизации.

Оценка копийности последовательностей нуклеиновой кислоты (НК) представляет собой сложную задачу, решение которой связано с адаптацией существующих и разработкой новых методов, позволяющих определять стехиометрию целевой последовательности с высокой точностью и чувствительностью (Covill et al, 2001; Giulietti et al., 2001; Williams, 2009). ПЦР в реальном времени в настоящий момент широко используется для количественной детекции низкокопийных последовательностей ДНК, однако для получения достоверных результатов он требует тщательной оптимизации (Freeman et al., 1999; Bustin, 2002; Bustin et al., 2004). Предельная теоретическая чувствительность метода ПЦР составляет одну копию последовательности НК на реакцию (Wabuyele and Soper, 2001; Piggee, 2008), однако реальная чувствительность может варьировать в широких пределах в зависимости от структуры анализируемой последовательности, состава и качества компонентов реакционной смеси, протекания в ней конкурирующих реакций и наличия ингибиторов, а также свойств используемого для амплификации фермента. Данные факторы влияют как на порог детекции, так и на характер зависимости аналитического сигнала от количества анализируемой последовательности, что затрудняет достоверную количественную оценку.

Использование ПЦР в реальном времени для оценки количества анализируемой НК требует учёта перечисленных факторов и уменьшения влияния тех из них, которые оказывают выраженное негативное влияние на чувствительность и воспроизводимость реакции, что достигается разработкой и использованием методов характеризации ключевых компонентов реакционной смеси, таких как ДНК-полимераза и флуоресцентно-меченый олипжукяеогидный зонд, оптимизацией состава реакционной смеси и температурных параметров реакции.

Таким образом, установление характера причинно-следственной связи между развитием признака ЦМС и организацией генома митохондрий сахарной свёклы требует достоверной оценки стехиометрии отдельных последовательностей-кандидатов, что, в свою очередь, связано с необходимостью разработки методических подходов, направленных на усовершенствование метода ПЦР в реальном времени.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение организации митохондриального генома Beta vulgaris и анализ гетероплазмаигческого состояния митохондриальной ДНК, характерной для фертильных растений сахарной свёклы и растений с оуэновским типом цитоплазматической мужской стерильности. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1.1. Разработка протокола флуоресцентной детекции ДНК-зависимой ДНК-полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-полимераз в режиме реального времени и оценка влияния на них различных факторов, как химической, так и физической природы.

1.2. Разработка системы оценки качества флуоресцентных зондов, используемых в ПЦР в реальном времени.

2. Анализ гетероплазматического состояния митохондриальной ДНК фертильных растений сахарной свеклы (Beta vulgaris) и растений, характеризующихся проявлением признака цитоплазматической мужской стерильности, методом ПЦР в реальном времени и анализ связи стехиометрии отдельных последовательностей и пыльцевого фенотипа.

Научная новизна. Впервые показано присутствие SVu/g-специфичных маркёров в мтДНК Beta vulgaris N-типа и ^-специфичных маркёров в мтДНК Beta vulgaris Svulg-шаа, что свидетельствует в пользу того, что гетероплазматическое состояние является естественным для мтДНК сахарной свёклы. Показано накопление точечных замен субгеномными вариантами в составе мтДНК. Разработаны подходы к оптимизации ПЦР в реальном времени, позволяющие добиться максимальной чувствительности и достоверности количественной детекции в широком диапазоне концентраций. Впервые разработаны методы, позволяющие одновременно определять ДНК-полимеразную и нуклеазную активности ДНК-полимераз и осуществлять стандартизацию флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов с использованием спектров поглощения и флуоресценции.

Положения, выносимые на защиту. Последовательности, входящие в состав митохондриального генома JV-типа сахарной свёклы, повсеместно обнаруживаются в составе мтДНК Svulg-типа, в то время как последовательности, входящие в состав генома Svulg-типа, повсеместно обнаруживаются в составе мтДНК ЛГ-типа.

Гетероплазмия является естественным состоянием митохондриального генома сахарной свёклы, при этом разница копийностей доминирующего и минорного вариантов может достигать шести порядков.

Повышение чувствительности и воспроизводимости ПЦР в реальном времени является необходимой предпосылкой для получения биологически-значимых результатов при анализе митохондриальных геномов растений. Чрезвычайную важность имеет оценка и модуляция активностей входящей в состав реакционной смеси ДНК-полимеразы и контроль качества флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов.

Практическая значимость. Результаты работы расширяют спектр представлений об организации мтДНК сахарной свёклы и могут быть использованы при дальнейшем изучении структуры, репликации и сегрегации митохондриального генома. Данные о естественной гетероплазматичности митохондриальнго генома В. vulgaris и разработанный метод быстрого высокочувствительного типирования мтДНК могут быть использованы в селекционной практике.

Методологические подходы, разработанные и использованные в работе для повышения чувствительности и воспроизводимости ПЦР в реальном времени, могут широко использоваться при оптимизации ПЦР для детекции присутствия низкокопийных

последовательностей, характеристике микроорганизменного состава природных сред и клинической диагностике возбудителей инфекционных заболеваний.

Метод одновременного определения полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-зависимых полимераз может использоваться при изучении кинетических свойств ферментов, для оценки влияния на них химических и физических факторов, определения эффективности ингибирования и оптимизации различных молекулярно-биологических протоколов с участием полимераз.

Личный вклад автора. Все экспериментальные процедуры, анализ и обработка данных и написание программного обеспечения выполнены автором самостоятельно.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на IV конференции молодых ученых, посвященной памяти М.А. Лаврентьева (Новосибирск, 2004), XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2005), международной конференции «Современные проблемы генетики» (Минск, 2005), международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию акад. Д.Г.Кнорре, (Новосибирск, 2006), Всероссийской научной конференции «Структура и экспрессия митохондриального генома растений» (Иркутск, 2006), III международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

По теме диссертации опубликовано две статьи в рецензируемых отечественных журналах, одна - в рецензируемом зарубежном журнале и одна - в монографии.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 145 страницах (в том числе 12 страниц в приложении), содержит 47 рисунков (в том числе 7 рисунков в приложении) и 5 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе анализировались образцы корнеплодов, зелёной ткани и цветоносов сахарной свеклы линий СОАН-22, мсСОАН-22, СОАН-31, мсСОАН-31, СОАН-252, мсСОАН-252, мсКНВС2, mcKWSI, сортов Белоцерковская односемянная 40, Ганусовская односемянная 55, Янаш A3. Растения были любезно предоставлены Е.И. Малецкой, С.И. Малецким и Е.В. Левитесом (лаборатория популяционной генетики растений, ИЦиГ СО РАН, Новосибирск).

Все использованные олигонуклеотвды были синтезированы ЗАО «Синтол», Россия.

Выделение митохондрий из образцов растений проводили по методике (Rogers and Bendich, 1985) с незначительными изменениями, выделение ДНК из митохондрий проводили с использованием СТАВ согласно (Rogers and Bendich, 1985).

ПЦР в реальном времени с использованием SYBR Green I проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10 тМ Трис-НС1, 50 мМ KCl, 4 мМ MgClj, 200 мкМ dNTP, 0.2 е.а. Taq-полимеразы, специфические праймеры 0.5 цМ, SYBR Green I (разведение коммерческого раствора 1:20000). ПЦР в реальном времени с использованием гидролизуемых зондов проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащй 67 тМ Трис-

HCl (pH 8.9), 1.6 mM (NH4)2S04, 4.5 mM MgCl2, 0.01% Tween-20), dNTP 200цМ, 0.2 e.a. Taq-полимеразы, специфические праймеры 0.5 цМ, зонд 0.25 цМ. Для «горячего старта» применяли моноклональные антитела к Taq-полимеразе («Clontech», США).

Протокол обеих реакций имел следующий вид: прогрев 94°С (60 с), 50 циклов: плавление при 94°С (10 с), отжиг праймеров (20 с, температура отжига зависела от используемых праймеров). Количество образовавшегося продукта оценивали посредством измерения интенсивности флуоресценции с использованием амплификатора с оптическим модулем iCycler iQ («Bio-Rad», США), либо Rotor-Gene 3000 («Corbett Research», США).

Одновременное определение полимеразвой и иуклеазной активностей ДНК-полимераз проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCl (pH 8.9), 1.6 мМ (NH4)2S04, 4.5 мМ MgCh, 0.01% Tween-20, 200 мкМ dNTP, 0.25 мкМ меченного флуорофором олигонуклеотидиого зонда, SYBR Green I (разведение 1:10000 от коммерческого стокового раствора), ДНК-матрицу в концентрации 5-20 нг/мкл и различные количества ДНК-полимеразы. Детекцию вели в реальном времени на амплификаторах с оптическим блоком iCycler iQ или Rotor-Gene 3000 при 65°С.

Для снятия спектров поглощения и флуоресценции флуоресцентно-меченный олигонувслеотид разводился в ТЕ-буфере до концентрации 2 мкМ и 200 нМ, соответственно, Програма для анализа спектров поглощения и флуоресценции была написана на языке Matlab версии 7.4.0.287 R2007a и скомпилирована с использованием компилятора Matlab Compiler версии 4.6.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ копийности последовательностей мтДНК Beta vulgaris методом ПЦР в реальном времени в варианте с использованием флуорожрома SYBR Green I

С использованием моноплексного ПЦР в реальном времени в варианте с флуоресцентным красителем SYBR Green I и нормировкой количества последовательности на массу мтДНК был проведён анализ ограниченного числа линий сахарной свёклы, в ходе которого определялась стехиометрия нескольких маркёров, среди которых было два, специфичных для митохондриального генома //-типа, четыре, специфичных для генома Svulg-типа, и один, присутствующий в мтДНК обоих цитотипов, по данным полного секвенирования геномов N- и Svulg-шпов (Kubo et al., 2000; Satoh et al., 2004). С целью исключения влияния ядерного окружения использовались растения изогениых линий.

Результаты оценки стехиометрии маркерных последовательностей в мтДНК (V- и Svulg'TBisoB приведены на рис. 1. Экспериментальные данные сравнивались с рассчитанными теоретически, исходя из размеров N- и Svu/g-Бариантов генома (368801 и 501020 п. н., соответственно) и копийности маркеров, полученными при анализе полных последовательностей "основных хромосом". Число копий уникальной последовательности в реакционной смеси вычислялось делением массы мтДНК, используемой в реакции в качестве матрицы (1 нг) на массу одной копии "основной хромосомы", равную произведению её длины на массу 1 п.н. (определялось абсолютное количество последовательности, нормированное на массу мтДНК). Для повторенных маркеров

полученная величина умножалась последовательности генома.

Л 8000000

7000000

6000000

'I 5000000 с

° 4000000

5 зоооооо ©

1 2000000 g

1000000 о

0 0 1960

на число полных копий в опубликованной

| 6000000

5000000

с 4000000

S 3000000

2000000

1000000

ом ¥

£Л n

Маркёр

Рве. 1. Сравнение экспериментально определённых (тёмные столбцы) и рассчитанных теоретически (исходя из предположения о существовании геномов в форме "основной хромосомы", светлые столбцы) количеств маркерных последовательностей в 1 нг ДНК митохондрий Б. vulgaris линий СОАН-252 (/V-плазмотип) (А) и цмсСОАН-252 (SvH/g-плазмотип) (Б). Цифрами обозначены экспериментально определённые копийности минорных последовательностей, среднеквадратичное отклонение не превышало 20% от среднего значения для всех проанализированных маркёров.

Для мтДНК JV-типа (линия СОАН-252), при использовании А'-специфичных маркеров, анализ показывает хорошее соответствие рассчитанных теоретически и определённых экспериментально последовательностей (рис. 1А). В то же время, результаты показывают присутствие небольших количеств Svulg-специфичного маркера orfl67 (Z(S')) и значительных количеств маркера orj324, который расматривается радом авторов в качестве возможной детерминанты ЦМС у В. vulgaris (Ducos et al., 2001; Satoh et al., 2004). Наши данные о высокой копийности этой последовательности в мтДНК линии с фертильной цитоплазмой (СОАН-252), изогенной по отношению к стерильной линии (цмсСОАН-252), свидетельствуют о том, что сам факт присутствия ог/324 не приводит к проявлению ЦМС фенотипа. В целом, можно отметить, за указанным исключением, сходство экспериментально определенной стехиометрии последовательностей с теоретической, что позволяет предположить существование значительной части молекул в форме стехиометрически близкой "основной хромосоме", при одновременном присутствии субгеномных вариантов, в том числе и содержащих Svn/g-специфические последовательности. Однако отсутствие других проанализированных Svulg-специфичных последовательностей, таких как atp6(S) и S-RAPD, свидетельствует в пользу того, что они присутствуют в мтДНК А'-типа в количествах, лежащих за пределами чувствительности метода, или образуются de novo в процессе конверсии к ЦМС фенотипу.

Экспериментальные данные о стехиометрии исследованных маркеров в мтДНК ЦМС растений (линия цмсСОАН-252) обнаруживают значительное несоответствие с теоретически рассчитанными, исходя из представления о существовании мтДНК в форме мастер-хромосомы (рис. 1Б). Все исследованные последовательности за исключением оф24 присутствуют в количествах, существенно меньше расчетных. Кроме того, стоит отметить присутствие всех исследованных N-специфичных последовательностей в мтДНК ЦМС-растений. Тот факт, что количества копий маркеров значительно отличаются друг от друга, свидетельствует о том, что Svulg-вариант генома характеризуется сложной комплексной организацией и скорее может быть представлен в виде совокупности субгеномных молекул, присутствующих в разной стехиометрии, чем в виде «основной хромосомы». В пользу этого говорят также данные, полученные методом рестрикционного картирования (Brears and Lonsdale, 1988). Стоит отметить присутствие обоих исследованных JV-специфичных маркеров в образцах мтДНК ЦМС-линий в количествах, сопоставимых с таковыми для некоторых iSWg-специфичных (S-RAPD, atp6(S)).

Важно отметить, что принципиально сложным моментом является очень широкий диапазон копийностей различных последовательностей в составе митохондриального генома растений. С использованием ПЦР в реальном времени в варианте детекции количества ампликона посредством флуоресцентного красителя SYBR Green I нами показаны отличия до 4-х порядков, при этом некоторые SVu/g-специфические маркеры в составе мтДНК Л'-типа не обнаружены. Опираясь на результаты ограниченной по масштабам проверки определить, было ли это связано с фактическим отсутствием ряда Лм^-спекифческих последовательностей в цитоплазме N-mna, или с ограничениями используемой методики было невозможно. В связи с этим было решено произвести усовершенствование используемого метода ПЦР в реальном времени, которое включало изменение состава реакционной смеси, оценку полимеразной и нуклеазной активностей, организацию «горячего старта» ДНК-полимеразы, а также внедрение оценки и стандартизации качества флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов. Два последних направления потребовали разработки самостоятельных методик, так как, несмотря на наличие значительного количества информации, указывающей на важность учёта качества препаратов полимераз и олигонуклеотидных зондов, в доступной литературе отсутствуют описания методов, которые были бы пригодны для оптимизации ПЦР. В дальнейших исследованиях мы также отказались от нормировки на абсолютное количество ДНК и перешли на нормировку с использованием универсальных мтДНК-маркеров, которые представлены одновременно в мтДНК JV-типа и Svulg-mnz. Оценка копийности подобных последовательностей, нормированной на массу мтДНК, показала, что их количество остаётся практически неизменным, варьируя незначительно как между различными растениями одной линии, так и между растениями разных сортов.

Анализ копийности последовательностей мтДНК расширенной выборки линий и сортов Beta vulgaris методом ПЦР в реальном времени в варианте с использованием гидролизуемых зондов

Помимо проанализированных при помощи ПЦР с SYBR Green Г маркёров orfB, S-RAPD и orß24 в анализ были добавлены универсальные маркеры coxll и rps4, которые были выбраны в качестве альтернативных вариантов нормировочной последовательности, и orf246 - единственная транскрибируемая открытая рамка с неидентифицированной функцией, специфичная для мастер-хромосомы jV-типа. Маркерные участки мтДНК сахарной свеклы, относительное количество которых измерялось в работе, равномерно распределены по геному, соответствуя последовательностям с разной копийностью и «блокам», потенциально образующим различные комбинации при обменах между основными повторами.

Сравнение копийности универсальных маркеров coxll и rps4 с использованием двух выборок растений линий СОАН-22 и мсСОАН-22, каждая из которых состояла из пяти особей, показало, что соотношение копийностей варьирует незначительно как в пределах линии, так и между линиями. Анализ с использованием U-критерия показал, что соотношение между маркерами rps4 и coxll одинаково для линий СОАН-22 и мсСОАН-22 с вероятностью более 99%, составляя 1.03+0.25 (рис. 2А).

Соотношения маркеров rps4/coxII оказались близкими и при сравнении растений различных линий, что позволило использовать любой из них в качестве нормировочного гена.

Совпадение эффективностей амплификации является необходимым условием относительной нормировки определяемого маркёра относительно маркёра стандарта: определённая экспериментально эффективность амплификации стандартных образцов после оптимизации условий ПЦР превышала 95%, что соответствует таковой специфических маркеров. В дальнейшем копийность маркёров мтДНК определялось с использованием мультиплексного количественного ПЦР в реальном времени, в реакционную смесь добавлялись лраймеры и зонды, соответствующие нормировочному маркёру rps4 (зонд был мечен флуорофором Су5), и праймеры и зонды детектируемых последовательностей orß, orß24, orft46, или S-RAPD (зонды были мечены FAM или R6G).

А i,8 т—------------— Б г-8

ГГЦ ...

- го

ГЦ | 1

о -Ж,-®, *

.от .г? .(-у .о^ .(v .л^ .fv

■ф- ^ ^ ^ ^

о с<>4° о0 о0"

d**

•V ,сР

,9 *

Рис. 2. (А). Оценка соотношения rps4!coxII для 10 растений сахарной свёклы линий СОАН-22 и мсСОАН-22. Стандартное отклонение здесь и далее вычислялось с использованием данных об амплификации 3-х повторов одного и того же образца в рамках одного эксперимента. (Б) Копийность универсального маркера orfB, нормированная на копийность маркера rps4.

Анализ копийности универсального маркера orfB показал его равное присутствие как в цитоплазмах фертильных растений (соотношение от 0.52 для линии KWS1 до 1.20 для линии СОАН-22), так и в цитоплазмах растений ЦМС-линий (соотношение от 0.52 для мсСОАН-31 до 1.01 для мсСОАН-22, рис. 2Б). Это вкупе с данными о присутствии универсального маркера coxll свидетельствует в пользу того, что стехиометрия последовательностей в составе доминирующего генома изменяется в ограниченных пределах (не более одного порядка), другими словами: структура превалирующей формы генома стабильна даже в дифференцированных вегетативных тканях растения.

В случае маркёров, специфичных по данным геномного секвенирования, мтДНК N-или Svulg-типа, ситуация коренным образом отличается. Показано, что jV-спеаифичный маркёр orf246 количественно преобладает в линиях фертильных растений, обнаруживая незначительную межлинейную вариацию. Если принять количество нормированного на rps4 маркера orf246 в растениях сорта Ганусовская за 100%, то количества этого маркера в мтДНК других фертильных растений составят 50, 69 и 88% для сортов Янаш A3, СОАН-31 и KWS1, соответственно, т.е. отличия не превышают двух раз. Иная ситуация имеет место в случае линии СОАН-22, для которой количество orf246 было меньше, чем количество rps4, в 1600 раз. Это означает, что субгеномный вариант, в составе которого находится данная последовательность, составляет не более 0.06% от числа копий гипотетической мастер-хромосомы (рис. ЗА). Сходная картина наблюдалась и для мтДНК стерильных линий сахарной свёклы в которых соотношение rps4/orf246 составляло от 6000 (мсСОАН-252) до 265000 (мсСОАН-22). В одном из исследованных образцов (мсКНВС2, мс1) указанная последовательность не была обнаружена, что, по всей вероятности, свидетельствует о том, что она была утрачена в мтДНК корня в ходе онтогенетического развития растения. Стоит отметить, что использование усовершенствованного метода ПЦР в реальном времени позволило выявить TV-специфичную последовательность во всех исследованных образцах с .SVtt/g-цитопяазмой кроме одного, что указывает на то, что мтДНК у В. vulgaris является гетероплазматичной. Крайне малые копийности минорных ^-специфических последовательностей в Svulg-цитоплазме можно объяснить тем, что для выделения ДНК использовались клетки дифференцированных тканей растения. По-видимому, после прохождения стадий дифференцировки клетки могут терять минорный вариант мтДНК, в то время как клетки меристематических тканей сохраняют и передают «трансмиссивную форму» (Arrieta-Montiel et al., 2001).

Оценка копийности .Svu/g-специфичных маркёров подтвердила полученные нами ранее данные о присутствии последовательностей, специфичных для плазмотипов стерильных линий в составе мтДНК растений фертильных линий (рис. ЗБ). Анализ копийности маркёра orJ324 в расширенном спектре линий показал, что соотношение количества этой ^^-специфичной последовательности к количеству универсального

маркера варьирует от 1:1 (линия мсСОАН-22) до 1:123 (образец линии мсКНВС2 с пыльцевым фенотипом мс1). Сходные данные получены и для другого ЦМС-специфичного маркёра - З-ЛАРИ с той оговоркой, что его количество оказалось ниже такового ог/324 для всех исследованных растений ЦМС-линий и составляло, в соотношении с грь4 от 1:48 (линия мсСОАН-22) до 1:564 (образец линии мсКНВС2 с пыльцевым фенотипом мс1). При этом между количествами обоих маркеров наблюдалось хорошее соответствие.

3 х о ч и ± ±

4 < в ? ® < < э о х 5 х о о

го и * * и и

эохЗхоо

го и М ^ и Ц

Ряс. 3. (А) Копийность >1-специфичного маркера 01^246, нормированная на копийность универсального маркера гря4. (Б) Копийность &>н/#-специфичных маркеров ог/324 (серые графики) и З-КАРО (чёрные графики), нормированных на копийность универсального маркера гр$4.

Анализ количества <!Л>и/£-специфичных маркёров в образцах растений с Ы-цитоплазмой показал повсеместное присутствие обеих последовательностей во всех исследованных образцах. Этот результат согласуется с высказанным ранее предположением о присутствии 5уи/#-специфичных последовательностей в цитоплазме фертильных растений в субстехиометрических количествах. Стоит отметить, что исследованные образцы можно разделить на две группы, опираясь на копийности специфичных маркеров: в первую входят растения, в которых соотношение как ог/324/гр$4, так и 8-1МРй/грз4 будет больше 1:1000 - все растения этой группы принадлежат к ЦМС-линиям; во второй группе окажутся растения, для которых указанные соотношения будут меньше, чем 1:1000 (то есть оба указанных маркера будут представлены в субстехиометрическом состоянии) - все растения этой линии фертильны. Единственным исключением является изогенная пара СОАН-22/мсСОАН-22, для которой характерно присутствие большого количества Зуи/^-специфичных маркёров как в растениях стерильной, так и в растениях фертильной линий, причём количество маркёров практически совпадает (сравн. с растениями изогенной пары СОАН-31/мсСОАН-31: в растениях фертильной линии количество ¿^/^-специфичных маркёров меньше на два порядка, чем в растениях ЦМС-линии).

Переход к использованию усовершенствованного варианта ПЦР в реальном времени в совокупности с анализом расширенной выборки растений позволили получить более полную картину организации мтДНК у Beta vulgaris. Показано, что как N-, так и Syulg-специфичные маркёры повсеместно присутствуют в цитоплазмах растений как с Оуэновским плазмотилом, так и с плазмотипом, обеспечивающим образование фертильной пыльцы, что свидетельствуют в пользу независимого сосуществования митохондриальных геномов N- и Svulg-iuaoB в пределах митохондрий растений одной линии. Это также подтверждается накоплением точечных мутаций разными вариантами последовательности (Satoh, 2004). Чтобы проверить эту гипотезу, нами было осуществлено клонирование и секвенирование продуктов ПЦР, образующихся при амплификации маркерных участков ДНК изогенных линий СОАН-252/мсСОАН-252. Секвенирование пяти независимо клонированных продуктов ПЦР с ^-специфичных праймеров atpA(N), полученных с использованием в качестве матрицы мтДНК растений \ ЦМС-линии, выявило наличие замен в ряде позиций, причем для четырех клонов замены относительно опубликованой последовательности совпадают (рис. 4). В то же время секвенирование трех клонированных продуктов ПЦР с этих же праймеров на мтДНК фертильного растения с iV-плазмотипом не выявило замен в этом участке. Наличие нуклеотидных замен в TV-специфичных фрагментах мтДНК, амплифицированных с Оуэновской цитоплазмы SVu/g-типа, по сравнению с амплифицированными с N-цитоплазмы, показано нами и для других фрагментов мтДНК (N-RAPD и coxII(N) маркеры, положение в митохондриальном геноме jV-типа (ВА000009) 255528-255728 и 234817-235003, соответственно). Эта информация дополняет данные о независимом накоплении последовательностями N- и SvH/g-геиомов точечных мутаций, распространяя | их и на последовательности, находящиеся в субстехиометрическом состоянии в составе минорных вариантов мтДНК, накопление замен в которых невозможно обнаружить секвенированием полных геномов в силу крайне малой вероятности попадания таких последовательностей в геномные библиотеки.

1 Ю 20 30 40 50 60 70 R0 90 100 110 120 130

I---,--------,-,-------,-1--1-I-■—.---1

atpfl(H>cwract!Sui :...... I - '.■! .. ...><■,] . . ':: s «¡(¿¡Та-СЯбШй—С ¡CfW ; Т'' ■ ¡¡ЯШЫШШИТбТЕбтК 1 .¡'11. ■ .¡ЯТ—I ¡¡(¡Ш«!! f.i. ГNJ;

atpfifttn .¡.гогм' t v . ' ,! Г:Т1 у-,гг. стгегййсабкбггеспхшлтшii^Rp"fRiGTeffl^c."гтзт^эдт-^^жйспт.к!«1

аЬрЛ(Н)2 '■■.iu:.i ' ¡1 I..: reel l[. ' : ; \ ¡¡..¡II,I;. . || ' iliC"ЖйЕТТ' 1 ОШЖ -¡E; ■ ;Н/.■ 'II — Л ; V' fC' ПВТСТКШГиШ« Гб^вПГСШйЗДЛ-Ш!*

atpfl<M>3 ¡¡:" IT1I ' '111 ' " .. I'll, ,1' I III ""¡¡¡(¡¡.I IUT! CI" ¡¡STT f ¡'.III IWHI If»—TflrCTRG ЦП if'tt! ■

afcpfl(H)4 ЬйВСОТШ ¡nil .' гI .:I |L'.:I'.M|,1 ..f;; ^ I"¡IVDui.lli. ifiTTT l '.¡¡ii.B'-ISilifiillliS—I,.!l .:t.!ll ПЙТСПЮ.ЖШШШ I' lGftT&l

«ti>fl(H)5 iiL"-.l.;.il.fi,.l. iiiiill.'¡1|М1,.,|:|1:.М|,! ,1 • ¡"¡"¡.¿¡^..¡¡¡К.".il: D. Ibl.GTTi Rl. ili11.1¡¡¡. . ¡RTCTifciTI¡ 'II¡¡j! ■ . ¡ЗЛЕ.! nil ¡¡'¡.¡".I. I ¡.Hi

ConeMin ¡¡.¡¡¡¡¡¡"'''¡"(ЖС! ¡¡.¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡¡'¡¡¡¡¡¡.¡¡¡¡¡¡¡¡ ¡.¡¡¡¡'I.¡¡¡¡¡¡¡'¡¡I.,cI СП1ЙП.®ГцТ1£СГсСЭ.<'1аШ(1 nCftFGIatgteM! с ¡'¡'¡¡i'li¡".¡'.M,.г¡¡¡■¡С

131 140 150 1БО 170 180 IBS

|-,----,-,-,-(

atpfliWl

etpaims '! )WT£SRir.WtfaiSCVrTi;iT»ifr(iWi'.r^lilWi птж.епш.^.нг:. Conwraus

Рис. 4. Выравнивание последовательностей клонов (atpA(N)l-5), несущик вставки продукта ПЦР с мтДНК В. vulgaris линии цмсСОАН-252, с использованием праймеров atpA(N). Последовательность atpA(N)consensus соответствует опубликованной (Kubo et al., 2000). 1 Consensus представляет результат выравнивания с использованием алгоритма MultAlin. Совпадающие позиции обозначены серым, черным обозначены вариабельные нуклеотиды.

Чрезвычайно важным является то, что стехиометрия N- и Svulg-специфичных маркёров находится в прямой зависимости от типа цитоплазмы для таких маркёров как N-специфичный orf246 и Ли/^-специфичные orf324 и S-RAPD, в то время как

представленность универсальных маркёров or/B, rps4 и coxll от типа цитоплазмы не зависит. Это подтверждает данные о преимущественном присутствии последовательностей, вошедших в состав мастер-хромосомы Летала (Kubo et al., 2000), в цитоплазме фертильных растений, и преимущественном присутствии последовательностей, вошедших в состав мастер-хромосомы Svulg-типа (Satoh et al., 2004), в цитоплазме растений с Оуэновским типом ЦМС.

Единственным исключением оказалась пара линий СОАН-22/мсСОАН-22, которая расценивалась нами как изогенная. Однако все полученные данные свидетельствуют в пользу того, что растения обеих линий имеют цитоплазму Оуэновского типа, в то время как фертильность растений линии СОАН-22 обеспечивается ядерными генами-восстановителями фертильности. Об этом говорят высокая копийность Svulg-специфичных последовательностей в препаратах мтДНК растений линии СОАН-22, идентичная таковой у растений линии мсСОАН-22 и существенно превосходящая копийность этих последовательностей во всех исследованных препаратах мтДНК растений фертильных линий, и субстехиометрические количества ЛГ-специфичного маркёра orf246, идентичные в растениях линий СОАН-22 и мсСОАН-22, в то время как все прочие растения фертильных линий характеризуются существенно большими количествами этого маркёра (разница составляет в среднем 1000 раз). Данные о высокой частоте конверсии линии СОАН-22 к стерильности можно объяснить тем, что для данной линии растений имеет место не истинная конверсия, а расщепление потомства по ядерным генам-восстановителям фертильности, что приводит к развитию ЦМС-фенотипа.

Мультиплексная ПЦР в реальном времени и титрование мтДНК

Данные о копийности маркёров мтДНК и оптимизация ПЦР в реальном времени позволили разработать метод быстрого титрования плазмотипа сахарной свёклы, на востребованность которого в селекционной практике указывают литературные источники (Cheng, 2009). Одновременный анализ более чем одного маркера при помощи мультиплексной ПЦР, возможный при использовании гидролизуемых зондов, имеет ряд преимуществ, среди которых сокращение времени анализа и количества нуклеотидного материала, а также повышение достоверности типирования за счёт одновременного анализа более чем одного маркёра. Оптимизация мультиплексной ПЦР в реальном времени позволила проводить одновременную количественную детекцию ог/324 и ог/246 с нормировкой на rps4, S-RAPD и orf246 с нормировкой на rps4 и orf324, и orf246 с нормировкой на coxll; амплификация нормировочного маркера проводилась в канале Су5, амплификация целевых маркёров - в каналах FAM и R6G. Оптимизация позволила добиться минимального снижения чувствительности мультиплексного варианта по сравнению с моноплексным, при этом диапазон линейной детекции составил от 100 до 107 копий последовательности на реакцию и не зависел от присутствия количеств мтДНК другого типа вплоть до соотношения 1/105.

Разработанный вариант типирования цитоплазмы сахарной свёклы с использованием мультиплексной ПЦР в реальном времени, в отличие от использующихся в настоящее время методов, позволяет не только типировать доминирующий плазмотип, но и

количественно оценивать гетероплазматическое состояние, что может найти широкое применение в селекционной практике.

Оптимизация ПЦР в реальном времени для детекции низкокопийных последовательностей митохондриального генома

Достоверность количественной ПЦР напрямую зависит от таких параметров реакции как чувствительность, эффективность и воспроизводимость. В ходе оптимизации состава реакционной смеси оценивали зависимость перечисленных параметров от концентрации катионов магния (менялась от 2 до 8 мМ), концентрации олигонуклеотидных праймеров (менялась от 0.25 до 1 мкМ) и флуоресцентно-меченного зонда (менялась от 0.15 мкМ до 0.5 мкМ). Также оценивалась зависимость от температуры этапа гибридизации праймеров в протоколе ПЦР (варьировала от 54 до 72 °С). В результате оптимизации были выбраны следующие условия: концентрация Мё2+ - 4.5 мМ, концентрация праймеров - 0.5 мкМ, концентрация зонда - 0.25 мкМ.

Оптимальная активность Та^полимеразы составила 0.2 и в реакции, активность всех партий фермента, использовавшихся в дальнейшей работе, контролировалась с использованием разработанного метода определения активности полимеразы. Данный метод также использовался непосредственно при оптимизации состава ПЦР-смеси. С использованием протокола оценки эффективности полимеразного синтеза и нуклеазной деградации зонда был также оптимизирован горячий старт Taq-пoлимepaзы с использованием моноклональных антител к её активному центру, Блокировка активности полимеразы при низких температурах на стадиях, предшествующих ПЦР, позволила добиться независимости амплитуды аналитического сигнала (величина прироста флуоресценции, связанной с нуклеазной деградацией флуоресцентно-меченного олигонуклеотидного зонда) от концентрации анализируемой последовательности (рис. 5), что позволило проводить достоверную количественную оценку во всём диапазоне концентраций, находящихся в границах чувствительности метода.

Цжя ПЦР

Рис. 5. Оптимизация ПЦР посредством введения горячего старта для полимеразы. Клонированные маркерные последовательности мтДНК Beta vulgaris в количестве 1000 (1) и 100 (2) копий в реакционной смеси анализировались с использованием ПЦР в реальном времени с горячим стартом (чёрные кривые) и без горячего старта (серые кривые). При отсутствии горячего старта с уменьшением концентрации матрицы происходит падение уровня аналитического сигнала, приводящее к снижению чувствительности и ошибке количественного определения.

Оптимизация активности ДНК-полимеразы в реакционной смеси: разработка метода определения полимеразной и эндонуклеазной активности

Использование предложенных в работе синтетических олигонуклеотидов, содержащих шпилечную структуру на 3'-конце и сайт посадки гидролизуемого зонда, позволяет одновременно определять полимеразную и нуклеазную активность ДНК-полимераз (Рис. 6). Это широко применялось для оптимизации ПЦР в данной работе (нормировка активностей новых партий полимеразы, определение температурного и солевого оптимума работы фермента и оптимизация «горячего старта»). Метод также может быть использован при исследовании кинетических свойств полимераз и для оценки наличия в растворе ингибиторов. Сравнение скоростей прироста флуоресценции позволяет нормировать различные партии полимеразы, что повышает воспроизводимость результатов ПЦР и позволяет сравнивать удельную активность препаратов полимеразы (активность на единицу массы белка), полученных, или очищенных различным образом. Разработка метода оценки полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-полимераз позволила определить оптимальное соотношение Тач-полимераза/моноклональные антитела в реакционной смеси и точно определять и нормировать активность препарата при переходе от одной партии полимераз к другой. Введение горячего старта добавлением в реакционную смесь антител к Taq-пoлимepaзe позволило предотвратить неспецифическое удлинение праймеров на стадиях, предшествующих ПЦР, что существенно повысило чувствительность метода.

Фл\-оресцснцня

--3 y.*JL.y

Полимераза <

dNTP SVBR Green I f

30;

Детекция i

канале HEX 1

20)

, * „ j

Детекция

в канале FAM 10

Рнс. 6. (А) Принцип одновременной детекции полимеразной и 5'—»З'-экзонуклеазной активностей полимераз с использованием ингеркаяирующего красителя SYBR Green I и флуоресцентного гидролизуемого зонда с разобщёнными спектрами флуоресценции. (Б) Определение экзонуклеазной активности препарата Taq-полимеразы в широком диапазоне концентраций. Активность препаратов сверху вниз составляет 2500, 1250, 625, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.2,0 mU/мкл (образцы 1-12, соответственно).

Анализ качества флуоресцентно-меченных олигнулеотидов Качество олигонуклеотидного зонда является одним из факторов, определяющих чувствительность ПЦР в реальном времени и достоверность количественной детекции с использованием этого метода. Эффективность флуоресцентного мечения и очистки конечного продукта от невключившихся молекул красителя оказывают существенное влияние на ключевые параметры ПЦР в реальном времени (Yeung et al., 2004; Espy et al., 2006). Нами была разработана методика характеризация олигонулеотидного зонда

посредством анализа спектров поглощения и флуоресценции, показана зависимость параметров ПЦР от качества препарата зонда и написано программное обеспечение, позволяющее осуществлять анализ в автоматическом режиме. Метод оценки качества флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов применялся при аттестации новых партий всех зондов, использованных для оценки стехиометрии маркёров, входящих в состав мтДНК Beta vulgaris.

Проведённые усовершенствования позволили получить более подробную характеристику состояния мтДНК для существенно большей выборки образцов. Чувствительность ПЦР в реальном времени после описанной выше оптимизации, включающей переход к использованию комплексов полимераза-антитела с известными параметрами температурной стабильности, и охарактеризованных препаратов полимеразы и флуоресцентных зондов, позволила идентифицировать малые количества минорных последовательностей мтДНК в присутствии преобладающего альтернативного варианта, вплоть до единичных копий. Применяя метод для анализа расширенной выборки линий и сортов сахарной свёклы нам впервые удалось показать, что N- и SViJg-варианты митохондрнальной ДНК сосуществуют в вегетативных тканях растений этого вида, но их количества драматически отличаются. Это объясняет факт того, что последовательности, входящие в состав минорных вариантов, не попали в опубликованные секвенограммы мастер-хромосом сахарной свёклы с jV-плазмотипом (Kubo, 1999) и ¿Vu^-плазмотипом (Satoh, 2004). Кроме того, это объясняет известные случаи спонтанной конверсии растений к фертильности, сопровождающиеся сменой плазмотипа, и результаты филогетенического анализа, указывающие на независимое существование гомологичных последовательностей, входящих в состав мтДНК N- и Svulg-таоъ, в то время как полученные ранее с использованием методов, не обеспечивающих достаточной чувствительности, данные о том, что часть маркерных последовательностей не обнаруживается в митохондриях с тем или иным плазмотипом (Cheng, 2009), входили с ними в прямое противоречие. Таким образом, полученные нами данные дополняют и систематизируют информацию об организации митохондриального генома сахарной свёклы и очерчивают направления и пути оптимизации экспериментальных подходов, использование которых позволяет получать качественно новую информацию об исследуемом объекте и разрабатывать практически-значимые приложения.

ВЫВОДЫ

1. Показано присутствие Svulg- специфичных маркёров orJ324 и Z(S) в мтДНК Beta vulgaris N-типа и iV-специфичных маркёров atp6(N) и atpA(N) в мтДНК Beta vulgaris Svulg-типа с использованием ПЦР в реальном времени в варианте с флуоресцентным красителем. Разница между копийностями последовательностей, входящих в состав доминирующего варианта мтДНК, и последовательностями, входящими в состав минорного варианта, доходила до трёх порядков. Для последовательности оф24, которая по результатам геномного секвенирования расценивалась как специфичная

для оуэновской цитоплазмы, показана высокая копийность в мтДНК фертильных растений.

2. Впервые разработан метод, позволяющий одновременно определять ДНК-полимеразную и нуклеазную активности ДНК-полимераз. Показана его применимость для оценки количества и нормировки активностей широкого спектра ДНК-полимераз, оптимизации состава реакционных смесей, содержащих полимеразы, в том числе смесей для ПЦР в реальном времени, оценки эффективности образования комплекса «полимераза-антитела» и оптимизации «горячего старта». Метод основан на измерении флуоресценции и может использоваться в стандартной лабораторной практике.

3. Разработан метод стандартизации флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов, основанный на анализе спектров поглощения и флуоресценции. Метод позволяет проводить оценку степени мечения олигонуклеотидов флуорофорами и гасителями флуоресценции, что облегчает оптимизацию и контроль качества реакций, в которых используются подобные олигонуклеотиды, например, ПЦР в реальном времени в варианте с гидролизуемыми зондами.

4. Путём оценки копийности N- и Svtt/g-специфичных маркёров в мтДНК N- и Svulg-типов на расширенной выборке растений разных линий и сортов с использованием оптимизированной ПЦР в реальном времени в варианте с гидролизуемым олигонуклеотидным зондом показано, что гетероплазмия является нормальным состоянием мтДНК Beta vulgaris, и что количество доминирующего и минорного варианта может отличаться более чем на шесть порядков.

5. Предложен способ быстрого титрования цитоплазмы сахарной свёклы, основанный на использовании мультиплексной ПЦР в реальном времени в варианте с гидролизуемым олигонуклеотидным зондом.

Работа поддержана грантом Министерства образования и науки РФ (№ 02.740,11.0705)

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Брагин А.Г., Иванов М.К., Дымшиц Г.М.. Оценка стехиометрии маркерных последовательностей митохондриалъного генома сахарной свеклы (Beta vulgarisj методом ПЦР в реальном времениИ Доклады Академии Наук, 2006, т.406, №2, с. 260265.

2. Брагин А.Г., Глушков С.А., Иванов М.К., Краснов А.А., Дымшиц Г.М. Определение ДНК-полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-зависимых полимераз с использованием флуоресцентной детекции в режиме реального времени // Биохимия, 2008, т.73, в.9, с.1252-1264.

3. Glushkov S.A., Bragin A.G., Dymshits G.M. Decontamination of polymerase chain reaction reagents using DEAE-cellulose II Analytical Biochemistry, 2009 v.393, n.l, pp 135 - 137.

4. Дымшиц Г.М., Брагин А.Г., Иванов M.K. Молекулярно-генетические аспекты цитоплазматической мужской стерильности //Энциклопедия рода Beta. Биология, генетика и селекция свеклы. Сборник научных трудов. Институт цитологии

и генетики СО РАН, Россия; Институт сахарной свеклы, Украина. Новосибирск. «Издательство Сова», 2010,686 стр., с. 228-247.

5. Иванов М.К., Ревенко A.C., Брагин А.Г., Малецкий С.И., Дымшиц Г.М. Вариации структуры и транскрипции митохондриальной ДНК у растений сахарной свеклы с различным фенотипическим проявлением признака ЦМС И Материалы IV конференции молодых ученых, посвященной памяти М.А. Лаврентьева. Новосибирск, 2004, Часть 2, с.86-91.

6. Брагин А.Г. Исследование комплексной организации митохондриального генома и гетероплазмии сахарной свеклы (Beta -vulgaris) методом ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) И Труды XL1II международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс". НГУ, 2005, с. 143-149.

7. Брагип А.Г., Иванов М.К. Комплексная организация митохондриального генома сахарной свеклы (Beta vulgaris): отличия в структуре и копийности отдельных последовательностей в связи с признаком ЦМС // "Молекулярная и прикладная генетика". Материалы международной научной конференции "Современные проблемы генетики". Минск, 2005, Т.1, с.71.

8. Дымшиц Г.М., Иванов М.К, Брагин А.Г. Анализ комплексной организации и гетероплазмии митохондриальной ДНК сахарной свеклы // Сборник трудов международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию акад. Д.Г.Кнорре, Новосибирск, 30 июля-3 августа 2006 г., с.108-109.

9. Брагин А.Г., Петров В.В., Краснов A.A., Иванов М.К., Дымшиц Г.М. Анализ структуры митохондриального генома сахарной свеклы методом ПЦР в реальном времени // Материалы Всероссийской научной конференции «Структура и экспрессия митохондриального генома растений», Иркутск, 3-7 сентября 2006 г., с. 17-22.

10. Дымшиц Г.М., Хворостов И.Б., Иванов М.К., Брагин А.Г. Гетероплазмия -потенциальный источник изменчивости структуры и экспрессии митохондриального генома сахарной свеклы И Материалы Всероссийской научной конференции «Структура и экспрессия митохондриального генома растений», Иркутск, 3-7 сентября 2006 г., с.42-47.

11. Bragin A.G., Glushkov S.A., Krasnov A.A., Vedernikov V.E., Ivanov M.K. New method of fluorescence detection of polymerase and nuclease activity of DNA polymerases which are used in molecular diagnostics // 3rd International Conference «Basic Science for Medicine», September 2-8, 2007, Novosibirsk, Russia, p.103.

12. Брагин А.Г., Краснов A.A., Иванов М.К. Регистрация активности ферментов-полимераз при помощи флуоресцентной детекции в режиме реального времени П «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» Сборник материалов Международной молодежной научно-методической конференции 9-12 мая 2007 г., Томск, с.30-31.

13.Глушков С.А., Брагип А.Г., Дымшиц Г.М. Очистка ПЦР-реагентов от контаминирующей нуклеиновой кислоты с помощью ДЭАЭ-целлюлозы // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008 года, Новосибирск, «Арта», с.369.

Подписано к печати 16.06.2010 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16, печ. л. 1, уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 Заказ №57

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Брагин, Антон Геннадьевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Организация мтДНК высших растений.

1.1.1 Структура мтДНК высших растений.

1.1.2 Последовательности мтДНК высших растений.

1.1.3 Гетероплазмия мтДНК высших растений и стехиометрия отдельных участков генома.

1.2 Изменчивость мтДНК и признак цитоплазматической мужской стерильности у высших растений.

1.2.1 Мутации мтДНК высших растений.

1.2.2 Ядерные локусы, контролирующие развитие ЦМС.

1.3 Организация митохондриального генома и ЦМС у сахарной свёклы Beta vulgaris.

1.3.1 Организация мтДНК Beta vulgaris с TV- и SVw/g-типами цитоплазм.

1.3.2 Признак ЦМС у сахарной свёклы.

1.3.3 Проблемы анализа гетероплазмии мтДНК и ЦМС у Beta vulgaris

1.4 Использование количественной ПЦР в реальном времени для детекции низкокопийных последовательностей.

1.5 Определение активностей ДНК-полимераз: обзор существующих методов.

1.5.1 Методы определения полимеразной активности.

1.5.2 Методы определения нуклеазной активности.

1.5.3 Использование методов определения активностей ДНК-полимераз для оптимизации ПЦР.

1.6 Оптимизация ПЦР в реальном времени и стандартизация флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.1.1 Реактивы.

2.1.2 Олигонуклеотиды.

2.1.2.1 Праймеры и зонды для ПЦР.

2.1.2.2 Праймеры для ссквенирования.

2.1.2.3 Олигонуклеотиды, содержащие шпилечную структуру.

2.1.2.4 Гидролизуемые зонды для определения нуклеазной активности ДНК-полнмераз.

2.1.3 Образцы растений.

2.2 Методы.

2.2.1 Выделение нуклеиновых кислот.

2.2.1.1 Выделение митохондрий сахарной свеклы.

2.2.1.2 Выделение ДНК из митохондрий сахарной свеклы.

2.2.1.3 Выделение суммарной ДНК из проростков сахарной свёклы.

2.2.1.4 Выделение мтРНК.

2.2.1.5 Выделение плазмидной ДНК.

2.2.1.6 Выделение плазмидной ДНК в макроколичествах.

2.2.2 Полимеразная цепная реакция.

2.2.2.1 Традиционная ПЦР.

2.2.2.2 ПЦР в реальном времени.

2.2.2.3 ПЦР в реальном времени с использованием SYBR Green 1.

2.2.2.4 ПЦР в реальном времени с использованием гидролизуемых зондов.

2.2.2.5 Мультиплексная ПЦР в реальном времени с использованием гидролизуемых зондов.

2.2.3 Клонирование и другие манипуляции с продуктами амплификаци.59 2.2.3.1 Гель-электрофорез и очистка продуктов ПЦР.

2.2.3.2 Клонирование продуктов ПЦР.

2.2.3.3 Секвенирование клонированных последовательностей.

2.2.4 Определение полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-полимераз.

2.2.5 Определение параметров флуоресцентно-меченных олигонуклеотидов.

2.2.5.1 Снятие спектров поглощения и спектров флуоресценции.

2.2.5.2 Разработка программного обеспечения, предназначенного для анализа спектров поглощения и флуоресценции.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Анализ копийности последовательностей мтДНК Beta vulgaris методом ПНР в реальном времени в варианте с использованием флуорохрома SYBR Green 1.

3.2 Анализ копийности последовательностей мтДНК расширенной выборки линий и сортов Beta vulgaris методом ПЦР в реальном времени в варианте с использованием гидролизуемых зондов.

3.2.1 Применение ПЦР в реальном времени для оценки копийности последовательностей мтДНК Beta vulgaris с нормировкой на универсальные маркёры мтДНК.

3.2.2 Анализ присутствия универсального маркера orfB.

3.2.3 Анализ стехиометрии TV-специфичного маркера orf246.

3.2.4 Оценка копийности б'гм/^-специфичных маркёров.

3.2.5 Мультиплексная ПЦР в реальном времени для одновременной количественной детекции двух маркёров мтДНК.

3.2.6. Анализ связи копийности последовательностей N- и Svw/g-типа и пыльцевого фенотипа у Beta vulgaris.

3.3 Оптимизация ПЦР в реальном времени для детекции низкокопийных последовательностей митохондриального генома.

3.3.1 Оптимизация состава реакционной смеси.

3.3.2 Оптимизация активности ДНК-полимеразы в реакционной смеси: разработка метода определения полимеразной и эндонуклеазной активности.

3.3.2.1 Область применения метода.

3.3.2.2 Выбор комплекса праймер-матрица, оптимального для регистрации полимеразной активности.

3.3.2.3 Определение полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-полимераз с использованием олигонуклеотидов, образующих шпильку.

3.3.2.4 Регистрация эндонуклеазной активности ДНК-полимераз.

3.3.2.5 Определение температурно-временных параметров диссоциации комплексов Taq-пoлимepaзaЛgG (со специфичными к Taq-полимеразе сайтами связывания антигена).

3.3.2.6 Сравнение активностей ферментов различных партий и тестирование влияния различных соединений на ДНК-полимеразную и нуклеазную активности полимераз.

3.3.4 Анализ качества флуоресцентно-меченных олигнулеотидов.

3.3.4.1 Автоматический анализ спектров поглощения и спектров флуоресценции флуоресцентно-меченых олигнулеотидов и разработка графического интерфейса пользователся.

3.3.4.2 Влияние качества препарата флуоресцентно-меченного олигонуклеотида на ПЦР.

3.3.5. Анализ гетероплазматического состояние митохондриальной ДНК сахарной свёклы: роль методологических исследований в развитии фундаментальных предствлений и практических приложений.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Стехиометрия минорных последовательностей и гетероплазмия митохондриального генома Beta vulgaris"

Митохондриальные геномы растений обладают рядом характерных черт, которые отличают их от митохондриальных геномов грибов и животных. Главными структурными отличиями являются большие размеры при сходной кодирующей ёмкости, что связано с наличием протяженных некодирующих областей, и сложная комплексная организация: присутствие в митохондриальной фракции ДНК конкатемеров, а-структур, субгеномных кольцевых и линейных вариантов, стехиометрия которых может варьировать в том числе и для разных особей одного вида (Dale et al., 1981; Mikami et al. 1984; Dudareva et al., 1988; Ivanov et al., 2004). Это приводит к тому, что традиционное представление полных последовательностей геномов митохондрий растений в форме «основной хромосомы» как правило не отражает их состояние in vivo, так как не учитывает количественный вклад отдельных последовательностей в составе митохондриальной ДНК и возможности присутствия низкокопийных и рекомбиногенных вариантов. В настоящее время известно, что проявление ряда фенотипических признаков растений непосредственно связано с организацией митохондриальной ДНК, одним из примеров подобных признаков является цитоплазматическая мужская стерильность.

Признак цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) связан с присутствием в митохондриях особого типа генома (для ЦМС Оуэновского типа у сахарной свеклы (Beta vulgaris) это геном Svulg). ЦМС проявляется при наличии особого ядерного окружения и заключается в неспособности растения производить фертильную пыльцу. К настоящему времени полностью секвенированы два варианта «основной хромосомы» митохондриального генома В. vulgaris - обеспечивающий образование фертильной пыльцы (iV-тип) и митохондриальный геном Svulg-тшт (Kubo et al., 2000; Satoh et al., 2004). Однако большое количество уникальных для каждого из геномов областей не позволяют связать ЦМС с утратой или приобретением какой-то отдельной последовательности. Анализ трансляционных спектров N и Svulg митохондрий также не позволил однозначно установить детерминанту ЦМС на белковом уровне (Ducos et al., 2001).

Для ряда видов растений показана роль увеличения (путём рекомбинации или избирательной амплификации) дозы отдельных химерных последовательностей мтДНК в развитии ЦМС (Dale et al., 1981; Mikami et al. 1984; Bailey-Serres et al., 1987); для фасоли (Phaseolus vulgaris) показана связь признака с избирательной амплификацией отдельных субгеномных вариантов (Arrieta-Montiel et al., 2001). Вероятно, что проявление признака ЦМС у В. vulgaris обеспечивается не только присутствием генома («основной хромосомы») определенного типа, но и составом и стехиометрией субгеномных вариантов. В этом случае, установление связи между ЦМС и структурой генома митохондрий у этого вида требует анализа состава и копийности субгеномных вариантов мтДНК в цитоплазмах мужскостерильных и фертильных растений. Важно отметить, что стехиометрия отдельных последовательностей, входящих в состав генома митохондрии, может отличаться более чем в 1000 раз, что приводит к необходимости использования высокочувствительных методов с широким диапазоном детекции и тщательной их оптимизации.

Метод ПЦР в реальном времени в настоящий момент является одним из наиболее точных и чувствительных методов количественной детекции последовательностей ДНК, ' однако для получения достоверных результатов он требует тщательной оптимизации (Freeman et al., 1999; Bustin, 2002; Bustin et al., 2004). Предельная теоретическая чувствительность метода ПЦР составляет одну копию последовательности НК на реакцию (Wabuyele and Soper, 2001; Piggee, 2008), однако реальная чувствительность может варьировать в широких пределах в зависимости от структуры анализируемой последовательности, последовательностей праймеров и зондов, используемых для амплификации и детекции накопления продукта амплификации, протекания в реакционной смеси конкурирующих реакций и наличия в ней ингибиторов, свойств используемого в реакции фермента (таких как процессивность и температурная стабильность). Данные факторы влияют как на порог детекции, так и на характер зависимости аналитического сигнала от количества анализируемой последовательности, затрудняя достоверную количественную оценку.

Использование метода ПЦР в реальном времени для оценки количества анализируемой НК требует учёта перечисленных факторов и уменьшения влияния тех из них, которые оказывают выраженное негативное влияние на чувствительность и воспроизводимость реакции, что достигается разработкой и включением в процесс анализа контрольных образцов различного рода, использованием методов характеризации ключевых компонентов реакционной смеси, таких как ДНК-полимераза и флуоресцентно-меченый олигонуклеотидный зонд, оптимизацией состава реакционной смеси и температурных параметров реакции. Наиболее тщательная оптимизация требуется в тех случаях, когда число копий анализируемых последовательности может меняться в широких пределах: от единичных копий до десятков и сотен тысяч копий на образец, что имеет место для митохондриальной ДНК растений, копийность генов в составе которой может варьировать в пределах нескольких порядков для разных организмов, в разных тканях одного растения и в зависимости от условий среды (Leaver et al., 1988). Таким образом, установление характера причинно-следственной связи между развитием признака ЦМС и организацией генома митохондрий сахарной свёклы требует достоверной оценки стехиометрии отдельных последовательностей-кандидатов, что, в свою очередь, связано с необходимостью разработки методических подходов, направленных на усовершенствование метода ПЦР в реальном-времени и позволяющих проводить количественную детекцию отдельных последовательностей ДНК с максимальной достоверностью в широком диапазоне значений.

Целью настоящей работы являлось изучение организации митохондриального генома Beta vulgaris и анализ гетероплазматического состояния митохондриальной ДНК, характерной для фертильных растений сахарной свёклы и растений с оуэновским типом цитоплазматической мужской стерильности.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка и оптимизация системы количественной детекции маркерных последовательностей в составе мтДНК сахарной свеклы с использованием ПЦР в реальном времени. С учётом специфики объекта и необходимости достоверного определения количества маркёров в широком диапазоне концентраций, решение этой задачи потребовало решения ряда промежуточных задач, таких как: 1.1. Разработка протокола флуоресцентной детекции ДНК-зависимой ДНК-полимеразной и нуклеазной активностей ДНК-полимераз в режиме реального времени и оценка влияния на них различных факторов, как химической, так и физической природы.

1.2. Разработка системы оценки качества флуоресцентных зондов, используемых в ПЦР в реальном времени. 2. Анализ гетероплазматического состояния митохондриальной ДНК фертильных растений сахарной свеклы (Beta vulgaris) и растений, характеризующихся проявлением признака цитоплазматической мужской стерильности, методом ПЦР в реальном времени и анализ связи стехиометрии отдельных последовательностей и пыльцевого фенотипа.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Брагин, Антон Геннадьевич

ВЫВОДЫ

1. Показано присутствие Svulg- специфичных маркёров orf324 и Z(S) в мтДНК Beta vulgaris //-типа и iV-специфичных маркёров atp6(N) и atpA(N) в мтДНК Beta vulgaris Svulg-тшт, с использованием ПЦР в реальном времени в варианте с флуоресцентным красителем. Разница между копийностями последовательностей, входящих в состав доминирующего варианта мтДНК, и последовательностями, входящими в состав минорного варианта, доходила до трёх порядков. Для последовательности orf324, которая по результатам геномного секвенирования расценивалась как специфичная для оуэновской цитоплазмы, показана высокая копийность в мтДНК фертильных растений.

2. Впервые разработан метод, позволяющий одновременно определять ДНК-полимеразную и нуклеазную активности ДНК-полимераз. Показана его применимость для оценки количества и нормировки активностей широкого спектра ДНК-полимераз, оптимизации состава реакционных смесей, содержащих полимеразы, в том числе смесей, для ПЦР в реальном времени, оценки эффективности образования комплекса «полимераза-антитела» и оптимизации «горячего старта». Метод основан на измерении флуоресценции и может использоваться в стандартной лабораторной практике.

4. Путём оценки копийности N- и 5уг</^-специфичных маркёров в мтДНК N- и Svulg-типов на расширенной выборке растений разных линий и сортов с использованием оптимизированной ПЦР в реальном времени в варианте с гидролизуемым олигонуклеотидным зондом показано, что гетероплазмия является нормальным состоянием мтДНК Beta vulgaris, и что количество доминирующего и минорного варианта может отличаться более чем на шесть порядков.

5. Предложен способ быстрого типирования цитоплазмы сахарной свёклы, основанный на использовании мультиплексной ПЦР в реальном времени в варианте с гидролизуемым олигонуклеотидным зондом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Брагин, Антон Геннадьевич, Новосибирск

1. Аульченко Ю.С., Вепрев С.Г., Аксенович Т.И. Изменение типа цитоплазмы усахарной свеклы (Beta vulgaris L.) при инбридинге. II. Сегрегационный анализ родословной II Генетика. 1997. Т.ЗЗ. С.808-815.

2. Бузанов И. Ф. Биология и селекция сахарной свеклы. М.: Колос. 1968. 775 с.

3. Вепрев С.Г., Дикалова А.Э., Мглинец А.В., Поповский А.В., Малецкий С.И.

4. Изменение типа цитоплазмы у сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) при инбридинге. I. Гибридологический анализ и тестирование типа митохондриальной ДНК П Генетика. 1997. Т.ЗЗ. С.799-807.

5. Малецкий С.И., Вепрев С.Г., Шавруков Ю.Н., Коновалов А.А., Малецкая Е.И.,

6. Дударева Н.А., Мглинец А.В. Генетический контроль размножения сахарной свеют. Новосибирск: Наука, 1991. 168 с.

7. Степанова Р.Ф. Использование компьютерных технологий в практике количественного анализа. Потенциометрический и фотометрический методы: Учебное пособие. Самара: Изд-во "Самарский университет", 2003. с. 31.

8. Abdelnoor R.V., Yule R., Elo A., Christensen A.C., Meyer-Gauen G., Mackenzie S.A.

9. Substoichiometric shifting in the plant mitochondrial genome is influenced by a gene homologous to MutS II Proc Natl Acad Sci USA. 2003. V. 100. P. 5968-5973.

10. Aksyonova E., Sinyavskaya M., Danilenko N., Pershina L., Nakamura C., Davydenko O.

11. Heteroplasmy and paternally oriented shift of the organellar DNA composition in barleywheat hybrids during backcrosses with wheat parents II Genome. 2005. Y.48. P. 761-769.

12. Allen J.O., Fauron C.M., Minx P., Roark L., Oddiraju S., Lin G.N., Meyer L., Sun H.,

13. Kim K., Wang C., Du F., Xu D., Gibson M., Cifrese J., Clifton S.W., Newton K.J. Comparisons Among Two Fertile and Three Male-Sterile Mitochondrial Genomes of Maize // Genetics. 2007. V.177. P. 1173-1192.

14. Andre C., Levy A., Walbot V. Small repeated sequences and the structure of plantmitochondrial genomes II Trends Genet. 1992. V. 8. P. 128-132.

15. Arezi В., Xing W., Sorge J., Hogrefe H. Amplification efficiency of thermostable DNApolymerases II Analytical Biochemistry. 2003. V.321. P. 226-235.

16. Arrieta-Montiel M., Lyznik A., Woloszynska M., Janska H., Tohme J., Mackenzie S.

17. Tracing evolutionary and developmental implications of mitochondrial stoichiometric shifting in the common bean!I Genetics. 2001. V. 158. P. 851-864.

18. Backert S., Lurz R., Borner T. Electron microscopic investigation of mitochondrial DNAfrom Chenopodium album (L.) II Curr. Genet. 1996. V.29. N.5. P.427-436.

19. Backert S., Meissner K., Borner T. Unique features of the mitochondrial rolling circleplasmid mpl from the higher plant Chenopodium album (L.) // Nucleic Acids Res. 1997. V.25(3). P. 582-589.

20. Bai R.-K., Wong L.-J.C. Detection and Quantification of Heteroplasmic Mutant

21. Mitochondrial DNA by Real-Time Amplification Refractory Mutation System Quantitative PCR Analysis: A Single-Step Approach II Clinical Chemistry. 2004. V.50(6). P. 996-1001.

22. Bailey-Serres G., Leroy P., Jones S.S., Wahleithner J.A., Wolstenholme D.R. Sizedistributions of circular molecules in plant mitochondrial DNAs II Curr. Genet. 1987. V.12. P.49- 53.

23. Bailey-Serres J., Hanson D.K., Fox T.D., Leaver C.J. Mitochondrial genomerearrangement leads to extension and relocation, of the cytochrome с oxidase subunit I gene in sorghum II Cell. 1986. V.47(4). P.567-576.

24. Bachmann В., Luke W., Hunsmann G., Improvement of PCR amplified DNA sequencingwith the aid of detergents //Nucleic Acids Research. 1990. V. 15(5). P. 1309.

25. Bendich A.J. Reaching for the ring: the study of mitochondrial genome structure II Curr.

26. Genet. 1993. V. 24. P. 279- 290.

27. Bendich A.J. Structural analysis of mitochondrial DNA molecules from fungi and plantsusing movingpictires andpulsed-field gel electrophoresis II J. Mol. Biol. 1996. V. 255. P. 564- 588.

28. Bergthorsson U., Richardson A.O., Young G.J., Goertzen L.R., Palmer J.D. Massivehorizontal transfer of mitochondrial genes from diverse land plant donors to the basal angiosperm Amborella II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 17747-17752.

29. Brears Т., Lonsdale D.M. The sugarbeet mt genome: a complex organization generatedby homologous recombination II Mol. Gen. Genet. 1988. V.214. P. 514—522.

30. Budar F., Touzet P., De Paepe R The nucleo-mitochondrial conflict in cytoplasmic malesterilities revisited II Genetica. 2003. V. 117. P. 3-16.

31. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction assays II Journal of Molecular Endocrinology. 2000. V.25. P. 169-193.

32. Bustin S.A., Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT

33. PCR): trends and problems II J. of Mol. Endocrinol. 2002. V. 29. P. 23-39.

34. Bustin, S.A., Nolan, Т., Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcriptionpolymerase chain reaction //J. Biomol. Tech. 2004. V. 15 (3). P. 155-166.

35. Cantor C.R., Tinoco I.Jr. Calculated optical properties of 64 trinucleoside diphosphates

36. Biopolymers. 1967. V.5(9). P. 821-835.

37. Cavaluzzi M.J., Borer P.N. Revised UV extinction coefficients for nucleoside-5'monophosphates and unpaired DNA and RNA // Nucleic Acids Res. 2004. V.32(l). el3.

38. Chandler D.P., Wagnon C.A., Bolton H.J.R. Reverse transcriptase (RT) inhibition of

39. PCR at low concentrations of template and its implications for quantitative RT-PCR II Applied and environmental microbiology. 1998. V.64(2). P. 669-677.

40. Chang T.L., Stoike L.L., Zarka D., Schewe G., Chiu W.L., Jarrell D.C., Sears B.B.

41. Characterization of primary lesions caused by the plastome mutator of Oenothera II Curr. Genet. 1996. V.30. P.522-530.

42. Chavan S.J., Prochaska H.J. Fluorometric measurement of reverse transcriptase activitywith 4' 6-diamidino-2-phenylindole II Anal Biochem. 1995. V.225(l). P. 54-59.

43. Cheng D., Kitazaki K., Xu D., Mikami Т., Kubo T. The distribution of normal and malesterile cytoplasms in Chinese sugar-beet germplasm II Euphytica. 2009. V.165. P. 345351.

44. Cho Y, Mower J.P, Qiu Y.L, Palmer J.D. Mitochondrial substitution rates areextraordinarily elevated and variable in a genus of flowering plants II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V.101(51) P.17741-17746.

45. Choi S.J., Szoka F.C. Fluorometric determination of deoxyribonuclease I activity with

46. PicoGreen И Anal. Biochem. 2000. V.281(l). P. 95-97.

47. Clifton S.W., Minx P., Fauron C.M., Gibson M., Allen J.O., Sun H., Thompson M.,

48. Barbazuk W.B., Kanuganti S., Tayloe C., Meyer L., Wilson R.K., Newton K.J. Sequence and comparative analysis of the maize NB mitochondrial genome // Plant Physiol. 2004. V. 136. P.3486-3503.

49. Conklin P.L., Hanson M.R. Recombination of plant mitochondrial genomes II

50. Homologous Recombination and Gene Silencing in Plants. Kluwer Academic Publishers, Netherlands. Paszkowski, J. (Ed.), 1994. P. 61-81.

51. Covill S., Mathis J., Hodge P., Cass M., Bott M., Bodrug S. Quantitative HCV TMA

52. Assay with Variable Dynamic Range II Abstr. Intersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemother. 2001. V. 41. P. 16-19.

53. Cui X., Wise R.P., Schnable P.S. The rf2 nuclear restorer gene of male- sterile Tcytoplasm maize II Science. 1996. N. 272. P. 1334- 1336.

54. Dale R.M.K., Duesing J.H., Keen D. Supercoiled mitochondrial DNAs from plant tissueculture cells И Nucl. Acids Res. 1981. V.9. P.4583-4593.

55. Dann O., Bergen G., Demant E., and Volz G. Trypanocide Diamidine des Phynylbenzofurans, 2-Phenylindens und 2-Phenyl-indols II Ann. Chem. 1971. V.749. P. 68-89.

56. De Koning A.P., Noble G.P., Heiss A.A., Wong J., Keeling P.J. Environmental PCRsurvey to determine the distribution of a non-canonical genetic code in uncultivable oxymonads II Environ. Microbiol. 2008. V. 10(1). P. 65-74.

57. Ducos E., Touzet P., Boutry M. The male sterile G cytoplasm of wild beet displaysmodified mitochondrial respiratory complexes II Plant J. 2001. V. 26. P. 171-180.

58. Ducos E., Touzet P., Saumitou-Laprade P. Nuclear effect on mitochondrial proteinexpression of the CMS Owen cytoplasm in sugar beet II Theor. Appl. Genet. 2001. V.102. P. 1299-1304.

59. Dudareva N.A., Kiseleva E.V., Boyarintseva A.E., Maystrenko A.G., Khristolyubova N.

60. В., Salganik R. I. Structure of the mitochondrial genome of Beta vulgaris L. II Theor. Appl. Genet. 1988. N 76. P. 753- 759.

61. Dudareva N.A., Popovsky A.V., Kasjanova U.V., Veprev S.G., Mglinets A.V., Salganik

62. R. I. Expression of mitochondrial genes in fertile and sterile sugar beet cytoplasms with different nuclear fertility restorer genes II Theor. Appl. Genet. 1991. N 83. P. 217- 224.

63. Espy M.J., Uhl J.R., Sloan L.M., Buckwalter S.P., Jones M.F., Vetter E.A., Yao J.D.C.,

64. Wengenack N.L., Rosenblatt J.E., Cockerill F.R. Ill, Smith T.F. Real-Time PCR in Clinical Microbiology: Applications for Routine Laboratory Testing II Clinical Microbiology Reviews. 2006. V.19(l). P. 165-256.

65. Ferrari E., Wright-Minogue J., Fang W., Baroudy B.M., Lau J.Y., Hong Z.

66. Characterization of soluble hepatitis С virus RNAdependent RNA polymerase expressed in Escherichia coli //J. Virol. 1999. V.73. P. 1649-1654.

67. Freeman W.M., Walker S.J., Vrana K.E. Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential II

68. Biotechniques. 1999. V. 26(1). P. 112-122, 124-125.

69. Freeman, W.M., Walker, S.J., Vrana, K.E., Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential II

70. Biotechniques. 1999. V. 26(1). P. 112-122, 124-125.

71. Frey J.E., Frey В., Forcioli D. Quantitative assessment of heteroplasmy levels in Seneciovulgaris chloroplast DNA II Genetica. 2005. V. 123. P. 255-261.

72. Fujie M., Kuroiwa H., Kawano S., Kuroiwa T. Studies on the behavior of organelles andtheir nucleoids in the root apical meristem of Arabidopsis thaliana L. II col. Planta. 1993. V.189. P. 443-452.

73. Fujie M., Kuroiwa H., Kawano S., Mutoh S., Kuroiwa T. Behavior of organelles andtheir nucleoids in the shoot apical meristem during leaf development in Arabidopsis thaliana L. //Planta. 1994. V.194. P. 395-405.

74. Fujii S., Toriyama K. Genome barriers between nuclei and mitochondria exemplified bycytoplasmic male sterility II Plant Cell Physiol. 2008. V. 49(10). P. 1484-1494.

75. Garcia-Diaz A., Oya R., Sanchez A., Luque F. Effect of prolonged vegetativereproduction of olive tree cultivars (Olea europaea L.) in mitochondrial homoplasmy and heteroplasmy II Genome. 2003. V.46(3). P. 377-81.

76. Giulietti A. , Overbergh L., Valckx D., Decallonne В., Bouillon R., Mathieu C. An

77. Overview of Real-Time Quantitative PCR: Applications to Quantify Cytokine Gene Expression II Methods. 2001. V. 25(4). P. 386-401.

78. Hagihara E., Itchoda N. , Habu Y., Iida S., Mikami Т., Kubo T. Molecular mapping of afertility restorer gene for Owen cytoplasmic male sterility in sugar beet II Theoretical and Applied Genetics. 2005. V. 111(2). P. 250-255.

79. Handa H. Linear plasmids in plant mitochondria: Peaceful coexistences or maliciousinvasions? //Mitochondrion. 2008. V.8. P. 15-25

80. Hanson M.R., Folkerts O. Structure and function of the higher plant mitochondrialgenome II Int Rev Cytol. 1992. V.141.P. 129-172.

81. Hanson, M.R. and Bentolila, S. Interactions of mitochondrial and nuclear genes thataffect male gametophyte development II Plant Cell. 2004. 16 Suppl 1. P. 154-169.

82. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR II Genome

83. Res. 1996. V.6(10). P. 986-994.

84. Henke W., Herdel K., Jung K., Schnorr D., Loening S.A. Betaine improves the PCRamplification of GC-rich DNA sequences II Nucleic Acids Research. 1997. V. 25(19). P. 3957-3958.

85. Hill I.R., Garnett M.C., Bignotti F., Davis S.S. Determination of protection from serumnuclease activity by DNA-polyelectrolyte complexes using an electrophoretic method II Anal. Biochem. 2001. V.291 (1). P. 62-68.

86. Hj erdin-Panagopoulos A, Kraft T, Rading I, Tuvesson S, Nilsson N-O (2002) Three OTLregions for restoration of Owen CMS in sugar beet// Crop Sci. 2002. V. 42 P. 540-544.

87. Ho D.L., Byrnes W.M., Ma W.P., Shi Y., Callaway D.J., Bu Z. Structure-specific

88. DNA-induced conformational changes in Taq polymerase revealed by small angle neutron scattering II J. Biol. Chem. 2004. V.10.1.279(37). P. 39146-39154.

89. Hochholdinger F., Guo L., Schnable P.S. Cytoplasmic regulation of the accumulation ofnuclear-encoded proteins in the mitochondrial proteome of maize II The Plant J. 2004. V. 37. P. 199-208.

90. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. Detection of specificpolymerase chain reaction product by utilizing the 5' -> 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88. P. 7276-7280.

91. Hori K., Takahashi Т., Okada T. The measurement of exonuclease activities by atomicforce microscopy II Biomedical and Life Sciences and Physics and Astronomy. 1998. V.27(l). P. 63-68.

92. Hon К., Takahashi Т., Okada Т. The measurement of exonuclease activities by atomicforce microscopy II Biomedical and Life Sciences and Physics and Astronomy 1998. V. 27(1). P. 63-68.

93. Ivanov M.K., Revenko A.S., and Dymshits G.M. Cytoplasmic male sterility-associatedstructural variation of the mitochondrial genome regions containing rps3 and orf215 in sugar beet Beta vulgaris L. I/ Mol. Biol. (Moscow). 2004. V. 38(2). P. 413-419.

94. Jacobs M.A., Payne S.R., Bendich A. J., Moving pictures and pulsed-field gelelectrophoresis show only linear mitochondrial DNA molecules from yeasts with linear-mapping and circularmapping mitochondrial genomes // Curr. Genet. 1996. Y.30. P. 3-11.

95. Janska H., Sarria R., Woloszynska M., Arrieta-Montiel M, Mackenzie S.A.

96. Stoichiometric shifts in the common bean mitochondrial genome leading to male sterility and spontaneous reversion to fertility II Plant Cell. 1998. N 10. P. 1163- 1180.

97. Johnson K.A., Bryant F.R. and Benkovic S.J. Continuous assay for DNA polymerizationby light scattering II Anal. Biochem. 1984. V.136. P. 192-194.

98. Kanazawa A., Tsutsumi N., Hirai A. Reversible changes in the composition of thepopulation of mtDNAs during dediVerentiation and regeneration in tobacco II Genetics. 1994. V.138.P. 865-870.

99. Karlen Y., McNair A., Perseguers S., Mazza C., Mermod N. Statistical significance ofquantitative PCRII BMC Bioinformatics. 2007. V.8. P. 131.

100. Kellogg D.E., Rybalkin I., Chen S., Mukhamedova N., Vlasik Т., Siebert P.D., Chenchik

101. A. TaqStart Antibody: "hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase II Biotechniques. 1994. V.16(6). P. 1134-1137.

102. Kmiec В., Woloszynska M., Janska H. Heteroplasmy as a common state of mitochondrialgenetic information in plants and animals II Curr. Genet. 2006. V.50. P. 149-159.

103. Kubista M., Akerman В., Norden B. Characterization of Interaction between DNA and4',6-Diamidino-2-phenylindole by Optical Spectroscopy II Biochemistry. 1987. V. 26. P. 4545-4553.

104. Kubo Т., Mikami T. Organization and variation of angiosperm mitochondrial genome //

105. Physiol. Plant. 2007. V. 129. P. 6-13.

106. Kubo Т., Newton K.J. Angiosperm mitochondrial genomes and mutations H

107. Mitochondrion. 2008. V. 8. P. 5-14.

108. Kubo Т., Nishizawa S., Mikami T. Alterations in organization and transcription of themitochondrial genome of cytoplasmic male sterile sugar beet (Beta vulgaris L) II Mol. Gen. Genet. 1999. V. 262. P. 283-290.

109. Kubo Т., Nishizawa S., Sugawara A., Itchoda N., Estiati A., Mikami T. The completenucleotide sequence of the mitochondrial genome of sugar beet (Beta vulgaris L.) reveals a novel gene for tRNACys(GCA) И Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 25712576.

110. Kubo Т., Satoh Y., Muro Т., Kinoshita Т., Mikami T. Physical and gene organization ofmitochondrial DNA from the fertile cytoplasm of sugarbeet II Curr. Genet. 1995. V. 28. P. 235- 241.

111. Kuzmin E.V., Duvick D.N., Newton K.J. A mitochondrial mutator system in maize II

112. Plant Physiol. 2005. V.137. P. 779-789.

113. Lahser F., Malcolm B. A continuous nonradioactive assay for RNA-dependent RNApolymerase activity II Analytical Biochemistry. 2004. V.325. P. 247-254.

114. Laksanalamai P., Pavlov A.R., Slesarev A.I., Robb F.T. Stabilization of Taq DNA

115. Polymerase at High Temperature by Protein Folding Pathways From a Hyperthermophilic Archaeon; Pyrococcus furiosus II Biotechnology and Bioengineering. 2005. V.93(l). P. 1-5.

116. Laser В., Mohr S., Odenbach W., Oettler G., Kuck U. Parental and novel copies of themitochondrial orf25 gene in the hybrid crop-plant triticale: predominant transcriptional expression of the maternal gene copy И Curr. Genet. 1997. V.32. P. 337-347.

117. Leaver C.J., Isaac P.G., Small I.D., Bailey-Serres J., Liddell A.D., Hawkesford M.J.,

118. Mitochondrial Genome Diversity and Cytoplasmic Male Sterility II Higher Plants Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B. 1988. V. 319(1193). P. 165-176.

119. Li X.Q., Jean M., Landry B.S., Brown G.G. Restorer genes for different forms of

120. Brassica cytoplasmic male sterility map to a single nuclear locus that modifies transcripts of several mitochondrial genes II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V.18. I. 95(17). P. 10032-10037.

121. Li K., Brownley A., Stockwell T.B., Beeson K., Mcintosh T.C., Busam D., Ferriera S.,

122. Murphy S., Levy S. Novel computational methods for increasing PCR primer design effectiveness in directed sequencing II BMC Bioinformatics. 2008. V. 9. P. 191.

123. Liu F., Cui X., Horner H.T., Weiner H., Schnable P.S. Mitochondrial aldehydedehydrogenase activity is required for male fertility in maize II Plant Cell. 2001. V. 13. P.1063-1078.

124. Liu G., Kunchakarra Y., Bipasha Mukheijee, Gerion D. Jett S., Bear D., Gray J.,

125. Alivisatos A., Lee L., Chen F. A nanoplasmonic molecular ruler for measuring nuclease activity andDNA footprint ingПNature Nanotechnology. 2006. V.l. P. 47-52.

126. Liu J., Feldman P. and Chung T. D. Real-time monitoring of in vitro transcription usingmolecular beacons 11 Anal. Biochem. 2002. V. 300. P. 40-45.

127. Lorenz M., Weihe A., Borner T. Cloning and sequencing of RAPD fragments amplifiedfrom mitochondrial DNA of male-sterile and male-fertile cytoplasm of sugar beet (Beta vulgaris L.) И Theoretical and Applied Genetics. 1997. V. 94(2). P. 273-278.

128. Lu Y.H., Negre S. Use of glycerol for enhanced efficiency and specificity of PCR amplification II Trends Genet. 1993. V. 9(9). P. 297.

129. Lyamichev V, Brow MA, Varvel VE, Dahlberg JE. Comparison of the 5' nuclease activities of Taq DNA polymerase and its isolated nuclease domain II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V.25.1.96(11). P.6143-6148.

130. Mann Т., Humbert R., Dorschner M., Stamatoyannopoulos J., Noble W.S. A thermodynamic approach to PCR primer design II Nucleic Acids Research. 2009. V. 37(13). e95.

131. Marienfeld J., Unseld M., Brennicke A. The mitochondrial genome of Arabidopsis is composed of both native and immigrant information II Trends in Plant Sci. 1999. V.4. P.495-502.

132. Marienfeld J.R., Newton K.J. The maize NCS2 abnormal growth mutant has a chimeric nad4-nad7 mitochondrial gene and is associated with reduced complex I function II Genetics. 1994. V. 138. P. 855-863.

133. Marras S., Gold В., Kramer F., Smith I., Tyagi S. Real-time measurement of in vitro transcription//Nucleic Acids Research. 2004. V.32(9). e72.

134. Martinez-Zapater J.M., Gil P., Capel J., Somerville C.R. Mutations at the Arabidopsis CHM locus promote rearrangements of the mitochondrial genome II Plant Cell. 1992. V.4. P. 889-899.

135. Menassa R., L'Homme Y., Brown G.G. Post- transcriptional and developmental regulation of a CMS- associated mitochondrial gene region by a nuclear restorer gene //Plant J. 1999.N 17. P. 491-499.

136. Mikami Т., Harada Т., Kinoshita T. Heterogeneity of circular mitochondrial DNA molecules from sugar beet with normal and male sterile cytoplasms 11 Curr. Genet. 1986. V. 10. P. 695- 706.

137. Moreira B.G., You Y., Behlke M.A., Owczarzy R. Effects of fluorescent dyes, quenchers, and dangling ends on DNA duplex stability II Biochemical and Biophysical Research Communications. 2005. V327(2). P. 473-484.

138. Nakazono M., Nishiwaki S., Tsutsumi N., Hirai A. A chloroplast-derived sequence is utilized as a source of promoter sequences for the gene for subunit 9 of NADH dehydrogenase (nad9) in rice mitochondria // Mol. Gen. Genet. 1996. V. 252. P. 371— 378.

139. Nazarenko I., Pires R., Lowe В., Obaidy M., Rashtchian A. Effect of primary and secondary structure of oligodeoxyribonucleotides on the fluorescent properties of conjugated dyes II Nucleic Acids Research. 2002. V.30(9). P. 2089-2195.

140. Newton K.J., Сое E.H. Jr. Mitochondrial DNA changes in abnormal growth (nonchromosomal stripe) mutants of maize IIPNAS. 1986. V. 83(19). P. 7363-7366.

141. Nishizawa S., Mikami Т., Kubo T. Mitochondrial DNA Phytogeny of Cultivated and Wild Beets: Relationships Among Cytoplasmic Male-Sterility-Inducing and Nonsterilizing Cytoplasms II Genetics. 2007. V.177. P. 1703-1712.

142. J. Agric. Res. 1942. V. 64. P. 679- 698. 122.Owen F.V. Mendelian male sterility in sugar beets II Inbid. 1952. V. 7. P. 371- 376.

143. Palmer J.D., Adams K.L., Cho Y., Parkinson C.L., Qiu Y.-L., Song K. Dynamic evolution of plant mitochondrial genomes: Mobile genes and introns and highly variable mutation rates II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V.97. P.6960-6966.

144. Park C., Kee Y., Park J., Myung H. A nonisotopic assay method for hepatitis С virus NS5Bpolymerase II J. Virol. Methods. 2002. V. 101. P. 211-214.

145. Perssona K., Hambya K., Ugozzoli L.A. Four-color multiplex reverse transcription polymerase chain reaction—Overcoming its limitations II Analytical Biochemistry. 2005. V. 344(1). P. 33-42.

146. Piggee C. Single-copy PCR in uniform nanoliter droplets II Anal. Chem. 2008. V. 80(11). P. 3946.

147. Pla M., Mathieu C., De Paepe R., Chetrit P., Vedel F. Deletion of the last two exons of the mitochondrial nad7 gene results in lack of the NAD7 polypeptide in a Nicotiana sylvestris CMS mutant II Mol. Gen. Genet. 1995. V. 22.1.248(1). P. 79-88.

148. Proudnikov D., Yuferov V., Zhou Y., LaForge K.S., Ho A., Kreek M.J. Optimizing primer-probe design for fluorescent PCR II Journal of Neuroscience Methods. 2003. V. 123(1). P. 31-45.

149. Ran Z., Michaelis G. Mapping of a chloroplast RLFP marker associated with the CMS cytoplasm of sugar beet (Beta vulgaris) II Theor. Appl. Genet. 1995. N 91. P. 836- 840.

150. Reynissona E., Josefsenb M.H., Krauseb M., Hoorfar J. Evaluation of probe chemistries and platforms to improve the detection limit of real-time PCR II Journal of Microbiological Methods. 2006. V. 66(2). P. 206-216.

151. Rhoads D.M., Subbaiah C.C. Mitochondrial retrograde regidation in plants II Mitochondrion. 2007. V.7. P. 177-194.

152. Richardson A.O. and Palmer J.D., Horizontal gene transfer in plants II Journal of Experimental Botany. 2007. V.58(l). P. 1-9.

153. Robertson J.M., Walsh-Weller J. An Introduction to PCR Primer Design and Optimization of Amplification Reactions И Methods in Molecular Biology, Forensic DNA Profiling Protocols. 2008. V. 98. P. 1064-3745(Print), P. 1940-6029(0nline).

154. Robinson M.M., Wolyn D.J. Complex organization of the mitochondrial genome of petaloid CMS carrot И Mol. Genet. Genomics. 2002. V.268. P. 232-239.

155. Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. И Plant Mol. Biol. 1985. V. 5. P. 69- 76.

156. Rybalkin I.N., Mukhamedova N.M., Vlasik T.N. Chenchik A.A. The new technology of hot start polymerase chain reaction II Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 1996. V. 121(2). P. 0007-4888 (Print) 1573-8221 (Online).

157. Sakamoto W., Kondo H., Murata M., Motoyoshi F. Altered mitochondrial gene expression in a maternal distorted leaf mutant of Arabidopsis induced by chloroplast mutator II Plant Cell. 1996. V.8. P. 1377-1390.

158. Sarria R., Lyznik A., Vallejos C.E., Mackenzie S.A. A cytoplasmic male sterility-associated mitochondrial peptide is post- translationally regulated II Plant Cell. 1998. N 10. P. 1217- 1228.

159. Satoh M., Kubo Т., Mikami T. The Owen mitochondrial genome in sugar beet (Beta vulgaris L.): possible mechanisms of extensive rearrangements and the origin of the mitotype-unique regions II Theor. Appl. Genet. 2006. V.l 13. P. 477—484.

160. Schardl C.L., Lonsdale D.M., Pring D.R., Rose K.R. Linearization of maize mitochondrial chromosomes by recombination with linear episomes II Nature. 1984. V.310. P. 292-296.

161. Schlageck J., Baughman M., and Yarbrough L. Spectroscopic techniques for study of phosphodiester bond formation by Escherichia coli RNA polymerase II Journal of Biological Chemistry. 1979. V.254 (23). P. 12074-12077.

162. Schlageck J., Baughman M., and Yarbrough L. Spectroscopic techniques for study of phosphodiester bond formation by Escherichia coli RNA polymerase II Journal of Biological Chemistry. 1979. V.254(23). P. 12074-12077.

163. Schnable P.S., Wise R.P. The molecular basis of cytoplasmic male sterility and fertility restoration II Trends in Plant Science. 1998. V. 3(5). P. 175-180.

164. Schuster W., Brennicke A. Conserved sequence elements at putative processing sites in plant mitochondria И Curr. Genet. 1989. V.15. P.187-192.

165. Senda M., Harada Т., Mikami Т., Sugiura M., Kinoshita T. Genomic organisation and sequence analysis of the cytochrome oxidase subunit II gene from normal and male-sterile mitochondria in sugar beet II Curr. Genet. 1991. V. 19. P. 175- 181.

166. Senda M., Mikami Т., Kinoshita T. The sugar beet mitochondrial gene for the ATPase alpha- subunit: sequence, transcription and rearrangements in cytoplasmic male-sterile plants И Curr. Genet. 1993. V. 24. P. 164- 170.

167. Shedge V., Arrieta-Montiel M., Christensen A.C., Mackenzie S.A., Plant mitochondrial recombination surveillance requires unusual RecA and MutS homologs II Plant Cell. 2007. V. 19. P. 1251-1264.

168. Small I.D., Isaac P.G., Leaver C.J. Stoichiometric diVerences in DNA molecules containing the atpA gene suggest mechanisms for the generation of mitochondrial genome diversity in maize IIEMBO J. 1987. V.6. P. 865-869.

169. Spencer D.F., Schnare M.N., Coulthart M.B., Gray M.W. Sequence and organization of a 7.2 kb region of wheat mitochondrial DNA containing the large subunit (26S) rRNA gene I I Plant Mol Biol. 1992. V. 20. P. 347-352.

170. Spiessa A.-N., Mueller N., Ivell R. Trehalose Is a Potent PCR Enhancer: Lowering of DNA Melting Temperature and Thermal Stabilization of Taq Polymerase by the Disaccharide Trehalose II Clinical Chemistry. 2004. V. 50. P. 1256-1259.

171. Spiro A., Lowe M. Quantitation of DNA Sequences in Environmental PCR Products by a Multiplexed, Bead-Based Method // Appl. Environ. Microbiol. 2002. Y. 68(2). P. 10101013.

172. Sullivan D., Fahey В., Titus D. Fast PCR: General considerations for minimizing run times and maximizing throughput II Bio-Rad Bulletin 5362 US/EG. 2006. Rev A.

173. Suslov O., Steindler D.A. PCR inhibition by reverse transcriptase leads to an overestimation of amplification efficiency // Nucleic Acids Research. 2005. V.33(20). el81.

174. Suzuki Т., Kawano S., Sakai A., Hirai A., Kuroiwa T. Variability of mitochondrial subgenomic molecules in the meristematic cells of higher plants II Genes Genet. Syst. 1996. V.71.P. 329-333.

175. Takahashi M., Ling C. Use of a fluorescent DNA analog for fluorometric detection of DNase activity И Anal. Biochem. 1991. V. 198(2). P. 246-249.

176. Taylor D.R., Olson M.S., McCauley D.E. A quantitative genetic analysis of nuclear-cytoplasmic male sterility in structured populations ofSilene vulgaris I I Genetics. 2001. Y.158. P. 833-841.

177. Tian X., Zheng J., Hu S., Yu J. The rice mitochondrial genomes and their variations II Plant Physiol. 2006. V. 140. P. 401-410.

178. Tolun G., Myers R.S. A real-time DNase assay (ReDA) based on PicoGreen fluorescence II Nucleic Acids Res. 2003. V. 31 (18). P. 111.

179. Tyagi S. and Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization И Nat. Biotechnol. 1996. V.14. P. 303-308.

180. Unseld M., Marienfeld J.R., Brandt P., Brennicke A. The mitochondrial genome of Arabidopsis thaliana contains 57 genes in 366,924 nucleotides II Nat. Genet. 1997. V.15. P.57-61.

181. Vassiliou W., Epp J.B., Wang B.B., Del Vecchio A.M., Widlanski Т., Kao C.C. Exploiting polymerase promiscuity: a simple colorimetric RNA polymerase assay И Virology. 2000. V.274. P. 429^137.

182. Wabuyele M.B., Soper S.A. PCR Amplification and Sequencing of Single Copy DNA Molecules И Single Molecules. 2001. V. 2(1). P. 13 21.

183. Ward B.L., Anderson R.S., Bendich A.J. The mitochondrial genome is large and variablein a family of plants (cucurbitaceae) 11 Cell. 1981. V. 25(3). P. 793-803.

184. Williams P.M. The Beginnings of Real-Time PCR И Clinical Chemistry. 2009. V. 55. P. 833-834.

185. Wolffs P., Grage H., Hagberg O., Radstrom P. Impact of DNA polymerases and theirbuffer systems on quantitative real-time PCR II J. Clin. Microbiol. 2004. V.42(l). P. 408-411.

186. Xue Y., Collin S., Davies D. R., Thomas С. M. Differential screening of mitochondrial cDNA libraries from male- sterile and male- fertile sugar beet reveals genome rearrangements at atpA and atp6 loci II Plant Mol. Biol. 1994. V. 25. P. 91-103.

187. Yamamoto M.P., Kubo .Т., Mikami T. The 5'-leader sequence of sugar beet mitochondrial atp6 encodes a novel polypeptide that is characteristic of Owen cytoplasmic male sterility II Mol. Gen. Genomics. 2005. V. 273. P. 342-349.

188. Yamato K.T., Newton K.J. Heteroplasmy and homoplasmy for maize mitochondrial mutants: a rare homoplasmic nad4 deletion mutant plant II J. Hered. 1999. V. 90. P. 369-373.

189. Yang L., Guo J., Pan A., Zhang H., Zhang K., Wang Z., Zhang D. Event-Specific Quantitative Detection of Nine Genetically Modified Maizes Using One Novel Standard Reference Molecule II J. Agric. Food Chem. 2007. V.55 (1). P. 15-24.

190. Yeung A.T., Holloway B.P., Adams P.S., Shipley G.L. Evaluation of dual-labeled fluorescent DNA probe purity versus performance in real-time PCR // Biotechniques. 2004. V.36(2). P. 266-270, 272, 274-275.

191. Zeugin J.A, Hartley J.L. Ethanol Precipitation ofDNA // Focus, 1985, V. 7(4). P. 1-2.

192. Каталог компании Синтол электронный ресурс. Режим доступа: http://www.ferments.boxmail.biz/cgi-bin/guide.pl?idrazdel=86596&action=article

193. Каталог компании Sigma, раздел Dual-Labeled DNA Probes электронный ресурс. Режим доступа: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/custom-oligos/dna-probes/product-lines/fluorescent-probes.html

194. Каталог компании Midland Certified, раздел Quality Control электронный ресурс. Режим доступа: http://www.oligos.com/qualityControl.htm

195. Каталог компании Eurogentec, раздел Oligonucleotide dynthesis and quality control электронный ресурс. Режим доступа: http://www.eurogentec.com/products/double-dye-probes.html

Информация о работе

Брагин, Антон Геннадьевич
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Стехиометрия минорных последовательностей и гетероплазмия митохондриального генома Beta vulgaris - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы