Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стабильность конформационных состояний апомиоглобина и его мутантных форм

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Стабильность конформационных состояний апомиоглобина и его мутантных форм"

На правах рукописи

БАЛОБАНОВ ВИТАЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

□034Э3320

СТАБИЛЬНОСТЬ КОНФОРМАЦИОННЫХ СОСТОЯНИЙ АПОМИОГЛОБИНА И ЕГО МУТАНТНЫХ ФОРМ

Специальность 03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

1 1 МАР 2010

Пущино - Москва 2010

003493320

Работа выполнена в Институте белка РАН и Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научные руководители: доктор физико-математических наук

Бычкова Валентина Егоровна

доктор биологических наук Долгих Дмитрий Александрович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Кутышенко Виктор Павлович

кандидат физико-математических наук Филимонов Владимир Васильевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт цитологии РАН

Защита диссертации состоится «2^» ЖА-рПк 2010 г. в 13.30 на заседании совета Д002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН г. Пущино по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан «20 »/^Л^бМЬ? 2010 г. Учёный секретарь совета .

кандидат физико-математических наук Н.Ф. Ланина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Согласно современным представлениям для большинства белков характерно сворачивание не по принципу «все-или-ничего», при котором накапливаются лишь нативное (Ы) и развёрнутое (и) состояния, а сворачивание через образование промежуточных (I) состояний, которые проявляются в тех или иных условиях. В присутствии высоких концентраций сильных денатурантов (таких, как гуанидингидрохлорид или мочевина) белки чаще всего представляют собой полностью развернутые (клубкообразные) полипептидные цепи. Более мягкие денатурирующие условия (низкие рН или высокие концентрации некоторых солей) приводят только к частично денатурированным конформационным состояниям белковой молекулы. Физико-химические свойства таких состояний являются промежуточными между свойствами нативных и полностью развернутых белков. Образование таких промежуточных состояний является важным этапом на пути сворачивания белков. Кроме того, с образования таких состояний может начинаться агрегация белка и/или образование им амилоидных структур. Можно сказать, что промежуточные состояния являются критическими в сети конформационных состояний белка, и поэтому их всестороннее изучение особенно важно.

Апомиоглобин кашалота является белком, для которого такое состояние наблюдается. Свойства этого белка достаточно хорошо изучены. На пути его сворачивания выделяют нативное, развёрнутое и стабильное промежуточное состояния. Накопление низкотемпературного промежуточного состояния апомиоглобина было показано при разворачивании белка мочевиной и понижением рН. Имеются также косвенные данные, что при температурной денатурации белка тоже накапливается некое промежуточное состояние. По данным литературы эти состояния обладают несколько различными свойствами. Однако до сих пор не решен вопрос: насколько сильны различия между формами промежуточного состояния, накапливающимися при различных способах денатурации, и являются ли эти формы вариантами одного и того же

термодинамического состояния или нет? Для ответа на этот вопрос необходимо определить область условий, где промежуточное состояние стабильно, и проследить изменение его свойств в переходе от одной формы к другой. Другими словами, необходимо построить диаграмму термодинамических состояний апомиоглобина и выяснить, является ли область промежуточного состояния непрерывной. Построение такой фазовой диаграммы целесообразно в координатах «рН - концентрация мочевины - температура», так как изменение этих условий по отдельности наиболее значимо и часто используется для исследования сворачивания белков. Для апомиоглобина такой диаграммы до настоящего времени построено не было.

В литературе опубликовано много работ, посвященных исследованию структуры промежуточного состояния апомиоглобина. Однако вопрос о том, насколько сильны взаимодействия, удерживающие это состояние до сих пор остаётся открытым. Для решения этого вопроса во второй части работы проведено исследование вклада ряда аминокислотных остатков в стабильность промежуточного и нативного состояний. Для этого, основываясь на равновесной денатурации мочевиной 12 мутантных форм апомиоглобина, были вычислены значения Ф-параметра для промежуточного состояния, характеризующего вклад боковых групп в стабильность этого состояния. Проведённый анализ показал относительную слабость взаимодействий боковых групп в промежуточном состоянии. Ранее такой анализ был проведён только для нестабильного переходного состояния на вершине энергетического барьера в переходе N-1, определяющего скорость сворачивания белка.

Переход белка в промежуточное состояние может вызывать и такой неклассический денатурирующий агент как фосфолипидная мембрана. Ранее в нашей лаборатории было показано, что свойства таких состояний сходны со свойствами промежуточного состояния, наблюдаемого при денатурации мочевиной или понижением рН. Кроме того, в литературе описана возможность инициации роста амилоидных структур на поверхности мембран. Поэтому исследование взаимодействия глобулярного немембранного белка с

фосфолипидной мембраной может помочь в понимании как процесса его сворачивания, так и процесса его амилоидной агрегации. В соответствии с этим исследование деталей процесса взаимодействия глобулярного водорастворимого белка с мембраной представляется достаточно интересным и необходимым.

Цели и задами исследования.

1) Построение и анализ фазовой диаграммы апомиоглобина в координатах рН - концентрация мочевины - температура; определение неразрывности фазовой области промежуточного состояния.

2) Определение вклада боковых цепей аминокислотных остатков в стабильность промежуточного состояния белка.

3) Выяснение механизмов воздействия мембраны на стабильность конформационных состояний апомиоглобина.

Научная новизна работы. Впервые получена трёхмерная фазовая диаграмма населённостей различных конформационных состояний апомиоглобина в координатах рН - концентрация мочевины - температура и показана неразрывность области промежуточного состояния. Проведён Ф-анализ для промежуточного состояния 12 мутантных форм апомиоглобина, обнаруживший относительную слабость взаимодействия боковых цепей в этом состоянии. Показано, что фосфолипидная мембрана стабилизирует промежуточное состояние апомиоглобина относительно нативного и развёрнутого и, вследствие этого, может выступать как умеренно денатурирующий агент для нативного состояния и как структурирующий для развёрнутого.

Научно - практическая значимость работы. Работа помогает лучше понять свойства промежуточного состояния апомиоглобина, условия его накопления и влияние этих условий на его стабильность. Оценка энергетических параметров процессов сворачивания и разворачивания белка в различных условиях позволяет выявить ключевые факторы, влияющие на эти процессы. Получение такой информации является важным для выявления

причин, приводящих к изменению структуры белка и к утрате им функциональной активности, а, в некоторых случаях, и к образованию амилоидных агрегатов. Это также должно учитываться при исследовании встраивания мембранных белков в мембрану.

Публикации. Основные результаты работы опубликованы в 17 печатных работах, в том числе 5 статьях.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: 18-я зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, Россия, 2006); Конференция "Современные проблемы молекулярной биофизики" (Санкт-Петербург, Россия, 2006); 2006 Biophysical society meeting (Salt Lake City, Utah, USA, 2006); International conference on "Protein biosynthesis, structure and function" (Pushchino, Russia, 2007); III Российский симпозиум "Белки и пептиды" (Пущино, Россия, 2007); 33rd FEBS Congress & 11th IUBMB Conference, (Athens, Greece, 2008); 2008 Biophysical Society Meeting (Long Beach, California, USA, 2008).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Исследование влияния температуры, мочевины и pH на стабильность нативного и промежуточного состояний. Построение и анализ диаграмм термодинамических состояний апомиоглобина.

В нашей работе мы используем модель сворачивания/разворачивания апомиоглобина, учитывающую наличие трёх термодинамических состояний и двух переходов между ними:

N (нативное) <-» I (промежуточное) <-+ U (развёрнутое)

Отсутствие накопления дополнительных промежуточных состояний подтверждается симбатностью изменений флуоресценции и кругового

дихроизма при денатурации апомиоглобина в условиях проведения наших экспериментов. Поэтому мы можем применять модель трёх состояний для совокупного анализа данных о денатурации апомиоглобина. Условиями середины перехода между состояниями считались условия равенства их свободных энергий и, соответственно равенство населённостей этих состояний.

Для построения диаграммы термодинамических состояний была проведена равновесная денатурация апомиоглобина такими денатурантами как мочевина, низкий рН и высокая температура. Изменения в структуре белка при изменении внешних условий наблюдались по изменению интенсивности триптофановой флуоресценции на длине волны 335 нм, а также по отношению интенсивностей флуоресценции на длинах волн 320 и 380 нм (ЬгсЛзво). На рисунке 1 приведены типичные кривые денатурации белка.

ч и 60

X

н

о 40

1Л

т

20

о 2.5

00

Л5 2.0

о 1.5

ГО

1.0

20°С, рН5.0

Д Д

д д д д „д д.

ДДдд д д

тДл

ДДДД Д д

рН5.0, ОМ Оеа

□□□оасР

0О

00

20°С, ОМ 1,'геа

та

-ЭСЮПг

иаашп

О 1 2 3 4 5 6 20 40 60 80 6 5 4 3 2

Концентрация Температура, °С РН

мочевины, 1\1

Рисунок 1. Типичные кривые денатурации апомиоглобина кашалота, полученные методом триптофановой флуоресценции при разворачивании белка мочевиной, температурой или понижением рН.

Равновесное разворачивание апомиоглобина мочевиной было проведено при различных значениях рН (4.2, 5.0 и 6.2) и температурах от 1°С до 50°С. Концентрация белка была максимально понижена, чтобы избежать возможной агрегации, и составляла 0.03 мг/мл. Равновесное изотермическое разворачивание понижением рН было проведено при температурах от 1°С до 45°С и концентрациях мочевины от 0.0 М до 4.0 М. Температурная денатурация белка проводилась при рН от 6.2 до 2.8 и концентрациях мочевины от 0.0 М до 4.5 М.

Для вычисления середин переходов между различными состояниями (нативпым, промежуточным и развернутым) все экспериментальные данные были аппроксимированы с использованием модели 3-х состояний и двух переходов между ними. В модели использовались следующие формы зависимостей разницы свободной энергии от условий: ДО=ДО°+т[игеа](при изменении концентрации мочевины), ДО=С1+С2*Т+С3*Т*1пТ (при изменении температуры), ДО=С1+С2*Т+С3*Т*1пТ+т*[игеа] (при совокупном действии температуры и мочевины), где Дв - разница свободной энергии между исследуемым состоянием и развёрнутой формой белка, Т - температура в Кельвинах, [игеа] - концентрация мочевины в молях, АО0 ,С| ,С2, С3 и ш искомые параметры. Значение ш при повышении температуры меняется незначительно, и может быть принято независящим от температуры.

Для уменьшения погрешности вычислений, а также в качестве внутреннего контроля, такие аппроксимации были проведены как в двух координатах (денатурирующий агент-интенсивность сигнала), так и в трёх координатах (денатурирующий агент 1-денатурирующий агент 2-интенсивность сигнала). В качестве денатурирующих агентов выступают температура, рН и мочевина. Совпадение результатов таких аппроксимаций, проведённых независимо друг от друга, говорит о достаточной точности и правильности расчётов. В результате аппроксимации были получены параметры, отражающие зависимости стабильности различных состояний от

условий. На основании полученных параметров были рассчитаны населённости состояний и построены двухмерные диаграммы в координатах концентрация мочевины-температура при значениях рН равных 6.2, 5.0 и 4.2 (рисунок 2), а также двухмерная фазовая диаграмма в координатах рН - температура (рисунок 3). На самом деле эти диаграммы являются трёхмерными так как третьим измерением служит населённость состояний, но для простоты представления на рисунках приведены только середины переходов.

Рисунок 2. Двухмерные фазовые диаграммы в координатах концентрация рН 4.2 рН 5.0 рН 6.2

мочевины-температура при значениях рН равных 4.2, 5.0 и 6.2, соответственно. Сплошная и пунктирная линии соответствуют рассчитанным серединам переходов N-1 и 1-и, соответственно.

а 4

а

О N-1

• 1-и

300 320 340 Т(К)

Рисунок 3. Двухмерная фазовая диаграмма в координатах рН - температура. Сплошная линия - середины переходов из нативного состояния в промежуточное, пунктирная - середины переходов из промежуточного в развёрнутое. Светлосерыми кружками показаны точки тепловой и холодовой денатурации, взятые из литературных данных.

На основании анализа всего объёма данных была построена трёхмерная диаграмма термодинамических

состояний апомиоглобина. В трёхмерной фазовой диаграмме в координатах рН-температура-концентрация мочевины (рисунок 4) можно выделить области, соответствующие накоплению нативного, промежуточного и развернутого состояний. Как и в случае с рисунками 2 и 3 стоит отметить, что в диаграмме есть ещё одно измерение, а именно, населённость каждого из состояний. Для простоты представления приведены лишь середины переходов.

Рисунок 4. Трёхмерная фазовая диаграмма. Светло-серая область соответствует нативному состоянию, тёмно-серая промежуточному, а белая -развёрнутому; черные сплошные линии соответствуют серединам фазовых переходов.

Анализ фазовых диаграмм показал, что промежуточные состояния белка, наблюдаемые при денатурации различными агентами, находятся в одной и той же области фазовой диаграммы и не разделены переходами с резким изменением спектральных свойств белка. Пример такого анализа для двухмерной фазовой диаграммы в координатах рН - температура приведён на рисунке 5. Показано, что при пересечении границ фазовых областей наблюдается резкое изменение спектральных свойств белка (рис. 5 б и в), однако при движении внутри области промежуточного состояния по линии его максимального накопления резких изменений не обнаружено (рис. 5 г), что свидетельствует о неразрывности области промежуточного состояния.

2.5

Чэ

CD о

OJ K>

<5. о

0

О о о О о

0.S

2.5

о

00

Л?

® 1.5

f>

эООо,

0.5

280 I 320

i т,к

—*--

360 280

320

т,к

360

о.

в

°осоо

6 5 4 3 2 pH

рН;Т

Рисунок 5. Анализ области промежуточного состояния на непрерывность. А) двухмерная фазовая диаграмма в координатах рН - температура; Б) и В) денатурационные кривые, тестируемые по отношению 1з2о/1з8о, полученные при тепловой денатурации белка или при его разворачивании понижением рН, соответственно; Г) зависимость отношения интенсивностей флуоресценции на длинах волн 320 и 380 нм от условий при движении внутри области промежуточного состояния. На рисунках Б) и В) квадратом и треугольником отмечены середины переходов N-1 и 1-и, соответственно.

Исследование влияния точечных мутаций на стабильность нативного и промежуточного состояний при равновесном разворачивании белка мочевиной.

Вторая часть этой работы посвящена изучению внутримолекулярных взаимодействий, которые стабилизируют нативное состояние, реализующееся на пути сворачивания апомиоглобина. Для этого были выбраны 12 гидрофобных аминокислотных остатков VIO, W14, L40, F46, М55, L61, L76,1111, L115, М131 и L135, образующих наибольшее количество контактов в нативной структуре. В каждой из выбранных позиций производилась точечная мутация - замена аминокислотного остатка на аланин. Алании был выбран из тех соображений, что он обладает наименьшей гидрофобной боковой группой и не разрушает структуру спиралей этого спирального белка.

Оценку стабильности нативного и промежуточного состояний апомиоглобина и его мутантных форм проводили, используя данные по их равновесному разворачиванию мочевиной с использованием методов КД в дальней УФ области и триптофановой флуоресценции.

На рисунке 6 показано изменение молярной эллиптичности на 222 нм для белка дикого типа и его мутантных форм в зависимости от концентрации мочевины при рН 6.2 и 1 ГС (А, Б). Из рисунка видно, что переход из нативного состояния в развернутое для белка дикого типа происходит в более узком интервале концентраций мочевины и при более высоком их значении, чем для мутантных белков. Сдвиг середины перехода в сторону меньших концентраций мочевины свидетельствует о дестабилизации нативной структуры всех мутантных белков по сравнению с белком дикого типа.

На рисунке 6 показаны также денатурационные кривые, полученные при разворачивании белков мочевиной, при рН 6.2 и П°С, тестируемые по изменению флуоресценции на длине волны 335 нм (В, Г). На данной длине волны, как было показано ранее в нашей лаборатории, наиболее четко выражены оба денатурационных перехода - из нативного в промежуточное и из промежуточного в развернутое состояние. Как видно из рисунка 6, зависимость 10

интенсивности флуоресценции от концентрации мочевины для всех белков проходит через максимум. Поскольку флуоресценция триптофана в промежуточном состоянии апомиоглобина сильнее чем в N и и состояниях, такое поведение указывает на его накопление. При этом для мутантных белков максимум на кривой разворачивания более выражен и смещен в сторону меньших концентраций мочевины по сравнению с белком дикого типа.

Рисунок 6. Зависимость эллиптичности на длине волны 222 нм (А, Б) и триптофановой флуоресценции на длине волны 335 нм (В, Г) от концентрации мочевины для апомиоглобина дикого типа и его мутантных форм при рН 6.2, 11°С.

Для того чтобы количественно оценить влияние введённых замен на структуру промежуточного состояния, для каждого мутантного белка был рассчитан параметр Ф для равновесного промежуточного состояния (Ф|).

' a^G

Данный параметр показывает долю взаимодействий, которую образует данный аминокислотный остаток в промежуточном состоянии от силы его взаимодействий в нативной структуре. Этот параметр равен 1, если аминокислотный остаток в промежуточном состоянии образует все нативные взаимодействия, и 0, если в промежуточном состоянии остаток не образует нативных взаимодействий. Полученные значения Ф| и разница свободных энергий в наблюдаемых переходах представлены в таблице 1.

Для расчёта термодинамических параметров, необходимых для вычисления Ф1 была проведена совместная аппроксимация данных КД и флуоресценции. Наличие симбатности изменений этих параметров как и в случае белка дикого типа позволило применить модель трёх состояний для анализа, а также уменьшить погрешность вычисления за счёт совместного применения независимых источников информации. Параметрами аппроксимации были базовые линии нативного, промежуточного и развёрнутого состояний, а также термодинамические параметры переходов между ними. Рассчитанные параметры были экстраполированы к единым условиям - pH 6.2 температура И°С в отсутствие мочевины.

Как следует из этих результатов, все мутации сильно влияют на стабильность нативного состояния, что проявляется в сдвиге середины перехода из нативного состояния в промежуточное для мутантных белков в сторону меньших концентраций мочевины по сравнению с белком дикого типа и в уменьшении разницы свободной энергии этого перехода. Дестабилизация промежуточного состояния для всех мутантных форм выражена заметно слабее.

Таблица 1. Рассчитанные термодинамические параметры апомиоглобина дикого типа и его мутантных форм.

4с ккал/моль аЧО ккал/моль № ккал/моль Ф.

\УТ 6.3±0.4 4.7±0.б 11.0±0.7

У10А 4.1 4.2 8.3 0.21±0.1

\V14A -1.2 3.5 2.3 0.14

1111А 4.2 4.2 8.4 0.20

Ы15А 2.8 2.9 5.7 0.33

Ы35А 3.2 3.8 7.0 0.23

М131А 3.1 4.0 7.1 0.18

128А 3.7 4.1 7.8 0.17

М55А 4.2 4.3 8.5 0.15

Ь61А 3.3 4.3 7.7 0.10

Ь40А 2.4 4.4 6.8 0.07

Г46А 5.0 5.4 10.4 -1.09

Ь76А 2.0 3.6 5.6 0.20

Параметры экстраполированы к условиям - рН 6.2, температура 11°С, ОМ мочевины. Погрешности определения соответствующих величин не превышают приведённых в первой строке. Подчёркнуты остатки, входящие в А, С и Н спирали.

Для всех исследованных замен параметр Ф[ мал и составляет в среднем 0.17. Для замен в спиралях А, в и Н параметр Ф] выше среднего, но его значение не превышает величины 0.3. Это говорит об относительной слабости взаимодействий боковых цепей в расплавленной глобуле этого белка. Однако измеренный вклад боковых цепей остатков А-, в- и Н-спиралей в стабильность промежуточного состояния выше, чем вклад изученных остатков других спиралей, что подтверждает важность А-, в- и Н- спиралей в стабилизации

промежуточного состояния. Расположение исследованных аминокислотных остатков в структуре миоглобина и их значения Ф( приведены на рис. 8.

1'исунок 8. Ход основной цепи миоглобина кашалота. Отмечены С" атомы исследованных остатков. Са атомы окрашены в соответствии с значениями их Фь шкала для которых приведена внизу рисунка. Подчёркнуты остатки, входящие в А, в и Н спирали.

Исследование влияния фосфолиииднои мембраны на стабильность апомноглобнна кашалота.

В живой клетке достаточно много мембранных поверхностей, и большое число исследований посвящено изучению их влияния на белки. Апомиоглобин является водорастворимым, а не мембранным белком, однако он способен взаимодействовать с поверхностью фосфолипидной мембраны. Изучению такого взаимодействия посвящена данная часть работы. Ранее в нашей лаборатории было показано, что апомиоглобин способен связываться с искусственными фосфолипидными везикулами и при этом претерпевать переход в некое промежуточное состояние, схожее по некоторым параметрам с промежуточным состоянием в растворе.

В качестве модели мембраны в настоящей работе были использованы малые бислойные везикулы, получаемые из отрицательно заряженного пальмитоилолеилфосфотидилглицерина (РОРО) или его смеси с нейтральным пальмитоилолеилфосфотидилхолином (РОРС), путём ультразвукового облучения. Концентрация фосфолипидов в эксперименте составляла 1 мг/мл, концентрация белка 0.2 мг/мл. Эксперименты проводили при рН 6.2, 1 ГС.

При проведении равновесного титрования мочевиной белка, связанного с везикулами, было обнаружено, что его спектральные свойства не меняются. Это говорит о высокой стабильности промежуточного состояния апомиоглобина, связанного с везикулами (см. рис. 9).

Кинетические и равновесные исследования взаимодействия апомиоглобина с везикулами только из РОРв показали, что апомиоглобин дикого типа взаимодействует с везикулами. Ранее было показано, что такое взаимодействие приводит к связыванию и переходу структуры белка в состояние, сходное с его состоянием расплавленной глобулы в растворе, то есть мембрана выступает как умеренный денатурирующий агент. Однако, если исследовать этот процесс в присутствии мочевины, оказывается, что изначально развёрнутый белок при связывании с везикулами структурируется, то есть мембрана в этих условиях действует как структурирующий агент (см. рис. 9 и

10). Скорость процесса взаимодействия в использованной системе велика, так, что он практически полностью протекает за мёртвое время измерения. В таких условиях невозможно исследовать кинетику процесса при помощи ручного смешения исходных растворов.

320 360 400 440 Длина волны, им

0 2 4 6

Концентрация мочевины, М

Рисунок 9. А) Изменение спектров Трп флуоресценции при добавлении апоМЬ к раствору везикул. Спектры нативной N. промежуточной I и развёрнутой мочевиной и форм апоМЬ приведены для сравнения. Б) Изменение Трп флуоресценции при разворачивании апоМЬ в отсутствие и в присутствии фосфолипидных везикул, тестируемое по отношению 1з2(Лз8о. Линии показывают значение ЬгоЛзво для различных состояний, их вид для каждого состояния соответствует виду лини спектра этого состояния на рисунке А.

А

уг

начальное значение 1Г -для состояния N

20 40

время, с

60

550 500 450 400

начальное значение Г, для состояния и

20 40

время, с

60

Рисунок. 10. Кинетика взаимодействия А) нативной формы апоМЬ \УТ с фосфолипидными везикулами, регистрируемая по изменению интенсивности Трп флуоресценции на 335 нм. Б) То же самое для развёрнутой в 6М мочевины формы апоМЬ \УТ. Интенсивность флуоресценции до нулевого значения времени отражает флуоресценцию раствора белка без везикул в нативном и развёрнутом состояниях соответственно.

Для выяснения деталей процесса взаимодействия апомиоглобина с везикулами скорость этого процесса была замедлена понижением удельного заряда мембраны. Была использована смесь фосфолипидов той же общей концентрации, содержащая лишь 20% РОРй (20% РОРв + 80% РОРС). Было использовано молярное соотношение фосфолипид:белок равное 400:1. Белок при таком соотношении занимает 7% поверхности везикул. Такой избыток поверхности снимает кинетические эффекты, которые могут быть вызваны конкуренцией между молекулами белка за места связывания на мембране.

В этой системе скорости взаимодействия понизилась на порядок. В этих условиях далее исследовалось взаимодействие с везикулами апомиоглобина дикого типа и его мутантных форм (см. рис. 11). Из проведённого анализа кинетических кривых следует, что взаимодействие с везикулами происходит как минимум в две стадии.

Рисунок И. Кинетика взаимодействия мутантных форм апоМЬ при содержании 20% отрицательно заряженных фосфолипидов в везикулах (20% POPG + 80% РОРС в смеси), тестируемая по изменению интенсивности Трп флуоресценции на 335 нм. А) дикий тип апоМЬ, М55А, F46A; Б) V10A, L70A; В) L40A, I111A. Кривая до момента смешения (0) соответствует значению интенсивности

флуоресценции в отсутствие везикул.

5

н о

п

О 20 40 60 80 100 120 140 время, с

Скорость первой стадии зависит от мутации и хорошо коррелирует с положением середины денатурационного перехода из нативного состояния в промежуточное при денатурации белков мочевиной (Ст). По всей видимости,

эта стадия соответствует взаимодействию свободного белка с везикулами и его денатурации под действием мембраны. Скорость второй стадии мало зависит от замены и, скорее всего, соответствует перестройкам в структуре белка, уже связанного с фосфолипидной мембраной и лишённого своей жёсткой структуры.

ал ш

ст,м

2.8

Рисунок 12. Зависимость логарифма констант скорости 1-й и 2-й стадий взаимодействия мутантных форм апоМЬ с фосфолипидными везикулами от положения середины перехода между состояниями N и 1 каждого мутанта при денатурации белков мочевиной. Погрешность измерений не превышает размеров

соответствующих значков.

Суммируя данные, полученные в ходе исследования взаимодействия апомиоглобина с фосфолипидными везикулами, можно сделать вывод, что поверхность фосфолипидной мембраны, сдвигая равновесие в сторону промежуточного состояния, может выступать и как денатурирующий агент, и как структурирующий. Показано также, что взаимодействие апомиоглобина с мембраной происходит как минимум в две стадии. При этом скорость первой стадии зависит от стабильности белка и удельного заряда мембраны.

выводы.

1. Впервые построена трехмерная диаграмма термодинамических состояний апомиоглобина в координатах «рН-температура-концентрация мочевины». Показано, что не наблюдается фазовых переходов между различными формами промежуточного состояния апомиоглобина, а, значит, все эти формы находятся в одном и том же фазовом состоянии.

2. Показано, что сила взаимодействия боковых групп аминокислотных остатков в исследованных позициях в промежуточном состоянии не превышает 30% от силы их взаимодействий в нативном состоянии. Однако измеренный вклад боковых цепей остатков А-, в- и Н-спиралей в стабильность промежуточного состояния выше, чем вклад других изученных остатков, что подтверждает важность комплекса этих спиралей в стабилизации промежуточного состояния.

3. Выяснено, что фосфолипидная мембрана стабилизирует промежуточное состояние апомиоглобина, то есть выступает как денатурирующий агент для его нативного состояния и как структурирующий для его развёрнутой формы. Скорость взаимодействия с мембраной зависит от заряда на её поверхности и от стабильности нативной формы белка.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

Статьи:

1. E.N. Samatova, N.S. Katina, V.A. Balobanov, B.S. Melnik, D.A. Dolgikh, V.E. Bychkova, A.V. Finkelstein. How strong are side chain interactions in the folding intermediate? Protein Sci. 0ct;18(10) 2009, p. 2152-2159.

2. E.H. Барышникова (Саматова), Б.С. Мельник, В.А. Балобанов, Н.С. Катина, А. В. Финкельштейн, Г.В. Семисотнов, В.Е. Бычкова. О роли некоторых консервативных и неконсервативных аминокислотных остатков в переходном состоянии и в интермедиате сворачивания апомиоглобина. Молекулярная биология, т.43,2009, С.136-147.

3. А.Е. Дюйсекина, Д.А. Долгих, Е.Н. Барышникова, Е.И. Тиктопуло, В.А. Балобанов В.Е. Бычкова Равновесное рН-зависимое разворачивание апомиоглобина: замены в консервативных позициях Trpl4, Metl31 и в неконсервативной позиции Vall7. Биохимия, т. 73,2008, с. 863-874.

4. Е.Н. Барышникова, В.А. Балобанов, Н.С. Катина, Б.С. Мельник, Д.А. Долгих, Г.В. Семисотнов, В.Е. Бычкова. Равновесное разворачивание мутантных форм апомиоглобина с заменами консервативных нефункциональных остатков на аланин. Молекулярная биология, т.41,2007,

с.674-680.

5. V.A. Balobanov, E.N. Samatova, N.S. Katina, V.E. Bychkova. 3D phase diagrams of apomyoglobin: construction and application to analysis of equilibrium thermodynamic properties. Protein Sci., in press.

Тезисы:

1. V.A. Balobanov, N.S. Katina, E.N. Samatova, V.E. Bychkova. 3D-phase diagram for apomyoglobin. 2008 Biophysical society meeting abstracts, Biophysical journal, Vol. 94, S, 2008, 2724-Pos

2. V.A. Balobanov, N.S. Katina, E.N. Samatova, V.E. Bychkova. Intermediates, which are observed during denaturation by different agents, are one and

the thermodynamic state. Abstracts. 33rd FEBS Congress & 11th 1UBMB Conference, Athens, Greece, 2008, p. 215.

3. V.A. Balobanov, N.S. Katina, N.B. llyina, I.A. Kashparov, E.N. Baryshnikova- Samatova, V.E. Bychkova. Phase diagrams of apomyoglobin in coordinates of pH, temperature and urea concentration. International conference on "Protein biosynthesis, structure and function", Programme and abstracts, Pushchino, Russia, 2007, p.57.

4. N.S. Katina, V.A. Balobanov, E.N. Samatova, B.S. Melnik, G.V. Semisotnov, V.E. Bychkova, A.V. Finkelstein. Heterogenity of the molten globule state of apomyoglobin. International conference on "Protein biosynthesis, structure and function", Programme and abstracts, Pushchino, Russia, 2007, p.81.

5. N.S. Katina, V.A. Balobanov, N.B. llyina, I.A. Kashparov, E.N. Samatova, V.E. Bychkova. pH-induced denaturation of mutant forms of apomyoglobin. International conference on "Protein biosynthesis, structure and function", Programme and abstracts, Pushchino, Russia, 2007, p.82.

6. B.A. Балобанов, H.C. Катина, E.H. Саматова (Барышникова), Н.Б. Ильина, И.А. Кашпаров, В.Е. Бычкова. Применение метода фазовых диаграмм для описания нативного, промежуточного и развернутого состояний апомиоглобина. Ill Российский симпозиум Белки и пептиды", Пущино, Россия. Тезисы стендовых сообщений, 2007, стр.35.

7. Н.С. Катина, В.А. Балобанов, Е.Н. Барышникова, Н.Б. Ильина, И.А. Кашпаров, А.В. Финкельштейн, В.Е. Бычкова. Роль боковых групп аминокислотных остатков в структуре промежуточного состояния апомиоглобина. III Российский симпозиум "Белки и пептиды" Тезисы докладов, Пущино, Россия, 2007, стр. 32.

8. V.A. Balobanov, N.S. Katina, E.N. Baryshnikova, V.E. Bychkova. Investigation on equilibrium unfolding of apomyoglobin variants with substituted conserved non-functional residues. 2006 Biophysical society meeting abstracts, Biophysical journal, supplement, Vol. 90, S, 2006, 912-Pos

9. В.А. Балобанов, Н.С. Катина, E.H. Барышникова, Н.Б. Ильина, И.А. Кашпаров, В.Е. Бычкова. Исследование влияния точечных мутаций в А-спирали апомиоглобина кашалота на стабильность его нативного и промежуточного состояний. 18-я зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" Тезисы докладов и стендовых сообщений, Москва, Россия, 2006, стр.30.

10. Н.С. Катина, В.А. Балобанов, E.H. Барышникова, Н.Б. Ильина, И.А. Кашпаров, В.Е. Бычкова. Исследование влияния аминокислотных замен в Н-спирали апомиоглобина кашалота на стабильность его нативного и промежуточного состояний. 18-я зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" Тезисы докладов и стендовых сообщений, Москва, Россия, 2006, стр.39.

11. В.А. Балобанов, Н.С. Катина, Б.С. Мельник, E.H. Барышникова, В.Е. Бычкова. Влияние pH и температуры на скорость сворачивания и разворачивания апомиоглобина. Конференция "Современные проблемы молекулярной биофизики" Сборник тезисов, Санкт-Петербург, Россия, 2006, стр. 17.

12. Н.С. Катина, В.А. Балобанов, E.H. Барышникова, В.Е. Бычкова. Влияние замены гидрофобных аминокислотных остатков на стабильность нативного и промежуточного состояний апомиоглобина. Конференция "Современные проблемы молекулярной биофизики" Сборник тезисов, Санкт-Петербург, Россия, 2006, стр. 18.

Заказ № 107-1/02/10 Подписано в печать 19.02.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 ('ч^)) www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Балобанов, Виталий Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Модели и подходы, используемые при изучении процесса сворачивания белков.

Сворачивание белков в растворе.

Конформационные переходы белка вблизи поверхности мембраны.

1.2 Конформационные состояния белков.

Нативное состояние.

Развёрнутое состояние.

Переходное состояние.

Промежуточные состояния.

1.3 Характеристика объекта исследования.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Методы, применяемые в работе.

Биохимические методы.

Экспрессия генов.

Выделение и очистка белков.

Физические методы исследования.

Абсорбционная спектроскопия.

Флуоресцентная спектроскопия.

Круговой дихроизм (КД).

2.2 Материалы, применяемые в работе.

2.3 Приборы, параметры и условия измерений.

2.4 Экспериментальные процедуры.

Равновесное разворачивание апомиоглобина и его мутантных форм мочевиной.

Равновесное разворачивание апомиоглобина понижением рН.

Равновесная тепловая денатурация апомиоглобина.

Равновесное исследование взаимодействия апомиоглобина с фосфолипидными везикулами.

Кинетическое исследование взаимодействия апомиоглобина с фосфолипидными везикулами.

2. 5 Расчет термодинамических параметров.

Расчет термодинамических параметров из равновесного эксперимента.

Зависимость стабильности белка от температуры и концентрации денатуранта.

Расчёт параметра Ф для промежуточного состояния.

Вычисление видимых констант скоростей процесса взаимодействия апомиоглобина и его мутантных форм с фосфолипидными везикулами.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Экспрессия генов мутантных форм апомиоглобина.

Выделение и очистка белков.

3.2 Построение и анализ диаграмм термодинамических состояний апомиоглобина.

3.3 Исследование влияния точечных мутаций на стабильность нативного и промежуточного состояний при равновесном разворачивании мочевиной.

3.4 Исследование влияния фосфолипидной мембраны на стабильность апомиоглобина кашалота.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Стабильность конформационных состояний апомиоглобина и его мутантных форм"

Согласно современным представлениям для большинства белков характерно сворачивание не по принципу «все-или-ничего», при котором накапливаются лишь нативное (N) и развёрнутое (U) состояния, а сворачивание через образование промежуточных (I) состояний, которые проявляются в тех или иных условиях. В присутствии высоких концентраций сильных денатурантов (таких, как гуанидингидрохлорид или мочевина) белки чаще всего представляют собой практически полностью развернутые (клубкообразные) полипептидные цепи. Более мягкие денатурирующие условия (низкие рН или высокие концентрации некоторых солей) приводят только к частично денатурированным конформационным состояниям белковой молекулы [Ptitsyn, 1995; Bychkova and Ptitsyn 1993]. Физико-химические свойства таких состояний являются промежуточными между свойствами нативных и полностью развернутых белков. Образование таких промежуточных состояний является важным этапом на пути сворачивания белков. Кроме того, с образования таких состояний может начинаться агрегация белка и/или образование им амилоидных структур [Booth et al., 1997; Sharma et al 2010 ]. Можно сказать, что промежуточные состояния являются критическими в сети конформационных состояний белка, и поэтому их всестороннее изучение особенно важно.

Апомиоглобин кашалота является белком, для которого такое состояние наблюдается [Eliezer et al., 1998; Barrick and Baldwin, 1993]. Свойства этого белка достаточно хорошо изучены [Harrison and Blout, 1965; Griko and Privalov, 1994; Eliezer and Wright, 1996; Garcia et al., 2000; Cavagnero et al., 2001; Bertagna and Barrick, 2004]. На пути его сворачивания выделяют нативное, развёрнутое и стабильное промежуточное состояния. Накопление низкотемпературного промежуточного состояния апомиоглобина было показано при разворачивании белка мочевиной или понижением рН. Имеются также косвенные данные, что при температурной денатурации белка тоже накапливается некое промежуточное состояние [Griko et al., 1988; Griko and Privalov, 1994]. По данным литературы эти состояния обладают несколько различными свойствами. Однако до сих пор не решен вопрос: насколько сильны различия между формами промежуточного состояния, накапливающимися при различных способах денатурации, и являются ли эти формы вариантами одного и того же термодинамического состояния или нет? Для ответа на этот вопрос необходимо определить область условий, где промежуточное состояние стабильно, и проследить изменение его свойств в переходе от одной формы к другой. Другими словами, необходимо построить диаграмму термодинамических состояний апомиоглобина и выяснить, является ли область промежуточного состояния непрерывной. Построение такой фазовой диаграммы целесообразно в координатах «рН - концентрация мочевины -температура», так как изменение этих условий по отдельности наиболее значимо и часто используется для исследования сворачивания белков. Для апомиоглобина такой диаграммы до настоящего времени построено не было.

В литературе опубликовано много работ [Hughson et al., 1991; Barrick and Baldwin, 1993; Jennings and Wright, 1993; Eliezer et al., 1998; Jamin and Baldwin, 1998], посвященных исследованию структуры промежуточного состояния апомиоглобина. Однако вопрос о том, насколько сильны взаимодействия, удерживающие это состояние, до сих пор остаётся открытым. Для решения этого вопроса во второй части работы проведено исследование вклада ряда аминокислотных остатков в стабильность промежуточного и нативного состояний. Для этого, основываясь на равновесной денатурации мочевиной 12-ти мутантных форм апомиоглобина, были вычислены значения Ф-параметра для промежуточного состояния, характеризующего вклад боковых групп в стабильность этого состояния. Проведённый анализ показал относительную слабость взаимодействий боковых групп в промежуточном состоянии. Ранее такой анализ был проведён только для нестабильного переходного состояния на вершине энергетического барьера в переходе N-I, определяющего скорость сворачивания белка [Baryshnikova et al., 2005; Барышникова, 2005].

Переход белка в промежуточное состояние может вызывать и такой неклассический денатурирующий агент как фосфолипидная мембрана. Ранее в нашей лаборатории было показано [Басова и др., 2004], что свойства таких состояний сходны со свойствами промежуточного состояния, наблюдаемого при денатурации мочевиной или понижением рН. Кроме того, в литературе описана возможность инициации роста амилоидных структур на поверхности мембран []. Поэтому исследование взаимодействия глобулярного немембранного белка с фосфолипидной мембраной может помочь в понимании как процесса его сворачивания, так и процесса его амилоидной агрегации. Изучение влияния мембран на белки важно и с точки зрения медицины как важный компонент пищеварения и доставки лекарств в клетки [Уголев, 1967; Strollet al., 2000; Lennernas, 2007; Wawrezinieck et al., 2008]. В соответствии с этим исследование деталей процесса взаимодействия глобулярного водорастворимого белка с мембраной представляется достаточно интересным и необходимым. Согласно результатам, полученным нами в ходе этой работы, фосфолипидная мембрана стабилизирует промежуточное состояние белка, то есть может выступать как денатурирующий агент для его нативного состояния и как структурирующий для его развёрнутой формы. Взаимодействие апомиоглобина с мембраной происходит как минимум в две стадии, и скорость первой из них падает с увеличением стабильности нативной формы белка.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Балобанов, Виталий Александрович

выводы.

1. Впервые построена трехмерная фазовая диаграмма апомиоглобина в координатах «рН — температура - концентрация мочевины». Показано, что не наблюдается фазовых переходов между различными формами промежуточного состояния апомиоглобина и, следовательно, все эти формы принадлежат одному и тому же фазовому состоянию.

2. Показано, что взаимодействия боковых групп аминокислотных остатков в исследованных позициях в промежуточном состоянии не превышают 30% от взаимодействий в нативном состоянии. Однако измеренный вклад боковых цепей остатков А-, G- и Н-спиралей в стабильность промежуточного состояния выше, чем изученных остатков других спиралей, что подтверждает важность А-, G- и Н- спиралей в стабилизации промежуточного состояния.

3. Выяснено, что фосфолипидная мембрана стабилизирует промежуточное состояние белка, то есть выступает как денатурирующий агент для его нативного состояния и как структурирующий для его развёрнутой формы. Скорость взаимодействия с мембраной падает с ростом стабильности нативной формы белка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Балобанов, Виталий Александрович, Пущино - Москва

1. S Baryshnikova E.N., Melnik B.S., Finkelstein A.V., Semisotnov G.V., and Bychkova V.E. (2005) Three-state protein folding: experimental determination of free-energy profile. // Protein Sci., Vol. 14, P. 2658-2667

2. S Basova L.V., Tiktopulo E.I., Kutyshenko V.P., A. Grant Mauk A.G., Bychkova V.E. (2008) Phospholipid membranes affect tertiary structure of the soluble cytochrome b5 heme binding domain. // Biochim. Biophys. Acta., Vol. 1778, P. 1015-1026

3. S Baum J., Dobson C.M., Evans P.A., Hanly C. (1989) Characterization of a partly folded protein by NMR methods: studies on the molten globule state of guinea pig a lactalbumin. // Biochemistry, Vol. 28, P. 7 - 13

4. S Bowen M., Brunger A.T. (2006) Conformation of the synaptobrevin transmembrane domain. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 103, P. 83788383

5. S Bryson E.A, Rankin S.E., Carey M., Watts A., Pinheiro T.J.T. (1999) Folding of apocytochrome с in lipid micelles: formation of alpha-helix precedes membrane insertion. // Biochemistry, Vol. 38, P. 9758-9767

6. S Cavagnero S., Dyson H.J., and Wright P.E. (1999) Effect of H helix destabilizing mutations on the kinetic and equilibrium folding of apomyoglobin. // J. Mol. Biol., Vol. 285, P. 269-282

7. S Cocco M.J., and Lecomte J.T. (1996) The native state of apomyoglobin described by proton NMR spectroscopy: the A-B-G-H interface of wild-type sperm whale apomyoglobin. // Proteins, Vol. 25(3), P. 267-285

8. S Davidson W.S., Jonas A., Clayton D.F., George J.M. (1998) Stabilization of alpha-synuclein secondary structure upon binding to synthetic membranes. // J. Biol. Chem., Vol. 273, P. 9443-9449.

9. S Day P.J., Pinheiro T.J.T., Roberts L.M., Lord J.M. (2002) Binding of ricin A-chain to negatively charged phospholipids vesicles leads to protein structural changes and destabilizes the lipid bilayer. // Biochemistry, Vol. 41, P. 28362843

10. S De Jongh H.H.J., Killian J.A., de Kruijff B. 1992. A water-lipid interface induces a highly dynamic folded state in apo-cytochrome с and cytochrome c, which may represent a common folding intermediate. // Biochemistry, Vol. 31, P. 1636-1643

11. S Dill K.A. and Chan H.S. (1997) From Levinthal to pathways to funnels. // Nature Struct. Biol., Vol. 4, P. 10-19

12. Dobson C.M. and Karplus M. (1999) The fundamentals of protein folding: bringing together theory and experiment. // Curr. Opin. Struct. Biol., Vol. 9, P. 92-101

13. S Dolgikh D.A., Gilmanshin R.I., Brazhnikov E.V., Bychkova V.E., Semisotnov G.V., Venyaminov S.Yu. and Ptitsyn O.B. (1981) a-lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure? // FEBS Lett., Vol. 136, P. 311 -315

14. S Dolgikh D.A., Kolomiets A.P., Bolotina I.A. and Ptitsyn O.B. (1984) "Molten-globule" state accumulates in carbonic anhydrase folding. // FEBS Lett, Vol. 165, P. 88-92

15. S Dyson HJ. and Wright P.E. (2005) Intrinsically unstructured proteins and their functions // Nature reviews, Vol. 6, P. 197-208

16. Eftink MR (1994) The use fluorescence methods to monitor unfolding transitions in proteins. // Biophys J., Vol. 66, P. 482-501

17. Eisenberg M., Gesalfi Т., Riccio Т., McLaughlin S. (1979) Absorption of monovalent cations to bilayer membranes containing negative phospholipids Biochemistry, Vol. 18, P. 5213-5223

18. Eliezer D, Yao J, Dyson H.J., Wright P.E. (1998) Structural and dynamic characterization of partially folded states of myoglobin and implications for protein folding. //Nature Struct. Biol., Vol. 5 P. 148-155

19. S Eliezer D. and Wright P.E. (1996) Is apomyoglobin a molten globule? Structural characterization by NMR. // J. Mol. Biol., Vol. 263, P. 531 538

20. S Endo Т., Eilers M., Schatz G. (1989). Binding of a tightly folded artificial mitochondrial precursor protein to the mitochondrial outer-membraneinvolves a lipid-mediated conformational change. // J. Biol. Chem., Vol. 264, P.2951-2956

21. S Fersht A.R. (1995) Optimization of rates of protein folding: the nucleation-condensation mechanism and its implications. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, P. 10869-10873

22. Fersht A.R. (1997) Nucleation mechanisms in protein folding. // Curr. Opin. Struct. Biol., Vol. 7, P. 3-9

23. S Fersht A.R. and Daggett V. (2002) Protein folding and unfolding at atomic resolution. // Cell, Vol. 108, P. 573-582

24. S Fersht A.R., Matouschek A., and Serrano L. (1992) The folding of an enzyme. I. Theory of protein engineering analysis of stability and pathway of protein folding. // J. Mol. Biol., Vol. 224, P. 771-782

25. S Garcia C., Nishimura C., Cavagnero S., Dyson H.J. and Wright P.E. (2000) Changes in the apomyoglobin pathway caused by mutation in the distal histidine residue. // Biochemistry, Vol. 39, P. 11227-11237

26. S Goto Y, Fink AL (1990) Phase diagram for acidic conformational states of apomyoglobin. J. Mol. Biol., Vol. 20, P. 803-805

27. S Grantcharova V.P., Riddle D.S., Santiago J.V., Baker D. (1998) Important role of hydrogen bonds in the structurally polarized transition state for folding of the src SH3 domain. //Nature Struct. Biol., Vol. 5, P. 714-720

28. Griko Y.V. and Privalov P.L. (1994) Thermodynamic puzzle of apomyoglobin unfolding. // J. Mol. Biol., Vol. 235, P. 1318 1325

29. S Griko Y.V., Privalov P.L., Veniaminov V.P. and Kutyshenko V.P. (1988) Thermodynamic study of the apomyoglobin structure. // J. Mol. Biol., Vol. 202, P. 127-138

30. Harrison S.C., Blout E.R. (1965) Reversible conformational changes of myoglobin and apomyoglobin. // J. Biol. Chem., Vol. 240, P. 299-303

31. S Jackson S.E., Fersht A.R. (1991) Folding of chymotrypsin inhibitor 2. Evidence for a two-state transition. // Biochemistry, Vol. 30, P. 10428 -10435

32. S Jaenicke L.A (1974) Rapid micromethod for the determination of nitrogen and phosphate in biological material. // Anal. Biochem., Vol. 61, P. 623-627

33. S Jamin, M. and Baldwin, R.L. (1998) Two forms of the pH 4 folding intermediate of apomyoglobin. // J. Mol. Biol., Vol. 292, P. 731-740

34. S Jennings P.A. and Wright P.E. (1993) Formation of a molten globule intermediate early in the kinetic folding pathway of apomyoglobin. // Science., Vol. 262, P. 292

35. S Jennings P. A., Stone M.J., Wright P.E. (1995) Overexpression of myoglobin and assignment of the amid, Ca and CP resonances.// J. Biomol. NMR, Vol. 6, P. 271-276

36. S Kamagata K., Kuwajima K. (2006) Surprisingly high correlation between early and late stages in non-two-state protein folding. // J. Mol. Biol., Vol. 357(5), P. 1647-1654

37. S Kamatari Y.O., Ohji S., Konno Т., Seki Y., Soda K., Kataoka M., Akasaka K. (1999) The compact and expanded denatured conformations of apomyoglobin in the methanol-water solvent. // Protein Sci., Vol. 8, P. 873882

38. S Kay M.S. and Baldwin R.L. (1996) Packing interactions in apomyoglobin folding intermediate. //Nature Struct. Biol., Vol. 3, P. 439-445

39. S Kolb V.A. Makeev E.V. and Spirin A.S. (1994) Enzymatic activity of the ribosome-bound nascent polypeptide. // EMBO J., Vol. 13, P. 3631-3637

40. Lennernas H. (2007) Modelling gastrointestinal drug absorption requires more in vivo biopharmaceutical data: experience from in vivo dissolution and permeability studies in humans. // Curr. Drug Metab., Vol. 8, P. 645-657

41. S Martinez J.C., Serrano L. (1999) The folding transition state between SH3 domains is conformationally restricted and evolutionarily conserved. // Nature Struct. Biol., Vol. 6, P. 1010-1016

42. S Massey S., Banerjee Т., Pande A.H., Taylor M., Tatulian S.A., Teter K. (2009) Stabilization of the tertiary structure of the Cholera toxin Al subunit inhibits toxin dislocation and cellular intoxication. // J. Mol. Biol., Vol. 393, P. 1083-1096

43. S Matouschek A., Kellis J.T., Jr., Serrano L., and Fersht A.R. (1989) Mapping the transition state and pathway of protein folding by protein engineering. // Nature, Vol. 340, P. 122-126

44. S Merrill A.R., Cohen F.S., Cramer W.A. (1990) On the nature of the structural change of the colicin-El channel peptide necessary for its translocation competent state. // Biochemistry, Vol. 29, P. 5829-5836

45. S Nishimura C., Dyson H.J., and Wright P.E. (2002) The apomyoglobin folding pathway revisited: structural heterogeneity in the kinetic burst phase intermediate. // J. Mol. Biol., Vol. 322, P. 483-489

46. S Oxender D.L., Fox C.F. (1987) Protein engineering (Tutorials in molecular and cell biology). // Alan R. Liss, inc., New York

47. S Pace C.N. (1986) Determination and analysis of urea and guanidine hydrochloride denaturation curves. // Methods Enzymol., Vol. 131, P. 266280

48. S Parker M.J. and Marqusee S. (1999) The cooperativity of burst phase reactions explored. // J. Mol. Biol., Vol. 293, P. 1195-1210

49. S Parker M.W., Tucker A.D., Tsernoglou D., Pattus F. (1990) Insights into membrane insertion based on studies of colicins. // Trends Biochem. Sci., Vol. 15, P. 126-129

50. S Patel J., Behrens-Kneip S., Hoist O., Kleinschmidt J.H. (2009) The periplasmic chaperone Skp facilitates targeting, insertion, and folding of OmpA into lipid membranes with negative membrane surface potential. // Biochemistry, Vol. 48, P. 10235-10245

51. S Ptitsyn O.B. (1995) Molten globule and protein folding. // Adv. Protein Chem., Vol. 47, P. 83-229

52. Rankin S.E., Watts A., Roder H., Pinheiro T.J.T. (1999) Folding of apocytochrome С induced by interaction with negatively charged lipid micelles proceeds via collapsed intermediate state. // Protein Sci., Vol. 8, P. 381-393

53. S Roder H., and Colon W. (1997) Kinetic role of early intermediate in protein folding // Curr. Opin. Struct. Biol., Vol. 7, P. 15 28

54. S Samatova E.N., Katina N.S., Balobanov V.A., Melnik B.S., Dolgikh D.A., Bychkova V.E., Finkelstein A.V. (2009) How strong are side chain interactions in the folding intermediate? // Protein Sci., Vol. 18(10), P. 21522159

55. S Sanger F, Tuppy H. (1951) The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin. I. The identification of lower peptides from partial hydrolysates. // Biochem. J., Vol. 49(4), P. 463-481

56. S Santoro M.M. and Bolen D.W. (1998) Unfolding free energy changes determined by the linear extrapolation method. // Biochemistry, Vol. 27, P. 8063-8068

57. S Sosnick T.R., Shtilerman M.D., Mayne L., Englander S.W. (1997) Ultrafast signals in protein folding and the polypeptide contracted state. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, P. 8545-8550

58. S Steensma E. and van Mierlo C.P.M. (1998) Structural characterization of apoflavodoxin shows that the location of the stable nucleus differs among proteins with a flavodoxin-like topology. // J. Mol. Biol., Vol. 282, P. 653666

59. S Stroll B.R., Leipold H.R., Milstein S., Edwards D.A. (2000) A mechanistic analysis of carrier-mediated oral delivery of protein therapeutics. // J. Control. Release., Vol. 64, P. 217-228.

60. У Tanford C. (1968) Protein denaturation. // Adv. Protein Chem., Vol. 23, P. 121

61. S Ternstrom Т., Mayor U., Akke M. and Oliveberg M. (1999) From snapshot to movie: ф analysis of protein folding transition states taken one step further. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, P. 14854-14859

62. S Tsong T.Y., Baldwin R.L. and McPhie P. (1972) A sequential model of nucleation dependent protein folding kinetic studies of ribonuclease A. // J. Mol. Biol., Vol. 63, P. 453-469

63. S Tsui V., Garcia C., Cavagnero S., Siuzdak G., Dyson H. J., and Wright P. E. (1999) Quench-flow experiments combined with mass spectrometry show apomyoglobin folds through an obligatory intermediate. // Protein Sci., Vol. 8, P. 45-49

64. S Uversky V.N., Ptitsyn O.B. (1996) Further evidence on the equilibrium "pre-molten-globule state": four-state guanidinium chloride induced unfolding of carbonic anhydrase В at low temperature. // J. Mol. Biol., Vol. 255, P. 215-228

65. S van der Goot F.G., Gonzales-Manas J.M., Lakey J.H., Pattus F. (1991) A molten-globule membrane-insertion intermediate of the pore-forming domain of colicin-A. //Nature, Vol. 354, P. 408^110

66. S van der Goot F.G., Lakey J.H., Pattus F. (1992) The molten globule intermediate for protein insertion or translocation through membranes. // Trends Cell Biol., Vol. 2, P. 343-348

67. S Vecsey-Semjen В., Moellby R., Van der Goot F.G. (1996) Partial C-terminal unfolding is required for channel formation by Staphylococcal a-toxin. // J. Biol. Chem., Vol. 271, P. 8655-8660

68. S Viguera A.R., Serrano L. and Wilmanns M. (1996) Different folding transition states may result in the same native structure. // Nature Struct. Biol., Vol. 3, P. 874-880

69. S Villegas V., Martinez J.C., Aviles F.X., and Serrano L. (1998) Structure of the transition state in the folding process of human procarboxypeptidase A2activation domain. // J. Mol. Biol., Vol. 83, P. 1027-1036i

70. У Wawrezinieck A., Pean J.M., Wuethrich P., Benoit J.P. (2008) Oral bioavailability and drug/carrier particulate systems. // Med. Sci. (Paris), Vol. 24, P. 659-664

71. У Yao J., Chung J., Eliezer D., Wright P.E., Dyson H.J. (2001) NMR structural and dynamic characterization of the acid-unfolded state of apomyoglobin provides insights into the early events in protein folding. // Biochemistry, Vol. 27, P. 3561-3571

72. S Zhao J.M., London E. (1988) Conformation and model membrane interactions of Diphtheria toxin fragment A. // J. Biol. Chem., Vol. 263, P. 15369-15377

73. S Барышникова Е.Н. (2005) Исследование ядра сворачивания апомиоглобина. диссертация на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук // Пущино ИБ РАН

74. S Птицын О.Б. (1973) Стадийный механизм самоорганизации белковых молекул. // Докл. Акад. Наук СССР, Т. 210, С. 1213 1215

75. S Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. (2002) Физика белка: курс лекций. // М.: Книжный дом «Университет»469.477