Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование ядра сворачивания апомиоглобина

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование ядра сворачивания апомиоглобина"

на правах рукописи

БАРЫШНИКОВА ЕКАТЕРИНА НИКОЛАЕВНА ИССЛЕДОВАНИЕ ЯДРА СВОРАЧИВАНИЯ АПОМИОГЛОБИНА

03.00.02. - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ПУЩИНО - 2005

Работ выполнена в Института бетка РАН

Научные руководители:

доктор физико-математических наук Бычкова Валентина Егоровна

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Пермяков Евгений Анатольевич доктор физико-математических наук Потехин Сергей Александрович

Ведущая органшация

Институт ни гологии РАН

Защита состоится Т-Ъ^Ъб^ в 13 час 30 мин на заседании диссертационного

совета Д002 093 01 в Институ ге 1еоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу 142290. г Пущино Московской области. Инсгиптская ут . 3

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Путинского НЦБИ РАН

Автореферат разослан « /-Г" » Ябкр 2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат физико-математических наук ^ Н Ф Ланина

шг

и^ис- ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Выяснение механизма спонтанного

сворачивания белков является одной из важнейших задач биофизики. Известно,

что многие болезни связаны с агрегацией или неправильным сворачиванием

белка. Оба этих процесса могут быть следствием не только завязывания

боковыми группами белка ненативных контактов в результате мутаций, но и

изменения скорости сворачивания белка. Путь сворачивания белков проходит

через формирование нестабильных переходных состояний и, в большинстве

случаев, также через формирование метастабильных промежуточных

состояний. В связи с этим, для понимания механизма сворачивания белков

необходимо исследование структурных и энергетических характеристик как

промежуточных, так и переходных состояний. Такого рода исследования

осложняются тем, что формирование ранних промежуточных состояний

происходит в миллисекундном временном интервале, и, зачастую, скорости их

формирования не могут быть измерены экспериментально, хотя их присутствие

влияет на видимую скорость формирования нативного состояния белка. Для

исследования структуры нестабильных переходных состояний необходимо

знание скоростей всех этапов сворачивания и разворачивания белка в широком

диапазоне концентраций денатуранта. Только в этом случае возможно оценить

вклад отдельных остатков в процесс сворачивания белка, в частности, в

формирование ядра сворачивания белка, т.е. структуры белка в переходном

состоянии, обеспечивающей последующее быстрое и правильное сворачивание

белка в нативную структуру. В результате интенсивных исследований

небольших белков, сворачивание и разворачивание которых происходит по

одностадийному механизму (т.е. без накопления промежуточных состояний),

разработан подход (Ф-анализ Фёршта) для исследования структуры и

термодинамики переходного состояния, формирующегося на барьере,

разделяющем нативное и развернутое состояние, путем введения точечных

мутаций и выявления аминокислотных остятк-ов, замена которых сильно

РОС. НАЦИОНАЛЫ)

меняет скорость сворачивания белка. Одна! о структурных и

термодинамических характеристик переходных и промежуточных состояний в более крупных белках, сворачивание которых происходит по многостадийному механизму, этот подход нуждается в дальнейшем усовершенствовании.

Данная работа посвящена разработке подхода, с помощью которого было бы возможно определять скорости отдельных переходов в белках с тремя состояниями (т.е. сворачивание которых проходит по двухстадийному механизму, с накоплением одного промежуточного состояния), а также изучению, с помощью этого подхода, ядра сворачивания апомиоглобина. Исследование структуры ядра сворачивания апомиоглобина проводили путем введения точечных замен аминокислотных (а/к) остатков и изучения влияния данных замен на стабильность промежуточного и нативного состояний белка и на скорость его сворачивания и разворачивания.

Цель и задачи исследования. 1. Разработать подход для анализа кинетических данных по сворачиванию/разворачиванию белков, имеющих три состояния: нативное (И), промежуточное (I) и развернутое (Ц) (на примере апомиоглобина).

2. Исследовать влияние а/к остатков, теоретически предсказанных как входящих в ядро сворачивания, на стабильность промежуточного и нативного состояний, а также на скорость сворачивания и разворачивания апомиоглобина.

Научная новизна работы. Разработан метод анализа кинетических данных для белков, сворачивающихся через формирование промежуточного состояния. Метод позволяет также изучать структуру переходного состояния на пути сворачивания таких белков. Использование этого подхода для исследования сворачивания и разворачивания апомиоглобина позволило найти а/к остатки, ответственные за его стабильность и скорость сворачивания в нативную структуру. Впервые получена зависимость доли кинетического промежуточного состояния, формирующегося в процессе сворачивания апомиоглобина, от концентрации денатуранта. Это позволило разделить вклады различных состояний в кинетику процесса сворачивания апомиоглобина. Показана возможность оценки кинетических и энергетических параметров для случаев с не полностью завершенным^ переходами и<->К

Практическая значимость работы. Понимание процесса сворачивания сложных белков, каким является апомиоглобин, может быть использовано в рациональном конструировании de novo белков с заранее заданными свойствами для нужд промышленности и медицины.

Оценка энергетических параметров равновесных и кинетических процессов сворачивания/разворачивания белковой молекулы позволяет выявить наиболее дестабилизирующие мутации, замедляющие процесс сворачивания белка. Получение такой информации является важным для выявления конформационных изменений в структуре белков, приводящих к амилоидным образованиям, и для разработки подходов к конструированию лекарственных средств, предотвращающих формирование амилоидных депозитов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: International Conference in Honour of Alexander Spirin "Protein Synthesis" (Пущино, Россия,, 2001); International Summer School "Understanding Protein Stability"( Huddinge, Sweden, 2004); 49th Annual Meeting of Biophysical Society (Long Beach, С A, USA, 2005), 6th European Symposium of the Protein Society (Barcelona, Spain, 2005), 30th FEBS Congress "The Protein World" (Budapest, Hungary, 2005), Annual Meeting of International Research Scholars of the Howard Hughes Medical Institute (Mexico, 2005); на российских конференциях: школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, Московская область, 2000), 5-ая Пущинская конференция молодых ученых. (Пущино, Московская область, 2001), Открытый семинар кафедры Молекулярной биофизики физического факультета СПБГУ (Санкт-Петербург, 2001), Третий Всероссийский Биохимический Съезд (Санкт-Петербург, 2002), III Съезд Биофизиков России (Воронеж, 2004), 17a" зимняя молодежная школа "Перспективные Направления Физико-Химической Биологии и Биотехнологии" (Москва, 2005), ежегодные научные конференции Института белка РАН (Пущино, Московская область, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004,2005).

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 16 печатных работах, в том числе 3 статьях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из "Введения", "Материалов и методов", четырех глав, посвященных описанию и обсуждению экспериментальных данных, "Заключения" и "Списка цитируемой литературы". Работу иллюстрируют 22 рисунка и 4 таблицы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Апомиоглобин сворачивается довольно быстро при физиологической и комнатной температурах, но для детального исследования необходимо замедлить скорость его сворачивания путем использования области более низких температур. Однако апомиоглобин претерпевает холодовую денатурацию, температура перехода которой зависит от рН, и при рН 5.0 она начинается с 5°С. Поэтому, чтобы структура апомиоглобина не подвергалась холодовой денатурации, была выбрана температура 11°С [Барышникова и др., 2005]. Выбор рН 6.2 обусловлен тем, что при этом рН даже наиболее дестабилизированная мутантная форма апомиоглобина с заменой Тгр14 на Ala сохраняет «нативную» структуру и не агрегирует.

Равновесное разворачивание апомиоглобина мочевиной. На рис. 1 представлен денатурационный переход апомиоглобина под действием мочевины, наблюдаемый методом КД в дальней УФ области. Переход хорошо описывается наличием двух состояний с серединой перехода при 2.9 М

i '»1

• 1 2 3 4 3 * ЯМ ЗМ Эм 3» 34» 35« Ж* Э7» ЭМ ЭЯ 4» 410 42» 4» 44« 4Я

Кашцтроции мочмины, М Длим волны, ни

Рис.1. Равновесное разворачивание рис<2. Спектры Тгр флуоресценции апомиоглобина при апомиоглобина мочевиной, разных концентрациях мочевины. Пунктирная линия

регистрируемое по изменению указывает длину волны 335 нм, на которой проводились спектра КД в дальней УФ области кинетические эксперименты. Вставка - зависимость Тгр

флуоресценции на 335 нм от концентрации мочевины.

мочевины. Однако, изменение спектра триптофановой (Тгр) флуоресценции при увеличении концентрации мочевины (рис. 2) указывает на накопление термодинамически стабильного промежуточного состояния апомиоглобина (появление максимума 1335 от концентрации мочевины), интенсивность Тгр флуоресценции которого заметно выше интенсивности нативного (Ы) и развернутого (и) конформационных состояний белка (рис. 2, вставка). По-видимому, промежуточное состояние имеет содержание вторичной структуры близкое к нативному, но сильно отличается по флуоресцентным свойствам. Последнее подтверждается дальнейшими кинетическими исследованиями процессов сворачивания и разворачивания апомиоглобина.

Исследование кинетических процессов сворачивания и разворачивания апомиоглобина. На рис. 3 представлены кинетические кривые сворачивания апомиоглобина из развернутого состояния (5М мочевины), зарегистрированные по изменению интенсивности Тгр флуоресценции на 335 нм. Видно, что при конечных концентрациях мочевины ниже ЗМ существуют две последовательные фазы сворачивания: 1-ая фаза протекает за мертвое время прибора и видна только по скачкообразному увеличению интенсивности флуоресценции, и 2-ая фаза, которая проявляется

Время, сек.

Рис.3. Кинетические кривые ренатурации апомиоглобина, регистрируемые с помощью метода Тгр флуоресценции. Цифры рядом с кривыми соответствуют концентрациям мочевины в растворе после смешения. Длина волны регистрации флуоресценции (1335) составляла 335 нм.

0 1 2 3 4 5

Концентрация мочевины, М

Рис.4. Зависимость доли (ф кинетического промежуточного состояния, рассчитанной из амплитуды первой фазы сворачивания (когда нативное состояние еще не успело образоваться), от концентрации мочевины. Вставка- Изменение амплитуды первой фазы сворачивания при уменьшении концентрации мочевины.

как относительно медленное падение интенсивности. При конечных концентрациях мочевины выше ЗМ наблюдается только 1 -ая фаза, проявляющаяся как скачкообразное увеличение интенсивности флуоресценции. Таким образом, за мертвое время прибора происходит переход апомиоглобина из развернутого состояния (1Г) в кинетическое промежуточное состояние (I), а затем переход из промежуточного состояния в нативное (М). По возрастанию амплитуды первой фазы сворачивания (переход и->1) можно оценить увеличение доли промежуточного состояния (5) при уменьшении конечной концентрации мочевины в процессе сворачивания белка (рис. 4). Населенность промежуточного состояния пропорциональна амплитуде первой фазы сворачивания А(М). Параметр £(М), соответствующий доле молекул в промежуточном состоянии перед началом перехода в Т^, можно рассчитать по формуле:

А,(М)-А„(М)

где Ац(М) и А1(М) - значения данного параметра для развернутого и промежуточного состояний, соответственно, полученные экстраполяцией базовых линий в область перехода (вставка на рис. 4). Отметим, что величина есть доля молекул в развернутом (Ц) состоянии, перед началом образования нативного состояния (Ы) составляет (1- $(М)). Из рис. 4 видно, что амплитуда первой фазы перестает увеличиваться при конечных концентрациях мочевины ниже 1.2М мочевины. Можно предположить, что при концентрациях мочевины меньших, чем 1.2 М, все молекулы белка на момент начала перехода в нативное состояние уже находятся в промежуточном состоянии. При 2.2 М мочевины доля промежуточного состояния составляет 0.5 (см. рис. 4). Это означает, что при этой концентрации мочевины промежуточное и развернутое состояния равны по стабильности, т.е. имеют одинаковую свободную энергию. Вместе с тем, из рис. 2 видно, что равновесное промежуточное состояние максимально населено в районе 3 М мочевины, и эта населенность (как следует из графика зависимости ^(М) от концентрации мочевины на рис.4) не превышает 10%.

На рис. 5 представлены кинетические кривые разворачивания, регистрируемые по изменению интенсивности флуоресценции на длине волны 335 нм. При конечных концентрациях мочевины ниже 3.5 М наблюдается возрастание интенсивности кинетических кривых, а затем, с увеличением конечной концентрации денатуранта, кинетические кривые разворачивания меняют знак. Это может быть объяснено следующим образом. Пока (при низких концентрациях мочевины) развернутое состояние менее стабильно, чем промежуточное, наблюдается рост интенсивности в ходе денатурации, так как I характеризуется большей интенсивностью Тгр флуоресценции. По мере того,

Рис.5.

Кинетические кривые разворачивания апомиоглобина, регистрируемые методом триптофановой флуоресценции. Цифры рядом с кривыми соответствуют концентрациям мочевины в растворе после смешения. Длина волны регистрации флуоресценции составляла 335 нм.

как с ростом концентрации денатуранта состояние и становится более стабильным, чем I, и начинает доминировать в денатурированном состоянии белка, и, так как его интенсивность меньше, чем в нативном состоянии (рис. 2, вставка), происходит смена знака кинетических кривых. Однако константа скорости процесса определяется исключительно первым, большим энергетическим барьером между N и I. Последующее быстрое перераспределение молекул между I и и практически не дает вклада в константу скорости разворачивания из N в I (к№) или из N в и (кцу), и, таким образом, кК1 = кми- Следует отметить, что, поскольку до 3.5 М мочевины наблюдается процесс увеличения интенсивности флуоресценции (напомним, что интенсивность флуоресценции на 335 нм у промежуточного состояния выше, чем у нативного), процесс разворачивания, по крайней мере, до 3.5 М мочевины, проходит через промежуточное состояние.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

Построение и анализ зависимости константы скорости сворачивания и разворачивания апомиоглобина от концентрации денатуранта.

Необходимым условием исследования структуры белка в переходном состоянии (ядра сворачивания белка) является построение зависимости констант скоростей сворачивания и разворачивания от концентрации денатуранта (так называемого шевронного графика). На рис. 6 представлена такая зависимость для апомиоглобина. При детальном рассмотрении этой зависимости можно заметить, что она (рис. 6) отличается от шевронных графиков белков, сворачивающихся по одностадийному механизму. Во-первых, в области малых концентраций мочевины (< 1.5 М) наблюдается загиб ветви сворачивания, который обычно объясняют наличием промежуточного состояния [МаЬивсЬек е1 а1. 1990] или широким переходным состоянием [Тегпйогш е1 а1. 1999]. Во-вторых, константы скорости в области минимума шевронного графика заметно занижены по сравнению с тем, что должно было бы наблюдаться в случае перехода между двумя состояниями. Действительно, как известно, константа скорости сворачивания/разворачивания (к^) является эффективной величиной и представляет собой сумму двух составляющих - константы скорости сворачивания и константы скорости разворачивания (ки) белка (к^ = кг + ки для одностадийных белков) [РегБ^ 2000]. Если предположить, что шевронный график на рис. 6 описывает одностадийный процесс, то в точке полуперехода (в

Рис.6. Зависимость наблюдаемой скорости сворачивания/разворачивания ко^ (■) и рассчитанных скоростей, относящихся к переходу между двумя состояниями (кщ, км, кцц, кыи) от концентрации мочевины: расчет скорости сворачивания для I—»К перехода кш (о), дня и—^ перехода кцц (Д), экстраполяция к^ в область больших

концентраций мочевины (—-),

экстраполяция кш (--------), шевронный

график, рассчитанный для 1<-»К перехода

(...........). Сплошная линия соответствует

линейной аппроксимация ветви разворачивания. Пунктирная линия соответствует линейной аппроксимации линейного участка ветви сворачивания. Другие пояснения - в тексте.

ветви

0 1 2 3 4 5 6 Концентрация мочевины, М

точке пересечения экстраполяций ветвей сворачивания и разворачивания) константы скорости сворачивания и разворачивания должны быть равны kf = кц т. е. ^ = 2-кц и ln(kobs) = ln(2) + ln(ku). Значит, минимум шевронного графика должен быть поднят на величину 1п(2) = 0.7 относительно точки пересечения экстраполяций ветвей сворачивания и разворачивания. В нашем же случае эта величина составляет примерно 0.25. Это позволяет сделать вывод о наличии всех трех состояний (N, I, U) в этой области концентраций мочевины, а не только N и U, как это наблюдалось бы для одностадийного перехода. Из всего вышесказанного следует, что на протяжении всей ветви сворачивания (до 3 М мочевины) присутствуют все три состояния. Принимая во внимание тот факт, что к№ и kiN « kui и кш (в нашем случае характерные времена переходов U<->I и I<->N порядка 10"3сек. и 1сек., соответственно), то для белков, сворачивание которых происходит по двухстадийному механизму, экспериментально определяемая константа скорости будет соответствовать уравнению [Baldwin 1996, Parker, 1995]:

kobs = kNi + fi*k,M, (2)

где f) - доля промежуточного состояния при переходе белка из развернутого в промежуточное состояние, рассчитанная из амплитуды первой фазы кинетических кривых сворачивания (рис.4). Учитывая выше сказанное, для kiN получаем: k^HzMM)^ (3)

где kobs, kNi и fj взяты напрямую из экспериментальных данных [Baryshnikova et al., 2005]. Необходимо отметить, что формула (3) применима на практике только в той области, где kobs(M) значительно больше, чем kNI(M), и fi(M) надежно отлична от нуля. Эти условия (рис. 4) выполняются при конечных концентрациях мочевины ниже 2.6-2.7 М. Наиболее точные расчеты могут быть сделаны при fi(M) = 1, то есть при концентрации мочевины ниже 1.2М, когда все молекулы после первой фазы сворачивания находятся в промежуточном состоянии. В этих условиях развернутое состояние сильно дестабилизировано по сравнению с промежуточным и не оказывает влияния на переход !<->N. Однако эта линейная часть шеврона (соответствующая fi(M) =1) для апомиоглобина очень короткая, а

9

для многих мутантных форм она практически отсутствует. Для того чтобы рассчитать кщ(М) более аккуратно, мы использовали экспериментальные зависимости к^СМ), к^(М), ^(М) и уравнение (3). Результат расчета показан на рис. 6 (открытые кружочки). Полученные величины 1п(кш(М)) хорошо ложатся на прямую линию (рис. 6). Точка пересечения экстраполяции данной прямой с ветвью разворачивания шевронного графика соответствует 4.2 М мочевины. При данной концентрации мочевины свободные энергии нативного и промежуточного состояний равны. Используя кщ(М), рассчитанные во всём используемом интервале концентраций мочевины, мы можем построить шевронный график, описывающий энергетический барьер между I и N состояниями (рис. 6).

Когда £ близко к 1, эффективная константа скорости сворачивания коЬ5 близка к к™, и тогда скорость-лимитирующая стадия сворачивания определяется переходом между I и N состояниями, то есть высотой барьера между этими состояниями. Высота барьера в данном случае равна Отз-Оь где втв и ^ -свободные энергии переходного (ТБ) и промежуточного (I) состояний, соответственно. Однако, при более высоких концентрациях денатуранта, промежуточное состояние населено незначительно (^«1), и коЬ5 отличается от км. Однако во всех случаях скорость-лимитирующей стадией сворачивания является формирование того же самого переходного состояния (ТБ). Высота данного барьера равна Отя-ви (где йц - свободная энергия развернутого состояния и, а Отэ - переходного состояния ТБ). Согласно формуле Крамерса, константу скорости для перехода можно представить как кш=к0-ехр[-(С1т5-Ои)Я1Т], где Я -

газовая постоянная, Т - температура, Ко - константа скорости выхода из переходного состояния. В то же время константа скорости для сворачивания 1->Ы равна к1к=к0-ехр[-(Отз-О1)Л1Т], где - свободная энергия состояния I. Подставляя км в предыдущее соотношение, получаем ки>,.=к^-ехр[-(01-0и)/КТ]. Отсюда

(4)

Таким образом, уравнение 2 может быть переписано в виде: коЬ5=км+(1-^)-кш . (5)

Принимая во внимание, что к№ = kNU (т.к. они определяются переходом через одно и то же TS):

ш l-f,(M) (6)

Уравнение (6) на практике применимо в той области сворачивания, когда 1-fj не мала, то есть при конечных концентрациях мочевины между 1.5М и З.ОМ. Результат расчета кда(М) показан на рис. 6 (открытые треугольники). Полученные величины 1п(кш(М)) хорошо ложатся на прямую линию. Скорости переходов N—>U и U-»N равны при 2.7М мочевины (свободные энергии состояний U и N равны), а зависимости кщ(М) и кцц(М) пересекаются при 2.2 М мочевины, что соответствует § = 0.5 (см. рис. 6 и рис. 4).

Анализ шевронного графика в случае отсутствия загиба на ветви сворачивания. Описанный выше метод позволяет рассчитать скорости отдельных фаз сворачивания в случае белка с тремя состояниями. Случай апомиоглобина относительно простой, поскольку шевронный график имеет довольно выраженный загиб ветви сворачивания. Довольно часто белки не имеют выраженного загиба, что может означать, что перед началом перехода в N, накапливается менее 100%

1.0 0.8 0.6

(м

0.4 0.2

0.0

1 2 3 4 50123456 Концентрация мочевины, М Концентрация мочевины, М Рис. 7. Анализ кинетических данных в случае, когда кинетическое промежуточное состояние не населяется на 100% в ходе сворачивания белка. А(М) и шевронный график обрезан в 2.1 М мочевины. Черные квадратики, открытые кружочки и открытые треугольники обозначают то же, что и на рис. 6. (а) Населенность промежуточного кинетического состояния (fi). (Вставка) Зависимость амплитуды первой фазы сворачивания от концентрации мочевины. Пунктирной линией показана аппроксимация А(М) по модели двух состояний, (б) Расчет км (квадратики) и кии (перевернутые треугольники). Сплошная линия соответствует экстраполяции к большим концентрациям мочевины. Пунктирная линия обозначает то же, что (----) на рис. 6.

кинетического промежуточного состояния в измеряемой области концентраций денатуранта. Для того чтобы проверить, как вышеприведенный подход работает в таких случаях, А(М) и шевронный график были обрезаны на 2.1М мочевины. В этих условиях промежуточное состояние накапливается только лишь на 50%. Поскольку после первой фазы сворачивания присутствуют только два состояния (I и Ц), А(М) была аппроксимирована моделью двух состояний, чтобы достроить А(М) до 100%, а затем были проведены все расчеты, описанные выше. Как видно из рис. 7, даже в случае, когда I накапливается не больше 50%, мы можем с достаточной точностью рассчитать константы скорости к^ и кц».

Построение зависимостей свободной энергии состояний апомиоглобина от концентрации денатуранта. Константы скорости, относящиеся к быстрым переходам (ки1 и кш), не могут быть измерены экспериментально, поскольку эти процессы проходят за «мертвое время» в1орре(1-Ао\у прибора. Тем не менее, можно оценить взаимное расположение энергетических уровней различных состояний и, I, N и Тв (ви, Оь вн и втв, соответственно) во всем диапазоне концентраций мочевины, используя экспериментально измеренные константы скорости сворачивания/разворачивания (к0ь5) и процент населенности промежуточного состояния (£).

Во-первых, значение (ОрОи) может быть получено при различных концентрациях денатуранта как:

0,(М)-0и(М) = -КТ-1п (7)

1 и 1-^(М) { }

Во-вторых, (в^-ОО может быть получено из перехода N<->1, как:

где км|(М) - значение константы скорости разворачивания, экстраполированное к данной концентрации мочевины М, а кгк(М) - скорость сворачивания из промежуточного состояния, рассчитанная по формуле (3).

Поскольку принято отсчитывать свободные энергии вссх состояний от развернутого состояния, уравнения (7) и (8) могут быть переписаны в виде:

G„(M)-Ou(M) = -RT-

lnMM)+lnj,(M)

= -RT • In

kw(M) "kNU(M)

(9)

В данном уравнении мы воспользовались уравнением (4) и равенством км = кш. По определению константа скорости разворачивания определяется высотой барьера между N и I состояниями, то есть величиной (СТ5-См):

RT

кы. = к—• exp(-(GTC - Gn )/RT),

(Ю)

где Ь - постоянная Планка, к - коэффициент трансмиссии, который может быть принят за 1.0 (БегеИг 2000, параграф 18), тогда

1п[к№(М)]-1п[кН

ате(М)-ом(М) = -кт и, используя уравнение (9), получаем:

Gts(^)~Gu(M) = -RT

1п[кш(М)]-1п

RT

(П)

(12)

RT

где RT ■ ln-^— = 69.4kJ/mol при 11°С (284К). h

На рис. 8 представлена зависимость свободной энергии всех трех состояний от концентрации мочевины в растворе. При низких концентрациях мочевины (ниже 1.2М) состояния N и I более стабильны, чем состояние U, и наблюдаемая скорость сворачивания соответствует переходу I-»N. При более высоких концентрациях мочевины (выше 2.IM) состояние I становится менее стабильным, чем состояние U. Вместе с тем нативное состояние еще остается стабильнее развернутого (до 2.7 М), и, поэтому, сворачивание белка все еще вероятно. Быстрое перераспределение

£ioo

I»

60

* 20 к

TS--"'

я

U

1-20

Рис. 8. Зависимость свободной энергии трех стабильных состояний (И, I, Ц) и переходного состояния (ТЭ) на скорость-лимитирукмцем барьере апомиоглобина от концентрации мочевины в растворе. Свободная энергия всех уровней отсчитывалась от уровня развернутого состояния.

1 2 3 4 5 Концентрация мочевины, М

молекул между I и U состояниями приводит к уменьшению населенности состояния I и, соответственно, уменьшению вероятности I-»N перехода. Это приводит к уменьшению наблюдаемой скорости сворачивания и к занижению минимума шевронного графика. При концентрациях мочевины выше 2.7М разворачивание белка становится более выгодным, но N остается все еще стабильнее, чем I, вплоть до 4.2М мочевины.

Знание свободных энергий U, I, N и TS состояний позволяет изучать структуру переходного состояния (исследовать ядро сворачивания) и структуру кинетического промежуточного состояния при помощи "Ф-анализа", используя точечные замены в а/к последовательности белка.

Выбор аминокислотных замен для исследований ядра сворачивания аиомиоглобина. Для того, чтобы выбрать положения а/к остатков, которые могут участвовать в формировании ядра сворачивания апомиоглобина, были использованы результаты двух ранее предложенных теоретических подходов.

Первый подход был разработан О.Б. Птицыным и соавторами [Shakhnovich et. al., 1996]. Проанализировав 728 глобиновых последовательностей [Ptitsyn and Ting, 1999], обнаружили, что во всех глобинах имеется только 6 консервативных нефункциональных а/к остатков в A, G и Н спиралях: VallO, Trpl4, lie 111, Leull5, Metl31, Leul35. Было предположено, что именно эти остатки входят в ядро сворачивания апомиоглобина.

Второй, «ландшафтный», подход к предсказанию а/к остатков, входящих в ядро сворачивания белка, состоит в поиске самых низких энергетических барьеров, отделяющих развёрнутое состояние от нативной структуры на ландшафте свободной энергии белковой цепи [Galzitskaya and Finkelstein, 1999]. Сравнение результатов расчёта с экспериментальными данными по определению ядер сворачивания показывает, что с помощью этого подхода можно удовлетворительно предсказывать ядра сворачивания белков в точке термодинамического равновесия нативного и развернутого состояний. Расчеты, сделанные О.В. Галзитской для апомиоглобина, показали, что в ядро сворачивания должны входить остатки, расположенные в В, С, D и Е спиралях. Для экспериментальной проверки данного метода предсказания были выбраны

14

6 таких остатков, достаточно глубоко погруженных в структуру белка, - 11е28, РЬеЗЗ (В спираль), Leu40 (С спираль), Met55, (D спираль), Leuól и Leu76 (Е спираль). Для того чтобы предсказания можно было сравнивать с опытом, все выбранные остатки поочередно заменили на Ala. Плазмиды, содержащие гены мутантных белков, были сконструированы Долгих Д.А. (ИБХ РАН).

Исследование равновесного процесса разворачивания мутантных форм апомиоглобина. С целью определения влияния мутаций на конформационную стабильность апомиоглобина были проведены эксперименты по равновесному разворачиванию мутантных белков мочевиной с помощью методов Тгр флуоресценции и КД в области поглощения пептидных связей. В качестве параметров, отражающих изменения на разных уровнях структурной организации белка, были выбраны интенсивность Тгр флуоресценции на длине волны 335нм и молярная эллиптичность на длине волны 222 нм.

Кояцентрацн нокмяы, М Концентрапяя иочечяны, М

Рис.9. Равновесное разворачивание апомиоглобина дикого типа и его мутантных форм, регистрируемое по изменению спектров КД в дальней УФ области (а, в) и по изменению интенсивности Тгр флуоресценции на длине 335 нм (б, ?), нормированной на интенсивность Тгр флуоресценции развернутого состояния.

Изменение молярной эллиптичности, характеризующей содержание вторичной структуры в белке, в зависимости от концентрации мочевины представлено на рис. 9а,в. Видно, что изменения в спектрах КД, а, следовательно, и во вторичной структуре мутантных белков начинаются при более низких концентрациях мочевины, чем для белка дикого типа (\\НГ), т.е. их структуры дестабилизированы мутациями по отношению к действию мочевины. При этом денатурационные переходы из нативного состояния в развернутое для мутантных белков становятся более широкими, т.е. менее кооперативными, чем для белка \УТ, особенно в мутантных белках с заменами Ьеи76А1а и Тгр14А1а. Сопоставление молярной эллиптичности на 222 нм в О М мочевины (где белки находятся в свернутом состоянии) показывает, что часть мутантных белков имеет меньшее содержание вторичной структуры по сравнению с белком МУТ. Если же посмотреть на зависимость интенсивности Тгр флуоресценции на выбранной длине волны (335 нм) от концентрации мочевины (рис. 96, г), то для всех мутантных белков, аналогично белку WT, наблюдается максимум этой зависимости, свидетельствующий о накоплении промежуточного состояния на пути разворачивания белка. При этом, у мутантных белков этот максимум более выражен, чем у белка что может свидетельствовать о том, что разворачивание мутантных белков характеризуются более высокой населенностью промежуточного состояния по сравнению с разворачиванием белка \\ГГ.

Кинетическое исследование процессов сворачивания и разворачивания мутантных форм апомиоглобина. Кинетические эксперименты по сворачиванию и разворачиванию мутантных форм апомиоглобина с заменами а/к остатков в консервативных нефункциональных положениях (спирали А, в и Н) и в положениях, предсказанных с помощью «ландшафтного» подхода (спирали В, С, Б, и Е), проводились с целью оценки включения этих а/к остатков в предполагаемое ядро сворачивания апомиоглобина в переходе 1«-»>1. Для всех мутантных белков получены шевронные графики и оценена доля промежуточного состояния.

1 2 3 4 5 Концентрация мочевины» М

С;-сииральи15А

0 12 3 4 5 Концентрации мочевины, М

4,- .

СО-сниралн М55А У У

2 3 4 5 Концентрация чочевины, М

Н-снираль 1Л35А.^'

МША

1 2 3 4 !

Концентрация чочевины, М

2 3 4 ! Концентрация чочевины, М

1 2 3 4 5 Концентрация чочевины, Ч

Рис.10. Шевронные графики для всех мутантных белков. Для каждого белка показаны экспериментальные зависимости скоростей сворачивания/разворачивания от концентрации мочевины, экстраполяция ветви разворачивания, а также экстраполяция рассчитанной зависимости скорости сворачивания кщ(М) из промежуточного в нативное состояние от концентрации мочевины.

Мутантные белки с заменами а/к остатков в консервативных нефункциональных положениях. Из рис. 10 (А, О и Н спирали) видно, что, несмотря на то, что процесс разворачивания данных мутантных белков сильно ускоряется по сравнению с при одних и тех же концентрациях денатуранта,

процесс сворачивания во всех случаях меняется не так существенно. Для мутантного белка с заменой Тгр 14, из-за его сильной дестабилизации, вообще не удалось получить ветвь сворачивания, а ветвь разворачивания изменила наклон по сравнению с белком WT. Это может свидетельствовать о возможном изменении пути сворачивания данного белка.

Мутантные белки с заменами а/к остатков в положениях, предсказанных с помощью «ландшафтного» подхода. Из рис. 10 (В, С, Б, и Е спирали) видно, что замены в данных положениях ускоряют разворачивание, то есть приводят к дестабилизации нативной структуры белка. Однако если посмотреть на ветвь сворачивания, можно видеть, что эти замены по-разному влияют на скорость сворачивания белка. Так, для белков с заменами Ие28 (В-спираль) и Ьеи76 (Е-спираль) скорость сворачивания замедляется на столько же, на сколько ускоряется процесс разворачивания белка. Замены Ме155 (О-спираль) и Ьеи61 (Е-спираль) замедляют сворачивание белка, однако скорость разворачивания меняется более существенно. Замены БЗЗ (В-спираль) и Ь40 (С-спираль) влияют на скорость разворачивания белка, тогда как скорость сворачивания не изменяется.

Для расчета скоростей сворачивания из I в N и из и в N (рис. 10) ко всем белкам был применен подход, разработанный для белка \УТ. Зная зависимость 1пкш(М) и 1пкш(М) для мутантных белков и белка \\ГГ, можно применить Ф-анализ Фершта для оценки вклада замененных а/к остатков в структуру переходного состояния на барьере, разделяющем I и N состояния. Параметр Ф, отражающий вовлеченность остатка в ядро сворачивания, был рассчитан по формуле [РегеЫ; 2000]:

Если параметр Ф близок к 1, то остаток входит в ядро сворачивания, если к 0 -не входит.

В таблице приведены значения параметра Ф, рассчитанные для всех мутантных белков:

(13)

параметр Замены в консервативных нефункциональных положениях Замены в положениях, предсказанных при помощи «ландшафтного» подхода

ЧУТ У10А \V14A 1111А Ы15А М131А 1Л35А 128А КЗЗА 1/40А М55А 1.61 А 1/76А

Середина перехода и<-1 2.2 ±0.2 2.2 2.1 2.0 2.0 2.3 2.3 2.1 2.3 2.0 2.0 2.2 2.0

Середина перехода 4.2 ¿0.2 2.8 9 2.3 1.0 0.4 1.0 2.8 0.9 2.2 0.9 0.6 0.4

Ф - 0.3 ±0.1 ? 0.3 0.2 0.3 0.2 0.6 0.2 0.0 0.4 0.4 0.7

Из таблицы видно, что для всех мутантных белков с заменами консервативных а/к остатков параметр Ф имеет значение порядка 0.2 - 0.3, что свидетельствует о том, что в переходном состоянии для №->1 перехода данные остатки завязывают порядка 20% - 30% контактов от возможных в нативном состоянии.

Для белков с заменами в В, С, Б и Е спиралях Ф варьирует от 0.0 до 0.7. Для Ие28 (В-спираль) и Ьеи76 (Е-спираль) параметр Ф имеет высокое значение (0.6 и 0.7, соответственно), что указывает на то, что данные остатки входят в ядро сворачивания апомиоглобина на стадии перехода из промежуточного в нативное состояние, а РЬеЗЗ, Ьеи40, \let55 и Ьеи61 ведут себя сходно с консервативными нефункциональными остатками, т.е. они слабо вовлечены в ядро сворачивания в переходе, лимитирующем скорость сворачивания.

В таблице также представлены концентрации мочевины, при которых населенности (и и I) и (I и Ы) состояний равны. По сравнению с диким типом нативное состояние всех мутантных белков сильно дестабилизировано относительно развернутого и промежуточного состояний, тогда как стабильность промежуточного состояния относительно развернутого меняется незначительно.

выводы

1. Разработан метод определения кинетических и термодинамических параметров переходов между нативным, промежуточным и развернутым состояниями для белков, сворачивание и разворачивание которых проходит по двухстадийному механизму.

2. Показано, что мутации в гидрофобном ядре белка сильно дестабилизируют нативное состояние, но практически не сказываются на стабильности промежуточного состояния.

3. Показано, что консервативные нефункциональные а/к остатки образуют

_ мало контактов в переходном состоянии на барьере, разделяющем

нативное и промежуточное состояние, и, по-видимому, не входят в ядро сворачивания апомиоглобина на этой стадии, в то время как некоторые неконсервативные а/к остатки (Т1е28 и Ьеи76), образуя более 50% нативных контактов в переходном состоянии, участвуют в формировании ядра сворачивания апомиоглобина при переходе из промежуточного состояния в нативное.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Е.Н. Барышникова, Б.С. Мельник, Г.В. Семисотнов, В.Е Бычкова Изучение кинетики сворачивания/разворачивания апомиоглобина. Молекулярная биология 39(6), 2005, in press

2. E.N. Baryshnikova, B.S. Melnik, A.V. Finkelstein, G.V. Semisotnov, and V.H. Bychkova. Three-state protein folding: experimental determination of free-energy profile. Protein Sci., 14, 2005, p. 2658-2667.

3. Е.Н. Барышникова, М.Г. Шарапов, И.А. Кашпаров, Н Б. Ильина, В.Е. Бычкова Изучение стабильности апомиоглобина в зависимости от мочевины и температуры при двух значениях рН. Молекулярная биология 39(2), 2005, стр. 292-297.

4. E.N. Baryshnikova, B.S. Melnik, А V. Finkelstein, G.V Semisotnov and V.E Bychkova. Effects of substitutions of conserved nonfunctional residues by Ala on the folding of apomyoglobin. The FEBS Journal, 272, 2005, p. 363.

5. E.N. Baryshnikova, B.S. Melnik, A.V. Finkelstein, G.V. Semisotnov and V.E. Bychkova. Equilibrium and kinetic study of three-state apomyoglobin with substitutions of conserved nonfunctional residues. 6th European Symposium of the Protein Society, Barcelona, Spain; Final program and abstracts, 2005, p. 125

6. B.S. Melnik, E.N. Baryshnikova, A.V. Finkelstein, G.V. Semisotnov and V.E. Bychkova. Analysis of a chevron plot for three-state unfolding/refolding reactions of apomyoglobin. 6 European Symposium of the Protein Society, Barcelona, Spain; Final program and abstracts, 2005, p. 125

7. E.N. Baryshnikova, B.S. Melnik, A.V Finkelstein, G.V Semisotnov and V.E. Bychkova Three-state protein folding: Analysis of a chevron for three-state unfolding/refolding

reactions of apomyoglobm 491'1 Annual Meeting of B'ophysical Society Long Beach СЛ. Abstiact Issue. 2005. 187-Pos

8. M 1 Шарапов Е.Н. Барышникова. И Л Кашпаров, Н Б Ильина, В Ь Бычкова Исследование стабильности мутантных форм апомиопобина с именами консервативных нефункциональных аминокислотных остатков 17-ая зимняя молодежная начиная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии)/. Москва. Россия Гезисы докладов и стендовых сообщений. 2005. стр 52

9. В А Балобанов. Е.Н. Барышникова. И А Кашпаров. Н Б Ильина. В Е Бычкова Исследование стабильности мутантных форм апомиоглобина с точечными заменами аминокислотных остатков в С и Е спиралях на аланин, 17-ая зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва. Россия, Тезисы докладов и стендовых сообщений. 2005. стр. 33

10. Е.Н. Барышникова, Б С Мельник А В Финкельштейн. Г В Семисотнов. В Е Бычкова Изучение кинетики сворачивания и разворачивания апомиоглобина. III Съезд Биофизиков России. Воронеж Гезисы докладов. 2004. Т 1. стр 7-8

11. E.N. Baryshnikova. В S Melnik. AV Finkelstein. G V Senusotnov VE Bychkova Three-state protein folding investigation of apomyoglobin unfolding refolding kinetics by tryptophan fluorescence International Summer School on "Understanding Protein Stability", Huddinge, Sweden. Book of abstracts. 2004 p 44

12. E.N. Baryshnikova (F N Trofimova), D A Dolgikh. A E Dyuysekina, EI Tiktopulo, N В Ilyina, V E Bychkova. Сравнительное изучение апомиоглобина дикого типа и его мутантов, замена консервативного Vail0 на гидрофобные остатки III Съезд Биохимического общества. Санкт-Петербург Россия. Тезисы научных докладов. 2002,стр 525-526

13. Е Н Трофимова (Е.Н. Барышникова). Д А До.и их. А Е Дюйсекина. Е И Тиктопуло. Н Б Ильина. В Е Бычкова. О Б Птицын Значение триптофана 14 для сворачивания миоглобина Открытый семинар кафедры Молекулярной биофизики физического факультета СПбГУ. С.Петербург. Россия. Сборник тезисов. 2001. 52

14. АЕ Dyuysekina. D A Dolgikh. Е N Trofimova (E.N. Baryshnikova). "N В Ilyina, E I Tiktopulo. V E Bychkova. PE Wright Conserved residues m apomyoglobin influence of Trpl4 substitution by Phe and Ala on protein folding International Conference on "Protein Synthesis". Pushchmo, Russia. Programme and abstracts 2001 p 59

15. Трофимова EH (Барышникова E.H.). Долгих ДА. Дюйсекина АЕ. Тиктопуло Е И, Ильина Н.Б. Бычкова В Е. Птицын О Б. Сравнение равновесных и кинетических свойств апомиоглобина дикого типа и его мутантов с заменой консервативного триптофана 5-ая Путинская конференция молодых ученых «Биология - наука 21 го века». Пушино. Россия. Сборник тезисов. 2001. стр 60

16. ЕН Трофимова (Е.Н. Барышникова). ДА Долгих, АЕ Дюйсекина. ЕИ Тиктопуло. Н Б Ильина. В Е. Бычкова. О Б Птицын Сравнительное изучение апомиоглобина дикого типа и его мутантов замена консервативного триптофана на алифатические остатки Школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии», Пущино, Россия, Тезисы стендовых сообщений, 2000, стр 61

«21 8 7 9 1

РНБ Русский фонд

2006-4 19992

Принято к исполнению 14/10/2005 Заказ № 1125

Исполнено 14/10/2005 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru.

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Барышникова, Екатерина Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Проблема сворачивания белка.

1.2. Модели сворачивания белка.

1.3. Промежуточные состояния белковой молекулы, реализующиеся в процессе ее сворачивания.

1.4. Переходное состояние и ядро сворачивания белка.

1.5. Характеристика объекта исследования.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы.

2.2. Приборы, параметры и условия измерений

2.3. Биохимические методы.

2.3.1. Экспрессия генов.

2.3.2. Выделение и очистка белков.

2.4 Физические методы исследования.

2.4.1. Абсорбционная спектроскопия.

2.4.2. Флуоресцентная спектроскопия.

2.4.3. Круговой дихроизм.

2.4.4. Сканирующая микрокалориметрия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА ПОДХОДА К АНАЛИЗУ КИНЕТИЧЕСКИХ

ДАННЫХ ДЛЯ БЕЛКОВ С ПРОМЕЖУТОЧНЫМ СОСТОЯНИЕМ НА

ПРИМЕРЕ АПОМИОГЛОБИНА.

3.1. Экспрессия и выделение апомиоглобина и его мутантных форм

3.2. Выбор условий для равновесных и кинетических исследований апомиоглобина.

3.3. Исследование равновесных свойств апомиоглобина при

11°С, рН6.

3.4. Исследование кинетики сворачивания/разворачивания апомиоглобина.

3.5. Построение и анализ зависимостей констант скоростей сворачивания/разворачивания апомиоглобина от концентрации денатуранта.

3.6. Анализ зависимости констант скоростей сворачивания/разворачивания от концентрации денатуранта в случае отсутствия загиба на ветви сворачивания.

3.7. Построение зависимостей свободной энергии состояний апомиоглобина от концентрации денатуранта.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ АПОМИОГЛОБИНА.

4.1. Выбор аминокислотных замен для исследований ядра сворачивания апомиоглобина.

4.2. Исследование равновесного процесса разворачивания мутантных форм апомиоглобина.

4.3. Кинетическое исследование процессов сворачивания и разворачивания мутантных форм апомиоглобина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование ядра сворачивания апомиоглобина"

Выяснение механизма спонтанного сворачивания белков является одной из важнейших задач биофизики. Известно, что многие болезни связаны с агрегацией или неправильным сворачиванием белка. Оба этих процесса могут быть следствием замедления скорости сворачивания белка или завязывания боковыми группами белка ненативных контактов в результате мутаций. Чтобы понять, чем определяется быстрое и правильное сворачивание полипептидной цепи в стабильную нативную функционирующую структуру, необходимо изучить влияние отдельных аминокислотных (а/к) остатков на различные стадии сворачивания белка. Путь сворачивания белков проходит через формирование переходных состояний и, в большинстве случаев, через образование наблюдаемых промежуточных состояний. В связи с этим для понимания механизма сворачивания белков необходимо исследование структурных и энергетических характеристик стабильных промежуточных и нестабильных переходных состояний. Однако такое исследование осложняется тем, что формирование ранних промежуточных состояний находится в миллисекундном временном интервале и, зачастую, не может быть измерено экспериментально методом «остановленного потока», хотя присутствие промежуточных состояний оказывает влияние на видимую константу скорости сворачивания белка. Для исследования же структуры переходных состояний необходимо знание скоростей всех этапов сворачивания и разворачивания белка в широком диапазоне концентраций денатуранта. Только в этом случае возможно оценить вклад отдельных остатков в процесс сворачивания белка, в частности, в ядро сворачивания белка, т.е. в структуру белка, образующуюся в переходном состоянии и обеспечивающую последующее быстрое и правильное сворачивание белка в нативную структуру.

Данная диссертационная работа состоит из двух частей. Первая часть работы была посвящена разработке подхода, при помощи которого было бы возможно определять скорости отдельных переходов в белках с тремя состояниями. Целью второй части работы было исследование ядра сворачивания апомиоглобина, имеющего промежуточное состояние на пути сворачивания, которое проводили путем введения точечных замен аминокислотных остатков и изучение влияния данных замен на стабильность белка и скорость его сворачивания.

Диссертационная работа состоит из «Введения», четырех глав, «Заключения», «Выводов» и «Списка цитируемой литературы». Во «Введении» раскрывается актуальность области исследования и дается краткое описание задач исследования. Глава 1 посвящена анализу литературных данных, отражающих современное положение исследований в области сворачивания белка. В главе 2 дано описание используемых материалов и методов. Глава 3 посвящена анализу кинетических данных апомиоглобина и разработке подхода, при помощи которого удалось разделить вклады различных процессов в скорость сворачивания данного белка. Глава 4 посвящена равновесному и кинетическому исследованию мутантных форм апомиоглобина и оценке их вклада в структуру переходного состояния (ядро сворачивания) апомиоглобина. Раздел «Заключение» содержит основные итоги работы. В конце диссертации приведены основные выводы из данной работы и список цитируемой литературы, включающий 148 наименований. Диссертация изложена на 112 страницах, содержит 22 рисунка и 4 таблицы.

Основные результаты диссертационной работы отражены в 16 печатных работах, в том числе 3 статьях в рецензируемых отечественных и международных научных журналах.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Барышникова, Екатерина Николаевна

выводы

1. Разработан метод определения кинетических и термодинамических параметров переходов между нативным, промежуточным и развернутым состояниями для белков, сворачивание и разворачивание которых проходит по двухстадийному механизму.

2. Показано, что мутации в гидрофобном ядре белка сильно дестабилизируют нативное состояние, но практически не сказываются на стабильности промежуточного состояния.

3. Показано, что консервативные нефункциональные а/к остатки образуют мало контактов в переходном состоянии на барьере, разделяющем нативное и промежуточное состояние, и, по-видимому, не входят в ядро сворачивания апомиоглобина на этой стадии, в то время как некоторые неконсервативные а/к остатки (Пе28 и Leu76), образуя более 50% нативных контактов в переходном состоянии, участвуют в формировании ядра сворачивания апомиоглобина при переходе из промежуточного состояния в нативное.

Данная работа выполнена в лаборатории физики белка Института белка РАН.

Выражаю глубокую и искреннюю благодарность моему научному руководителю Валентине Егоровне Бычковой за огромный опыт и знания, которые она мне передала, доброжелательность и терпение, сопровождавшие всю мою работу.

Хочу поблагодарить Кашпарова Ивана Андреевича и Ильину Нелли Борисовну за помощь, оказанную в процессе освоения методик экспрессии и выделения белка, Тиктопуло Елизавету Игнатьевну за помощь в измерениях микрокалориметрии и обработке полученных данных.

Большое спасибо Балобанову Виталию Александровичу за неоценимую помощь в проведении и обсуждении экспериментов по равновесному разворачиванию белков.

Особая благодарность Финкельштейну Алексею Витальевичу и Семисотнову Геннадию Васильевичу за неоднократные обсуждения моей работы и ценные советы.

Я очень признательна Мельнику Богдану Степановичу за постоянную поддержку, помощь и внимание к моей работе.

И, конечно, я очень благодарна всем сотрудникам лаборатории физики белка Института белка РАН, без участия, внимания и понимания которых работа бы не состоялась.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Оценка энергетических параметров равновесных и кинетических процессов сворачивания/разворачивания белковой молекулы позволяет выявить наиболее дестабилизирующие мутации и мутации, замедляющие процесс сворачивания белка. Получение такой информации является важным для выявления конформационных изменений в структуре белков, приводящих к агрегационным образованиям, и для разработки подходов к конструированию лекарственных средств, предотвращающих формирование амилоидных депозитов.

Данная диссертационная работа посвящена исследованию белка апомиоглобина, а также выявлению аминокислотных остатков, замена которых сильно влияет на его стабильность и скорость сворачивания. Апомиоглобин принадлежит к белкам, сворачивающимся через образование промежуточного состояния. Оценка энергетических параметров сворачивания/разворачивания таких белков затруднена тем, что измеряемые на практике скорости являются эффективными, тогда как необходимо знать скорости, относящиеся к переходу между двумя отдельно взятыми состояниями.

Для решения данной задачи нами был разработан метод анализа кинетических данных для двухстадийных белков. Метод позволяет разделить вклады различных состояний в кинетику процесса сворачивания белка и изучать структуру переходного состояния на пути сворачивания таких белков при помощи точечного мутагенеза. Показана возможность оценки кинетических и энергетических параметров для случаев с не полностью завершенными переходами U<-*N.

Использование этого подхода для исследования сворачивания и разворачивания апомиоглобина позволило найти аминокислотные остатки, ответственные за его стабильность и скорость сворачивания в нативную структуру. Впервые получена зависимость доли кинетического промежуточного состояния, формирующегося в процессе сворачивания апомиоглобина, от концентрации денатуранта. Это позволило разделить вклады различных состояний в кинетику процесса сворачивания апомиоглобина. Показано, что в ядро сворачивания апомиоглобина в переходе из промежуточного в нативное состояние входят аминокислотные остатки, расположенные в В и Е спиралях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Барышникова, Екатерина Николаевна, Пущино

1. Болотина И.А. 1987. Определение вторичной структуры белков из спектров кругового дихроизма. Вторичная структура белков в состоянии "расплавленной глобулы". // Молекуляр. биология. Т.21. С.1625-1635.

2. Бурштейн Э.А. 1977. Итоги науки и техники. // Биофизика. Т.7. С. 1-187.

3. Векшин Н.Л. 1998. Фотоника биологических структур. // Пущино: Изд. НЦБИ.

4. Гловер Д. 1988. Клонирование ДНК. Методы. // Изд. "Мир" Москва. С. 140167.

5. Барышникова Е.Н., Шарапов М.Г., Кашпаров И.А., Ильина Н.Б., Бычкова В.Е. 2005. Изучение стабильности апомиоглобина в зависимости от мочевины и температуры при двух значениях рН. // Молекуляр. Биология. Т.39. С.292-297.

6. Котова Н.В, Семисотнов Г.В. 1998. Сворачивание глобулярных белков in vivo. II Успехи биологической химии. Т.38. С. 199-223

7. Лакович Дж. 1986. Основы флуоресцентной спектроскопии. // Изд. "Мир". Москва.

8. Птицын О.Б. 1973. Стадийный механизм самоорганизации белковых молекул. //Докл. Акад. Наук СССР. Т.210. С. 1213-1215.

9. Пфайль В. 1998. Стабильность и кооперативные свойства частично свернутых белков. // Биохимия. Т.63. С.349-359.

10. Родионова Н.А., Семисотнов Г.В., Кутышенко В.П., Уверский В.Н., Болотина И.А. Бычкова В.Е., Птицын О.Б. 1989. Стадийность равновесного разворачивания карбоксиангидразы В сильными денатурантами. // Молекуляр. Биология. Т.23. С.683-692.

11. Финкелыптейн А.В., Бадретдинов А.Я. 1997. Физические причины быстрой самоорганизации стабильной пространственной структуры белков: решение парадокса Левинталя. // Молекуляр. Биология. Т.31. С.469-477.

12. Abkevich V.I., Gutin A.M., and Shakhnovich E.I. 1994. Specific nucleus as the transition state for protein folding: evidence from the lattice model. // Biochemistry. V.33. P.10026-10036.

13. Aim E., and Baker D. 1999. Prediction of protein-folding mechanisms from free-energy landscapes derived from native structures. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. V.96. P.l 1305-11310.

14. Anfinsen C.B. 1973. Principles that govern the folding of protein chains // Science. V.181. P.223-230.

15. Baker D.A. 2000. Surprising simplicity to protein folding//Nature. V.405. P.39-42.

16. Baldwin, R.L. 1996. On-pathway versus off-pathway folding intermediates. // Fold. Des. V.l. P.R1-R8.

17. Barrick D., and Baldwin R.L. 1993. The molten globule intermediate of apomyoglobin and the process of protein folding. // Protein Sci. V.2. P.869-876.

18. Baum J., Dobson C.M., Evans P.A., and Hanly C. 1989. Characterization of a partly folded protein by NMR methods: studies on the molten globule state of guinea pig a-lactalbumin. // Biochemistry. V.28. P.7-13.

19. Brahms S., and Brahms J. 1980. Determination of protein secondary structure in solution by vacuum ultraviolet circular dichroism. // J. Mol. Biol. P. 138.

20. Burns L.L. Dalessio P.M. and Ropson I.J. 1998. Folding mechanism of three structurally similar beta-sheet proteins. // Proteins. V.33. P.107-118.

21. Burton R.E., Huang G.S., Daugherty M.A., Calderoni T.L., and Oas T.G. 1997. The energy landscape of a fast-folding protein mapped by Ala—>Gly substitutions. // Nature Struct. Biol. V.4. P.305-310.

22. Bychkova V.E., and Ptitsyn O.B. 1993. The molten globule in vitro and in vivo. H Chemtracts: Biochem. Mol. Biol. V.4. P.133-163.

23. Bychkova V.E., and Ptitsyn O.B. 1993. The state of unfolded globules of protein molecules is more quickly becoming a rule, rather then an exception. // Biophysics. V.38. P. 58-66.

24. Cavagnero S., Dyson H.J., and Wright P.E. 1999. Effect of H helix destabilizing mutations on the kinetic and equilibrium folding of apomyoglobin. // J. Mol. Biol. V.285. P.269-282.

25. Cavagnero S., Nishimura Ch., Schwarzinger St., Dyson, H.J., and Wright P.E. 2001. Conformational and dynamic characterization of the molten globule state of an apomyoglobin mutant with the altered folding pathway. // Biochemistry. V.40. P.14459-14467.

26. Chaffotte A.F., Cuigarro J.I., Guillon Y. Delepierre M., and Goldberg M.E. 1997. The "premolten globule", a new intermediate in protein folding. // J. Protein Chem. V.16. P.433-439.

27. Chiti F„ Taddei N„ White P., Bucciantini M., Magherini F., Stefani M., and Dobson C. 1999. Mutational analysis of acylphosphatase suggests the importance of topology and contact order in protein folding. // Nature Struct. Biol. V.6. P. 1005-1009.

28. Clarke A.R., and Waltho J.P. 1997. Protein folding pathways and intermediates. // Curr. Opin. Biotechnol. V.8. P.400-410.

29. Clementi С., Jennings P.A., and Onuchic J.N. 2000. How native-state topology affects the folding of dihydrofolate reductase and interleukin-lbeta. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. V.97. P.5871-5876.

30. Cocco M.J., and Lecomte J.T. 1996. The native state of apomyoglobin described by proton NMR spectroscopy: the A-B-G-H interface of wild-type sperm whale apomyoglobin. // Proteins. V.25. P.267-285.

31. Creighton Т.Е. 1994. The protein folding problem: In Mechanisms of Protein Folding: Frontiers in Molecular Biology. // Edited by Pain R.H., NY, Oxford University Press. P. 1-25.

32. Dill K.A., and Chan H.S. 1997. From Levinthal to pathways to funnels. // Nature Struct. Biol. V.4. P.10-19.

33. Dobson C.M., and Karplus M. 1999. The fundamentals of protein folding: bringing together theory and experiment. // Curr. Opin. Struct. Biol. V.9. P.92-101.

34. Dolgikh D.A., Kolomiets A.P., Bolotina I.A., and Ptitsyn O.B. 1984. "Molten-globule" state accumulates in carbonic anhydrase folding. // FEBS Lett. V.165. P.88-92.

35. Dolgikh D.A., Gilmanshin R.I., Brazhnikov E.V., Bychkova V.E., Semisotnov G.V., Venyaminov S.Yu., and Ptitsyn O.B. 1981. a-lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure? // FEBS Lett. V.136. P.311-315.

36. Baryshnikova E.N., Melnik B.S., Finkelstein A.V., Semisotnov G.V., and Bychkova V.E. 2005. Three-state protein folding: experimental determination of free-energy profile. // Protein Sci. V.14. P.2658-2667.

37. Eliezer D., and Wright P.E. 1996. Is apomyoglobin a molten globule? Structural characterization by NMR. // J. Mol. Biol. V.263. P.531-538.

38. Ellis R.L. and Hartl F.U. 1999. Principles of protein folding in the cellular environment//Curr. Opin. Struct. Biol. V.9. P.102-110.

39. Elove G.A., Bhuyan A.K., and Roder H. 1994. Kinetic mechanism of cytochrome с V folding: involvement of the heme and its ligands. // Biochemistry. V.33. P.6925-6935.

40. Fersht A.R. 2000. Structure and Mechanism in Protein Science. // 3nd ed. W.H.Freeman & Co. Press, NY.

41. Fersht A.R. 1995. Characterizing transition states in protein folding: an essential step in the puzzle. // Curr. Opin. Struct. Biol. V.5. P.79-84.

42. Fersht A.R. 1997. Nucleation mechanisms in protein folding. // Curr. Opin. Struct. Biol. V.7. P.3-9

43. Fersht A.R., and Dagget V. 2002. Protein folding and unfolding at atomic resolution. // Cell. V.108. P.l-20.

44. Fersht A.R., Matouschek A., and Serrano L. 1992. The folding of an enzyme. I. Theory of protein engineering analysis of stability and pathway of protein folding. // J. Mol. Biol. V.224. P.771-782.

45. Finkelstein A.V., and Badretdinov A.Ya. 1997. Rate of protein folding near the point of thermodynamic equilibrium between the coil and the most stable chain fold. // Fold. Design. V.2. P. 115-121.

46. Fulton K., Main E., Daggett V., and Jackson S. 1999. Mapping the interactions present in the transition state for unfolding/folding of FKBP12. // J. Mol. Biol. V.291.1. P.445-461.

47. Galzitskaya O.V., and Finkelstein A.V. 1999. A theoretical search for folding/unfolding nuclei in three-dimensional protein structures. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. V.96. P.l 1299-11304.

48. Galzitskaya O.V., and Finkelstein A.V. 1995. Folding of chains with random and edited sequences: similarities and differences. // Protein Eng. V.8. P.883-892.

49. Galzitskaya O.V., Skoogarev A.V., Ivankov D.N. and Finkelstein A.V. 1999. Folding nuclei in 3D protein structures. // Proceedings of the Pacific Symposium on Biocomputong'2000. Singapore-New Jersey-London-Hong Kong: World Scientific. P.131-142.

50. Garcia C., Nishimura Ch., Cavagnero S., Dyson H.J. and Wright P.E. 2000. Changes in the apomyoglobin pathway caused by mutation in the distal histidine residue. // Biochemistry. V.39. P.l 1227-11237.

51. Gast K., Damaschun H„ Muller-Frohne M., Zirwer D. and Damaschun G. 1994. Compactness of protein molten globules: temperature-induced structural changes of the apomyoglobin folding intermediate. // Eur. Biophys. J. V.23. P.297-306.

52. Goldberg M.E., Semisotnov G.V., Friguet В., Kuwajima K„ Ptitsyn O.B. and Sugai S. 1990. An early immunoreactive folding intermediate of the tryptophan synthase 02 -subunit is a «molten globule». // FEBS Lett. V.263. P.51-59.

53. Goldenberg D.P., Creighton Т.Е. 1983. Circular and circularly permuted forms of bovine pancreatic trypsin inhibitor//J. Mol. Biol. V.165. P.407-413.

54. Grantcharova V.P., Riddle D.S., Santiago J.V., Baker D. 1998. Important role of hydrogen bonds in the structurally polarized transition state for folding of the src SH3 domain. //Nature Struct. Biol. V.5. P.714-720.

55. Griko Y.V., and Privalov P.L. 1994. Thermodynamic puzzle of apomyoglobin unfolding. //J. Mol. Biol. V.235. P. 1318-1325.

56. Griko Y.V., Privalov P.L., Veniaminov V.P., and Kutyshenko V.P. 1988. Thermodynamic study of the apomyoglobin structure. // J. Mol. Biol. V.202. P.27-35.

57. Gutin A.M., Abkevich V.I., and Shakhnovich E.I. 1996. Chain Length Scaling of Protein Folding Time. // Phys. Rev. Lett. V.77. P.5433-5436.

58. Gutin A.M. Abkevich V.I., and Shakhnovich E.I. 1995. Is burst hydrophobic collapse necessary for protein folding? // Biochemistry. V.34. P.3066-3076.

59. Hargrove M. S., Krzywda S., Wilkinson A. J., Dou Y., Ikeda-Saito M., and Olson J.S. 1994. Stability of myoglobin: a model for the folding of heme proteins. // Biochemistry. V.33. P.l 1767-11775.

60. Hughson F.M. and Baldwin R.L. 1989. Use of site-directed mutagenesis to destabilize native apomyoglobin relative to folding intermediates. // Biochemistry V.28. P.4415-4422.

61. Hughson F.M., Wright P.E., and Baldwin R.L. 1990. Structural characterization of a partly folded apomyoglobin intermediate. // Science. V.249. P.l544-1551.

62. Jackson S.E. 1998. How do small single-domain proteins fold? // Fold. Design. V.3. P.R81-R91.

63. Jackson S.E., and Fersht A.R. 1991. Folding of chymotrypsin inhibitor 2. Evidence for a two-state transition. // Biochemistry. V.30. P.10428-10435.

64. Jaenicke L. 1974. A rapid micromethod for the determination of nitrogen and phosphate in biological material. // Anal. Biochem. V.61. P.623-627.

65. Jamin M., Antalik M., Loh S.N., Bolen D.W., and Baldwin R.L. 2000. The unfolding enthalpy of the pH 4 molten globule of apomyoglobin measured by isothermal titration calorimetrv. // Protein Sci. V.9. P. 1340-1346.

66. Jamin M., and Baldwin R.L. 1998. Two forms of the pH 4 folding intermediate of apomyoglobin. // J. Mol. Biol. V.276, P.491-504.

67. Jamin M., Yeh S.-R., Rousseau D.L., and Baldwin R.L. 1999. Submillisecond unfolding kinetics of apomyoglobin and its pH 4 intermediate. // J. Mol. Biol. V.292. P.731-740.

68. Jeffrey К., Pace C. and Scholtz J. 1995. Denaturant m values and heat capacity changes: Relation to changes in accessible surface areas of protein unfolding. // Protein Sci. V.4. P.2138-2148.

69. Jennings P.A. and Wright P.E. 1993. Formation of a molten globule intermediate early in the kinetic folding pathway of apomyoglobin. // Science. V.262. P.292-398.

70. Jennings P.A., Stone M.J., and Wright P.E. 1995. Overexpression of myoglobin and assignment of the amid, Ca and C(3 resonances. // J. Biomol. NMR. V.6. P.271-276.

71. Kay M.S., and Baldwin R.L. 1996. Packing interactions in apomyoglobin folding intermediate. //Nature Struct. Biol. V.3. P.439-445.

72. Kiefhaber T. 1995. Kinetic traps in lysozyme folding // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. V.92. P.9029-9033.

73. Kim P.S., and Baldwin R.L. 1990. Intermediates in the folding reactions of small proteins. // Annu. Rev. Biochem. V.59. P. 631-666.

74. Kragelund B.B., Robinson C.V., Knudsen J., Dobson C.M., and Poulsen F.M. 1995. Folding of a four-helix bundle: studies of acyl-coenzyme A binding protein. // Biochemistry. V.34. P.7217-7224.

75. Kuwajima K., Nitta K., Yoneyama M., and Sugai S. 1976. Three-state denaturation of alpha-lactalbumin by guanidine hydrochloride. // J. Mol. Biol. V.106. P.359-379.

76. Laurents D.V., Corrales S., Elias-Arnanz M., Sevilla P., Rico M., and Padmanabhan S. 2000. Folding kinetics of phage 434 Cro protein. // Biochemistry. V.39. P.13963-13973.

77. Lecomte J.T., Sukits S.F., Bhattacharya S., and Falzone C.J. 1999. Conformational properties of native sperm whale apomyoglobin in solution. // Protein Sci. V.8. P. 14841491.

78. Levinthal C. 1968. Are there pathways for protein folding? // J. Chim. Phys. V.65. P.44-45.

79. Li L., Mirny L.A., and Shakhnovich E.I. 2000. Kinetics, thermodynamics and evolution of non-native interactions in a protein folding nucleus. // Nature Struct. Biol. V.7. P.336-342.

80. Lopez-Hernandez E., Serrano L. Structure of the transition state for folding of the 129 aa protein CheY resembles that of a smaller protein, CI-2. // Fold. Design. 1996. V.l. P.43-55.

81. Luo Y„ Kay M.S., Baldwin R.L. 1997. Cooperativity of folding of the apomyoglobin pH 4 intermediate studied by glycine and proline mutations. // Nature Struct. Biol. V.4. P.925-930.

82. Martinez J.C., Serrano L. 1999. The folding transition state between SH3 domainsis conformationally restricted and evolutionarily conserved. // Nature Struct. Biol. V.6. P.l 010-1016.

83. Matouschek A., Kellis J.T., Jr., Serrano L„ and Fersht A.R. 1990. Transient folding intermediates characterized by protein engineering. // Nature. V.346. P.440-445.

84. Matouschek A., Kellis J.T., Jr., Serrano L., and Fersht A.R. 1989. Mapping the transition state and pathway of protein folding by protein engineering. // Nature. V.340. P.122-126.

85. Merrifield R.B. 1965. Automated synthesis of peptides. // Science. V.150. P.178-185.

86. Mirny L.A. and Shakhnovich E.l. 1999. Universally conserved positions in protein folds: reading evolutionary signals about stability, folding kinetics and function. // J. Mol. Biol. V.291. P.177-196.

87. Mun5z V., and Eaton W.A. 1999. A simple model for calculating the kinetics of protein folding from three-dimensional structures. // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. V.96. P.l1311-11316.

88. Munoz V., Lopez E.M., Jager M., and Serrano L. 1994. Kinetic characterization of the chemotactic protein from Escherichia coli, CheY. Kinetic analysis of the inverse hydrophobic effect. // Biochemistry. V.33. P.5858-5866

89. Myers J.K., Pace C.N., and Scholtz J.M. 1995. Denaturant m values and heat capacity changes: Relation to changes in accessible surface areas of protein unfolding. // Protein Sci. V.4. P.2138-2148.

90. Nail B.T. 1994. Proline isomerization as a rate limiting step in mechanisms of protein folding: Frontiers in Molecular Biology. // Edited by Pain R.H. NY. Oxford University Press. P. 80-103

91. Nishimura С., Dyson H.J., and Wright P.E. 2002. The apomyoglobin folding pathway revisited: structural heterogeneity in the kinetic burst phase intermediate. // J. Mol. Biol. V.322. P.483-489.

92. Nishimura C. Prytilla S„ Dyson H.J., and Wright P.E. 2000. Conservation of folding pathways in evolutionarily distant globin sequences. // Nature Struct. Biol. V.7. P.679-86.

93. Nolting В., and Andret K. 2000. Mechanism of protein folding. // Proteins. V.41. P.288-298.

94. Odefey C., Mayr L.M., and Schmid F.X. 1995. Non-prolyl cys-trans peptide bond isomerization as a rate-determing step in protein unfolding and refolding. // J.Mol.Biol. V.245. P.69-78

95. Onuchic J.N., Socci N.D., Luthey-Schulten Z„ and Wolynes P.G. 1996. Protein folding funnels: the nature of the transition state ensemble. // Fold. Design. V.l. P.441-450.

96. Otzen D.E., and Fersht A.R. 1998. Folding of circular and permuted chymotrvpsin inhibitor 2. // Biochemistry. V.37. P.8139-8146.

97. Otzen D.E., Kristensen O., Proctor M., and Oliveberg M. 1999. Structural changes in the transition state of protein folding: alternative interpretations of curved chevron plots. // Biochemistry. V.38. P.6499-6511.

98. Pace C.N. 1986. Determination and analysis of urea and guanidine hydrochloride denaturation curves. // Methods Enzymol. V.131. P.266-280.

99. Pace C.N., Laurents D.V., and Thomson J.A. 1990. pH dependence of the urea and guanidine hydrochloride denaturation of ribonuclease A and ribonuclease Tl. // Biochemistry. V.29. P.2564-2572.

100. Pande V.S., Grosberg A.Yu., Tanaca Т., and Rokhasar D.S. 1998. Pathways for protein folding. // Curr. Opin. Struct. Biol. V.8. P.68-79.

101. Pande V.S., and Rocksar D.S. 1999. Folding pathway of a lattice model for proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. V.96. P.1273-1278.

102. Parker M.J., Dempsey C.E, Lorch M., and Clarke A.R. 1997. Acquisition of native beta-strand topology during the rapid collapse phase of protein folding. // Biochemistry. V.36. P. 13396-13405.

103. Parker M.J., Spencer J., and Clarke A.R. 1995. An integrated kinetic analysis of intermediates and transition states in protein folding reactions. // J. Mol. Biol. V.253. P.771-786.

104. Parker M.J., and Marqusee S. 1999. The cooperativity of burst phase reactions explored. //J. Mol. Biol. V.293. P.l 195-1210

105. Perl D., Welker Ch., Schindler T, Schroder K„ Marahiel M.A., Jaenicke R., and Schmid F.X. 1998. Conservation of rapid two-state folding in mesophilic, thermophilic and hyperthermophilic cold shock proteins. // Nature Struc. Biol. V.5. P.229-235.

106. Permyakov E.A. 1993. Luminescence spectroscopy of Proteins. // CRC Press. London. Tokyo.

107. Phillips C.M., Mizutani Y. and Hochstrasser R.M. 1995. Ultrafast thermally induced unfolding of RNase A. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. V.92. P.7292-7296.

108. Plaxco K.W., Larson S„ Ruczinski I., Riddle D.S., Thayer E.C., Buchwitz В., Davidson A.R., and Baker D. 2000. Evolutionary conservation in protein folding kinetics. // J.Mol.Biol. V.298. P.303-312.

109. Plaxo K.W., Simons K.T., and Baker D. 1998. Contact order, transition state placement and the refolding rates of single domain proteins. // J. Mol. Biol. V.277. P.985-994.

110. Plotkin S.S. and Onuchic J.N. 2000. Investigation of routes and funnels in protein folding by free energy functional methods. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. V.97. P.6509-6514.

111. Privalov P.L. 1982. Stability of proteins. Proteins which do not present a single cooperative system. // Adv. Protein Chem. V.35. P. 1-104.

112. Privalov P.L. 1992. Physical basis of the folded conformations of protein. // Protein Folding, Ed. Т. E. Creighton, NY, Freeman P. 83-126.

113. Privalov P.L. 1979. Stability of proteins. Small globular proteins. // Adv. Protein 'V Chem. V.33. P. 167-241.

114. Ptitsyn O.B. and Ting K-L.H. 1999. Non- functional conserved residues in globins and their possible role as a folding nucleus. // J. Mol. Biol. V.291. P.671-677.

115. Ptitsyn O.B. 1995. Molten globule and protein folding. // Adv. Protein Chem. V.47. P.83-229.

116. Ptitsyn O.B. 1998. Protein folding and protein evolution: common folding nucleus in different subfamilies of c-type cytochromes. // J.Mol.Biol. V.278. P.655-666.

117. Riddle D.S., Grantcharova V.P., Santiago J.V., Aim E., Ruczinski I., and Baker D. 1999. Experiment and theory highlight role of native state topology in SH3 folding.г

118. Nature. Struct. Biol. V.6. P.l016-1024.

119. Roder H., and Colon W. 1997. Kinetic role of early intermediate in protein folding // Curr. Opin. Struct. Biol. V.7. P. 15-28.

120. Santoro. M.M. and Bolen, D.W. 1988. Unfolding free energy changes determined by the linear extrapolation method. 1. Unfolding of phenylmethanesulfonyl alpha-chymotrypsin using different denaturants. // Biochemistry V.27. P.8063-8068.

121. Schreiber, G., and Fersht, A.R. 1993. The refolding of cis- and trans-peptidylprolyl isomers of barstar. // Biochemistry. V.32 P.l 1195-11203.

122. Semisotnov G.V., Rodionova N.A., Kutyshenko V.P., Ebert В., Blanc J. and Ptitsyn O.B. 1987. Sequential mechanism of refolding of carbonic anhydrase B. // FEBS Lett. V.223. P.9-13.

123. Shakhnovich E., Abkevich V., and Ptitsyn O. 1996. Conserved residues and the mechanism of protein folding. // Nature. V.379. P.96-98.

124. Shastry M.C.R. and Roder H. 1998. Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale. // Nature Struct. Biol. V.5. P.385-92.

125. Shoemaker B.A., Wang J., and Wolynes P.G. 1999. Exploring structures in protein folding funnels with free energy functional: the transition state ensemble. // J. Mol. Biol. V.287. P.675-694.

126. Shoemaker B.A., and Wolynes P.G. 1999. Exploring structures in protein folding funnels with free energy functionals: the denatured ensemble. // J. Mol. Biol. V.287. P.657-674.

127. Sosnick T.R. Mayne L., Hiller R., and Englander S.W. 1994. The barriers in protein folding // Nature Stract. Biol. V.l. P. 149-156.

128. Sosnick T.R., Shtilerman M.D., Mayne L., and Englander S.W. 1997. Ultra fast signals in protein folding and the polypeptide contracted state. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. V.5. P.8545-8550.

129. Steensma E., and van Mierlo C.P.M. 1998. Structural characterization of apoflavodoxin shows that the location of the stable nucleus differs among proteins with a flavodoxin-like topology. // J. Mol. Biol. V.282. P.653-666.

130. Tanford C. 1968. Protein denaturation. // Adv. Protein Chem. V.23. P. 121-282.

131. Tang, K.S, Guralnick, B.J., Wang, W.K., Fersht, A.R., and Itzhaki, L.S. 1999. Stability and folding of the tumour suppressor protein pi6. // J. Mol. Biol. V.285. P.1869-1886.

132. Tcherkasskaya O., and Ptitsyn O.B. 1999. Direct energy transfer to study the 3D structure of non-native proteins: AGH complex in molten globule state of apomyoglobin. // Protein Eng. V.12. P.485-490.

133. Ternstorm Т., Mayor U. Akke M„ and Oliveberg M. 1999. From snapshot to movie: Ф-analysis of protein folding transition states taken one step further. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. V.96. P.14854-14859.

134. Tsong T.Y. Baldwin R.L. and McPhie P.A. 1972. Sequential model of nucleation-dependent protein folding kinetic studies of ribonuclease A. // J. Mol. Biol. V.63. P.453-469

135. Tsui V., Garcia C., Cavagnero S„ Siuzdak G„ Dyson H.J., and Wright P.E. 1999. Quench-flow experiments combined with mass spectrometry show apomyoglobin folds through an obligatory intermediate. // Protein Sci. V.8. P.45-49.

136. Uversky V.N., and Ptitsyn O.B. 1996. Further evidence on the equilibrium "pre-molten-globule state": four state guanidinium chloride - induced unfolding of carbonic anhydrase В at low temperature. // J. Mol. Biol. V.255. P.215 - 228.

137. Vanhove M„ Raquet X., Palzkill Т., Pain R.H. and Frere J.M. 1996. The rate-limiting step in the folding of the cis-Pro 167Thr mutant of Tem-ip lactamase in the trans to cis isomerization of a non-prolyne peptide bond. // Proteins. V.25. P.104-111.

138. Viguera A.R., Serrano L., and Wilmanns M. 1996. Different folding transition states may result in the same native structure. // Nature Struct. Biol. V.3. P.874-880.

139. Villegas V., Martinez J.C., Aviles F.X., and Serrano L. 1998. Structure of the transition state in the folding process of human procarboxypeptidase A2 activation domain. //J. Mol. Biol. V. 83. P. 1027-1036.

140. Weissman J.S., and Kim P.S. 1992. Kinetic role of the normative intermediates in the folding of BPTI. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. V.89. P.9900-9904.

141. Wolynes P.G. 1997. Folding funnels and energy landscapes of larger proteins within the capillarity approximation. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. V.94. P.6170-6175.

142. Wrabl J., and Shortle D. 1999. A model of the changes in denatured state structure underlying m value effects in staphylococcal nuclease. // Nature Struct. Biol. V.6.1. P.876-883.