Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительный анализ структуры комплекса Гольджи в клетках эукариот разных систематических групп
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология
Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ структуры комплекса Гольджи в клетках эукариот разных систематических групп"
На правах рукописи
Ирина Сергеевна
СЕСОРОВА
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСА^ГОЛЬДЖИ
В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ РАЗНЫХ СИСТЕМАТИЧЕСКИХ ГРУПП
03.03.04. - Клеточная биология, цитология, гистология 14.03.01 - Анатомия человека
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
005536122
3 1 ОКТ 2013
Санкт-Петербург - 2013
005536122
Работа выполнена на кафедре анатомии человека в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ивановская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Научные консультанты:
доктор медицинских наук,
член-корреспондент РАМН, профессор Банин Виктор Васильевич
доктор медицинских наук,
профессор Миронов Александр Александрович
Официальные оппоненты: Снигиревская Екатерина Сергеевна,
доктор биологических наук, ФГБУН «Институт цитологии Российской академии наук», группа ультраструктуры клеточных мембран, ведущий научный сотрудник
Алиева Ирина Борисовна,
доктор биологических наук, профессор, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», отдел электронной микроскопии, ведущий научный сотрудник
Баженов Дмитрий Васильевич,
доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН, профессор, ГБОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра анатомии человека, заведующий
Ведущая организация — государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Защита состоится «28» ноября 2013 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 208.087.01 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 194100, Санкт-Петербург, ул. Литовская, д. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО СПбГПМА Минздравсоцразвития России по адресу: 194100, Санкт-Петербург, ул. Кантемировская, д. 16.
Автореферат разослан «Л4" » октября 2013 г.
Кульбах Ольга Станиславовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность научного исследования
Система внутриклеточного транспорта, объединяющая взаимосвязанные процессы экзо- и эндоцитоза, обеспечивает одну из важнейших функций клетки - взаимодействие с окружающей средой, поэтому анализ собственно цитологических механизмов ее реализации и, как следствие, поиск возможных способов воздействия является актуальной проблемой цитологии, молекулярной и клеточной биологии. Ключевым участником внутриклеточного транспорта является комплекс Гольджи (КГ) - мембранная органелла, осуществляющая посттрансляционную модификацию белков и липидов, сортировку молекул, их концентрирование, упаковку и отправку к месту назначения.
Через КГ транспортируется большое количество различных молекул, встраивающихся в структуры тканей и органов и определяющих, в том числе, их функциональную микроанатомию. Так, строение большинства органов зависит от секреции коллагена и ряда внеклеточных белков, включая белки базальной мембраны. Синтез и секреция антител, транспортируемых через КГ, влияет на особенности строения лимфоидных органов и функционирование иммунной системы в целом. Образование синаптических везикул с последующей их доставкой в аксоны и образованием синапсов, во многом определяет микроанатомическую организацию мозга и других органов нервной системы. Наконец, образование новых сосудов (васкуло- и ангиогенез) также во многом зависит от функции КГ в эндотелиальных клетках, так как для формирования почек роста сосудов требуется доставка на плазматическую мембрану (ПМ) рецепторов факторов роста, что происходит при обязательном участии органеллы.
Поэтому изучение механизмов перемещения веществ через КГ открывает новые перспективы в медицине, сельском хозяйстве и других областях: дает возможность начать целенаправленный поиск лекарственных препаратов для лечения заболеваний, в основе которых лежат нарушения модификации и транспорта белков (Миронов А. А., 1998; Банин В. В., 1999) и моделировать тест-системы для их оценки; позволяет разрабатывать новые методы борьбы с возбудителями заболеваний человека и животных, способы стимуляции роста и созревания плодов, защиты растений от неблагоприятных факторов среды (Uknes S. et al., 1992); поможет понять механизмы «строительства» органов и их систем из клеток и внеклеточного матрикса.
Структура КГ традиционно представляется в виде диктиосомы - стопки уплощенных цистерн или мешочков и ассоциированных с ней мелких везикул и секреторных гранул (Griffiths G., 2000). В клетках человека и многоклеточных животных организация КГ достаточно хорошо изучена (Ladin-sky М. et al., 1999, 2002; Trucco A. et al., 2004). В клетках растений так же, как и животных, КГ описывается в виде диктиосомы. Однако эволюционные
группы, давшие начало современным растительным и животным организмам, рано обособились в процессе эволюции и имеют свои существенные характеристики генома, что может определять особенности строения органеллы.
Несмотря на то, что наличие диктиосомы КГ признается одной из характеристик эукариотических клеток (Dacks J. et al., 2007), существуют организмы, среди которых немало известных паразитических видов, в клетках которых мембраны с функциями КГ не формируют диктиосому (Mowbrey К. et al., 2009). Понимание причин вариаций морфологии КГ и их связи с особенностями секреции в клетках таких организмов может быть полезным в решении ряда спорных вопросов о механизмах транспорта через органеллу.
КГ, несмотря на его кажущуюся морфологическую простоту, является сложной в функциональном отношении поляризованной органеллой. В ее «работе» органически сочетаются антероградное перемещение молекул, предназначенных для секреции или экспрессии на клеточной поверхности, и ретроградный возврат собственных, резидентных белков, включая ферменты, в соответствующий компартмент. Выделено и охарактеризовано большое количество молекул, участвующих в этих процессах, все более понятной становится, их конкретное участие в регуляции функций органеллы. Однако идентификация всех белков-участников не решила главный вопрос: как происходит процесс перемещения белков и липидов через чрезвычайно сложно устроенный КГ.
Именно поэтому при обилии огромного фактического материала не кажется парадоксальным отсутствие согласованного мнения о конкретных цитологических механизмах, обеспечивающих перенос молекул между ком-партментами КГ и тех мембранных преобразованиях, которые и определяют, собственно, эти механизмы. Причина нам видится в том, что в течение многих лет обсуждались, в основном, две модели транспорта через органеллу: «везикулярная» и модель так называемого «созревания и прогрессии» цистерн (мешочков) КГ. Другие модели внутриклеточного транспорта практически не рассматривались.
В соответствии с очень популярной «везикулярной» моделью, которая была предложена Дж. Паладе (Palade G., 1975; Farquhar М., Palade G., 1981), но наиболее полно разработана Дж. Ротманом (Rothman G. et al., 1984; Roth-man G., 1994), молекулы карго (модифицируемого продукта) перемещаются от цистерны к цистерне в мелких (50-60 нм) транспортных везикулах. С позиции этой модели сложно объяснить отсутствие в везикулах известных белков, например альбумина и ряда других, а также понять, как транспортируются молекулы, имеющие большие размеры, чем размеры везикулы, например проколлаген I в фибробластах (Leblond С., 1989) или липопротеино-вые агрегаты в гепатоцитах и энтероцитах (Claude А., 1970; Sabesin S., 1977). Исследования последних лет выявили новые факты, которые также не могут быть объяснены «везикулярной» моделью транспорта. В частности, было
доказано, что агрегаты проколлагена I длиной 300 нм и необыкновенной резистентностью к изгибам транспортируются через КГ (Bonfanti L. et al., 1998) с той же скоростью, что и мембранные белки (Mironov A. et al., 2001).
В классическом варианте модели «созревания и прогрессии» цистерн транспортируемый белок, оставаясь в составе цистерн, постепенно передвигается от проксимального г/ис-полюса КГ к дистальному транс-потосу орга-неллы. Такая прогрессия должна сопровождаться возвратом ферментов и других резидентных белков КГ, который, как предполагается, осуществляется везикулами, имеющими COPI-покрытие (Bannyhk S., 1997; Mironov А. et al., 1997; Glick В., 1998). Однако в везикулах, ассоциированных с диктио-сомой (стопкой мешочков), не было выявлено повышенной концентрации ферментов гликозилирования, а также трансмембранных переносчиков моносахаров, химически связанных с нуклеотидами (Orci L. et al., 2000; Kweon H. et al., 2004; Fusella A. et al., 2013).
В последние годы появились доказательства существования непрерывных тубулярных сообщений между цистернами КГ, вследствие чего было высказано предположение о перемещении некоторых транспортируемых белков по этим связям (Marsh В. et al., 2004; Trucco A. et al., 2004). Было предложено сразу несколько новых моделей, одной из которых стала «диффузионная» модель (Patterson G. et al., 2008). Однако и она не объяснила существующие противоречия. Так, например, если для карго, имеющего небольшие размеры и обладающего способностью к диффузии (например, альбумина), существует возможность перемещения по тубулярным сообщениям, то для больших молекул (проколлаген) такой путь невозможен - диаметр трубочек слишком мал для этого. Кроме того, при рассмотрении постоянных тубулярных коммуникаций как основного транспортного пути трудно понять механизм концентрирования растворимых и мембранных белков-карго по мере их продвижения через стопку и поддержания вдоль секреторного пути концентрационных и других градиентов (Mironov A. et al., 2012).
В настоящее время начала активно обсуждаться модель, в которой в качестве базового используется механизм «слияния и последующего разделения» мембран, получившей название kiss-and-run модели (Mironov A. et al., 2008, 2012). Она предполагает, что транспорт растворимых секретируемых белков и мембран через КГ осуществляется с участием тубулярных сообщений, которые временно формируются между компартментами КГ. Образование таких связей дюжет ингибироваться 50-60 нм везикулами, имеющими COPI-покрытие (Fusella A. et al., 2013). Крупные агрегаты белков, которые не могут диффундировать по тонким тубулярным сообщениям между цистернами, видимо, транспортируются согласно асимметричной версии модели «слияния и последующего разделения» компартментов. Эта модель предполагает, что слияние происходит на лидирующей стороне переносчика, содер-
жащего агрегаты белков, а разделение осуществляется на участке, расположенном непосредственно за транспортером (Mironov А. et al., 2012).
Необходимым условием существования данной модели является наличие временных мембранных сообщений между компартментами секреторного пути. Кроме того, должны существовать механизмы концентрации транспортируемых белков по ходу их передвижения через КГ, а также белков SNARE в местах слияния мембран и разделения мембранных соединений. При этом основным противоречием (скорее, камнем преткновения) всех обсуждаемых моделей стало определение роли COPI-зависимых 50-60 нм пузырьков, транспортные функции которых сторонники классических теорий продолжают доказывать.
В решении спорных вопросов, по нашему мнению, помогут новые морфологические подходы в изучении клетки, одним из которых является сравнительная микроанатомия, а также современные методы трехмерной реконструкции клеток и органелл.
Обсуждаемые в настоящее время модели секреторного транспорта в большинстве своем разрабатываются и тестируются на клетках млекопитающих. Однако при использовании в качестве модельных объектов клеток других организмов (растений, паразитических простейших и др.) полученные экспериментальные данные плохо согласуются с предложенными гипотезами. Между тем, учитывая филогенетические исследования последних лет (Klute М. et al., 2011), представляется маловероятным формирование у эука-риот разных механизмов транспорта через КГ. Поэтому если предположить возможность существования некоторого общего механизма транспорта через органеллу во всех клетках, то потребуется верификация обсуждаемых моделей и доказательства универсальности для КГ всех известных эукариот.
Следовательно, для решения спорных вопросов и поиска морфологических доказательств в пользу одной из обсуждаемых моделей транспорта мы сравниваем структуру КГ клеток человека и ряда модельных объектов -типичных представителей систематических групп эукариот со «стопочной» организацией КГ: представителей Высших растений (Embryophyta) и Настоящих животных (Metazoa), тела которых формируются специализированными клетками, имеющими сложную многоступенчатую систему посттрансляционной модификации белков, обеспечивающуюся в том числе и общими классами гликозилтрансфераз (Munro S., 2002; Reiter W., 2002). Для возможности сравнения было важно учесть, насколько изучены те или иные организмы. Поэтому мы взяли представителей с мало известным строением КГ (для доказательства/опровержения существования тех же закономерностей), но из систематических групп, где в какой-то мере уже был проведен анализ строения органеллы (тип Черви, Членистоногие, класс Рыбы, Насекомые). КГ других взятых нами объектов практически не исследован.
КГ в клетках растений, несмотря на стопочную структуру, имеет существенные особенности организации. Поэтому остается непонятной возможность экстраполяции механизмов секреторного транспорта, разработанных на клетках животных, на секреторный путь растительных организмов, имеющих значительные, по сравнению с животными, различия генома.
Кроме того, мы проанализировали строение КГ в клетках, не имеющих «классической» стопки органеллы, обладающих более простой структурой секреторных белков и ограниченным количеством ферментов гликозилиро-вания (Мипго 8. е1 а1., 1995), и также хорошо известным геномом. Мы учитывали доступность материала для электронно-микроскопического изучения.
Таким образом, несмотря на большое количество работ, изучающих секреторный транспорт, не сформировалось единого мнения о механизмах перемещения белков (карго) через КГ. Поэтому сравнительно-морфологический анализ с использованием, в том числе электронно-микроскопической томографии и сканирующей электронной микроскопии на основе детектора обратно рассеянных электронов и внутреннего ультратома, вмонтированного в камеру микроскопа (один из современных методов микроанатомии), представляется достаточно эффективным для изучения моделей внутриклеточного транспорта.
Цель исследования - сравнительный анализ структуры комплекса Гольджи в клетках эукариот для обоснования наиболее адекватной модели внутриклеточного транспорта.
Задачи исследования
1. Выявить и обобщить на основании комплексного морфологического исследования, включающего микроанатомический анализ, особенности строения разных морфологических форм комплекса Гольджи в клетках модельных объектов: а) фибробластов человека и животных основных систематических групп; б) меристематических клетках корня гороха; в) дрожжах БассИаготусез сегеу1х1ае; г) микроспоридиях.
2. Найти морфологические обоснования для одной из моделей внутриклеточного транспорта через комплекс Гольджи:
а) выявить в модельных объектах и охарактеризовать тубулярные сообщения компартментов секреторного пути;
б) проанализировать распределение и возможную роль СОР1-зависимых везикул в структуре комплекса Гольджи клеток эукариот.
3. Проанализировать возможность существования в клетках человека и эукариот разных систематических групп общего принципа организации транспорта белков через комплекс Гольджи:
а) провести сравнительный анализ организации комплекса Гольджи растительных и животных клеток с использованием информационных показателей;
б) проанализировать зависимость структуры комплекса Гольджи в клетках эукариот от систематического положения организма и комплекса молекулярных механизмов, принимающих участие в функционировании органеллы.
4. При использовании результатов сравнительно-морфологического анализа обосновать наиболее вероятную модель транспорта белков через комплекс Гольджи в клетках эукариот.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Основные мембранные компоненты комплекса Гольджи: цистерны (мешочки), тубулы (трубки) и везикулы (сферы) - представляют собой дискретные функциональные единицы органеллы, которые могут быть связаны в единую мембранную структуру.
2. Тубулярные сообщения между компартментами секреторного пути присутствуют во всех модельных объектах и носят непостоянный характер, что соответствует представлениям об организации транспорта через комплекс Гольджи на основании механизма «слияния и последующего разделения» компартментов.
3. СОРЬзависимые мелкие везикулы не являются обязательным компонентом комплекса Гольджи, что исключает их ведущую роль в качестве основного транспортного переносчика.
4. Разработаны морфологические критерии для оценки строения комплекса Гольджи и впервые предложена классификация его фенотипических форм. Доказано, что в клетках эукариот существуют три основных фенотипических формы органеллы: стопочная; с преобладанием единичных мешочков и тубулярная. Каждая из указанных форм может характеризоваться разной выраженностью везикулярного компонента и иметь дискретный или централизованный тип расположения мембранных структур.
5. Строение комплекса Гольджи не зависит от систематического положения организма. Комплекс Гольджи формировался в клетках каждой систематической группы эукариот на основе единых, эволюционно старых молекулярных механизмов, ведущих свое происхождение от последнего единого предка эукариот.
6. Морфологические и информационные показатели подтверждают универсальный план строения и принципы функционирования комплекса Гольджи в клетках человека, животных (фибробласты) и растений (клетки меристемы).
7. Полученные в работе данные подтверждают существование общего принципа организации транспорта белков через комплекс Гольджи в клетках эукариот, который наиболее полно описывается моделью «слияния и последующего разделения» компартментов.
Научная новизна исследования
1. Впервые новые, современные методы электронно-микроскопического анализа, включая трехмерную реконструкцию на основе ЭМ-томографии, адаптированы для сравнительно-микроанатомического анализа структуры комплекса Гольджи. Данный подход впервые используется как способ обоснования модели секреторного транспорта в клетках эукариот.
2. Впервые доказано существование тубулярных соединений между цистернами комплекса Гольджи, как морфологического субстрата модели «слияния и последующего разделения» мембран не только в клетках млекопитающих, но и организмов, находящихся на разных ступенях эволюционной лестницы.
3. Впервые дана детальная количественная характеристика комплекса Гольджи у представителей типов Mollusca (моллюски), Annelida (черви), классов Pisces (рыбы), Amphibia (земноводные), Aves (птицы).
4. Впервые на основании сравнительного анализа доказана ограниченная роль везикул как переносчиков белков и липидов в разных систематических группах эукариот. Показано отсутствие «мегавезикул» не только в культуре ткани, но и в клетках in situ.
5. На основании ряда существенных признаков (локализации органеллы в клетке и степени связности функциональных единиц, состава и выраженности структурных компонентов) выявлены и обоснованы фенотипи-ческие формы строения комплекса Гольджи, которые отражают особенности строения органеллы в клетках эукариот разных систематических групп.
6. Предложена оригинальная морфологическая классификация комплекса Гольджи, способствующая пониманию закономерностей строения и механизмов транспорта через органеллу в клетках представителей разных систематических групп эукариот.
7. На примере комплекса Гольджи некоторых клеток человека, животных и растений впервые использован структурно-информационный анализ в качестве метода сравнительной оценки динамичных клеточных систем, который продемонстрировал универсальность плана строения и единые принципы функционирования органеллы в различных организмах. ,
8. Оригинальным является анализ распространенности разных фенотипиче-ских форм и типов строения комплекса Гольджи и причин их формирования среди систематических групп эукариот на основе предложенной классификации.
9. Впервые получены прямые доказательства того, что в микроспоридиях транспорт через комплекс Гольджи осуществляется посредством механизма «слияние - разъединение («разрыв») мембран.
10. Разработана новая оригинальная гипотеза раннего эволюционного происхождения комплекса Гольджи в клетках эукариот на базе мембранных соединений между предшественником эндоплазматического ретикулюма и плазматической мембраной с участием и ведущей ролью прото-коатомера.
Практическая значимость научного исследования
Полученные результаты:
1) расширяют представление о биологии клеток изученных организмов;
2) способствуют пониманию закономерностей строения комплекса Гольджи в клетках эукариот разных систематических групп;
3) доказывают универсальность организации комплекса Гольджи в клетках эукариот, что позволяет конструировать и тестировать единую модель секреторного транспорта, применимую к клеткам с разными фенотипи-ческими формами строения органеллы;
4) могут использоваться для создания экспериментальных систем для тестирования лекарственных средств; средств воздействия на растения; борьбы с возбудителями болезней животных и другие;
5) способствуют пониманию клеточных механизмов ряда заболеваний, в том числе опухолевого роста, что необходимо для создания эффективных методов лечения, а также оценки возможных и наблюдаемых эффектов применения лекарственных средств;
6) способствуют решению ключевых вопросов филогении клетки.
Примененные в работе методические подходы, в том числе микроанатомический анализ, составляют новое направление в клеточной биологии и могут быть использованы для дальнейшего изучения морфологической организации транспортных путей эукариотических клеток.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедрах биологии и экологии и гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО «Ивановская медицинская академия» Минздрава России; экологии и безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВПО «Шуйский государственный университет»; экологии и зоологии Мелитопольского государственного педагогического университета им. Б. Хмельницкого; ботаники и зоологии ГБОУ ВПО «Ивановский государственный университет»; паразитологии имени академика РАСХН Ю.Ф. Петрова и селекции, ботаники и экологии ФГБОУ ВПО «Ивановская государственная сельскохозяйственная академия имени академика Д. К. Беляева»; ботаники и экологии растений, экологии и зоологии ФГБОУ ВПО «Балтийский федеральный университет имени Иммануила
Канта»; кафедре экологии ФГБОУ ВПО «Владимирский государственный университет имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых».
Личный вклад автора
Автор принимал самое непосредственное участие в определении направления исследований, выборе темы, постановке цели, определении задач, в разработке новых методических и экспериментальных подходов, проведении научного поиска, обработке, анализе и интерпретации результатов. Некоторые наблюдения и их интерпретация были осуществлены совместно с другими исследователями, что подробно указано в тексте работы и документировано совместными публикациями. В частности, образцы микроспоридий были подготовлены с участием канд. биол. наук Е. В. Селиверстовой и канд. биол. наук В. В. Долгих. Подготовка и съемка части образцов осуществлена с помощью д-ра мед. наук Г. В. Безнусенко в НИИ Марио Негри Суд (Италия) и в Ивановском НИИ материнства и детства им. В. Н. Городкова с участием д-ра мед. наук, профессора Л. П. Перетятко.
Апробация диссертации
Основные положения диссертации были представлены в 23 докладах на конференциях и конгрессах, в том числе: на V Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004); на II Съезде лимфологов России (Санкт-Петербург, 2005); на Международном конгрессе по световой и электронной микроскопии (Давос, Швейцария, 2005); на VIII Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Орел, 2006); на 5-й Всероссийской конференции «Бабухинские чтения» (Орел, 2006); на научной конференции «XXII Любищевские чтения» (Ульяновск, 2008); на X Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); на VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010); на Международной научной конференции, посвященной 65-летию ивановской школы лимфологов (Иваново, 2009); на I Международной научно-практической конференции «Наука и современность 2010» (Новосибирск, 2010); на IV Съезде Ассоциации лимфологов России с международным участием (Москва, 2011); на XI Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Самара, 2012); на IX Международной научной конференции «Наука и образование» (Прага, Польша, 2013).
Публикации
По результатам выполненных исследований опубликовано 43 научных и приравненных к ним работ, из которых 18 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, и 8 включены в международные информационные базы данных.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 281 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав результатов собственных исследований с иллюстрациями, заключения, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 53 комбинированными рисунками. Библиография включает 368 источников.
Благодарность
Выражаю персональную благодарность научным консультантам А. А. Миронову, В. В. Банину, а так же Г. В. Безнусенко, В. В. Долгих, Е. В. Селиверстовой, Л. П. Перетятко, и другим ученым, помогавшим в проведении исследований (подробнее см. текст диссертации).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования
Объекты исследования, клеточные линии, ДНК-конструкции, антитела и химические реагенты. КГ человека изучался на клеточной линии фибробластов кожи человека (Istituto Dermatológico dell'Immacolata (IDI), Italy; Клинический центр клеточных технологий медицинской ассоциации «МераМед», Москва). КГ фибробластов животных исследовался в образцах соединительной ткани: под кожным эпителием моллюска физы заостренной Fhysa acuta Draparnaud, 1805 (Mollusca); области межсегментной перегородки дождевого червя Lumbricus terrestris Linnaeus, 1758 (Annelida); области жирового тельца сверчка двупятнистого Gryllus bimaculatus De Geer, 1773 (Arthropoda); продольной межмышечной перегородки широчайшей мышцы карася серебристого Carassius auratus Linnaeus, 1758 (Pisces); ахиллова сухожилия лягушки травяной Rana temporaria Linnaeus, 1758 (Amphibia); ахиллова сухожилия цыпленка кросса «Хайсекс коричневый» (Aves); ахиллова сухожилия новорожденной крысы линии Вистар (Mammalia) (табл.).
Использовались штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae клеточных линий: RSY 248 (фенотип MAT Of his 4-619); термочувствительная мутантная линия Sec 23 - RSY 281 (фенотип MAT« SEC 23-1 ura 3-52, his 4-619) (Lab. D. Botstein Princeton Univercity, USA); клеточная линия NRK (Department of Cell Biology and Oncology, Consorzio Mario Negri Sud, Santa Maria Imbaro, Italy); ткани сверчков, зараженных микроспоридиями Nosema grylli, любезно предоставленных лабораторией микробиологического контроля Всероссийского НИИ защиты растений (г. Санкт-Петербург); клетки меристемы кончика корня гороха посевного Pisum sativum Linnaeus, 1758. ДНК-конструкцию GFP-Rar изготовил доктор H-S. Kweon (2004) (Department of Cell Biology and Oncology, Consorzio Mario Negri Sud, Santa Maria Imbaro, Italy) (табл.).
Таблица
Распределение материала исследования в соответствии с использованными методами
Материал Методы исследования
ТЭМ/ ИЭМ 3T/3D ИФМ М/м Инф. анализ Всего
Homo sapiens (HFb) 30 5 - 30 30 95
Модельный объект, клетки Систематическая группа
Fhysa acuta (Fb) Opisthokonta, Metazoa, Mollusca 30 - - 30 30 90
Lumbricus terrestris (Fb) Opisthokonta, Metazoa, Annelida 30 - - 30 30 90
Gryllus bimaculatus (Fb) Opisthokonta, Metazoa, Arthropoda 30 - - 30 30 90
Carassius auratus (Fb) Opisthokonta, Metazoa, Pisces 30 - - 30 30 90
Rana temporaria (Fb) Opisthokonta, Metazoa, Amphibia 30 - - 30 30 90
Птица - курица кросса «Хайсекс коричневый» (Fb) Opisthokonta, Metazoa, Aves 30 - - 30 30 90
Крыса линии Вистар (Fb) Opisthokonta, Metazoa, Mammalia - 3 - - - 3
Крыса-NRK - 10/10 18 18 - 56
S. cerevisiae Opisthokonta, Fungi, Ascomycota 60/25 5/5 - 60 - 155
Nosema grylli Opisthokonta, Fungi, Microsporidia 30 5/5 - 30 - 70
Pisum sativum Archaeplastida, Embryophyta 60 5/5 - 40 30 140
ВСЕГО 360/25 33/25 18 358 240 1059
Примечание: ТЭМ/ИЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия/иммуноэлектронная микроскопия; ЭТ/ЗБ - электронная томография/трехмерная реконструкция электронно-томографического изображения; ИФМ - иммунофлюоресцентная микроскопия; М/м - морфометрический анализ; БЬ - фибробласт; НРЪ - фиб-робласты кожи человека; >ЖК- эпителиальные клетки почки крысы.
При культивировании клеток использовались среды: DMEM, сыворотки CS, FCS производства Invitrogen (UK); YPD (Sigma); дрожжевые экстракты (Difco).
Трансфекция. Синхронизационные протоколы. Для транфекции клеток штамма Sec 23 - RSY 281 использовались растворы TriaHCl и EDTA фирмы «SIGMA» (USA) и кит для приготовления плазмидной ДНК компании «Qiagen» (USA). Трансфекция проводилась ДНК-конструкцией GFP-Rar путем электропорации с помощью электропоратора «BIO-RAD, UK» (USA).
Увеличение объема карго достигалось путем блокирования выхода белка из ЭР с помощью инкубации температурно-зависимого штамма дрожжей Sec 23 - RSY 281 при +37°С в течение 40 минут и последующим возвратом клеток к температуре +24СС. Изучалась ультраструктура секреторных путей через 5 и 10 минут после отпуска температурного «блока». Эксперимент проводился на базе лаборатории электронной микроскопии Consorzio Mario Negri Sud, Santa Maria Imbaro (Италия).
Для синхронизации транспорта температурно-чувствительного G-белка вируса везикулярного стоматита (VSVG) через КГ клетки инфицировались штаммом вируса в течение 1 часа при +32°С. Затем клетки инкубировались при +40°С в течение 2-х часов для накопления VSVG в ЭР и вновь помещались в инкубатор при +32°С, что приводило к началу транспортировки белка VSVG через КГ. Через две и шесть минут клетки обрабатывались N-этилмалеимидом (NEM), после чего фиксировались и подготавливались для иммунофлюоресцентного анализа.
Воздействие N-этилмалеимидом (N-ethylmaleimide). Образы инкубировались в течение 15 минут на льду с 100 цМ раствором NEM. Затем отмывались дистиллированной водой, инкубировались в течение 3 минут при +32°С (животные клетки) и 5-10 минут при +23°С (растительные клетки), фиксировались 2,5%-ным глутаровым альдегидом (ГА) и готовились для электронной микроскопии эпоновых срезов.
Иммунофлюоресцентный анализ. Клетки фиксировались 4%-ным раствором формальдегида на фосфатном буфере в течение 15 минут и обрабатывались блокирующим раствором, содержащим 1%-ный бычий сывороточный альбумин и 50 цМ хлорида аммония и 0,1%-ный сапонин для перфорации мембран. Затем клетки инкубировались в течение 30 минут с антителами против VSVG и маркеров промежуточного- и медиального компартментов КГ (GM130 и маннозидаза II) (антитела компании «Sigma», разведение 1 : 500), снова отмывались блокирующим раствором в течение 15 минут и инкубировались в растворе вторых антител против соответствующих видов связанных с флюорохромами Алекса (Alexa) 488 и СуЗ. После этого клетки анализировались в конфокальном микроскопе «510 Zeiss» (FPG), где и проводилось измерение степени колокализации маркеров.
Электронная микроскопия. Фиксация, осмирование и заключение в эпоксидную смолу («Ероп 812») клеток животных и микроспоридий проводилось по общепринятой методике (Mironov A. A. et al., 1994). Смола полимеризировалась в течение 24 часов в термостате при +60°С.
Образцы ткани кончика корня гороха размером 0,5 см фиксировались фиксатором Милонинга (в модификации О. И. Баулиной, 1995) при температуре 0—4°С 2 часа, постфиксировались смесью 2%-ного 0s04 на дистиллированной воде и 3%-ного ферроцианида калия в пропорции 1 : 1 на 0,2 M како-дилатном буфере в течение 1 часа на льду, промывали шесть раз 0,05 M какодилатным буфером (pH 6,8) (Kornovsky M., 1971). Затем проводили обезвоживание спиртами восходящей концентрации и заключали в эпоксидную смолу (Миронов А. А., 1994). Забор изображений проводили на электронном микроскопе «Tecnai 12» и «ЭВМ-100АК».
Клеточная линия дрожжей RSY 248 перед фиксацией находилась при +24°С. Клетки линии Sec 23 - RSY 281 помещались на 40 минут на водяную баню при +37°С на 1 час с последующим снижением температуры до +24°С. Фиксация клеток Sec 23 - RSY 281 осуществлялась через 5 и 10 минут после установления +24°С. В 100 мл культуры вводилось 2 мл 50%-ного ГА. Клетки центрифугировались 5 минут при 5000 g и в полученный пелет добавлялся 2%-ный ГА на 0,2 M какодилатном буфере (pH 6,8) и оставлялся на сутки при +4°С. На следующий день клетки постфиксировались 2%-ным OSO4 (Kornovsky M., 1971), суспензировались в 2%-ном водном растворе уранила ацетата и инкубировались 12-18 часов при +4°С. Обезвоживание и заливка в эпоксидную смолу осуществлялась по общепринятой методике.
Получение и иммуномечение ультратонких криосрезов. Ультратонкие криосрезы изготавливали с помощью ультракриомикротома «Leica ultracut R». (Austria), собирались металлической петлей с каплей смеси 2,3 M сахарозы и 2%-ной метилцеллюлозы (1:1) и переносились на покрытые формваром сеточки (Liou J„ et al. 1996). Процедура мечения представляла собой перемещение сеточек со срезами с капли на каплю различных растворов с определенным временем инкубации на их поверхности (Slot J. et al., 1985). Для заключения использовали смесь 1,8%-ной метилцеллюлозы и 0,4%-ного раствора уранила ацетата. После высушивания на воздухе сеточки со срезами изучали с помощью электронного микроскопа «Tecnai-12» («Philips», Netherlands) с использованием цифровой видеокамеры «ULTRA VIEW CCD» (USA). Срезы изготовлены с помощью Г. В. Безнусенко (Consorzio Mario Negri Sud, Santa Maria Imbaro, Italy).
Метод быстрого замораживания и замещения. Образцы растительной ткани были заморожены в криокамере под высоким давлением, («Technotrade», Manchester) и помещены в жидкий азот для хранения. Извлеченные из жидкого азота образцы помещались в раствор 0,5%-ного ГА и 0,2%-ной та-
пиковой кислоты в ацетоне при температуре -80°С на 3 дня. Затем образцы 4 дни фиксировались 2%-ным безводным 0s04 при температуре -80°С и медленно нагревались до комнатной температуры в последующие 2 дня. После нескольких раз промывки в ацетоне образцы заливали в эпоновую смолу при плавном увеличении се концентрации каждые 2-4 часа (25, 50, 75 и 100%) и полимеризовали при +60°С 24 часа (Mironov A. et al., 1994).
Эле1стро1шая томография. Серийные эпоновые срезы толщиной 150200 им были изготовлены на ультратоме «Leica Ultraçut-UCT» («Leica», Germany). Забор изображений проводили на электронном микроскопе «Tecnai 12». Для построения трехмерного изображения использовали программу «IMOD». Количественный анализ проводился но пяти томограммам на каждую группу объектов. Томограммы построены с помощью Г. В. Безнусенко (Consorzio Mario Negri Sud, Santa Maria Imbaro, Italy).
Получение серийных изображений с помощью детектора обратно рассеянных электронов в сканирующем электронном микроскопе, оборудованном внутренним ультратомом. Анализ проводился в соответствии с методом, описанным Н. С. Kalson et al. (2011) на сканирующем электронном микроскопе «Quanta 250» (FEI), оборудованном ультратомом «GATAN». Образцы сухожилий новорожденных крыс фиксировались 1-2%-ным ГА, отмывались, постфиксировались в 1%-ном редуцированном 0s04, снова отмывались и обрабатывались в 0,3%-ном растворе тиокарбогидразида. Затем образцы снопа обрабатывались редуцированной четырехокисью осмия для усиления контраста мембран, обезвоживались спиртами восходящей концентрации и заключались в эпоксидную смолу (Миронов А. А., 1994). После заливки образец наклеивался на держатель сканирующего электронного микроскопа, затачивался на ультратоме. На полученную поверхность образца напылялся слой золота, и образец помещался в сканирующий электронный микроскоп. После первого полного среза, сканируя поверхность образца узким пучком электронов, с помощью детектора обратно рассеянных электронов получалось изображение, образуемое под поверхностью образца от обратного рассеяния тонким слоем электронов (ускоряющее напряжение в 1,5 кВ). Серийные изображения получались после каждого срезания слоя смолы толщиной в 70 им.
Морфометрический анализ проводился при помощи программы Sta-tistica 6.0. Для каждой группы изучаемых животных и для получения каждой расчетной величины анализировалось, как минимум, 30 стопок КГ. Относительное количество структур разных морфологических форм ко всем мембранам КГ рассчитывалось путем подсчета точек пересечения после наложения морфометричсской сетки (100 х 100 им) на анализируемые структуры КГ.
Структурно-информационный анализ. Информационные параметры рассчитывались по формулам из руководства Г. Г. Автандилова (1982) и с помощью кластерного анализа программы Statistica 6.0 из исходных параметров КГ - процентного соотношения мембран органеллы, приходящихся на три основных структурных элемента везикулы, трубочки и мешочки. Сложность биологической системы КГ и уровень ее организации оценивали по шкалам X. Кадыкова (1974) и Т. Хутиева (1991). Возможность использования структурно-информационного анализа в качестве сравнительно-морфологического метода была апробирована нами на эндотелиальных клетках грудного лимфатического протока (Банных С. В. и др., 1996; Катаев С. И. и др., 2010; Сесорова И. С. и др., 2009).
Анализ фенотипических форм комплекса Гольджи и распределения белков секреторного транспорта в систематических группах эукари-от. Оценивалась встречаемость морфологических форм КГ (стопочной, тубу-лярной, с преобладанием единичных мешочков) в клетках не менее 100 представителей шести таксонов эукариот: Opisthokonta, Archaeplastída, Chromalveolata, Rhizaria, Amoebozoa, Excavata. Анализировалось наличие 14 белков (COPI и СОРИ, клатрин, NSF, синтаксин-5 и синтаксин-16, SNAP-25, Slylp, Rabí, Rab6, TANGOl, GRASP65, P115, BARS) у представителей основных систематических групп эукариот на основании открытых баз данных геномных проектов и Rab-белков лаборатории вычислительной геномики IGC (Португалия).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ структуры комплекса Гольджи в клетках эукариот разных систематических групп
Для решения спорных вопросов о механизмах транспорта через КГ мы проанализировали особенности строения органеллы в клетках ряда модельных объектов - представителей основных систематических групп эукариот -и установили, что у всех них основными компонентами структуры КГ являются уплощенные дисковидные мешочки или цистерны, трубки цилиндрической формы 30-40 нм в диаметре и свободные везикулы 50-60 нм в диаметре.
Уплощенные дисковидные мешочки комплекса Гольджи
В большинстве типов клеток многоклеточных и одноклеточных эукариот КГ представлен стопкой параллельно расположенных уплощенных мешочков (цистерн), формируя структуру, называемую стопкой (диктиосомой). Мор-фометрический анализ КГ фибробластов и клеток меристемы показал, что
количество мешочков в дикгиосоме органеллы варьирует. Однако для каждого типа клетки эта величина относительно постоянная и может выступать в качестве морфологической характеристики органеллы. Так, для фибробластов человека и шести систематических групп животных среднее количество цистерн в стопке не имеет достоверных различий между группами и составляет 5,18 ± 0,18, в клетках меристемы корня гороха посевного - 5,25 ±0,25.
Мешочки представляют собой плоские дисковидные замкнутые структуры с большой площадью поверхности, т. к. их высота в 20—35 раз превышает диаметр. Ширина и форма мешочков имеют вариации, при этом диаметр одинаков как в одной, так и в разных стопках клетки одного типа. Так, для фибробластов он составил в среднем 928,43 ± 22 нм, для меристематических клеток - в 2 раза меньше, в среднем 520,04 ± 13,2 нм. На стопку мешочков в орга-нелле, как правило, приходится немногим более 50% всех мембран КГ. Однако этот показатель может быть и более высоким, как мы наблюдали в клетках моллюска и меристемы, у которых мешочки заняли 87,1 ± 4,7 и 77,87 ± 4,9% мембран соответственно (рис. 1). Мешочки в стопке различаются между собой степенью перфорированности. Срединные (медиальные) цистерны не перфорированы или имеют единичные перфорации в отличие от цис- и трансмешочков. Из последних наиболее перфорированы транс-цистерны органеллы. Диаметр перфораций, как показывают трехмерные реконструкции на основании ЭМ-томограмм КГ фибробластов человека, составляет 50-70 нм.
У ряда организмов мешочки КГ не формируют стопку, а встречаются в виде отдельных изолированных элементов. Так, у 5. cereviciae диктиосома КГ из трех параллельно расположенных цистерн наблюдается меньше чем в 1% случаев. В 48,5% органеллу представляет одна мало перфорированная цистерна, имеющая вид плоского диска диаметром 440,7 ± 25 нм.
Кроме отдельных мешочков, как описывает большинство авторов, в 33,1% случаев органеллу формируют две мембранные цистерны, которые чаще (в 31,9%) изогнуты в центральной области и образуют сферическую структуру. В 1,2% случаев два мешочка расположены параллельно и близко прилежат друг к другу. Мешочки органеллы сферической формы расположены на относительно большом расстоянии - 200-300 нм друг от друга (в среднем - 239 ± 28 нм).
Тубулярный мембранный компонент комплекса Гольджи
Тубулярный мембранный компонент КГ формируется цилиндрическими 30-40 нм в диаметре трубками гладкой или извитой формы, которые могут образовывать трехмерные сети, а также непрерывные, непостоянные единичные коммуникации между компартментами секреторного пути и цистернами соседних стопок.
Цис-сеть в КГ клеток эукариот имеет разную степень выраженности. У фибробластов всех изученных систематических групп цис-сеть выражена
плохо и представлена первой перфорированной цистерной. В клетках меристемы она отсутствует. У S. cerevisiae во время увеличения грузового потока транспортируемых молекул на цис-полюсе органеллы выявляются мелкоячеистые, слабо окрашенные осмием трубчатые сети, ассоциированные с цис-цистерной КГ.
Транс-сеть КГ представляет собой сложно организованную перфорированную цистерну транс-полюса, имеющую почки с клатриновой каймой. Транс-сеть у фибробластов выражена только в двух из десяти стопок, что подтверждает данные о зависимости площади поверхности транс-сети от объема транспортируемых молекул (Griffiths G. et al., 1989). В клетках меристемы транс-сеть хорошо выявляется на электронограммах, полученных методом «быстрого замораживания и замещения», и представляет собой ячеистую тубулярную структуру, расположенную на транс-полюсе органеллы, которая, так же как и у фибробластов, может находиться на некотором расстоянии от стопки или непосредственно примыкать к последней цистерне органеллы.
На транс-полюсе КГ S. cerevisiae встречаются два вида тубулярных структур: в виде мелкоячеистой сети с 50-60 нм варикозными расширениями и полигональные, с крупными ячейками и варикозными расширениями, достигающими диаметра 100 нм. Наблюдаются зоны фрагментации узелковых сетей и свободные осмиофильные гранулы в цитоплазме. Тубулярные сети КГ S. cerevisiae не имеют морфологической идентичности с цис- и транссетями клеток млекопитающих и растений, поэтому не ясно, представляют ли они их функциональную аналогию.
Везикулярный компонент комплекса Голъджи
В качестве обязательных структур, ассоциированных с КГ, традиционно описываются малые 60-80 нм свободные пузырьки. В КГ фибробластов человека и животных на ультратонких срезах обнаружено небольшое количество свободных везикулярных профилей в области цис- и медиального ком-партмента органеллы, которое достоверно не различалось между изучаемыми группами (рис. 1). При этом на томограммах около 70% округлых профилей имели продолжение в тубулярные структуры или представляли собой мембранные почки, соединяющиеся тонкой мембранной «шейкой» с цистерной органеллы.
Наши наблюдения, в том числе с использованием высокоразрешающего метода ЭМ-томографии с последующей трехмерной реконструкцией, не выявили свободных везикул в структуре КГ в клетках микроспоридии Nosema grulli. В клетках дрожжей S. cerevisiae на электронограммах везикулы не выявляются, однако обнаружены редкие единичные округлые профили с помощью ЭМ-томографии.
растение моллюск червь
насекомое рыба лягушка птица человек
□ везикулы итубулы □ мешочки
Рис. 1. Распределение мембранных элементов комплекса Гольджи в фибробластах животных разных систематических групп и клетках меристемы, * - р < 0,05
В меристематических клетках гороха Pisum sativum, по данным мор-фометрического анализа электронограмм, процентное соотношение мембран, приходящихся на свободные везикулярные профили, достоверно не отличается от показателей фибробластов. Однако, учитывая меньший диаметр мешочков, действительное количество свободных везикул в клетках меристемы должно быть ниже. Более того, с помощью ЭМ-томографии свободных везикул нам выявить не удалось. Таким образом, в КГ эукариот наблюдается разная выраженность везикулярного компонента.
Классификационные признаки строения комплекса Гольджи
Проведенный комплексный морфологический анализ строения КГ выявил общие характеристики структуры органеллы, а также особенности строения органеллы в клетках эукариот разных систематических групп, которые проявляются как в составе и выраженности основных мембранных компонентов, гак и в степени их связанности.
Было показано, что основные компоненты КГ (цистерны, тубулы и везикулы) локализуются в определенной зоне цитоплазмы клетки и формируют специфическую целостную мембранную систему, которую можно определить как функциональную единицу КГ.
В разных типах клеток многоклеточных и одноклеточных организмов структура КГ различается по локализации и степени связанности функциональных единиц. Пространственная организация мембран КГ и функционирование органеллы тесным образом связаны с системой микротрубочек клетки
i^vr 1
(Trueco A. et al., 2004), поэтому в фибробластах, как и в большинстве других клеток животных (Polichuk R. et al., 2004), структуры органеллы локализуются вокруг клеточного центра (центра организации микротрубочек). Такой фено-типический тип строения КГ мы определяем как перицентросомалъный.
Напротив, у микроспоридий, дрожжей и растительных клеток нет такой централизации структур органеллы. Дискретные функциональные единицы в этом случае могут быть локализованы около ядра, как мы наблюдаем в клетках дрожжей S. cerevisige, или же быть более или менее равномерно расположенными в цитоплазме, как, например, у микроспоридии Nosema grylli. У меристемы корня гороха функциональные единицы органеллы объединяются в группы по 2-3 стопки и регистрируются в периферической зоне клетки. Описанные фенотипические типы строения органеллы мы определили как диспергированный с перинуклеарным, периферическим, кластерным или диффузным расположением функциональных единиц.
В случае централизации мембран КГ функциональные единицы могут располагаться в цитоплазме клетки дискретно (фрагментированно) или формировать единую мембранную структуру, в которой связываются между собой трубочками, образующими «некомпактные» зоны (лентовидный феноти-пический тип строения органеллы).
В фибробластах человека и большинства животных соседние стопки морфологически связаны мембранными трубочками диаметром 30—40 нм, соединяющими как гомотипические, так и гетеротипические цистерны в единую структуру в виде мембранной «ленты». Транс-цистерны и транс-сети соседних стопок между собой не связаны. Наличие мембранных трубочек, соединяющих между собой соседние цистерны, документируется на эпоно-вых срезах и подтверждается анализом томограмм.
У насекомых и моллюсков, в клетках меристемы, в микроспоридиях и дрожжах функциональные единицы дискретны, что подтверждается как серийными срезами, так и ЭМ-томографией. Мы определили такой феноти-пический тип строения органеллы, как фрагментированный.
Анализируя литературные данные, мы выявили еще одну важную характеристику КГ - подвижность функциональных единиц. У большинства организмов во время секреторного цикла КГ представляет собой относительно стационарную систему. Однако КГ в клетках растений отличается высокой подвижностью диктиосомы во время секреции. Эта особенность функционирования отражается и в организации КГ. В частности, можно отметить компактность функциональных единиц, отсутствие везикул и везикулярно-тубулярных кластеров у цис-полюса органеллы и некоторые другие.
На основании полученных нами и с учетом опубликованных данных о строении КГ в клетках эукариот разных систематических групп мы выде-
лили ряд признаков органеллы, на основании которых предложили ее морфологическую классификацию.
По преобладанию в строении КГ вида мембранных структур все возможные варианты органеллы можно объединить в три фенотипические формы: а) преобладание стопок цистерн (стопочная, диктиосомальная); б) преобладание тубулярных структур (тубулярная); с) преобладание единичных мешочков.
По степени развития (выраженности) везикулярного компонента:
а) развитый; б) слабо развитый; в) с отсутствием везикул.
По степени изолированности функциональных единиц: а) целостная система с морфологически связанными функциональными единицами (пери-центросомальный лентовидный тип); б) дискретные функциональные единицы, рассеянные по цитоплазме (диспергированный фрагментированный тип); в) дискретные функциональные единицы, сконцентрированные в околоядерной зоне; г) дискретные функциональные единицы, сгруппированные в кластеры; д) дискретные периферические функциональные единицы.
По степени подвижности функциональных единиц: а) стационарные;
б) подвижные.
Перицентромсомальный фенотипический тип может встречаться как в лентовидной, так и фрагментированной форме. Стопочная фенотипическая форма может иметь развитый или слабо развитый везикулярный компонент. В саккулярной фенотипической форме везикулярный компонент слабо развит. Наконец, в тубулярной фенотипической форме наблюдается полное отсутствие везикулярного компонента.
В соответствии с выделенными классификационными признаками мы характеризуем КГ изученных нами представителей эукариот разных систематических групп следующим образом.
КГ фибробластов человека и большинства животных (лягушки, рыбы, дождевого червя) относится к стационарной стопочной фенотипической форме перицентросомального лентовидного типа и с развитой системой везикул.
КГ фибробластов насекомого и моллюска относится к стационарной стопочной фенотипической форме диспергированного типа с рассеянными по цитоплазме функциональными единицами и развитой системой везикул.
КГ меристематических клеток корня гороха относится к стационарной стопочной фенотипической форме диспергированного типа со сгруппированными в кластеры функциональными единицами и слабо развитой системой везикул.
КГ дрожжей 5. сегеутае относится к стационарной фенотипической форме с преобладанием единичных мешочков диспергированного типа
со сконцентрированными в околоядерной зоне структурно-функциональными единицами и слабо развитой системой везикул.
КГ микроспоридий относится к стационарной тубулярной фенотипи-ческой форме диспергированного фрагментированного типа с диффузно расположенными функциональными единицами и отсутствием везикул.
Формирование той или иной фенотипической формы КГ представляет собой морфологическое проявление коадаптации молекулярных механизмов к условиям секреции в данном типе клеток.
Степень сложности структуры комплекса Гольджи и секреторная активность клеток
Одна из обсуждаемых моделей «созревания и прогрессии» цистерн предполагает обязательное наличие стопочной структуры органеллы. Однако существует множество организмов, не имеющих «классической» стопки КГ. К ним относятся в том числе дикий штамм дрожжей S. cereviciae и микроспоридии. Анализируя литературные данные, мы предположили, что количество цистерн в стопке может увеличиваться при увеличении объема транспортируемого через КГ белка. Для проверки возможности формирования стопочной структуры органеллы у организмов, в строении КГ которых преобладают единичные мешочки, была использована термочувствительная клеточная линия дрожжей S. cereviciae Sec 23 с мутацией субъединицы СОРИ.
Мы создали «блок» для выхода секреторных молекул из ЭР, поместив клетки на 40 минут в термостат при +37°С. После возврата клеток в условия нормальной температуры (+24°С) формировался большой «поток» транспортируемых через органеллу белков. Анализ структур секреторного пути дрожжей через 10 минут после возврата клеток в условия нормальной температуры показал увеличение количества мешочков в стопке КГ, которое доходило до 7-8. Наши данные согласуются с результатами экспериментов на клетках позвоночных животных и человека, у которых большая «грузовая волна» карго приводит к увеличению стопки органеллы на 1-2 мешочка (Trucco А. et al., 2004). Таким образом, объем транспортируемого через стопку органеллы белка является одним из факторов, определяющих стопочную организацию КГ.
Среди эукариот существуют организмы с редуцированной формой КГ, не имеющей мембранных мешочков, например микроспоридии. На ультратонких срезах ранних мерогональных клеток Nosema grulli КГ представлен скоплением 45-50 нм трубчато-варикозных мембран, образующих клубочек 325 ± 23 нм в диаметре. При этом в клетке обычно регистрируется 5-6 таких скоплений как в околоядерной, так и в периферической областях. На стадии споронта, во время увеличения синтетической активности, диаметр трубочек и их скоплений увеличивается соответственно до 70-80 нм и 872 ± 32 нм. При этом мембранные мешочки органеллы не формируются.
Мембранные связи компартментов секреторного пути
Одним из ключевых моментов обсуждаемых транспортных моделей являются доказательства существования тубулярных мембранных сообщений между структурами секреторного пути, в частности мешочками КГ.
В фибробластах человека и всех изученных групп животных обнаружены тубулярные связи между: цистернами ЭР и цис-цистерной КГ; цистернами диктиосомы; транс-цистерной и плазматической мембраной. С помощью ЭМ-томографии выявлены мембранные трубочки диаметром около 10 нм, соединяющие структуры промежуточного компартмента (ЕГЮ1С) с цис-мешочком, а также зоны плотных мембранных контактов между ними. На томограммах тубулярные структуры, соединяющие цистерны одного или разных уровней, обнаружены в четырех из пяти стопок, при этом наибольшее их количество (в среднем 2-4 на срезе 200 нм) наблюдалось в средней части стопки. Кроме того, выявлены тубулярные связи между цистернами органеллы и мешковидными мембранными структурами с элек-тронноплотным содержимым (транспортными переносчиками).
Многочисленные мембранные трубочки обнаружены между всеми компартментами секреторного пути в клетках меристемы. Трехмерная реконструкция томограмм КГ в ряде случаев имеет вид «губчатой» структуры. ЭМ-томография выявила также мембранные сообщения цис-сети и медиальных цистерн органеллы с вакуолярным компартментом.
В клетках 5. сегеу'тае также обнаружены мембранные связи между всеми структурами секреторного пути: цистернами ЭР и мелкоячеистой сетью и цис-цистерной КГ (идентифицированной нами с помощью ОРР-Яаг-маркера и последующего иммуномечения); мешочками органеллы; трансцистерной и осмиофильными «узелковыми» сетями, а также между последними и ПМ. Объем тубулярных сетей и выявляемость сообщений между структурами секреторного пути дрожжей увеличивается с увеличением «потока» транспортируемых через КГ молекул.
КГ микроспоридий, представленный тубулярным «клубочком», формирует мембранные связи как с цистернами ЭР, так и с плазматической мембраной.
Описанные тубулярные сообщения, выявляющиеся как на эпоновых срезах, в том числе серийных, так и на томограммах и их ЗЭ-реконструкциях доказывают их обязательное участие в секреторном транспорте.
Характер мембранных сообщений компартментов комплекса Гольджи
Редкая выявляемость тубулярных сообщений между компартментами КГ является аргументом в пользу представлений об их временном характере. Для доказательства этого предположения мы использовали эксперименталь-
ную модель по блокированию транспорта VSVG в инфицированных NRK-клетках воздействием NEM на SNARE-механизм.
Прогрессия VSVG изучалась с помощью иммунофлюоресцентного анализа. Мы изучали локализацию флюоресцентных маркеров промежуточного компартмента и медиальной цистерны (GM130, маннозидаза II) с флюоресцентным маркером VSVG в условиях «большой» транспортной «волны» G-белка, созданной его накоплением в ЭР с помощью температурного «блока».
Контрольный эксперимент без воздействия NEM показал хорошую колокализацию VSVG с GM130 на 2-й минуте после отпуска «блока» и низкую - с маннозидазой II. Через 3-4 минуты характер колокализации меняется на противоположный, что указывает на перемещение VSVG через стопку. К 10 минуте большая часть белка покидает стопку КГ.
Воздействие на 2-й и 6-й минутах транспорта NEM с брефелдином А не привело к увеличению колокализации VSVG с маннозидазой II на 4-й минуте и снижению уровня наложения цветов через 7 и 10 минут. В клетках, обработанных брефелдином А на 2-й и 6-й минутах эксперимента, колокали-зация белков близка к контрольной группе.
Полученные данные доказывают, что перемещение G-белка через стопку останавливается под воздействием NEM, блокирующего функции SNARE-белков, а нарушение механизма образования COPI-везикул существенным образом не влияет на перемещение белка через стопку, что подтверждает временный характер тубулярных сообщений между цистернами и необходимость их восстановления во время транспорта.
Распределение и возможная роль COPI-везикул в комплексе Гольджи
COPI-производные пузырьки, имеющие COPI-кайму (покрытие), традиционно описываются в качестве обязательных структур, ассоциированных с КГ, и им отводится важная роль в функционировании органеллы (Griffiths G., 2000). Действительно, нарушение функций COPI-каймы или ее сборки приводит к прекращению транспорта (Seemann J. et al., 2000; Ward Т. et al., 2001), а белки субъединиц, формирующих покрытие, высоко консервативны, присутствуют во всех группах эукариот и, следовательно, и у последнего их общего предка (Jekely G., 2008). Тем не менее, функции COPI-зависимых везикул не очень ясны, спорны и продолжают интенсивно обсуждаться.
В классических моделях секреторного транспорта - «везикулярной» и модели «созревания и прогрессии» цистерн предполагается их участие в качестве транспортных переносчиков (Farquhar М„ Palade G., 1981; Rot-man G., 1994; Mironov A. et al., 1997). Однако ряд опубликованных экспериментальных данных не согласуются с этим тезисом (Orci L. et al., 2000; Kweon et al., 2004).
Для доказательства наличия COPI-производных везикул и активности COPI мы обработали клетки NEM, используя его свойства избирательно инактивировать протеин NSF, отвечающий за связывание SNARE-белков донорской и акцепторной мембран КГ. Воздействие NEM на клетки, имеющие функционально активный COPI, не оказывает влияния на образование везикул, однако блокирует их слияние, что в результате должно привести к накоплению свободных пузырьков в «зоне» органеллы.
В результате эксперимента в фибробластах человека и животных всех изученных групп наблюдается постепенная, полная и обратимая трансформация мембран органеллы с накоплением 50-80 нм везикулярных мембранных профилей. Наблюдаемые изменения структуры органеллы при отщеплении COPI-производных везикул доказывают возможное участие COPI в контроле геометрии мембран органеллы.
В клетках дрожжей S. cerevisiae обработка NEM не вызывает ожидаемой мембранной трансформации органеллы. В клетках меристемы гороха сохраняется стопочная структура. Обнаружены мембранные почки и единичные округлые профили в зоне КГ. Однако массивного накопления везикул не наблюдалось. Отсутствие «везикуляции» в клетках дрожжей и меристемы гороха после обработки NEM может указывать как на отсутствие свободных везикул, так и на их малое количество. Однако результаты, полученные с помощью ТЭМ и ЭМ-томографии, позволяют полагать, что у последних в структуре КГ существует небольшое количество свободных COPI-производных везикул.
Мы повторили эксперимент по воздействию NEM на клетки микроспоридии, проведенный Г. В. Безнусенко и др. (2007) и подтвердили отсутствие морфологических изменений в структуре КГ. Однако осталась вероятность низкой проницаемости NEM в клетку микроспоридии, что могло определить полученный эффект. Поэтому в поисках дополнительных доказательств отсутствия COPI-производных везикул мы изучили серийные срезы мнкроспоридий на ранней стадии развития (в меронте) и во время деления ядра.
Как известно, в эукариотических клетках во время митоза внутриклеточный транспорт блокируется, а КГ подвергается «везикуляции» с участием COPI-механизма (Wang J., 2008). Если бы COPI-производные везикулы в микроспоридиях все же существовали, то во время деления клетки мы наблюдали бы фрагментацию мембран органеллы, выражающуюся, по крайней мере, в уменьшении размеров тубулярных «клубочков».
Анализ пяти серийных срезов мерогональных клеток микроспоридий, находящихся в фазе деления, не обнаружил морфологических изменений в структуре КГ. Кроме того, их максимальный диаметр в клетках во время деления не имел достоверных отличий от значений клеток контрольных серий и составил 335 ±21 нм.
Проведенные эксперименты подтверждают разную степень развития везикулярного компонента КГ у представителей разных филогенетических
групп эукариот. Поэтому, несмотря на необходимость присутствия в орга-нелле функционально активного COPI (Ward Т. et al., 2001), везикулы, обладающие таким покрытием, не являются обязательным компонентом органел-лы, а их образование - не основная функция первого коатомера, что ставит под сомнение их роль в качестве транспортных переносчиков секреторных белков и/или ферментов органеллы. Наши данные нашли подтверждение в недавно опубликованной работе, где доказано, что COPI-везикулы играют ингибирующую роль в транспорте через КГ (Fusella A. et al., 2013).
Чтобы судить о том, какая модель транспорта является наиболее адекватной, следовало также последовательно исключать возможные модели на основе тестирования вытекающих из них предсказаний.
В последнее время опубликованы новые данные, позволившие их авторам вновь доказывать отвергнутую в 2001 г. (Mironov A. et al., 2001) идею о «мегавезикулах» как переносчиках белков и липидов. Было высказано предположение, что в клетках in situ транспорт осуществляется именно «мегавезикулами», а их отсутствие в клеточных культурах представляет собой артефакт культивирования.
С целью проверки гипотезы о существовании в КГ «мегавезикул» мы изучили серийные срезы фибробластов растущих сухожилий новорожденных крыс, полученные с помощью современного микроанатомического метода, использующего сканирующий электронный микроскоп, оборудованный внутренним ультратомом и детектором обратно рассеянных электронов.
Анализ 124 изученных серийных срезов КГ фибробластов не показал ни одного расширения цистерн органеллы, которое было бы полностью изолировано, то есть не связано мембранными сообщениями хотя бы с одной цистерной или трубочкой. Полученные данные исключают возможность транспорта карго, в частности проколлагена, с помощью «мегавезикул» in situ.
Морфометрический и информационный анализ классической стопочной структуры комплекса Гольджи
Мы предположили, что механизмы секреторного транспорта через КГ в клетках эукариот могут иметь универсальный характер. Между тем на модельных объектах мы выявили ряд особенностей строения органеллы, которые заключаются в разной степени выраженности мембранных компонентов КГ и их пространственной организацией в цитоплазме клетки. Кроме того, КГ является весьма динамичной органеллой и его строение может зависеть от самых разнообразных факторов (Polishchuk R. et al., 2004). Поэтому мы решили использовать метод формальной оценки структуры органеллы на основе информационных показателей (Шеннон К., 1963) и сравнить «классическое» стопочное строение КГ в клетках организмов, имеющих значительные различия генома (растительных (меристема) и животных (фибробласты) клетках).
Сравнительная оценка стопочной организации КГ в фибробластах человека и животных основных систематических групп, а также в клетках меристемы проводилась на основании некоторых критериев, которые включали: сходство морфологии структурных элементов органеллы, сложность мембранной системы и степень организованности структур. Морфометриче-ские характеристики основных мембранных элементов органеллы: везикул, тубул и цистерн — в своем большинстве не имеют достоверных различий. Однако на ультратонких срезах доля мембран, относящихся к структурам разного вида органеллы, варьирует. В КГ фибробластов моллюска и мери-стематических клетках по сравнению с органеллой в клетках других изученных групп достоверно выше процент мембран, формирующих мешочки, и ниже - приходящийся на мембранные трубочки, (р < 0,05). Напротив, средний процент мембран, приходящихся на свободные везикулярные профили, достоверно не различается в КГ всех систематических групп (см. рис. 1).
Структурная сложность мембранных систем оценивалась по показателям информационной энтропии (Н) (Автандилов Г. Г., 1980) и максимальной информационной емкости (Нтах) (Хутиев Т. В. и др., 1991). Во всех изученных объектах Н не имеет достоверных различий между изучаемыми группами и составляет 1/3 Н^, что указывает на низкое структурное разнообразие, реализуемое органеллой. По показателю Нтах КГ фибробластов и меристема-тических клеток относятся к очень сложным биологическим системам (Хутиев Т. В. и др., 1991).
Для оценки функциональной сложности мембранных структур КГ мы выявили и охарактеризовали возможные реализуемые функциональные состояния органеллы. Допустив, что совокупность вариантов строения органеллы с близкими характеристиками отражает одно из реализуемых функциональных состояний, мы определили возможное их количество, объединив с помощью кластерного анализа случайно выбранные варианты строения КГ в группы. Морфологический состав и количественные характеристики, особенности формирования и информационные параметры кластеров, объединяющих разные варианты структуры КГ, доказывают один уровень функциональной сложности органеллы в клетках изученных систематических групп, а также существование разных функциональных состояний и динамический характер мембранной системы КГ.
Степень организованности мембранной системы оценивалась относительной упорядоченностью (R) и абсолютной организацией системы (S). В фибробластах и клетках меристемы S не имеет достоверных различий, что иллюстрирует один уровень реализованной неопределенности в структуре органеллы.
Коэффициент R во всех изученных клетках организмов высокий и также не имеет достоверных различий (рис. 2). Он указывает на одинаковую долю избыточной информации, обеспечивающей динамический характер
работы органеллы (варианты положения структур, перемещения, трансформации и т. д.) и описывающей структурные элементы, способные выступать в качестве морфофункционального резерва, в том числе при адаптации к различным факторам среды или функциональным нагрузкам.
Например, при увеличении транспортного потока через КГ секреторного продукта, который может возрасти, по меньшей мере, в 2 раза. Кроме того, большие значения Я могут указывать на высокую степень развития ре-гуляторных механизмов, однако это также может быть признаком некоторой инертности системы (Автандилов Г. Г., 1980).
7,74
6,96 6,96 6,96 6,96 6,96
человек птица лягушка рыба насекомое череь моллюск растение
□ Нмзх бит/с В Н бит/с В 5 бит/с
Рис. 2. Гистограмма распределения информационных показателей комплекса Гольджи в фибробластах животных разных систематических групп и меристеме: Нпшх - максимальная информационная емкость системы; Н - информационная энтропия; 8 - абсолютная организация системы.
Относительная энтропия (Ь) показывает, насколько система «загружена» информацией от максимально возможной величины, и также может использоваться как мера сходства мембранных систем. В изучаемых группах 1) имеет одинаковые или близкие значения (рис. 2) и иллюстрирует использование органеллой около 1/3 резервных возможностей системы.
Таким образом, отсутствие достоверных различий информационных показателей, характеризующих КГ в фибробластах и клетках меристемы, указывает на один уровень сложности структурной и функциональной организации органеллы и степени организованности мембранной системы в клетках с одним уровнем развития адаптивных возможностей и регуляторных механизмов. Полученные данные подтверждают предположение об универсальном плане морфологического строения стопочной фенотипической формы КГ в клетках представителей неродственных организмов (растительных и животных клетках) и единых принципах функционирования органеллы.
Систематическое положение организмов
и возможные механизмы формирования комплекса Гольджи
Комплексный морфологический анализ выявил в клетках эукариот несколько форм строения КГ. Однако осталось не ясным, как отражают особенности строения органеллы механизмы, реализуемые во время секреторного транспорта и может ли существовать в клетках эукариот общий принцип организации транспорта белков через КГ.
Мы проанализировали распространенность разных фенотипических форм в систематических группах эукариот и показали, что как минимум в восьми таксонах (Microsporidia, Ascomycota, Entamoebidae, Archeamoebae, Dip-lomonadida, Oxymonadida, Retromonadida, Apicomplexa) имеются виды, в клетках которых КГ не выявляется в виде стопки цистерн. У Археапластид выявлена стопочная фенотипическая форма КГ диспергированного типа. При этом у Опистоконт обнаружены все три фенотипические формы КГ как диспергированного, так и «лентовидного» типа. Кроме того, разные формы органеллы могут встречаться в клетках одного типа, как мы показали на фибробластах человека и животных, или организмов одной систематической группы.
Кроме того, у организмов, не имеющих стопочную организацию КГ, фенотипическая форма органеллы не определяется его положением на филогенетическом «древе» эукариот. Так, предположительно «древние» Parabasalida имеют морфологически хорошо сформированную стопку цистерн, а большая часть представителей Fungi, являющаяся сестринской группой Настоящих животных (Metazoa), не обладает стопочной организацией органеллы.
Мы не нашли также явной зависимости между фенотипической формой и принадлежностью организма к экологической группе, в том числе и у паразитических простейших, среди которых встречаются представители как с хорошо сформированной диктиосомой КГ, так и организмы, не имеющие стопочную организацию органеллы. Однако можно проследить отчетливую связь между формированием стопочной структуры и объемом транспортируемой через КГ продукции (Adam R. et al., 2001; Lujan H. et al., 2003; Elmendorf H. et al., 2003).
Анализ эволюционной динамики 14 ключевых белков, участвующих в транспорте через КГ, выявил три группы. В первую вошли белки, имеющие повсеместное распространение среди таксонов эукариот и отвечающие за механизмы разделения мембран, их адресного слияния и концентрации белков: NSF, COPI и СОРИ, SNARE, Syntaxins (Syn5 и Synl6); Slyl, Rabs (Rabí и Rab6). Имеются некоторые особенности в распределении данных белков. Так, молекулярные комплексы белков покрытий у ряда организмов, например у микроспоридий, редуцированы (Katinca М. et al., 2001). Количество SNARE-белков закономерно, но не очень значительно (примерно в 1,5 раза) возрастает с усложнением секреторного пути и увеличением численности компартментов КГ.
Количественный анализ Rab-белков показал зависимость их численности от количества цистерн в стопке и экологических условий обитания организма. Так, у ряда паразитических организмов, например у Entamoeba histolytica (Amoebozoa) или Trichomonas vaginalis (Excavata), численность Rab более чем в пять раз превышает таковую у человека. Низкое количество Rab-белков с минимальными изменениями состава между видами регистрируется в клетках грибов (от 8 до 12).
Во вторую группу вошли белки, широко распространенные, но имеющиеся не во всех систематических группах - GRASP 65, PI 15, клатрин. Несмотря на участие GRASP 65 и PI 15 в формировании стопочной структуры КГ, закономерности между их присутствием и фенотипической формой КГ у организмов не выявлено. Клатрин либо сформировался после разделения эволюционного «древа» эукариот, либо был утрачен у ряда систематических групп.
В третью группу объединились белки, имеющиеся преимущественно у позвоночных животных (SNAP-25, TANGOl) или только у позвоночных животных (BARS). Они принимают участие в разных молекулярных механизмах.
Подобное распределение семейств белков, участвующих в секреторном транспорте, доказывает не только раннее эволюционное происхождение белков первой и второй групп, но и существование у последнего общего предка эукариот (LCEA) достаточно сложной структуры КГ стопочной фенотипической формы. Это означает, что и основные молекулярные механизмы, и структура КГ у LCEA уже были сформированы. Наши данные согласуется с утверждениями авторов о том, что расширение семейств генов, кодирующих большую часть белков секреторного транспорта, произошло у древних предковых форм до становления LCEA и разделения предковой линии эукариот (Dacks J. et al., 2007). Белки третьей группы, имеющие более позднее эволюционное возникновение, могут определять специфические особенности строения и функционирования КГ у позвоночных животных, однако полного понимания их функций пока нет.
Поэтому нет основания говорить о постепенном изменении структуры КГ в процессе эволюции эукариот или ее усложнении с переходом к многоклеточным формам организации. Формирование разных фенотипических форм, вероятнее всего, связано с различными условиями функционирования органеллы, к которым в каждой систематической группе происходила коадаптация имеющихся древних молекулярных механизмов.
Поэтому в. КГ всех эукариот сохраняются общие характеристики строения органеллы, отражающие общность молекулярных машин, обеспечивающих ее работу.
При этом близкие условия функционирования формировали похожие фенотипические формы КГ не зависимо от систематического положения организма и его экологической принадлежности. Так, в условиях крайне низкой секреторной активности как паразитических, так и непаразитических
организмов сохраняются минимально необходимые механизмы секреции, что отражается в структуре КГ. Напротив, при большом объеме или разнообразии секретируемых клеткой продуктов как у одноклеточных, так и многоклеточных форм наблюдается усложнение структуры КГ и незначительное расширение членов имеющихся семейств белков секреторного транспорта.
Само же происхождение органеллы следует отнести к более раннему периоду эволюции эукариот, к возникновению их первого общего гипотетического предка. Морфологические исследования секреторных путей микроспоридий, а также доказательства существования тубулярных соединений компартментов секреторного пути у организмов разных систематических групп подтверждают возможность существования протоКГ в виде единого мембранного компартмента, представляющего собой сеть трубочек, связывающих ЭР и ПМ, и в которых после отделения от ПМ концентрировались ферменты гликозилирования.
В формировании такой структуры существенную роль сыграло возникновение белка Sari, прикрепление которого к ПМ индуцировало увеличение мембранной кривизны и способствовало образованию ее впячивания (Lee М. et al., 2005). С этой же ГТФазой связывают формирование ядерной оболочки и ЭР как инвагинации ядерной или плазматический мембраны (Duve С. de, 1998; Rizzotti М., 2000), который впоследствии стал самостоятельным компартмен-том. Эта гипотеза согласуется с результатами G. Jekely et al. (2006), показавшим, что следующей за Sari филогенетически сформировалась ГТФаза, функционирующая с белками ядерной поры (Jekely G. et al., 2006). Тубулярное сообщение между ЭР и ядерной и плазматической мембранами некоторое время существовало у предков эукариот и могло использоваться как транспортная магистраль. Позже в клетке сформировался особый механизм, способный уменьшать просвет и разрывать мембранные трубочки, в котором ведущую роль могли играть белки ARF-COPI. Временный характер связи между ЭР и ПМ увеличил безопасность ядерного материала. На следующем этапе из сети мембранных канальцев произошло выделение компартмента, в котором сегрегировалось большинство ферментов гликозилирования.
Таким образом, формирование КГ происходило, вероятнее всего, до разделения предковой линии эукариот. Проведенный нами анализ не позволяет поддержать гипотезу о постепенном усложнении структуры органеллы в процессе эволюции эукариот. Фенотипические формы строения КГ формировались независимо в каждой систематической группе на основе общих консервативных молекулярных механизмов в соответствии с условиями функционирования органеллы. Предложенная нами гипотеза раннего эволюционного происхождения КГ согласовывается с имеющимися экспериментальными данными и филогенетическими исследованиями последних лет и служит дополнительным доказательством модели «слияния и последующего разделения» компартментов.
Модель «слияния и последующего разделения» компартментов как общий принцип организации транспорта белков-карго через комплекс Гольджи
Проведенный комплексный сравнительно-морфологический анализ показал универсальность строения КГ у представителей эукариот разных систематических групп - растительных, животных организмов и грибов, несмотря на выявленные особенности строения и изменчивость органеллы. Информационные показатели мембранной системы КГ доказывают единые принципы формирования структуры и функционирования органеллы в клетках изученных организмов, имеющих различные характеристики генома. Если принять во внимание также общность ключевых молекулярных механизмов, обеспечивающих функционирование органеллы, у нас появляются достаточные основания для обсуждения и формулировки некоторой общей модели транспорта в клетках эукариот.
В качестве такой модели наименее вероятными кандидатами являются модели, основанные на представлении о везикулах как транспортных переносчиках молекул. Об этом свидетельствуют данные, характеризующие разную, часто незначительную, выраженность везикулярного компонента ворганелле у представителей разных систематических групп. Полученные дополнительные свидетельства отсутствия везикул у микроспоридий, наши данные об их низкой численности в клетках меристемы растений и у дрожжей S. cerevisiae (в последнем случае в условиях значительных расстояний между компартментами КГ) также свидетельствуют против везикулярной модели. Тем не менее одинаковое процентное соотношение свободных везикул к мембранам органеллы в фибробластах человека и животных подтверждает их участии в секреторном транспорте, но, вероятно, в ином качестве. Это, скорее всего, механизм регулирования скорости транспорта (Fusella A. et al., 2013).
Крупные молекулярные агрегаты, в частности проколлаген в фибробластах человека и животных, транспортируется через стопку КГ, не покидая расширенной зоны цистерны. С помощью ЭМ-томографии было показано, что такие «мегавезикулы» не являются дискретными образованиями, что говорит против версии «мегавезикул» в качестве транспортных переносчиков, поддержанной лабораторией Дж. Ротмана (Lavieu G. et al., 2013).
Классический вариант модели «прогрессии и созревания» цистерн также маловероятен, т. к. предполагает изначально наличие стопочной организации КГ. Однако, как мы выяснили, стопочная фенотипическая форма органеллы не является единственно возможной. Кроме того, при изменении условий секреции диктиосома может как исчезать, так и появляться, что отмечено рядом авторов при изучении морфологии жизненных циклов простейших (Lujan Н. et al., 1995; Соколова А. и др., 2007) и доказано нами на модельном объекте S. cerevisiae Sec 23. Однако механизм «созревания и прогрессии» явно присутствует в секреторном транспорте в клетках эукариот и
может быть проиллюстрирован на примере переносчика проколлагена в КГ фибробластов.
Используя электронно-микроскопические методы высокого разрешения, в том числе ЭМ-томографию, мы доказали существование временных, как правило тубулярных, мембранных соединений между КГ у микроспоридий и цистернами ЭР и плазматической мембраной. Подобные тубулярные связи могут появляться между всеми компартментами КГ фибробластов, в том числе между мешочками соседних диктиосом. Показана мембранная трансформация секреторного пути Я. сегеч'тае, проявляющаяся в формировании трубчатых сетей на цис- и транс-полюсах органеллы и имеющих сообщения с цистернами ЭР и мешочками КГ. Таким образом, механизм диффузии, несомненно, вносит свой вклад в секреторный транспорт.
Однако классический вариант «диффузионной» модели основывается на непрерывных, постоянно существующих тубулярных соединениях. При этом остаются неясными механизмы их формирования, а при условии стабильной непрерывности способы концентрирования карго и обеспечения существующих градиентов вдоль секреторного пути. Наши эксперименты по блокированию 8КАКЕ-белков также подтвердили данные других авторов (Тгиссо А. е1 а1., 2004) и показали временный характер сообщений, что доказывает и низкая частота их выявляемое™.
Таким образом, при разработке модели транспорта через КГ должен учитываться временный характер существования тубулярных сообщений между структурами органеллы и, соответственно, механизм «прерывания» непрерывности, поскольку постоянный характер тубулярных связей не обеспечивает поддержание описанных в литературе концентрационных градиентов ионов, белков и липидов вдоль секреторного пути. Последнее совершенно необходимо для поддержания идентичности компартментов КГ и его асимметрии. Кроме того, модель должна включать и как-то объяснять механизмы концентрирования транспортируемых молекул и роль СОР1-производных везикул.
Поэтому наиболее адекватной нам представляется модель, которая в качестве базового использует механизм «слияния и последующего разделения» мембран («Ывв-апё-гип»). СОР1-производные везикулы способны эффективно регулировать механизмы слияния и разделения мембран, разобщая при своем формировании ЗИАКЕ-комплекс. Напротив, у организмов с тубулярной фе-нотипической формой органеллы определяющей функцией СОР1-покрытия остается концентрирование БЫАКЕ-белков, а также разделение тубулярных сообщений. Транспорт же крупных агрегатов белков осуществляется на основе асимметричного варианта модели «слияния и последующего разделения» мембран. Расширения цистерн, содержащих проколлаген, сливаются с более дистальной цистерной, а разделение происходит в месте их присоединения к предыдущей цистерне органеллы (ЬаШшку М. е1 а1., 2002).
выводы
1. Основными компонентами комплекса Гольджи в клетках всех изученных представителей Opisthokonta и Archaeplastida являются уплощенные дис-ковидные мешочки (цистерны), цилиндрические трубки (тубулы) диаметром 30-40 нм и свободные везикулы диаметром 50-60 нм. Их выраженность и представленность определяют особенности строения орга-неллы в клетках эукариот.
2. Цистерны в клетках большинства эукариот формируют стопку (диктио-сому), реже существуют в виде отдельных изолированных элементов (например, в Saccharomyces cerevisiae). Количество цистерн в стопке в каждом типе клетки представляет собой относительно постоянную величину и определяется условиями функционирования органеллы, одним из которых является интенсивность транспортируемого через комплекс Гольджи карго.
3. Наборы цистерн, трубок и везикул формируют функциональные единицы органеллы, которые могут быть представлены в цитоплазме как в виде дискретных единиц, так и единой морфологически связанной структуры. У представителей Opisthokonta, независимо от систематического положения организма, встречаются обе формы пространственной организации органеллы; в клетках Archaeplastida - только дискретная фено-типическая форма.
4. Цилиндрические или извитые мембранные трубки могут формировать трехмерные сети, а также непрерывные сообщения между компартмен-тами секреторного пути. Тубулярные мембранные связи между цистернами комплекса Гольджи обнаружены во всех модельных объектах. Они носят непостоянный характер, что согласуется с моделью «слияния и последующего разделения» компартментов. Одной из фенотипических форм строения комплекса Гольджи является сеть, образованная только из тубулярных компонентов (микроспоридии).
5. Свободные везикулы диаметром 50—60 нм, ассоциированные с комплексом Гольджи, формируются при участии набора белков покрытия (коатомера один) на цис- и медиальных цистернах и тубулах, где они образуют мембранные почки и варикозные расширения. Отдельные везикулы могут вновь сливаться с мембранами органеллы с помощью группы белков слияния - SNARE. «Мегавезикул» не существует не только в культуре ткани, но и in situ, в частности в фибробластах сухожилий, которые транспортируют агрегаты проколлагена I.
6. На основании проведенного морфофункционального анализа и имеющихся данных литературы были предложены критерии, характеризующие морфологические различия комплекса Гольджи: 1) преобладание тех или иных мембранных структур (мешочков, тубул, везикул); 2) степень
изолированности (связности) функциональных единиц; 3) степень развития везикулярной системы, 4) степень подвижности функциональных единиц. Данные критерии использованы в оригинальной классификации комплекса Гольджи, объединяющей особенности строения органеллы в клетках эукариот в два фенотипических типа (перицентросомапьный и диспергированный) и три формы (стопочную, с преобладанием единичных мешочков, тубулярную), имеющих разную выраженность везикулярного компонента.
7. Структурно-информационный анализ комплекса Гольджи в фибробла-стах и клетках меристемы не выявил различий информационных показателей, что доказывает идентичный уровень сложности структурной и функциональной организации, а также степени организованности мембранной системы органеллы в клетках представителей Ор18Йюкоп1а и АгсЬаер1а8Йс1а. Результаты подтверждают универсальный план строения комплекса Гольджи.
8. Анализ эволюционных различий морфологии комплекса Гольджи и основных молекулярных механизмов секреторного транспорта не позволяет говорить о постепенном изменении структуры органеллы в процессе эволюции или ее усложнении с переходом к многоклеточным формам организации. Комплекс Гольджи в клетках всех эукариот работает на основе консервативных, эволюционно древних молекулярных механизмов, которые лишь в минимальной степени адаптируются к условиям функционирования органеллы, определяющим особенности ее строения.
9. Наиболее вероятной моделью, описывающей функционирование комплекса Гольджи в клетках эукариот, является модель, основанная на механизме «слияния и последующего разделения» мембран. В соответствии с ней транспорт белков и мембран через комплекс Гольджи осуществляется с участием временных тубулярных связей, формирующихся между компартментами и обеспечивающих белковые, липидные и концентрационные градиенты. Их образование ингибируется формированием 50-60 нм везикул. Варианты этой модели могут непротиворечиво объяснить транспорт как небольших молекул, так и крупных молекулярных агрегатов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Предложен сравнительно-морфологический подход, основанный на детальном электронно-микроскопическом анализе (включающем электронно-микроскопическую томографию) организации комплекса Гольджи и систематизации эволюционной динамики определяющих ее молекулярных механизмов, являющийся эффективным инструментом изучения внутриклеточного транспорта в клетках эукариот.
2. Трехмерные реконструкции с высоким разрешением (электронно-микроскопическая томография, сканирующая электронная микроскопия с использованием внутреннего ультратома и детектора обратно рассеянных электронов) необходимы для суждения о дискретном или непрерывном механизме транспорта молекул в клетке.
3. Метод формализованного описания комплекса Гольджи с использованием морфометрических и информационных параметров можно применить при сравнительном изучении динамичных мембранных клеточных структур.
4. Протоколы синхронизации позволяют временно разобщить этапы секреторного «конвейера», увеличить объем мембран на каждом этапе и, тем самым, дать возможность детального изучения структуры и молекулярных механизмов.
5. Метод «быстрого замораживания и замещения» способствует быстрой фиксации и лучшей сохранности мембранных структур клетки и наиболее эффективен при анализе динамичных мембранных систем.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
В журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ
1. Банных, С. И. Клапанный аппарат и тканевая организация эндотелия грудного протока / И. С. Сесорова, А. А. Миронов мл., В. А. Миронов, В. К. Шишло, В. А. Колпаков, А. А. Миронов // Морфология. - 1996. -Т. 109, № 1,-С. 40-50.
2. Банин, В. В. Цитологические подходы к анализу структуры и функций комплекса Гольджи / В. В. Банин, Г. В. Безнусенко, И. С. Сесорова // Морфология. - 2004. - Т. 127, № 4. - С. 16.
3. Безнусенко, Г. В. Как измерять структуры, или новая стереология. I. Способы отбора и ориентации образцов / Г. В. Безнусенко, И. С. Сесорова,
A. А. Миронов // Морфология. - 2005. - Т. 128, № 5. - С. 73-75.
4. Безнусенко, Г. В. Как измерять структуры, или новая стереология:
II. Методы определения абсолютных размеров клеточных структур на светооптическом уровне / Г. В. Безнусенко, И. С. Сесорова, А. А. Миронов, В. В. Банин // Морфология. - 2005. - Т. 128, № 6. - С. 63-66.
5. Миронов, А. А. (мл.). Как измерять структуры или Новая стереология:
III. Электронно-микроскопическая стереология / А. А. Миронов (мл.), Г. В. Безнусенко, И. С Сесорова, В. В. Банин // Морфология. - 2006. - Т. 129, №3,-С. 72-75.
6. Безнусенко, Г. В. Электронно-томографический анализ строения комплекса Гольджи в тканевой культуре клеток / Г. В. Безнусенко, И. С. Сесорова,
B. В. Банин // Морфология. - 2006. - Т. 129, № 3. - С. 41-44.
7. Сесорова, И. С. Эволюционный подход к пониманию структурно-функциональной организации комплекса Гольджи / И. С. Сесорова, Г. В. Безнусенко, В. В. Банин, В. В. Долгих // Морфология. - 2006. -Т. 129, № 1,-С. 91-94.
8. Сесорова, И. С. Структурно-функциональная характеристика КГ растительных клеток / И. С. Сесорова, Г. В. Безнусенко, В. В. Долгих // Морфология. - 2006. - Т. 129, № 4. - С. 111-112.
9. Сравнительный анализ ультраструктурных изменений аппарата Гольджи, индуцированных действием фторида алюминия и NEM, в клетках млекопитающих, насекомых и в микроспоридиях / Г. В. Безнусенко, И. С. Сесорова, В. В. Долгих, Е. В. Моржина и др. // Морфология. - 2006. -Т. 129,№4.-С. 21-22.
10. Mironov, A. A. Evolution of the endoplasmic reticulum and the Golgi complex / A. A. Mironov, V. V. Banin, I. S. Sesorova, V. V. Dolgikh, A. Luini, G. V. Beznoussenko // Advances in Experimental Medicine and Biology. -2007. - Vol. 607. - C. 61-72.
11. Безнусенко, Г. В. Новые методы двойного мечения и опыт их применения в изучении внутриклеточного транспорта / Г.В. Безнусенко, В. В. Банин, И. С. Сесорова // Морфология. - 2008. - Т. 131, № 2. - С. 18.
12. Сесорова, И. С. Оценка состояния эндотелиального монослоя после реэн-дотелизации участка криоповреждения грудного протока / И. С. Сесорова, Т. В. Лазоренко // Морфология. - 2009. - Т. 136, № 6. - С. 57-61.
13. Сесорова, И. С. Морфофункциональный анализ строения комплекса Гольджи фибробластов животных / И. С. Сесорова // Морфология. -2010.-Т. 137, №4.-С. 173.
14. Катаев, С. И. Ивановская школа лимфологов / JI. И. Полянская, Н. А. Калашникова, И. С. Сесорова, Т. В. Кодина [и др.] // Вестник Ивановской медицинской академии. - 2010. - Т. 15. - С. 13-19.
15. Сесорова, И. С. Организация тубулярных структур секреторного пути фибробластов животных разных систематических групп / И. С. Сесорова// Вестник новых медицинских технологий. - 2011. - Т. 18, № 2. -С. 160-162.
16. Сесорова, И. С. Морфологическая организация комплекса Гольджи в эндотелиальных клетках лимфатических протоков / И. С. Сесорова // Морфология. - 2012. - Т. 142, № 3. - С. 142.
17. Сесорова, И. С. Структурная сложность как мера сравнения динамичных мембранных систем клетки / И. С. Сесорова, Т. В. Лазоренко // Вестник новых медицинских технологий. - 2012. - Т. XIX, № 2. - С. 20-21.
18. Сесорова, И. С. Ультраструктурные изменения комплекса Гольджи в меристеме гороха посевного, Pisum sativum, индуцированные действием N-этилмалеимида [Электронный ресурс] / И. С. Сесорова II Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 3. - Режим доступа: www.science-education.ru/109-9494 (дата обращения: 29.06.2013).
Прочие публикации
19. Банин, В. В. Транспорт белков через комплекс Гольджи / В. В. Банин, Г. В. Безнусенко, И. С. Сесорова // Вестник морфологии. - 2004. -Т. 127, № 1.-С. 10-11.
20. Сесорова, И. С. Новые данные о структуре комплекса Гольджи / И. С. Сесорова // Материалы по научным исследованиям естественно-географического факультета ШГПУ: сб. науч. статей. - Шуя : Весть,
2003.-С. 62-65.
21. Сесорова, И. С. К эволюции комплекса Гольджи / И. С. Сесорова, Г. В. Безнусенко // Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии, - Томск : Изд-во ТГСУ, 2004. - С. 152-153.
22. Безнусенко, Г. В. Метод усиления контрастирования образцов для электронной микроскопии / Г. В. Безнусенко, И. С. Сесорова // Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии. - Томск : Изд-во ТГСУ,
2004.-Т. 4, № 1,-С. 20-21.
23. Сесорова, И. С. Изучение динамики макромолекул в живых клетках / И. С. Сесорова, Т. А. Мочалова // Актуальные проблемы морфологии. -Красноярск. - Изд-во КрасГМА, 2004. - С. 235-237.
24. Сесорова, И. С. Новые возможности электронной микроскопии в клеточной биологии / И. С. Сесорова, Г. В. Безнусенко // Актуальные проблемы морфологии. - Красноярск : Изд-во КрасГМА, 2004. - С. 38-39.
25. The clatrin-positive endosomal TGN attaches to the Golgi stack during transport of cargo / G. V. Beznoussenko, I. Neumuller, M. Vetterlein, D. di Giandomenico, I. S. Sesorova [et al.] I I Microscopy Conference 2005. -Davos, Switzerland, 2005. - P. 159.
26. Сесорова, И. С. Новые возможности световой микроскопии в клеточной биологии / И. С. Сесорова, Г. В. Безнусенко, Т. Е. Лазарева // Естествознание и гуманизм. - Томск : Изд-во ТГСУ, 2005. - Т. 2, № 3. - С. 88-90.
27. Сесорова, И. С. Синтетический аппарат эндотелия грудного протока в норме и после регенерации / И. С. Сесорова // Материалы докладов II Съезда лимфологов России. - СПб., 2005. - С. 278-280.
28. Сесорова, И. С. Функциональная роль белков каймы в молекулярных механизмах внутриклеточного транспорта / И. С. Сесорова, Г. В. Безнусенко // Проблемы преподавания молекулярной биологии, биотехнологии и вирусологии : сб. науч. тр. Всерос. науч.-практ. конф. - Орехово-Зуево, 2006. - С. 95-99.
29. Банин, В. В. Эндоцитоз: ретроградная ветвь внутриклеточного транспорта / В. В. Банин, Г. В. Безнусенко, И. С. Сесорова // Альманах «Ретинои-ды», материалы 5-й Всерос. конф. «Бабухинские чтения в Орле». — М. : ЗАО «Ретиноиды», 2006. - Вып. 24. - С. 110-111.
30. Сесорова, И. С. Комплекс Гольджи как центральная органелла секреторных путей растительных клеток / И. С. Сесорова, Г. В. Безнусенко // Актуальные проблемы морфологии : сб. науч. тр. / под ред. проф. Н. С. Горбунова. - Красноярск : Изд-во КрасГМА, 2006. - С. 149-151.
31. Сесорова, И. С. Морфофункциональные особенности секреторного пути микроспоридий / И. С. Сесорова, Г. В. Безнусенко, В. В. Долгих, Е. В. Моржина // Естествознание и гуманизм. - Томск : Изд-во ТГСУ, 2007. - Т. 4, № 3. - С. 101-102.
32. Банин, В. В. Механизмы внутриклеточного транспорта / В. В. Банин, Г. В. Безнусенко, И. С. Сесорова // Альманах «Ретиноиды», материалы 6-й Всерос. конф. «Бабухинские чтения в Орле». - М. : ЗАО «Ретиноиды», 2007. - Вып. 25 - С. 76-78.
33. Сесорова, И. С. Использование структурно-информационного анализа в оценке тканевой организации эндотелия грудного протока после реэндо-телизации криоповреждения / И. С. Сесорова, М. В. Сесорова // Вестник лимфологии. - 2008. - № 3. - С. 51.
34. Сесорова, И. С. Гипотеза эволюционного возникновения комплекса Гольджи / И. С. Сесорова, В. В. Банин, Г. В. Безнусенко // Любищевские чтения, 2008. Современные проблемы эволюции : сб. докл. : в 2-х т. -Т. 1. - Ульяновск: УГЛУ, 2008. - С. 155-160.
35. Сесорова, И. С. Основные типы структурной организации комплекса Гольджи / И. С. Сесорова, Г. В. Безнусенко, В. В. Долгих, Т. В. Лазорен-ко // Вестник Ивановской медицинской академии. - 2009. - Т. 14, № 2. -С. 14-17.
36. Сесорова, И. С. Морфология эндотелия клапанного аппарата грудного протока / И. С. Сесорова, А. А. Миронов // Вестник лимфологии. - 2009. - № 2. - С. 17-19.
37. Сесорова, И. С. Сравнительно-морфологический анализ структурной организации комплекса Гольджи / И. С. Сесорова, Г. В. Безнусенко,
B. В. Долгих // Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической морфологии: матер, междунар. науч. конф., посвящ. 65-летию ивановской школы лимфологов. - Иваново : ГОУ ВПО ИвГМА Росздрава, 2009. - С. 93-96.
38. Сесорова, И. С. Современные методы световой микроскопии в морфологических исследованиях / И. С. Сесорова, В. В. Банин И Однораловские морфологические чтения : сб. науч. тр. - Волгоград, 2009. - С. 31-35.
39. Сесорова, И. С. Опыт использования структурно-информационного анализа в оценке функциональной организации комплекса Гольджи фиброб-ластов человека / И. С. Сесорова, Т. В. Лазоренко // Материалы VIII Всероссийской конференции по патологии клетки. - М., 2010. -
C.222-224.
40. Сесорова, И. С. Механизмы секреторного транспорта в клетках растений / И. С. Сесорова // Наука и современность - 2010 : сб. матер. I Меж-дунар. науч.-практ. конф. - В 3-х т. / под ред. С. С. Чернова. - Новосибирск : СИБПРИНТ, 2010. - С. 36-41.
41. Выренков, Ю. Е. Лимфатическая система в норме и эксперименте / Ю. Е. Выренков, Н. А. Калашникова, А. Ю. Харитонова, И. С. Сесорова. - Иваново : ПресСто, 2011. - 278 с.
42. Сесорова, И. С. Ультраструктурная организация секреторного пути в эндотелиальных клетках грудного протока / И. С. Сесорова // Материалы IV съезда лимфологов России. - М., 2011. - С. 136-137.
43. Сесорова, И. С. Анализ ультраструктурных изменений комплекса Голь-джи в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae, индуцированных действием N-этилмалеимида / И. С. Сесорова // Materialy IX mezinarodni ve-decko-prakticka conference «Veda a vznik - 2012-2013». - Praha : Publishing House «Education and Science» s. r. o„ 2013. - P. 22-24.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
COPI (coatomer protein I) — первый комплекс белков покрытия СОРИ (coatomer protein И) - второй комплекс белков покрытия ERGIC-компартмент (ER-Golgi intermediate compartment) - промежуточный компартмент КГ
NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) - N-этилмалеимид чувствительный фактор
LECA (last eukaryotic common ancestor) - последний общий предок эука-риот
SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptors) - растворимые белки слияния мембран, опосредованного N-этилмалеимидчувствительными рецепторами
GRASP (Golgi ReAssembly Stacking Proteins) - формирующий стопку белок комплекса Гольджи
Sly 1 (Golgi transport protein) - белок, регулирующий работу SNARE-комплекса
SNAP-25 (synaptosomal-associated protein 25) - ассоциированный с мембраной синапса белок, принадлежащий к классу t-SNARE
TANGOl (transport and Golgi organization 1) - белок, отвечающий за транспорт и организацию КГ
BARS (BFA-dependent ADP-ribosylation substrate) - брефелдин A-зависимый АДФ-рибозилирующий субстрат
СЕСОРОВА Ирина Сергеевна
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСА ГОЛЬДЖИ
В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ РАЗНЫХ СИСТЕМАТИЧЕСКИХ ГРУПП
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Подписано в печать 27.06.2013. Формат 60x84 '/16. Печ. л. 2,75. Усл. печ. л. 2,6. Тираж 100 экз.
ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздрава России 153012, Иваново, Шереметевский просп., д. 8
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Сесорова, Ирина Сергеевна, Иваново
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО
ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ИВАНОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
На правах рукописи
05201450022
Сесорова Ирина Сергеевна
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСА ГОЛЬДЖИ В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ РАЗНЫХ СИСТЕМАТИЧЕСКИХ ГРУПП
Специальность: 03.03.04. - Клеточная биология, цитология, гистология
14.03.01 - Анатомия человека
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук
Научные консультанты:
д.мед.н, чл.-кор. РАМН, проф. Банин В.В.
д.мед.н, проф. Миронов A.A.
Иваново 2013
СОДЕРЖАНИЕ
Стр.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ................................4
ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................................5
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................18
1.1. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ.....................................................18
КОМПЛЕКСА ГОЛЬДЖИ...............................................................................................................18
1.2.СРАВНИТЕЛБНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПЛЕКСА ГОЛЬДЖИ В КЛЕТКАХ МОДЕЛЬНЫХ ОРГАНИЗМОВ.......................................................................................................30
1.3.МО ДЕЛИ СЕКРЕТОРНОГО ТРАНСПОРТА ЧЕРЕЗ КОМПЛЕКС ГОЛЬДЖИ..................36
1.4.ГИПОТЕЗЫ ЭВОЛЮЦИОННОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ КОМПЛЕКСА ГОЛЬДЖИ.........50
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................................................58
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...................................62
ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..........................................................70
III.1 .МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПЛЕКСА ГОЛЬДЖИ В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ...........................................................................................................70
Ш.2.МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПЛЕКСА ГОЛЬДЖИ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ ДИКОГО ТИПА SACCHAROMYCES CEREVISIAE................................................107
III.3. СТРОЕНИЕ КОМПЛЕКСА ГОЛЬДЖИ В КЛЕТКАХ МИКРОСПОРИДИИ NOSEMA GRYLLI.............................................................................................................................................124
Ш.4.СТРОЕНИЕ КОМПЛЕКСА ГОЛЬДЖИ В МЕРИСТЕМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ КОРНЯ ГОРОХА ПОСЕВНОГО PISUMSATIVUM..................................................................................134
III. 5 .СТРУКТУРНО-ИНФОРМАЦИОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПЛЕКСА ГОЛЬДЖИ ФИБРОБЛАСТОВ ЖИВОТНЫХ И МЕРИСТЕМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК КОРНЯ ГОРОХА ...........................................................................................................................................................151
III. 6. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ КЛЮЧЕВЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ СЕКРЕТОРНОГО ТРАНСПОРТА СРЕДИ СИСТЕМАТИЧЕСКИХ ГРУПП ЭУКАРИОТ....171
ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................................175
IV. 1.АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСА ГОЛЬДЖИ В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ РАЗНЫХ СИСТЕМАТИЧЕСКИХ ГРУПП....................................................................................................175
У1.2.МОРФОМЕТРИЧЕСКИЙ И ИНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ КЛАССИЧЕСКОЙ СТОПОЧНОЙ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСА ГОЛЬДЖИ..........................................................202
VI.3.МОДЕЛЬ «СЛИЯНИЯ И ПОСЛЕДУЮЩЕГО РАЗДЕЛЕНИЯ» КОМПАРТМЕНТОВ КАК ОБЩИЙ ПРИНЦИП ОРГАНИЗАЦИИ ТРАНСПОРТА КАРГО ЧЕРЕЗ КОМПЛЕКС ГОЛЬДЖИ.......................................................................................................................................213
У1.4.ФОРМИРОВАНИЕ КОМПЛЕКСА ГОЛЬДЖИ В ЭВОЛЮЦИИ ЭУКАРИОТ...............225
ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................................238
ВЫВОДЫ..............................................................................................................................241
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
245
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ERGIC - компартмент (ER-Golgi intermediate compartment) - промежуточный компартмент;
COPI (coatomer protein I) - первый комплекс белков покрытия; СОРИ (coatomer protein II) - второй комплекс белков покрытия; NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) - N-этилмалеимид чувствительный фактор; LECA (last eukaryotic common ancestor) - последний общий предок эукариот; SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptors) - растворимые белки слияния мембран опосредованного N-этилмалеимид чувствительными рецепторами;
GRASP (Golgi ReAssembly Stacking Proteins) - формирующий стопку белок комплекса Гольджи;
Sly 1 (Golgi transport protein) - белок регулирующий работу SNARE комплекса; Rabs - малые ГТФ-азы;
SNAP-25 (synaptosomal - associated protein 25) - ассоциированный с мембраной синапса белок, принадлежит к классу t- SNARE;
TANGO 1 (transport and Golgi organization 1) - отвечающий за транспорт й организацию КГ белок;
BARS (BFA- dependent ADP - ribosylation substrate) - брефелдин A - зависимый АДФ- рибозилирующий субстрат
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность научного исследования
Система внутриклеточного транспорта, объединяющая взаимосвязанные процессы экзо- и эндоцитоза, обеспечивает одну из важнейших функций клетки -взаимодействие с окружающей средой, поэтому анализ собственно цитологических механизмов ее реализации и, как следствие, поиск возможных способов воздействия является актуальной проблемой цитологии, молекулярной и клеточной биологии. Ключевым участником внутриклеточного транспорта является комплекс Гольджи (КГ) - мембранная органелла, осуществляющая посттрансляционную модификацию белков и липидов, сортировку молекул, их концентрирование, упаковку и отправку к месту назначения.
Через КГ транспортируется большое количество различных молекул, встраивающихся в структуры тканей и органов и определяющих, в том числе, их функциональную микроанатомию. Так, строение большинства органов зависит от секреции коллагена и ряда внеклеточных белков, включая белки базальной мембраны. Синтез и секреция антител, транспортируемых через КГ, влияет на особенности строения лимфоидных органов и функционирование иммунной системы в целом. Образование синаптических везикул с последующей их доставкой в аксоны и образованием синапсов, во многом определяет микроанатомическую организацию мозга и других органов нервной системы. Наконец, образование новых сосудов (васкуло- и ангиогенез) также во многом зависит от функции КГ в эндотелиальных клетках, так как для формирования почек роста сосудов требуется доставка на плазматическую мембрану (ПМ) рецепторов факторов роста, что происходит при обязательном участии органеллы.
Поэтому изучение механизмов перемещения веществ через КГ открывает новые перспективы в медицине, сельском хозяйстве и других областях: дает возможность начать целенаправленный поиск лекарственных препаратов для лечения заболеваний, в основе которых лежат нарушения модификации и транспорта белков [3, 17] и моделировать тест-системы для их оценки; позволяет разрабатывать новые методы борьбы с возбудителями заболеваний человека и
животных, способы стимуляции роста и созревания плодов, защиты растений от неблагоприятных факторов среды [349] поможет понять механизмы строительства органов и их систем из клеток и внеклеточного матрикса.
Структура КГ традиционно представляется в виде диктиосомы - стопки уплощенных цистерн или мешочков и ассоциированных с ней мелких везикул и секреторных гранул [145]. В клетках человека и многоклеточных животных организация КГ достаточно хорошо изучена [190, 191, 309].
В клетках растений так же, как и животных, КГ описывается в виде диктиосомы. Однако эволюционные группы, давшие начало современным растительным и животным организмам, рано обособились в процессе эволюции и имеют свои существенные характеристики генома, что может определять особенности строения органеллы.
Несмотря на то, что наличие диктиосомы КГ признается одной из характеристик эукариотических клеток [98], существуют организмы, среди которых немало известных паразитических видов, в клетках которых мембраны с функциями КГ не формируют диктиосому [243]. Понимание причин вариаций морфологии КГ и их связи с особенностями секреции в клетках таких организмов может быть полезным в решении ряда спорных вопросов о механизмах транспорта через органеллу.
КГ, несмотря на его кажущуюся морфологическую простоту, является сложной в функциональном отношении поляризованной органеллой. В ее «работе» органически сочетаются антероградное перемещение молекул, предназначенных для секреции или экспрессии на клеточной поверхности, и ретроградный возврат собственных, резидентных белков, включая ферменты, в соответствующий компартмент.
Выделено и охарактеризовано большое количество молекул, участвующих в этих процессах, все более понятной становится их конкретное участие в регуляции функций органеллы. Однако идентификация всех белков-участников не решила главный вопрос: как происходит процесс перемещения белков и липидов через чрезвычайно сложно устроенный КГ.
Именно поэтому при обилии огромного фактического материала не кажется парадоксальным отсутствие согласованного мнения о конкретных цитологических механизмах, обеспечивающих перенос молекул между компартментами КГ и тех мембранных преобразованиях, которые и определяют, собственно, эти механизмы. Причина нам видится в том, что в течение многих лет обсуждались, в основном, две модели транспорта через органеллу: «везикулярная» и модель так называемого «созревания и прогрессии» цистерн (мешочков) КГ. Другие модели внутриклеточного транспорта практически не рассматривались.
В соответствии с очень популярной «везикулярной» моделью, которая была предложена Дж. Паладе [122, 259], но наиболее полно разработана Дж. Ротманом [295, 296] молекулы карго (модифицируемого продукта) перемещаются от цистерны к цистерне в мелких (50-60 нм) транспортных везикулах. С позиции этой модели сложно объяснить отсутствие в везикулах целого ряда известных белков, например альбумина, проинсулина, вирусных белков и некоторых других, а также понять, как транспортируются молекулы, имеющие большие размеры, чем размеры везикулы, например проколлаген I в фибробластах [196] или липопротеиновые агрегаты в гепатоцитах и энтероцитах [80, 299].
Исследования последних лет выявили новые факты, которые также не могут быть объяснены «везикулярной» моделью транспорта. В частности, было доказано, что агрегаты проколлагена I длиной 300 нм и необыкновенной резистентностью к изгибам транспортируются через КГ [272] с той же скоростью, что и мембранные белки [323].
В классическом варианте модели «созревания и прогрессии» цистерн транспортируемый белок, оставаясь в составе цистерн, постепенно передвигается от проксимального цис-полюса КГ к дистальному транс-попюсу органеллы. Такая прогрессия должна сопровождаться возвратом ферментов и других резидентных белков КГ, который, как предполагается, осуществляется везикулами, имеющими СОР1-покрытие [46, 138, 230]. Однако в везикулах,
ассоциированных с диктиосомой (стопкой мешочков), не было выявлено повышенной концентрации ферментов гликозилирования, а также трансмембранных переносчиков моносахаров, химически связанных с нуклеотидами [39, 130, 140].
В последние годы появились доказательства существования непрерывных тубулярных сообщений между цистернами КГ, вследствие чего было высказано предположение о перемещении некоторых транспортируемых белков по этим связям [215, 309]. Было предложено сразу несколько новых моделей, одной из которых стала «диффузионная» модель [260]. Однако и она не объяснила существующие противоречия.
Так, например, если для карго, имеющего небольшие размеры и обладающего способностью к диффузии (например альбумина), существует возможность перемещения по тубулярным сообщениям, то для больших молекул (проколлаген) такой путь невозможен - диаметр трубочек слишком мал для этого. Кроме того, при рассмотрении постоянных тубулярных коммуникаций как основного транспортного пути трудно понять механизм концентрирования растворимых и мембранных белков-карго по мере их продвижения через стопку и поддержания вдоль секреторного пути концентрационных и других градиентов [229].
В настоящее время начала активно обсуждаться модель, в которой в качестве базового используется механизм «слияния и последующего разделения» мембран, получившей название «kiss-and-run» модели [228, 229]. Она предполагает, что транспорт растворимых секретируемых белков и мембран через КГ осуществляется с участием тубулярных сообщений, которые временно формируются между компартментами КГ. Образование таких связей может ингибироваться 50—60 нм везикулами, имеющими COPI-покрытие [130].
Крупные агрегаты белков, которые не могут диффундировать по тонким тубулярным сообщениям между цистернами, видимо, транспортируются согласно асимметричной версии модели «слияния и последующего разделения» компартментов. Эта модель предполагает, что слияние происходит на
лидирующей стороне переносчика, содержащего агрегаты белков, а разделение осуществляется на участке, расположенном непосредственно за транспортером [229].
Необходимым условием существования данной модели является наличие временных мембранных сообщений между компартментами секреторного пути. Кроме того, должны существовать механизмы концентрации транспортируемых белков по ходу их передвижения через КГ, а также белков SNARE в местах слияния мембран и разделения мембранных соединений. При этом основным противоречием (скорее, камнем преткновения) всех обсуждаемых моделей стало определение роли COPI-зависимых 50—60 нм пузырьков, транспортные функции которых сторонники классических теорий продолжают доказывать.
В решении спорных вопросов, по нашему мнению, помогут новые морфологические подходы в изучении клетки, одним из которых является сравнительная микроанатомия, а также современные методы трехмерной реконструкции клеток и органелл.
Обсуждаемые в настоящее время модели секреторного транспорта в большинстве своем разрабатываются и тестируются на клетках млекопитающих. Однако при использовании в качестве модельных объектов клеток других организмов (растений, паразитических простейших и др.) полученные экспериментальные данные плохо согласуются с предложенными гипотезами. Между тем, учитывая филогенетические исследования последних лет [182], представляется маловероятным формирование у эукариот разных механизмов транспорта через КГ. Поэтому если предположить возможность существования некоторого общего механизма транспорта через органеллу во всех клетках, то потребуется верификация обсуждаемых моделей и доказательства универсальности для КГ всех известных эукариот.
Следовательно, для решения спорных вопросов и поиска морфологических доказательств в пользу одной из обсуждаемых моделей транспорта мы сравниваем структуру КГ клеток человека и ряда модельных объектов -типичных представителей систематических групп эукариот со «стопочной» организацией
КГ: представителей Высших растений (ЕшЬгуорЬ^а) и Настоящих животных (Ме1агоа), тела которых формируются специализированными клетками, имеющими сложную многоступенчатую систему посттрансляционной модификации белков, обеспечивающуюся в том числе и общими классами гликозилтрансфераз [247, 286]. Для возможности сравнения было важно учесть, насколько изучены те или иные организмы. Поэтому мы взяли представителей с мало известным строением КГ (для доказательства/опровержения существования тех же закономерностей), но из систематических групп, где в какой-то мере уже был проведен анализ строения органеллы (тип Черви, Членистоногие, класс Рыбы, Насекомые). КГ других взятых нами объектов практически не исследован.
КГ в клетках растений, несмотря на стопочную структуру, имеет существенные особенности организации. Поэтому остается непонятной возможность экстраполяции механизмов секреторного транспорта, разработанных на клетках животных, на секреторный путь растительных организмов, имеющих значительные, по сравнению с животными, различия генома.
Кроме того, мы проанализировали строение КГ в клетках, не имеющих «классической» стопки органеллы, обладающих более простой структурой секреторных белков и ограниченным количеством ферментов гликозилирования [246], и также хорошо известным геномом. Мы учитывали доступность материала для электронно-микроскопического изучения.
Таким образом, несмотря на большое количество работ, изучающих секреторный транспорт, не сформировалось единого мнения о механизмах перемещения белков (карго) через КГ. Поэтому сравнительно-морфологический анализ, включающий комплекс электронно-микроскопических (ЭМ) методов, в том числе ЭМ-томографию и сканирующую электронную микроскопию с использованием детектора обратно рассеянных электронов и внутреннего ультратома, вмонтированного в камеру микроскопа (один из современных методов микроанатомии), представляется достаточно эффективным для обоснования (или отрицания) той модели внутриклеточного транспорта, которая наиболее полно объясняет имеющиеся экспериментальные факты.
Цель исследования - сравнительный анализ структуры комплекса Гольджи в клетках эукариот для обоснования наиболее адекватной модели внутриклеточного транспорта.
Задачи исследования
1. Выявить и обобщить на основании комплексного морфологического исследования, включающего микроанатомический анализ, особенности строения разных морфологических форм комплекса Го
-
Сесорова, Ирина Сергеевна
-
доктора биологических наук
-
Иваново, 2013
-
ВАК 03.03.04
- Роль цитоскелета в упорядоченной локализации и распределении органелл клеток высших растений
- Зависимость строения аппарата Гольджи от состояния клеточного центра в гепатоцитах мыши
- Морфофункциональные изменения элементов цитоскелета и вакуолярной системы опухолевых клеток на начальных этапах развития множественной лекарственной устойчивости
- Молекулярные механизмы внутриклеточного транспорта белков
- Происхождение и положение животных в системе органического мира
