Сравнительный анализ последовательностей биополимеров в систематике микроорганизмов

Чумаков, Константин Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительный анализ последовательностей биополимеров в систематике микроорганизмов
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ последовательностей биополимеров в систематике микроорганизмов"

ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи

Константин Михайлович ЧУМАКОВ

УДК 577.21?.8.001.34

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ВИОГЮ.ЛЙМ!?М )Ь В СИСТЕМАТИКЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой ст^гг^ни доктора биологических ннцк в форме научного доклада

(оз.оо.оз - молекулярная биология)

Москва - 1 ',)я8

Работа выполнена в Межфакультетской проблемной лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии имени А.Н.Белозерского МГУ.

Официальные оппоненты:

академик АН СССР, доктор биологических наук, профессор

М.В.Иванов

член-корр. АН СССР, доктор физико-математических наук, профессор

М.В.Волькенштейн доктор биологических наук, профессор А.С.Антонов

Ведущее учреждение - Институт цитологии и генетики АН СССР.

Защита состоится и_"_198 г.

в _ часов _ мин. на заседании Специализированного совета

Д. 053- 05. 70 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Доклад разослан "_"_ 198 г.

Ученый секретарь Специализированного совета Кандидат химических наук

В.Н.Каграманов

Актуальность создания новых подходов к систематике микроорганизмов, основанных на сравнительном анализе последовательностей биополимеров связана с тем, что такой анализ позволяет выявлять филогенетические связи между микроорганизмами, которые практически не учитываются в существующей систематике, основанной лишь на фенотишческих признаках. В последние года благодаря использованию новых методов определения последовательностей аминокислот в белках и нуклеотидов в ДНК и РНК появилась возможность проводить широкомасштабный филогенетические исследования, направленные на получение информации об эволюции отдельных генов и белков. Для адекватного решения задачи реконструкции фотогении и создания естественной систематики микроорганизмов необходимо накопление информации о различных репер-ных молекулах и разработка биологически состоятельных, эффективных подходов к построению филогенетических деревьев на основе сравнения последовательностей биополимеров.

Цель и задачи настоящей работы состояли в изучении систематики микроорганизмов путем определения и сравнения последовательностей гомологичных биополимеров, в первую очередь 53 рибосомной РНК. я разработке новых методов филогенетической реконструкции. Новизна работы состоит в том, что определение последовательностей нуклеотидов 5в рибосомной РНК примерно 100 видов и штаммов микроорганизмов позволило исследовать ряд частных вопросов систематики и впервые определить филогенетическое положение ряда важных групп микроорганизмов. Впервые ' сформулирован принцип построения филогенетических схем, названный принципом максимального топологического подобия (МТП), который свободен от априорных допущений относительно хода эволюции и ставит целью построение такого дерева, общая структура (топология) которого в максимальной степени соответствует топологическим характеристикам, содержащимся в исходных данных. Для реализации этого нового направления /- /311 -I-

филогенетического анализа на основе специального математического аппарата созданы алгоритмы и на их основе разработан комплекс прикладных компьютерных программ для филогенетического анализа последовательностей биополимеров.

Практическая ценность работы связана с тем, ■что определенные в работе последовательности 5S рРНК позволили исследовать ряд частных таксономических вопросов, сформулировать предложения по изменению существующей систематики. Созданные на основе предложенного принципа МТП алгоритмы построения филогенетических деревьев, реализованные в комплексе компьютерных программ, могут быть применены для решения разнообразных филогенетических проблем как при анализе последовательностей биополимеров, так и при сравнении других количественных признаков (в нумерической таксономии). Кроме того, определена биологическая природа предполагаемого возбудителя вшшйского энцефалита.

Апробация работы. Работа была доложена на VII съезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-ата, 1985), У международной конференции по фотосинтезирующим прокариотам (Гриндельвальд (Швейцария), 1985), Международной конференции по почвенным микроорганизмам (Копенгаген, 1985), сессии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (Москва, 1985), школе-конференции "Структура и функции биополимеров" (Рига, 1986), конференции "Физиология, генетика и биохимия метилотрофных бактерий" (Канев, 1986), школе-конференции "Фундаментальные науки - народному здравоохранению" (Каунас, 1986), Всесоюзной конференции "Биология возбудителей инфекционных болезней и их экспресс-диагностика" (Горький, 1986), на симпозиуме по архебактериям (Пущино, 1987), совещании "Генкнформ" (Москва, 1987), Всесоюзной школе-конференции по биотехнологии (Львов,, 1987).

Установление естественных эволюционных связей между микроорганизмами едва ли считалось осуществимым пару десятилетий назад. Сложность этой задачи определяете с одной стороны, скудостью палеонтологических данных, а с другой - тем, что из тех немногих признаков микроорганизмов, которые доступны для определения, большая часть имеет ярко выраженный адаптативный характер, и поэтому вряд "ли отражает филогенетические связи между ними, являясь скорее отражением общих условий существования (то есть могут иметь конвергентную природу). Именно поэтому существующая в настоящее время систематика микроорганизмов является почти исключительно фенотипической.

В последнее время делаются попытки подвести под 'нее филогенетическую основу, что связано с введением в употребление

методов молекулярной филогенетики. Основным постулатом, лежащим1"* в основе этого подхода, является представление о том, что филогения реперных макромолекул отражает филогению всего вида. Ряд исследователей, ссылаясь на принципиальную возможность горизонтального переноса генетической информации, например, при участии плазмид и транедуцирующих вирусов считает, что это явление подрывает основу для использования макромолекул как реперов филогении биологических объектов. И хотя несомненно, что это явление может иметь место и1 в ряде случаев было экспериментально обнаружено, его широкое распространение в природе доказано не было. Однако для того чтобы свести к минимуму возможное влияние этого процесса на выводы филогенетического анализа, целесообразно проводить исследования не с одним видом макромолекул, а с несколькими, выбирая те, для которых вероятность горизонтального переноса минимальна.

/- 3 -

Рибосомальная РЖ как объект филогенетических исследований

Считается, что, выполняя черезвычайно важную, по-существу центральную роль в живой клетке, рибосома вряд ли может быть объектом горизонтального переноса. В связи с этим наиболее популярным объектом' для исследований молекулярной филогенетики микроогранизмов являются молекулы рибосомадьной РНК, в особенности-- РНК малой субчастида (1бБ рРНК), сочетающие в себе консервативность и убиквитарность.. Это позволяет проводить филогенетические исследования на самом высоком таксономическом уровне.

На начальном этапе, до введения в практику методов быстрого секвенирования нуклеиновых кислот, вместо сравнения собствено последовате'льностей РНК использовали сравнение наборов олигонуклео-тидов, получаемых из РНК обработкой рибонуклеазой . Именно применяя такой подход был сделан вывод о том, что существующая систематика бактерий находится в серьезном противоречили с данными о филогении РНК, а также обосновано представление об архебактериях как о своеобразной разнородной в фенотипическом отношении группе, составляющей отдельное первичное царство, наряду с эукариотами и остальными бактериями (эубактериями).

В настоящее время стало возможным, в основном используя клонированные гены, определять полные последовательности рибосомаль-ных РНК, однако до сих пор такая работа требует достаточно высокой квалификации и затрат труда. Альтернативой К16Б рРНК является 58 рРНК, которая также давно используется для филогенетических исследований. Преимуществом данного объекта является ее малый размер и связанная с этим простота определения ее первичной структуры. Однако небольшая длина 5Э рРНК является и недостатком, обуславливая невысокую точность выводов, которые 1 можно сделать на основании сравнения ее последовательностей. Несомненно, что наиболее ответственные филогенетические выводы следует делать с

использованием по 'возможности более длинных молекул, таких как 1бз рРНК, но для широкомасштабного скрининга и предварительной филогенетической характеризации вполне достаточно той точности, которую обеспечивает 58 рРНК. Поэтому в этой работе мы сосредоточили основное внимание именно на определении последовательностей 5Э рРНК для.того, чтобы шире продемонстрировать применимость этой—молекулы для исследования таксономии бактерий и оперативной идентификации вновь выделяемых организмов.

Необходимость коренного пересмотра систематики микроорганизмов юбудила нас в ряде случаев отказаться от использования общепринятых таксономических рангов и позволить себе употребление таких терминов, сак "супергруппа пурпурные бактерии", не пытаясь пока придать ей сакой-либо определенный ранг. Более того, у нас нет убежденности в :ом, что в будущей систематике следует сохранить эти классические >анги, поскольку пересмотру должна подвергнуться не только сама яистематика, но и ее принципы. 1етоды филогенетической реконструкции

Существенным этапом создания систематики на основе сравнения оследовательностей биополимеров является построение илогенетических деревьев по этим данным. Эта задача является резвычайно сложной, по целому ряду причин, и в настоящее время етоды ее решения, которым можно было бы дать очевидное редпочтение,. отсутствуют. Это побудило нас искать новые подходы к зшению этой задачи. Однако прежде чем приступить к их описанию зобходимо более четко сформулировать саму проблему и дать краткую арактеристшсу основных методов, традиционно используемых для этой зли, с тем, чтобы показать их органичения и сформулировать тре-звания, которые следует предъявлять к новому методу.

В общих чертах методы филогенетической реконструкции сладываются из нахождения дерева, оптимального относительно - /зу6

выбранного критерия (фенограммы), и его филогенетической трактовки. Для того чтобы обеспечить адекватность такой трактовки, на этапе построения фенограммы необходимо в максимальной степени воздержаться от каких-либо априорных допущений. В противном случае биологически "несостоятельные постулаты, принятые на первом этапе, могут исказить филогенетическую трактовку.

Сама идея реконструкции филогении (то есть дерева, описывающего эволюционную историю исследуемых объектов) неизбежно основана на ряде допущений, первым из которых является . представление об их дивергенции от общего предшественника. В том случае, если бы мы располагали информацией о точном числе эволюционных событий, происходивших в ходе дивергенции, то реконструкция истинного филогенетического дерева не составляла бы труда и могла бы быть выполнена однозначно. Поскольку истинное число эволюционных событий неизвестно, то в качестве его меры принимается мутационное расстояние между парами последовательностей современных биополимеров (число замен, которое необходимо произвести для того, чтобы превратить одну последовательность в другую), либо некоторая величина, производная от этого числа. Использование мутационных расстояний делает ситуацию более сложной. Если бы процесс дивергенции происходил таким образом, что мутационные события «в каждом из элементов последовательности происходили лишь один рдз, то мутационные расстояния в точности соответствовали бы истинным эволюционным расстояниям. .Стохастический характер мутационного процесса приводит к тому, что такая ситуация, называемая аддитивной, может реализоваться лишь при весьма незначительном общем числе мутаций, поскольку по мере их накопления возрастает вероятность повторной мутации.

Таким образом можно сформулировать второе допущение, лежащее в основе филогенетического анализа последовательностей биополимеров:

предположение о том, что мутационное расстояние отражает истинное эволюционное расстояние. Положение о том, что они в подавляющем числе реальных примеров оказываются не равными, следует не только из общих соображений о характере мутагенеза, но и из того, что получаемые при сравнении последовательностей биополимеров мутационные расстояния оказываются неаддитивными (см. ниже). Однако даже в случае, если мы имеем дело с полностью аддитивными данными, мы никогда не можем быть уверены в том, что эта аддитивность является следствием "идеальной эволюции» (без повторных мутаций), а не есть результат причудливого сочетания прямых, повторных, обратных, и параллельных мутаций, которые взаимно компенсировали и маскировали друг друга. Следовательно, сама задача реконструкции филогении на основе сравнения последовательностей современных макромолекул может быть решена лишь предположительно, и не существует способа доказать что полученная схема описывает истинную эволюционную историю. Напротив, любая такая реконструированная филогения является лишь предположительной и эта предположительность вытекает из того, что реконструкция проводится не на основе истиш&х. а на основе мутационных расстояний. Поэтому в дальнейшем, хотя мы для краткости и опускаем слово "предположительная", однако везде подразумеваем реконструируемую филогению именно в этом смысле.

Как уже отмечалось выше, в случае, если попарные мутационные расстояния аддитивны, реконструкция дерева может быть проведена легко и однозначно. Иначе говоря, можно построить такое дерево, в котором расстояния между всеми парами видов точно равны экспериментально определяемым мутационным расстояниям. Однако такие аддитивные данные на практике обычно не встречаются. Вместо этого мутационные расстояния обычно обнаруживают отклонения от аддитивности, и следовательно построение точного дерева (то есть дерева, в котором расстояния между всеми видами равны мутационным расстояниям)

становится невозможным. Поэтому при филогенетическом анализе реальных данных встает задача построения приближенного дерева (приближения к предполагаемому дереву). Традиционные методы филогенетической реконструкции

Методы филогенетической реконструкции можно условно разделить на несколько групп. Первая группа основана на методологии кластерного анализа, и по существу ставит своей задачей именно восстановление хода эволюционного процесса как бы в обратном порядке. Филогенетическая трактовка деревьев, полученных этими методами, с неизбежностью предполагает равномерность накопления мутаций во всех филогенетических линиях. В том случае, если такая равномерность нарушается, эти методы приводят к реконструкции неправильного в топологическом отношении дерева. В связи с этим следует отметить, что стохастический и дискретный характер мутагенеза, а также возможность изменения функции макромолекул в ходе эволюции создают реальную возможность вариаций скорости накопления мутаций в различных линиях, что и было обнаружено при анализе многочисленных примеров. Поэтому эта группа методов в общем случае является неприменимой для филогенетической реконструкции.

Вторая группа методов, объединяемых принципом максимальной экономии (МЭ), ставит задачей построение такого дерева, в котором расстояния между всеми парами видов.были бы не меньше мутационнйх расстояний между ними, а суммарная длина ребер дерева была минимальной. Эти методы, несмотря на свое широкое распространение, имеют несколько недостатков. Одним из них является его черезвычайная вычислительная сложность ДО-полнота, или невозможность получения точного решения иначе, как путем полного перебора всех возможных вариантов деревьев). Поэтому этот подход обычно применяется лишь для поиска приближенных решений тем или иным эвристическим методом, а это значительно снижает его ценность. Другой, и пожалуй самый

серьезный недостаток, состоит в отсутствии разумной биологической основы у этого принципа, поскольку требование минимальности длины дерева постулируется априорно, но не может быть доказано. Это накладывает существенное и необоснованное ограничение на возможные решения и, следовательно, затрудняет филогенетическую трактовку получаемой схемы.

Третья группа методов основана на построении деревьев путем анализа матриц попарных мутационных расстояний и минимизации некоторого функционала, характеризующего близость исходной матрицы мутационных расстояний и матрицы расстояний между видами в построенном дереве. Иными словами, делаются попытки найти дерево, наилучшим образом реализующее исходную матрицу расстояний. Метода этой группы не предполагают каких-либо особенностей эволюционного процесса, как методы двух предыдущих групп, однако также не лишены недостатков. Одним из главных недостатков является заметная неустойчивость решений к незначительным изменениям данных, которая вероятно связана с тем, что выбор топологии дерева тесно связан с определением длин его ребер (ветвей), и обе задачи решаются одновременно.

Таким образом основные методы филогенетической реконструкции,

зрименяемые в настоящее время, в достаточно явном виде вовлекяют те

ыи иные априорные предпосылки' относительно хода эволюционного

1роцесса, что естественно накладывает отпечаток на получаемые схемы.

)чевидно, что для классификационных исследований определение общей

:труктуры (топологии) является существенно более важной задачей по

¡равнению с определением конкретных значений длин ветвей (ребер).

ри этом известно, что задача нахождения длин ребер (взвешивание)

ерева с известной топологией решается эффективно, а основную слож-

ость представляет именно выбор оптимальной топологии дерева.

ээтому мы остановили свое внимание на разработке топологического

эдхода, который не требовал бы введения никаких априорных допущений -/ЗН _ 9 _

относительно характера эволюционного процесса. Описание структуры дерева.

Для наиболее эффективного решения задачи нахождения оптимальной топологии дерева на начальном этапе построения дерева целесообразно отвлечься от конкретных значений расстояний, чтобы в максимальной степени сосредоточиться на определении структуры дерева. Дня этого необходимо разработать аппарат, который позволил бы характеризовать топологическую структуру дерева, сравнивать деревья между собой, а также выявлять топологические соотношения, в которых находятся между собой объекты, подлежащие анализу. Такой топологический метод может быть основан на условии четырех вершин, впервые сформулированном Зарецким (1965), а впоследствии независимо переоткрытом Буннеманом (1971) и Добсон (1974). Это условие устанавливает, связь между топологическими и метрическими характеристиками деревьев.

В любом дереве можно выделить четыре висячих (концевых) вершины, и рассмотреть поддерево, составленное из этих вершин, двух внутренних вершин и пяти ребер, соединяющих их (рис. 1).

Рисунок 1. Дерево составленное из 4-х вершин.

Легко видеть, что всегда найдутся две пары вершин, которые можно назвать соседями, так как путь между ними составлен минимальным числом элементов дерева (два ребра и одна внутренняя вершина). Если мы обозначим эти пары видов {ав} и {со}, то всегда

поскольку в две большие суммы в правой стороне неравенства входит удвоенная длина центрального ребра, а в левую сумму не вводит.

йав+%в « йас+% = йав+йбс

(1)

Условие четырех вершин позволяет выявить топологические отношения, в • которых находятся вершины дерева, не зная его вида, а лишь на основании формального анализа расстояний между ними. Доказано, что если это условие выполняется для всех поднаборов из 4-х видов (именуемых далее квартетами) некоторого множества видов, то такие данные могут быть однозначно представлены в виде дерева, и именно такие данные называются аддитивными.

Как уже указывалось выше, реальные данные о последовательностях биополимеров обычно оказываются неаддитивными. Это означает, что условие 4-х вершин нарушается по крайней мере для части квартетов. Естественш, что в первую очедедь нарушается равенство в правой части соотношения (1). Однако в любом случае три суммы расстояний между объектами можно упорядочить таким образом, что

Вполне естественно считать, что левая, меньшая сумма в этом ослабленном условии четырех вершин соответствует парам, которые являются соседями. Таким образом, ослабленное условие четырех вершин может быть использовано для выявления топологии поддеревьев, содержащих 4 вершины, на основе формального анализа неаддитивной матрицы попарных расстояний.

Показано, что дерево может быть восстановлено из набора полученных из него поддеревьев, содержащих 4 вершины. Однако очевидно, что не всякий набор таких поддеревьев Может быть реализован суммарным деревом. Колониус и Шульце (1981), а вслед за ними и Юпманов (1987) нашли критерии, позволяющие определять реализуемость анализируемого набора данных деревом. Приведем критерий Ешманова, для чего введем две функции.

Пусть р^(а,в,с,б) определена и равна 1, если пары {ав} и {сб} соседи, и не определена во всех остальных случаях.

- II -

Пусть Pd(A,B,c,D) определена и равна 1, если ослабленное условие 4-х вершин (2) соблюдается, и не определена во всех остальных случаях. Иными словами, определим все упорядоченные сочетания 4-х вершин, которые могут быть описаны деревом на рис. v.

Fd может быть реализована топологически эквивалентным деревом, если выполнены четыре условия:

1. Если f^ определена хотя бы. на одном из наборов abcd, cdab и dcab , то она определена' на всех трех;

2. определена' не более, чем на одном из наборов abcd, acbd, adbc;

3. Если fd определена на наборах abcd, abde, adce, то она определена и на АБСЕ;

4. Если у определена на наборе abcd, то она определена на каком-то из наборов авсе, abed, aecd, ebcd.

Таким образом метод характеризации топологии деревьев через набор поддеревьев, порожденных квартетами висячих вершин, дает возможность определить реализуемость того или иного набора данных деревом. Принцип максимального топологического подобия

Приведенный выше способ описания топологии деревьев и возможность топологической характеризации матриц попарных расстояний позо-лили применить новый принцип построения деревьев, названный нами принципом максимального топологического подобия (МТП). При этом ставится задача нахождения такого дерева, топологические свойства которого максимально близки топологическим свойствам исходной матрицы расстояний (в простейшем случае дерева,; для которого число квартетов, на которых f^ i минимально).

Задача построения дерева, максимально близкого в топологическом отношении исходной матрице расстояний, имеет ряд преимуществ перед другими подходами. В отличие от большинства применяемых в настоящее время методов построения филогенетических деревьев, принцип МТП не вводит никаких дополнительных допущений относительно хода

эволюционного процесса и скоростей эволюции.

Для аддитивных данных метод дает точные решения. Метод нечувствителен к малым погрешностям исходных данных. Так, если некая матрица аддитивна, то для любого квартета {А,в,0,0} из трех суш ^ = ^ + <1СГ). з2 = <1АС + и з3 = с!АС + йво две, скажем в, и з2> равны и много больше третьей. Любая малая погрешность вычисления а1 или в^ или входящих в него расстояний нарушает аддитивность матрицы, но не меняет значения функции р , и, следовательно, не нарушает ее реализуемости деревом. Таким образом, класс матриц, для которых Р^ реализуется деревом, шире класса аддитивных матриц.

Функция I ? - р ! (т.е. топологическое несовпадение, которое в простейшем случае равно числу квартетов, на которых ? г Р.), дает

Л о

простой объективный способ оценки соответствия структуры построенного дерева исходной матрице расстояний. Это, в частности, позволяет сравнивать между собой филогенетические деревья, построенные по разным критериям, то есть позволяет решать задачу, которая ранее осуществлялась путем экспертной оценки специалистами.

Сравнение функций и на всех квартетах, включающих какой-либо интересующий нас вид, позволяет получить количественную оценку надежности его помещения в конкретное положение на дереве в виде величины локального, топологического несовпадения. Иными словами, появляется возможность обнаруживать места в построенных деревьях, которые требуют более осторожной трактовки.

Метод МТП позволяет строить классификационные схемы, учитывающие информацию о разных признаках, выраженных в единицах различной размерности. При этом будет производиться усреднение зменно топологии, а не самих расстояний в нескольких исходных матри-дах. Принцип МТП позволяет при необходимости вводить априорные ограничения на структуру искомого дерева, которые могут быть

пчь

следствием каких-либо биологических соображений. И, наконец, принцип МТП позволяет в явной форме получить алгоритмы построения деревьев.

Алгоритмы нахождения деревьев МТП

По существу принцип МТП и сопутствующий ему математический аппарат, основанный на условии 4-х вершин, позволяет получать при анализе матрицы взаимных расстояний полный набор поддеревьев, содержащих 4 вершины. Поэтому задача построения общего дерева сводится к объединению этих поддеревьев. Для этого нами предложено несколько алгоритмов.

Алгоритм А. Найдем пару видов, которые при анализе функции чаще других входят в соотношение соседства. Естественно считать, что они являются соседями в дереве. Запомним это и удалим один из них из набора анализируемых видов. Будем цроделывать эту процедуру до тех пор, пока в наборе не остается 4 вида. Построим дерево, содержащее эти 4 вида таким образом, что р = Р . Будем в обратном порядке

О и

добавлять удаленные на каждом шаге вершины рядом с теми, с которыми они были соседними. Дерево построено. Этот алгоритм, реал-изованнный в программе тткее, гарантирует нахождение точного дерева МТП при условии его существования.

Алгоритм Б. Второй алгоритм основан на локальной оптимизации структуры дерева путем перестановки ветвей. . Эта процедура может быть применена к любому произвольному дереву, однако на практике удобно в качестве исходного дерева использовать "змейку", то есть дерево, в котором висячие вершины последовательно присоедины к цепочке внутренних вершин. Оптимизация производится следующим образом.

Зафиксируем некоторое внутреннее ребро I, и рассмотрим все квартеты, пороадаемые этим ребром. Про квартет вершин будем говорить, что он поровдается ребром I, если все цепи, соединяющие входящие в него вершины проходят по крайней мере через одну из

внутренних вершин, смежных с ребром I. Иными словами, порождаемыми называются те квартеты, для которых данное ребро является внутренним. Подсчитываем число квартетов, порождаемых I, для которых

Р 4= Р.. Находим такое расположение смежных с I ребер (одно из трех d t

возможных), для которого эта величина минимальна, и запоминаем разницу между этими величинами (иными словами,.определяем величину, на которую можно уменьшить топологическое несовпадение перестановкой смежных ребер).

Просматривая все внутренние ребра, находим такое, перестановка ребер вокруг которого приводит к максимальному улучшению топологии дерева, и производим соответствующую перестановку ребер. Будем последовательно производить такие перестановки до тех пор, пока это возможно.

Если Fd может быть реализована топологически эквивалентным деревом (условие Шманова выполняется), этот алгоритм найдет это дерево. Если нет - то алгоритм позволяет найти хорошие приближения. Изменение структуры исходного дерева позволяет получать слегка различные деревья и отобрать среди них то, для которого величина топологического несовпадения (число квартетов, для которых 4= Pt) ■ минимальна. Этот алгоритм реализован в программе streb.

Алгоритм В. Определение длины ребер (взвешивание дерева). Эта задача решается эффективно разными методами, например, линейным программированием. - Однако в применении к большому числу видов этот метод громоздок. Поэтому дЛя предварительного взвешивания дерева мы разработали быстрый приближенный метод. Он основан на следующих соображениях. Длина внутреннего ребра может быть найдена при рассмотрении расстояний между четырьмя вершинами, порождаемыми этим ребром по формуле:

' Ь = (4Ю.+ SD + dAD + «ВО - 2МЛВ - 7 4

Рассматривая последовательно все четверки видов, порождаемые данным

ребром, мокно получить усредненную величину и считать ее длиной ребра.

Аналогичная формула может быть применена для нахождения длины висячего ребра:

L = <*АВ+ dac - w ' 2 Усреднение по всем тройкам вершин, порождаемым данным ребром, дает

его длину. Этот алгоритм, реализованный в программе measmat,.

позволяет быстро находить достаточно хорошие приближения.

Описание комплекса программ для филогенетического анализа

Комплекс состоит из 20 специализированных программ, написанных на языке "С" в операционной системе UNIX. Программы обмениваются между собой результатами вычислений через потоки данных (файлы), представленные в текстовом виде, что позволяет осуществлять контроль и редактирование обычными текстовыми редакторами. Объектами, с которыми оперируют программы комплекса, являются:

1. Наборы выравненных последовательностей, представленных в одном из следующих форматов: формате Гейдельбергской базы данных о нуклео-тидных последовательностях (EMBL), базе данных о последовательностях аминокислот (pgtrans), либо в формате сжатой (побитовой) записи, разработанной вами для компактного хранения информации о последовательностях биополимеров на персональных компьютерах.

2. Матрицы расстояний, представленные в текстовом формате, которые для удобства редактирования разбиты на страницы. Все объекты в матрице, помимо имен, помечены номерами, начиная с 1.

3. Деревья, которые записаны в виде списка внутренних вершин степени 3 (помеченных номерами, начиная с п+1, где п - число висячих вершин), с указанием соседних вершин и расстояний до них. Висячие вершины обозначены своими именами.

На рис. 2 показана схема обмена информацией между программами описываемого комплекса. Результаты работы каждой из программ могут

(РТК5В)

Рисунок 2. Схема обмена информацией в комплексе программ для филогенетического анализа.

£Г-П Ч6 - -

быть либо записаны на дисковом файле, либо непосредственно переданы

следующим программам через информационные каналы (потоки). Ниже

дана краткая характеристика программ.

1. Программа ВАКК предназначена для поддержания базы данных о последовательностях биойолимеров, представленных в побитовой (сжатой) записи. Для работы с Гейдельбергской базой. данных и базой pgtrans имеются аналогичные программы еывь и pgtrans. эти программы создают индексные файлы, в которых записываются адреса хранения всех последовательностей и их имена, и позволяют быстро извлекать любую последовательность в символьном (ascii) формате, принятом в Гейдельбергской библиотеке.

2. Программа cross позволяет вести перекрестный поиск последовательностей по ключевым словам, используя индексные файлы, создаваемые программами bank, еывь и pgtrans.

3. Программа difmat. производит рассчет матрицы мутационных расстояний между последовательностями нуклеотидов, допускающими использование специальных символов для обозначения неоднозначно определенных элементов последовательностей. Расстояния выражаются в виде доли отличающихся позиций.

4. Программа comp" рассчитывает матрицы расстояний между последовательностями аминокислот с использованием различных правил сравнения аминокислот (матриц сходства MDM78, мутационной матрицы, и др.) либо по совпадению аминокислот.

5. Программа ршиши, используя датчик случайных чисел производит произвольную перестановку строк и столбцов матриц расстояний для того, чтобы иметь возможность получать слегка различные варианты дервьев, используя программу stkee.

6. Программа quaucat позволяет определять характеристики матриц расстояний, их аддитивность, выполнение правила треугольника.

7. Программа penta позволяет определить представимость матрицы

расстояний топологически эквивалентным, деревом. Для этого используется критерий, предложенный Шмановым (см. выше).

8. Программа cius строит деревья одним из нескольких возможных кластерных методов (upgma, wpgma, либо с усреднением, либо по минимальным, либо по максимальным расстояниям).

9. Программа streb является центральной программой комплекса. Она генерирует топологию невзвешенного дерева МТП, используя алгор- • итм Б (см. выше).

Ю. Программа MTREE генерирует топологию невзвешенного дерево, используя несколько матриц расстояний, и позволяет получать усредненную топологию дерева по многим признакам.

11. Программа ttree генерирует топологию деревьев МТП несколькими другими алгоритмами, некоторые из которых описанны выше.

12. Программа ptree генерирует топологию дерева, построенного по цринципу максимальной экономии алгоритмом Б (см. выше).

13. Программа improve генерирует новую топологию путем локальной . оптимизации положения отдельных видов. Она позволяет определить

величины локального топологического несовпадения для определенного вида, помещенного во все возможные положения на дереве, и таким образом оценить надежность и устойчивость построенного, дерева.

14. Программа measmat позволяет определить длины ребер дерева (взвешивание) матричным методом, описанным выше (алгоритм В).

15. Программа measseq позволяет провести взвешивание дерева путем восстановления предковых последовательностей!

16. Программа treemat рассчитывает матрицу расстояний для дерева и определяет суммарную длину ребер дерева.

17. Программа СМРНАТ сравнивает топологические и метрические свойства матриц расстояний и деревьев, и позволяет определить величины локального топологического несовпадения для всех видов,

входящих в дерево. 18. Программа МЖЕЕ выводит на экран дисплея бескорневое дерево. Биологическая состоятельность принципа МТП

Выше ухе отмечалось, что одним из главнейших требований, предъявляемых к методам филогенетической реконструкции, является их биологическая состоятельность. Такая состоятельность может быть обоснована несколькими способами. Первым является отсутствие каких-либо априорных органичений, не содержащихся в исходных данных. Принцип МТП удовлетворяет этому требованию в той мере, в которой это возможно, учитывая неизбежное ограничение- самой задачи. Иным подходом является проведение симуляционных компьютерных экспериментов при различных режимах "эволюционного" процесса. Такой анализ дает информацию о свойствах метода как такового, однако мало пригоден для оценки его надежности при обработке экспериментальных результатов, поскольку характер эволюционного процесса в каждом конкретном случае нам заранее неизвестен. Поэтому в рамках данного исследования, направленного на обработку собственных экспериментальных данных, такие работы не проводились. Более осмысленным нам представляется проверка на непротиворечивость результатов "здравому смыслу", базирующемуся на всей совокупности биологических данных. Именно такой подход, основанный на сравнении получаемых схем с общепринятыми филогенетическими представлениями, ранее заставил усомниться в адекватности ряда методов филогенетической реконструкции. Суждение"по этому вопросу является более сложным, и неизбежно вовлекает некоторый элемент субъективности при сравнительной оценке. Однако в любом случае несоответствие получаемого результата "здравому смыслу" не должно трактоваться однозначно как указание на несостоятельность метода (естественно, если соблюдается условие отсутствия априорных ограничений), поскольку, именно случав несовпадения представляют наибольший интерес, указывая на неполному

и неточность наших представлений.

Мы попытались апробировать новый подход на наборе последовательностей цитохромов с, которые давно использовались для филогенетических построений различными методами, в частности, классическим методом Фитча и Марголиаш (1967), основанном на минимизации среднеквадратичного отклонения. Некоторым ребрам этого дерева приписаны отрицательные длины, что вряд ли может иметь разумное биологическое содержание. Дерево МТП, построенное по этим же данным, сходно по топологии с деревом Фитча-Марголиаш, за исключением тех мест, которые в первом дереве характеризуются ребрами с отрицательной длиной. Величина топологического несовпадения дерева Фитча-Марголиаш примерно в 1,5 раза выше, чем у дерева, построенного нашим методом.

Высокая вычислительная сложность метода МЭ приводит к тому, что деревья МЭ могут быть получены только для весьма незначительных по объему наборов данных. Однако Фулдс и др. (1979) разработали метод, который в ряде случаев позволяет получить оценку нижнего значения суммарной длины дерева, соответствующего какому-либо набору данных. Таким образом, если дерево, построенное каким-либо эвристическим методом, обладает длиной, соответствующей этой теоретически полученной нижней границе, то это может служить доказательством того, что это дерево является деревом МЭ. Пользуясь этим подходом, Фулдс и др. нашли дерево МЭ для последовательностей цитохромов с 23 видов животных. Это дерево приводится на рис. за. Биологическая трактовка ряда районов этого дерева вызывает затруднения. Так, например, сомнительно, чтобы положение мыши в группе млекопитающих, соответствовало бы истинной филогении грызунов, равно, как сомнителен именно такой порядок дивергенции в группе копытных. Мы считаем, что эти аберрации являются артефактами, -связанными с искусственностью постулата, лежащего в основе метода МЭ. На рис. зб показано дерево ¿-/¿46

Рисунок 3. Деревья МЭ (А) и МТП (Б), построенные по последовательностям цитохромов с. Обозначения:

ГО голубь КР кролик ЛЯ лягушка СБ свинья ТУ тунец

ЗЕ зебра КУ курица . МЫ мышь СК скумбрия ТЮ тюлень

КЕ кенгуру ЛМ летучая мышь ОБ обезьяна СО собака ЧП черепаха

КИ кит ЛО лошадь ПИ пингвин СТ страус

КА карп ЧЕ человек УТ утка ЭМ эму

МТП, построенное по тем же данным. Несомненно, оно намного лучше соответствует "здравому биологическому смыслу". Следует отметить, что дерево. МЭ характеризуется величиной топологического несоответствия равной 1604, в то время как дерево МТП - 1104. Кроме того важно подчеркнуть, что те виды, положение которых вызывает наибольшее недоумение в дереве МЭ, характеризуются максимальной величиной локального топологического несовпадения, и, следовательно, оценка величины локального топологического несовпадения позволяет объективно выявлять районы филогенетического дерева, которые требуют осторожной трактовки. Кроме того, это показывает, что топологический критерий является биологически адекватным, и его минимизация приводит к более состоятельным с эволюционной точки

зрения схемам.

Филогенетический анализ вирусных РНК-полимераз.

В последнее время усилия многих авторов были направлены на расшифровку последовательностей геномов вирусов. В результате накопилось много информации о последовательностях важнейшего вирусного фермента - РНК-зависимой РНК-полимеразы.' Сравнение этих структур у ряда вирусов позволило вывести консенсус (Камер и Аргос, 1984, Кунин и др, 1987). Такой консенсус был затем найден в последовательностях ряда позитивных рибовирусов, у которых локализация гена РНК-полимеразы ранее проведена не была. Кунин и др. (1987), провели выравнивание последовательностей РНК-полимераз позитивных рибовирусов (всего около 30 последовательностей). Мы использовали этот массив данных для построения деревьев МТП. Такое дерево приводится на рис. 4.

-«BNYW

Рисунок 4. Дерево МТП, построенное по последовательностям РНК-полимераз позитивных рибовирусов.

- 23 -

Анализ его структуры позволяет выявить г достаточно компактные обширные группы вирусов эукариот, представление о монофилии которых хорошо соответствует большой совокупности данных о.структуре других вирусных белков и механизмах экспрессии вирусных геномов. Одна из этих групп включает пикорнавирусы млекопитающих (ру и др.) и две группы вирусов растений (комо- и потивирусы), а другая - альфавирусы животных и ряд групп вирусов растений (тму и др.). Естественным также представляется выделение вирусов бактерий в отдельную ветвь (1£32 и др.). ■ С другой стороны, локализация некоторых ветвей в дереве вызывает сомнения. Так, РНК-полимераза вируса паралича сверчка (сгру), относимого к пикорнавирусам, не только не группируется с полимеразами млекопитающих, но и отстоит от них намного дальше, чем полимеразы многих других вирусов, имеющих значительные молекулярно-биологические отличия. В настоящее время не представляется возможным решить, связано ли это с тем, что последовательность РНК-полимеразы этого вируса эволюционировала с весьма высокой скоростью, и сохранила лишь, незначительное сходство с другими РНК-полимеразами на уровне, который не может обеспечить достоверные филогенетические выводы, либо с тем, что выравнивание этой отдаленной последовательности было проведено неоптимально. На ненадежность положения этой последовательности в дереве указывает и высокая величина локального топологичо сцого несопадения. Попытки перенести вершину, соответствующую вирусу паралича сверчка в другое место на дереве не приводят к улучшению глобального тополог>ического критерия, однако, положение ее в ряде других районов дерева лить ненамного хуже того, которое показано на рис. 4- Очевидно, что это подтверждает вывод о том, что удаленность этой последовательности от всех других обуславливает ненадежность ее положения в общей схеме, поэтому она, равно как и последовательность РНК-полимеразы коронавируса инфекционного бронхита кур 1В7, для которого величина

локяпъного топологического несовпадения также весьма велика, показаны пунктиром.

Определение последовательностей 5S рРНК микроорганизмов.

Работа проводились в сотрудничестве с исследователями из ю институтов Москвы, Киева, Риги и Пущино. В качестве исходного материала мы использовали примерно 50-1000 мг влажной биомассы (осадок клеток обычно в логарифмической фазе роста). Экстракцию РНК проводили в 0.01м Na-ацетатном буферном растворе рН 5,1 с 0,5$ доде-

цилсульфата натрия (SDS) фенолом при бо°с. РНК.метили in vitro 32

[ Р]-цитидиндифосфатом (рСр) при помощи РНК-лигазы бактериофага Т4 (Ингланд, Уленбек, 1978). Далее РНК очищали препаративным электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) с 7М мочевиной. Специфическую химическую модификацию РНК проводили по методу Питти (1979), а после гидролиза РНК анилином фрагменты разделяли электрофорезом в пластинах ПААГ размером 600x300x0,19 мм. В результате нами было определены последовательности 5s рРНК примерно 100 видов и штаммов прокариотических микроорганизмов (таблица 1), Таблица 1. Сведения о микроорганизмах, исследованных в данной работе.

Груша количество исследованных штаммов

Пурпурные бактерии . Метилотрофные бактерии - Метанокисляющие бактерии Олиготрод^е бактерии Тороидальные бал^а-р*«, Галофильные архебактерии Метаногенные архебактерии Другие

7 28

7 25

8 9

что составляет около 40% от числа всех опубликованных до настоящего времени. Ниже мы рассматриваем Некоторые частные вопросы филогении,

по^^йшшс D Дййи^й paöuxe .

Происхождение риюсетсий.

Риккетсии представляют собой своеобразную группу прокариот, отличительной чертой которых является облигатный внутриклеточный паразитизм. В связи с этим практически все представители этой группы являются возбудителями тех или иных заболеваний человека, животных или растений. Риккетсии известны уже очень давно, и до середины 20 века относились к вирусам, благодаря малому размеру и внутриклеточному паразитизму. Обнаружение клеточной организации риккетсий и наличия у них белоксинтезируицего аппарата позволило установить их прокариотическую природу, однако филогенетическое положение риккетсий оставалось абсолютно неясным.

Мы определили последовательности 5S рРНК двух представителей рода Rickettsia: R.prowazekii и R.moozeri. Сравнение показало, что они в наибольшей степени близки группе пурпурных несерных бакте_рий (подгруппа альфа по номенклатуре Вузе).

Интересно отметить, что именно к 5S рРНК бактерий этой группы близки 5S рРНК ' митохондрий растений (см. рис. 5). Нам представляется, что это может быть не Случайным совпадением, а отражать тот факт, что бактерии данной группы обладают способностью к образованию симбиотических ассоциаций с другими клетками, что в случае свободноживущих предшественников митохондрий привело к возникновению эукариотических клеток, а в случае риккетсий - к установлению паразитических взаимоотношений. Помимо схоп^'ва 5S рРНК, на родство риккетсий и предшественников митохоядр0® указывают

и другие косвенные данные, например, нал^*10 АДФ/АТФ-обменника.

- '

Филогенетический анализ легионелл.

Открытие легионелл и осознание роли бактерий этой группы в патогенезе ряда заболеваний было одним из важнейших открытий в медицинской микробиологии в 70-е годы. Наиболее известным и важным из легионеллезов является атипическая пневмония (болезнь легионеров). Легионеллы обладают рядом необычных свойств, что затрудняет их отнесение к какой-либо из известных групп бактерий. Многие исследователи считали, что легионеллы могут быть родственны риккет-сиям.

Людвиг и др. (1983) попытались определить филогенетическое положение легионелл на основе составления каталогов 16Б рРНК, однако не смогли сделать это с полной определенностью. "Филогенетическое положение легионелл не является бесспорным" - заключили авторы этой работы. .

Мы провели исследование 5Б рРНК пяти представителей рода 1^1опе11а: Ii.pneumophi.la: штаммы р}г11а<1е1р1г1а-1 И В1оот1п§1;оп, Ь.ЪогегаапИ, ъ.аито1ГИ и Ь.1оп£Ьеас11ае. При сравнении этих последовательностей выявилось, что они распадаются на две группы - в одну входят представители ь.рпешюрМХа, а в другую - все остальные, причем расстояние мевду группами превышает максимальное расстояние меаду последовательностями в пределах каждой из групп. Это согласуется с предложением выделить три последние вида в новый род -?1иог1Ьас^ег." Однако для окончательного суждения по этому вопросу необходимы ■ исследования других' представителей легионелл и близких родов.

При сравнении последовательностей 5Б рРНК легионелл и других бактерий максимальное родство было отмечено с группой пурпурных серных бактерий - Ес^Мог1юс1о8р1га и представителями семейства У1Ъг1опасеае, входящими в подгруппу гамма пурпурных бактерий (см. рис. 5). Таким образом, это позволяет однозначно отвергнуть

гипотезу о родстве легионелл и риккетсий. Пурпурные бактерии.

При сравнении результатов филогенетических исследований, проведенных на модели 16S и 5S рРНК неизбежно возникает вопрос о соотношении между филогениями этих молекул. Пурпурные и родственные им бактерии служили объектом широких филогенетических исследований с использованием олигонуклеотидных каталогов и полных последовательностей 16S РНК. В отличие от этого, до начала нашей работы была изучена лишь одна последовательность.5S рРНК из этой группы: Rhodos-pirillum rubrum. Мы решили восполнить этот пробел с целью сравнения выводов, которые можно сделать по этим различным молекулам рРНК. На рис. 5 приведена схема, на которой показано

ю««"»«*

Рисунок 5. Дерево МП, построенное по последовательностям 53 рРНК пурпурных и родственных им бактерий.

филогенетическое положение представителей супергруппы "пурпурные бактерии", а также нескольких грам-полокительных бактерий. Основной вывод из проделанной работы состоит в том, что филогенетические схемы, полученные по 168 и 5в рРНК, в общих чертах совпадают.

Л b

а <

с о а

о <

Представители рода НзхжЯорвеийотопав оказались довольно удаленными друг от друга в филогенетическом отношении, подтверждая справедливость выделения'Н.сарвиЗ^а и Л.врЬаегоЫез в новый род КюйоЬас^ег.

Пурпурные серные бактерии также характеризуются заметной филогенетической разобщендастыо. Так, Ои-отаиит не удается поместить шесте с Ес^МотйойоарЛга, что опять же соответствует выделению его в отдельное семейство Огготаиасеае.

В целом проблема филогенеза пурпурных бактерий не может считаться окончательно ршенной. Напротив, по нашему убеждению, исследование этого вопроса постепенно подходит к наиболее существенному и интересному вопросу - о соотношении фенотипа, филогении РНК и филогении сагах бактерий. Этот наиболее кардинальный вопрос всей филогенетивзе микроорганизмов, от ответа на который зависит стратегия создания микробной таксономии, может быть исследован применительно к отдельным группам в том случае, если будет накоплен достаточный: по объему и репрезентативности массив данных. Такой массив, вероятно, в скором времени будет получен для пурпурных и родственных им бактерий.

Парадоксальность сложишейся ситуации состоит в том, что филогения, выявляемая по рибосшальной РНК, и классическая систематика, основанная на большей жди меньшей совокупности фенотипических признаков, не могут быть совмещены на равноправных началах. В случае, если мы предполагав«, что филогения РНК отражает истинный ход эволюции бактерий» то мы вынуждены предположить либо конвергентный характер большинства признаков (среди которых тип метаболизма, морфология и т.д.), либо горизонтальный перенос систем соответствувдих генов. В противном случае мы вынуждены постулировать горизонтальны® перенос самих генов рибосомальных РНК. Для того, чтобы решить этот всшрос и совместить мозаику разнообразных

признаков, удачно охарактеризованную Заварзиным термином "простран-. ство логических возможностей", с представлением о канонической дихотомической эволюции, либо отвергнуть саму применимость последнего представления к микроорганизмам, необходимо подробно исследовать молекулярную филогению различных систем бактерий, а не только рибосомального аппарата. Представляется, что пурпурные бактерии, благодаря разнообразию их свойств и подробно изученной филогении рибосомальной РНК, являются хорошим объектом для проведения такого анализа.

Метилотрофвне и метанокислявдие бактерии.

Одним из важнейших фенотипических признаков, используемых в традиционной систематике бактерий, являются трофические свойства, способность утилизировать те или иные субстраты. Метилотрофия - это способность использовать различные с1 соединения. Вполне естественен вопрос о систематическом значении -этого признака, его связи с филогенией. Мы исследовали ряд метилотрофных и метанокислявдих бактерий, как облигатных, так и факультативных. Дерево, показывающее филогенетические связи между ними, приведено на рис. 6. Видно, что в целом с1-утилизирующие бактерии распадаются на несколько, ветвей, что согласуется с их фенотипическими свойствами. Так, облигатные метанокисляицие и облигатные метилотрофвые бактерии расположены.в пределах обособленных кластеров, что свидетельствует о монофилетическом происхождении этих признаков.

Положение факультативных метилотрофных бактерий на общем дереве показывает, что они расположены вперемежку с формами, для которых способность утилизировать с1 соединения не показана (см. например рис. 5). В целом, признаком метилотрофш обладают бактерии, которые, по классификации Вузе, принадлежат к супергруппе "пурпурные бактерии". Выше мы отмечали, что для этой группы характерна мозаика признаков, и метилотрофия является одним из них. Поэтому

нурномюяошим

Рисунок 6. Дерево, показывающее связи между бактериями, утилизирующими- с1-соединения.

окончательное решение вопроса о дивергентном или конвергентном характере этого свойства требует дальнейшего исследования с использованием более представительного набора форм и детального анализа филогении отдельных ключевых ферментов метаболизма с1 соединений.

Проводя эту работу, мы исследовали не только коллекционные, хорошо охарактеризованные культуры, но и новые изоляты, прошедшие лишь первичное описание и идентификацию по классическим тестам. Изучение последовательностей 5S рРНК позволило в ряде случаев выявить ошибочность выводов, сделанных на основе этих тестов.

Так, организм, идентифицированный вначале как "Mycobacterium vaocae" штамм 8, обладает 5S pFHK, отличавдейся лишь на 4 нуклеотида от Blastobaoter viscosus, то есть находится на филогенетическом расстоянии, характерном для- представителей одного рода. Таким образом мы можем не только констатировать ошибочную идентификацию, но и предположить причину возникновения этой ошибки. Известно, что

В1ав-ЬоЬас^ег способен образовывать гифоайразные клетки, которые при микроскопическом исследовании могли бить ошибочно приняты за.мико-

бактерии.

Это показывает, что ухе сейчас, несмотря на фрагментарность наших сведений о последовательностях 5Б рРНК бактерий, их определение может дать не меньше, а зачастую больше, чем все остальные тесты, проводимые при первичной идентификации. Мы считаем, что простота такого анализа прзволяет ставить вопрос о введениии непреложного требования определения' последовательностей зб рРНЙ в ходе первичной иде нтификации, что существенно снизит вероятность грубых ошибок. Олиготрофше бактерии.

Эта экологотрофичеекая группа микроорганизмов, включает такие роды как Саи1оЬас1;ег, НурйотАсгоМит, НурЪааюпаа, Rвnobaotвгi М1ого-оус1ив, Ргоз^есот1ого1)1ит, 8в11Ьег1а и щр (Никитин, 1985). Они обитают преимущественно в почве и пресной воде, и для них характерно приспособление к очень низкой концентрации субстратов; зачастую' их рост даже ингибируется такими концентрациями субстратов, которйё являются оптимальными для роста обычных мшфоорганизмов. Анализ 5Б рРНК показал, что, за одним примечателен исключением (тороидальные бактерии), все они образуют филогенетически компактную группу, входящую в супергруппу "пурпурные бактерии". Интересно, что для некоторых олшмгщиВиа бактерий черезвычайно характерна своебразная, довольно сложная форма, наличие простегав (выростов), увеличивающих поверхность клеток. Разнообразны они щ в формально-таксономическом отношении. Тем не меже, сравнение их 58 рРНК показывает, что некоторые роди (М1огооуо1иа и ЕепоЪао1;ег) по этому признаку вполне могли бы быть объединены в один род.

Анализ липидов олиготрофных бактерий, проведенный Никитиным, Цирениной и Андреевым (1986), показывает хорошее соответствие с

- 32 -

результатами сравнения 5s рРНК. Таким образом, можно сделать вывод о том, что разнообразие морфологических признаков олиготрофных бактерий являтся вторичным, недавним приобретением, которое имеет явное приспособительное значение и поэтому не может служить основой для филогенетических построений. Тороидальные бактерии

Исследование 5S рРНК трех тороидальных бактерий: Spirosoma sp., Microcyclus major и Microcyclue flavus показало, что последняя бактерия, вероятно, идентична Spirosoma, а все они - чрезвычайно удалены от остальных бактерий. В связи с этим не вызывает сомнения необходимость и справедливость выделения Microcyclus major в отдельный род piectobacillus, для того чтобы подчеркнуть его отличие от Microcyclus aquaticus, который определенно входит в только что обсуждавшуюся группу олиготрофов.

Spirosoma и Flectobacillus, хотя и различаются между собой по 5S рРНК на довольно значительное число мутаций, максимально близки друг другу. Они имеют сходную делецию в шпильке "Е" 5S рРНК, что также является диагностическим признаком. Среди всех других бактерий, для которых известны лоследовательности 5S рРНК, наиболее близка тороидальным бактериям зеленая фотосинтезирующая бактерия Chlorobium limicola, 5S рРНК которой также была исследована нами (см..рис. 7). Ее 5S рРНК также содержит характерную делецию.

Родство тороидальных бактерий и зеленой бактерии Chlorobium достаточно отдаленное, но все же, вероятно, может считаться достоверным, поскольку подтверждается рядом других косвенных признаков (липидный состав). Масштаб филогенетических расстояний в пределах этой группы, несомненно представляющей самостоятельную линию развития эубактерий, показывает, что они дивергировали довольно рано, и ближе всего к грам-положительным бактериям.

Рисунок 7.,Общее дерево прокариот, построенное методом МТП

по последовательностям 5Б рРНК. Архебактерии.

Само выделение архебактерий в самостоятельное первичное царство живых существ целиком обязано исследованию молекулярной филогении 1&з рРНК. Выводы, сделанные на основании этой работы, были в дальнейшем подтверждены при исследовании других свойств этих своеобразных микроорганизмов, что привело к практически полному признанию того факта, что таксономический ранг этой группы сравним с рангом эукариот и всех остальных бактерий,

53 рРНК архебактерий до начала нашего исследования была изучена значительно хуже, чем 1бэ рРНК. Поскольку'мы считаем, что именно 5Б рРНК является перспективным объектом для экспресс-идентификации организмов, мы провели исследование примерно 25 штаммов архебактерий. В их число были включены как коллекционные культуры, так и недавно выделенные новые штаммы.

Мы исследовали две группы архебактерий - экстремально галофильные бактерии и метаногеные бактерии, в частности, выделенные недавно Жилиной и Заварзиным новые формы галофильных метаногенных бактерий. Результаты проведенных филогенетических исследований суммированы.па рис. 8. Филогения архебактерий, построенная по 53 рРНК, хорошо согласуется с филогенией, построенной по 1бэ рРНК. Видно, что гало-фильные бактерии образуют

на.оаттаитц» о ■ огатп |шити* /Д.. ' натро мососсг.^**

. О^О^^-аСТ«"!"»« швттвития 1

^^о^^^ги^итив 13 г»

очму1дастея

мтнмпамлпп«

ммимкоеси*

Рисунок 8.. Дерево МТП, построенное по последовательностям 5в рРНК архебактерий.

достаточно компактную группу, расположенную среди метаногенных бактерий, что указывает на их взаимное родство. Алкалофильные экстремальные галофилы, принадлежащие к родам Ка1;гопоЪасЪег и Ыа1;го-пососоиа, очень близки между собой.

Несколько наблюдений заслуживает серьезного внимания. Первое состоит в том, что изученные нами новые изоляты экстремально галофильных архебактерий, выделенные Звягинцевой и Тарасовым, и помещенные ими в новый вид На1оЪа^ег:шт <из-Ьг1Ьи1;из, оказались черезвычайно гетерогенными в филогенетическом отношении. Это

означает, что их следовало бы выделить по крайней мере в отдельные виды. Однако кроме последовательностей 5Б рРНК, никаких других оснований для этого нет. Все остальные признаки, которыми они обладают, весьма сходны.

На возможную причину такого очевидного несоответствия гетерогенности филогении и сходства фенотипа указывает другое интересное наблюдение, которое мы сделали, изучая один из штаммов Н.<ив1;г1Ъи1;и8 - штамм 13. При очистке 58 рРНК из этого штамма электрофорезом в ПААГ в зоне 55 рРНК наблюдаются три полосы. Такая гетерогенность иногда наблюдается у некоторых организмов и обычно связана либо с отсутствием у части молекул одного -двух концевых нуклеотидов, либо с некоторой гетерогенностью последовательностей, связанной с одновременной активностью в клетке нескольких слегка различных копий гена 5Б рРНК. В случае Н.<Ш!1;г1Ьи1;и® 13 определенные наш две последовательности 5Э рРНК (из верхней и средней полос) оказались различными на 25 нуклеотидов. Насколько нам известно, в литературе не сообщалось о гетерогенности такого масштаба в пределах одного генного семейства.

Причин, объясняющих наличие такого генного полиморфизма, может быть две. Первая и наименее вероятная состоит в горизонтальном переносе рибосомальных генов от какой-либо другой экстремально гало-фильной архебажпшри. Вторая - независимая эволюция в течении длительного времени отдельных копий генов рРНК. Такая возможность вытекает из нейтралистской теории молекулярной эволюции. Поскольку галобактерии населяют столь экзотическую экологическую нишу, они находятся под действием черезвычайно сильного стабилизирующего отбора, заставляющего консервировать фенотипические признаки, что делает последние мало информативйыми в филогенетическом отношении. Последовательности макромолекул, в данном случае рРНК, в противоположность этому испытывают гораздо меньшее селективное давление,

которое, вероятно, не намного отличается от того, которое испытывают рРНК других организмов. В результате взаимные скорости эволюции фенотипа и генотипа оказываются существенно различными у галофильных архебактерий, с одной стороны, и обычных - с другой. В результате длительной эволюции и дивергенции отдельных копий генов рРНК образуются "химерные" виды, каким, вероятно является Н.й1з1;г1ьи1;из 13. При утрате различных копий "^яов рРНК могут возникнуть бактерии, которые при формальн. • сравл:нии последовательностей 5Э рРНК окажутся существе! Различными, в то врь " как в действительности являются близкородствеьлыми. Таким о<5р_^и.,:. нейтральная эволюция независимых копий - представителей генного семейства с последующей утратой отдельных копий может наряду с горизонтальным-переносом служить основой часто наблюдаемой "мозаичности" признаков бактерий.

Это рассуждение вызывает сомнение в применимости молекулярно филогенетического анализа, основанного на одном признаке, для получения надежных филогенетических схем. Следует отметить, что для того чтобы избежать ошибочных выводов, следует, с одной стороны, тщательно исследовать генный полиморфизм анализируемого признака, и с другой - не ограничиваться анализом лишь одаого гена (генного семейства).

Исследование галофильных метаногенных бактерий показало, что они на дереве группируются надалеко от экстремально галофильных бактерий, и, возможно, могут быть переходными формами. Анализ 5Б рРНК позволяет сделать вывод, который можно сделать и на основе анализа 1бБ рРНК, о том," что метанагены являются черезвычайно филогенетически- разнородной группой; возможно, " это отражает древность этих бактерий. Они являются как бы связующим звеном между экстремальными галофилами,. термоацидофиламя, серозависимыми бактериями И оубчктериями.

- 5? -

Разнче микроорганизмы

Помимо описанных выше больших групп микроорганизмов, мы исследовали 5S рЕНК некоторых отдельных представителей прокариот, что позволило уточнить или впервые определить их филогенетическое положение.

Филогенетическое положение Deinococous radiodurans, своеобразного микроорганизма, отличительной чертой которого является экстремальная устойчивость к ионизирующему излучению, не было известно. Определение последовательности 5S РНК этой бактерии позволило сблизить ее по этому признаку с бактериями рода Thermus. Положение группы Thermus - Deinoooocus на общем дереве прокариот показывает, что они отдаленно родственны супергруппе "пурпурные бактерии", однако, вероятно, дивергировали в самом начале эволюции этой супергруппы и представляют собой самостоятельную ветвь. На родство тьегшиз и Deinoooocus указывают также и другие данные (например, относительно клеточной стенки), полученные в последнее время.

Frankia - представитель азотфиксирующих актиномицетоподобных микроорганизмов,. при анализе 5S рРНК оказался близким актиномицетам и в филогенетическом отношении.

Определение последовательности 5S рРНК Vibrio alginolyticus, бактерии, у которой Скулачевым и др. (1986) показано наличие своеобразного механизма мембранного энергетического сопряжения ("Na-энергетика"), позволило подтвердить, что этот организм по своей филогении . не отличается сколько-нибудь значительно от других представителей vibrionaoeae. Это дало основание предположить, что и другие вибрионы ' также могут обладать этим своеобразным физиологическим механизмом.

Эукариотический микроорганизм Plasmodium bergbei - малярийный плазмодий - оказался первым представителем класса споровиков, для которого било исследовано филогенетическое положение определением

последовательности рибосомной ГНК. Этот организм в наибольшей степени оказался близким инфузориям (хотя и весьма отдаленно). К сожалению, несмотря на важность для понимания ранних этапов эволюции эукариот, молекулярная филогения простейших исследована не лучше, чем филогения прокариот, и в этом отношениии предстоит провести еще' большую работу. На рисунке 9 показано тональное филогенетическое дерево, построенное по последовательностям 5Э рРНК представителей трех царств.

, Рисунок 9. Тотальное дерево, построенное методом МТП по последовательностям 5Б рРНК. Совершенно очевидно, что дерево распадается на множество обособленных ветвей, взаимное расположение которых вряд ли может .восприниматься как однозначно' установленное, поскольку набор входящих в него видов далеко не репрезентативен. Тем не менее очевидно, что его общая структура хорошо соответствует общепринятому

делению на три царства: эукариоты, эубактерии и архебактерш. 4.5S РНК

При препаративной очистке электрофорезом во многих препаратах РНК из различных бактерий, наряду с 5S рРНК обнаруживается другая РНК со слегка большей подвижностью. У бактерий, принадлежащих к роду Legionella, эта полоса заметна наиболее отчетливо. В этом случае интенсивность ее мечения in vitro рСр примерно в ю раз выше, чем 5S рРНК, в то время как у других бактерий эта полоса обычно является минорной. Определение последовательностей РНК из этой полосы показало, что она гомологична 4.5S РНК, наделенной.ранее из Escherichia coli. Сходство 4.5S РНК, выделеноЙ из различных бактерий лишь ненамного ниже, чем сходство соответствующих 5S рРНК. Эволюционная консрвативность указывает на то, что она скорее всего выполняет важную функцию в клетках.

Роль 4.5S РНК в клетке неясна. Известно лишь, что она требуется для нормального протекания процесса синтеза белка (Фурнье, 1987). Значительное по сравнению с другими, бактериями, количество этой РНК в бактериях рода Legionella позволяет предложить этот объект для изучения функции и механизма действия этой РНК.

Для 4.5S РНК E.coli была предложена вторичная структура в виде единой шпильки с незначительными нарушениями спиральной структуры. Анализ последовательностей других 4.5S РНК показывает, что нуклео-тидные замена ша тагеаашию с E.coli являются взаимно компенсирупдими и не нарушают шпилькообразвой вторичной сруктуры, показывая, что именно такая вторичная структура является биологически важной.

Интересно отметить, что мы пока не обнаружили 4.5S РНК у бактерий за пределами филогенетической группы, выделенной Вузе при анализе 16S рРНК и обозначаемой им как "пурпурные бактерии групп бета и гамма". Это наблюдение находится в некотором противоречии с важностью функции этой молекулы. Помимо гипотезы о том, что мы не

- 40 -

обнаружили ее благодаря небольшого* гсличеству или несовершенству применявшихся методов, можно предполостиъ, что либо функция, выполняемая этой РНК, осуществляется молекулами РНК с другой электрофоретической подвижностью, либо какими-то белками, либо вообще не нужна в этих бактериях. Ответ на этот интересный вопрос может быть получен при сравнительном исследовании различных микроорганизмов.

Определение биологической природы агента КПН - предполагаемого возбудителя вилюйского энцефалита.

Выше мы продемонстрировали эффективность сравнения последовательностей биополимеров для уточнения идентификации и клас-. сификации микроорганизмов. Помимо этого, такой подход может успешно применяться и для . экспресс-идентификации вновь выделяемых микроорганизмов. Ниже мы приведем лишь один пример, показывающий эффективность этого подхода для целей практической определительной систематики.

В ходе поиска этиологического агента вилюйского энцефалита -тяжелого неврологического заболевания, эндемичного для ряда районов Якутии, был выделен агент, обозначенный КПН, размножающимся в -культуре клеток. На основании ряда косвенных данных было высказано предположение, что этот агент, во-первых, является возбудителем вилюйского энцефалита, и во-вторых, представляет собой РНК-содержащий вирус. Однако, несмотря на почти ю-летние исследования с применением канонических методов вирусологической идентификации, сколько-нибудь определенной его характеризации'достичь не удалось. Ряд его свойств оказался весьма необычным, а ряд - не удалось определить совсем": так, морфологические исследования остались безрезультатными.

В ходе изучения макромолекулярного синтеза в зараженных агентом КПН культурах и при исследовании состава очищенного агента наряду с

тремя видами высокомолекулярной РНК (20S) был найден набор низкомолекулярных РНК, по своему поведению при электрофорезе в ПААГ напоминавший тРНК и 5S рРНК (рис. ю).

Рисунок ю. Электрофорез в ПААГ нм РНК, выделенных из очищенного

агента КПН (А,Б), незараженных клеток СШВ (Д), клеток, зараженных агентом КПН (Е), тРНК (Г) и 5S рРНК E.coli (В).

Такой результат заставил поставить под сомнение вирусную природу агента КПН, поскольку вирусы не содержат рибосомального аппарата. Определение последовательности 5Б рРНК этого агента показало ее полную идентичность 5Б рРНК простейшего из класса саркодовых -Асап1;ЬшпоеЬа саз1е1ап!1.

Такой результат позволил однозначно идентифицировать агент КПН как амебоидное 'простейшее и предположить, что вилюйский энцефалит является амебиазом ЦНС. Такая определенная - идентификация биологической природы агента КПН открывает перспективу целенаправленного поиска амеб в организме больных и окружающей

среде, что может подтвердить или опровергнуть выдвинутую гипотезу. В любом случае, это существенно продвигает вперед исследование природы этого заболевания. Заключение

В этой работе мы ставили перед собой задачу создания нового эффективного подхода к систематике микроорганизмов, основанного на филогенетическом анализе последовательностей биополимеров и продемонстрировать его применимость для решения частных классификации микроорганизмов. При этом мы не стремились к исчерпывающему решению вопросов филогении и систематики, отдавая себе отчет в том, что реконструкция хода эволюционного процесса представляет собой намного более сложную задачу, нежели построение дерева по одному признаку. Мы органичились определением последовательностей 5Э рРНК у возможно более представительного множества бактерий и попытались применить новый подход, свободный от часто используемых априорных ограничений для построения предполагаемых филогенетических деревьев. Ценность таких работ состоит в том, что они могут служить эвристической основой для последующего исследования новых групп организмов, которое может либо подтвердить, либо опровергнуть предлагаемые филогенетические гипотезы. На настоящем этапе они кроме того призваны помочь в формулировании новых принципов систематики микроорганизмов. Результаты, полученные в данном исследовании позволяют рекомендовать определение филогенетического положения бактерий путем сравнения последовательностей 5в рРНК для использования в качестве непреложного элемента при характеристике вновь выделяемых и описываемых микроорганизмов. Очевидно, что новый подход к филогенетическому анализу имеет хорошую перспективу и может служить основой разнообразных работ, посвященных вопросам эволюции и систематики микроорганизмов. Кроме того, с нашей точки зрения, имеет перспективу и само, развитие топологического подхода к

реконструкции филогении. В частности, необходимо провести более углубленное теоретическое обосновани нового метода,филогенетической реконструкции, включая компьютерную симуляцию эволюции биополимеров. Дальнейшему усовершенствованию могут подвергнуться алгоритмы построения деревьев МТП. Комплекс программ для филогенетического анализа следует сделать более интерактивным, его следует адаптировать к вычислительным средствам большей мощности, для того чтобы сделать возможным совместный анализ большего числа признаков большего числа видов. Этот подход может стать основой одного из новых направлений молекулярной филогенетики в будущем.

ВЫВОДЫ

1. Определены последовательности 5S рибосомных РНК примерно too видов и штаммов прокариотических микроорганизмов, что составляет примерно 40# мировой коллекции аналогичных данных.

2. Для построения филогенетических деревьев использован подход, названный принципом максимального топологического подобия, ставящий целью построение такого дерева, топологические свойства которого были бы идентичны либо в максимально возможной степени близки топологическим свойствам исходной матрицы попарных расстоян»®» Дзе решения этой задачи применен математический аппарат для сравнения топологии матриц попарных расстояний и деревьев. Этот принцип имеет следующие достоинства:

- метод свободен от допущений относительно особенностей хода эволюционного процесса, его равномерности, относительных скоростей, минимальности и т.д.

- метод позволяет находить точные решения для класса матриц более широкого, нежели класс аддитивных матриц

- метод в достаточно широких пределах устойчив к погрешностям в

определении взаимных расстояний

_ щ _

- мета* позволяет получать объективную количественную оценку топологии деревьев, построенных различными методами

- метод позволяет выявить те места, в построенном дереве» в которых величины топологического отклонения максимальны, указывая тем самым на необходимость более осторожной биологической интерпретации этих районов

- метод позволяет сформулировать несколько вычислителвш эффективных алгоритмов для построения филогенетических деревьев»

3. Созданы алгоритмы для построения филогенетических деревьев максимального топологического подобия, характеризующиеся-, высота®

вычислительной эффективностью (сложность ~ ОхН ), возможностью1 получения различных альтернативных решений с различными величинами топологического несовпадения и возможностью работай нетолько с последовательностями биополимеров но иг с дщотпив признаками, информация о которых может быть представлена ® виде матрица попарных расстояний.

4. Создан комплекс компьютерных программ для филогенетичеенпго) анализа последовательностей биополимеров. Этот комплекс; шсшетг бйипь использован для нахождения филогенетических деревьев к лев другим: признакам объектов, которые представимы в виде матриц® »п»ярн(азк расстояний.

5. Применение разработанного подхода к анализу определенных в данной работе последовательностей 5S рРНК позволило исследовать некоторые частные вопросы филогении:

- впервые определено филогенетическое положение Rickettsia, prowazekii и .' R.moozeri, уникальной группы внутриклеточных паразитических прокариот, и высказано предположение ой их родстве с предшественниками митохондрий эукариот.

- на основе определения последовательностей 5S рРНК 5 видов рода Legionella сделан определенный вывод о положении этих бактерий

- HS -

среди организмов, родственных пурпурным серным бактериям и энтеробактериям, а также выяснены филогенетические взаимоотношения в пределах рода.

- сделан вывод о том, что бактерия Ве1поооооиз гасИойигагш родственна бактериям рода тьегшшз, что позволяет поместить эту до сих пор неклассифицированную бактерию в общую систему прокариот.

- на основе исследо^анйкн рРНК 7 видов пурпурных фотосинтезирутшщх <?акте|!УРЬ^лан вывод о совпадении результатов анализа 16Б и ри^осомаш? РЙК, и тем самым еще раз подтверждена пригодность 5Б рРНйРв кй^ёстйеэ'объекта для экспресс-идентификации

яг" оопло,.

мшфоорганизмов.

- "сравнение 53 рРНК зелено^^тосинтезирующей бактерии СЫ-огоЫит 11т1оо1а и тороидальныхл§§ктерий Flectobaoi.il.us и Бр^гозота показало, что эти бак^ерш!*6 родственны и составляют группу, черезвычайно удаленную^ё филогенетическом отношении от всех остальных исследованных эубактерий.

- исследование 9 штаммов экстремально галофильных архебактерий ОТНОСЯЩИХСЯ К родам На1оЬа^ег1ит, НаЮсоссиз И Natronobactertum и Natгonoooocus выявило своеобразие соотношения филогенетических и фенотипических свойств бактерий этой группы, что заставляет усомниться в надежности молекулярно филогенетического анализа единичных признаков для систематики бактерий этой группы.

- исследованние 8 штаммов галофильных метаногенных архебактерий показало, что они родственны как экстремально галофильным бактериям, так и метаногенным бактериям.

- исследование примерно зо видов так называемых олиготрофеых бактерий показало, что эта группировка, выделенная по эколого-трофическим особенностям, является довольно однородной е филогенетическом отношении. Широкое морфологическое разнообразие, наблюдаемое у бактерий этой группы, плохо коррелирует с

филогенетическим положением,^¡щщ^р ^ на вторичность морфологических признаков и. ^^п^^вдаюсть, для , решения филогенетических вопросов запрд^ам^таксономшюского. уровня отдельного рода. ,0. . , ц. *[ ü

- исследование примерно 35 ¡ВВДРВ^ и гоЩ|аммо^ п кркроорганизм^в, утилизирующих отсоединения,, поз^^д^^дполокить, признак факультативной метилотрофии не явлр^ся ^онофилетцческим, в то время как облигатные метанокисляющие бактерии составляют обособленный кластер на филогенетическом дереве. Применение анализа последовательностей 5S рРНК некоторых бактерий этой группы позволило выявить неточности в их первичной классификации проведенной классическими методами.

- Впервые методами молекулярной филогенетики изучено положение Plasmodium berghei - представителя класса споровиков.

6. Исследованы 4.5S РНК с неизвестной функцией у бактерий родов Legionella, Pseudomonas и Eotothiorhodospira. Эволюционная консервативность последовательностей позволила сделать вывод о важности этой молекулы для жизнедеятельности "пурпурных" бактерий, однако за пределами этой группы 4-.5S РНК пока не найдена.

7. Определена последовательность малой РНК, выделяемой из очищенных

1 ,ljr>

препаратов выращенного в культуре ткани предполагаемого возбудителя вилюйского энцефалита - агента КПН." "'идентичность этой последовательности 5S рРНК Acanthamoeba castellanii позволила однозначно определить биологическую природу этого агента и тем самым продемонстрировать эффективность анализа последовательностей биополимеров для идентификации микроорганизмов.

- 47 -

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

и. ¿UG-Шраванов, К.М.Чумаков. Некоторые характеристики штамма- КПН - яд®даолагаемого этиологического агента вшшйского энцефалита. ЯЬалек-тенетика, микробиол., вирусол., 1, стр. 27-34, 1983.

<2. ЮИЛйгвэков, А.С.Караванов. Выяснение биологической природа мп КПН. В кн.: Актуальные вопросы медицинской вирусологии, ащд звди С.Г.Дроздова. М., 1985. стр. 216.

3- K-U-Ohumakov, E.N.Kondratleva.' Phylogeny of phototrophio bacteria by sequencing of 5S rna. Тезисы v международного симпозиума no фотосинтезирукщим прокариотам, Гриндельвальд, 1985. сор. 1624. D-I-TTlkltin, K.M.Chumakov. The functional role of oligotrophia ogranlsms. В кн.: Microbial communities in soil, ПОД ред. V.Jensen, A.KJoller, L.H.Sorensen, Elsevier publ., London and N.Y., 177-189, 1985.

5. K.M.Чумаков, О.А.Огаркова. Происхождение риккетсий. Труда всесоюзн. съезда миробиол. об-ва, т. 1, стр. 53, 1985.

6. K.li.Ghumakov, A.S.Karwrancrr. Ppelielnary characterization of an organism isolated troa tbe case «С WLluy encephalomyelitis indicates a jpiBiMWal rathe- than viral, aetiology.

9- 1127-1133» 1985.

7. К.М.Чумаков, ттгпшиин. И-1.Пщргиина. Филогенетическое положение олиготрофных <гя»пуиД. Швеетия АН СССР, сер. биол.. стр., 125-131, 1986.

8. b.E.Bakeeva, А.1.Grachev, A.L.lfetlina, V.P.Skulaehev, K.H.Ohumakov. The sodium cycle. III. Vibrio alginolyticus resembles Vibrio cholerae and some other vibriones by flagellar motor and ribosomal 5S-RNA structures. Biochim.biophys. acta, -850, l>- 466-472. 1986.

9. К.М.Чумаков, И.С.Тартаковский, О.А.Огаркова, С.В.Прозоровский.

Изучение филогении бактерий рода Legiorteil а путем определения последовательностей нуклеотидов рЗ рибосомной РНК. Молек.генетика, микробиол., вирусол., 8, стр. 38-40,

10. А.Е.Булыгина, К.М.Чумаков, А.И.Нетрусов. определение последовательностей 5S рибосомной РНК ряда метилотрофных бак терий. В сб. Физиология, генетика и биохимия метилотрофных бактерий. стр. 11-16, Киев, 1986.

11. К.М.Чумаков, И.С.Звягинцева, А.Л.Тарасов, Т.Н.Жилина, Г.А.Заварзин 5S РНК у архебактерий. Журнал общей биологии, т. •68, С. 167-184, 1987.

12. K.M.Chumakov. Evolution of nucleotide sequences. В кн.: Soviet Soi. Rev., V.P.Skulachev, éd., vol.7, 215-264, 1987.

13. Е.В.Кунин, A.E. Горбаленя, К.М.Чумаков, А.П.Донченко, В.М.Блинов. Эволюция РНК-зависимых РНК полимераз позитиышх рибовирусов. Молек. генетика, микробиол., вирус, т. 7, стр. 27-39. 1987.

14. Л.Е.Бакеева, А.Л.Драчев, А.Л.Метлина, В.П.Скулачев, К.М.Чумакор. Сходство Vibrio alginolyticus.V.chol. и некоторых других вибрионов по строению фибриллярного мотора и структуре 5S -ГНК. БИОХИМИЯ Т. 52, С.8-14, 1987.

15. К.М.Чумаков, С.В.Юшманов. Принцип максимального топологического подобия в молекулярной систематике. Молек. генетика, микробиол. вирус. 1988, т. 3, 3-9.

16. С.В.Юшманов, К.М.Чумаков. Алгоритми построения филогенетических деревьев максимального топологического подобия. Молек. генетика, микробиол. вирус. 1988, т. 3, 9-15.

17. Е.В.Кунин, К.М.Чумаков, С.В.КШманов, А.Е.Горбаленя. Эволюция РНК-зависимых РНК-полимераз позитивных рибовирусов: сравнение филогенетических деревьев, построенных различными способами. Молек. генетика, микробиол. вирус. 1988, т. 3, 16-19.

- +S -

у чао глюс сьш^лл*

Л ¿ог>*11123е/

Подписано ж тчятш i9.C5.iS.

Л- Формат 60x90/16.

Усл. пен. л. .^¡0 Уч.-иад. л. 2^0

Тираж Заказ № /346

Ордена 'Знак Почета'издательство Московского университета. ЮЗООЭ, Москва, ул. Герцена. 5/7. Типография ордена 'Знак Почета" издательства МГУ. И9899, Москва. Ленинские горы.

Информация о работе

Чумаков, Константин Михайлович
доктора биологических наук
Москва, 1988
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы