Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ полиморфизма ДНК, выявляемого гипервариабельной пробой ДНК фага М13 в популяциях человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ полиморфизма ДНК, выявляемого гипервариабельной пробой ДНК фага М13 в популяциях человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РАМН

ОГК Ой На правах рукопиеи

4 1 УДК 575.591.

г""-;

СЕМИНА Елена Владимировна

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ДНК, ВЫЯВЛЯЕМОГО ГИПЕРВАРИАБЕЛЬНОЙ ПРОБОЙ ДНК ФАГА М13 В ПОПУЛЯЦИЯХ ЧЕЛОВЕКА.

03.00.15.-генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993 г.

Работа выполнена в лаборатории генетической эпидемиологии Медико-генетического научного центра РАМН. Директор - член-корреспондент РАМН, профессор В.И.Иванов.

Научные руководители: член-корреспондент РАМН, профессор Е.К.Гинтер; доктор биологических наук, профессор С.А.Лимборская;

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, В.А.Спицын; доктор биологических наук, Ю.Е.Дуброва.

Ведущее учреждение: Московская Медицинская Академия им.Сеченова РАМН.

Защита диссертации состоится "_" _1993 г. в

_часов на заседании Специализированного ученого совета

(Д.001.16.01) Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: Москва, 115478, ул.Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Медико-генетического центра РАМН.

Автореферат разослан "_"_1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук, профессор Л.Ф.Курило

Актуальность проблемы.

Изучение генетической структуры популяций и факторов ее обуславливающих является одной из ключевых задач популяционной генетики.

Требования, предьявляемые к фенотипическим и генетическим системам, привлекаемым исследователями для описания -генетической структуры популяций можно суммировать следующим образом - ясный характер наследования, выраженный широкий полиморфизм, четкое различение аллелей, селективная нейтральность аллелей и их сочетаний, если исследование специально не изучает действие фактора отбора и методическая простота использования (Roberts D.F.,1980). Многочисленные генетические маркеры и фенотипические признаки, традиционно используемые популяционными генетиками, не всегда им удовлетворяют. Так, антропологические и дерматоглифические признаки имеют недостаточную и сложную наследственную компоненту, биохимические маркеры часто проявляют слабый или ограниченный определенными расовыми и этно-территориальными группами полиморфизм, подвержены действию отбора (Schanfield M.S., 1980). Нашедший широкое применение в популяционной генетике метод использования в качестве аналога генетического маркера фамилий также имеет свои недостатки (Morton N.E.,, 1970), частично обсуждаемые ниже в настоящей работе.

Кроме того, получение достоверной информации о генетическом родстве требует одновременного обследования популяции по многим генетическим системам (Рычков Ю.Г., 1974; Животовский Л.А. 1992), что значительно усложняет методическую часть работы. При медико-генетическом описании населения, когда обследованию подвергаются большие подразделенные популяции, обьем работ возрастает еще больше. Таким образом, актуальной задачей популяционной генетики является поиск новых наиболее информативных и экономичных генетических маркеров.

Открытый недавно высокий полиморфизм ДНК, обнаруживаемый посредством мультилокусных проб и происходящий, в основном, за счет вариабельного числа тандемных повторов (VNTR), составляющих аллели некоторого локуса и множественной представленности в геноме таких локусов (Jeffreys A.J., 1987; Рысков А.П., 1988), привлек пристальное внимание популяционных генетиков.

Менделевский характер наследования и соматическая стабильность картины гибридизации, селективная нейтральность минисателлитных локусов и возможность одновременного выявления нескольких гипервариабельных локусов относятся к явным достоинствам новой технологии.

Популяционно-генетические исследования, использующие полиморфизм, открываемый посредством мультилокусных проб, представлены в мировой литературе, однако пока недостаточно широко. Практически отсутствуют работы, -посвященные анализу популяционной структуры больших подразделенных популяций.

Мультилокусная проба ДНК фага М13 (Vassart et аГ, 1987; Рысков с соавт., 1987,1989) используется некоторыми авторами при описании различных популяций человека наравне с другими зондами

(Jeffreys et al., 1990), однако полученные результаты фрагментарны и не позволяют сделать вывод о возможности использования полиморфизма, открываемого настоящей пробой при сопоставлении популяций разной степени близости.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования состояла в изучении пригодности для популяционно-генетаческого анализа нового высокоинформативного маркера - гипервариабельной мультилокусной пробы ДНК фага M13, выявляющего широкий полиморфизм в популяциях человека.

Для этого было необходимо решить следующие задачи:

1) отработать методику выполнения и обработки индивидуальных "фингерпринтов" ДНК человека, позволяющую проводить сравнительный анализ популяций;

2) изучить характер наследования "фингерпринта" ДНК, выявляемого пробой ДНК фага М13;

3) изучить полиморфизм "фингерпринта" ДНК, выявляемого пробой ДНК фага M13, в популяциях человека разного иерархического уровня;

4) сравнить описание генетической структуры подразделенной популяции, получаемое с помощью метода "фингерпринтинга" ДНК, с другими, традиционно используемыми в популяционно-генетических исследованиях методами - т.е. оценить возможность описания микроэволюционных процессов с помощью нового полиморфизма;

5) изучить пригодность метода "фингерпринтинга" ДНК для изучения генетического родства удаленных друг от друга популяций, в том числе принадлежащих к другим расовым и этническим группам для оценки генетической дифференциации популяций на межэтническом и межрасовом уровне.

В работе впервые представлены статистически обработанные данные семейногоанализа "фингерпринтов" ДНК человека, полученных при гибридизации геномной ДНК человека с пробой ДНК фага М13. Оценены сегрегационная частота фрагментов, значения показателя сходства Ли, частота появления в потомстве "мутантных", отсутствующих у родителей фрагментов, проведен анализ на аллельность или сцепленностъ фрагментов ДНК, представленных на "фингерпринте".

Впервые представлены результаты изучения полиморфизма ДНК, открываемого зондом ДНК фага М13, в большой подразделенной популяции русских Кировской области, в выборках русских г.Краснодара, чувашей г.Чебоксары и тувинцев г.Кызыл.

Продемонстрированы выгодные стороны новой технологии -возможность адекватного описания как популяционной структуры большой подразделенной популяции, принадлежащей к одному этносу, так и генетической близости различных в этническом й даже расовом отношении популяций.

Практическая значимость

Результаты работы позволяют рекомендовать для активного использования в популяционно-генетических исследованиях новый маркер - мультилокусную пробу ДНК фага М13, выявляющую широкий полиморфизм в популяциях человека.

Полученные данные семейного и популяционного анализа могут быть использованы в медико-генетических и судебно-медицинских учреждениях при консультировании случаев со спорным отцовством и любых других, связанных с идентификацией личности. В работе сделаны необходимые для этого оценки сегрегационной частоты фрагментов, частоты "мутирования" к фрагментам новой длины в потомстве, популяционных частот встречаемости отдельных полос "фингерпринта" в популяциях русских, чувашей итувинцев, вероятности идентификации личности. Показана необходимость предварительного популяционного анализа материалас целью получения наиболее корректных оценок вероятности идентификации личности.

Кроме того, результаты работы могут быть интересны исследователям, занимающимся сцеплением генов с помощью мультилокусных проб.

Положения, выносимые на защиту.

1) Показано строгое менделевское кодоминантное наследование фрагментов, составляющих "фингерпринт", получаемый при гибридизации ДНК человека с зондом ДНК фага М13, средняя частота сегрегации полосы, представленной у одного из родителей указывает на преимущественно гетерозиготное состояние минисателлитных локусов; •

2) На изученном в работе семейном материале не обнаружено аллельных или сцепленных друг с другом фрагментов в пределах анализируемой зоны электрофореграммы от 1.9 до 6.67 тпн, что подтрерждается и данными популяционного анализа;

3) Средняя частота мутирования, вычисленная как частота появления у ребенка фрагмента новой длины, равняется 0.006 на фрагмент, что согласуется с данными, полученными другими авторами для сходных последовательностей;

4) Средние популяционные частоты отдельных полос "фингерпринта" ДНК, определенные в русских популяциях, в выборках чувашей и тувинцев демонстрируют широкий полиморфизм, открываемый посредством данного зонда в популяциях человека;

5) Генетические расстояния, определенные между всеми обследованными популяциями на основании частот отдельных фрагментов "фингерпринта" ДНК, вполне соответствуют априорно предполагавшейся степени близости изученных популяций;

6) Корреляция между генетическими и географическими расстояниями, определенная в подразделенной популяции русских Кировской области, равняется 0.68, что хорошо согласуется с тем фактом, что географические расстояния являются важным фактором формирования популяционной структуры русских популяций.

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации были доложены на Конференциях "Геном человека" в г.Переяславле в 1990г. и г.Черноголовке в 1993 г., а также на межлабораторном семинаре МГНЦ РАМН в мае 1993 года.

По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей и 6 тезисов.

Диссертация изложена на 110 страницах машинописного ' текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы. Указатель литературы содержит 70 отечественных и 82 иностранных библиографических источника. Диссертация проиллюстрирована 4 рисунками, 3 дендрограммами, 14 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Семейный материал. В работе были исследованы образцы крови, поступившие в лабораторию из медико-генетической консультации г.Москвы от семей с подозрением на различные наследственные заболевания, в основном с рецессивным характером наследования. Всего обследовано 40 ядерных семей: 80 родителей и 76 детей.

Популяционный материал. Сбор крови в популяциях Кировской области проходил на фельдшерско-акушерских пунктах, куда приглашались коренные жители села или поселка. В г.Краснодаре, г.Чебоксары Чувашской Республики и г.Кызыл Тувинской Республики выборка формировались на базе Центра по переливанию крови из местных доноров, в республиках особоевнимание уделялось предварительному анкетированию, так чтобы пробандами являлись только лица коренной национальности. Всего было обследовано 328 образцов крови.

Данные о распределении фамилий, собранные по спискам избирателей,'суммировались в списках наиболее часто встречаемых в данной популяции, к которым относили фамилии с частотой более 1) от списочного состава (Ельчинова Г.И., 1990).

Выделение высокомолекулярной ДНК человека из крови проводилось методом фенольной экстракции (Ма1е\л/ С.С.Р.1984). Электрофорез, гидролиз ДНК рестриктазой Берг 1, блоттинг-гибридизация проводились в соответствии с известными протоколами (Маниатмс Т.,1984; Уэллс Р. 1990). Радиоактивное мечение ДНК фага М13 фосфором проводили методом праймирования с последующей достройкой цепи при помощи фрагмента Кленова ДНК-полимеразы

(Уэллс P., 1990).

Анализ "фингерпринтов" ДНК производили в зоне от 2 до 20 тпн, поделенной на четыре подзоны - А, В, С и Д в соответствии с положениями фрагментов маркера молекулярной массы-ДНК фага, рестриктированной по Hind 111 (рис.2). Описание "фингерпринтов" заключалось в придании каждой отдельной полосе индивидуального "фингерпринта" некоторого наименования в соответствии с положением ее в 2-мм сетке, покрывающей каждую подзону. Дополнительными маркерами являлись фрагменты "фингерпринтов" с приданными им наименованиями некоторых конкретных индивидов, геномная ДНК которых наносилась на каждый форез (рис.2).

Статистическая обработка данных включала стандартные способы рассчета средних величин и среднего квадратичного отклонения (Рокицкий П.Ф., 1978), рассчета генетических расстояний по формуле Эвклида и построения дендрограмм (LB.Jorde, 1980). Вероятность идентификации личности в популяции рассчитывалась по формуле:

/ = 1-П(ДхР!)хП(1-Д)(1-Р1),

isl ¡=1

где Д=1 в случае присутствия полосы и Д=0 в случае ее отсутствия. Средняя вероятность идентификации личности в популяции определялась как среднее всех вероятностей идентификации конкретных индивидов или приблизительно вычислялась по формуле:

где р - средняя частота полосы, ах- среднее число

фрагментов у индивида. Алгоритмы рассчетов средней сегрегационной частоты, анализа на сцепленность или аллельность фрагментов и частоты "мутирования" приведены ниже в следующей главе.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 1.Семейный анализ "фингерпринтов" ДНК.

- Анализ сегрегации полос "фингерпринта".

"Фингерпринты" ДНК отдельных индивидов были проанализированы для фрагментов размерами от 2 до 23 тпн. В области от 6.67 до 23 тпн фрагменты встречались крайне редко. В области от 2 до 6.67 • тпн в среднем каждый родитель характеризовался наличием 11.4±1.85 и каждый ребенок 11.1±1.9 полос гибридизации, число полос колебалось в пределах от 7 до 15 на отдельном "фингерпринте". Видно, что ребенок не наследует полос, отличных от полос родителей (рис.1). При этом в среднем 50% полос ■фингерпринтов" родителей оказывалось общими и таким образом невозможно было проследить их происхождение на "фингерпринтах"

Рис.1. Картина гибридизации ДНК человека с зондом ДНК фага MI3. М- мать, О- отец, Р- ребенок. I и 2- номер семьи. Слева указано расположение фрагментов маркера ДЖ фагаА+Hind. III.

М, 5 а, ы

Рис.2. Картина гибридизации ДНК человека с зсндсм ДНК фага Ы13. М- мать. О- отец, Р- ребенок. 1,2, 3- номер семьи. Стрелкой отмечен фрагмент, присутствующий у Р!', но отсутствующий у обоих родителей ("мутация").

"ibPf 0,^ИЧ0г,м3р3р3о3

детей этой супружеской пары, а 2.7 специфические полосы ребенок в среднем наследовал от каждого родителя. Специфической передачи каких-либо фрагментов, связанной с полом родителя или ребенка установить не удалось.

Средняя сегрегационая частота полосы, встречающейся только у одного из родителей (усредненная на количество детей и количество положений) равняется 0.485, что соответствует гипотезе менделевского наследования и преимущественного гетерозиготного состояния локусов, формирующих "фингерпринт". Также были рассчитаны показатели сходства двух "фингерпринтов" по новой формуле, предложенной Ли ( и С.С., 1992), между родительскими парами и родителями и детьми и проверены их соответствия аналитической зависимости между данными величинами (Таблица 1). Средняя оценка сходства двух "фингерпринтов", рассчитанная на материале родителей, относящихся к разным брачным парам, не отличается от полученных оценок среднепопуляционного показателя сходства (см. ниже) и равняется 0.405. На фоне этого интересно явное превышение данного показателя (0.54) внутри родительской пары, т.е. между мужем и женой. Усредненный показатель сходства между родителями и детьми, равный 0.73, вполне соответствует установленной Ли аналитической зависимости между показателями сходства для случайных индивидов (II) и родителей и детей (Э), где 5=0.5+0.511. Так как данная аналитическая зависимость установлена Ли из предположения о менделевском характере наследования полос и частоте сегрегации признака 0.5, то соответствие наших результатов аналитической зависимости является дополнительным указанием на этот факт. Превышение показателя сходства между мужем и женой связано, возможно, с брачной ассортативностью. Следует отметить, что выборка семей формировалась в медико-генетической консультации из обращавшихся в нее по подозрению на рецессивную наследственную патологию и в ряде случаев был установлен конкретный диагноз - мукополисахаридоз, муковисцидоз, синдром Руси-Леви, фенилкетонурия. Логично предположить, что повышение показателя сходства внутри родительской пары указывает на существование некоторого инбридинга, проявлениями которого можно считать и неблагоприятный семейный анамнез.заставивший родителей обратиться в медико-генетическую консультацию (частые выкидыши, преждевременные роды, мультифакгориальные отклонения в развитии плода).

Таблица 1.

Значения показателя сходства Ли.

тип сравниваемой пары средний показатель

родитель/родитель * 0.405

муж/жена 0.540

отец/ребенок 0.735

мать/ребенок 0.732

родитель/ребенок 0.734

среднепопуляционный 0.410

* - сравнение проводилось между родителями, принадлежащими к разным супружеским парам.

Анализ на аллельноеть или счепленность полос, представленных на "фингеппринте".

При анализе на возможное сцепление или аллельноеть полос гибридизации "фингерпринта" не получено достоверных результатов. В первом случае предполагалось, что частота совместной сегрегации двух фрагментов ДНК должна приближаться к 1 тем в большей степени, чем больше сцепленных локусов, находящихся в фазе притяжения будет представлено на электрофореграмме. Во втором случае, напротив, предполагалось, что частота совместной сегрегации любых двух фрагментов, представленных у одного из родителей будет стремиться к 0 в тем большей степени, чем больше оба аллеля представлены на электрофореграмме. Реальная же частота совместной сегрегации любых двух фрагментов, определенная на материале 80 родителей и 76 детей не отличалась достоверно от 0.25. Это позволяет предположить, что, по крайней мере в большинстве случаев, фрагменты сегрегируют независимо друг от друга. Конечно полученный результат не позволяет исключить, что в некоторых случаях на электрофореграмме могут встречаться как тесно сцепленные, так и оба аллеля одного локуса. Процедура тестирования, включающая объединение в одном анализе фрагментов с разной локализацией, должна быть мало чувствительна к искажению независимого наследования отдельных фрагментов ДНК. Обычная процедура получения данных по малым родословным невозможна, поскольку не существует простого метода определения, какая из полос "фингерпринта" ДНК данного индивида представляет ту или иную полосу в картине другого индивида.

Возникновение новых аллелей минисателлитных локусов связано с мутациями в сайтах используемых рестриктаз, ошибками при репликации ДНК, мутациями в самих соге-последовательностях, но, главным образом, является следствием неравного обмена тандемными единицами при кроссинговере.

На обследованном материале у 5 из 76 детей наблюдалось наличие одного фрагмента, не обнаруженного ни у одного из родителей ( рис.2). Следовательно частота мутации, определенная в среднем на аллель для локусов, продукты которых обнаруживаются в диапозоне от 2 до 23 тпн, равняется 0.006. Аналогичные оценки, полученные для "фингерпринта" ДНК человека, равняются 0.004 на аллель (фрагмент ДНК) для мультилокусных проб (Фогель Ф., Мотульски А%, 1990), а для некоторых локус-специфических проб достигают 0.052 на аллель (^С.^Агеуэ, 1989).

Рис.3. Картина гибридизации Сфингерпринт") ДНК человека с зондом ДНК фага MI3. 1-16-с<5разщ1 ДНК человека из нескольких русских популяций. А, В, С и Д- зовы, на которые, согласно расположению фрагментов маркера ДНК фага Я + Hlnd III, разбивалась анализируемая зона электрофореграымы.

—2.0 тпн

к а

—6,7 s

С

—ч.ъ

■а.

а

-5,3

Рис.4. Картина гибридизации ДНК человека с зондом ДНК фага HI3. I-IS-образпн ДНК из русских популяций. Ы1 и Ы2- "фипгерпршгш"

конкретных индивидов, являющиеся дополнительными маркерами. Стрелками отмечены положения фрагментов, встретившихся практически во всех популяциях с частотой больше 0.5.

100 80 60 40 20

О I— —'И *'

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37

I L. ■mllmirn.lllilhllhlil

Бор

100 80 60 40 20 0

lLB-JiMlL,i«lii-LilllllllllliI

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37

Мухино

100 ! 80 { 60 j 40 |

20 I

■-.I. .bill...II..J li.liiHnil.

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37

Рис.5а. Частоты отдельных полос "фингерпринтов" ДНК для каждой популяции, изображенные в виде гистограмм. Внизу указаны номера установленных позиций, стрелка показывает расположение фрагментов маркера молекулярной массы- ДНК фага , рестриктированного Hind Ш.

Краснодар

100 : 80 60 40 20 !

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37

Чуваши

100 80 i

60 40 : 20

^.^lll.-itllil-jlllj-jjllljlllillllj-

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37

Рис.56. Частоты отдельных полос "фингерпринтов" ДНК для каждой популяции, изображенные в виде гистограмм. Внизу указаны номера установленных позиций, стрелка показывает расположение фрагментов маркера молекулярной массы-ДНК фага реетриктироаанного Hind 111.

2.Популяционный анализ.

Описаний полиморфизма ДНК, выявляемого пробой ДНК фага М13г в каждой популяции.

Расположение и этническая принадлежность популяций, обсуждаемых в настоящей работе обозначены на карте. Объем выборки в среднем составил 40-45 образцов крови. "Фингерпринты" ДНК отдельных индивидов были проанализированы для фрагментов размерами от 1.9 до 23 тпн. В области от 2 до 6.67 тпн частота встречаемости отдельных полос колебалась в пределах от 0.028 до 1. Область от 6.67 до 23 тпн заполнена редкими фрагментами со средней частотой встречаемости 0.045+0.015 и средним количеством полос на одного обследованного 0.17+0.04. Частоты редких фрагментов не использовались в дальнейшем популяционном анализе ввиду возможной высокой ошибки в идентификации полосы и определении ее частоты.

Частоты встречаемости отдельных полос по 37 позициям, на которые была разбита область от 1.9 до 6.67 тпн наглядно представлены на рис.5а и 56. Заметно выделяется частота полосы на позиции 23, равная 1 во всех популяциях. Кроме того, обращают на себя внимание полосы на позициях 5 и 14, частоты которых практически во всех обследованных популяциях превышают 0.5 (см. также рис.3 и 4). Средняя же частота встречаемости отдельного фрагмента а рассматриваемой области колеблется от 0.25 до 0.33, т.е. различается недостоверно и является практически одной и той же во' всех популяциях.

Число полос на одного обследованного представлено в Таблице 2. Видно, что этот показатель примерно одинаков во всех изученных популяциях.

Таблица 2.

Число полос на одного обследованного в каждой популяции

популяция ср.число полос у индивида популяция ср.число полос у индивида

с.Гордино 11.6±1.8 п.Косино 12.8+2.0

п.Бор 11.3+1.9 г.Краснодар 10.4±2.1

сЛема 12.9±2.0" г.Чебоксары 10.7+1.6

с.Мухино 12.1±1.6 г.Кызыл 10.0±2.0

Таким образом, средняя оценка вероятности идентификации конкретного лица не отличается в каждой популяции и равняется 9.82*10"11. Однако, следует отметить, что в пределах каждой популяции можно выделить наиболее значимые для идентификации личности дискретные положения полос. Так, что вероятность идентификации конкретного лица может быть определена более корректно с использованием популяционных частот, установленных для 37 описанных дискретных положений полосы в каэедой популяции.

Средние значения показателя сходства, полученные путем

усреднения попарных показателей сходства внутри популяции, равнялись таковым, полученным при сравнении индивидов из разных популяций и составили в среднем 0.41. Таким образом, не было обнаружено увеличения показателя сходства внутри какой-либо популяции / а этого можно было ожидать в гординской популяции, уровень инбредности которой на порядок выше остальных кировских популяций/, что указывает на нечувствительность данного показателя к колебаниям коэффициента инбридинга в диапазоне 0.0001-0.001. Равенство же показателя сходства0.41 в других изученных популяциях, в том числе чувашской и тувинской, и, кроме того, равенство внутри- и межпопуляционных значений показателя сходства, вероятно свидетельствует о стабильности этой величины, вызванной самим характером используемых полиморфизмов.

В целях выявления аллельных друг другу полос, а также, возможно сцепленных фрагментов, был проведен следующий анализ. Если в рассматриваемой зоне нет аллельных или сцепленных между собой полос, то при независимом комбинировании полос попарно вероятность их совместной встречи равна произведению вероятностей встречаемости отдельных полос, т.е. их частот в обследованной популяции. Матрица вероятностей попарного независимого комбинирования полностью соответствовала матрице частот попарной встречаемости полос.

Кроме того, для обнаружения возможных ассоциаций между исследуемыми признаками на уровне популяции была рассчитана матрица ковариаций между частотами полос на материале всех изученных популяций. Обнаружено, что коэффициенты ковариаций незначительные, так что все признаки (частоты полос) информативны, так как наследуются независимо друг от друга. <

Генетические расстояния между обследованными

Генетические расстояния между популяциями расчитывались с помощью эвклидовой метрики. В качестве частоты признака использовались частоты встречаемости полос по всем 37 описанным дискретным положениям для каждой популяции. Матрица генетических расстояний представлена в Таблице 3. Видно, что наиболее близкими друг к другу оказались русские популяции. Причем первыми в один кластер объединяются популяции, принадлежащие к

Таблица 3.

Матрица генетических расстояний между популяциями.

попул. Гордино бор Мухино Лема Косино Чебок Кызыл

Гордино 0

Бор 1.1651 0

Мухино 1.3877 1.8209 0

Лема 1.4845 2.4303 1,5206 0

Косино 1.9416 2.5429 1.2011 1.00 0

Чебоксары 2.4213 2.2014 2.4759 3.0697 3.2277 0

Кызыл 3.4252 3.1779 2.9756 3.8263 4.1344 3.4586 0

Краснодар 1.6841 2.6097 1.4079 1.9684 2.3635 2.4678 2.7452

одному району, затем одной области, практически на том же уровне к ним присоединяется выборка жителей г.Краснодара. Дальше к образовавшемуся объединению русских популяций присоединяется выборка чувашей г.Чебоксары и наиболее далеко отстоящей от всех обследованных оказывается выборка тувинцев г.Кызыл ( рис.ба). Интересно, что русские относятся к европеоидной расе, чуваши -смешанной (европеоидно-монголоидной), а тувинцы - монголоидной расе. Так как результаты исследования полиморфизма ДНК, в выборках чувашей и тувинцев, вероятно, близки к некоторым средним величинам, характеризующим данный этнос, вследствие формирования выборок в столицах союзных республик, куда мигрирует население со всей ее территории, то полученная дендрограмма вполне удовлетворяет априорно предполагавшейся степени реальной близости изучаемых популяций.

Интересно сравнить генетические расстояния, рассчитанные на основе полиморфизма, открываемого пробой ДНК фага М13,с расстояниями, полученными другими методами.Такое сравнение возможно для популяций Кировской области, по которым был собран репрезентативный материал о распределении частот фамилий, выступающих в качестве квазигенетического маркера в русских популяциях (Ревазов А.А., 1986). Кроме того, был собран материал о брачных миграциях за последние 3-5 лет и рассчитаны индексы эндогамии и миграционные матрицы для каждой популяции. Индекс эндогамии в изученных популяциях колебался в пределах от 15% (с.Лема) до 53% (с.Гордино), количество браков, зарегистрированных с жителями своего же района-от 40% (с.Мухино) до 83% (с.Гордино), браки, заключенные непосредственно между жителями обследованных населенных пунктов крайне редки - от 0 до 2%. Поэтому также для-сравнения с генетическими расстояниями нами вместо миграционной матрицы были использованы географические расстояния между популяциями, являющиеся, какизвестно,одним изважнейших факторов формирования популяционной структуры вследствие ограничения процесса миграций и во многих исследованиях, посвященных русским популяциям обнаруживающие тесные корреляции с генетическими расстояниями (Парадеева Г.М., 1985). Матрицы географических и квазигенетических расстояний, определенных на основе распределения частот фамилий представлены в Таблицах 4 и 5 соответственно. Коэффициенты линейной корреляции между матрицами суммированы в Таблице 6. Видно, что самый высокий коэффициент корреляции отмечается между генетическими расстояниями, определенными на основе полиморфизма ДНК и географическими расстояниями (0.57), что указывает на 'существование тесной связи между коррелируемыми системами. Коэффициент корреляции между географическими и квазигенетическими расстояниями равен 0.32, что считается достаточным для подтверждения существования связи между признаками. Между генетическими и квазигенетическими расстояниями корреляция практически отсутствует. Из анализа матриц географических, квазигенетическихи генетических, расстояний, наглядно представленных на рис.6 (а, бив) видно, что к объединению популяций Зуевского района первой на дендрограмме квазигенетических расстояний присоединяется борская популяция, что

Рис.6а. Пендрограмма близости лопупяций Кировской области, оцениваемой географическими расстояниями.

4 .. 3 .. 2 ...

1 ..

Рис.66. Пендрограмма близости популяций Кировской области, оцениваемой квазигенетическими расстояниями, рассчитанными с использованием частот фамилий.

0.13..

0.11..

0.09..

0.07

0.05

0.03-.

0.01 ..

Косино Пема Мухино Бор Гордин» Краснодар Чебоксары Кызыл

-„-II-,-II—г—I

русские

чуваши тувинцы

Рис.бв. Пендрограмма близости популяций, оцениваемой генетическими расстояниями, рассчитанными на основе полиморфизма ПНК, выявляемого зондом ОНК фага М13.

Таблица 4.

Матрица квазигенетических расстояний между популяциями Кировской области.

популяция Гордино Бор Мухино Лема Косино

Гордино 0

Бор 4.7651 0

Мухино 4.8877 1.3485 0

Лема 5.2735 1.7395 1.2079 0

Косино 4.9389 1.4049 1.0000 1.2662 0

Таблица5.

Географические расстояния между популяциями Кировской области.

популяция Гордино Бор Мухино Лема Косино

Гордино 0

•бор 15 0

Мухино 41 43 0

Лема 4244 2 0

Косино 32 38 6 8 0

Таблица 6.

Коэффициенты корреляции между матрицами генетических, квазигенетических и географических расстояний.

коррелируемые матрицы расстояний Коэфициенты

генетические-географические 0.5727

генетические-квазигенетические -0.1606

географические-квазигенетические 0.3164

не соответствует ни географическим расстояниям между населенными пунктами, ни административному делению области (что как показано в ряде работ- Ревазов A.A., 1985; Парадеева Г.М., 1986; Ельчинова Г.И., 1988,1989 является важным фактором, формирующим популяционную структуру), так как п.Бор расположен в Афанасьевском районе Кировской области. При сравнении же дендрограмм, построенных на основе матриц генетических и географических расстояний становится очевидным практически полное их совпадение. Так как для многих русских сельских популяций было показано, что их генетическая структура хорошо описывается моделью изоляции расстоянием Малеко, которая предполагает уменьшение вероятности миграции с целью заключения брака по мере роста расстояния между врачующимися, что указывает на возможную корреляцию между географическими и генетическими расстояниями (Парадеева Г.М. 1987; Ельчинова Г.И. 1988,1989), что также было продемонстрировано и для популяций Кировской области (Мамедова P.A. 1993), то высокая корреляция между генетическими расстояниями, определенными на основе полиморфизма ДНК, открываемого пробой ДНК фага М13, и географическими расстояниями является надежным свидетельством в пользу пригодности метода для исследования популяционной структуры современных неизолированных популяций. Квазигенетические расстояния, как нам представляется, в данном случае неверно представляют генетическую структуру популяции, что, помимо известных недостатков этого метода, возможно,связано с ошибками, возникающими вследствие сложившейся здесь системой брачных миграций "невеста к жениху" и перемены фамилии невесты, 'что приводит к недоучету генетически значимых миграций и искажениями, возникающими при сравнении центральных популяций, принадлежащих к разным районам, так как уже на этом уровне оценки генетических расстояний становятся максимальными вследствие крайне различных списков частых фамилий, так что наиболее адекватное описание при сравнении посредством квазигенетических расстояний небольших популяций типа села или поселка можно получить только в случае принадлежности их к одному району (Ельчинова Г.И., 1989).

ВЫВОДЫ.

1) Впервые продемонстрирован широкий полиморфизм, открываемый в популяциях человека с помощью мультилокусной пробы ДНК фага М13;

2) Генетические расстояния, рассчитанные на основе полиморфизм? "фингерпринтов" ДНК человека обнаруживают высокую корреляцию с географическими расстояниями (0.57). Так как предыдущими исследованиями было показано, что географические расстояния являются одним из наиболее важных факторов популяционной динамики русских сельских популяций, то данный факт можно считать достаточным основанием в пользу пригодности нового метода к описанию генетической структуры крупных подразделенных популяций;

3) Генетические расстояния, определенные на основании полиморфизма "фингерпринтов" ДНК человека, получаемых при

гибридизации с пробой ДНК фага М13 между всеми обследованными популяциями, вполне соответствуют априорно предполагавшейся степени реальной близости изученных популяций. Полученный результат свидетельствует о пригодности метода для оценок генетической близости удаленных популяций, в том числе различного этнического и расового состава;

4) Впервые представлены статистически обработанные данные семейного анализа "фингерпринтов" ДНК человека, полученные при гибридизации с пробой ДНК фага М13, и показано строгое менделевское кодоминантное наследование фрагментов и преимущественно гетерозиготное состояние минисателитных локусов;

5) На изученном в работе семейном материале в пределах анализируемой зоны элекгрофореграммыне обнаружено аллельных или сцепленных фрагментов. Анализ популяционного материала также подтвердил независимое комбинирование полос гибридизации, составляющих "фингерпринт", не обнаружено ассоциаций между

" частотами фрагментов;

6) Средняя частота мутирования равняется 0.006 на фрагмент, что на 4 порядка выше частоты мутирования уникальных последовательностей ДНК.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1) Барышева (Семина Е.В., Просняк М.И., Власов М.В., Лимборская С.А., Ревазов А.А., Гинтер Е.К., Голубцов В.И. "Использование ДНК фага М13 для анализа межиндивидуального полиморфизма ДНК человека на примере изучения популяции г.Краснодара" //Генетика.1989.Т.25.М11.С.2079-2081.

2) Барышева (Семина) Е.В., Букина A.M., Петрова Н.К., Лимборская С.А., Гинтер Е.К. "Использование полиморфизма ДНК, выявляемого с помощью пробы ДНК фага М13в популяционных исследованиях" //Генетика. 1991.T.27.N3.C.399-403.

3) Барышева (Семина) Е.В., Букина A.M., Лимборская С.А., Гинтер Е.К. "Анализ генетических расстояний между популяциями с помощью "фингерпринтов" ДНК человека, выявляемых зондомДНК фага М13 //Генетика.1991.T.27.N9.1493-1498.

4) Семина Е.В., Букина A.M., Лимборская С.А., Гинтер Е.К. "Семейный анализ "фингерпринтов'ДНК человека, полученных с помощью зонда ДНК фага М13".//Генетика.1993.Т..Ы11.

5) Семина Е.В., Букина А.М., Старцева Е.К., Лимборская С.А., Гинтер Е.К. "Генетические расстояния между популяциями различной этнической принадлежности, рассчитанные на основе полиморфизма ДНК, открываемого гипервариабельной пробой ДНК фага М13".//Генетика.1993.Т..1\111.