Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование рестрикционного полиморфизма ДНК в популяционно-генетических исследованиях

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Использование рестрикционного полиморфизма ДНК в популяционно-генетических исследованиях"

РОССИЙСКАЯ АЩЕШЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МВДШ-ГЕНЕТИЧЖЖИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 575:599, 577:213.1

ХВДЩТОВА ИРИНА МИХАЙЛОВНА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕСТРШЦЮНЮГО ГОЛИМЗРЫША ДНК ' В.ПОШЯЦЮШОЧ'ЕНЕТЩЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандццага биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена на базе следующих институтов: Отдела биохимии и цитохимии Башкирского научного центра Уральского Отделения РАН, Института молекулярной генетики РАН, Института биологии гена РАН и Института акушерства и гинекологии РАМН.

Научные руководители:

Р^чнье! консультант: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кавдвдат медицинских наук ■Х.С. Рафиков

каццвдат биологических наук Э.К.фсцутдинова

доктор биологических наук, профессор С.А.Лимборская

доктор биологических наук В.А.Спицын

каццвдат биологических наук Н.С.Куприянова

Институт биологии развития РАН

Защита диссертации состоится "__Ч__1993г.

в_часов на заседании Специализированного Совета Д.001.16.01

по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН

Автореферат разослан "_

1993г.

Учении секретарь

Специализированного Совета Л.Ф.Курило

доктор биологических наук

профессор

Введение

Актуальность темы. В связи с открытием в молекулярной биологии явления полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ЦЩ3^) ДНК появилась возможность исследования структуры и эволюции популяций человека на уровне ДНК - материального субстрата наследственности. Генетическая изменчивостьнаблюдаемая на уровне ДЕК, существенно вше, чем на уровне белков: основная часть полиморфных участков ДНК принадлежит нетранскрибируемнм областям генома, частичные изменения которых чаще всего не имеют прямого фенотипи-ческого проявления. Этим определяется значительный научный интерес изучения полиморфных ДНК-локусов в качестве генетических маркеров популяций.

В настоящее Еремя изучение полиморфизма ДНК проводится во многих популяциях мира, при этом в исследования включаются как диаллельные, так и гипервариабельные локусспецирические последовательности ДНК; для многих полиморфных систем установлены попу-ляционные различия в распределении частот аллелей; показано, что гипервариабельные локусы ДНК, в силу своей большей гетерозигот-ности в популяциях, являются более информативными маркерами при изучении структуры популяций. Использование не в качестве генетических маркеров популяций диаллельных ДНК-локусов приобретает особенный интерес тогда, когда для одной из аллельных форм полиморфной' системы установлено неравновесное генетическое сцепление с каким-либо наследственным заболеванием. Так, для ДНК-локусов МЕТ и Д75 23, картированных на 7-й хромосоме и сцепленных с геном муковисцидоза, установлены и неравновесное сцепление с данным заболеванием, и попуяяционные различия в распределении частот аллелей (Баранов с соавт., 1991; Лившиц с соавт., 1990).

Среди гипервариабельных локусов ДНК, очевидно, наиболее информативными в попу ляцио нных исследованшх ДНК-маркерами должны бить минисателлитнке последовательности, имеющие гомологии во многих участках генома. Широкий пспуляционный полиморфизм, открываемый с помощью единственного ДНК-зоцца - основное преимущество, предполагающее получение бэгатой информации при использовании таких полиморфных систем ДНК в популяционно-генетических исследованиях. В 1937 году в работах Вассара с соавт. (уазаахЧ et а1. 3 и Рискова с соавт. было показано, что к маркерам такого типа относятся 'гипервариабельные последовательности ДНК, выявляемые с помощью гибрццизационной пробы ДНК бактериофага М13. Для гибри-

дизуюшдхся с ней' участков геномной ДНК человека характерны высокая межицциведуальная специфичность, соматическая стабильность и менделевский тш наследования. В отличие от большинства других описанных мш-шсателлитов, для которых характерно преимущественно прицеитромернэе и теломерное расположение на хромосомах, последовательности ДНК, гибрвдизующиеся с зондом ДНК фага М13, равномерно распределены по всем хромосомам 1о1г1вйпапп еъ а1.,1991).

Метод выявления гшерполшорфизма ДНК, названный "геномной дактилоскопией", нашел применение презде всего в судебной экспертизе для едентирикацш личности и установления кровного родства. Ь популяционных же исследованиях пока сделаны лишь первые попытки использован® минисателлитного гиперполиморфизма ДНК, показавшие его преимущества и трудности, связанные с анализом получаемых данных (Баршева с соавт., 1989,1991). Основным недостатком таких полиморфных систем является отсутствие генетической интерпретации происхождения фрагментов гибридизации. Неизвестное число локусов не позволяет работать непосредственно с аллелями, использовать стандартные методы популяционной генетики и анализа данных. Всеми этими факторами определяется актуальность дальнейшего изучения полиморфной системы ДНК, выявляемой зондом ДНК фага характера распределения ее вариантов в популяциях человека и возможностей применения в популяционно-генетическом анализе.

исходя из этих предпосылок, указанные полиморфные системы ДМ били использованы в данной работе: характер распределения их аллельных вариантов изучен в трех популяциях башкир, представляющих различные этногеографические группы, и в популяции коми, принадлежащей к -¿.инно-угорской группе народностей.

Выбор объекта исследования также не был случайным. Популяция башкир среди народов Волго-Уральского региона отличается значительной сложностью своего этногенеза, протекавшего на основе объединения различных по происхождению центральноазиатских, южносибирских, индоиранских, угро-финских и булгаро-мадьярских родо-племонных образований, в настоящее время в популяции башкир исследователи вьщеляют четыре этногеографические группы, отличающиеся путями консолидации и этнокультурными процессами (Кузеев, 1974). Генетическая дифференциация современной популяции башкир ц генетическая близость их с отдельными тюркскими и фшно-угор-. скими народами Волго-Уральского региона была показана ранее Ра-фиг.овым с соавт. 11931,1987,1990) на основе изучения распределе-

нвд частот аллелей биохимических полиморфных систем групп крови и белков. Таким образом, с одной стороны, мы тлели возможность проверки информативности полиморфных систем ДНК на этногеогра-фических группах одного народа и сравнения результатов с данными о биохимическом полиморфизме, и, с .другой стороны, наши данные должны были явиться вкладом в изучение генетической структуры популяции башкир.

Исходя из вышеизложенного, были сформулированы основные цель и задачи данной работы.

Цель исследования. Целью настоящего исследования являлось определение возможностей применения полиморфизма ДНК в популя-ционно-генетичеаких исследованиях.

Задачи исследования.В соответствие с целью исследования, были поставлены следующие задачи:

1 .Провести сравнительный анализ характера распределения частот аллелей диморфных ДНК-локусов МЕТ иД7з23, сцепленных с геном муковисцвдоза, в различных этногеогра]?ических группах башкир и в популяции коми, представляющей финно-угорскую группу народностей.

2.Провести методом геномной дактилоскопии на основе ДНК бактериофага М13 ПДР-£-анализ ДНК в изучаемых популяциях башкир и кош.

3.Провести оценку метода факторного анализа соответствий при использовании его для' анализа ДНК-фингерпринтов.

Новизна и практическое значение работы. Впервые в популяции башкир, с учетом этногеографических подразделений и в сравнительном аспекте с финно-угорской группой, начато исследование . полиморфизма ядерного генома.

Определение частот аллелей полиморфных локусов МЕТ и Д7323, сцепленных с геном цуковисцвдоза, тлеет значение как для попу-ляционной генетики - представляет новую информацию о генофонде народов одного из регионов страны - Урала, так и для медицины -может послужить первым шагом в1 изучении проблемы распространенности и генетических причин цуковисцвдоза в Башкирии.

Впервые проведено изучение возможности использования гипер-полиморфнзма мшшсателлитов ДНК человека, выявляемого на картинах гибридизации типа "фшгерпринт", в популпцпонно-генетичес-ких исследованиях на уровне этнических групп и народов. Показа--но, что выбранный для ПДР-£-анализа гибрцдизационный зонд ДНК

фага М13 в сочетании с последующей компьютерной обработкой картин гибридизации методом факторного анализа соответствий, мокет являться надежны.! методом популяционно-генетических исследований, позволяющим диф1«ренциировать популяции по небольшим выборкам. Полученные данные могут представлять практический интерес и для целей судебной экспертизы, в случае использования метода геномной дактилоскопии на основе ДНК-зонда М13 для идентификации личности или установления отцовства, поскольку проведение таких анализов требует предварительной информации о характере распределения частот фрагментов картин гибридизации в популяции.

Основные положения, выносимые на защиту:

1 .Возможность использования диморфных ДНК-локусов МЕТ и Д7з23, сцепленных с геном цуковисцццоза, в качестве генетических маркеров популяций,на основании сравнительного анализа распределения частот их аллелей среди башкир и коми с аналогичными данными по другим популяциям.

2.Значительная генетическая однородность популяций башкир (этногеографических групп) по характеру распределения частот ал-" лелей и генотипов ДНК-локусов МЕТ и Д7323, установленная на основании расчета генетических расстояний по частотам аллелей указанных локусов.

3.Возможность использования гипервариабельных участков ДНК человека, гомологичных ДНК бактериофага ШЗ, в качестве высокоинформативных маркеров популяций.

4.Выявление различий в исследуемых популяциях башкир и коми по оценке среднего числа гипервариабельных фрагментов у отдельного 'индшзцлуума и по распределению частот некоторых фракций. .

5.Использование метода факторного анализа соответствий в приложении к обработке ДНК-фингерпринтов для подтвервдения генетической подразделенности изученных популяций.

Апроб ацм работы .Р езу льтаты исследования были представлены на И Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Алма-Ата, 1990), на научной конференции "Изучение и рациональное .использование природных ресурсов (Уфа, 1991), на У111 Международном конгрессе по генетике человека (США, 1991), на 11 Всесоюзной конференции "Геном человека-91" (ПереалавлыЗалесский, 1991), на 11 итоговой конференции "Геном человека и патология" (Томск, 1992), па международной конференции "Геном человека- 92" (франция, 1992).

Публикации. По материала!.! диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и иллюстрирована 11 рисунками. Список цитируемой литературы включает 177 наименований.

Материал и методы.

В работе использованы образцы ДНК, вьделенные из крови коренных жителей - башкир Абзелиловского, Архангельского и Или-шевского районов Башкортостана, представляющих соответственно его юго-восточную, северо-восточную (центральную) и северо-западную этногеогра]?ические зоны, а также кош Сысольского района Республики Коми. Материал собран в ходе экспедиционных выездов -1989-1991 гг. Забор крови производили после медицинского осмотра у взрослых жителей, принадлежащих к разным семьям, что позволяет рассматривать выборки случайными для популяций.

В анализ рестрикционного полиморфизма ДНК-локусов МЕТ и Д7523, сцепленных с геном муковисцццоза, включено всего - 197 образцов ДНК. Среди них 54 образца представляют популяцию Абзелиловского, 51 - Архангельского, 50 - Илишевснэго районов Башкортостана и 42 образца - популяцию Кош.

Методом геномной дактилоскопии на основе ДНК бактериофага М13 всего проанализирован 231 образец ДНК, среди них 63 - Абзе-лиловской популяции, 70 - Архангельской, 56 - Илишевской и 42 - популяции Коми.

ДНК ввделяли из 10 мл крови методом фенолыю-хлороформной, экстракции, как описано Мэтью (Mathew ,1984).

Для определения рестрикционного полиморфизма ДНК-локусов МЕТ и Д7523 был использован .метод полимеразной цепной реакции синтеза ДКК с последующим гидролизом амплифищфованных фрагментов (Шварц с соавт. ,1988). Праймеры для ДНК-зондов Met-H и С3.7 синтезированы в НПО "Фермент" г.Вильнюс, ДНК-полимераза тьегшиз Thennophilia - в Институте ядерной физики РАН (Гатчина).

Для зондов Met -Н и Сз.7 использовали соответственно рестрикта-зы Mapl и Hin6-1 .После рестрикции проводили электрофорез в вертикальном в/о полиакриламвдном геле, окрашивали бромистым этвди-ем и визуально, в У-1>-свете оценивали наличие рестрикции.

Блот-гибрвдизацип с ДНК фага М13.

Гидролиз геномной ДНК человека рестршстаюй ВорЯ1провод""я

- б -

в стандартных условиях Шаниатис с соавт.,1984). Электрофорез рестрикифованной ДНК проводили в горизонтальном блоке 0,Е$-го агарозного геля в трис-ацетатной буфере при напряженности поля 0,8 В/см в течение 18 часов. Параллельно с исследуемыми образцами ДНК человека в одну из крайних дорожек геля наносили маркер молекулярной массы - ДНК фага А-, рестриктированного Hindi 11 и меченного Р^ по концевым цуклеотвдам. Перенос рестриктных фрагментов ДНК из геля на нитроцеллюдозные фильтры ("Schieicer und Sohuele ",ВА 85,iPT) проводили по модифицированному варианту метода Саузерна, предложенному Лихтенштейном 11987), особенностью которого является перенос ДНК из геля на фильтр сверху вниз. Прегибрццизация и гибрццизация с высокомеченной одно-цепочечной пробой на основе ДНК фага M13mpll была проведена по методике, описанной в работе Вассара (vaasart et al.,1987). Для редиоавтографии использовали рентгеновскую пленку РМ-В. Экспозицию проводили с усиливающими экранами в течение 1-2 суток.

Методы анализа данных.

Частоты кодоминантных аллелей диморфных ДЩ-локусов МЕТ и Д7Э23 и статистическую ошибку этой оценки рассчитывали по формулам, приведенным в работе Животовского (1991). Для сравнения выборок по частотам генотипов был применен критерий хи-квадрат. Генетические расстояния между популяциями рассчитывали по методу Кнусскакна (кпиззтапп ,1962).

При анализе гшервариабельных фрагментов ДНК, гибрадизую-щихся с зондом ДНК фага М13, 'на- радиоавтографах учитывались все полосы гибридизации, поддающиеся разрешению, т.е. в зоне от 2 доа2Э тпн. По кавдоцу радиоавтографу составлялась бинарная матрица данных типа "объект - признак", где присутствие полосы обозначалось "1", отсутствие -"О". Для идентификации одних и тех же фракций на разных РА мы воспользовались подходом,. предложенным Калншшм (ИБГ РАН), в основе которого лежит подбор по маркерным фракциям аппроксимирующих функций для каждого фингер-принта, позволяющих учесть все различия между разными форезами и рассчитать молекулярные веса всех фракций. По молекулярным весам фракций и их частотам на кавдом РА, принадлежащем одной популяции, было проведено сопоставление позиций фрагментов на всех радиоавтографах.

Среднее число полос у индивидуума, его статистическою ошибку и достоверность различий в популяциях (методом t-критерия Стьвдента) рассчитывали по стандартным методикам (Лакин, 1990),

Для определения генетической близости между популяциями по частотам фрагментов гибридизации были рассчитаны показатели генетического сходства (Животовский, 1979).

Для идентификации и сравнения популяций по подученным картинам гибридизации Калниньм было предложено проведение анализа итоговой матрицы данных методом факторного анализа соответствий. Им же была разработана программа и проведен компьютерный анализ.

Результаты исследований и обсуждение.

1 .Полиморфизм ДНК-локусов МЕТ ИД75 23. сцепленных с геном .чуковисцвдоза, в популяциях башкир и коми.

На рис.1 представлены результаты рестрикции и последующего электрофорез а. ампли^ициро ванного ДНК-локуса МЕТ (зонд Met-H). После гидролиза ашлифицированного фрагмента (414 пн) рестрикта-зой Mspl при наличии сайта рестрикции образовывались два фрагмента с размерами 220 и 194 иутеонвдов. Всего выявлялось три варианта комбинаций аллелей данного локуса: AjA^ - гомозиготы по ал-лелю с отсутствием сайта рестрикции - одна полоса с подвижностью 414 нуклеотвдов, A^Ag - гетерозиготы - три полосы: 414, 220 и 194 нуклеотвдов, AgAg - гомозиготы по наличию сайта рестрикции - две полосы с подвижностью 220 и 194 нуклеотвдов. .

На рис.2 представлены результаты рестрикции и последующего электрофореза ДНК-локуса Д7з23 (зонд С3.7). Амплифицированный фрагмент имеет размер 330 цуклеотццов. После расщепления Жпб-1 при наличии сайта рестрикции образовывались два фрагмента длиной 165. нуклеотцдов. В результате выявлялось три варианта комбинаций аллелей: CjC-j - гомозиготы по аллелю с отсутствием сайта рестрикции - одна полоса с подвижностью 330 нуклеотцдов, CjCg - гетерозиготы - две полосы с подвижностью 330 и 165 нуклеотвдов и CgCg-гомозиготы по наличию сайта рестрикции - одна полоса размером 165 цуклеотвдов.

В таблице 1 представлены частоты генотипов и аллелей ДНК-локусов МЕТ ¿1 Д7Й23 в исследуемых популяциях башкир и коми, а также оценки ^-критерия соответствия частот фенотипов в популяциях равновесию Харди-Вайнберга.. Установлено, что аллельные формы данных локусов ДНК встречаются во всех четырех популяциях с высокой частотой, близкой к 0,5; статистически достоверное отклонение от' равновесия Харди-Вайнберга 0^6,62) обнаружено в популяции коми по локусу ет, где наблюдается недостаток гетсрэзк-гот, преобладание фенотипа A^Aj, и в популяции .башкир Архангол*-

Я-

4

414 пн

220 пн 194 пн

I г з v ^ в в э т it а и 14 is ie it

IB 13

Рис. 1 Амплификация ДНК при помощи олигоцуклеотед-ных приймеров зонда Met -Н в полимеразной ЦРС ДНК; рестрикция !»Ьр1 и электрофорез. Окраска бромистым этцдием: 5,8,11, 13, 14 - генотип AjA^, 1,2,3,4,6, 7,10,15,16,17,18,19 - А^з, 9, 12 - A^Ag.

ту< Т^Г^^Ш^^^ЩУ'Щ ^уп- WB' та*

; —••'■О' Z&— ' '

I '

"ГФТЙ F-'UHH

i* С- ;.':■ ><• "V'S'.I

te"*- '■ ......................

330 пн 165 пн

I 2 3 Ч 5 В 7 в Э ЮН а И П И !й

Рис.2 Амплификация ДНК при помощи олигоцуклеотвд-ных праймеров зонда СБ.7 в полимеразной ЦРС ДНК; рестрикция Н1п6-1 и электрофорез. Окраска бромистым этедием: 7,13,18 - генотипы С1С1, 1,2,6,11,12,14,15,

16-0^2, 3,4,5,8,9,10,17 -

ского района по локусу Д7з23, где достоверно (Х^=5,68) доминируют гетерозиготы

Так как в двух популяциях было обнаружено достоверное отклонение распределения частот фенотипов от равновесия Харди-Вайнберга, сравнение популяций меаду собой мы проводили по частотам фенотипов (генотипов).

По локусу МЕТ обнаружено достоверное различие в распределении частот генотипов в популяции коми со всеми изучаемыми популяциями башкир 7,05; 11,65; 8,25 соответственно для Абзе-

Таблица 1

Распределение частот генотипов и аллелей ДНК-локусов ¡'ЛЕТ и Д7з23 в популяциях башкир и коми; проверка соответствия распределения частот фенотипов равновесию Харди-Вайнберга.

! Г_МЕТ (Ме1;-Н/Мзр1)_! !_Д7523. (Сз ,7/Н1п6-1)_

Популяция ! и ! генотшы^абс,зн' ^ ¡частота аллелей! X2 ! и ! генотшы^£лЗн±2 'частота аллелей! X2 ' ! !_ % !_! ! !_^ ! !

\ |А1А1 А^А^ к.^2 | А5 А2 ] | }С1С1 С^ С2С2 | С'1 С2 |

1.Абзелклов-сккй р-он Башкирки 1 54 1 10 25 19 118,51 46,30 35,19 0,42 0,58 0,12 1 ! 54! 17 26 И ! 0,55 0,45 131,48 48,15 20,37! 0,17

2.Архангельск^ р-он Башкирии ! 50 ! 8 31 11 ! 16,0 62,0 22,0 0,46 0,54 2,99 ! | 51! 9 34 6 ! 0,50 0,50 !17,65 66,67 15,69! 5,о8

З.Илишевский р-он Башкирии ! 45 ! 9 26 10 !20,3 58,0 £2,0 0,49 0,51 1,09 ! 1 44! 12 22 10 ! 0,52 0,48 !27,27 50,0 22,73! 0,002

4 .Коми

!42 I 18 12 12 ! 0,59 0,41 ! !42,8б 28,57 28,57!

б,62! 42! 11 23 8 1 0,54 0,46 !0,43 ! 126,19 54,76 19,05! !

лшюзского, Архангельского и Ишшевского районов; Р>0,05). Между популяциями башкир достоверных различий по рестрикционноцу поли-морфизцу данного локуса ДНК не выявлено.

Сравнительный анализ с литературными даннши показал, что распределение частот аллелей локуса МЕТ в популяциях башкир и коми близко 'к таковоьу в санкт-петербургской популяции (Баранов с соавт., 1991), популяциях Северо-Западной Европы (Рагга1 еЬ а1.> 1968) и Северной Америки (маг«а ег а1.,1988). В то >:се вре-.я, все эти популяции обнаруживают достоверное различие в распределении аллельных частот локуса МЕТ с популяцией Литвы, где набладается значительное смещение в сторожу преобладания аллеля А^ (0,76; 0,24) (Баранов с соавт.,1991).

По локусу Д7д23 достоверных различий в распределении частот генотипов и аллелей как медду популяциями башкир, так и мезду популяциями башкир и коми не выявлено. При сравнении с литературными даннши можно отметить соответствие аллельного полиморфизма яэкуса Д7В23 в популяциях башкир и кош с таковым в популяциях Лигш 1.0,55; 0,45) и Бурятии (0,56;0,44).Достоверные отличия быявлг--! с популяцией Санкт-Петербурга .(0,63; 0,32) и Азербайджана (0,66;0,34), где аллель С| встречается вдвое чаще, чей аллель ^ (там жеЬ

Считая, что наши данные подтверждают популяционную неоднородность полиморфных ДНК-лоиусов МЕТ и Д7323, мы использовали порченные частоты их аллелей для 'расчета генетических расстояний меяду изучаемыми популяциями башкхтр и коми. Они сведены в таблицу 2, из которой вцдно, что генетические расстояния между популяциями башкир и кош значительно превшают таковые между саыи!.щ популяциями башкир, что, при учете генетической дифференциации последних, свидетельствует об их однородности по данным полиморфным системам ДНК. Среди исследуемых популяций башкир наиболее близкой по данной матрица к популяции коми являются шпшевские башкиры. Безусловно, расчет генетических расстояний только по дсум полиморфным системам не может служить достоверным показателем генетической близости мевду популяциями, а монет являться лишь констатацией факта о степени соответствия данных признаков в исследуемых популяциях.

Генетические расстояния, рассчитанные по частотам аллелей ДШ-ловусов МЕТ иД7з23, в определенной степени сопоставимы с таковым, подученными для данных популяций на основе частот ге-

Таблица 2.

Матрица генетических расстояний между популяциями башкир и кош, полученных по частотам аллелей ДНК-локусов МЕТ и Д7323.

Популяция ! ' 1 I ' 2 ! ' 3 !' 4

1 .Абзелшгавский р-он Башкирии - 0,0648 0,0773 0,1703

2.Архангельский

рюн Башкирии - 0,0361 ' 0,1362

3.Илишевский

р-он Башкирии - 0,1023

4.Кош

Таблица 3.

Матрица генетических расстояний мезду популяциями башкир и коми, полученных по частотам аллелей Полиморфных систем АВ0,НЬ-Нг , Нр, АСР.

Популяция ! 1 1 2 ! 3 ! 4

1.Абзелиловский р-он Башкирии — 0,0708 0,1296

2. Арханг ельский р-он Башкирии - 0,0697 0,0995

З.Илишевский р-он Башкирии - 0,1382

4.Коми -

нов биохимических полиморфных систем (табл.3). Так, полное совпадение соотношений генетических расстояний наблюдается мезду популяциями башкир Абзелиловского, Архангельского районов и популяцией коми. В то же время, расчет коэффициента корреляции между двумя матрицами генетических расстояний (по Спирмену) показал недостоверность положительной корреляции. Очевидно, такое неполное соответствие матриц генетических расстояний, рассчитанных по разным полиморфным системам, возникает за счет ограниченного числа исследуемых систем. В литературе тлеются сведения о сопоставимЬсти и взаимодополняемости данных о полиморфизме ДНК и иммунобиохимическом полиморфизме (Рычков, Балановская, 1937). Поэтоцу мы полагаем, что и диаллельные ДНК-локусы МЕТ и Д7з23, характеризующиеся популяционной неоднародностью, можно считать удобными молекулярно-генетическими маркерами популяций.

- 12 -

£.Анализ полиморфизма ДНК, выявляемого методом ■ геномной дактилоскопии на основе ДНК фага №3.

в популяциях башкир и коми. В исследуемых популяциях башкир и коми проведен анализ рес-трикцшнного (варН1) полиморфизма гипервариабельных участков ДНК, гомологичных ДНК бактериофага М13. На рис.3 представлен образец радиоавтографа блот-гибрцдизации ДНК человека с ДНК фага М13.

тпн - 23,7

О О

О

о

е»

о

е а

а

о*» ®Ов

о

е

• о

°se®3s

t )f

ej" _

* -О.. э

—■ « -,' i , г*

cn iSOe Ca • ® * 'S

(vi 0'Ü«O>Q.

9,5 6,7

4,3

2,3 1,9

3 -5 * 6 7 о я ia и /г n M n /s и m w го г/

Рис.3 Полшорфныеварш - фрагменты ДНК человека, выявляемые при гибридизации с зондом ДНК фага М13; 1 . - 20 -"фшшерпршты" отдельных иццивцпуумов, 21 - маркер молекулярной массы - фрагменты ДНК фага X, рестриктирован-ной Hindi 11.

В электрофоретической зоне от 2 до 20 тпн для четырех популяций установлено 146 позиций фрагментов, имеющих размеры от 13400 до 1900 пар нуклеотедов. Разница мезду позициями составила В результате была подучена бинарная матрица объемом 231x146.

Поскольку генетическая модель дда гиперполиморфизма минисател-литов ДНК не ясна, ш рассматривали фрагменты гибридизации как фенотипы, а каждую идентифицированную позицию как признак: отсутствие фрагмента по установленной позиции у отдельного индивидуума означало фенотипическое отсутствие у него данного признака.

Исходя из полученной матрицы данных, мы рассчитали некоторые показатели, характеризующие изучаемую полиморфную систему. В табл.4 представлены значения среднего числа фракций у индивидуума (х) в зоне от 2 до 20 тпн в исследуемых популяциях в отдельности, а также их среднее значение для всех популяций в целом. Для популяции башкир Абзелиловского района число полос на индивцпуум колебалось от 9 до 20; Архангельского - от 11 до 24; Илишевского -от 8 до 20; для популяции коми - от 9 до 23. Распределение данной характеристики отвечает требованиям нормального распределения (р>0,05). Наибольшее значение среднего числа фракций у индивидуума отмечено в популяции башкир Архангельского района. Оно достоверно отличается от такового во всех остальных популяциях (.^4,003; 7,28?; 4,05 соответственно для популяций Абзелиловского, Илииев-ского районов и коми). Достоверное отличие обнаружено и между популяциями Абзелиловского и Илишевского районов Башкирии (^=2,72). Предполагая, что данный показатель может .характеризовать степень гетерозиготности популяции по изучаемой полиморфной системе, можно допустить, что в Архангельском районе она несколько выше, чем в других популяциях. Это может определяться центральным географическим положением данного района в Башкирии, где вероятны более интенсивные процессы обмена генетической информацией, уменьшения инбридинга.

. % Таблица 4.

Среднее число фракций (полос гибридизации) у ивдивццуума в популяциях башкир и коми.

Популяция 1 1 ! ! х + зх дисперсия в2

1 .Абзелиловский ! 63! 15,35 + 0,41 10,45

р-он Башкирии ! !

2.Архангельский ! 70! 17,35 + 0,29 5,85

р-он Башкирии ! !

3. Ил киевский ! 56! 13,84 ± 0,38 8,03

р-он Башкирии ! !

4. Кош ! 42! 1 I 14,95 + 0,53 10,73

Сумма !231! ! ; '15,37 + 0,22

На рис. 4 представлены профили частот всех фрагментов тибри-"1 дизации в области от 2 до 20 тпн в зависимости от их положения (молекулярной массы) в популяциях башкир и коми. Как вццно из гистограмм, для каждой популяции обнаружены уникальные фрагменты (встреченные только в одной из популяций). Сведения о их числе представлены в таблице 5, из которой ввдно, что больше всего уникальных фрагментов - в популяции башкир. Абзелиловского района- (9), где, в пересчете на одного индивидуума, их число составляет 0,143.

Таблица 5. .

Количество уникальных фракций - фрагментов гибридизации ШЖ человека с зондом $13 в популяциях башкир и коми Тв зоне от 2 до 20 тпн).

!абс. число ! число уникальных'!^ от общего числа Популяция ¡уникальных ¡фракции на 1 ¡фракций в популяции _¡фракций_¡индивидуум_!__

1.Абэелияов- ! ! !

ские башкиры ! 9 ! 0,143 ! 7,82

2.Архангель- 1 ! ! . ские башкиры ! 9 I 0,129 1 8,03 .

3.Илишевские ! I 1

башкиры ! 6 ! 0,107 1 6,31

4.Коми ! 5 ! 0,119 ! . 5,49

Уникальные фрагменты, го нашим данным, могут составлять в популяциях башкир и коми от 5 до имея при этом различный размер: . от 2300 до 13500 пн. Средняя частота встречаемости их в популяциях низка и составляет 0,033, за исключением трех случаев, где она достигает в среднем значения 0,242: одна из таких фракций, встречается в Абзелшювском районе (4600 пн),другая - в Архан- ... гельском (4100'пн) и третья - в Илишевском районе Башкирии (3100).

- В результате анализа зависимости частоты фрагментов гибридизации от их молекулярной массы было установлено, что в области от 13400 до 6700 цуклеотвдов частота фрагментов <5$. Частые фрагменты (р>30^) появляются только при уменьшении их размеров до. 6000 цуклеотщов. Самый частый фрагмент имеет размер-^3400 пн. Его частота достигает в трех популяциях 1, т.е. встречается у всех ицциведуумов. Однако, в Архангельском районе Башкирии у трех человек этот фрагмент отсутствовал, а частота его в популяции составила 0,986. По литературным данным (Баршева с соавт., -1989, 1991), этот фрагмент с частотой 1,0 встречается и в других

,10 kb

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

- 15' ,6 kb

3.5 kb

.2 kb

20 40 60 80 100 120

140

20 40 60 80 100 120

140

20 40 eo 80 100 120

Numbers of fragments

Рис .4. Распределение частот встречаемости фрагментов гибридизации ДНК человека с зондом ШЗ по их позициям на электрофореграмме в популяциях: а - башкир Абэели-ловского района, в - башкир Архангельского района, с - башкир Шшшевского района Башкортостана, d - кош. По оси абсцисс - позиция полосы, по оси ординат -частота. Ьверху указаны размеры маркерных фрагментов.

популяциях человека, что, на первый взгляд, позволяет считать его, по крайней мере, вадоспецифичным. В то же время, обнаруженное нами отсутствие данного ^агмента в 1случаев для популяции дает возможность предположить, что такой фенотип является проявлением редкого аялеля, хсоторый может быть выявлен и в других популяциях человека. В этом случае данный редкий аллель можно было бы считать димерещиирующим для популяций.

Среди крупных фрагментов (р>6000 пн) нет таких, которые встречались бы во всех четьрех популяциях. Число фрагментов, обнаруженных во всех четырех популяциях, равно 59 (40% от общего числа фрагментов).Самый крупный из них - 6330 пн. По мере уменьшения размера число таких фрагментов увеличивается.

В таблице 6 показано, какая доля фрагментов приходится на а) редкие б) "средние" (5£йрсЗС$) и в) частые (р>30^). Из

таблицы видно, что наибольшую доли составляют "среднечастотше" Фрагменты, причем, в башкирских популяциях ци|ры очень близки, в популяции коми - чуть выше. Следующий' класс фрагментов - редкие, их доля может составлять от 17 до 33$; меньше всего частых фрагментов - от 5 до 13^, хотя именно они, как характеризующие популяции, могут представлять наибольший интерес.

Среди высокочастотных фрагментов в популяциях башкир и коми можно вьдеяшь как характерные для одной или двух из. изучаемых популяций (частота которых в 2 раза превышает их частоту в других популяциях), так и характерные для всех исследуемых популяций башкир, но отсутствующие в популяции .коми (см.гистограммы). Такие фрагменты, а также уникальные высокочастотные фракции можно считать характеристически:® для отдельных популяций. . . .

Таблица 6.

Зависимость количества фрагментов гибридизации ДНК человека с зондом М13 от их частоты в популяциях оашкир и коми.

Популяция ! р<5$ ! 3® ! р >3032

1.Абзелиловский ! р-он Башкирии ' ! ' 0,339 ! 1 ! 0,603 ■ !' 0,052

2.Арханг ель скин ! р-он Башкирии ! 0,241 ! ! 1 0;б25 . ! 0,133

З.Илшевский ! р-он Башкирии ! . 0,292 1 1 ! 0,633 ! 0,075

4.Коми ! 0,176 ! 0,736 ! 0,088

По частотам фрагментов гибридизации была рассчитана средняя частота встречаемости полосы (р) в области от 2 до £0 тпн. Для популяций Абзелиловского, Архангельского, Илишевского районов Башкирии и для популяции коми она равна соответственно 0,134 + 0,043; 0,158 + 0,043; 0,146 + 0,047; 0,162 + 0,055. Из двух подученных оценок: средней частоты одной полосы (р) и среднего числа полос на индиввдуума (х) мы рассчитали среднюю вероятность идентификации лица, равную 1 - рх. Для всех исследуемых популяций значения ее оказались очень близки к 1, что соответствует литературным данным по другим популяциям (Барышева с соавт.,1991) и подтверждает вывод о возможности использования фингерпринтов на основе гибрццизационного зонда ДНК фага ШЗ для идентификации личности.

Сравнение популяций по полученнш наборам фрагментов гибридизации с зондом М13 было проведено методом- факторного анализа соответствий. На рис. 5 представлено расположение всех исследованных ивдивцпуумов популяций башкир и коми в пространстпе 1 и 11 фаг-лоров. Разными символами обозначены и оконтурены щциввдуупм, относящиеся к разным популяциям. Ib рисунка видно, что популяция коми в значительной степени перекрывается с популяцией, бгапскр Абзелиловского района; в зоне их перекрытия - Архангельская популяция, которая и географически занимает центральное положение; . Илишевская популяция башкир в наименьшей степени перекрывается со всеми другими. Здесь следует оговоришься, что приведенная пике интерпретация подученной картины остается пока на уровне предположения, т.к. это лишь первые исследования такого рода, отсутствие аналогичной информации по другим популяциям не дает возможности ,■ проведения сравнительного анализа. Так, в данной ситуации мы полагаем, что наблюдаемые на картине зоны перекрывания популяций ■ могут отражать процесс метисации, игравшей существенную роль в истории башкирского народа. Можно предположить, что результатом ■ данного процесса метисации в историческом форм^овашга башкирского и других народов Волго-Уральского региона явилось образование своеобразного, но устойчивого генетического комплекса, прослеживающегося в популяциях различных народов этого региона, имеющих какие-то общие генетические корни. При этом, вероятно, в популяциях с более интенсивными процессами обмена генетической информации такой, сложившийся в результате метисации, генетический комплекс может охватывать большую часть популяции и служить yze основной характеристикой ее генетической структуры. Мы полагаем, что в

г,0

1,С-

У 0,0.

-1.0 1

-г,о

Г4"......^

0 А О

-г,о

ь

йй

--------/

* 8> N <$> „о

а'

-1,1

-0,3

0,6

1,6

Рис.5 ФАС. Расположение в пространстве 1 и 11 факторов популяций башкир и коми. Кадцая точка - ицциввдуум. Популяции обозначены и оконтурены разными символами:

о------ Абзелиловский район Башкирии;

. —:-Архангельский район Башкирии;

Д -л/»V* Илишевский район Башкирии; +. Кош.

нашем примере именно такой является популяция башкир Архангельского района, занимающая, как уже было сказано, центральное географическое положение в Башкирии. Вполне очевидно, что генетическая .структура популяций, сложившаяся в результате интенсивных- . процессов метизации, должна содержать большее число редких аллелей. Такая картина наблвдается и в нашем случае: в популяции башкир Архангельского района отмечено наибольшее число уникальных . фрагментов (8^ от общего числа фракций в популяции), найден редкий фенотип - отсутствие в трех случаях фрагмента, встречающегося в других популяциях с частотой, равной 1. Известно и наличие -в данной популяции повышенной концентрации редких аллелей биохимических маркеров -SOD 2 (l,<$),rrI)ohl (6,3$) (Рафиков, 1937).

Перекрывание на полученной картине двух популяций башкир с популяцией коми также не противоречит данным о наличии в этноге- • незе башкир финно-угорского компонента, хотя на основании наших результатов такой вывод был .бы преждевременным, т.к. невозможно сопоставление- с данными по другим популяциям,, относящимся к финно-угорским, тюркским и другим группам народностей.

Взаиморасположение же трех популяций башкир - северо-западной, центральной (сев.-вост.) и юго-восточной, напоминающее по форме фигуры два листа общего (вместе с популяцией коми) трилистника, интересно тем, что сразу'ассоциируется с выводах! многих исследователей, согласно которым, в-основе этногенеза башкир -, помимо финно-угорского, как минимум, два различных тюркских корня:'со второй половины 1 тысячелетия - миграция в Среднее Поволжье тюркоязычных волжских булгар и, одновременно (У111 -IX вв), - миграция тюркских кочевников со стороны Средней Азии (Кузеев, 1987). Анализ литературных данных о принадлежности башкир наших, выборок к определенным племенам и их этнической истории позволил внести в это несколько большую ясность. Так, наша выборка из Или-шевского района представляет собой племена киргиз и елан северозападной этнографической группы башкир. Считается, что в сложении их этнической основы ведущую роль сыграли кыпчакские родо-племен-ные образования; значительно и влияние волжско-булгарского .компонента. Для выборки из Абзелиловского района Башкирии (юго-вост.),. представляющей собой 'племя тамьян, установлено этническое родство ■ с казахами и древними монгольскими племенами. Значительное монгольское влияние прослеживается и в этногенезе племен биаул, кум-рук и бадрак, представляющих нашу выборку из Архангельского райо-

на (сев.-вост.). Истоки происхождения указанных племен, поданным этнографов, надо искать на востоке, в районе форифования т'-рко-монгольских племен. Все эти племена с 2(11 - XI11 вв., а возможно и раньше, оказались в сфере влияния крупного племени табын, также имеющего тюркское происхождение и испытавшего до этого значительное монгольское воздействие (Кузесв, 1974).

Таким образом, на наш взгляд, взаиморасположение на подученной картине трех популяций башкир и популяции коми вполне сопоставимо с историко-зтнографическтьш данными о их происхождении и историческом взаимодействии.

Результат анализа внутренней структуры исследуемых популяций (по срставлгасщим выборки микропопуляциям) показал достаточную однородность материала.

Сравнение ицдивццуумов методом -МС с учетом пола показало отсутствие отличий в фенотипическом проявлении изучаемой полиморфной системы ДНК (сочетании фрагментов гибридизации ), связанных с полом. Этот результат был ожидаем, т.к. соответствует положению о мемделевском типе наследования минисателлитов ДНК.

• Как ац^«/, метод (¡шторного анализа соответствий в приложении к обра: 'т'е ДНК-фингерпринтов позволяет по небольшим выборкам (30 - 50 . 1еловек) дкфференциировать генетически подразделенные популяции на уровне этнических групп народов.

Попытка рассчитать генетические расстояния между популя,-циями по частотам фрагментов гибридизации привела к следующим результатам. Прежде всего, в ходе расчетов мы обнаружили, что суша частот фрагментов в каждой популяции совпадает с соответствующим для нее средним числом фрагментов у отдельного индивидуума. Если учесть, что сумма частот аллелей для каждого отдельного локуса равна 1, то можно предположить, что каждый фрагмент у .индивидуума представляет аллель отдельного лоцуса, а в популяции минимальное число лонусов при этом равно среднему числу фрагментов у индивидуума. Это обстоятельство в значительной степени облегчило выбор формулы для расчета генетических расстояний. Мы использовали показатель сходства, предложенный в работе Уивотовского (1979). В таблице 7 представлена матрица показателей генетического, сходства для исследуемых популяций башкир и коми. Из таблицы вцдно, что к популяции башкир Архангельского района опять же наиболее близки оказались абз&яаяовскиз•башкиры и популяция коми, йлиаевская по-

Таблица 7.

Показатели сходства для популяций башкир и кош, подученные по частотам фрагментов гибрвдизацш с зоцдом ДНК бактериофага М13.

Популяция ! 1 ! 2 ! ! ' 3 ! -4

1.Абзелиловский р-он Башкирии 0,8982 0,8045 0,6597

2.Архангельский р-он Башшфии - 0,8101 0,8507

З.Илишевский р-он Башкирии - 0,7939

4.Коми —

пуляция башкир- несколько дальше, но, пршерно, равноудалена от остальных трех исследуемых популяций. По отношению к популяции кош! наибольшую близость проявляет Архангельская популяция, затем - Ияшевскал, наименьшую - Абзелиповская популяция башкир. Как вцдим, полученные соотношения показателей генетического сходства в значительной степени соответствуют данным, полученным в результате факторного анализа соответствий, что также подтверждает информативность метода геномной дактилоскопии на основе зонда ШЗ в популяционно-генетических исследованиях.

Таким образом, полученные результаты вполне доказывают существование популяционных различий по характеру распределения фрагментов гибрщцизации ДНК человека с зондом ДНК фага М13 и подтверждают выводы этнограф и историков о генетической подразделенности популяции башкир, вьделении в их составе различных этнографических групп. Ксходя из этого; можно заключить, что метод геномной дактилоскопии на основе зонда ШЗ может оказаться весьма перспективным и е решении вопросов этногенеза народов. Однако для убедительного доказательства последнего необходимо продолжение подобных исследований для .других популяций. Так,наверное, более значимые выводы могут быть сделаны, если в приведенный здесь анализ включись данные как по другим родо-племенным подразделениям башкир, так и по ряду родственных им народов Волго-Уральского регшг. ч При этом актуальной остается и проблема генетической интерпретации происхождения фрпгк-ентов гибрвдизацш, т.к. при возможности работать с определенными лэ-кусами ДНК и их аллелями можно о'ыло бы получить дополнительно очень богатую пнцррмацта.

ВЫВОДЫ

1.Б трех этногеографических группах башкир и в популяции коми проведено изучение рсстрикционного полиморфизма диморфных ДИК-локусов Ы£Т и Д7Э23, сцепленных с геном муковисцидоза. Установлена высокая частота их аллелей, близкая к 0,5; по распределению частот аллелей данных лоцусов достоверных различий мегэду исследуемыми популяциями не выявлено; по распределению частот генотипов локуса (ЛЕТ показаны достоверные различия между популяциями башкир и популяцией коми.

2.Установлено, что генетические расстояния между популяцией кош и ка-здой из исследуемых групп башкир, рассчитанные по частотам' аллелей ДНК-локусов йЕТ и Д7б23, значительно превышают таковые ме;гду самими популяциями башкир. При учете существующей генетической дифференциации последних это свидетельствует об их значительной однородности по данным признакам. Наибольшую близость к популяции коми проявили башкиры Илишев-ского района.

3.Сравнительный анализ распределения частот аллелей ДНК-локусов МЕТ и Д7э23 среди башкир и .коми с аналогичными литературными данными по другим популяциям показал существование генетической подразделенности популяций человека по данным. • полиморфным системам ДНК, что определяет возможность их использования в качестве генетических маркеров популяций.

4.В исследуемых популяциях башкир и коми проведено изучение гшерполиморфизма иинисателлитов ДНК, выявляемого гибрцци-зациошюй пробой ДНК бактериофага М13. Установлены достоверные популяционные различия как по -оценке среднего числа фрагментов гибридизации у отдельного индивидуума, так и по распределению частот некоторых фракций.

5.Для каздой исследуемой популяции башкир и кош выявлены наборы характеристических фрагментов; они установлены также и для популяций- башкир в целом, в отличие от популяции кош.

6.Показано, что сумма частот фрагментов гибридизации ДНК человека с зондом ШЗ в каздой популяции совпадает с соответствующим для нее средним числом фрагментов у отдельного индивидуума. Это позволяет предположить, что отдельные фрагменты представляют аллели разных локусов, при этом-минимальное число логсусов в популяции равно среднему числу фрагментов у индивида

- 23 -

7.Продемонстрирована возможность использования метода факторного анализа соответствий в приложении к обработке ДНК-фин-герпринтов для подтверждения генетической подразделенное!:! изученных популяций.

8,Показано, что гипервариабельные участки ДНК человека, гомологичные ДНК бактериофага ШЗ, могут служить вксокоипфор-матиЕНЫ.ш маркерами популяций на уровне этнических групп и народов, и использоваться в популяционно-генетических исследованиях.

.СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TffiiE ДИССЕРТАЦИИ.

ЬРариков Х.С., Хускутдинова З.К., Хвдиятова W.M. Генное разнообразие среди тюркоязычннх и финно-угорских народов // Докл. 7. Меядунар. конгресса финно-угроведения. - Дебрецеп,-1990.- С.204 -209.

2.Рафиков Х.С., Хуснутдинова Э.К., Долматова И.Ю./ Хвдия-това И.М., К/зеев Р.Г. Генетические связи башкир с народами-Волго-Уральского региона и Сибири //Сб. Сравнительная антропология башкирского народа. - Уфа.- 1990,- С.60 -75.

3.}(уснутдшюва Э.К., Хвдиятова И.М., Власов Ра[иков Х.С. Изучение характера распределения гшерЕариабельних участков ДНК'Д популяциях башкир // Тезисы 2 Всесоюзного съезда медицинских генетиков,- Алма-Ата,- 1990.- С.470.

» 4.Рафиков Х.С., фснуздинова Э.К., Хвдиятова И.М. Особенности формирования генетической структуры башкир //Сб. Этнография и антропология башкир. - Уфа,- 1991,- С.60 - 70.

5.Хуснутдинова Э.К., Хвдиятова И.М., Иваценко Т.Э., Баранов B.C., Рафиков Х.С. Анализ полиморфизма*ДНК в участках, тесно сцепленных с геном цуковисцвдоза, в популяциях о'ашкир // Тезисы 2 Всесоюзной конференции "Геном человека - 91". - Пере-славль - Залесский. - 1991,- С.1оВ-139,

6.Хуснутдшова Э.К., Хвдиятова И.М., Иваненко Т.Д., Рафиков Х.С. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ДНК в области гена муковисцвдоза в популяциях башкир и коми // Тезисы 2 итоговой конференции 'Генетика человека и патология". -Томск.- 1992. - С.217 - 218.

7.Хвдиятова И.М., Хуснутдинова Э.К., Иващепко Т.П., Рафиков Х.С. ГЩРФ-анализ локусов МЕТ и Д7э23, сцеплс-шчлх с геном муковисцвдоза, в популяциях башкир и коми // Генетика. -1993.-Т. , !Р2.

S.Khusnutdinova 13.IC., Khidiyatova I.!!., Ivaschenko T.E., Safikov ICh.S. Analysis of DMA polymorphism in sites closely linked with cystic fibrosis gens in Bashkir population // Proc. of the 8th Internat. Congress of Human Genetics.- Washington.-1991 (II 2317)..

g.Linborska 3.A., Pogoda T.V., Prosnjak II.I., Perova II.V., liiconovu A.L., Kalnin V.V., Kalnina O.V., Khidiyatova I.M., JChusnutdinova E.K., Rafikov Kh.S. Analysis of Minisatellite Heterogeneity in Human Populations // Abstracts of Internat. Conference "Human Genome' 92".- Nice, Prance.-1992.

ГГ1 «Принт» Зак.№20 Тираж WD экз.