Сравнительный анализ и консервация геномов штаммов вируса натуральной оспы из российской коллекции

Бабкина, Ирина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительный анализ и консервация геномов штаммов вируса натуральной оспы из российской коллекции
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ и консервация геномов штаммов вируса натуральной оспы из российской коллекции"

На правах рукописи

Бабкина Ирина Николаевна

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ И КОНСЕРВАЦИЯ ГЕНОМОВ ШТАММОВ ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ ИЗ РОССИЙСКОЙ КОЛЛЕКЦИИ

03.00.03 —молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 2006

Работа выполнена в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Щелкунов С.Н.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Морозова О.В. кандидат биологических наук Тикунова Н.В.

Ведущая организация

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Защита состоится «8» сентября 2006 г. в 9.00 часов на заседании диссертационного совета при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцове Новосибирской области, 630559; тел. +7 (383) 3367428.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Авторефератразослан^26й-шо1ш_2()0^х.

Ученый секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Широкомасштабные мероприятия, предпринятые мировым сообществом под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по вакцинопрофилактике населения Земного шара против натуральной оспы и строгому противоэпидемическому надзору, привели к ликвидации этого заболевания на планете. В настоящее время коллекции вирусов натуральной оспы (ВНО) поддерживаются только в двух Сотрудничающих центрах ВОЗ: в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцово, Россия) н в Центре по контролю и профилактике заболеваний (Атланта, США). В результате повсеместного прекращения после 1980 года иммунизации против оспы доля населения, восприимчивого к ВНО, постоянно увеличивается. Наличие хранилищ жизнеспособных штаммов ВНО рассматривается как источник возможной биологической опасности. Поэтому на четвертом заседании Комитета ВОЗ по оргопоксвирусным инфекциям в 1986 году было принято решение о необходимости уничтожения коллекций штаммов ВНО и их геномных ДНК. Учитывая планируемое уничтожение в будущем коллекций ВНО, необходимо осуществить надежную консервацию в биологически безопасной форме генетического материала разных изолятов ВНО, что чрезвычайно важно для будущих исследований.

Эксперименты, выполненные ранее в лаборатории проф. С.С. Маренниковой, выявили большое разнообразие штаммов ВНО по спектру биологических свойств. Поэтому, несомненно, важным направлением исследований является дальнейшее углубленное сравнительное изучение структуры геномов широкого набора изолятов ВНО, выделенных в разное время в разных географических зонах. Только детальное генотипирование штаммов позволит выявить границы изменчивости их геномов.

Известно, что штаммы ВНО различного географического происхождения могут вызывать поражения человека, отличающиеся по тяжести и формам протекания заболевания. Оспа, характеризующаяся легким течением, исторически получила название малая оспа (variola minor), в то время как оспу, вызывающую тяжелые заболевания, относят к большой оспе (variola major). В Азии был распространен тип variola major, тогда как в Африке существовали оба типа ВНО. Штаммы малой оспы, циркулирующие в Америке, принято называть alastrim. Биологические тесты выявили четкие отличия штаммов alastrim как от штаммов variola major, так и от изученных африканских изолятов variola minor.

Натуральная оспа была ликвидирована до периода бурного развития новейших технологий молекулярной биологии, наблюдаемого в последние два десятилетия. Поэтому возбудитель данного заболевания и его геном остались почти не изученными. Без фундаментальных исследований генома ВНО разработка современных методов диагностики ВНО и других ортопоксвирусов, создание новых эффективных и безопасных вакцин, методов лечения натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций типа оспы обезьян у человека невозможны или мало эффективны.

Цели и задачи исследования. Целями настоящего исследования были консервация генетического материала различных штаммов вируса натуральной оспы в биологически- безопасной форме, изучение вариабельности геномов набора штаммов ВНО из коллекций России и США и оценка скорости молекулярной эволюции штаммов ВНО.

В ходе работы решались следующие задачи:

1, Выделение препаратов ДНК вируса натуральной оспы и получение музея препаратов полноразмерных ДНК набора штаммов ВНО.

2. Создание и характеризация музея коллекций перекрывающихся ампликонов, охватывающих в совокупности полный геном ВНО, для набора штаммов этого вируса.

3. Получение и характеризация музея клонотек гибридных плазмид, содержащих фрагменты ДНК, покрывающих в совокупности полные геномы набора штаммов ВНО.

4. Сравнительный рестрикционный анализ продуктов длинной полимеразной цепной реакции (ДПЦР) полных геномов штаммов ВНО Российской коллекции.

5. Филогенетический анализ генетического разнообразия штаммов ВНО Российской коллекции на основе данных исследования полиморфизма длин рестрикциоиных фрагментов (ПДРФ) продуктов ДПЦР.

6. Сравнительное изучение молекулярно-биологического разнообразия 63 штаммов ВНО из Российской коллекции и коллекции США.

7. Оценка скорости молекулярной эволюции штаммов ВНО на основе данных ДПЦР-ПДРФ анализа.

Научная новизна и практическая значимость работы. Создан музей препаратов полноразмерных ДНК штаммов ВНО, позволяющий проводить дальнейшее изучение структурно-функциональной организации генома этого уникального вируса. Впервые реализована стратегия создания коллекции ампликонов, перекрывающих в совокупности полный геном ВНО. На основе полученной коллекции ампликонов получены представительные библиотеки гибридных плазмид, содержащих фрагменты полных геномов девяти штаммов ВНО. Проведена паспортизация и надежная консервация полученного музея ампликонов семнадцати шгаммов ВНО и музея клонотек девяти штаммов ВНО в составе Международного репозитария ДНК ВНО при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», что дает возможность использовать их в последующих научных исследованиях. Полученный репозитарий обеспечит возможность долговременного и безопасного хранения фрагментов хенома разных вариантов ВНО, используя которые можно будет создавать новейшие поколения вакцин, продуценты любых вирусных белков, накапливать данные секвенирования выбранных районов генома ВНО и разрабатывать новейшие методы ДНК-диагностики.

Впервые проведен сравнительный анализ полиморфизма длин рестрикциоиных фрагментов двадцати ампликонов, покрывающих в сумме полные геномы 21 штамма ВНО Российской коллекции. Была использована стратегия получения ампликонов ДНК ВНО с помощью длинной полимеразной цепной реакции. Создана база данных ДПЦР-ПДРФ анализа, которая может быть использована как референс система для генотипирования штаммов ВНО. Филогенетический анализ выявил, что штаммы ВНО группируются в зависимости от их географического происхождения, и штаммы alasíritn демонстрируют наибольшие отличия от остальных штаммов ВНО. Впервые выявлен полиморфизм штаммов ВНО внутри одной численно малой вспышки натуральной оспы, произошедшей в Москве в 1960 г.

Проведено подробное исследование генетического разнообразия 63 штаммов ВНО, находящихся в коллекциях ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия) и Центре по контролю и предотвращению заболеваний (США) и имеющих различное географическое происхождение. При проведении сравнительного филогенетического анализа данных ДПЦР-ПДРФ этих штаммов ВНО показано, что западноафриканские штаммы ВНО и штаммы ВНО minor alastrim относятся к отдельному подтипу ВНО, демонстрирующему наибольшие отличия от остальных штаммов ВНО, и что штаммы alastrim произошли от западноафриканских шгаммов ВНО. Впервые сделано предположение о времени, когда западноафриканский подтип эволюционно произошел из вида вируса натуральной оспы.

Апробация работы. По материалы диссертации опубликованы 3 статьи в реферируемых изданиях. Результаты работы были представлены на международных конференциях: 4th, 5th and 7th Meetings of the WHO Advisory Committee on Variola Virus Research (Geneva, Switzerland, 2002; 2003; 2005); 2nd, 4th and 5th US-Russia Cooperative Biological Research Review Conferences (Serpukhov, St. Petersburg, St. Petersburg, Russia,

2002; 2004; 2005); the XVth International Poxvirus and Iridovirus Symposium (Oxford, UK, 2004).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы». Работа изложена на 148 страницах, содержит 32 рисунка, И таблиц и 2 приложения. Библиография включает 277 литературных источников.

Вклад автора. Выделение препаратов ДНК вируса натуральной оспы проводилось в лаборатории 1-го уровня биобезопасности ГНЦ ВБ «Вектор» автором совместно с И.В. Бабкиным и М.В. Михеевым. Создание и характеризация музея коллекций амгоиконов ДНК ВНО выполнено лично автором. Получение и характеризация музея клонотек геномов штаммов ВНО в плазмидных векторах выполнено П.Ф. Сафроновым, Е.А. Уваровой, A.B. Тотмениным, Л.Н. Голиковой, Е. В. Серегиной совместно с автором. ДПЦР-ПДРФ анализ двадцати одного штамма ВНО Российской коллекции выполнен лично автором. ДПЦР-ПДРФ анализ сорока пяти штаммов ВНО из коллекции США выполнен Ю Ли при участии автора. Филогенетический анализ генетического разнообразия штаммов ВНО из Российской коллекции и коллекции США проведен автором совместно с И.В. Бабкиным.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Получение и характеризация препаратов полноразмерных ДНК ВНО.

Целью этого этапа работы было создание коллекции полноразмерных ДНК ВНО и ее характеризация. Штаммы ВНО были наработаны на культуре клеток Vero или на ХАО КЭ. Из полученных препаратов вирусов, были выделены и проверены в ПЦР вирусные ДНК. Для количественной оценки препаратов вирусных ДНК были приготовлены образцы с последовательными разведениями вирусных ДНК и проведена ПЦР. Оценку количества вирусной ДНК в препаратах выполняли после визуализации электрофореграммы продуктов ПЦР в агарозном геле. Далее образцы ДНК ВНО тестировали в ДПЦР. Список полученных препаратов ДНК штаммов ВНО Российской коллекции, пригодных для ДПЦР, представлен в табл. 1. Коллекция полноразмерных ДНК ВНО была помещена на хранение в Международный репозитарий ДНК вируса натуральной оспы ГНЦ ВБ «Вектор».

2. Создание и характеризация музея коллекций ампликонов ДНК ВНО. Задачей второй части данной работы было получение музея, содержащего коллекции ампликонов ДНК ВНО, в целях консервации генетического материала уникальной российской коллекции штаммов ВНО в биологически безопасной форме.

Геном ВНО представлен крупной двухцепочечной линейной молекулой ДНК (около 190 т.п.н.) с ковалентно замкнутыми концами, в которой выделяют консервативную центральную область и вариабельные концевые районы. В настоящее время задача консервации генетического материала ВНО может быть решена при использовании метода ПЦР и создания музея ПЦР-фрагментов полного генома ВНО.

Прогресс в развитии технологии ПЦР позволяет получать ампликоны длиной до 40 тыс.п.н. Была осуществлена стратегия создания музея коллекций ампликонов, полученных в ДПЦР, и охватывающих в сумме полный геном ВНО.

Была разработана схема расположения праймеров, позволяющая получить в ДПЦР 28 перекрывающихся ампликонов, включающих в себя нуклеотидную последовательность полного генома ВНО (рис. 1). Следует подчеркнуть, что прямой праймер ампликона Xsl и обратный праймер ампликона №28 комплементарны NRI1 районам, прилежащим к концевым шпилькам ДНК ВНО.

В ДПЦР использовали ДНК-полимеразу «rTlh DNA Polymerase XL», которая имеет редактирующую активность и позволяет синтезировать продукты с меньшей частотой мутаций. Ампликоны предсказанной длины приблизительно от 2,4 до 11,6

Таблица 1. Сводный список штаммов ВНО из Российской коллекции, ДНК которых выделена и использована для консервации генетического материала и для ДПЦР-ПДРФ анализа

Haiiiunionnii КС шта&гма Географ ичес кии район выделения штамма Страна выделения штамма Гол иыделс ння ЭпИДО МИОЛОП1'ЧССКН н тип вируса Музе Г ¿IM Г I.41 конов Мучен клон ore к фрагмент ов ДПЦР-ПДРФ анализ

Cong о-2 Африка Конго 1970 variola major 4- +

Congo-9 Африка Кон го 1970 variola major +

Rw-18 Африка Руанда 1970 variola major + +

12/62 Африка Танзания 1962 variola major +

13/62 Африка Танзания 1962 variola major + +

22/62 Африка Танзания 1962 variola major +

Ilelder Африка Танзания 1962 variola major + +

Mary Африка Танзания 1962 variola major +

Ngumi Африка Танзаиня 1962 variola major + +

Sem at Африка Танзания 1962 \>ariola major

Butler Европа Великобритания 1952 variola muter alas trim + +

Bra7il-128 (О. Америка Кралнлня II variola minor alastrhn + +

IiniziM31 ТО. Америк-.» Бразилии н variola minor alastrim + +

In d-3 a Ашя Пили я 1967 variola major + +

IntMa Азия II» 1 дня 1967 variola major +

lndiu-71 Азия Пили я 1975 variola major + +

Kuw-5 Азия Кувейт 1967 variola major

6/58 .VI и н Пакистан 1958 variola major + +

Aziz Азия Пакистан 1970 variola major +

Khateen Азия Пакистан 1970 variola major

Taj-RaHn ■\зня Пакистан 1970 variola major + + +

Wzim-Ahmed Азия Пакистан 1970 variola major + +

M-A-60 •\зня/Еврона Россия I960 variola major + +

M-Abr-60 Азия/Еиропа Россия 1960 variola major + +

M-1U-60 4.энм/Еироиа Россия 1960 variola major + + +

M-Gavr-60 Лзин/Еиропа Россия I960 'ariota nuijor + +

M-Sok-60 Лзпн/ Енрона 'осени I960 'iiriola major

M-Sur-60 \зня/Еиропа Россия I960 variola major + +

M-N-60 Азпя/Европа 'ос спя 1960 •ariola major + +

Примечание, н - год выделения неизвестен.

т.п.н. были получены в ДПЦР на препаратах ДНК семнадцати штаммов ВНО, имеющих различное географическое происхождение и относящихся к двум эпидемиологическим типам: variola major и variola minor alasirlm (табл. 1). Все коллекции амшшконов ДНК семнадцати штаммов ВНО, представляющие собой наборы взаимоперекрывающихся фрагментов генома ВНО, были паспортизованы и помещены на долговременное хранение в Международный репозитарий ДНК вируса натуральной оспы ГНЦ ВБ «Вектор».

3. Создание клопотек фрагментов ДНК полных геномов штаммов вируса натуральной оспы. К недостаткам хранения генетической информации в виде

коллекции ампликонов относятся возможный риск деградации продуктов ДПЦР при долговременном хранении, невозможность восполнения полноразмерной коллекции ампликонов по мере их расходования при отсутствии геномной ДНК ВНО. Для решения этой проблемы генетическую информацию можно хранить в виде коллекций рекомбинактных плазмид, содержащих фрагменты ДНК ВНО, которые будем называть клонотеками.

Для решения данной задачи нами предложена схема, включающая использование ДПЦР-ампликонов, подвергнутых гидролизу определенными эпдонуклеазами рестрикции, для последующего клонирования полученных фрагментов в Е. coli в составе плазмидных векторов (рис. 1). Эта схема делает реальным создание клонотек фрагментов ДНК ВНО, в которых любая плазмидная конструкция может быть легко и быстро получена в необходимых количествах, при этом использование штаммов E.coli, дефектных по системе репарации, позволяет избежать накопления ошибок во время репликации ДНК. Такой подход является более трудоемким, но обеспечивает безопасное и более надежное сохранение фрагментов ДНК ВНО в составе плазмид в течение длительного времени. В виде рекомбинантных плазмид геномные последовательности ВНО могут долговременно сохраняться в биологически безопасной форме и обеспечивать работы по изучению генетической организации этого уникального вируса, разработке современных методов экспресс диагностики ВНО, а также являться источником генов BIIO.

При расчете праймеров учитывали наличие консервативных сайтов для ферментов рестрикции Airol, Hindill, Pstl, AsuU, EcoTH и Bamlll на геноме ВНО для последующего клонирования фрагментов. При необходимости сайты гидролиза для эндонуклеаз рестрикции Xhol, BamHl или HindlU вводили в нуклеотидную последовательность праймеров. Была использована схема расположения праймеров, позволяющая получить в ДПЦР 28 перекрывающихся ампликонов, включающих в себя нуклеотидную последовательность полного генома ВНО. Ампликоны имели сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, позволяя упростить клонирование в E.coli в составе плазмидных векторов (рис. 1). Для получения клонотек фрагментов ДНК разных штаммов ВНО были выбраны штаммы, имеющие различное географическое происхождение (табл. 1). Ампликоны предсказанной длины были получены в ДПЦР на препаратах ДНК девяти штаммов ВНО. Все ампликоны ДНК ВНО были проанализированы электрофорезом в агарозном геле. Пример одной из элекгрофореграмм приведен на рис. 2.

Стратегия создания гибридных плазмид включала в себя обработку эпдонуклеазами рестрикции ампликонов в соответствии со схемой, приведенной на рис. 1. Полученные фрагменты встраивали в состав векторов, созданных на основе плазмиды pBluescript II SK+. После трансформации компетентных клеток E.coli отбирали клоны с фенотипом Lac"", в рекомбинантных плазмидах которых определяли наличие вставок ДНК ВНО с помощью рестрикционного анализа. Для каждого из девяти штаммов ВНО была получена коллекция рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты ДНК полного генома ВНО. Все плазмиды коллекций были охарактеризованы гидролизом ДНК эндонуклеазой рестрикции Vspl. Все плазмиды, содержащие фрагменты генома ВНО, были помещены на долговременное хранение в паспортизованный музей клонотек. В результате выполненной работы создан музей клонотек фрагментов ДНК полных геномов девяти штаммов ВНО (табл. 1). Этот музей является безопасным и долговременным хранилищем генетической информации ВНО.

4. Изучение вариабельности геномов штаммов ВНО Российской коллекции при использовании ДПЦР-ПДРФ анализа. Задачей данной части работы являлось изучение генетического разнообразия штаммов ВНО. Для этого провели сравнительный рестрикционный анализ продуктов ДПЦР полных геномов штаммов ВНО из Российской коллекции. Для проведения ПДРФ анализа выполнили синтез

( III 1 II 1 1 1 III II 1 ■Ч

1 1 1 1 II III 1 1 1 II III

)Фо\- Я К Е

фрагменты генома

1 2 3

ХЬо\

ш-нш\

ХЬо\-ВатИ\

ХМ -Р5Й Р£Л-£еоИ]

5 6 4 8

I N В М Н □ Р 19

14 15 16 18 17

С С О I Р О

26 27 28

21 23

24 25

Рис. 1. Схема расположения амшшконов на геноме ВНО пггамм Индия-1967. Латинскими буквами обозначены НтШ\ и Л7го1 фрагменты генома. Двунаправленными стрелками обозначены соответствующие ДПЦР-ампяшсоны, цифрами над ними - порядковые номера амшшконов. Слева указаны эндонуклеазы рестрикции дм гидролиза соответствующих амшшконов.

M I 2 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12 13 14

M 15 16 17 IS 19 2СГ 31, 22. 22 24 25 2« 28 M

i «иаавИиыу,; .ta^ -

Рис. 2. Электрофореграмма амшгиконов, полученных в ДПЦР при использовании ДНГС ВНО штамма М-В1-60. Номера фрагментов (см. рис. 1) приведены над рисунком. М -ДНК-маркер, длина фрагментов в т.п.н. приведена слева.

перекрывающихся ампликонов, в совокупности охватывающих полный геном вируса. Последовательности 20 пар олигонуклеотидных праймеров, комплементарных консервативным районам вирусной ДНК рассчитали, используя выровненные нуклеотидные последовательности секвенированных ранее трех геномов ВНО. Прямой (5-31) праймер ампликона №19 и обратный (3'-5') праймер ампликона №20 (рис. 3) комплементарны консервативным районам, расположенным в непосредственной близости к концевым шпилькам ДНК ВНО.

-[-1-Г- 1 D РО С 1 1-1-----1........1 Е RQ К Н М L 1 "Г" 1 I 1 F N -----1 Т" А —1-Г" S J —г—Г в -Г" G

III 1 II 1 III 1 1 1 1 1 1 ч

III'" 1 1 М 1 1 1 1 1 1 1 Ml

i™1" RKJE A LN BMHDF С GOIPQ

фрагменты

Рис. 3. Схема расположения ампликонов на геноме ВНО штамм Бангладеш-1975.

- Двунаправленными стрелками обозначены соответствующие ампликопы, цифрами под ними — порядковые номера ампликонов. В верхней строке приведены координаты на геноме в т.п.н. Латинскими буквами обозначены Hindlli iiXhol фрагменты генома.

Была использована схема расположения праймеров, предложенная нашими коллегами из CDC (Центр по контролю и предотвращению заболеваний,'Атланта, США), позволяющая получить в ДПЦР. 20 перекрывающихся ампликонов, включающих в себя нуклеотидную последовательность полного генома ВНО (рис. 3). Использование общей схемы ДПЦР и ПДРФ позволяло сопоставить результаты анализа ДНК штаммов ВНО как Российской коллекции, так и коллекции США. ДПЦР проводили при использовании 40 праймеров. Амшшконы, в совокупности охватывающие полный геном ВНО, предсказанной длины от 2,5 до 16 т.п.н. были получены, для каждого из 21-го изученного штамма ВНО (табл. 1, рис. 4). Амшшконы №19, 1 и 2 соответствуют левому вариабельному району генома, ампликоны с №3 по 12 расположены в центральном консервативном районе, а ампликоны №13-18 и 20 — в правом вариабельном районе генома ВНО.

ajjjÎ* V V-te îÎ. » UU i Wit-* W'ii'i

ililiUll.il

Рис. 4. Электрофореграмма ампликонов, полученных в ДПЦР при использовании ДНК ВНО штамма НеЫег. Номера фрагментов (см. рис.3) приведены над рисунком. М - ДНК-маркер, длина фрагментов в т.п.н. приведена слева.

'.те ■■■

1 'С

2 3 4)

6 7 8 У 10 И 12 M

Рис.5. Электрофореграмма ПЦР продуктов, » q полученных при амплификации правого î Й концевого ампликона (№20) ДНК ВНО | штаммов: 1. Ngami, 2. Congo-2, 3. Ind-3a, 4. " Kuw-5, 5. 12/62, 6. 6/58, 7. Butler, 8. M-Abr- ' 60, 9. Aziz, 10. Semât, 11. M-Sok-60, 12. M- " — Sur-60. M - ДНК-маркер, длина в т.п.н. показана слева.

Электрофорез продуктов ДПЦР разных штаммов ВНО выявил достоверный полиморфизм длин концевых ампликонов 19 и 20. Пример сравнительного анализа длин ампликона №20 разных штаммов ВНО приведен на рис. 5.

Из большого набора известных на сегодняшний день эндопуклеаз рестрикции класса II были выбраны ферменты ИраМ и Лл7РЫ1. Данные эндонуклеазы рестрикции были использованы, так как их сайты узнавания представлены в геноме ВНО с частотой в среднем 1 сайт на 1200 п.н. Эти ферменты узнают специфические СС-богатьте нуклеотидные последовательности двухцепочечной ДНК длиной 4 п.н.. Выполненный компьютерный анализ показал, что количество сайтов узнавания Лл/РЬП варьирует между штаммами ВНО в большей степени по сравнению с НраМ. Были получены НраII- и Д57I-гидролизаты всех 20 ампликонов для каждого из 21-го штамма ВНО. Продукты гидролиза всех ампликонов рестриктазами 11ра\\ и В^/РШ были разделены электрофорезом в градиентных 4-20% полиакриламидиьи гелях. Это позволило достоверно разделить фрагменты ДНК длиной от 30 п.н. до нескольких т.п.н. в геле длиной 8 см. Пример одной из электрофореграмм приведен на рис. 6.

" """" дав """" дг-г вв —г разделение в 4-20% ПААГ

"" — __ _ _ .—• — — —" фрагментов, полученных при

■» .__ — — - * ' гидролизе рестрикгазой Нра\1

™ — ЦТ ампликонов ДНК ВНО.

15 —• . -__, — —- : ■" ■___Ампликоны: №3 — дорожки 1, 2;

..........................~ ^ ГГ ГГГ ___№4 -3,4; №5 — 5, 6; №6 — 7, 8.

„, т _ .....- -"-Г" Дорожки: 1, 3, 5, 7 — штамм 1п<1-

:-------4а; 2,4, 6, 8 — штамм М-Оауг-бО.

„ .'■-■- М — ДНК-маркер, длина в п.н.

" • ; . ■ показана слева.

Для подтверждения достоверности полученных результатов были проведены повторные ДПЦР-ЦЦРФ анализы как Д^РЫ!-, так и ДроП-гидролизатов отдельных амшгахонов некоторых ДНК ВНО. Во всех случаях была показана полная воспроизводимость метода.

С помощью программы ВюМитепсз выполняли рад операций по обработке изображений гелей: коррекцию нарушений изображений гелей, возникших во время электрофореза; построение денситомеорических кривых; выравнивание изображений гелей относительно маркерной системы; отнесение полос к определенным классам. В результате выполнения данной работы впервые создана ДПЦР-ПДРФ база данных набора штаммов ВНО из Российской коллекции, которая может быть использована как референс-система для генотипирования штаммов ВНО на основе анализа полного вирусного генома.

5. Филогенетический анализ ДПЦР-ПДРФ базы данных штаммов ВНО Российской коллекции. На основе созданной базы данных, включающую Лл/РТЛ- и ДоаП-рестршщионные карты 20-ти амшшхонов каждого из изученных 21 штамма ВНО, сконструировали единую бинарную таблицу. На основе этой таблицы-провели- -филогенетический анализ полученных результатов. Построили дендргараммы методом объединения ближайших соседей.

Сначала провели филогенетический анализ как НраВ.-, так и ДгГЙД-гидролизатов кавдого из 20 ампликонов 21-го изучаемого штамма ВНО. При изучении дендрограмм, построенных для каждого отдельного ампликона после НраИ гидролиза, установили, что рестрикционные картины для амплификационных фрагментов №5, б, 8, 17 совпадают для всех исследованных штаммов. Наибольший полиморфизм наблюдается во фрагментах №1-3, 15, 19, 20, расположенных ближе к правому и левому вариабельным концам генома вируса натуральной оспы. Было обнаружено, что полиморфизм центральной консервативной части генома незначителен за исключением фрагментов №3 и 12..

Исследование дендрограмм, полученных для каждого отдельного ампликона после Ду/П^П-гидролиза, выявило сходную картину. Рестрикционные картины для амплификационных фрагментов №4, 5, и 14 были идентичны. Наибольший полиморфизм наблюдается во фрагментах №1-3, 15, 18-20, расположенных ближе к правому и левому концам генома, а центральная часть генома демонстрирует, как и для Лра11-гддролизатов, небольшой полиморфизм. Сравнительный анализ дендрограмм для обоих ферментов рестрикции показал, что наибольшие отличия, в центральной части генома представлены во фрагменте №3 и 12. Следует отметить, что в ДиРМ-дендрограммах наблюдается больший полиморфизм, чем в /(раП-децдрограммах. Это согласуется с тем, что количество .й^гЕМТ-сайтов различается между штаммами в большей степени, чем в случае эндонуклеазы рестрикции НраН.

На основе ДПЦР-ПДРФ данных было выявлено, что наибольшие различия между штаммами сосредоточены в вариабельных концевых районах геномов. При этом было установлено, что наибольшие различия между штаммами ВНО локализованы в протяженных амдлихонах №2, 15 ив относительно коротких амшшконах №19, 20, расположенных в непосредственной близости к концевым шпилькам ДНК ВНО (рис. 3) и содержащих короткие тандемные повторы. Изучение генетической карты ампликона №2 из левого вариабельного района генома выявило, что наибольшие различия между штаммами Индия-1967 и Бангладеш-1975 имеет ОРТ С5Ь, а между штаммами Индия-1967 и Гарсия-1966 - ОРТ Б13.5Ь. Анализ генетической карты ампликона №15 из правого вариабельного района генома показал, что наибольшие различия между штаммами Индия-1967 и Бангладеш-1975 имеет ОРТ Л9Я, а между штаммами Индия-1967 и Гарсия-1966 - ОРТ На основании данных рестрикционного анализа ДНК различных штаммов ВНО из Российской коллекции

можно заключить, что для последующего детального молекулярно-биологического исследования наибольший интерес представляют районы ампликонов №2 и 15. Несомненное научное значение имеет филогенетический анализ данных секвенирования этих областей генома ВНО для дальнейшей разработки современных методов диагностики и генотипирования биологического разнообразия штаммов ВНО.

Затем построили дендрограммы методом объединения ближайших соседей при использовании коэффициентов подобия Жаккарда и провели перестановочный анализ статистической значимости дерева по 1000 реплик по данным ДПЦР-ПДРФ анализа ДрсгИ-гидролизатов и Ау/РМ-гидролизатов всех ампликонов генома каждого штамма ВНО, а также рассчитали общее филогенетическое дерево для обоих гидролизатов (рис.

7).

ВгагП-131 ВгагИ-128 Butler 22/62 13/62 Congo-в Congo-2 Haider Rw-18 lndla-71 6/58 M-N-60 lnd-3a M-Sur-60 Wzlm-Ahmed Taj-Barin M-Abr-60 lnd-4a M-Gavr-80

■w-erao----

M-A-SO

* + * * * * * *

Рис. 7. Дендрограмма, построенная методом объединения ближайших соседей по результатам объединенного анализа НраИ- и .Rf/FNI-гидролизатов всех 20-ти ампликонов каждого штамма ВНО. Условные обозначения: звездочка - азиатские штаммы ВНО; квадрат — африканские штаммы ВНО; кружок - штаммы ВНО alastrim. Цифры на дендрограмме показывают индексы статистической надежности узлов дерева. Сверху приведена шкала с указанием значений подобия для дендрограммы в процентах.

Дендрограммы имеют тенденцию к образованию трех групп штаммов ВНО: африканские, азиатские и штаммы ВНО alastrim. Штаммы ВНО alastrim, для которых обнаружены наибольшие отличия от остальных штаммов ВНО, образуют общую группу с высокой надежностью на всех трех деревьях по результатам перестановочного анализа, при этом наибольшее сходство наблюдается между штаммами Brazil-128 и

Butler. Для африканских штаммов ВНО выявлена высокая степень гомологии как между штаммами Congo-9 и Congo-2, так и между штаммами Helder и Rw-18 (рис. 7). Следует отметить, что на всех филогенетических деревьях азиатские штаммы, имеют тенденцию формировать две подтруппы (рис. 7): первая включает в себя штаммы М-Sur-60, M-N-60, Ind-За, Wzim-Ahmed и Taj-Barin; вторая - штаммы М-АЪг-60, M-Gavr-60, M-Bl-60, М-А-60 и Ind-4a.

Среди изученных в данной работе штаммов ВНО шесть выделены от разных больных во время завозной вспышки натуральной оспы в Москве в 1960 г (табл. 1). Для некоторых из них известен путь передачи вируса от человека к человеку (рис. 8). Инфекция была завезена в Москву из Индии российским туристом. Выделения вируса от него не проводилось. От этого больного заразилось 19 человек, которые в свою очередь инфицировали 23 человека. Благодаря интенсивным противоэпидемическим мерам в 3-ей генерации заболело только 3 человека, из числа находившихся в карантине или под наблюдением. Штаммы ВНО M-Sur-60 и M-N-60 получены от больных первой генерации, заразившихся непосредственно от этого туриста. Штамм М-В1-60 (вторая генерация) получен от женщины, заразившейся от жены туриста, а штамм М-А-60 (третья генерация) выделен от ее мужа. Другие два изученных в данной работе штамма ВНО выделены от больных, заразившихся, по-видимому, в результате внутрибольничной инфекции, и сведения об источниках их инфицирования не ясны.

игами* к. ЦИрмит «w» m »Нашаflt

Пг(Ш*Я БМЯЦК ЯЫ.ЙШЙПК В»ЛМЕШК£ЭД.

n»wanw ВГГАМММ-К-6» . ШТАМMMDMt

ШТАММ М-Ш-СО

Ги*ть» ЗВадыюЙХ*

TIM.1UWU д

НГГАМММЛ-»

Рис. 8. Схема источников инфицирования и распределения штаммов по генерациям среди больных во время завозной вспышки натуральной оспы в Москве в 1960 г.

При сравнении штаммов ВНО, выделенных во время вспышки натуральной оспы в Москве, на всех дендрограммах нами выявлен значительный полиморфизм штаммов первой генерации и высокая степень гомологии внутри одной цепочки между штаммами М-В1-60 и М-А-60 второй и третьей генерации соответственно; при этом штамм М-Биг-бО обнаруживает наибольшие отличия от всех остальных рассмотренных штаммов (рис. 7).

Важно отметить, что нами впервые был выявлен полиморфизм штаммов ВНО внутри короткой эпидемиологической цепочки. Возможно, чгго обнаруженные различия геномов московских штаммов ВНО объясняются гетерогенностью исходного вирусного материала, проявившейся в первой генерации вспышки заболевания. Если это так, то можно предполагать наличие набора эволюционных вариантов ВНО в инфекционных выделениях единичного больного. Следует подчеркнуть, что все

московские штаммы группируются на всех полученных нами филогенетических деревьях с азиатскими штаммами. Это согласуется с эпидемиологическими данными о заносе ВНО в 1960 г. в Москву из Индии.

В настоящее время смешанный тип инфекций обнаружен при исследовании таких ДНК-содержагцих вирусов, как аденовирус, вирус гепатита В, вирус папилломы человека, TT вирус, вирус Эшптейна-Барр н цитомегаловирус.

6. Филогенетическое сравнение геномов штаммов ВНО Российской коллекции и коллекции США. Для исследования генетического разнообразия широкого набора штаммов ВНО, находящихся в двух хранилищах: ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия) и CDC (США), был проведен филогенетический анализ по результатам данных ДПЦР-ПДРФ 63 штаммов ВНО. При этом использовали экспериментальные данные, полученные на препаратах ДНК 21-го штамма ВНО из Российской коллекции (табл. 1) и 45-ти штаммов ВНО из репозитария США (табл. 2). Условия проведения ДПЦР-ПДРФ анализа коллекции штаммов США в точности совпадали с условиями анализа Российской коллекции.

Первоначай.нЬё"с0п0ставленйё рестрикционпых профилейппаммов-Росеийекой -коллекции и коллекции США выявило, что профили штаммов Congo-2, Congo-9 и Butler, представленных в обеих коллекциях, полностью идентичны. При этом ДПЦР-ПДРФ анализ независимо проводился в двух научных центрах. Этот результат изучения штаммов ВНО, которые имеют общее происхождение и хранятся в двух коллекциях, явился подтверждением воспроизводимости использованного метода геяотипирования. Полная идентичность рестрикционных карт этих штаммов позволила использовать их как референс-образцы при сравнительном изучении двух коллекций ВНО. Совместный филогенетический анализ включал 63 разных цггамма ВНО.

Созданную базу данных, включающую ÄrfFNi- и Дра11-рестрикционные карты 20-ти амшшконов каждого из изученных 63 штаммов ВНО, обработали с помощью компьютерной программы BioNumerics и сконструировали единую бинарную таблицу. На основе этой таблицы провели филогенетический анализ полученных результатов для обоих гидролизатов, так как при его построении используется максимальное количество информации о геномах, и это позволяет получить более достоверные данные по сравнению различных штаммов ВНО. Дендрограмму построили методом объединения ближайших соседей при использовании коэффициентов подобия Жаккарда и провели перестановочный анализ статистической значимости дерева по 1000 реплик (рис. 9).

В созданной дендрограмме выделяются три кластера: первый — включающий только азиатские штаммы, второй — азиатские и африканские штаммы, третий -западноафриканские штаммы и изоляты из Южной Америки (рис. 9). Внутри каждого кластера штаммы ВНО имеют тенденцию группироваться в зависимости от их географического происхождения с невысокими значениями индексов статистической надежности. Важно подчеркнуть, что изоляты третьего кластера демонстрируют наиболее значительные отличия от всех остальных штаммов ВНО. Внутри него выделяются две группы изолятов ш Южной Америки и из Западной Африки, также в эту группу входит завозной штамм-МШ.

Для проверки достоверности полученных результатов построили общее филогенетическое дерево для обоих гидролизатов методом максимальной экономии Общий характер формирования групп этого дерева оказался подобен характеру кластеризации дерева, построенного при использовании метода объединения ближайших соседей. Все исследованные штаммы ВНО также распределяются на три аналогичные кластера. Западноафриканские штаммы (Бенин и Сьерра-Леоне) демонстрируют наибольшие отличия от остальных африканских штаммов и образуют единый кластер со штаммами ВНО minor alastrim.

Таблица 2. Штаммы вирусов натуральной оспы из коллекции Центра по контролю и предотвращению заболеваний (США), использованные для ПДРФ-ДПЦР анализа.

Географический район лыдслепня штамма Сграна выделения штамма Наименование иггамма Год вццеления

Западная Африка Бенин BEN68 1968

Западная Африка Сьерра-Леоне SRLN69 1969

Африканский Рог Эфиопия ЕТН72-16 1972

Африканский Рог Эфиопия ВТН72-17 1972

Африканский Рог Сомали SOM77-1252 1977

Африканский Рог Сомали SOM77-1605 1977

Африканский Рог Сомали SOM 1977

Африка ркпсий Рог Судан SUDR47 1941

Африканский Рог Судан SUDJ47 1947

Центральная Африка Конго Congo-9 1970

Центральная Африка Конго Congo-2 1970

Южная Африка Ботсвана BOTW72 1972

Южная Африка Ботсвана BOTW73 1973

Южная Африка Танзания TAN65 1965

Южная Африка ЮАР (Наталь) SAF65-I02 1965

Южная Африка ЮАР (Трансвааль) SAF65-103 1965

Южная Америка Бразилия OAR66 1966

Южная Америка Бразилия BRZ66 1966

Северная Америка США (Миннеаполис) MIN 1939

Европа Великобритания Butler 1952

Европа Великобритания HAR46 1946

Европа Великобритания HIG47 1947

Европа Великобритания HIN46 1946

Европа Германия HBG и

Азия (Индостан) Бангладеш BSH75 1975

Азия (Индостан) Бангладеш BSH74NI 1974

Азия (Индостан) Бангладеш BSH7SH 1974

Азия (Индостан) Бангладеш BSII74SO 1974

Азия (Индостан) Индия (Мадрас) IND53-Kali 1953

Азия (Цндостнн) Индия (Дели) IND53-NewDel 1953

Азия (Индостан) Индия (Веллор) IND64-7I24 1964

Азия (Индостан) Индия (Веллор) 1ND64-7125 1964

Азия (Индостан) Непал NEPAL73 1973

Азия (Индостан) Пакистан PAK69 1969

Азия Суматра SUM70-222 1970

Азия Суматра SUM70-228 1970

Азия (Центральная Азия) Афганистан AFGV7Q 1970

Азия (Центральная Азия) Иран (Тебриз) IRAN и

Азия (Центральная Азия) Кувейт KUW67 1967

Азия (Центральная Азия) Сирия SYR72 1972

Азия Япония HRP51 1951

Азия Япония YAM46 1946

Азия Япония STIL51 1951

Азия Китай HOR48 1948

Азия Корея LEE47 1947

Примечание, н - год выделения неизвестен.

Данные сравнительного ДПЦР-ПДРФ анализа позволили выявить детальные различия между изолятами разных вспышек. В результате проведенного ДПЦР-ПДРФ анализа можно заключить, что западноафриканские штаммы ВНО и штаммы variola minor alastrim относятся к отдельному биологическому подтипу ВНО, демонстрирующему наибольшие отличия от остальных штаммов ВНО, и штаммы alastrim произошли от западноафриканских штаммов ВНО. Это находится в

соответствии с данными биологических тестов по определению летальной дозы вируса для куриных эмбрионов и уровня гемагглютинина в инфицированных клеточных культурах. При этом по предельной температуре размножения вируса на ХАО КЭ, гемадсорбции при 40°С и по известным эпидемиологическим данным западноафриканские штаммы ВНО отличаются от изолятов variola minor alastrim. Различие в их биологических свойствах, возможно, обусловлено их независимой эволюцией, начиная с определенного времени. Это подтверждается тем, что штаммы ВНО из Южной Америки и из Западной Африки формируют две отдельные группы в общем кластере филогенетического дерева (рис. 9).

Данные о происхождении штаммов alastrim от западноафриканских штаммов ВНО согласуются с историческими фактами преимущественного ввоза рабов на американский континент с западного побережья Африки. Известно, что массовые перемещения рабов в Америку начались в начале 16 века из Западной Африки, вначале вывоз осуществлялся через Европу, а затем работорговцы перешли к прямым поставкам невольников в Америку. В 1517 г. оспа была завезена из Западной Африки на острова Карибского моря, в 1520 г. она была перенесена в Центральную Америку, а в 1524 г. — в Южную Америку. Основываясь на исторических данных о завозе ВНО на южноамериканский континент в 1517-1524 гг. из Западной Африки, провели изучение эволюции ВНО. Для этого выбрали 23 штамма, выделенные в течение короткого промежутка времени между 1965 и 1972 гг., и провели анализ их ДПЦР-ПДРФ данных с помощью пакета BioNumerics. С помощью полученной бинарной таблицы подобия построили матрицу расстояний, используя программу RESTDIST из пакета Phylip 3.6. Применяя программу KITSCH из этого же пакета, на основе полученной матрицы расстояний сконструировали дендрограмму методом Фитча-Марголиаша с оценкой эволюционных часов. При сравнении этого дерева с дендрограммами, построенными методами объединения ближайших соседей и максимальной экономии, можно заключить, что общий характер распределения штаммов сохраняется во всех дендрограммах.

Основываясь на том, что независимая эволюция штаммов ВНО в Южной Америке и Западной Африке происходила в течение примерно 400 лет, с помощью построенной дендрограммы можно оценить, что выделение подтипа ВНО, включающего штаммы minor alastrim и западноафриканские штаммы, из вида Variola virus произошло примерно 1100 лет назад. При проведении филогенетического анализа таким же образом, но только для высококонсервативного района генома этих штаммов ВНО (ампликоны №3-12) сделали оценку, что этот подтип ВНО появился примерно 1300 лет назад (рис. 10). Таким образом, сопоставление данных, полученных при ДПЦР-ПДРФ анализе полного генома ВНО и его консервативного района, позволило впервые, определить, что подтип ВНО, объединяющий западноафриканские штаммы и штаммы minor alastrim, выделился из вида вируса натуральной оспы примерно 11001300 лет назад.

-Е1Е

* 1.ЕЕ47

* НО1Ч40

* $иМ70-22в

* БиМ70-2г2

* УАМ48

* НЛР61

* вт»ив1

* |ЫОВЗ-К«П

* Н1Ы4в -А в/бв

* НАП4в

* Т»>-В»Пп

* \ЛЛ1т-АЬт»<1

* (N064-7126

* 1ЫО&4-7124

* КЦ\ЛЛ7

* АР(ЭУ70

* 1НАЫ

* рлква ■

* 8УИ72

* ВЭН743Н

* В8Н74ЭО

* ВвН74М(

* В8Н76

* М-АЬГ-вО

* м-ы-во

* т<а-зв

1п4-4а

* МЧЭяуг-вО

* М-А-вО

* М-В1-вО

* ЫБРА1.73

* М-€иг-40

■ 8АР85*102

■ 5АРвб-10Э М ВОТУУ72

■ ВОТУ>/7Э

■ ТАМвб

* НЮ47

* нво

■ н«к]ег

■

■ 13/62

■ гэдг

я Сап()о>2 ш Сопдо-9

■ вОМ77»1вОв

■ бОМ

Я ЭОМ77-12В2

■ 81ЛЖ47

■ виоЛ7

■ ЕТН72-18

■ ЕТН7Й-17 т ВЕЫвП

Я вПЬМбв

* М(М

* Виивг

Рис. 9, Дендрограмма, построенная по суммарным результатам- анализа ЯлтРК!- и /У/заП-гидролизатон всех 20-ти ампликонов 63 штаммов ВНО методом объединения ближайших соседей. Условные обозначения: звездочка —азиатские штаммы; квадрат—африканские штаммы; кружок - штаммы ромб - штаммы ВНО, выделенные во время завозных вспышек натуральной оспы в странах, свободных от данной инфекции. Цифры на дендрограмме показывают индексы статистической надежности узлов дерева. Снизу приведена шкала с указанием значений подобия для дендрограммы в процентах.

-1300 лаг

* - время выделения штаммов ВНО (1965-1972гг.)

•400 лет

-5Ш169 ~веш

|ВЯ266

■1100

Рис. 10. Дендрограмма, построенная по результатам анализа &/ЕЫ1~ и ДряП-гидролизатов ампликонов №3-12 двадцати трех штаммов ВНО методом Фитча-Марголиаша с оценкой эволюционных часов. Цифры на дендрограмме показывают индексы статистической надежности узлов дерева. Снизу приведена временная шкала.

ВЫВОДЫ

1. Получены и охарактеризованы препараты полноразмерных ДНК 29 штаммов ВНО; коллекции ампликонов ДНК 17 штаммов ВНО, охватывающих в сумме полный геном вируса; клонотеки фрагментов ДНК полных геномов 9 штаммов ВНО. Паспортизованные коллекции помещены в Международный репозитарий ДНК ВНО при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

2. С использованием ДПЦР-ПДРФ анализа впервые проведено изучение генотипического разнообразия 21 штамма вируса натуральной оспы Российской коллекции и выполнен филогенетический анализ полученных данных. Показано, что все штаммы ВНО формируют три филогенетические группы: африканские, азиатские изоляты и штаммы ВНО alastrim.

3. Впервые обнаружена гетерогенность индивидуальных изолятов ВНО внутри одной ограниченной вспышки натуральной оспы, произошедшей в г. Москве в 1960 г. Сделано предположение о возможности смешанной инфекции различными вариантами ВНО одного больного.

4. В результате филогенетического исследования данных ДПЦР-ПДРФ анализа ДНК 63 штаммов ВНО из Российской коллекции и коллекции США впервые обнаружено, что западноафриканские штаммы ВНО и штаммы ВНО minor alastrim объединяются в отдельный подтип ВНО, демонстрирующий наибольшие отличия от остальных штаммов ВНО. Исходя из того, что дивергентная эволюция ВНО alastrim и западноафриканского варианта ВНО началась около 400 лет назад, определено, что западноафриканский подтип ВНО выделился из вида Variola virus примерно 1100-1300 лет назад.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бабкипа И.Н., Бабкин И.В., Маренникова С.С., Сандахчиев Л.С., Щелкунов С.Н. Сравнительный рестрикциоиный анализ геномов штаммов вируса натуральной оспы из российской коллекции // Молекуляр. биология - 2004 - Т. 38 - С. 429-436.

2. Бабкина И.Н., Бабкин И.В., Ли Ю., Ропп С., Клайн Р., Дэмон И., Эспозито Дж., Сандахчиев Л.С., Щелкунов С.Н. Филогенетическое сравнение геномов различных штаммов вируса натуральной оспы // Докл. РАН - 2004 - Т. 3 98 - С. 316-319

3. Бабкина И.Н., Сафронов П.Ф., Бабкин И.В., Уварова Е.А., Тотменин А.В., Голикова Л.Н., Михеев М.В., Серегина Е.В., Гуськов А.А., Сокунова Е.Б., Щелкунов С.Н. Создание клонотек фрагментов ДНК полных геномов разных штаммов вируса натуральной оспы // Вопр. вирусологии - 2005 — Т. 50 - С. 18-23

4. I.N. Babkina, I. V. Babkin, S. N. Shchelkunov Comparative restriction enzyme analysis of the genome of variola virus strains from the Russian collection. In: The XVth International Poxvirus and Iridovirus Symposium. 2004. Oxford, UK, September 3-8, P.

Участие в конференциях

1. I.N. Babkina, I. V. Babkin, S. N. Shchelkunov Conservation of genetic material and study of genomic structure of different variola virus strains. In: Cooperative Biodefese Research. 2002. Serpukhov, Russia, June 3-5

2. S. N. Shchelkunov, I. N. Babkina, I. V. Babkin Genetic material conservation and study of the genome structure of various natural smallpox strains (ISTC # 1987). In: Fourth Annual Cooperative Biological Research Annual Review. 2005. Saint-Petersburg, Russia, July 12-15

3. I. V. Babkin, I. N. Babkina, S. N. Shchelkunov Project #1987p. Conservation of genetic material and study of genomic structure of different variola virus strains. In: 5th US-Russia Cooperative Biological Research Review Conference. 2005. St. Petersburg, Russia, October 10-13

4. Результаты исследований были доложены на ежегодных Meeting of the WHO Advisory Committee on Variola Virus Research (Geneva, Switzerland, 2002; 2003; 2005)

Подписано в печать 12.07.2006 Формат 60x84 1/1 б Печ.л. I

Заказ № 74 Бумага офсетная, 80 гр/м2 Тираж 100

Отпечатано в типографии Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бабкина, Ирина Николаевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. МЕТОДЫ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ВИРУСОВ.

2.1 Уникальные методы генотипирования РНК-содержащих вирусов.

2.1.1. Олигонуклеотидный метод "отпечатков пальцев".

2.1.2. Анализ полиморфизма длин геномных сегментов. (Электрофоретипирование).

2.2. Методы генотипирования ДНК- и РНК-содержащих вирусов.

2.2.1. Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот.

2.2.2. Иммуноферментный анализ ДНК.

2.2.3. Анализ с помощью РНКазы А.

2.2.4. Гетеродуплексный анализ.

2.2.4.1. Анализ подвижности гетеродуплексов.

2.2.4.2. Анализ подвижности гетеродуплексов с меченым зондом.

2.2.5. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК.

2.2.6. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

2.2.6.1. Классический ПДРФ анализ.

2.2.6.2. ПЦР-ПДРФ анализ.

2.2.6.3. ОТ-ПЦР-ПДРФ анализ.

2.2.6.4. ДПЦР-ПДРФ анализ.

2.2.6.5. Филогенетический анализ данных ПДРФ.

2.2.6.6. Саузерн-блот анализ.

2.2.7. Определение нуклеотидной последовательности вирусных геномов.

2.2.7.1. Методы секвенирования.

2.2.7.2. Стратегия секвенирования протяженных фрагментов ДНК.

2.2.7.3. Применение секвенирования для генотипирования вирусов.

2.2.8. Генотипирование смешанных инфекций.

2.3. Генотипирование поксвирусов.

2.3.1. ПДРФ анализ ДНК ортопоксвирусов.

2.3.2. ПЦР-ПДРФ анализ ортопоксвирусов.

2.3.3. ПЦР методы анализа ДНК ортопоксвирусов.

2.3.4. Методы молекулярной гибридизации ортопоксвирусов.

2.3.5. ПДРФ анализ ДНК поксвирусов.

2.3.6. Определение нуклеотидных последовательностей поксвирусов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительный анализ и консервация геномов штаммов вируса натуральной оспы из российской коллекции"

Широкомасштабные мероприятия, предпринятые мировым сообществом под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по вакцинопрофилактике населения Земного шара против натуральной оспы и строгому противоэпидемическому надзору, привели к ликвидации этого заболевания на планете (WHO, 1980). В настоящее время коллекции вирусов натуральной оспы (ВНО) поддерживаются только в двух Сотрудничающих центрах ВОЗ: в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцово, Россия) и в Центре по контролю и профилактике заболеваний (Атланта, США). В результате повсеместного прекращения после 1980 года иммунизации против оспы доля населения, восприимчивого к ВНО, постоянно увеличивается. Наличие хранилищ жизнеспособных штаммов ВНО рассматривается как источник возможной биологической опасности. Поэтому на четвертом заседании Комитета ВОЗ по ортопоксвирусным инфекциям в 1986 году было принято решение о необходимости уничтожения коллекций штаммов ВНО и их геномных ДНК (WHO, 1980). Учитывая планируемое уничтожение в будущем коллекций ВНО, необходимо осуществить надежную консервацию в биологически безопасной форме генетического материала разных изолятов ВНО, что чрезвычайно важно для будущих исследований.

Эксперименты, выполненные ранее в лаборатории проф. С.С.Маренниковой, выявили большое разнообразие штаммов ВНО по спектру биологических свойств (Маренникова, Щелкунов, 1998). Поэтому, несомненно, важным направлением исследований является дальнейшее углубленное сравнительное изучение структуры геномов широкого набора изолятов ВНО, выделенных в разное время в разных географических зонах. Только детальное генотипирование штаммов позволит выявить границы изменчивости их геномов.

Цели и задачи исследования

Целями настоящего исследования были консервация генетического материала различных штаммов вируса натуральной оспы в биологически безопасной форме, изучение вариабельности геномов набора штаммов ВНО из коллекций России и США и оценка скорости молекулярной эволюции штаммов ВНО.

В ходе работы решались следующие задачи:

1. Выделение препаратов ДНК вируса натуральной оспы и получение музея препаратов полноразмерных ДНК набора штаммов ВНО.

5. Филогенетический анализ генетического разнообразия штаммов ВНО Российской коллекции на основе данных исследования полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) продуктов ДПЦР.

7. Оценка скорости молекулярной эволюции штаммов ВНО на основе данных ДПЦР-ПДРФ анализа.

Научная новизна и практическая значимость работы

Создан музей препаратов полноразмерных ДНК штаммов ВНО, позволяющий проводить дальнейшее изучение структурно-функциональной организации генома этого уникального вируса.

Впервые реализована стратегия создания коллекции ампликонов, перекрывающих в совокупности полный геном ВНО.

На основе полученной коллекции ампликонов получены представительные библиотеки гибридных плазмид, содержащих фрагменты полных геномов девяти штаммов ВНО.

Проведена паспортизация и надежная консервация полученного музея ампликонов семнадцати штаммов ВНО и музея клонотек девяти штаммов ВНО в составе Международного репозитария ДНК ВНО при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», что дает возможность использовать их в последующих научных исследованиях. Полученный репозитарий обеспечит возможность долговременного и безопасного хранения фрагментов генома разных вариантов ВНО, используя которые можно будет создавать новейшие поколения вакцин, продуценты любых вирусных белков, накапливать данные секвенирования выбранных районов генома ВНО и разрабатывать новейшие методы ДНК-диагностики.

Впервые проведен сравнительный анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов двадцати ампликонов, покрывающих в сумме полные геномы 21 штамма ВНО Российской коллекции. Была использована стратегия получения ампликонов ДНК ВНО с помощью длинной полимеразной цепной реакции. Создана база данных ДПЦР-ПДРФ анализа, которая может быть использована как референс система для генотипирования штаммов ВНО. Филогенетический анализ выявил, что штаммы ВНО группируются в зависимости от их географического происхождения, и штаммы alastrim демонстрируют наибольшие отличия от остальных штаммов ВНО. Впервые выявлен полиморфизм штаммов ВНО внутри одной численно малой вспышки натуральной оспы, произошедшей в Москве в 1960 г.

Проведено подробное исследование генетического разнообразия 63 штаммов ВНО, находящихся в коллекциях ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия) и Центре по контролю и предотвращению заболеваний (США) и имеющих различное географическое происхождение. При проведении сравнительного филогенетического анализа данных ДПЦР-ПДРФ этих штаммов ВНО показано, что западноафриканские штаммы ВНО и штаммы ВНО minor alastrim относятся к отдельному подтипу ВНО, демонстрирующему наибольшие отличия от остальных штаммов ВНО, и что штаммы alastrim произошли от западноафриканских штаммов ВНО. Впервые сделано предположение о времени, когда западноафриканский подтип эволюционно произошел из вида вируса натуральной оспы.

Апробация работы

По материалы диссертации опубликованы 3 статьи в реферируемых изданиях. Результаты работы были представлены на международных конференциях: 4th, 5th and 7th Meetings of the WHO Advisory Committee on Variola Virus Research (Geneva, Switzerland, 2002; 2003; 2005); 2nd, 4th and 5th US-Russia Cooperative Biological Research Review Conferences (Serpukhov, St. Petersburg, St. Petersburg, Russia, 2002; 2004; 2005); the XVth International Poxvirus and Iridovirus Symposium (Oxford, UK, 2004).

Вклад автора

Выделение препаратов ДНК вируса натуральной оспы проводилось в лаборатории 1-го уровня биобезопасности ГНЦ ВБ «Вектор» автором совместно с И.В. Бабкиным и М.В. Михеевым. Создание и характеризация музея коллекций ампликонов ДНК ВНО выполнено лично автором. Получение и характеризация музея клонотек геномов штаммов ВНО в плазмидных векторах выполнено П.Ф. Сафроновым, Е.А. Уваровой, А.В. Тотмениным, JI.H. Голиковой, Е. В. Серегиной совместно с автором. ДПЦР-ПДРФ анализ двадцати одного штамма ВНО Российской коллекции выполнен лично автором. ДПЦР-ПДРФ анализ сорока пяти штаммов ВНО из коллекции США выполнен Ю Ли при участии автора. Филогенетический анализ генетического разнообразия штаммов ВНО из Российской коллекции и коллекции США проведен автором совместно с И.В. Бабкиным.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Бабкина, Ирина Николаевна

6. ВЫВОДЫ

3. Впервые обнаружена гетерогенность индивидуальных изолятов ВНО внутри одной ограниченной вспышки натуральной оспы, произошедшей в г. Москве в 1960г. Сделано предположение о возможности смешанной инфекции различными вариантами ВНО одного больного.

2.4. Заключение

Быстрое развитие за последние десятилетия молекулярно-биологических методов исследования ДНК и РНК предоставило ученым возможность детального изучения вирусных геномов. В настоящее время существует широкий набор молекулярных методов типирования и субтипирования вирусов. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, которые необходимо учитывать при изучении конкретного вируса.

Возможность использования метода определяется характерными особенностями изучаемого вируса. В первую очередь это обуславливается природой нуклеиновой кислоты вирусного генома - относится она к ДНК или РНК. Другие характеристики вирусного генома, определяющие выбор метода генотипирования: представлен геном одно- или двухцепочечной нуклеиновой кислотой, его размер, наличие сегментов генома. Следует также учитывать трудоемкость культивирования вируса и необходимость соблюдения при этом специальных мер биобезопасности.

В базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) депонированы последовательности вирусных геномов от ста нуклеотидов до 1,2 миллиона п.н. в случае Mimivirus. Во многих случаях можно провести определение полной нуклеотидной последовательности коротких геномов, однако, зачастую молекулярно-биологическое изучение протяженных геномов целесообразно проводить другими методами.

При изучении поксвирусов наибольшее распространение получили методы, основанные на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Этот выбор обусловлен тем, что их геном содержит протяженную двухцепочечную молекулу ДНК, и ПДРФ анализ вирусной ДНК легко выполним при наличии необходимого количества препарата выеокоочищенной геномной ДНК. Однако, получение таких препаратов особоопасных для человека ортопоксвирусов, таких как ВНО, требует культивирования препаративных количеств вируса, проведение его очистки от клеточных компонентов и выделения нативной вирусной ДНК, в условиях лаборатории 1-го уровня биобезопасности. Применение ПЦР для амплификации фрагментов вирусной ДНК позволяет использовать значительно меньшие количества ДНК, без дополнительных требований к чистоте и целостности матрицы.

Для упрощения генотипирования в большинстве современных исследований анализируют отдельные короткие локусы вирусных геномов (ПЦР-ПДРФ), к выбору которых необходимо подходить с большой аккуратностью, так как результаты такого анализа могут быть недостаточно информативными. Изучение литературных данных ПЦР-ПДРФ анализа ортопоксвирусов позволяет сделать вывод, что детальное генотипирование на основе данных полиморфизма коротких вирусных фрагментов невозможно.

Для подробного сравнительного молекулярно-биологического исследования высокопатогенных для человека ортопоксвирусов целесообразно использовать ДПЦР-ПДРФ анализ полных вирусных геномов. Гидролиз мелкощепящими эндонуклеазами рестрикции длинных ампликонов, охватывающих в совокупности весь вирусный геном, позволяет выявить детальные различия между изолятами ортопоксвирусов. Потенциал использования ДПЦР-ПДРФ анализа при исследовании такого опасного вируса, как ВНО, оценивается очень высоко.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3.1. Материалы Реактивы, наборы реактивов, ферменты.

Наборы реактивов:

1. GeneAmp® XL PCR Kit («Applied Biosystems», США);

2. QIAquick Gel Extraction Kit («QIAGEN», США);

3. Taq ДНК-полимераза, буфер для ПЦР, набор dNTP («СибЭнзим», Россия); Реактивы:

1. Агароза, («Sigma», США);

2. Ампициллин (АКО «Синтез», Россия);

3. Ацетат калия («Реахим», Россия);

4. Ацетат натрия («Реахим», Россия);

5. Бакто-агар («Sigma», США);

6. Бакто-триптон, («Sigma», США);

7. Глицерин («Sigma», США);

8. Глюкоза («Реахим» Россия);

9. Додецилсульфат натрия (SDS) («Serva», Германия).

10. Дрожжевой экстракт («Sigma», США);

11. Изопропанол («Реахим», Россия);

12. Изопропил-Р-О-тиогалактозид (ИПТГ) («Sigma», США);

13. Канамицин (АКО «Синтез», Россия);

14. РНКаза A («Sigma», США);

15. Тетрациклин («Sigma», США);

16.1,1,2, трифтортрихлорэтан («Sigma», США);

17. Фенол («Реахим», Россия);

18. Хлороформ («Реахим», Россия);

19. Этанол (Россия)

20. 2-Р-меркаптоэтанол («Sigma», США);

21. 5-бром-4хлор-Зиндолил-Р-0-галактопиранозид (X-Gal) («Sigma», США);

22. СаС12х2 Н20 («Sigma», США);

23. СНзСООН («Реахим», Россия);

24. DMSO («Sigma», США);

25. EDTA («Sigma», США);

26. LiCl («Sigma», США);

27. МпС12х4Н20 («Sigma», США);

28. MOPS («Sigma», США);

29. NaCI («Реахим», Россия);

30. NaOH («Реахим», Россия);

31. RbCl («Sigma», США);

32. Tris («Sigma», США);

33. Tris-HCl («Sigma», США);

34. Triton X-100 («Sigma», США);

Ферменты и маркеры молекулярных весов

В работе использовали лизоцим производства компании «Serva» (Германия), эндонуклеазы рестрикции Hindlll, Xhol, ДНК-лигазу фага Т4 производства компании «Fermentas» (Литва), эндонуклеазы рестрикции ВатШ, EcoKl, Asull, Pstl, Bsa29l, Vspl, лизоцим, протеиназу К и щелочную фосфатазу компании «СибЭнзим» (Новосибирск, Россия). 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-0-галактопиранозид (X-Gal), изопропил- (3-D-тиогалактопиранозид (IPTG) компании «Sigma» (США).

Во всех ферментативных реакциях использовали буферы и условия проведения реакции, рекомендованные производителем фермента.

Маркеры молекулярных весов нуклеиновых кислот: 1 Kb ДНК-маркер, 100 bp ДНК-маркер и X ДНК/Я/wdIII маркеры («СибЭнзим», Россия); BenchTop pGEM («Promega», США).

Буферные растворы

Гипотонический буфер: (10 мМ Трис-НС1; 10 мМ КС1; 5 мМ ЭДТА; рН 8,0) Изотонический буфер: (10 мМ Трис-НС1; 150 мМ NaCI; 5 мМ ЭДТА; рН 8,0) Лизирующий буфер (ЛБ): (100 мМ Трис-НС1; 100 мМ ЭДТА; 100 мМ NaCI; 1% SDS; рН 8,0)

ТЕ: (10 мМ Трис-НС1; 1 мМ ЭДТА; рН 8.0) ТАЕ: (40 мМ Трис-НС1; 40 мМ СН3СООН; 2 мМ ЭДТА; рН 8.0) ТВЕ: (2 мМ ЭДТА; 89 мМ Трис-HCl; Борная кислота; рН 8.3) RF-1: (100 мМ RbCl; 50 мМ МпС12х4Н20; 30 мМ КОАс; 10 мМ СаС12х2Н20; Глицерин-15% (вес/обьем); рН 5.8)

RF-2: (ЮмМ RbCl; 10 мМ MOPS; 75мМ СаС12х2Н20; Глицерин- 15% (вес/обьем); рН 6.8). Стерилизовали фильтрацией через нитроцеллюлозный фильтр 0.2 мкм.

Растворы для выделения ДНК методом щелочного лизиса

Раствор I: (10 мМ ЭДТА; 25 мМ Трис-HCl; Глюкоза -50 мМ; рН 8.0)

Раствор II: (0,2 М NaOH; 1% SDS)

Раствор III: (3 М ацетат калия; рН 5,2)

Питательные среды

LB-бульон: (Триптон -10 г; Дрожжевой экстракт -5 г; NaCl - 5 г; рН 7,5; Н2О - до 1 л) Стерилизуется автоклавированием.

Агаризованная среда: (LB-бульон + 1,8% агара) Стерилизуется автоклавированием.

Штаммы Escherichia coli и плазмиды

В работе использовали штаммы E.coli JM109 {recAl endAl gyrA96 thi hsdR17(rk mk+) supE44 relAl X A (lac-proAB) [F traD36proAB lacPZAM15]} и XLl-Blue {supE44 hsdRl7 recAl endAl gyrA96 thi relAl lac [F proAB+ lacPZAM15 TnlO (Tef)]} из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор», а также плазмиду pBluescript II SK+ «Stratagene», США.

Штаммы ВНО

Штаммы ВНО из Российской коллекции (ГНЦ ВБ «Вектор»), для которых получены препараты полноразмерной ДНК, приведены в табл. 2. Штаммы ВНО, использованные при создании коллекций ампликонов, представлены в табл. 3. Список штаммов ВНО, ДНК которых была использована для создания музея клонотек фрагментов генома, приведен в табл. 4. Штаммы ВНО, использованные для ПДРФ-ДПЦР анализа, перечислены в табл. 5. Культивирование вирусов проводили, как описано ранее (Lapa et al, 2002) на хорион-аллантоисных оболочках куриных эмбрионов (ХАО КЭ) или на культуре клеток Vero.

Штаммы ВНО из коллекции Центра по контролю и предотвращению заболеваний (Атланта, Джорджия, США), ДНК которых использовалась в сравнительном ДПЦР-ПДРФ анализе, представлены в табл. 6.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бабкина, Ирина Николаевна, Кольцово

1. Бароян О.В., Серенко А.Ф. Вспышка оспы в Москве в 1959-1960 гг. // Журн. микробиол. -1961. № 4. - С. 72-79.

2. Болдырев Г.Е., Шатров И.И., Брайнина Р.А., Юлаев С.Н. О противоэпидемических мероприятиях по ликвидации очага натуральной оспы. // Журн. микробиол. 1962. -№ 2. - С. 116-119.

3. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. -КМК.-1998.-386 с.

4. Мацеевич Г.Р., Радюк С.Н., Рыжов К.А., Анджапаридзе О.Г. Эволюция методов лабораторной диагностики ортопоксвирусных инфекций. // Вопр. вирусол. 1996. -Т. 41.-№5.-С. 195-200.

5. Носик Н.Н., Стаханова В.М. Лабораторная диагностика вирусных инфекций. // Клин, микробиол. и антимикроб, химиотерап. 2000. - Т. 2. -№ 2. - С. 70-78.

6. Орешкова С.Ф. ДНК-технологии в диагностики и характеризации вирусных патогенов сельскохозяйственных животных. // Молекуляр. генетика микробиол. и вирусол. 2002. - Т. 2. - С. 3-9.

7. Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Вахитов В.А. Секвенирование ДНК. М.: Наука. -1999.-429 с.

8. Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций. // Клин, микробиол. и антимикроб, химиотерап. 2000. - Т. 2. - № 3. - С. 82-95.

9. Щелкунов С.Н., Блинов В.М., Ресенчук С.М., Денисов С.И., Тотменин А.В., Сандахчиев J1.C. Семейство анкиринподобных белков ортопоксвирусов. // Докл. РАН. 1993. - Т. 328. - С. 256-258.

10. Энциклопедический словарь «Всемирная история». Изд.: Большая Российская энциклопедия. - 2000. - 880 с.

11. Abba М.С., Golijow C.D. Herpes simplex virus genotyping: multiple optional PCR-based RFLP systems and a non-isotopic single-strand conformation polymorphism method. // J. Virol. Methods. 2004. - V. 118. - № 1. - P. 73-76.

12. Adhikary A.K., Banik U., Numaga J., Suzuki E., Inada Т., Okabe N. Heterogeneity of the fibre sequence in subgenus С adenoviruses. // J. Clin. Pathol. 2004. - V. 57. - № 6.-P. 612-617.

13. Afonso C.L., Tulman E.R., Lu Z., Zsak L., Sandybaev N.T., Kerembekova U.Z., Zaitsev V.L., Kutish G.F., Rock D.L. The genome of camelpox virus. // Virology. 2002. - V. 295.-№ l.-P. 1-9.

14. Afonso C.L., Delhon G., Tulman E.R., Lu Z., Zsak A., Becerra V.M., Zsak L., Kutish G. F., Rock D. L. Genome of deerpox virus. // J. Virol. 2005. - V. 79. - № 2. - P. 966977.

15. Ahumada-Ruiz S., Taylor-Castillo L., Visona K., Luftig R.B., Herrero-Uribe L. Determination of human cytomegalovirus genetic diversity in different patientpopulations in Costa Rica. // Rev. Inst. Med. trop. Sao Paulo. 2004. - V. 46. - № 2. -P. 87-92

16. Aitichou M., Javorschi S., Ibrahim M.S. Two-color multiplex assay for the identification of orthopox viruses with real-time LUX- PCR. // Mol. Cell. Probes. 2005. - V. 19. -№5.-P. 323-328.

17. Albuquerque D.M., Costa S.C. Genotyping of human cytomegalovirus using nonradioactive single-strand conformation polymorphism (SSCP) analysis. //

18. J. Virol. Methods. 2003. - V. 110. - № 1. - P. 25-28.

19. Alcami A., Smith G.L. Vaccinia, cowpox, and camelpox viruses encode soluble gamma interferon receptors with novel broad species specificity. // J. Virol. 1995. - V. 69. -№8.-P. 4633-4639.

20. Almazan F., Tscharke D.C., Smith G.L. The vaccinia virus superoxide dismutase-like protein (A45R) is a virion component that is nonessential for virus replication. // J. Virol. 2001. - V. 75. - № 15. - P. 7018-7029.

21. Anderson S. Shotgun DNA sequencing using cloned DNase-I generated fragments // Nucl. Acids Res. 1981. - Vol. 9. - P. 3015-3027.

22. Ansorge W., Voss H., Zimmermann J. DNA sequencing strategies. N. Y. Wiley; Spektrum. - 1996. - 202 pp.

23. Antoine G., Scheiflinger F., Domer F., Falkner F.G. The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain: comparison with other orthopoxviruses. // Virology. 1998. - V. 244. - № 2. - P. 365-396.

24. Arens M., Dilworth V. Remarkably homogeneous population of adenovirus type 3 and 7 genome types. // J. Clin. Microbiol. -1988. V. 26. - P. 1604-1608.

25. Arens M., Swierkosz. E. M. Detection of rotavirus by hybridization with a nonradioactive synthetic DNA probe and comparison with commercial enzyme immunoassays and silver-stained polyacrylamide gels. // J. Clin. Microbiol. -1989. V. 27.-P. 1277-1279.

26. Arens M. Methods for subtyping and molecular comparison of human viral genomes. // Clin. Microbiol. Rev. -1999. V. 12. - № 4. - P. 612-626.

27. Banham A.H., Smith G.L. Vaccinia virus gene B1R encodes a 34-kDa serine/threonine protein kinase that localizes in cytoplasmic factories and is packaged into virions. // Virology. -1992. V. 191. - № 2. - P. 803-812.

28. Barlow K.L., Green J., Clewley J.P. Viral genome characterisation by the heteroduplex mobility and heteroduplex tracking assays. // Rev. Med. Virol. 2000. - V. 10. - № 5. -P. 321-335.

29. Barnes W. M. PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from 1 bacteriophage templates. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1994. V. 91. - P. 2216-2220.

30. Beattie E., Tartaglia J., Paoletti E. Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon. // Virology. -1991. V. 183. - № 1. - P. 419-422.

31. Belkum A. DNA fingerprinting of medically important microorganisms by use of PCR. // Clin. Microbiol. Rev. -1994. V. 7. - № 2. - P. 174-184.

32. Bhat P.P. A comparison of genomes of sheep pox virus isolates. // Indian J. Exp. Biol. -1989. V. 27. -№ 8. - P. 714-717.

33. Bosch S., Amauld C., Jestin A. Study of full-length porcine endogenous retrovirus genomes with envelope gene polymorphism in a specific-pathogen-free Large White swine herd. // J. Virol. 2000. - V. 74. № 18. - P. 8575-8581.

34. Breault D.T., Stover ML., Li M., Lichtler A.C., Rowe D.W. Novel use for BAL31 nuclease-generated nested deletions: sequencing from the inside out // Biotechniques.1995.-V. 18.-P. 614-617.

35. Brown C.K., Turner P.C., Moyer R.W. Molecular characterization of the vaccinia virus hemagglutinin gene. // J. Virol. 1991. - V. 65. - № 7. - P. 3598-3606.

36. Buchman T.G., Roizman В., Adams G., Stover B.H. Restriction endonuclease fingerprinting of herpes simplex virus DNA: a novel epidemiological tool applied to a nosocomial outbreak. // J. Infect. Dis. 1978. - V. 138. - P. 488-498.

37. Buchman T.G., Roizman В., Nahmias A.J. Demonstration of exogenous genital reinfection with herpes simplex virus type 2 by restriction endonuclease fingerprinting of viral DNA. // J. Infect. Dis. 1979. - V. 140. - P. 295-304.

38. Cassinotti P., Mietz H., Siegl G. Suitability and clinical application of a multiplex nested PCR assay for the diagnosis of herpes simplex virus infections. // J. Med. Virol.1996. V. 50.-№ l.-P. 75-81.

39. Cassinotti P., Siegl G. A nested-PCR assay for the simultaneous amplification of HSV-1, HSV-2, and HCMV genomes in patients with presumed herpetic CNS infections. // J. Virol.Methods. -1998.-V. 71.-№ l.-P. 105-114.

40. Cheng S., Fockler C., Barnes W.M., Higuchi R. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -V. 91.-№ l.-P. 5695-5699.

41. Chou S. Acquisition of donor strains of cytomegalovirus by renal-transplant recipients. // N. Engl. J. Med. -1986. V. 314. - P. 1418-1423.

42. Church G.M., Kieffer-Hiigins S. Multiplex DNA sequencing // Science. 1988. - V. 240.-P. 47-50.

43. Coaquette A., Bourgeois A., Dirand C., Varin A., Chen W., Herbein G. Mixed cytomegalovirus glycoprotein В genotypes in immunocompromised patients. // Clin. Infect. Dis. 2004. - V. 39. - № 2. - P. 155-161.

44. Deininger P.L. Approaches to rapid DNA sequence analysis. // Anal. Biochem. 1983. -V. 135,-№2.-P. 247-263.

45. Delwart E.L., Shpaer E.G., Louwagie J., McCutchan F.E., Grez M., Rubsamen-Waigmann H., Mullins J.I. Genetic relationships determined by a DNA heteroduplex mobility assay: analysis of HIV-1 env genes. // Science. 1993. - V. 262. - P. 12571261.

46. Delwart E.L., Sheppard H.W., Walker B.D., Goudsmit J., Mullins J.I. Human immunodeficiency virus type 1 evolution in vivo tracked by DNA heteroduplex mobility assays. // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 6672-6683.

47. Delwart E. L., Pan H., Sheppard H.W., Wolpert D., Neumann A.U., Korber В., Mullins J.I. Slower evolution of human immunodeficiency virus type 1 quasispecies during progression to AIDS. // J. Virol. -1997. V. 71. - P. 7498-7508.

48. Dolan K.T., Twist E.M., Horton-Slight P., Forrer C., Bell L.M., Plotkin S.A., Clark H.F. Epidemiology of rotavirus electropherotypes determined by a simplified diagnostic technique with RNA analysis. // J. Clin. Microbiol. 1985. - V. 21. - P. 753-758.

49. Dragon A.D., Spadoro J.P., Madej R. Quality control of polymerase chain reaction. Diagnostic molecular microbiology. Principles and applications. Washington: ASM Press.-1993.-160 pp.

50. Drew W.L., Sweet E.S., Miner R.C., Mocarski E.S. Multiple infections by cytomegalovirus in patients with acquired immunodeficiency syndrome: documentation by Southern blot hybridization. // J. Infect. Dis. 1984. - V. 150. - P. 952-953.

51. Dumbell K.R., Huq F. Epidemiological implications of typing of viriola isolates. // Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 1975. - V. 69. -№ 3. - P. 303-306.

52. Dumbell K.R., Huq F. The virology of variola minor. Correlation of laboratory tests with the geographic distribution and human virulence of variola isolates. // Amer. J. Epidemiol. 1986. - V. 123. - P. 403-415.

53. Dumbell K.R, Richardson M. Virological investigations of specimens from buffaloes affected by buffalopox in Maharashtra State, India between 1985 and 1987. // Arch. Virol. 1993. - V. 128. № 3. - P. 257-267.

54. Eckert R.L. New vectors for rapid sequencing of DNA fragments by chemical degradation. // Gene. 1987. - V. 51. - P. 247-254.

55. Engelstad M., Howard S.T., Smith G.L. A constitutively expressed vaccinia gene encodes a 42-kDa glycoprotein related to complement control factors that forms part of the extracellular virus envelope. // Virology. 1992. - V. 188. -№ 2. - P. 801-810.

56. Engelstad M., Smith G.L. The vaccinia virus 42-kDa envelope protein is required for the envelopment and egress of extracellular virus and for virus virulence. // Virology. -1993. V. 194. -№ 2. - P. 627-637.

57. Esposito J.J., Obijeski J.F., Nakano J.H. Orthopoxvirus DNA: strain differentiation by electrophoresis of restriction endonuclease fragmented virion DNA. // Virology. 1978. -V. 89.-P. 53-66.

58. Esposito J.J., Knight J.C. Orthopoxvirus DNA: A comparison of restriction profiles and maps. // Virology. -1985. V. 143. -№ 1. - P. 230-251.

59. Espy M.J., Cockerill F.R., Meyer R.F., Bowen M.D., Poland G.A., Hadfield T.L., Smith T.F. Detection of smallpox virus DNA by LightCycler PCR. // J. Clin. Microbiol. -2002.-V. 40.-№6.-P. 1985-1988.

60. Fedorko D.P., Preuss J.C., Fahle G.A., Li L., Fischer S.H., Hohman, P., Cohen J.I. Comparison of methods for detection of Vaccinia virus in patient specimens. // J. Clin. Microbiol. 2005. - V. 43. - № 9. - P. 4602-4606.

61. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. // Evolution. 1985. - V. 39. - P. 783-791.

62. Felsenstein, J. PHYLIP Phylogeny inference package (Version 3.2). // Cladistics. -1989.-V.5.-P. 164-166.

63. Fenner F., Wittek R., Dumbell K.R. Orhopoxviruses. San Diego: Acad. Press Inc. -1989.-432 pp.

64. Fonseca F.G., Trindade G.S., Silva R.L., Bonjardim C.A., Ferreira P.C., Kroon E.G. Characterization of a vaccinia-like virus isolated in a Brazilian forest. // J. Gen. Virol. -2002.-V. 83.-P. 223-228.

65. Frischauf A.M., Garoff H., Lehrach H. A subcloning strategy for DNA sequence analysis. // Ibid. -1980. V. 8. - P. 5541-5549.

66. Gaggero A., Avendano L.F., Fernandez J., Spencer E. Nosocomial transmission of rotavirus from patients admitted with diarrhea. // J. Clin. Microbiol. -1992. V. 30. -P. 3294-3297.

67. Garon C.F., Barbosa E., Moss B. Visualization of an inverted terminal repetition in vaccinia virus DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - V. 75. - № 10. - P. 48634867.

68. Gharizadeh В., Ghaderi M., Donnelly D., Amini В., Wallin K.L., Nyren P. Multiple-primer DNA sequencing method. // Electrophoresis. 2003. - V. 24. - № 7. - P. 11451151.

69. Gillard S., Spehner D., Drillien R., Kirn A. Localization and sequence of a vaccinia virus gene required for multiplication in human cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1986. V. 83. -№ 15. - P. 5573-5577.

70. Goebel S.J., Johnson G.P., Perkus M.E., Davis S.W., Winslow J.P. Paoletti E. The complete DNA sequence of vaccinia virus. // Virology. 1990. - V. 179. - № 1. - P. 247-266.

71. Golijow C.D., Perez L.O., Smith J.S., Abba M.C. Human papillomavirus DNA detection and typing in male urine samples from a high-risk population from Argentina. Hi. Virol. Methods.-2005.-V. 124.-№ 1. P. 217-220.

72. Gomi Y., Sunamachi H., Mori Y., Nagaike K., Takahashi M., Yamanishi K. Comparison of the complete DNA sequences of the Oka varicella vaccine and its parental virus. // J. Virol. 2002. - V. 76. № 22. - P. 11447-114459.

73. Gray A., Guillou L., Zufferey J., Rey F., Kurt A., Jichlinski P., Leisinger H., Benhattar J. Persistence of parvovirus B19 DNA in testis of patients with testicular germ cell tumours. // J. Gen. Virol. 1998. - V. 79. - P. 573-579.

74. Gubser C., Smith G.L. The sequence of camelpox virus shows it is most closely related to variola virus, the cause of smallpox. // J. Gen. Virol. 2002. - V. 83. - № 4. - P. 855872.

75. Gubser C., Hue S., Kellam P., Smith G.L. Poxvirus genomes: a phylogenetic analysis. // J. Gen. Virol.-2004.-V. 85.-№ l.-P. 105-117.

76. Guo L.-H., Wu R. New rapid methods for DNA sequencing based on exonuclease III digestion followed by repair synthesis. // Nucl. Acids Res. 1982. - V. 10. - P. 20652084.

77. Gutierrez M.I., Ibrahim M.M., Dale J.K., Greiner T.C., Straus S.E., Bhatia K. Discrete Alterations in the BZLF1 promoter in tumor and non-tumor-associated Epstein-Barr virus. // J. Natl. Cancer Institute. 2002. - V. 94. - № 23. - P. 1757-1763.

78. Hardie D.R., Kannemeyer J., Stannard L.M. DNA single strand conformation polymorphism identifies five defined strains of hepatitis В virus (HBV) during an outbreak of HBV infection in an oncology unit. // J. Med. Virol. 1996. - V. 49. - P. 49-54.

79. Harris T.J.R., Robson K.J.H., Brown F. A study of the level of nucleotide sequence conservation between the RNAs of two serotypes of foot and mouth disease virus. // J. Gen. Virol. 1980. - V. 50. P. 403-418.

80. Hayakawa Y., Yamamoto Т., Yamanishi K., Takahashi M. Analysis of varicella-zoster virus DNAs of clinical isolates by endonuclease Hpal. // J. Gen. Virol. 1986. - V. 67. -P. 1817-1829.

81. Hayashi K. PCR-SSCP: a simple and sensitive method for detection of mutations in the genomic DNA. // Genome Res. 1991. - V. 1. - P. 34-38.

82. He R., Ruan Q., Xia C., Liu L.Q., Lu S.M., Lu Y., Qi Y., Ma Y.P., Liu Q., Ji Y.H. Sequence variability of human cytomegalovirus UL144 open reading frame in low-passage clinical isolates. // Chin. Med. Sci. J. 2004. - V. 19. -№ 4. - P. 293-297.

83. Henikojf S. Unidirectional digestion with exonuclease III in DNA sequence analysis. // Meth. Enzymol. 1987. - V. 155.-P. 156-165.

84. Her C., Weinshilboum R.M. Rapid restriction mapping by use of long PCR. // BioTechniques. 1995. - V. 19. - P. 530-532.

85. Hierholzer J.C., Barme M. Counterimmunoelectrophoresis with adenovirus type-specific anti-hemagglutinin sera as a rapid diagnostic method. // J. Immunol. 1974. -V. 112.-P. 987-995.

86. Hierholzer J.C., Wigand R., Anderson L.J., Adrian Т., Gold J.W. Analysis of antigenically intermediate strains of subgenus В and D adenoviruses from AIDS patients. // Arch. Virol. 1988a. - V. 103. - P. 99-115.

87. Hierholzer J.C., Wigand R., Anderson L.J., Adrian Т., Gold J.W. Adenoviruses from patients with AIDS: a plethora of serotypes and a description of five new serotypes of subgenus D (types43-47).//J. Infect. Dis.- 1988b.-V. 158.- P. 804-813.

88. Hierholzer J.C. Adenoviruses in the immunocompromised host. // Clin. Microbiol. Rev. -1992.-V. 5.-P. 262-274.

89. Hong G.F. The use of DNase I, buffer gradient gel, and 35S label for DNA sequencing. // Meth. Enzymol. 1987. - V. 155. - P. 93-110.

90. Hosamani M., Mondal В., Tembhurne P.A., Bandyopadhyay S.K., Singh R.K., Rasool T.J. Differentiation of sheep pox and goat poxviruses by sequence analysis and PCR-RFLP of P32 gene. // Virus Genes. 2004. - V. 29. - № 1. - P.73-80.

91. Huang E.-S., Alford C.A., Reynolds D.W., Stagno S., Pass R.F. Molecular epidemiology of cytomegalovirus infections in women and their infants. // N. Engl. J. Med. 1980. - V. 303. - P. 958-962.

92. Huang Y.P., Wang Y.M., Lan L., Fan Y. Quasispecies and mutation of hepatitis В virus polymerase gene in lamivudine- treated patients. // Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. -2003.-V. ll.-№4.-P.235-238.

93. Hudnall S.D., Chen Т., Tyring S.K. Species identification of all eight human herpesviruses with a single nested PCR assay. // J. Virol. Methods. 2004. - V. 116. -№ 1. - P. 19-26.

94. Hughes S.J., Johnston L.H., De Carlos A., Smith G.L. Vaccinia virus encodes an active thymidylate kinase that complements a cdc8 mutant of Saccharomyces cerevisiae. // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. -№ 30. - P. 20103-20109.

95. Ibrahim M.S., Esposito J.J., Jahrling P.B., Lofts R. S. The potential of 5' nuclease PCR for detecting a single-base polymorphism in orthopoxvirus. // Mol. Cell. Probes. 1997. -V. 11.-P. 143-147.

96. Ibrahim M.S., Kulesh D.A., Saleh S.S., Damon I.K., Esposito J.J., Schmaljohn A.L., Jahrling P.B. Real-time PCR assay to detect smallpox virus. // J. Clin. Microbiol. -2003. V. 41. -№ 8. - P. 3835-3839.

97. Inoshima Y., Murakami K., Yokoyama Т., Sentsui H. Genetic heterogeneity among parapoxviruses isolated from sheep, cattle and Japanese serows (Capricornis crispus). // J. Gen. Virol. 2001. - V. 82. - № 5. - P. 1215-1220.

98. Isaacs S.N., Wolffe E.J., Payne L.G., Moss B. Characterization of a vaccinia virus-encoded 42-kilodalton class I membrane glycoprotein component of the extracellular virus envelope. // J. Virol. 1992. - V. 66. - № 12. - P. 7217-7224.

99. Johansson M.E., Andersson M.A., Thorner P.A. Adenoviruses isolated in the Stockholm area during 1987-1992: restriction endonuclease analysis and molecular epidemiology. // Arch. Virol.-1994.-V. 137.-P. 101-115.

100. Jonczyk M., Borodynko N., Pospieszny H. Restriction analysis of genetic variability of Polish isolates of Tomato black ring virus. // Acta Biochimica Polonica 2004. - V. 51. -№3.-P. 673-681.

101. Kafatos F.C., Jones C.W., Efstratiadis A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. // Nucl. Acids Res. 1979. - V. 7. - P. 1541-1552.

102. Katayama Y., Shibahara K., Kohama Т., Homma M., Hotta H. Molecular epidemiology and changing distribution of genotypes of measles virus field strains in Japan. // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. - P. 2651-2653.

103. Kerr S.M., Smith G.L. Vaccinia virus encodes a polypeptide with DNA ligase activity. // Nucl. Acids Res. -1989. V. 17. - № 22. - P. 9039-9050.

104. Kilpatrick B.A., Huang E.-S., Pagano J.S. Analysis of cytomegalovirus genomes with restriction endonucleases Hindlll and EcoRI. // J. Virol. 1976. - V. 18. - P. 10951105.

105. Kim T.J., Schnitzlein W.M., McAloose D., Pessier A.P., Tripathy D.N. Characterization of an avianpox virus isolated from an Andean condor (Vultur gryphus). // Vet. Microbiol. 2003. - V. 96. № 3. - P. 237-246.

106. Klein J., Tryland M. Characterisation of parapoxviruses isolated from Norwegian semi-domesticated reindeer (Rangifer tarandus tarandus). // Virol. J. 2005. - V. 2. - P. 7980.

107. Kotwal G.J., Moss B. Vaccinia virus encodes a secretory polypeptide structurally related to complement control proteins. // Nature. 1988. - V.335. - № 6186. - P. 176-178.

108. Kotwal G.J., Moss B. Vaccinia virus encodes two proteins that are structurally related to members of the plasma serine protease inhibitor superfamily. // J. Virol. -1989. V. 63. -P. 600-606.

109. Kovacs G.R., Vasilakis N., Moss B. Regulation of viral intermediate gene expression by the vaccinia virus B1 protein kinase. // J. Virol. 2001. - V. 75. - № 9. - P. 4048-4055.

110. Kuan M.M. Detection and rapid differentiation of human enteroviruses following genomic amplification. // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. - P. 2598-2601.

111. Laassri M., Chizhikov V., Mikheev M., Shchelkunov S., Chumakov K. Detection and discrimination of orthopoxviruses using microarrays of immobilized oligonucleotides. // J. Virol. Methods 2003. - V. 112. - P. 67-78.

112. Lagerstrom M., Parik J., Malmgren H., Stewart J. Petterson U., Landegren V. Capture PCR: Efficient amplification of DNA fragments adjacent to a known sequence in human and YAC DNA. // PCR Meth. Appl. 1991. - V. 1. - P. 111-119.

113. Lareu R.R., Swanson N.R., Fox S.A. Rapid and sensitive genotyping of hepatitis С virus by single-strand conformation polymorphism. // J. Virol. Methods 1997. - V. 64. - P. 11-18.

114. Law K.M., Smith G.L. A vaccinia serine protease inhibitor which prevents virus-induced cell fusion. // J. Gen. Virol. 1992. -V. 73. -№ 3. - P. 549-557.

115. LeDuc J.W., Damon I., Meegan J.M., Relman D.A., Huggins J., Jahrling P.B. Smallpox research activities: U.S. interagency collaboration. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - V. 8. - № 7. - P. 743-745.

116. Lee Y.F., Wimmer E. Fingerprinting high molecular weight RNA by two-dimensional electrophoresis: application to poliovirus RNA. // Nucl. Acids Res. -1976. V. 3. - P. 1647-1658.

117. Lee J. A., Kim N.H., Kim S.J., Choi E.H., Lee H.J. Rapid identification of human adenovirus types 3 and 7 from respiratory specimens via multiplex type-specific PCR. // J. Clin. Microbiol. 2005. - V. 43. - № 11. - P. 5509-5514.

118. Li Q., Zheng Q., Liu Y., Wadell G. Molecular epidemiology of adenovirus types 3 and 7 isolated from children with pneumonia in Beijing. // J. Med. Virol. 1996. - V. 49. - P. 170-177.

119. Likos A.M., Sammons S.A., Olson V.A., Frace A.M., Li Y., Olsen-Rasmussen M., Davidson W., Galloway R., Khristova M.L., Reynolds M.G., Zhao H., Carroll D.S.,

120. Curns A., Formenty P., Esposito J.J., Regnery R.L., Damon I.K. A tale of two clades: monkeypox viruses. // J. Gen. Virol. 2005. - V. 86. - № 10. - P. 2661-2672.

121. Lin S., Chen W., Broyles S.S. The vaccinia virus B1R gene product is a serine/threonine protein kinase. // J. Virol. 1992. - V. 66. -№ 5. - P. 2717- 2723.

122. Lin J.C., De B.K., Lin S.C. Rapid and sensitive genotyping of Epstein-Barr virus using single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. // J. Virol. Methods. -1993. V. 43. - № 2. - P. 233-246.

123. Lin J.C., Lin S.C., Mar E.C. A strategy for precision of genotyping of Epstein-Barr virus by polymerase chain reaction: application for studying Hodgkin's lymphoma. // Leuk. Lymphoma. 1994. - V. 15. -№ 5. - P. 389-397.

124. Lin S.F., Robinson D.R., Miller G., Kung H.J. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. // J. Virol.1999. V. 73. - № 3. - P. 1909-1917.

125. Loparev V.N., Massung R.F., Esposito J.J., Meyer H. Detection and differentiation of old world orthopoxviruses: restriction fragment length polymorphism of the crmB gene region. // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. - № 1. - P. 94-100.

126. Luschow D., Hoffmann Т., Hafez H.M. Differentiation of avian poxvirus strains of on the bases nucleotide sequences of 4b gene fragment. // Avian Dis. 2004. - V. 48. - № 3.-P. 453-462.

127. Mackett M., Archard L.C. Conservation and variation in orthopoxvirus genome structure. // J.Gen.Virol. 1979. - V. 45. - № 3. - P. 683-701.

128. Mantero G., Zonaro A., Albertini A., Bertolo P., Primi D. DNA enzyme immunoassay: general method for detecting products of polymerase chain reaction. // Clin. Chem.1991. V. 37. - № 3. - P. 422-429.

129. Manuilov V.A., Netesova I.G., Osipova L.P., Shustov A.V., Baiandin R.B., Kochneva G.V., Netesov S.V. Genetic variability of hepatitis В virus isolates among population of

130. Shuryskarsky area of Yamal-Nenets autonomous region. // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 2005. - V. 4. - P. 30-34.

131. Massung R.F., Liu L.I., Qi J., Knight J.C., Yuran Т.Е., Kerlavage A.R., Parsons J.M., Venter J.C., Esposito J.J. Analysis of the complete genome of smallpox variola major virus strain Bangladesh-1975. // Virology. 1994. - V. 201. - № 2. - P. 215-240.

132. Massung R.F., Loparev V.N., Knight J.C., Totmenin A.V., Chizhikov V.E., Parsons J.M., Safronov P.F., Gutorov V.V., Shchelkunov S.N., Esposito J.J. Terminal region sequence variations in variola virus DNA. // Virology. -1996. V. 221. - P. 291-300.

133. Maxam A.M., Gilbert W. A new method for sequencing DNA // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977. - V. 74. - P. 560-564.

134. McGeoch D.J. Protein sequence comparisons show that 'pseudoproteases' encoded by the poxviruses and certain retroviruses belong to the deoxyuridine triphosphatase family. // Nucl. Acids Res. -1990. V. 18. - P. 4105-4110.

135. McNearney Т., Hornickova Z., Markham R., Birdwell A., Arens M., Saah A., Ratner L. Relationship of human immunodeficiency virus type 1 sequence heterogeneity to stage of disease. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992. V. 89. - P. 10247-10251.

136. Melo A. A, Roa E.I., Montenegro H.S., Capurro V.I., Roa S.J.C. Detection of human papilloma virus in cytologic samples or biopsies of the cervix. // Rev. Med. Chil. -2005. V. 133. - № 6. - P. 639-644.

137. Messing J., Crea R., Seeburg P.H. A system for shotgun DNA sequencing. // Nucl. Acids Res. 1981. - V. 9. - P. 309-321.

138. Meyer H., Ropp S.L., Esposito J.J. Gene for A-type inclusion body protein is useful for a polymerase chain reaction assay to differentiate orthopoxviruses. // J. Virol. Methods. 1997.-V. 64.-P. 217-221.

139. Mishra S.S., Mallick B.B. Comparative immunological and genomic characterization of fowlpox virus isolates. // Indian J. Exp. Biol. 1996a. - V. 34. - № 1. - P. 11-17.

140. Mishra S.S., Mallick B.B. Restriction fragment analysis of fowlpox virus using Bgll, BamHI, Hhal and Smal restriction endonucleases. // Indian J. Exp. Biol. 1996b. - V. 34. -№10. -P. 959-963.

141. Morgan J.R., Roberts B.E. Organization of RNA transcripts from a vaccinia virus early gene cluster. // J. Virol. 1984. - V. 51. - № 2. - P. 283-297.

142. Moussatche M., Tuyama M., Kato S.E.M., Castro A.P.V., Njaine В., Peralta R.H., Peralta J.M., Damaso C.R.A., Barroso P.F. Accidental infection of laboratory worker with vaccinia virus. // Emerg. Infect. Dis. 2003. - V. 9. - № 6 - P. 724-726.

143. Mukinda V.B., Mwema G., Kilundu M., Heymann D.L., Khan A.S., Esposito J.J. Re-emergence of human monkeypox in Zaire in 1996. Monkeypox epidemiologic working group. // Lancet. 1997. - V. 349. - № 9063. - P. 1449-1450.

144. Mullis K.B., Faloona F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. // Methods Enzymol. 1987. - V. 155. - P. 335-350.

145. Myers R.M., Larin Z., Maniatis T. Detection of single base substitutions by ribonuclease cleavage at mismatches in RNA:DNA duplexes. // Science. 1985. - V. 230. - P. 12421246.

146. Nazzari C., Gaeta A., Lazzarini M., Castelli T.D., Mancini C. Multiplex polymerase chain reaction for the evaluation of cytomegalovirus DNA load in organ transplant recipients. // J. Med. Virol. 2000. - V. 61. - № 2. - P. 251-258.

147. Nelson J.A.E., Fiscus S.A., Swanstrom R. Evolutionary variants of the human immunodeficiency virus type 1 V3 region characterized by using a heteroduplex tracking assay. // J. Virol. -1997. V. 71. - P. 8750-8758.

148. Neubauer H., Pfeffer M., Meyer H. Specific detection of mousepox virus by polymerase chain reaction. // Lab. Anim. 1997. - V. 31. - № 3. - P. 201-205.

149. Neubauer H., Reischl U., Ropp S., Esposito J.J., Wolf H.,Meyer H. Specific detection of monkeypox virus by polymerase chain reaction. // J. Virol. Methods. 1998. - V. 74. -№2.-P. 201-207.

150. Newton C.R., Graham A. PCR. Oxford: Bios Scientific Publishers. - 1996. - P. 18-19.

151. Nitsche A., Ellerbrok H., Pauli G. Detection of orthopoxvirus DNA by real-time PCR and identification of variola virus DNA by melting analysis // J. Clin. Microbiol. 2004. - V. 42. -№ 3. - P. 1207-1213.

152. Nitsche A., Steger В., Ellerbrok H., Pauli G. Detection of vaccinia virus DNA on the LightCycler by fluorescence melting curve analysis. // J. Virol. Methods. 2005. - V. 126.-P. 187-195.

153. Nottay B.K., Kew O.M., Hatch M.H., Heyward J.T., Obijeski J.F. Molecular variation of type 1 vaccine-related and wild polioviruses during replication in humans. // Virology. 1981. - V. 108. - P. 405-423.

154. Okamoto H., Nishizawa Т., Takahashi M., Asabe S., Tsuda F., Yoshikawa A. Heterogeneous distribution of TT virus of distinct genotypes in multiple tissues from infected humans. // Virology. 2001. - V. 288. - № 2. - P. 358-368.

155. Ong H.T., Duraisamy G., Kee P.N., Wen S.T, Seow H.F. Genotyping of hepatitis В virus in Malaysia based on the nucleotide sequence of preS and S genes. // Microbes Infect. 2005. - V. 7. - № 3. - P. 494-500.

156. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Hayashi K., Sekiya T. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 2766-2770.

157. Panning M., Asper M., Kramme S., Schmitz H., Drosten C. Rapid detection and differentiation of human pathogenic orthopox viruses by a fluorescence resonance energy transfer real-time PCR assay. // Clin. Chem. 2004. - V. 50. - № 4. - P. 702708.

158. Paula V.S., Saback F.L, Gaspar A.M., Niel C. Mixed infection of a child care provider with hepatitis A virus isolates from subgenotypes IA and IB revealed by heteroduplex mobility assay. // J. Virol. Methods. 2003. - V. 107. - № 2. - P. 223-228.

159. Persing D.H, Cimino G.D. Amplification product inactivation methods. Diagnostic molecular microbiology. Principles and applications. Washington: ASM Press. -1993.-105 pp.

160. Pfeffer M., Meyer H., Wernery U., Kaaden O.R. Comparison of camelpox viruses isolated in Dubai. // Vet. Microbiol. 1996. - V. 49. - № 1-2. - P. 135-146.

161. Pogam S.L., Dubois F., Christen R., Raby C., Cavicchini A., Goudeau A. Comparison of DNA enzyme immunoassay and line probe assays (Inno-LiPA HCV I and II) for hepatitis С virus genotyping. // J. Clin. Microbiol. -1998. V. 36. - P. 1461-1463.

162. Psikal I., Smid В., Rodak L., Valicek L. Bendova J. Atypical myxomatosis virus isolation, experimental infection of rabbits and restriction endonuclease analysis of the isolate. // J. Vet. Med. - 2003. - V. 50. - P. 259-264.

163. Pulford D.J., Meyer H., Ulaeto D. Orthologs of the vaccinia A13L and A36R virion membrane protein genes display diversity in species of the genus orthopoxvirus. // Arch. Virol. 2002. - V. 147. - № 5. - P. 995-1015.

164. Pulford D., Meyer H., Brightwell G., Damon I., Kline R. Ulaeto D. Amplification refractory mutation system PCR assays for the detection of variola and Orthopoxvirus. // J. Virol. Methods. 2004. - V. 117. - № 1. - P. 81-90.

165. Rempel R.E., Traktman P. Vaccinia virus B1 kinase: phenotypic analysis of temperature-sensitive mutants and enzymatic characterization of recombinant proteins. // J. Virol. 1992. - V. 66. - № 7. - P. 4413-4426.

166. Rickinson A.B., Kieff E. Epstein-Barr virus. In Fields В., Knipe D., and Howley P. (ed.) Fields virology, 3rd ed. - V. 2. - Philadelphia, PA.: Lippincott-Raven. - 1996. -P. 2397-2446.

167. Robinson A. J., Mercer A. A. Parapoxvirus of red deer: evidence for its inclusion as a new member in the genus parapoxvirus. // Virology. 1995. - V. 208. - № 2. - P. 812815.

168. Ropp S.L., Jin Q., Knight J.C., Massung R.F., Esposito J.J. PCR strategy for identification and differentiation of smallpox and other orthopoxviruses. // J. Clin. Microbiol. -1995. V. 33. - P. 2069-2076.

169. Ruther U„ Koenen M., Otto K., Mailer-Hill B. pUR222, a vector for cloning and rapid chemical sequencing of DNA. // Ibid. 1981. - V. 9. - P. 4087-4098.

170. Saint K.M., French N., Kerr P. Genetic variation in Australian isolates of myxoma virus: an evolutionary and epidemiological study. // Arch. Virol. 2001. - V. 146. - P. 11051123.

171. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. // Mol. Biol. Evol. 1987. - V. 4. - P. 406-425.

172. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning: A laboratory manual, the third edition. -NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001. - 545 pp.

173. Sample J., Young L., Martin В., Chatman Т., Kieff E., Rickinson A. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. // J. Virol. -1990.-V. 64.-P. 4084-4092.

174. Sanchez-Pescador R., Urdea M.S. Use of unpurified synthetic deoxynucleotide primers for rapid dideoxynucleotide chain termination sequencing. // DNA. 1984. - V. 4. - P. 339-343.

175. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Ibid. 1977. - V. 74. - P. 5463-5467.

176. Schwarz D.A., Katayama C.D., Hedrick S.M. Schlafen, a new family of growth regulatory genes that affect thymocyte development. // Immunity. 1998. - V. 9. - № 5. -P. 657-668.

177. Seki M., Oie M., Ichihashi Y., Shida H. Hemadsorption and fusion inhibition activities of hemagglutinin analyzed by vaccinia virus mutants. // Virology. 1990. - V. 175. -№ 2.-P. 372-384.

178. Seregin S.V., Babkina I.N., Nesterov A.E., Sinyakov A.N., Shchelkunov S.N. Comparative studies of gamma-interferon receptor-like proteins of variola major and variola minor viruses // FEBS Lett. 1996. - V.382. - № 1-2. - P. 79-83.

179. Shchelkunov S.N., Resenchuk S.M., Totmenin A.V., Blinov V.M., Marennikova S.S., Sandakhchiev L.S. Comparison of the genetic maps of variola and vaccinia viruses. // FEBS Lett. 1993. - V. 327. - P. 321-324.

180. Shchelkunov S.N. Functional organization of variola major and vaccinia virus genomes. //VirusGenes.-1995.-V. 10.-№ l.-P.53-71.

181. Shchelkunov S.N., Massung R.F., Esposito J.J. Comparison of the genome DNA sequences of Bangladesh-1975 and India-1967 variola viruses. // Virus Res. 1995. -V. 36.-P. 107-118.

182. Shchelkunov S.N., Totmenin A.V., Loparev V.N., Safronov P.F., Gutorov V.V., Chizhikov V.E., Knight J.C., Parsons J.M., Massung R.F., Esposito J.J. Alastrim smallpox variola minor virus genome DNA sequences. // Virology. 2000. - V. 266. -P. 361-386.

183. Shchelkunov S.N., Marennikova S.S., Moyer R.W. Orthopoxviruses pathogenic for humans. Springer Science & Business Media, Inc. - 2005. - 425 pp.

184. Shida H. Nucleotide sequence of the vaccinia virus hemagglutinin gene. // Virology. -1986.-V. 150.-№2.-P. 451-462.

185. Shivaprasad H.L., Kim T.J., Woolcock P.R., Tripathy D.N. Genetic and antigenic characterization of a poxvirus isolate from ostriches. // Avian Dis. 2002. - V. 46. - № 2.-P. 429-436.

186. Sitki-Green D., Edwards R.H., Webster-Cyriaque J., Raab-Traub N. Identification of Epstein-Barr virus strain variants in hairy leukoplakia and the peripheral blood by use of a heteroduplex tracking assay. // J. Virol. 2002. - V. 76. - P. 9645-9656.

187. Sitki-Green D.L., Edwards R.H., Covington M.M., Raab-Traub N. Biology of Epstein-Barr virus during infectious mononucleosis. // J. Infect. Dis. 2004. - V. 189. - № 3. -P. 483-492.

188. Smith G.L., de Carlos A., Chan Y.S. Vaccinia virus encodes a thymidylate kinase gene: Sequence and transcriptional mapping. // Nucl. Acids Res. 1989a. - V. 17. - № 19. -P. 7581-7590.

189. Smith G.L., Chan Y.S., Kerr S.M. Transcriptional mapping and nucleotide sequence of a vaccinia virus gene encoding a polypeptide with extensive homology to DNA ligases. // Nucl. Acids Res. 1989b. - V.l 7. - № 22. - P. 9051-9062.

190. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. //J. Mol. Biol. 1975. - V. 98. - P. 503-517.

191. Spector S.A., Spector D.H. Molecular epidemiology of cytomegalovirus infections in premature twin infants and their mother. // Pediatr. Infect. Dis. 1982. - V. 1. - P. 405409.

192. Spector S.A., Hirata К. K., Neuman T. R. Identification of multiple cytomegalovirus strains in homosexual men with acquired immunodeficiency syndrome. // J. Infect. Dis. 1984.-V. 150.-P. 953-955.

193. Steele A. D. Shift in genomic RNA patterns of human rotaviruses isolated from white children in South Africa. // SAMJ. -1991. V. 79. - P. 143-145.

194. Stemmler M., Neubauer H., Meyer H. Comparison of closely related orthopoxvirus isolates by random amplifed polymorphic DNA and restriction fragment length polymorphism analysis. // J. Vet. Med. 2001. - V. 48. - P. 647-654.

195. Steyer A., Poljsak-Prijatelj M., Barlic-Maganja D., Bufon Т., Marin J. The emergence of rotavirus genotype G9 in hospitalised children in Slovenia. // J. Clin. Virol. 2005. - V. 33.-№ l.-P. 7-11.

196. Stoflet E.S., Koeberl D.D., Sarkar G., Sommer S.S. Genomic amplification with transcript sequencing. // Science. 1988. - V. 239. - P. 491-494.

197. Storch G.A., Park C. S., Dohner D.E. RNA fingerprinting of respiratory syncytial virus using ribonuclease protection. // J. Clin. Investig. 1989. - V. 83. - P. 1894-1902.

198. Strauss E.C., Kobori J.A., Siu G., Hood L.E. Specific-directed DNA sequencing. // Anal. Biochem. -1986. V. 154. - P. 353-360.

199. Tadese Т., Reed W.M. Use of restriction fragment length polymorphism, immunoblotting, and polymerase chain reaction in the differentiation of avian poxviruses. // J. Vet. Diagn. Invest. 2003. - V. 15. - № 2. - P. 141-150.

200. Takada M., Suzutani Т., Yoshida I., Matoba M., Azuma M. Identification of varicella-zoster virus strains by PCR analysis of three repeat elements and a Pstl-site-less region. // J. Clin. Microbiol. -1995. V. 33. - P. 658-660.

201. Takayama M., Takayama N., Kameoka Y., Hachimori K., Kaneda K., Minamitani K. Comparative restriction endonuclease analysis of varicella-zoster virus clinical isolates. // Med. Microbiol. Immunol. 1989. - V. 178. - P. 61-67.

202. Takayama M., Takayama N., Inoue N., Kameoka Y. Application of long PCR method to identification of variations in nucleotide sequences among varicella-zoster virus isolate. // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34. - № 12. - P. 2869-2874.

203. Takehisa J., Zekeng L., Ido E., Mboudjeka I., Moriyama H., Miura Т., Yamashita M., Gurtler L.G., Hayami M., Kaptue L. Various types of HIV mixed infections in Cameroon. // Virology. 1998. - V. 245. - P. 1-10.

204. Tanaka Т., Kuroda K., Kobayashi M., Sato K. Detection and typing of TT virus DNA genotype by the PCR-RFLP method. // Mol. Cell. Probes. 2001. - V. 15. - № 4. - P. 195-200.

205. Thiel Т., Whiteman N.K., Tirape A., Baquero M.I., Cedeno V., Walsh Т., Uzcategui G.J., Parker P.G. Characterization of canarypox-like viruses infecting endemic birds in the Galapagos Islands. // Vet. Pathol. 2005. - V. 42. -№ 1. - P. 59-65.

206. Trincado D.E., Scott G.M., White P.A., Hunt C., Rasmussen L., Rawlinson W.D. Human cytomegalovirus strains associated with congenital and perinatal infections. // J. Med. Virol. 2000. - V. 61. - № 4. - P. 481-487.

207. Tripathy D.N., Schnitzlein W.M., Morris P.J., Janssen D.L., Zuba J.K., Massey G., Atkinson C.T. Characterization of poxviruses from forest birds in Hawaii. // J. Wildl. Dis. 2000. - V. 36. - № 2. - P. 225-230.

208. Tulman E.R., Afonso C.L., Lu Z., Zsak L., Sur J.-H., Sandybaev N.T., Kerembekova U.Z., Zaitsev V.L., Kutish G.F., Rock D.L. The genomes of sheeppox and goatpox viruses. // J. Virol. 2002. - V. 76. - № 12. - P. 6054-6061.

209. Tuveri R., Rothschild C., Pol S., Reijasse D., Persico Т., Gazengel C., Brechot C., Thiers V. Hepatitis С virus genotypes in haemophiliacs kinetics and reappraisal of mixed infections. // J. Med. Virol. 1997. - V. 51. - P. 36-41.

210. Volckaert G. A systematic approach to chemical DNA sequencing by sybcloning in pGV451 and derived vectors. // Meth. Enzymol. 1987. - V. 155. P. 231-250.

211. Wachter R., Fiers W. Preparative two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of 32P-labeled RNA. // Anal. Biochem. -1972. -V. 49. P. 184-197.

212. Wadell G. Molecular epidemiology of human adenoviruses. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1984. - V.110.-P.191 -220.

213. Wallace R.B., Shaffer J., Murphy R.F., Bonner J., Hirose Т., Itakura K. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch. // Nucl. Acids Res. 1979. - V. 6. - № 11. - P. 3543-3557.

214. Walls D., Perricaudet M. Novel downstream elements upregulate transcription initiated from an Epstein-Barr virus latent promoter. // EMBO J. -1991. V. 10. - № 1. - P. 143-151.

215. Wang Y.-H., Griffith J. Effects of bulge composition and flanking sequence on the kinking of DNA by bulged bases. // Biochemistry. -1991. V. 30. - P. 1358-1363.

216. Watson J.D. The double helix. London: W.W. Norton & Co. - 1968. - 298 pp.

217. Weismanova E., Weismann P., Vizvaryova M., Lehotska V., Krizanova O., Repiska V., Kausitz J. New approach to human high-risk papillomavirus (HR-HPV) genotyping. // Neoplasma. 2002. - V. 49. - № 4. - P. 217-224.

218. Weli S.C., Okeke M.I., Tryland M., Nilssen 0., Traavik T. Characterization of avipoxviruses from wild birds in Norway. // Canadian J. Vet. Res. 2004. - V. 68. - P. 140-145.

219. Wenli M., Yan W., Hongmin W., Wenling Z. An oligonucleotide microarray for the detection of vaccinia virus. // Br. J. Biomed. Sci. 2004. - V. 61. - № 3. - P. 142-145.

220. White P.A., Li Z., Zhai X., Marinos G., Rawlinson W.D. Mixed viral infection identified using heteroduplex mobility analysis (HMA). // Virology. 2000. - V. 271. -№2.-P. 382-389.

221. WHO. Report of the fourth meeting of the Committee on orthopoxvirus infections. -Geneva. -1986.

222. WHO. The global eradication of smallpox. Final report of the Global Commission for the certification of smallpox eradication. Geneva. -1980.

223. Wigand R., Adrian T. A rational system for classifying and denominating adenovirus genome types. // Virus Res. 1991. - V. 142. - P. 47-56.

224. Wittek R., Menna A., Schumperli D., Stoffel S., Muller H.K., Wyler R. Hindlll and SstI restriction sites mapped on rabbit poxvirus and vaccinia virus DNA. // J. Virol. 1977. -V. 23.-№ 3.-P. 669-678.

225. Wu J.C., Huang I.A., Huang Y.H., Chen J. Y., Sheen I.J. Mixed genotypes infection with hepatitis D virus. // J. Med. Virol. 1999. - V. 57. - P. 64-67.

226. Xue F., Cooley L. Kelch encodes a component of intercellular bridges in Drosophila egg chambers. // Cell. 1993. - V. 72. -№ 5. - P. 681-693.

227. Young J.F., Desselberger U., Palese P. Evolution of human influenza A viruses in nature: sequential mutations in the genomes of new H1N1 isolates. // Cell. 1979. - V. 18.-P. 73-83.

228. Zingg W., Bossart W., Berli E., Nadal D. Detection and quantification of cell-free Epstein-Barr vims by polymerase chain reaction and subsequent DNA enzyme immunoassay. // J. Virol. Methods. 1999. - V. 79. - № 2. - P. 141-148.

229. Zou S. A practical approach to genetic screening for influenza virus variants. // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. - P. 2623-2627.

Информация о работе

Бабкина, Ирина Николаевна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Сравнительный анализ и консервация геномов штаммов вируса натуральной оспы из российской коллекции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы