Сравнительные динамические аспекты биологической активности гормонов по данным ЯМР-релаксометрии in vitro

Орлова, Елена Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительные динамические аспекты биологической активности гормонов по данным ЯМР-релаксометрии in vitro
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительные динамические аспекты биологической активности гормонов по данным ЯМР-релаксометрии in vitro"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О.В.ПАЛЛАДІНА

Р Г Б ОД

На правах рукопису

ОРЛОВА Олена Анатоліївна

ПОРІВНЯЛЬНІ ДИНАМІЧНІ АСПЕКТИ БІОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ ГОРМОНІВ ЗА ДАНИМИ ЯМР-РЕЛАКСОМЕТРІЇ IN VITRO

03.00.04 - Біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ-1996

Дисертацією с рукопис.

Робота виконана в Науково-Дослідному центрі Луганського державного медичного університету.

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор

КОМАРЄВЦЕВА Ірина Олександрівна

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

ВОЙЦІЦЬКИЙ Володимир Михайлович

доктор медичних наук , .

старший науковий співробітник ЛУЧИЦЬКИЙ Євгеній Васильович

Провідна організація:

Український національний медичний університет ім. акад. О.О. Богомольця, м.Київ

Захист відбудеться " “/<1 ” 1996р.на

засіданні спеціалізовано? вченоі’ради Д 01.84.01 гі$и Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (252 601 м.Киів-30, вул. Леош-о^рча,9 )

о '{4'"'_________________________

З дисертацією можна ознайомиться у бібліотеці Інституту біохіміі ім. О.В.Палладіна. , * ? ,

Автореферат розісланий " /& " ''/{СЇ'шЛ/і Я' 1996р.

Вчений секретар спеціалізованої ради

к.б.н. О.В.Кірсенко

Актуальність проблеми.

Під час еволюціГ сформувалися дні основні системи, які виконують функцію міжклітинної комунікацій нервова, яка розглядається, як система проведення сигналів , та гормональна, яка використовує у якості мобільних посередників гормони, котрі секретуються специфічними клітинами і потім транспортуються, впливаючи на прилеглі чи віддалені тканини (Breyer M.D., 1994).

Одним з актуальних та інтригуючих питань суч..: юі біохімії є питання про те, як гормональний сигнал, адресован»-.,; клітинній мембрані, трансформується у ланшог подій, що несуть цю інформацію до клітини.

Принцип генералізованої реакціГ мембрани на гормон і є основою специфічності гормонально? діГ з тієГ думки, що поодинокі молекули гормону, завдяки послідовному посиленню цього сигналу та розповсюдженню його післядії', викликають зміни у ряді ефекторних систем клітини. Ймовірно, в основі впливу багатьох гормонів лежать генералізовані структурні переходи, що змінюють білкові, ліпідні, вуглеводні та інші компоненти плазматичної' мембрани. В цьому плані особливий інтерес викликає середовище протікання всіх метаболічних процесів організму - вода та водні компартменти організму.

Вода гідратаціі'впливае на структурне формування мембран

і являється безпосереднім середовищем всіх мембранних процесів. Припускають, що оборотна зміна структури води в мембранах супроводжується конформаційними змінами білка та розташуванням полярних ліпідів (Garrido L., 1994). Дія гормонів, певно, здійснюється шляхом впливу на структуру зв'язаноі з мембраною води, що й визначає"х генералізований системний ефект на кліти-

ну-мішень.

Зміну фізико-хімічних властивостей тканинної води відображує ядерно-магнітно-резонансна релаксація. Внаслідок прогонного обміну між гідрованою та свободною фракціями тканинної води змінюються часи релаксаціГ. їх величина залежить від загальної“ кількості води в тканинах та здібності зв'язувати воду в гідрований шар (ТІ), а також від концентрації місць зв'язування кристаличноГ води й товщини мультислою гідрованої' води (Broks D., 1994).

Таким чином, вивчення гідроосмотичних ефектів гормонів методом ЯМР-релаксаціГ протонів тканинної води відкриває шлях до розуміння біохімічних механізмів іх дії на структурно-конформаційному рівні.

Робота виконана в межах конкурсной держбюджетноЧ теми М3 України К 1/7.21.12.94 "Ендогенні опіоіди та гуморальне звено функціональної адаптації нирок в регуляції артеріального тиску та водно-електролітного балансу при есенціальній гіпертензії й ниркової патології”, а також планової держбюджетної тематики НДЦ ЛДМУ "Вплив екологічно небезпечних факторів на організм в умовах промислового регіону та розробка методів корекції метаболізму й інтенсивної терапії" (регістраційний номер 01.0.10.033409).

Мета роботи.

Вивчити вплив пепгидних та стероїдних гормонів на ЯМР-релаксацію протонів тканинно’ї води, фракційний склад водних компартментів, їх внутрішньо - та позаклітинне розміщення.

Відповідно до поставленої мети завданням роботи було:

1. Провести порівняльний аналіз гідроосмотичної активності пептидних та стероїдних гормонів методом ЯМР-релаксаціГ

протонів тканинної води.

2. На основі біекспоненціальних характеристик ЯМР-показників тканинної води вивчити іГ фракційний склад , внутрішньо- та позаклітинний розподіл у тканинах-мішенях (мозку, нирках) під вливом пептидних та стероїдних гормонів.

3. Враховуючи відомі механізми дії гормонів, що досліджувалися, визначити роль гканинноі води в гормонокомпетентності клітини як регуляторноГ та ефекторноГ системи.

4. Визначити найбільш ЯМР-релаксаційно активні гормони, які можуть бути використані для практичного вживання, як контрастні агенти в ЯМР-томографіГ.

Наукова новизна роботи.

Вперше проведено дослідження впливу біологічно-активних речовин як центрального походження ( АКТГ, про-лактин, вазопресин ), так і проміжних рівнів (паратгормон, каль-цитонін, альдостерон, прогестерон, тестостерон) на транспорт тканинноГ води нирок та мозку щурів методом ЯМР-релаксометріГ з урахуванням маси відповідних органів. Визначено характер гідроосмотичного ефекту гормонів на тканинному рівні (нирки, мозок) відповідно до природи ( білково - пептидно! та стероїдної).

Вперше встановлено співвідношення внутрішньо-' та міжклітинної" води мозку, нирок як в умовах фізіологічного спокою, так і під впливом біологічно-активних речовин. Виміряні ТІ- та Т2- показники релаксаціГ протонів тканинної води мозку і нирок щурів після інкубації з гормонами у різних концентраціях, які відобразили молекулярно-структурну різноманітність фракційного складу тканинної ріднини. Виявлено значення концентрацій гормонів, при яких спостерігався максимальний гідроосмотич-

ний ефект.

Вперше сформульовано положення про ефехторну та регуляторну роль тканинної' води в реалізації гормонального стимулу, який забезпечу« генералізацію гормоноіндукуемих процесів у клітинній мембрані, що дозволяє пояснити механізм розпізну-вання, посилення, реалізації”та потенціювання діГгормонів, який фактично полягає у створенні- та порушенні' водної' структури. Отримані різноспрямовані результати гідроосмотичноГ активності пептидних та стероїдних гормонів відображують іх різний вплив на фізіко-хімічні властивості тканинно? води.

Практичне значення роботи.

Розроблений метод вивчення гідроосмотичних ефектів біологічно-активних речовин у нирках та мозку за магнітно-релаксаційними параметрами з урахуванням маси тканини, який поєднує в собі точність і високу ефективність з простотою відтворення, дозволяє проводити дослідження швидко та з невеликою кількістю тканини і може бути застосований для вивчення водного транспорту не тільки у нирках та мозку, айв інших тканинах.

Виявлений гідроосмотичний ефект ряду гормонів дозволяє рекомендувати їх для використання , як природні контрастні агенти в ЯМР-діагностиці. Результати про фракційний склад тканинної води, ІГ внутрішньо- та міжклітинне співвідношення в умовах діГ біологічно активних речовин на ізольовані біопрепа-

• • . і X < •

рати с важливими для пояснення механізмів ЯМР-контрастів та'Іх залежності від конкретно" патології.

Розроблений методичний підхід вимірювання часу протонної" рел аксації" с перспективним для вивчення структурного стану води в тканинах in vivo під час гормональної патологіГ.

Отримані дані можуть бути використані в ЯМР-центрах УкраГни, зокрема у м.Луганську.

Основні положення, які виносяться на захист:

1. Вивчені пептидні та стероїдні гормони мають гідроосмо-тичну та ЯМР-релаксаційну активність, пов'язану зі специфічною фракційною гетерогенністю тканинноГводи в тканинах-мішенях.

2. Пептидні гормони (вазопресин, опіати, пролактин, АКТГ,ПТГ,кальцитонін) дозозалежно викликають дегідратацію тканини, тоді як стероїдні (у фізіологічних дозах) - гідрать ; зо, що обумовлено їх амфіфільною селективністю і різноманітна : ступенем полярізації води, які пов'язані з їх хімічною структурою та механізмом пострецепторного впливу.

3. Здатність гормонів як зменшувати, так і підвищувати час релаксації, змінювати гідратацію тканин, впливати на стан не тільки внутрішньоклітинноҐ. але й міжклітинної води, розподіляти окремі фракції тканинної води між клітиною і позаклітинним простором, а головне - їх тканинна специфічність і селективність дозволяють розглядати гідроосмотично активні гормони як самостійні контрастні агенти для ЯМР-томографіГабо як носіїдля традиційних парамагнетиків.

Апробація роботи.

Окремі фрагменти дисертації* повідомлені на І з'їзді Українського біофізичного товариства (КиТв, 1994), науково-практичній конференції "Екологія Донбасу" (м.Луганськ, 1993).

Структура та обсяг дисертації.

і '

Дисертація викладена на 180 стор. машинопису, складається з вступу, аналітичного огляду літератури, розділу "Матеріали і методи досліджень", трьох розділів власні’,* досліджень, заключного обговорення експериментальних даних, вис-

новків, покажчика літератури, який включає 42 вітчизняних та 123 іноземних джерел.

Конкретний особистий вклад автора.

Експериментальний матеріал був цілком виконаний дисертантом O.A. Орловою самостійно. Вона вперше встановила дозозалежний характер гідроосмотичноГ дії гормонів різної' природи на тканинному рівні. Розглянула стан про ефекторну та регуляторну роль тканинної води в реалізаціГ гормонального стимулу, який забезпечує генералізацію гормоноіндукуємих процесів у клітинній мембрані, що дозволяє пояснити механізм дії' гормонів з точки зору створення та порушення водної' структури. '

Впровадження в практику одержаних результатів. "

Одержані в експерименті дані про спрямованість гідро-осмотичноі активності біологічно активних пептидів та стероїдів на тканини нирок та мозку було впроваджено в лекційному матеріалі на тему "Гормональна регуляція водно-електролітного балансу організму" на кафедрі медбіохіміі’ Луганського держ.мед.університету. Магнітнорелаксаційні характеристики нирковоі’тканини та мозку в нормі та під впливом біологічно-активних речовин було розглянуто фахівцями науково-дослідно“ лабораторії' ЯМР - спектроскопіі' НПЦМД " Резонанс" м.Луганська для подальшого Гх вивчення при розробці нових природних контрастних агентів.

Публікаціі. За темою дисертації опубліковано !0 робіт.

Матеріали і методи дослідження.

Дослідження проведено на 600 білих щурах-самках' лінії’ Вістар у віці від 8 до 10 тижнів. Експериметнальна частина роботи виконувалась згідно з Правилами проведення робіт з експерй-

ментальними тваринами, які затверджені Наказом МОЗ СРСР N755 від 12.08.1977 р.

Тварин забивали декапітацією й виймали нирки та мозок. Для вирішення поставленого завдання - вивчення характеру діГбіологічно-активних пептидів, стероїдів, ендогенних та синтетичних опіоідів на транспорт води нирок та мозку - використовувався "Спосіб визначення водного балансу організму in vitro на прикладі тканини нирок регістрацією ТІ- і Т2- показників часу релаксаціГ протонів тканинної* води методом ЯМР-релаксометріГ (І.О.Комаревцева, 1989). З цією метою в інкубаційне середовище додавали аргінін-вазопресин (АВП) у концентраціях 5 пг/мл,20 пг/д»л.8() лг/лгл (Швейцарія): бета - ендорфін -

0,19пмоль/л, 1,9 пмоль/л, 19 пмоль/л ; синтетичних опіатів: лей -

-ю -t -6

енкефалин -даларгин - 5 х 10 г/л , 5 х 10 г/л , 5 х 10 г/л;

-ю -е -6 с

тирозин-феніл-аланін -5x10 г/л, 5 х х 10 г/л, 5x10 г/л; тирозин--ю -$ -6

аргінін - 5 X 10 г/л, 5 х 10 г/л, 5 х 10 г/л (США); пролактин -

20мкМО/мл, 200 мкМО/мл, 2000 мкМО/мл; ПТГ - 5 пг/мл, 45

пг/мл, 450пг/мл; кальцитонін - 20 пг/мл, 150 пг/мл, 500 пг/мл;

АКТГ - 5 пг/мл, 25 пг/мл, 175 пг/мл (Франція); альдостерон - 10

пг/мл, 100 пг/мл, 500пг/мл ( Франція ); прогестерон - 2 пмоль/л, 10

пмоль/л. 50 пмоль/л ; тестостерон - 1 нмоль/л, 10 нмоль/л

(Беларусь).

Інкубацію тканин проведено на водяній бані "Нааке" (Німеччина) при 37 С на протязі ЗО хвилин.

До і після інкубаціГ ниркову та мозкову тканини зважували за допомогою електронної'ваги "Sartorius" (Німеччина).

Концентрацію іонів натрію й калію в інкубаційному середовищі вимірювали на біологічному ал кал і-м і к ро а н ал із ато р і (Угорщина).

ТІ- і Т2 - показники часової’ релаксації протонів тканинної'води вимірювали на приладі для ЯМР-релаксометріГ"МіпІ5рес РС-120" фірми”Bruker" (Німеччина). Подовжня релаксація (ТІ) визначалася за методом " inversion - recovery ” з використанням

9 О

180 -Т- 90 - імпульсно" послідовності, а поперечна (Т2) - за методом CPMG (Карра-Парсешіа-Мельбума-Гилла). Час повторення радіочастотного імпульсу був однаковим в обох випадках (3,0 сек). При наявності двокомпонентних кривихТІ- і Т2-параметри розкладалися на біекспоненти і по показниках Та і ТЬ розраховували Ра та РЬ, які характеризують розподіл між внутрішньо* (Ра) та позаклітинною (РЬ) фракціями тканинно“ води. Експериментальні дані оброблялися автоматично персональним комп’ютером "Minispec" за допомогою серійного інтерфейса RS 232С за програмним пакетом фірми "Bruker" "DTI, DT2" "Experiment Supervisor".

Одержані результати опрацьовані статистично за допомогою t-крітерію Стьюдента (Ю.Ф.Кабатов, М.Б.Славін, 1976) і оцінювались вірогідними при р < 0,05.

Результати та Тк обговорення.

Накопичені за останній час факти дали поштовх до розвитку уявлення про те, що гормональна молекула не являє собою інформаційне послання, в якому записані усі данні, а, скоріше, має значення сим’зола чи лексичної' одиниці, яка виступав як тригер, котрий запусжае специфічну для клітини інформацію, закодовану у рецепторному білку (Yates F.E., 1982, CsabaG., 1986).

Існуюче припущення про зміну просторової' структури білків, які приймають участь у механізмах діГгормонів, базується на структурно-функціональній природі будь-якого білка, в амінокіслотній послідовності якого закладена інформація про

придбання ним вторшшоі'та третинної"структури. До сих пір не-мас точних даних про які-небудь модифікаціГ третинної та четвертинної" структур будь-якого білка, який приймає участь в механізмі діГгормона (Дж.Теппермен та співавт., 1989). Однак, говорити про модифікуючий вплив гормонів на фізико-хімічний стан мембран неможливо без врахування Гх амфіфільності та-структуруючо'і ролі води в термодинамічній стабільності біслою клітинно? мембрани. Вода гідратації виконує структуруючу функцію у формуванні мембран та впливає майже на всі <ем-бранні процеси.

Характер взаємодії води з поверхнями клітинних мембран відображують ЯМР-релаксаційні показники протонів тканинної’ води. Якщо в наслідок дії гормонів відбуваються конформаційні зміни у рецепторних та інших білках, то ЯМР-релаксація -специфічний універсальний регістратор впливу гормонів на тканину. Це одна сторона методичного підходу нашого дослідження.

З іншого боку, вибір у нашій роботі досліджуваних гормонів різноманітних за хімічною будовою, за механізмом трансмембранної дії, за видоспецифічністю до них рецепторів, за тканинами-мішенями та за фізіологічною активністю дозволив виявити ефекгорну та регуляторну роль тканинно“ води у реалізаціі'гормонального стимулу.

Досліджені нами гормони у більшому чи меншому ступені можуть впливати на водно-електролітний баланс in vivo чи in vitro, деякі безпосередньо, інші пермисивно. А гідроосмотична та іонорегуляторна активність частини з них до сих пір підлягає сумніву (Galcheva-GargovaZ., 1994).

Якщо розбирати здобуті нами результати ЯМР-показників

тканинної води та окремих іГ фракцій з фізіологічної* точки зору, то досліджені нами пептидні та стероїдні гормони мають гідро-осмотичну активність, хоча й різного напрямку.

Так, білково-пептидні гормони ( вазопресин, опіати, про-лактин.АКТГ, ПТГ, кальцитонін) дозозалежно зменшували часи релаксації'протонів води у нирковій тканині, визивали дегідратацію тканини, зменшуючи в ній кількість води (мал.2).

Стероїдні гормони (альдостерон, тестостерон, прогестерон), в основному, підвищували подовжню (ТІ) та поперечну (Т2) релаксацію протонів тканинно" води. Але кожний гормон виявляв строго індивідуальну спрямованість. Наприклад, альдостерон у своєму органі-мішені - нирках - ТІ збільшував майже в два рази, тоді як Т2 - зменшував; прогестерон при малих концентраціях також підвищував ТІ та зменшував Т2, що вказує на формування кристалічної фракції води біля структуроство-рюючих факторів. При великих концентраціях прогестерон, навпаки, знижував час релаксації у нирковій тканині, мало місце зменшення кількості гідрованої води, намітилась тенденція до дегідратації тканини.

На відміну від пептидних гормонів, стероїдні гормони (крім прогестерону у великій концентрації) визивали значну гідратацію нирково” тканини (мал. 1).

У мозку стероїдні гормони вели себе так само, як і у нирках, тобто визивали ії гідратацію, збільшували час релаксації протонів тканинної води, засвідчуючи про ущільнювання гідрованого шару.

Пептидні гормони при малих концентраціях, в основному, визивали гідратацію тканин мозку, тоді як з іГ ростом ефект був протилежним: спостерігалася дегідратація тканини з пере-

розподілом внутрішньоклітинної” води у позаклітинний простір. Необхідно зазначити, що дія пептидних гормонів на водну фракцію мозкової' тканини не так рівнозначна, як стероїдів. Наприклад, при односпрямованому кінцевому ефекті на мозок, АКТГ збільшував кристалічну фракцію позаклітинної води, тоді як ПТГ спонукав росту кристалічної фракції внутрішньоклітинної води. Дійсно, існують данні про наявність двох кристалічних фаз у. фосфоліпідній системі мозку (Ангонченко В .Я. і співавт., 1991).

Виявлена нами чітка диференціація в характері впливу, який залежить від хімічної природи, поширює наші уявлення про клітинні механізми гормональної дії'.

На жаль, нема експериментальних доказів підтвердження проникнення гормонів білкової природи у клітину, також, як і дії стероїдних гормонів через системи внутрішньоклітинних рецепторів. Однак, існує механізм, який забеспечує швидку (метаболічну) дію стероїдних гормонів та повільну (ростову на рівні клітинного ядра) - пептидних гормонів. І наші дослідження це підтвердили.

Час інкубації (ЗО хвил.) тканини в присутності стероїдних гормонів недостатній, щоб пояснити гідроосмотичні ефекти стероїдів по'іх класичному механізму дії через ядерний геном. Альдостерон у нашому експерименті продемонстрував свою здібність змінювати іони натрія на іони калія в інкубаційному середо-вищї (Шрейбер В., 1987), при цьому спостерігалося переміщення тканинної води в сторону внутрішньоклітинної, відбувалася різка гідратація тканини. Динаміка спін-спінової та спін-рішетчатої релаксації засвідчувала про формування кристалічної фракції тканинної' води. Однак, офіційно визнано неясним, яким

чином збільшення рівня мРНК (котре альдостерон викликає на рівні транскрипції') приводить до виявлення його мінералокор-тикоідного ефекту (Данн М., і987).

Якщо б ми працювали не з нирковими зрізами, без встано-вленного часу інкубації та досліджували б тільки цей гормон із стероїдного ряду, то отримавши описані вище результати, узгоджені з його ренальними ефектами, могли б не звертати уваги на те, що одержані ефекти метаболічного характеру, а ніяк не ростового.

Досліджені нами інші стероїдні гормони (прогестерон і тестостерон), натрій - та діуретична активність котрих пояснюється складовою частиною протеоанаболічноі'дїГна рівні цілого організму (Шрейбер В., 1987), в in vitro умовах безпосередньо також збільшували вихід в інкубаційне середовище калію та знижували - натрію, викликали гідратацію тканини, сприяли формуванню кристалічно? фракції"води. Дегідратація у ниркових зрізах при великих дозах прогестерону являється за думкою інших дослідників (Бреннер Б. із співавт., 1983) неспецифічним і відображує токсичний ефект,

Про ренотропну дію тестостерону відомо, але його механізм дії'визначнено ще неостаточно (Brown D., 1993).

У нашому експерименті тестостерон виявив швидку (метаболічну) дію з чіткою кореляцією між збільшенням маси ниркових зрізів, часом релаксаціГ протонів тканинної' води і процентної' кількості іГ внутрішньоклітинної фракцій При цьому його гідратуючий ефект набагато перевищував таковий альдостерону.

Динамічні процеси в таких нелінійних системах, як водні системи, приводять до хаотизаціі посування, або, навпаки, до його

упорядкування й появі просторово-часових структур, які можуть спостерігатися на певному часовому інтервалі ( Антонченко В. і співавт., 1991). Дійсно, всі досліджені нами гормони, викликали у нирковій та мозковій тканині зміну часу релаксаціі'протонів тканинної* води. Цілком можливо, що зміни часу релаксації в водних системах зв'язані не стільки зі структурними перебудовами самоТ води, а скільки зі змінами іТ мікроструктури у взаємодії з розчинними осмотично активними речовинами ( Антонченко В. і співавт., ! 99і). І в цьому плані нас дуже зацікавила поведінка на-трія у наших дослідженнях.

Відомо, що пересування одновалентного катіона натрія дуже залежить від того, в якому становищі знаходиться вода. Якщо гідратна вода знаходиться в твердому становищГ (покої), то мембранна вода має льодоподібну структуру, а провідність мембрани для іонів натрію буде низькою. А якщо гідратна вода переходить у рідке становище, то пересування іона натрія зростає на 5-6 порядків (Анісімов М. і співавт., 1981).

Пептидні гормони викликають перехід мембранно" води з квазікристалічного становища в рідке компактно-пакувальне. При цьому, вони не проникають до клітини і де-гідратують тканини, завдяки перерозподілу внутрішньоклітинної води до позаклітинної. Також спостерігається зріст пересування іонів натрія, його транспорту у міжклітинний простір.

Стероїдні гормони, завдяки рідкокристаличної природи плазматичної'мембрани, вільно проникаючи у середину клітини, не порушують льодоподібну структуру води мембранних білків. Скоріше вони служать іонофорами, які переносять протони поза ліпідний шар мембран, на що вказує зміна протонного обміну та пов'язаний з цим процесом транспорт натрія. Саме цим механіз-

мом можливо пояснити швидку метаболічну дію стероїдних гормонів на тканину, що приводить до іГ гідратації', перерозподілу позаклітинно? води до клітини. На відміну від пептидных гормонів, стероїдні сприяли упорядкуванню тканинної води, формуванню іГ гідрованого шару, а в деяких випадках й кристалічно"! фракції.

Виявлена нами спрямованість гідроосмотичних ефектів біологічно-активних речовин може бути використана при розробці нових контрастних агентів, менш токсичних, релаксаційно ефективних та тканинноспецифічних. Серед досліджених гормонів, як найбільше ЯМР-активними, були визначені такі: тестостерон (10 нмоль/л), бета-ендорфін (0,19пмоль/л, 1,9

пмоль/л), синт. тирозин-феніл-аланіи (N95)- для нирок й для мозку - пролактин (200 мкМО/мл), прогестерон (10 пмоль/л; 50пмоль/л), тестостерон (10 нмоль/л).

Таким чином, одержані результати вказують на наявність молекулярно-структурноГ ролі тканинної" води в специфічності, генералізації", системній кооперативній реорганізаціГ плазматичної мембрани під впливом гормонального сигналу.

Висновки.

1. Вазопресин з підвищенням концентрації" викликає зміну про-

тонного обміну та густини гідрованого шару води, що сприяє дегідратації як ниркових зрізів, так і тканини мозку, яка супроводжується підвищенням проникності мембран для води із внутрішньоклітинного простору (Ра) до позаклітинного (РЬ).

2. Ендогенні опіоіди виявляють гідроосмотичну активність на ниркову тканину ( лей-енкефалін < мет-енкефалін < бета -ендорфін ), однотипову з вазопресином, але різною за ме-

ханізмом протонного обміну. Рівномірне скорочення часу релаксації вказує на зменшення фракції“ вільної" внутрішньоклітинної води, густини іҐгідрованого шару.

3. Дія синтетичних опіатів на тканинний транспорт води неоднозначна. Синтетичний тирозин-феніл-аланін (Ы 95) за всіма концентраціями і синтетичний тирозин-аргінін (N172) при 5 х 10 г/л, 5 х х 10 г/л змінюють рух тканинної води у внутрішньоклітинний простір, про що свідчить подовження часу поперечноГ та подовжньої'релаксації'й збільшення маси іпір-кової тканини, що вказує на протилежність результатів для

АДГ та природних опіоідів. При інкубації’ ниркових зрізів з

* 6

синтетичним лей-енкефалін-даларгіном (Ы 41) при 5 х 10 г/л намітилася тенденція до дегідратації тканини, що характерно для експерименту з АДГ та ендогенними нейропептидами.

4. Для білкових та пептидних гормонів (АКТГ, ПТГ, кальцитовій, пролактин) визначений дозозалежний гідроосмотичний ефект, спрямований на дегідратацію нирковоГ тканини, для якого характерно підвищення швидкості релаксації (як 1/Т1, так і 1/Т2), зменшення густини гідрованого шару тканинної води. Біекспоненціальний аналіз показав перерозподіл води з внутрішньоклітинного простору в позаклітинний, котрий супроводжується підвищенням виходу в інкубаційне середовище осмотично активних іонів натрію, що припускає його первинність у формуванні периферийно’і діГгормонів.

5. Для гормонів стероїдної природи (альдостерон, тестостерон) виявлена тенденція до гідратаціГ нирковоГ та мозкової тканини незалежно від переміщення іонів натрію і калію. Гідро-осмотична активність стероїдів супроводжується підвищенням показників спін-рішетчатої релаксації й незначним зни-

женням - спін-спіновоГ ралаксаціГ на фоні ЯМ Р-результатів в контрольній групі. Це вказує на упорядкований, малорухомий стан тканинно" води завдяки синтезу нових білкових молекул, або завдяки іншим структуруючим факторам. Поведінка прогестерона аналогічна для гормонів білкового походження.

6. Вплив біологічно активних пептидів та білків (АКТГ, про-лактин, ПТГ, кальцитонін) на ЯМР-релаксацію протонів тканинної’ води мозку направлен о на дегідратацію тканини на фоні підвищеного виходу іонів натрію і калію в інкубаційне середовище.

7. Виявлена гідроосмотична активність пепгидних та стероїдних гормонів вказує на чітку градацію цих речовин по змінюванню фізико-хімічних властивостей тканинної води, що свідчить про наявність протонного механізму і про молекулярно-структурну роль води в гормонокомлетентності клітини.

8. Гідроосмотичні ефекти ряда гормонів - пролактин (20 мкМЕ/мл), прогестерон (Юпмоль/л, 50 пмоль/л), тестостерон (10 нмоль/л) для тканини мозку і для ниркової тканини -бета-ендорфін (0,19 пмоль/л, 1,9 пмоль/л), синт. тирозин-аргінін (N 172), що направлені на затримку води, можуть дозволити їх використування як природні контрастні агенти в ЯМР-діагностиці.

Список робіт, опублікованих за матеріалами дисертаціі:

1. Бобров В.А., Комаревцева И.А., Орлова Е.А., Комаревцев В.Н.,Верник Г.В. Ядерно-магнитно-резонансная релаксация в диагностике эссенциальной гипертензии // Український кардіологічний журнал. -1996. -N3.-с.47-51.

2. Комаревцева И.А., Орлова Е.А. Действие биологически активных пептидов и стероидов на ядерно-магнитно-

резонансную релаксацию протонов тканевой воды почек in vitro// Український біохімічний журнал.- 1996.- N4. -с. 92-96.

3. Орлова Е.А. Сравнительное влияние природных и синтетических опиатов на ЯМР- показатели почечной ткани // В сборнике НДЦ. -Луганск, 1996.- -с. 103-105.

4. Орлова Е.А. Изучение магнитнорелаксационных характеристик ряда гормонов на транспорт тканевой воды в почечной ткани // В сборнике НДЦ.- Луганск, 1996. -с.88-91.

5. Орлова O.A., Комаревцева I.O., Кузнецова О.В. Вплив стероїдів на показники ЯМР-релаксаціі’ протонів тканинної’води нирок in vitro // Тез. І з'ізду Укр.біоф.товариства.-КиГв, 1994.-N 219.-е. 177.

6. Орлова Е.А. Изучение гндроосмотических эффектов кальци-тонина на уровне почки in vitro методом ЯМР-релаксометрии // У зб.: Мат. міжнар. конференції з актуальних питань морфологи. -Тернопіль, 1996.--c.4B9.

7. Орлова Е.А. Действие тестостерона на ЯМР-релаксацию протонов тканевой воды почек // У зб. тез молодих вчених та спеціалістів. -Луганськ, 1996.-c.112.

8. Орлова Е.А., Кузнецова Е.В., Комаревцева И.А., Романенко И.Ю. Зависимость Т1-и Т2-показателей времен релаксации протонов тканевой води мозга и почек от концентрации про-лактина в инкубационной среде // В сб..'Экологические проблемы промышленного региона с точки зрения врача. -Луганск, 1993.-с. 102-103.

9. Орлова O.A., Кузнецова О.В., Комаревцева I.O., Китачаева

З.Б., Сенчий В.М. Порівняльні магнігнорелаксаційні характеристики циркової' тканини під впливом р -ендорфіна та АКТГ // Тез.І з'ізду Укр. біоф.товариства. -Київ, 1994.-N 220.-c.177.

10. Орлова Е.А.. Кузнецова Е.В.. Комаревцева И.А. ЯМР-релаксационные характеристики ткани мозга и почек при инкубации с паратиреоидным гормоном // В сб.: Экологические проблемы промышленного региона с точки зрения врача.-Луганск, 1993 -с. 103-104.

. , Анотації'

Orlova Н. Comparative dynamic aspects of biology activity of hormones on data of NMR-relaxation in vitro. The Dissertation for Obtaining a Scientific Degree of Phylosophy Doctor ( Biology ) in the Speciality - Biochemistry . Medical University. Lugansk. 1996.

The present experiments were conducted to determine the effects of peptides and steroids hormones mediated changes in normal rat brain and kidneys tissue water distribution on proton relaxation times /Т1; T2/with a 20 MHz NMR-pulse-spectrometer /pc 120 Minispec,Bruker,FRG/. It has been possible to determine the dose-dependent hydroosmotic effect of used hormones and to study the mode of different action of peptides and steroids hormones at the molecular structure level.

Орлова E.A. Сравнительные динамические аспекты биологической активности гормонов по данным ЯМР-релаксометрии in vitro.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности биохимия. Луганский государственный медицинский университет, Луганск, 1996.

Настоящее исследование позволило установить действие пептидных и стероидных гормонов на распределение тканевой воды в молгу и почках интактных крыс по показателям времени релаксации протонов воды / Т1;Т2 / с помощью 20 МГц ЯМР-

релаксометра / рс ¡20 Міпіірес, Вшкег, РМСт/. Это дало возможность определить дозозависимый эффект исследованных гормонов и изумить механизм различного действия пептидных и стероидных гормонов на молекулярно-структурном уровне.

Ключові слова: ЯМР - релаксація протонів тканинної' води, пептидні та стероїдні гормони, фракції' тканинно!'води, нирки, мозок.

а) б)

1100-о .

О)

£ 900-

Р 7 ООН

500

1С32

3) г)

Мел. I. ЯШ5- релаксація протонів ткижнної води під впливом стероїдів.

а, б - нирхи: І - контроль; 2 - прогестерон, ІО пмоль/л; З - тестостерон, 10 нмоль/л; 4 - альдостерон,100 пг/нл;

в, г - мозок: І - контроль; 2 - тестостерон, Ю нмоль/л; З - прогестерон, 50 пиоль/д; 4 - альдостерон, 100 пг/мл.