Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамические свойства биологических мембран, обладающих гемокоагуляционной активностью

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Динамические свойства биологических мембран, обладающих гемокоагуляционной активностью"

од

РОССИЙСКАЯ АКАДШЙЯ 1ВДШШНСЯИГ НАУК ГЕШТОЛОГКЧЕЧСКЙЙ НАУЧКШ ЦЕНТР

На правах рукописи

БАИКЕЕБ РУСТ ЕИ ФРУШЕВМЧ

ДИНАШЧгСКИБ СВОЙСТВА биологических: МЕМБРАН, ОБВДАВДК ГШЖОАГУЛЩЙСННОИ АКТКВНОСШЭ

03.00.G4- БЙОХИМШ

Автореферат диссертации на соискание учекой степени доктора медицинских наук

Мэскза- 1993

Работа выполнена в Казанском государственном медицинском институте им. С.Е Кураюва.

Научный консультант - д. ы. н.,

профессор Л М. Зубаиров

Официальные ошоневгы:

доктор ыедгцишсюк наук, профессор В.А. Макаров

доктор ыедихиаских наук, профессор Г.А. Яровая

доктор биологических наук Л.Б. Козлов

Бед уте учреэдевие- Кардиологический научная центр РАМН

Защита состоится "_"_1993 г в_час

на заседания специализированного совета Д 074. 08.02 в Гематологической научно;.; центре РАМН, Москва 125167 Новозыковский проезд, 4з

С диссертацией гюзао ознакомиться в библиотеке ГЩ Автореферат разослан "_"_ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета

кандидат б;:сЕог::°есккх наук

З.Д. Реук

-3--

ОВШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность пройггиы. Инициирование свертывания крови при достругано! тканей было обнаруйено более полутора века назад, когда de Blairiville в 1834 году наблюдал устарение свертывания крови при её контакте с кусочками органов. Избыточное поступление разрушенных тканей в кровяное русло призодит к одному из наиболее частых неспедифических нарушений гемокоагуляции - дисееминированвоку внутри-сосудистому свертывании (ДВС), которое осложняет многие патологические процессы, имеицие место при уирургических, Ejysspcirax, гинекологических (В.И. Кулаков, 1982; ЫХБалуда, 1976; 3.Д Федорова, 1970; АД. Макацария, 1983),терапевтических (В.А Люсов,1976) .инфекционных заболеваниях, злокачественных опухолях (A R Филатов, 1953), шоке, ожогах (В.Д Балуда, 1981),посттрансфузионных.ослонненыах (R А Горбунова, 1981).

Для профилактики и лечения дисееьянированного внутрисосудистого свертывания необходимо детальное изучение на молекулярном уровне структуры биологических мембран и механизма их взаимодействия с факторами свертывапцэй системы плазмы крови. В настоящее время научен биохимэтеский состав мембран, способных активировать сЕертызавдую счетему крови (J.A Hayverd, 1934; A Rehemtulla, 1991), определены кинетические параметры активации "внутреннего" (В. Osterud, 1977; J. Rosing, 1988; F. A Dcirbrose, 1979) и "внеинего" путей свертывания крови (S.D. Foriran, 190S; S. А Seiverberg:, 1977; Е. Bjorklid, 1Э75; М. Zur, 1980). Однако для понимания молекулярных механизмов перехода

мембранных структур, обладающих гемокоагуляционной активность», ,из латентной ь активную форму, необходимо исследование данамичесюи информационных изменения как плазменных факторов свертывания, так и самих биологических мембран.

Общепринято, что проявление тромбопластической активности (инициирование внешнего пути через фактор УП) для соматических иеток возможно в результате травматического воздействия на ткань . Большинство исследователей изучают этот вопрос путем регистрации количественных изменений в системе ферментативного каскада гемокоагуляции, происходящих после повреждения плазматических мембран, отдельных изолированных клеток, тканей, органов. Изменения в структуре мембран на уровне липид-белок при этом, как правило,.не исследуются.

Цель исследования. Ставилась цель изучить фазовое состояние и динамические свойства липидного и белкового компонентов вшопротеидных комплексов, обладаю®« громбопластической активностью, а также корреляции между деструкцией тканей, биологических мембран и инициированием свёртывания крови.

Задачи исследования:

1) Исследовать корреляцию между деструкцией тканей и инициированием свёртывания крови.

2) Шлучить референтную плазму и разработать тест-систему, специфически чувствительную к мембранным структурам, обладающим тромбоплаетической активностью.

3) Исследовать тромболластическую активность нормальных и опухолевых тканей.

4) Изучить структуру и молекулярный механизм тепловой, протеолитической и химической инактивации тканевого тромбопластина из головного мозга человека.

5) Изучить влияние деструкции на динамические свойства клеточных мембран.

Научная тзкака. В результате исследований расширен перечень нозологических форм заболеваний, при которых для диагностики деструкции тканей можно применять, определение в крона активности 5'- нуклеотидазы, содержания ц-АМЕ, №. ЭПР- регистрируемых парамагнитных центров, величины коэффициента церулоплазимн/трансферрин и значений времен ЯМР-1Н (Т1.Т2) релаксации.

Разработана тест-система для определения троа5ошгасткческой активности мембранных структур. Установлено, что тромбэиластическая активность мембран ьюкет ингибироваться нетивными компонентами тканей.

Изучена ; динамическая структура препарата тканевого тро;л5опластика из головного мозга человека; исследован молекулярный мэхакизм его тепловой, протеолитической и хшнческой инактивации.

Изучено влияние деструкции на фазовое состояние и динамические свойства липидного и белкового компонента кэкОран, облвдесщих тромбопластической екгиезостыш

Заработаны требования к погегадиальным лечебным препаратам, которые могут быть использованы в качестве ингибитороз тканевого тромбопяастиза.

Практическая л творэ-тчесхая цгшюсть юехэдоваяхп. Полученные данные позволяют шире применять использованные нами маркёры в практической работе лечебных учереддений для

лабораторной диагностики деструктивных процессов в организме человека к для контроля га эффективностью лечения.

Используемые в нашей работе методы определения деструкции тканей внедрены в городской противотуберкулезной больнице и научно-практическом объединении "Онкология" г. Казани,

Ib материалам данной работы под руководством диссертанта защищена кандидатская диссертация (ff гос. регистрации - 01.8. S0.045100, Москва, 1993 г.) с практической направленностью на тему "Оценка активности костно-суставного туберкулеза по маркёрам альтерации тканевых структур".

Разработанная тест-система по определению тромбопластической активности мембран может использоваться клиническими лабораториями в амбулаторных и стационарных условиях.

Выявленная способность димексида ингибировать летальный эффект тканевого тромбопласгкна in vivo (получено положительное решение по заявке аз 4907534/14(010494) на патент "Применение димексида в качестве вещества, ингибирутацего активность тканевого тромбопластина") может быть использована для поиска лечебных средств по профилактике и лечению нарушений гемостаза в клинической практике.

Полученные результаты затрагивают фундаментальные вопросы теории свертывания крови и могут быть использованы при изучении молекулярных механизмов инициации гемокоагуляции.

Положения, вьдекгаеые та зацсту. 1. Пусковым моментом тромбопластической реакции является контакт фактора VII с поверхностью апопротеид III-содержащей клеточной мембраны. Если это сопровождается повреждением

клеток, то увеличивается число контактирующих с плазмой крови центров связывания и активации фактора VII. Фпсфолипиды при этом реорганизуются из бчламеллярдай в гексагональную (НИ), мицеллярную или в какую-то иную лиотропную меэофазу и возрастает подвижность яирнокислотних радикалов липидов. Удельную тромбопластическую активность мембраны, помимо числа центров связывания фактора VII определяет специфичность ориентации фосфэжтидов вокруг алояротевда Ш. Это зависит как от динамического [информационного состояния апопротеида III, так и от состава самих пограничных фосфолипидов.

2. Клеточные мембраны не следует рассматривать как чисто механическую матрицу с определенной мозаикой зарядов, на поверхности которой идё-í свёртывание, т.к. нормальные и опухолевые клетки обнаруживают способность к регуляции гемокоагуляции. Регуляция происходит не только эа счёт физической перестройки плазматической мембраны в результате изменения фазового состояния, диффузии, флуктуации плотности, вращгния, "флип-флопа" липидов и белков, но и за счет синтеза de novo белковых и лилидных факторов, экспрессируемых на поверхность клетки и активно воздействующих на реакции свёртывающей и противосвёртдаающей систем крови.

3. Схема, описывающая инициирование диссешяшроваяного виутрисосудистого свёртызакия, макет быть представлена как "деструкция тканей - тромболдасгин- и фосфолипадешя-инициирование свёртывания". Троибопластичеиая активность фрагментов мембран кожт ингибироваться нативкыми компонентами тканей. Свёртывание крови и отлошие фибрина в тканях возможно и без повреждения клеток. Инициирующим моментом этого процесса является увеличение проницаемости сте-

нок сосудов к контакт плазмы с поверхностью клеток, расположенных экстраваскулярно.

Апробацяа работы. Материалы докладывались на: VII Республиканской конференции молодых ученых (Казань, 1987), выездном заседании Центрального совета Всесоюзного биохимического общества (Казань, 1988), Всесоюзной конференции "Применение магнитного резонанса в народном хозяйстве" (Казань, 1988), научно-практических конференциях по внелегочгому туберкулезу (Тула, 1988; Иваново, 1989; Калининград, 1991; Казань, 1992), международной конференции "Клеточная патология и фармакология" (Budapest , 1988), XXIV конгрессе Ампера (Poznan , 1988), 9-ом специализированном коллоквиуме Ампера "Магнитный резонанс в полимерах" (Prague, 1969), XIX Европейском конгрессе по молекулярной спектроскопии (Dresden , 1989), втором Всесоюзном совещании "Длффузия молекул" (Казань, 1990).

Дуйлкеззри. По теме диссертация опубликовано 35 работ, 3 работы принята в печать.

Структура и объем работы. Выполненное исследование является частью плановой научней работы кафедры биохимии КГШ им. С.Е Курашова по изучению ключевых реакций системы гемостаза (номер государственной регистрации 0188.0077072).

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, пяти глав, отражах>-щих итоги собственных исследований, выводов, указателя литературы и приложения.

Диссертация изложена на 260 листах машинописного текста, содержи* 66 рисунков, 31 таблицу. Библиография состоит из 327 работ отечественных и зарубежных авторов.

- 9 -

МАТЕРИАЛ И ИСТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Кровь получали от здоровых доноров (возраст 18-55 лет), Сольных опухолевыми + неопухолевыми заболеваниями (705 образцов, от больных туберкулевоы легких (459 образцов) и костко-суставной системы (268 образцов).

Изучали ткани людей (лёгкое, желудок, толстый кишечник, пищевод, молочная железа, поджелудочная железа, сердце, надпочечники, почка, печень, матка, плацента, мышца скелетная, предстательная железа, яичко), погибших от случайных причин, полученные через 12-14 часов после смерти (судебно-медицинские вскрытия), 121 образец. Исследовали ткачи больных туберкулёзом лёгких (10 образцов) и костно-суставной системы (5 образцов); патоиорфологические вскрытия.

Опухолевые ткани человека исследовали через 2-4 часа после операции; 81 образец, включая и патологические ткани. Изучали центральные и периферичесгае участки. Изучали ¡региональные лимфатические узлы, свободные от метастазов, полученные ,от 24 больных во время операции по поводу рака желудка. Б качестве, контроля служили лимфатические узлы 50 здоровых лиц, старие 30 лет, погибших от случайных причин (судебно-медицинские вскрытия).

Препараты тканей окрашивали гематоксилином и эозином, по Браше, толуидшовш сишш, на фибрин ко Маллари и Вейгерту, ишрегнировали серебром по «угу и Папу. Криостатные срезы подвергали исследованию в ультрафиолетовом спектре люминисцентного микроскопа "ЛКЬйМ - Р2" для выявления собственного свечения эластических волокон в сосудах микроциркуляторного русла. Вгорзя часть испо.пь-

зовалась для элекгронношкроскопического исследования.

Препарат головного мозга человека использовали через 12-14 часов, а крупного рогатого скота - через 2 часа после смерти. Миелин центральной нервной системы быка получали, как описано ранее (L.A. Autillo, 1964).

йсследозали три образца тканевого тромбопластина.-комыерческий. препарат (Каунасское предприятие по производству бактерийных препаратов), изготавливаемый из головного мозга человека, и препараты, полученные нами из головного мозга человека и крупного рогатого скота(Е. Perlíck, I960).

Препараты головного мозга лиофилизировалм на установке "Frigera HS-30" (ЧССР).

Препарат тканевого тромбопластина подвергали тепловому (Д.М. Зубаиров, 1S83) , протеолитическому (папаин, трипсин) (Д.Ы. Зубаиров, 1981) и химическому (NaOH, HCl, глицерин, диметилсульфзкеид- ДОСО , глютаральдегид) (F.A. Pitl ick, 1976; Р.Ф. Байкеев, 1983; Д. М. Зубаиров, 1991) воздействиа

При изучении инактивации тканевого тромбопластина in vivo эксперимента проводились на 20 кроликах породы Shinshilla, весом 2,5 - 3 кг. Кровь для анализа бралась из ушной вены при помощи силиконированного шприца. Туда же делалась внутривенные шгьекции биологического раствора или дшексида и суспензии -тканевого тромбопластина.

Макрофаги (степень чистоты 96 7.) получала из лёгких кролика (М. I. Yorik, 1961).

Элекгронномикроскопические исследования проводили по известным методикам (Г.Гайер, 1974; E.S. Reynolds, 1963; RA. Ровенский, 1979). Для трансмиссионной электронной

микроскопии использовали электронные микроскопы JEOL-IOOC, JEM-10X (Япония), а для растробой электронной микроскопии сканирующий электронный мжроскоп JSM-25S (Япония).

AKiWBRocib 5'-НК определяли в сыворотке крови (D. М.СайфЪэ11,1962).

При определении ц-АШ> исследовали кровь из локтевой вены, радиохимическим методом (А Б. Gi J nan). Радиоактивность просчитывали в жидкостном сцинцилляторе 2D-8 на радиоспектрометре "Delta-ЗОО'Ч США). Парамагнитные центры и коэффициент церулоплазмия (Дп) /' траясфэррин (Тр) в цктратной плазме определяли-методом ЭПР при температуре 140-0,2 К.

Продукты деградации фибриногена исследовали в нитратной плазме (3. С. Баркаган, 1988)

Использовали пертехнетат 99тТс - при коствсм туберкулёзе, цитрат 676а ■ - при- легочном туберкулёзе. Сканирование проводили ва многоцветном сканере MB-8200 фирмы "Gamma" (Венгрия).

Исследовали общебиохимические показатели у 35 Сольных туберкулёзом лёгких и костно-еоеуднстой системы аланинамшгатрансфераза (Алт), аспарагинзыкнотрансфераза (Act), щелочная фосфагава (Щ, лактатдегидрогеназэ (Ддг), гаша-гшяамяд-аминотразсфзраза (Ггт), протеин, холестерин, триглицервды (Тг), ашлаза, иочэьина, креаткЕин, мочевая кислота, бикртбин, фосфор, кальций, хлор.

Содеравзяе белка определяли по методу Лсури .

Использовали разработанную нами гедакозг7ляди0няую тест-систему,-специфически чувствительную к алопротеид Ш-содервдим мембранным структурам .

В качестве ЭПР-спинового зонда использовали водный

раствор TEMPO (2,2,6,6 - тетраметилпиперидин-1-оксил) в -з.

концентрации 5-10 К (JL Берлинер, 1979). Спектры ЭПР регистрировали Sa радиоспектрометре ER-200 ("Bruker", Германия), оснадзиком компьютером "Aspect -2000. "

Времена ЯМР-1Н релаксации (Т1.Т2) сыворотки крови и тканей определяли на ШР-релакссметре "Minispee PC - 120" ("Bruker", Германия). Рабочая частота прибора 20 МГц. Для измерения времени и использовали "последовательность 180°- С - 90°, а для измерения Т2. - последовательность импульсов Еарра - Шрсела -Мэйбума - Гилла.

Спектры ШР-31Р водных суспензий и спектры ЯМР-1Н сухих препаратов тромбопластина и лилидов записывали на ■•яекгроыетре СлР-100 ("Bruker", ФРГ) на частоте 36,4 и 90 Mi*:, соответственно ( P.A. Kroon, 1975; L.А.Т. Littleirore, 1979).

Спектры ЯЫР-1Н водных суспензий тромбопластина и лилидов записывали на спектрометре VM-250 ("Bruker", ФРГ). Спад свободной индукции (ОСИ) сигнала ШР-1Н при исследовании сухих препаратов мозга, тромбопластина и

с

лилидов регистрировали после 90 РЧ импульса. Анализ ССИ выполняли, используя метод нелинейного регрессионного

о

анализа Значения Т1 регистрировали с использованием 180 -90° РЧ импульсов с помощью стандартной программы фирмы "Bruker".

Измерения самодиффузии молекул выполняли на ЯМР-релаксометре с резонансной частотой для протонов 60 МГц и импульсным градиентом магнитного поля с максимальной амплитудой 70 Т/м. Использовали метод "стимулированное эхо" (Р. Т. Callaghan,1983; J. Karger, 1969; J. Е. Tanner, 1968).

Информацию получали в виде затухания сигнала спинового эхо (ДЗ). то есть зависимости амплитуды эхо A(g) ог амплитуды импульса градиента z в координатах 1еСА(е)/А(0)] от k ,

где А(0) - амплитуда эхо в отсутствии градиента, f -гиромагнитное отношение для протонов, - время диффузии. Б таком представлении коэффициент самодиффузии (КОД, D) определяется наклоном ДЗ.

Спектры 23Na-HMP регистрировала на спектрометре СХР-200 фирмы "Bruker" (Германия) с рабочей частотой 52,9 МГц. Для раздельного определения двух характеристических времён поперечной релаксации Т2' и Т2" кривую спада поперечной намагниченности аппроксимировали суперпозицией двух экспонент с использованием нелинейного метода наименьших квадратов (С. Е Дворянцев, 1984).

Цри анализе результатов исследований использовали методы вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по критерию t Стьадента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСВДЕШИЕ

Тромбоэмболии, подострое внутрисосудисгое свертывание крови, вплоть до развития синдрома ЛВС, являются одними из клинических проявлений различных заболеваний , включая и опухолевого процесса в организме человека . Главной причиной этого, по общему мнению, является активация фактора VII при массивном поступлении в кровоток тканевого тромбопдастина. Роль контактной фазы при этом существенно нивелируется .

Практическое разрешение профилактики подобныг осложнений требует решения ряда ключевых вопросов. Во-первых, необходито знать удельный вклад внешнего и внутреннего путей гемостаза в

общую гемокоагуляционную активность тканей. Ео-вторых, диагностировать состояние тромбопластинемии и инициирована свёртывания крови.

Ув всего многообразия диагностических тестов мы остановил свой выбор на двух группах показателей .

1 группа - прямые показатели деструкции мембран: активность фермента 5*-нуклеотидазы , содержание циклического аденозЕнмояофосфата (ц-АШ), наличие свободнорадикальных соединений в крови.

2 группа - косвенные показатели деструкции клеток: тигр продуктов деградации фибриногена (ВДФ), значение времен ЯМР-1Н(Т1.Т2) релаксации в крови, значение коэффициента церулодлазмин/трансферрин.

Полученные нами результаты согласуются с данными други авторов (ЯЛ Алмпа,1983; И.А. Аядрушко,1988;Д.М. Зубаиров, 1981; ас. Баркаган, 1988; Р. Г. Сайфутдинов, 1989; М. J. Auger 1987; Е.Т. Fossel. 1986) и расширяют перечень нозологически форм заболеваний, при которых для диагностики деструкции тканей можно применять определение, использованных нами марю

Попытки отдельных авторов диагностировать опухоли п< временам ШР-1Н релаксации компонентов крови или тканей мы считаем необоснованными по следующим причинам.

Во-первых, пределы значений времен релаксации тканей ил крсви здоровых доноров существенно перекрываются с показателями таковых людей больных опухолевыми и неопухолевыми заболеваниями .

Во-вторых, времена релаксации ЯЫР-1Н (Т1, 12) отражаю изменения содержания ионов металлов, диамагнетиков высокомолекулярных соединений (L.I. Gerasimova, 1990)

- 15 -

и низкошлекудярных лигандов (С. И. Аксенов, 1989). Регистрация ни одного из этих компонентов организма человека не может служить как маркёр опухолей.

Б качестве критерия эффективности лечения заболевания может быть использовано определение активности 5'-НК, уровня ц-АШ.

Определение ГЩФ,времён ЯМР-1Н релаксации, коэффициента Цп/Тр и общепринятых биохимических тестов при этом не информативно. Возвращение значений этих параметров к контрольным, указывающее на завершение репарзтквных процессов, наступает позднее клинически видимого выздоровления.

Анализ полученных результатов и литературных данных '( 0. А. Терсенов, 1989; Ch. Т. Esrron, 1987) позволяет сделать вывод, что мембранные структуры, обладающие тромбопластической активностью, не всегда способны проявить, свой прокоагулянтньй эффект. Аналогичные результата по ингибированию тромбопластической активности были получены при исследовании тканей животных и отдельных органов человека (S. D. Carson, 1981). Причину наблюдаемого зффекта авторы усматривают в присутствии в гомогенатах тканей таких антикоагулянтов как гепарин (R. Machovich, 1985) и протеин С ( Ch.T. Esmon, 1987). Кроме этого, в отдельных органах, в частности, в плаценте, обнаружены белки, способные ингибировать комплекс тромбопластин-фактор Vila (Т. Funakoshi, 1987; S. Kondo, 1987). Ингибитор внешнего пути освобождается в месте механического повреждения сосудов из активированных, агрегированных тромбоцитов , эндотелиальннх клеток ( V. Abildgaard, 1968) и блокирует активность комплекса фактор VI 1а-тканевой фактор (P. Colburn, 1991; N.S^ Callander, 1992).

В наших исследованиях косвенным подтвервдением

присутствия антикоагулянтов в тканях человека является увеличение тромбопластической активности тканей после удаления поверхностных" белков и обработки ацетоном .

Исследовали корреляцию между деструкцией тканей и инициированием свёртывания крови. В качестве маркера деструкции использовали 5'-ЕК, а инициирование свертывания крови определяли по уровню ВДФ.

В традиционную схему "деструкция тканей - тромбо-пластинемия - инициирование свёртывания крови" укладывалась только часть результатов. В другой части случаев наблюдали высокий уровень 5' -НК и сохранение содержания ПДФ в пределах нормы, что ыогао объяснить гак блокирование свертывающей способности мембран поступающими вместе с ниш нативными антикоагуляятами клеток. Ife исключено, что при этом были обнаружены цитошшзматические, не связанные с мембранами, растворимые формы 5'-НК ( J. Oka, 1989). Тем не менее, появление таких форм 5'-НК в-кровяном русле возможно таклк только после разрушения клеток. Здесь следует подчеркнуть, что не вся прокоагу-лянтная активность спухолезых клеток может быть отнесена на счёт содержания в них тканевого фактора (М. Colucci, 1981; V. A. Ewan, 1983). Установлено, что множество опухолевых клеток является поверхностью для синтеза протромбиназы, подобно мембране тромбоцитов при внутрисосудистом свёртывании ( К. Weber, 1969; Л.Д. Зербино, 1989). Аналогичными свойствами обладает поверхность клеток и нормальных тканей, не содержащих апопротеид III; В связи с этим очевидно, что рассматривать тромбопластин как единственный источник инициации синдрома ДВС не совсем верно.

Циркулирующие в кровяном русле фрагменты мембран, которые

- 17 -

обнаруживаются по уровню мембранного фермента 5'-НК , по ускорению времени свертывания плазмы, подвергнутой ультрацентрнфугкрованию (O.A. Терсенов, 1988), в общем случае следует рассматривать как смесь алопротеид ГП-содердалих и свободных от него мембранных лкпопротеидных комплексов. Точно так яе, обнаружение в плазме алопротеид III-содержащих структур не исключает присутствия в системе, других липопротеидных комплексов или чисто фосфолипидньк структур, инициирующих свёртывание по внутреннему пути. На существенную роль контактной фазы указывает1 и наш результаты, из которых вытекает, что тромбояластическая активность„тканей в условиях отсутствия активавди контактной фазы может ингибироваться натив-ными компонентный клеток.. .

В наших исследованиях показана возможность инициации свёртывания крози, судя по уровню 5'-Ж, без "видимого" повреждения клеток .

Опухолевые клетки способны синтезировать тканевой фактор и зкспрессировать его на наружную поверхность клеток или везикул, образующихся из. плазматической, мембраны ягах клеток ( S. Hartzell, 1989; H.F. Dvorak, 1983). В проведённых ранее исследованиях показано, что вокруг опухолевых клеток мояет откладываться фибрин (M.Colucci, 1981; Н. F. Dvorak, 1979). Экстраваекулярное отлоиение фибрина - это результат проникновения через сосудистую стенку и коагуляции плазменного фибриногена. В норме эндотелий сосудов не содержит алопротеид III, хотя ухе на уровне субэндотелия моиет обнаруживаться тканевой фактор (J. 1!. Wilcox, 1989). Фактически, сосуды являются естественным барьером, изолирующим факторы свёртывания крови от тромбопластйческих

- 18 -

субстанций тканей . Опухолевые клетки продуцируют пептид, способность которого увеличивать проницаемость сосудов з 1 ООО раз больше, чем у гистамина. Подобно гистамину он вызывает разъединение эндотелкальных клеток без их повредцевня (Н. F. Dvorak, 1972). Кроме этого опухолевые клетки вырабатывают факторы, способные активировать фактор X(S. а Gordon, 1975).

В случае лимфатического узла юеодка, свободного от метастазов, я на границе туберкулёзного очага со здоровой тканью отсутствуют факторы активации фактора X Влияние болезни, по-видимому, ограничивается увеличением проницаемости сосудов, г. к. целостность цитоллазматической мембраны эндотелия при этом не нарушается. Согласно морфологическим данным нормальные неповреждённые клетки также участвуют ь каскаде свертывания, предоставляя свою поверхность для инициирова- • ния свёртывания крови и отложения фибрина.

Таким образом, нормальный уровень активности 5'-НК и высокий титр ЦДФ в часта клинических случаев можно объяснить как то, что на поверхности неповреждённых клеток идёт процесс гемоко-агуляции, а увеличение содержания Щ£> в плазме происходит в результате ди^узии ЩФ из межклеточного пространства в кровяное русло.

Препараты мембран, обладающие высокой удельной тромбопластической активностью, в частности, тромбопластин из головного мезга человека, находят широкое применение в экспериментальных и клинических лабораториях, занимающихся изучением гемокоагуляции.

Несмотря на длительную историю изучения, форма активности и химическая природа препарата тканевого

тромбоплаетина из головного мозга человека остаётся недостаточно изученной.

Результаты проведённых наш исследований с помощь» методов ЯМР, ЭЛР и методов электронной микроскопии свидетельствуют о том, что в препарате тканевого тромбоплаетина головного мозга человека фосфолипиды организованы в гексагональную (Н^) лиотропяу» мезофазу. Сохранены лишь единичные мембраноподобные структура

В наших исследованиях ионы кальция в концентрации 0,2 и не изменяют фор.му упаковки фосфолапидов , что объясняется, видимо, стабилизирующим эфактом мембранных белков в структуре тканевого тромбоплаетина Однако подвижность атома фосфора значительно снижается, что указывает на взаимодействие Са2+ с полярными фосфорсодержащими группами в структуре фос-фолипидоз тканевого тромбоплаетина

Полученные результаты и анализ механизма слияния мембран (Р. Я. СиШз, 1979) позволили нам разработать модель препарата тканевого тромбоплаетина из головного мозга человека. Согласно предлагаемой схемы с водной средой ¡сонтак-тируют гидрофильные участки липидов и белков, а все гидрофобные структуры погружены внутрь и не контактируют с водой. Наружу экспонировано только 10-20 % полярных фосфореодоряагдих головок фосфолипидов, остальная часть находится внутри конгломерата, где они образуют как чисто липидные гексагональные цилиндры, так и комплексы с белками.

Одним из нерешённых вопросов тепловой инактивации биологической активности тромбоплаетина является влияние теплового воздействия на фазовое состояние липидов и на динамические свойства его липидного и белкового компонентов.

Интерпретация полученных результатов может быть изложена в рамках теории строения биологических мембран и описанной схемы строения препарата тканевого тромбопластика "из головного мозга человека .

Нагревание троыбопдаетина в присутствии Од, в принципе, может приводить к двум изигнениям в структуре тромбооастина: 1) перекиснсе окисление лнпядов и белков; 2) денатурация белкового компонента Что касается перекисного окисления липи-дов, то показано, что нагревание тромбопластина существенно ускоряет этот процесс (Д. К. Зубаиров, 1883). Тепловое воздействие приводит к некоторому разворачиванию молекул интегральных белков, что увеличивает площадь их соприкосновения с липидами. Происходит ишобшшзащя свободных молекул липи-дов и липидов с промежуточным* „динаическиад характеристиками. Это вызывает уменьшение-их подвижности. Однако этот -процесс незначителен, т. к. при этом не • изменяется фазовое состояние липидов и уменьшается коэффициент сададиф$узии только у части липидов. Белковый компонент также изменён незначительно, т.к. взаимодействие На с поверхностью тромбопластина достаточно удовлетворительно описывается двумя константами кажущейся диссоциации (К^).

Тепловое воздействие на тромйопластин в водной среде оказывает существенно большее влияние. Степень денатурации белкового компонента настолько велика, что полностью ' нарушается гексагональная (Н^) форма упаковки липидов , Ыа-связывающие центры перестают быть едины)« пулом. Доля обездвиженных липидов увеличивается и уменьшается подвижность их молекулярных сегментов. Липиды становятся более однородными и по динамическим характеристикам, о чём могно су-

дитъ по существенном/ увеличению D и одноэкспоненциальности формы ДЗ .

Протеолитические ферменты способны избирательно модифицировать белковый компонент тканевого тромбопластина, снилая его гемокоагуляционную активность (Д. М. Зубаироз, 1981; R. Bach, 198S), Гидролиз пептидных связей существенно влияет на динаютеские характеристики всех составляющих тромбопластина. Судя по Форш сигнала 31Р-ЯМР , значениям К^ для ионов Na ч величинам коэффициентов саюдкффузии , папаин сильнее, чем трипсин, нарушает структурную организацию тромбопластина. Результатом воздействия папаина и трипсина является снижение информационной тепловой устойчивости тромбопластина, изменение конформации белкового компонента, экспонированного на его поверхности, ограничение подвижности жирнокисдотяых радикалов липидов и разрыхление препарата тканевого тромбопластина в целом.

Использованные наш криопротектсры (ДМСО и глицерин) оказывают существенное влияние на структуру и функцию биологических мембран. В реорганизацию мембран под влиянием этих веществ вовлечены процессы, отличающиеся от фазовых переходов, что подтверждается нашми результатами по данным 31Р-ШР.Б результате действия глицерина и MX) имеет место ограничение подвижности диржжислотньк радикалов и диффузии липидов , изменяется конформация белкозого компонента .

. Изменение рН нарушает структурную организацию липидного компонента тромбопластина и иммобилизует яирнокислотные радикалы . Судя по данным 23Ма-ЯМР, инкубации при рН-2,0 сильнее влияет на белковый, а инкубация при рБ-10,0 -на лшидкый компоненты. Появление двуэкспонециальности

после воздействия рН=10,0 при измерении Т1 указывает» что имеет место кластеризация препарата тканевого тромбоплас-тина на домены, существенно различающиеся по своим динамическим характеристикам . Причиной данного явления, по-видимому, является гидролиз жирнокисдоткых радикалов. Бри рН=2,0 гидролиз липидов в структуре трэмбопласткча не происходит ( JLM. Зубаиров, 1991). Инкубация при рН=2,0 таю,к не влияла на фазовое состояние обшей фракции липидов.

Глютаровьй альдегид при концентрации 2 7. не сказывал заметного влияния на фазовое состояние липидов и динамические характеристики компонентов тканевого троыбопласткна . Наиболее значительные изменения имели место в структуре белкового компонента, о чём-южно судить по нарушение взаимодействия ионов На с тканевым тромбопластиноы.

Яри всех видах использованных . нами воздействий, ионы кальция сохраняли способность к ззсимодейстзию с белковым компонентом тканевого трокбошйамдаг.' .

Схематически активация фактора X по внешнему пути мокет быть представлена следующим образом ( Y. Nomerson, 1988):

Т«4фУ 11ач== ВДУ1 Ia+фХ з^ТФ фУ 11а фХ Т®фУ ] 1а +фХа (1) k-ч ^ %

Взаимодействие фХ с комплексом Тйф'/Иа можно рассматривать как взаимодействие лиганда с мембранным ■ рецептором. Основанием для подобного утверадения являются следующие экспериментальные данные: 1. Glu- домен фактора Vila участвует не только в образовании стабильного комплекса ТФфУ!1а, но и в узнавании

- 23 -

протяжённого субстрата - фактора X (V. Ruf. 1991);

2. Кинетические параметры активации фактора X внешней свёртывающей системы определяются концентрацией свободного, несвязанного с мембраной, фактора X (S.D. Forman, 1986);

3. Значение в системе (1) составляет

1110 Ы • С , что близко к предельному теоретическому значению этого соотношения при бимолекулярных взаимодействиях • (0.а Berg, 1985);

4. Теоретически было показано, что степень взаимодействия лиганд - рецептор на поверхности мембран очень незначительно зависит от неспецифического связывания лиганда с его последующей диффузией по поверхности мембраны

(O.e. Berg, 1985). Исследование нами липидов тромбопластина не выявило корреляцию между фазовым состоянием, коэффициентом самодиффузии липидов и гемокоагуляционной активностью препарата тромбопластина.

Схема инактивации тромбопластина, по нашему мнению, может быть из ложна в виде следующего.

Центры связывания фактора VII в структуре тромбопластина из головного мозга человека или нэтиееых мембранах включают в себя белок - апопротеид III и ближайшие слои фосфолипидов. Последние являются продолжением биламеллярной структуры липидов плазматических мембран. Апопротеид III индуцирует такую ориентации липидов вокруг себя, что при этом возникает специфическое распределение зарядов, которое в присутствии

V

Са2+ является конгруентным к фактору VII. Этот участок мембраны приобретает сродство к фактору VII . При инактнви-рующем воздействии, независимо от его характера, нарушается нативное взаимодействие апопротеида III и пограничных

липидов. При этом нарушается индуцированная ориентация липидов и происходит разрушение- центра связывания фактора VII. Конечным итогом всех этих процессов является снижение гемокоагуляционной активности тромбопластина.

Для инактивации тканевого тромбопластина в условиях :п vivo мы остановили свой выбор на ДМСО , т. к. использование остальных реагентов было ограниченно рядом нежелательных побочных эффектов.

ДМЗО отличается от остальных агентов, кроме глицерина, ингибирующих тромбопластин, и механизмом инактивации. Во-первых, его влияние 7 на мембраны носит обратимый характер (R. L Neulieb, 1990). Во-вторых, ДМСО увеличивает гидрофобность именно белкового компонента мембран (J.P. Miletich, 1978).

Наиболее значительные изменения при добавлении ДЖО к мембранам происходят на границе белково-липидных контактов ( 0. L Нардид, 1989). Влияние ДМСО на мембраны относится, по-видимому, к тому типу воздействия на белок-липидные взаимодействия, когда изменяется не только латеральная и ротационная подвижность белков, но также и степень экспонирования белков из толил липидов в водную фазу (U. Kralisz, 1984). Белок при этом фактически погружается в толщу липидного бислоя. Наш: данные по 23Ма-ШР косвенно подтверждают это, ~ т.к. в случае применения ДМСО во всём диапазоне концентраций добавленного Na имело место слабое связывание ионов Na белковым компонентом с большими временами корреляции.

Схему инактивации тромбопластина ДМСО, по нашему мнению, можно представить следующим образом. Погружение апопротеида III в липидный ма^рикс под действием ДМСО уменьшает

влияние апопротеида III на пограничные липиды - нарушается индуцированная ориентация липидов. При этом снижается сродство этого участка мембраны к фактору VII, что и приводит к торможению тромбопласгической реакции.

3 результате проведённого анализа литературных сведений и собственных данных были выработаны требования к потенциальным лечебным препаратам, которые могли бы использоваться для инактивации тромбопластина in vivo.

Общие свойства потенциальных ингибиторов тромбопластина:. а) лишены токсической, аллергенной и энзиматической активности; б) не должны нарушать биосинтез прокоагулянтов и снижать активность плазменных факторов свёртывающей системы крови. ■

Мембранотропные свойства- а) не должны изменять фазового состояния липидов и нарушать физическую целостность липидного и белкового компонента мембран; б) должны обратимо повышать гидрофобность апопротеида III.

Появление тромбопластической активности в мембране связывают с механическим повреждением. Однако имеется большое количество публикаций (Н. Pr/dz, 1980,1983; R. Lorenzat, 1983; Т. Lyberg, 1984;), в которых показано, что возрастание тромбопластической активности мембранных структур целого ряда клеток, циркулирующих в крови, не связало с их механическим повреждением. Показано, что возмодпо формирование всего протрохсияазного комплекса с участием фактора VII и тканевого тромбопластина на поверхности нормальных неповреждённых клеток ( G.M. Rodgers, 1984). Макрофаги способны синтезировать факторы V, VII, IX, X. протромбин, тромбопластин и секретировать их на свою поверхность (Б. Osterud, 1981).

При этом имеет место активация фактора X непосредственно на поверхности клеток, а сам фактор Ха освобо;кдается в меикле-точное пространство ( В. Osterud, 1980).

Топология центров связывания и активации фактора VII в структуре плазматической мембраны клетки длительное ( время

Г'*1

была предметом экспериментального разрешения. Установлено, что зти центры локализованы преимущественно на наружной поверхности клеток ( D.S. Fair, 1987). Обиаругены единичные клетки, где они расположены исключительно на внутренней поверхности плазматической мембраны ( S.D. Carson, 1990). Степень экспонирования апопротевд III- содержащих центров .на наружную поверхность плазматической мембраны в нативных неповреждённых клетках колеблется ст 100 % до 0 1. . Соответственно степень увеличения громбопластической активности клеток при их механическом разрушении колеблэтся от О.до 62 раз (Т.A. Drake, 1989).

По нашим данным, само по себе, механическое повреждение тканей не обязательно приводит к изменению биологической активности комплекса ашпротеид III - фосфолипиды плазматических мембран клеток. Критическим фактором определяющим увеличение тромбопластической активности мембраны при ее механическом поврендении является не столько изменение динамических характеристик лшидаого и белкового койпронента мембран, сколько увеличение числа контактирующих с плазмой крови центров связывания и акгизацйи-ййстора VII.

В H ВОДЫ

1. Активность 5'-НК, содержанке. ц-АМФ, ЭПР-' регистрируемых парамагнитных центров, величина коэффициента церулоплазмин / трансфферин и значения времён ЯМР-1Н (Г1.Т2) релаксации в крови отражают степень деструкции тканей в

организме человека.

2. Определение активности 5'-Ж, содержания ц-АШ> в крови позволяет контролировать эффективность проводимой терапии. Для каждого пациента необходимо создание информационной базы ' данных биохимических тестов

с целью их сопоставления в ходе последующего

обследования.

3. Свёртывание крози и отлокзние фибрина в тканях возможно и без повреящения ¡меток. Инициирующим моментом этого процесса является увеличение проницаемости стенок сосудов й контакт плазмы с поверхностью клеток, расположенных экстраваскулярно. Тромбопластическая активность фрагментов мембран может ингибироваться натквными компонентами тканей.

4. После механической гомогенизации и . экстракции холестерина из препарата головного мозга человека фэсфолипиды клеточных мембран реорганизуются в гексагональную Н^ лиотропную мезофазу, возрастает подвижность хирнокислотных радикалов и самодиффузия части липидов, что коррелирует с увеличением тромбопластической активности.

5. Препарат тканевого тромбопластина из головного мозга человека состоит из конгломератов липопротеидных комплексов, где сохранены лишь единичные мембраяолодобнке структуры. Сосфолипидный компонент организован преимущественно в гексагональную Н^ лиотропную мезофазу. Белковый компонент существенно влияет как на фазовое состояние липидов, так и на динамические свойства их жирнокислотных радикалов. В структуре тромбопластина, во временной шкале ЯМР-1Н релаксации (при 310 К, Л^.-бО МГЦ) имеются три группы динамически однородных молекул: 1) свободные липиды, не

контактирующие с белками (Т*^ 1100 АХ -40 9

Р с^ 0,4, О — 4-10 м/с); 2) белки с иммобилизованными липидами и липиды с жестким каркасом молекулы

5.-0,4); 3) липиды с промежуточными характеристиками

С I

(Т^-бСуЙз, 1^—0,2, 1^7,4x10 м /с).

6. Тепловое воздействие на тканевой троыбопластин. нарушает гексагональную^ (Н^) форму упаковки липидов, вызывает денатурацию белкового компонента, уменьшает подвижность молекулярных сегментов липидов, увеличивает диффузию липидов.

7. Прогеолитическое воздействие (папайн, трипсин) на тканевой тромбопластин снижает тепловую фазовую устойчивость липидов, ограничивает подвижность их жирнокислотных радикалов, изменяет конформацию белкового компонента, экспонированного на поверхность, и вызывает разрыхление препарата тромбопластина.

8.' Инкубация тромбопластина при рН=2,0 и 10,0 полностью нарушает гексагональную (Н^,) форму упаковки липидов, и иммобилизует фосфорсодержащие группы, жирнокислотные радикалы и увеличивает диффузии липидов. - При рК-2,0 изменяется конформация белкового компонента, а при рН=10,0 имеет место кластеризация структуры троибопластина, на молекулярные домены с большей и меньшей подвикностыо.

9. В реорганизацию троибопласткна под влиянием глицерина, дкметилсульфоксида, ' глюгаральдегида вовлечены • процессы, отличанэдиеся от фазовых переходов . липидов: сохраняется гексагональная (IIформа упаковки липидов, ограничивается подвижность зирногаслотных радикалов (в присутствии глицерина и диметклсульфоксида), уменьшается

диффузия лйпидог, изменяется нонформация белкового компонента.

10.Ионы кальция взаимодействуют как с белковым, так и с фосфолипчдньш компонентами тканевого троыбопластина; . не изменяют форму упаковки фосфолипидов, однако сникаит подвижность фосфорсодержащих групп и яирнонислотзых радикалов

ЛИПИДОЕ.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Байкеев Р.Ф., Зинин В.Н., Ильясов A.B. Исследование взаимодействия криопротекторог биологических иеыбран и Са~'1"

с тканевым троибоп ласти но;: методом ЕМР-31Р // УП республиканская конференция молодых учёнкх-химакоз.. Часть I. Биоорганическая и органическая химия: Тез. докл. -май, 1987.. Таллин, 1987. - С. 102-102.

2. Байкеев Р.Ф., Зубэяроз Д.¡2., Ильясов A.B. Исследование липопрстеинов голозкого ыозгг человека иетодо;» ЯУР-^Р и 1К использованием сдвигающего реагента /JV^V // X Всесоюзная конференция по биозшии нервной системы "Фундаментальные достикеяия нейрохииии - медицине". Тез. докл. - сентябрь 1987, Горький, 1987. - С. Г72-Г72.

3. Байкеез Р.Ф., Черног А.Н. Фторогэн как гидрофобный зонд при исследовании тканевого тзоибопластина методой ЯИР-^F. //Республиканская научно-практическая конференция иолодих учёных "Фвзиво-хииические иетоды исследования в области хинин, Физика, биологик, ^здипи.чы и народной хозяйства": Тез. докл. - декабрь 1957, Казань, 1987. - С. 177-177.

А. Байкеен Р.Ф., Чернов А.Н., Ильясоз A.B. Влияние <гторотанг на шаговое состояние йос£олипидов биологических меыбран

//Всесоюзная конференция "Приыенекие магнитного резонанса е народное хозяйстве". Честь II.:"Тез. докл. - 22-24 июня 1988, Казань. -'Каззяь. - 1988. - С. «НЮ.

5. БаПкеев Р.Ф. Тканевой трокбопластин // Казанский над. е.-1988. - Т. 6S. - С. 376-378.

6. Байкеев Р.Ф., Чернов А.Н., Ильясоз A.B. Иодель тканевого трсибопластана // Укр. биохим. к. - 1988. - Т. 60. - №6.-С. 3-9.

7. Байкеев Р.Ф., Чернов А.Н., Ильясов A.B. Тканевой троибоплас-тин головного ыозга человека // Укр. биохиы. к. - 1989. -

Т. 61. - К. - С. 14-22.

8. Байкеев Р.Ф., Зинин в_н> ^ йльясое A.B. К вопросу об анти-троыбопластпчёско;: действии криопротектороь биологических мембран// Криобиология. - 19С5.-Й4. - С. 52-54.

9. Байкеев P.C., Iai-.руялина В.Р., ЗиятдинозК.Ы., Мазитова Ф.М., Мавлгатова ?.й. Измерение времени ЯМР-*Н релаксации сыворотки нроБИ как метод лабораторной диагностики // Лаб. дело.-

1990. - »22. - С. 17-19.

10. Байкеев Р.Ф. Тканезой трочбопластин // Всесоюзная конференция "Оазиология и патология гемостаза": Тез. докл. - Полтава. -

1991. - С. 26-26.

11. Байкеев Р.Ф., Азанчеев _H.11. Тепловая инактивация тканевого тромбопластина // Укр.' биохим. е. 1991 . - Т. 64. - 1Ы, -С. 10-16.

12. Байкеев P.O., Зиятдиноз K.M., Абдулхабиров H.A., Демидова Н.Г. Показатели деструкции ткзней при лечении костно-суставного туберкулёза// Юбилейная конференция, посещённая 60-летию Узбекского НИИ фтизиатрии и пульмонологии : Тез. докл. -Ташкент. - 1992. - С. 201-203.

13. Байкеев Р.Ф., Зиятдияс1) K..U., Ахмадеев И.Р., Рахызева Г.Т.. Демидова Н.Г. Диагностика деструктивного процесса при легочное и костно-сустзвно;.: туберкулёзе// Пробл. туб,-1992. - й II-I2; - С. 28-31.'

14. Байнеев Р.Ф., Дыплаков Д.З., Бубякин А.Н., Хейруллияа В.Р.. 1л5зитога Ф.Ы., Цыалакоза A.B. Трокбоплэстпческая активность нормальных и опухолевых тканей человека//' Геыатология и трансфузиопогия. - 1993 . - принято в печать.

15. Байнеев P.î>., Азанчеев Н.Ы., Бубякия А.Н. Деструкция тканей и инициация внешнего пути гемостаза // Гематология и трансфузиология. - 1993. - принято в печать.

16. Байнеев Р.Ф., Хайруллкнз В.Р., Ахыетзянов Ф.Ш., Маэитова Ф.М., Демидова Н.Г., Ахмадеев И.А. Андреев Н.К., Зэрипов И.Р., Хасанов Р.Ф., Каримова Ф.Г. Маркёры деструкции тканей // Лзб. дело. - 1993. -лр:;яято в печать.

17. Гииатдияов P.C., Байнеев Р.Ф., Щеглова Е.Г. Проницаемость ызмбран лейкоцитов по данный ШР с импульсным градиентом магнитного поля// Республиканская научно-практическая конференция молодых учёных "Физико-химические методы исследования в области химии, физики, биологии, медицины и народном хозяйстве": Тез. докл.-декэбрь 1987, Казань, 1987. - С. 177-177.

18. Гиыатдинов P.C., Байнеев Р.Ф., Петров C.B. ЯМР-релакса-ция и самодиффузия s лейкоцитах // Всесоюзная конференция "Применение магнитного резонанса в народном хозяйстве". Чазть II.: Тез. докл.- 22-2^ июня 1988, Казань. - Казань. - 1983. - С. 39-39.

19. Зиятдкное K.U., Байкеев Р.Ф. Диагностическое значение -определения активности 5-яуклеот;:дэзы в плазие больных туберкуле so;.: - Рукопись депонг.р. г НЭДКИ//Пробл. туберкулёза. - 1990. - лЗо.

20. Зиятдинов К. 11., БаПнеев Р.Ф. Активность 5-нуклеотндазы

• в крохи как показатель процесса деструкции при туС^рку-лёзной инфекции // Казанский мед. ж. - 1990. - Е5. -С. 359-362.

21. Зубзиров Д.М., Тимербаег Б.Н., БаПкеев Р.Ф., Киселёв С.В., Попова Л.Г., Соболева И.В., Ченборисова Г.Ш., Киршин С.В. Исследование внешнего пути свёртывания крови // Биохимия животных и человека. 1989. - Вып. 13. - С. 1-10.

22. Зубаиров Д.15., Байнеев. Р.Ф* Определенйе активности тканевого троибопластина i клетках крови, и тканей //■ Лаб. дело.

- 1991. - Ё 12. - С. 25-28.

25. Зубаиров Д.U., -Байке ез Р.Ф. Метод определения активности тканевого троыболлэстина // Клизико-лабораторнак диагностика предтраибоза и тромботйчесних состояний. Сборник научных трудов. Отв. ред.Л.П. Папаян. - Санкт-Петербург, 1991.

- С. 84-87.

24. Ченборисова Г.Ш., Байнезв Р.Ф.., Субханкулова Ф.Б., Зубаиров Д.И. Влияние1 химических модификаций белковой чзстн тромбоплэстина на его. биологическую активность // Механизмы регуляции гемостаза на-уровне молекулярных взаимодействий. Отв. ред. А.Ш.-Бшевовий.т Свердловск,'1988. - С. 50-55.

25. Eaykeev. R.F., Кхелсют А.1Г.', Kadirov М.К., Ilycsov АЛ. Cell's death an<T initiation of the external, coagulatins system of hlood plesma // Abstracts of lectures of the international

" conference "Cellular pathology and pharmacology". 18-20 July, 1988., 3udapest,-- 1Э8Б. - P. 48-48.

J

26. Baykeev R.F., Chernov A.N., llyasov O.V. Three- dimentional structure of human tissue factor according to electron microscopy and in, 19F, 31P-NMR // Abstracts of XXIV-th Congress Ampere on magnetic resonance and related phenomena. September, 1988, Poznan.' - 198B. - D.~ 1.

27. Baykeev R.F., Chernov A.N., Subhankulova F.B., Ismaev I.E., ICarimova F.B», Ilyasov A.V. Inactivation of thromboplastin in vitro and in vivo // Abstracts of 19-th meeting of the FEBS. July 2-7, Rome, 1989.

2B. Baykeev R.F., Chernov A.N. , Azancfieev N.M. , Ilyasov A.V;

Thermal inactivation of thromboplastin according to 1H, 31P -NMR. // Abstracts of 9-th specialized collogue Ampere " Magnetic resonance in polymers." Prague, July 10-13, 1989.

- P. 20 (1).

29. Baykeev R.F., Chernov A.N., Ismaev I.E., Ilyasov A.V. Chemical inactivation of thromboplastin according to 23Na, 31P-NMR. // Abstracts of X-th meeting of International society of magnetic resonance. Morzine. France, July 16-21, 1989. - P. 10-li.

30. Baykeev R.F., Chernov A.N., Azancheev N.M., Ismaev I.E., Ilyasov A1V. Proteolytic inactivation of thromboplastin from the human brain according to 1H, 23Na, 31P-NMR. // Abstracts of XlX-th European congress on molecular spectroscopy. Drezden. September 4-8, 1969. - P. 142 - P. 171-172.

31. Baykeev R.F., Chernov A.N., Ismaev I.E., Ilyasov A.V. Chemical inactivation of thromboplastin according to 23Na, 31P-NMR. // Bull. Magn. Resonan. - 1<?90. - V. 12. - N. 1-2. -P. 104-104. - '-!

32. Baykeev R.F., Azancheev N.M. , Chernov A.N., Gimatdinov R.S., Bibyakin A.N. Membrane destruction and blood coagulation. // Abstracts of 20-th meeting of the FEBS, Budapest, Hungary, August 19-24. - 1990. - No. 506. - P. 107-107.

33. Filippov fl.v., Baykeev R.F. Self diffusion of lecithin in the ether—watei—lecithin dispersions. II Zbornic prednasok., FYZIKA. VI, Vedecka Conferencia elektrotechnickej fukulty s medzinarodnou ucastou. Kosice, 1992. - S, 209-215.

34. Gimatdinov R.S., Baykeev R.F. Permeability of cell plasma membranes as studied by pulsed magnetic field gradient NMR. // Abstracts of XXIV-th Congress A.npere on magnetic resonance and related phenomena. September, 1908, Poznan. - D. - 6.

35. Gimatdinov R.S., Filippov V.A., Baykeev R.F. Diffusion of the proteins as studied by pulsed field gradient NMR. // Abstracts of 9-th specialized collogue Ampere " Magnetic resonance in polymers." Prague, July 10-13, 19B9. - P. 95.1-2

36. Gimatdinov R.S., Baykeev R.F., Filippov A.V. Lateral diffusion of the plasmatic membrane lipids and proteins as studied by pulsed field gradient NMR. // Abstracts of the xix-th European congress on molecular spectroscopy. Dresden. September 4-S, 1989. - P. 147. - P. 174-174.

37. Ziyatdinov K.M., Baykeev R.F. Biochemical indices of tissue destruction in tuberculosis. // Abstracts of 20~th meeting of the FEBS, Budapest, Hungary, August 19-24,'1990. - P. Tuo: 72. - P. 141-141.

38. Zubairov D.M.. Baykeev R.F., Kirshin S.V., Kisilev S.V., Popova L.G., Soboleva I.V., Tiroerbaev V.N., Chenborisova G.Ch. Study of the biochemical and physiological mechanisms of blood coagulation via the extrinsic pathway. // Hematology reviews. Biochemical mechanisms of the-system regulating the aggregate state of blood. - 1989. - V. 3. - Part 1. - P. 9 -25.