Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Природа и свойства надмолекулярных частиц, циркулирующих в кровотоке, их роль в поддержании гемостатического потенциала
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Природа и свойства надмолекулярных частиц, циркулирующих в кровотоке, их роль в поддержании гемостатического потенциала"

РГи Ой

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ГАЛЕНКО ОЛЕГ ВАЛЕРИЕВИЧ

УДК 612.115:612.617.7+612.386

ПРИРОДА И СВОЙСТВА НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЧАСТИЦ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В КРОВОТОКЕ, ИХ РОЛЬ В ПОДДЕРЖАНИИ ГЕМОСТАТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА

03. 00. 04 - Биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 1993

Работа выполнена в Тюменском Государственном медицинском институте

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ доктор медицинских наук, профессор А.Ш.Бышевский

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ доктор медицинских наук, профессор Б.И.Кузник доктор биологических наук, профессор В.Е.Рябинин

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ Санкт-Петербургский НИИ Гематологии и Переливания крови

Защита состоится "_"_ 1993 г. в _ часов

на заседании специализированного Ученого Совета Д-084.04.01 при Челябинском Государственном медицинском институте (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинского Государственного медицинского института

Автореферат разослан "_"_ 1993 г.

Ученый секретерь специализированного Ученого Совета кандидат медицинских наук, доцент Л.В.Кривохижина

Актуальность проблемы. При центрифугировании коагуляци-онная активность плазмы в верхних слоях падает и повышается в нижних /Gaertner, 1960/. Это объясняли флотацией антикоагулянтов с низкой плотностью. Более вероятным связывать повышение свертывающей активности нижних уровней центрифугируемой плазмы с седиментацией циркулирующих в крови надмолекулярных частиц (НМЧ), источник которых - физиологическая деградация форменных элементов и клеток эндотелия. Это предположение основано на следующем: 1) тканевой тромбопластин -липопротеид, представленный фрагментами клеточных мембран /Д.М.Зубаиров, 1982; Hvatum, Prydz, 1966/; 2) можно освободить биологическую жидкость от активности тромбопластина ультрафильтрацией /Д.Н. Зубаиров и др., 1969/; 3) показано, что тромбопластическая активность изменяется под действием вазоактивных веществ /В.П.Скипетров, Б.И.Кузник, 1973/, при изменении проницаемости сосудов /Б.И.Кузник и др., 1989; Zaugg, 1980/, при механических /Б.Г.Лукьянец, 1983/, термических /В.С.Соловьев, 1983/ и химических /Вгох е.а., 1984/ повреждениях, а также при воспалении /Edgington е.а., 1987/.

Сопоставляя эти данные с указаниями на возможность изменить свертывающую активность плазмы под действием ускорения, обеспечивающего седиментацию НМЧ, без повреждения биомолекул /Хэм, Кормак, 1982/, мы предположили, что в плазме крови имеются коагулоактивные частицы.

Принимая во внимание участие фрагментов клеточных мембран (ФКМ) эритроцитов, тромбоцитов и лимфоцитов в свертывании по внутреннему пути /Hemker е.а., 1983/ и, особенно, по внешнему (фрагменты плазматических мембран мононуклеаров и клеток эндотелия сосудов) /Д.М.Зубаиров, 1978/, непрерывность их появления в кровотоке, связанная с непрерывной физиологичес-

кой деградацией клеток, можно допустить, что они участвуют в поддержании гемостатического потенциала крови и формировании гемокоагуляционных сдвигов, связанных с ускоренным разрушением клеток и (или) проникновением ФКМ из экстравазального пространства в кровоток.

Представляет интерес также изучение роли ФКМ в формировании гемокоагуляционной активности гомогенатов тканей. Чаще о свертывающей активности тканей судят по влиянию гомогенатов, лишь частично освобожденных от грубых частиц, на время свертывания цельной плазмы /А.В.Люлько и др., 1984/ или плазм с дефицитом факторов свертывания /С.П.Голышенков, 1982/.

Тромбогеморрагические осложнения при патологических состояниях, особенно при травмирующих операциях, обоснованно связывают с тромбопластинемией и последующим ускорением непрерывно протекающего диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови /Б.И.Кузник и др., 1983; 3.С.Баркаган, 1988; М.Ферстрате, Ж.Фермилен, 1986/. Все сказанное определило направление исследований.

Цель работы: охарактеризовать природу и коагуляционные свойства циркулирующих в крови надмолекулярных частиц, их участие в поддержании гемостатического потенциала и в возникновении гемокоагуляционных сдвигов.

Задачи исследования: 1. Изучить гемокоагуляционную активность плазмы, освобожденной от НМЧ. 2. Разработать способ количественной оценки их коагуляционной активности. 3. Охарактеризовать гемокоагуляционную активность НМЧ. 4. Изучить гемокоагуляционную активность НМЧ в крови разных регионов кровотока. 5. Изучить геиокоагуляционные свойства ФКМ из разных органов, их циркуляцию в кровотоке, и антигепариновую активность.

В процессе работы возник интерес к изучению влияния комплекса антиоксидантов на активность неполного и тканевого тромбопластинов внутренних органов, эритроцитов и НМЧ частиц плазмы крови.

Научная новизна: Впервые установлено, что в кровотоке циркулируют НМЧ - ФКМ, которым свойственна активность тканевого и неполного тромбопластинов, что коагуляционная активность гомогенатов большинства тканей животных и человека обусловлена преимущественно этими частицами и что их гемоко-агуляционная активность представлена тканевым и неполным тромбопластинами.

Впервые показано, что продолжительность циркуляции НМЧ в кровотоке определяется их происхождением. НМЧ из плазмы крови и гомогенатов тканей разных органов проявляют^антигепари-новую активность, реализующуюся путем связывания гепарина на их поверхности.

Практическая ценность работы: 1. Предложен способ получения "тромбопластиндефицитной" плазмы. 2. Разработан способ освобождения плазмы от гепарина (авторское свидетельство N 1371208 от 1 октября 1987 г).

Апробация работы: Основные положения работы доложены на конференциях: "Актуальные вопросы теоретической и практической медицины" /Тюмень, 1983, 1985, 1988/, "Некоторые вопросы клинической и экспериментальной гемокоагулологии" /Тюмень, 1984/, научно-технической конференции по химии и химической технологии /Тюмень, 1985/, "Компенсаторно-приспособительные механизмы внутренних органов и головного мозга в норме, патологии и эксперименте" /Тюмень, 1984/, "Актуальные проблемы фармации" /Тюмень, 1985/, на конференции молодых ученых по проблемам химизации основных отраслей народного хозяйства

Тюменской области /Тюмень, 1986/, "Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике" /Москва, 1987/, "Механизмы регуляции гемостаза на уровне молекулярных взаимодействий" /Свердловск, 1988/, "Актуальные проблемы фармации Западной Сибири и Урала" /Свердловск, 1989/.

Публикации: Материалы работы опубликованы в журнале "Гематология и трансфузиология", "Украинском биохимическом журнале", в трудах и сборниках вышеназванных конференций.

Положения. выносимые на защиту:

1. Циркулирующие в крови надмолекулярные частицы - обломки клеточных мембран - участвуют в поддержании гемокоагуля-ционного потенциала в норме и могут являться фактором, обусловливающим гиперкоагулемию при экстремальных воздействиях.

2. С присутствием надмолекулярных частиц связана мозаич-носгь гемокоагуляционного потенциала.

3. Оценка свертывающей активности тканевых экстрактов может производиться только после полного удаления надмолекулярных частиц.

Структура и объем работы. Диссертация представлена на 150 страницах машинописного текста, содержит 9 рисунков, 29 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы (97 отечественных и 112 иностранных источников).

Материалы и методы исследований. В работе использовали кровь здоровых доноров (120 человек) и экспериментальных животных (900 белых крыс), стабилизировали ее 3,8% раствором натрия цитрата (1:9 или 1:4 в зависимости от задачи). Плазму отделяли центрифугированием (1 ООО g, 15 мин). Для получения плазмы с малым содержанием тромбоцитов повторно центрифугировали (1 500 g, 20 мин). Для удаления НМЧ плазму с малым

содержанием тромбоцитов центрифугировали с ускорениями от 25 ООО до 150 ООО g в течение 20-60 мин в зависимости от задачи исследования. Все болезненные манипуляции на животных выполняли в условиях эфирного наркоза. Кровь отбирали из яремной вены, а в части опытов - из бедренной артерии, бедренной вены,сонной артерии, передней и задней полой вены. Инъекции производили в яремную вену или левый желудочек сердца.

Ткани гомогенизировали с .0,14 И раствором натрия хлорида в стеклянном гомогенизаторе (1 500 об/мин, 10 мин). Кашицу, освобожденную от грубых частиц центрифугированием (300 g, 10 мин), рассматривали в качестве гомогената. Гомогенат центрифугировали при ускорении 150 000 g, 40 мин. Супернатанг сохраняли для исследований, осадок, полученный при ультрацентрифугировании, дважды отмывали 0,14 М раствором натрия хлорида, повторяя скоростное центрифугирование, и ресуспендиро-вали в исходном объеме 0,14 М раствора NaCl.

Для оценки свертывающей активности исследуемых материалов определяли: 1. Время рекальцификации нормальной плазмы. 2. Активированное время рекальцификации. 3. Частичное тромбоп-ластиновое время плазмы. 4.Тромбиновое время. 5. Тромбоплас-тиновое время /Г.Н.Детинкина и др., 1984/.

При оценке коагуляционных свойств НМЧ применяли методы определения активности факторов V,VII,VIII,IX и X, факторов контактной фазы /В.П.Балуда и др., 1980; З.С.Баркаган,1988/.

В качестве модельных систем использовали нормальную, бес-тромбоцитную и освобожденную от надмолекулярных частиц плазму, а также плазмы с дефицитом фактора V ("старая плазма"), факторов VII и X, факторов II, VII, IX и X (сорбированная бария сульфатом) /В.П.Балуда и др., 1980/. Кроме того, использовали 0,2% раствор фибриногена, препараты бычьего прот-

ромбина, факторов X и VII, суммарный препарат факторов II, VII, IX и X. Для определения активности факторов IX и VIII использованы плазмы больных с гемофилией А (фактор VIII-де-фицитная плазма) и с гемофилией В (фактор 1Х-дефицитная плазма).

Изучая циркуляцию в кровотоке тканевого тромбопластина, полученного из разных органов, последний выделяли следующим образом: навеску сырой ткани (1,0 г на 10 мл 0,14 М раствора натрия хлорида) измельчали в стеклянном гомогенизаторе (3000 об/мин, 5 мин). Гомогенат центрифугировали с ускорением 2 000 g, 20 мин. Надосадок отбрасывали, осадок трижды отмывали в 0,14 М растворе NaCl (освобождение от растворимых примесей). В данном случае исходили из представлений о тканевом тромбопластине как надмолекулярном образовании, представляющем собой ФКМ /Д.М.Зубаиров и др., 1969; Д.М.Зубаиров, 1978,1982/. Включение в препараты тромбопластина и гепарина радиометки осуществляли по В.Н.Родионову, Ю.П.Решетко /1968/ в нашей модификации.

В работе использовали тромбин, фибриноген, тромбопластин (Каунас), эритрофосфатид (Минск), гепарин ("Spofa"), витамины к, Е, С и Р, (1311]-калия йодид ("Изотоп"), Сефадекс G-200("Pharmacia"), Акрилекс Р-60 ("Reanal"). Приборы: высокоэффективный жидкостный хроматограф "Милихром-1" (СССР), спектрофотометрическая аппаратура, ' центрифуги 1-23, Т-24, К-23, ультрацентрифуга VAC-601 (Германия), гомогенизаторы тканей, приборы для термостатирования, комплекс радиометрической аппаратуры.

Все данные подвергали математической обработке методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений.

Гемокоагуляционные свойства плазмы после скоростного цен-

тшфугирования. В одном из опытов кровь здоровых доноров, стабилизированную 3,8% раствором натрия цитрата (1:4), освобождали от основной массы клеток центрифугированием (1 OOOg, 10 мин), затем - от тромбоцитов (1 500 g, 20 мин). Полученную "бестромбоцитную" плазму центрифугировали, изменяя ускорение и продолжительность. Обнаружилось, что нормальная плазма свертывается при рекальцификации за 124±5 с, бестром-боцитная - за 244+6 с, после центрифугирования с ускорением 10 000 g (20 мин) - за 360+9 с. Последующее центрифугирование (50 000 g, 20 мин) увеличило время рекальцификации до 470±15 с, а с ускорением 100 000 g (20 мин) - до 587±21 с.

В другом случае пулированную плазму крыс центрифугировали с ускорением 120 000 g 10, 20 и 40 мин, отбирая пробы на каждом этапе на уровне верхней, средней и нижней^третей патрона. Свертывающая активность плазмы из верхней трети убывала с наибольшей скоростью - время рекальцификации удлинилось за 10, 20 и 40 мин в 1,5, 1,7 и в 1,9 раза, из средней трети - в 1,4, 1,5 и в 1,53 раза. В нижней трети патрона свертывающая активность плазмы практически не изменялась.

Следовательно, изменение общей свертывающей активности плазмы обусловлено перемещением коагулоактивных элементов под влиянием центробежной силы. Скорость смещения зависит от интенсивности и продолжительности центрифугирования.

Чтобы исключить связь изменений с инактивацией прокоагу-лянтов при центрифугировании провели ряд опытов с пулирован-ной донорской плазмой, освобожденной от форменных элементов крови, тромбоцитов, а затем центрифугированной с ускорением 150 000 g (40 мин). Эту плазму вносили в системы, позволяющие оценивать содержание в ней факторов V, VII+X, II+VII+IX+ X, VIII и I, а также факторов контактной фазы и факторов

фибринолиза. Оказалось, что снижение общей свертывающей активности плазмы после центрифугирования, обеспечивающего седиментацию надмолекулярных образований, но не осаждающего макромолекул /Б.Уильяме, К.Уильсон, 1978/, не связано с инактивацией изученных плазмокоагуляции или фибринолиза. Следовательно, снижение свертываемости плазмы вызвано седиментацией надмолекулярных частиц.

Гемокоагуляиионная активность НМЧ. взвешенных в плазме. Пулированную плазму доноров освободили от эритроцитов и лейкоцитов, затем от тромбоцитов и центрифугировали с ускорением 120 ООО £ (40 мин). Плазму декантировали, а осадки в каждом центрифужном патроне суспендировали в 0,14 М растворе КаС1 и повторно осадили, а затем ресуспендировали в исходном объеме. Скоростное центрифугирование бестромбоцитной плазмы удлиняет время рекальцификации с 227±6,2 до 589±21,2 с, возвращение в плазму взвеси НМЧ его восстанавливает. Степень восстановления линейно зависит от количества возвращенного осадка. Далее, оказалось, что можно подобрать таное количество коммерческого препарата тромбопластина, добавление которого в плазму восстановит свойственное ей до центрифугирования время рекальцификации. При этом выявилось, что плазма, освобожденная от взвешенных частиц становится как бы плазмой с их дефицитом - реагирует на внесение взвеси коммерческого тромбопластина до 0,000 000 4 мг против 0,000 006 мг на пробу, т.е. в 15 раз более "чувствительна".

Приведенные в табл. 1 данные свидетельствуют о связи между НМЧ, циркулирующими в кровотоке, и свертывающей активностью крови: 1) с увеличением интенсивности центрифугирования время рекальцификации удлиняется, 2) снижение свертывающей активности компенсируется добавлением достаточного коли-

чества взвеси коммерческого препарата тромбопластина, который кроме НМЧ (ФКМ) никаких других факторов свертывания крови не содержит, 3) тромбин вызывает свертывание плазмы с одинаковой скоростью при разной интенсивности центрифугирования.

Таблица 1

Влияние интенсивности центрифугирования на время рекальцифи-кации, тромбопластиновое и тромбиновое время плазмы человека

Плазма получена при Время рекаль- Тромбопласти- Тромбиновое центрифугировании с цификации, с новое время,с время, с ускорением: I II I II

1 000 g (отделены

эритроциты и

лейкоциты) 149: ►5,6 72i :1,9 72: ►0,9 29±1,0 45+2

1 500 g (бестром- :

боцитная плазма) 244: ►6,4 90i :4,9 91: ►5,3 28±1,0 43+1

10 000 g 360: ►9,0 107+11 95: ►4,3 29±1,1 42+1

50 000 g 470: ► 15 130i :10 94: ►4,4 30+0,9 44+1

100 000 g 587: ►29 129±13 89: ►2,9 30±2,0 45+6

200 000 g 673: ► 32 1351 :12 94: ►3,7 •30+2,3 44+4

Примечание: знаки I и II - внесено в пробу тромбопластина 0,000 1 и 0,01 мг соответственно и тромбина 0,01 и 0,1 мг соответственно.

Многократное скоростное центрифугирование с последующим возвращением осадка в плазму не изменяет свойств плазмы и осадка.

Результаты описанных экспериментов позволяют заключить, что взвешенные в плазме крови НМЧ участвуют в поддержании ее гемостатического потенциала и их удаление ведет к снижению свертывающей активности, не связанному с изменением содержания или активности фф. I, II, V, VII, VIII, IX, X, факторов контактной фазы, антитромбиновой активности и не изменяет состояние фибринолиза.

Механизм влияния НМЧ плазмы на гемокоагуляцию уточняли с помощью дефицитных по отдельным факторам гемокоагуляционных систем.

Удаление НМЧ из сорбированной, дефицитных по ф. V, ф.

VIII плазм и возвращение НМЧ из нормальной плазмы или адекватного количества тканевого тромбопластина не приводило к каким либо изменениям свойств этих плазм.

Активация контактной фазы привела к одинаковому результату в плазме без НМЧ, и в плазме, в которую они были возвращены. Тот не эффект контактная активация проявила и в бест-ромбоцитной плазме: сокращение времени рекальцификации во всех вариантах опыта одинаково (10,9, 13,3 и 10,4%).

Таким образом, НМЧ плазмы крови не компенсируют дефицита прокоагулянтов и не влияют на контактную фазу в модельных гемокоагуляционных системах. Это повышает вероятность того, что НМЧ катализируют свертывание плазмы подобно действию ФКМ или фосфолипидных липосом, т.е. ведут себя либо подобно ф. Р^ или эритрофосфатиду, либо подобно тканевому тромбопласти-ну - ф. III.

Для сопоставления зависимости скорости свертывания плазмы от концентрации НМЧ, тканевого тромбопластина и эритрофосфа-тида приготовили убывающие концентрации взвесей и испытали их в пробе "Тромбопластиновое время" с нормальной плазмой доноров. При увеличении концентрации всех видов частиц свыше определенного предела выявили торможение свертывания. Куполообразные кривые (рис. 1) для всех трех видов частиц указывают на существование концентраций насыщения и концентраций, угнетающих тромбиногенез, что подтверждает сходство механизмов действия.

Те же три вида частиц с одинаковой активностью испытывали

в системе, содержащей ф. I, II, VII, IX, и X при добавлении 2+

Са . Оказалось, что эритрофосфатид на ранних сроках инкубации активирует тромбиногенез слабее, чем полный тромбоплас-тин, который активирует тромбиногенез и по внутреннему и по

внешнему путям.

Н1Н мл

I

0,5

Ч

О

25

50 С, иг/ил

Рис. 1. Зависимость скорости образования тромбина (ордината) при активации протромбинового комплекса разными концентрациями (абсцисса) тканевого тромбопластина-(1), неполного тромбопластина (2) и взвеси НМЧ (3).

Непонятен более сильный эффект НМЧ из плазмы в смеси, продуцирующей тромбин - он сильнее, чем следовало ожидать, исходя из активности этих частиц, определенной в опытах на плазме. Не исключено, что частицы содержат и полный, и неполный тромбопластины - они не конкурируют между собой на стадиях, предшествующих превращению ф. X и Ха,. и поэтому их эффект может взаимоусиливаться. Тканевой и неполный тромбопластины, смешиваемые в разных соотношениях, испытывали в системе, содержащей компоненты протромбинового комплекса и ионы кальция, и выявили оптимальное соотношение.

Три факта ( 1 - агент, активирующий тромбиногенез на фоне насыщающей концентрации эритрофосфатида, реализует эффект через ф. VII; 2 - внесение на пике насыщения (3,75 мг/мл) взвеси НМЧ сокращает время свертывания плазмы; 3 - снижение свертывающей активности плазмы после удаления НМЧ не компен-

сируется неполным тромбопластином) позволяют утверждать, что НМЧ обладают активностью, свойственной тканевому тромбоплас-тину, т.е. способностью активировать ф. VII, и благодаря этому активировать протромбин по внешнему пути (в системе, насыщенной неполным тромбопластином).

Циркулирующие в крови НМЧ - это ФКМ, принадлежащие форменным элементам крови, эндотелиальным клеткам, а, возможно, и клеткам других тканей. При дальнейшем изложении корректнее называть седиментиругацие из плазмы при высоком ускорении частицы ФКМ.

В очередной серии исследований крыс под эфирным наркозом подвергали одному из следующих воздействий: рассечение мышцы бедра, лапаротомия с эвентерацией, погружением и ушиванием брюшной полости, резекция одного рога матки, кро^оизвлечение (30-35% циркулирующей крови), введение околоплодных вод.

После разреза мышцы бедра через 15 мин гемокоагуляционная активность частиц повысилась с 65 до 82%, т.е. на 26%, не отличаясь от контроля в последующем. Лапаротомия вызвала значительные сдвиги коагуляционной активности ФКМ: рост на 41,6, 56,9, 39,7 и 20,7% через 0,25, 0,5, 1 и 2 ч соответственно. Еще более заметный прирост коагуляционной активности ФКМ вызвала резекция рога матки: на 72,4, 84,7, 58,7 и на 20,6% соответственно через 0,25, 0,5, 1 и 2 ч после операции. Самый интенсивный рост активности ФКМ вызвала кровопо-теря: на 143,1, 147,7, 169,8 и 77,8% через 0,25, 0,5, 1 и 2 ч соответственно. Рост гемокоагуляционной активности ФКМ, циркулирующих в кровотоке, пропорционален тяжести повреждающего действия, однако особенно значителен при кровоизвлече-нии, непосредственно сказывающемся на состоянии клеток крови /Д.М.Зубаиров и др., 1969/.

В следующей серии исследовали активность-ФКМ крови крыс из сонной и бедренной артерий, яреиной, задней полой вены и вены бедра.

Оказалось, что свертывающая активность крови артерии ниже, чем оттекающей крови (соответствующие вены) на 15-18%. Гемокоагуляционная активность ФКМ также различна: она выше в венозной крови по сравнению с артериальной кровью, питающей эти же регионы. Это различие сохраняется после лапаротомии.

Следовательно, обломки клеточных мембран формируют моза-ичность гемостатического потенциала и обуславливает активацию свертывания при повреждении тканей.

Кровопотеря (25-30% от ОЦК) активировала свертывание: сокращение времени рекальцификации плазмы через 15 и 30 мин, рост свертывающей активности ФКМ. Через 45 мин активность ФКМ и общая свертывающая активность плазмы крови восстановились. Аналогичные данные получены н при введении дистиллированной воды в кровоток (2,5 мл/100 г массы). По-видимому, частичный гемолиз, сопровождаясь высвобождением ФКМ, способствовал росту общей свертывающей активности.

Приведенные данные свидетельствуют, что ФКМ в значительной мере определяют гемостатический потенциал крови и, в частности, его мозаичность, т.е. неодинаковую свертываемость в разных регионах.

Гемокоагуляпионные свойства ФКМ из разных органов и тканей. Одинаковые по гемокоагуляционной активности взвеси ФКМ из разных органов и околоплодных вод ввели крысам. Через 5 мин определяли свертывающую активность плазмы и НМЧ плазмы. ФКМ из мышцы бедра, легких, околоплодных вод, головного мозга, печени вызывали сокращение времени рекальцификации на 26,6, 22,1, 20,3, 11,9 и на 6,7/4 (венозная кровь). В артери-

альной крови изменения менее выражены, однако ранжировка сохраняется: частицы из мышцы, легких, околоплодных вод, мозга и печени сократили время рекальцификации на 21,0, 19,2, 17,8, 14,1 и на 3,3%.

Приведенные данные указывают на роль малого круга кровообращения в элиминации НМЧ, введенных в венозный кровоток извне: видимо, при прохождении крови через капилляры легких осуществляется извлечение частиц, что снижает их содержание в артериальной крови и ограничивает развитие в ней гиперкоа-гулемии.

Циркуляция ФКМ в кровотоке. В вену вводили взвеси (1 мг/ 100 г) с одинаковым содержанием (на единицу объема) меченых радиоактивным йодом ФКМ. Скорость освобождения крови от введенных в вену ФКМ в зависимости от их происхождения предс-

Рис. 2. Скорость элиминации из кровотока внутривенно введенных ФКИ, меченых радиойодом: из околоплодных вод (1), мышца бедра (2), легких (3), головного мозга (4) и печени (5).. Абсцисса - время после инъекции, мин; ордината - десятичный логарифм концентрации в крови (% от расчетной, принятой -за 100%).

крови медленнее других. Быстрее удаляются частицы из мышечной ткани, однако, медленнее, чем ФКМ из ткани головного мозга и печени. Вначале замедлена элиминация ФКМ из легких, но к концу наблюдения их содержание в крови снижается в той же степени, как и ФКМ других тканей.

Разница между содержанием частиц в венозной и артериальной крови может объясняться способностью легких интенсивно поглощать циркулирующие в крови ФКМ. Через 3 мин после внутривенной инъекции ФКМ разного происхождения максимальной была их концентрация в ткани легкого. Только частицы из околоплодных вод с одинаковой скоростью накапливались в течение первых 3 мин в легочной ткани и в ткани печени.

ФКМ, попадая в кровоток, повышают общую свертывающую активность крови. Это более заметно в венозной крови, т.к. при прохождении через малый круг кровообращения кровь заметно освобождается от суспендированных надмолекулярных частиц.

При введении взвеси ФКМ в левый желудочек (артериальный кровоток) скорость их элиминации из крови близка к найденной после внутривенной инъекции. Однако, максимальное накопление ФКМ обнаружено в печени, затем в почке и легких. Видимо, проникающие в левый желудочек частицы с током крови попадают в первую очередь на периферию, где и задерживаются в паренхиматозных органах с богатой капиллярной сетью.

Таким образом, проникающие в кровоток ФКМ, извлекаются при прохождении крови через капиллярное русло паренхиматозных органов, в первую очередь тех, которые первыми оказываются на их пути - легкие при введении в венозное русло, почки и печень - при введении в артериальное русло.

Антигепариновая активность ФКМ. Раствор гепарина (10 ЕА/ мл в 0,075 М боратном буфере, рН 7,6) инкубировали при 37°С

с навеской тромбопластина и без него, сравнивая после отделения тромбопластина влияние гепарина на время самосборки фибрина. Время самосборки фибрина (контроль - 20,0±0,9 с) составило в присутствии гепарина (10 ЕА/мл в 0,075 М борат-ном буфере, pH 7,6) 51±4 с, в присутствии гепарина, экспонированного с 5 мг/мл тромбопластина, - 20+1,2 с, с 2,5 мг -27,0+0,9 с, с 1,25 мг - 37±2 с и с 0,625 мг - 49+3,4 с. После добавления к гепарину тромбопластина (10 мг/мл) активность антикоагулянта исчезала. Б нативной плазме 20 мг тромбопластина, способные связать, как показывает расчет, около 2 ЕА гепарина, при экспозиции с 0,5 мл плазмы и последующим удалением сокращают ее время рекальцификации на 40%. Чтобы выяснить, обусловлено ли это удалением гепарина, плазму ге-паринизировали, добавляя разные количества антикоагулянта, а затем обрабатывали тромбопластином (40 мг/мл). Экспозиция с тромбопластином сокращает время рекальцификации гепаринизи-рованной плазмы до исходных значений (табл. 2). Следователь-

Таблица 2

Время рекальцификации гепаринизированной плазмы до и после инкубации с тромбопластином, с

Характер опыта Время рекальцификации

Исходная плазма (гепарин не вносили, тромбопластином не обрабатывали) 312±3,5

Исходная плазма после обработки тромбопластином 75±4,9

Плазма с гепарином 0,4 ЕА/мл 0,8 ЕА/мл 1,6 ЕА/мл 3,2 ЕА/мл 139±5,7 167±8,0 202+10,3 416+21,5

Плазма с гепарином, обработанная тромбопластином 0,4 ЕА/мл + 40 мг ТП 0,8 ЕА/мл + 40 мг ТП 1,6 ЕА/мл + 40 мг ТП 3,2 ЕА/мл + 40 мг ТП 69±3,5 . 75±2,0 69±2,8 75+4,9

но, тромбопластин инактивирует и эндогенный, и внесенный из-

вне гепарин.

В эксперименте, меченным ]-гепарином мы установили

что 1 мг тромбопластина устраняет из плазмы 0,094+0,001 ЕА гепарина и что степень снижения радиоактивности совпадает со снижением прогивосвертывающей активности.

На этом основании разработан способ освобождения плазмы от гепарина (авторское свидетельство N 1371208 от 1 октября 1987 г.).

Чтобы выяснить, действительно ли происходит связывание гепарина тромбопластином, радиогепарин преинкубировали с тромбопластином и фильтровали на колонке (Сефадекс 6-200). Число пиков и профиль элюиройания были одинаковы для всех трех проб, отличаясь высотой над осью абсцисс (Рис. 3).

Рис. 3. Гель-фильтрация 2 мл I I]-гепарина (Сефадекс G-200). Ось абсцисс - номера фракций (объем 2 мл), ось ординат - радиоактивность имп/мин на 1 мл элюата. 1 - исходный препарат гепарина, 2 - инкубированный со 150 мг тромбопластина, 3-е 500 мг тромбопластина.

Не объясняется ли участие ФКМ в поддержании гемостатичес-

кого потенциала их антигепариновой активностью? В ряде экспериментов изучали связь между экзогенной и эндогенной (раздавливание мышц бедра) тромбопластинемией и скоростью элиминации гепарина из кровотока, вводя [ I]-гепарин и определяя через 3 и 60 мин радиоактивность крови.

Уже через 3 мин после инъекции содержание гепарина, введенного на фоне тромбопластинемии, снизилось на 18,9%, а к 60 мин - на 31,8%. Следовательно, гепарин при тромбопластинемии уходит из сосудистого русла быстрее, чем в норме, т.е. тромбопластин, покидая сосудистое русло, уносит с собой гепарин. В тоже время тромбопластин, преинкубированный с гепарином и освобожденный затем от него, терял способность вызывать гибель животных и гипокоагулемию потребления при введении в кровоток. Это подтверждает способность тромбопластина связывать на себе гепарин и одновременно указывает, что тромбопластин, фиксировавший на своей поверхности гепарин, теряет коагуляционную активность.

Правомерно допустить, что способность тромбопластина связывать гепарин может увеличивать гемостатический потенциал крови и сокращать продолжительность противосвертывающего эффекта гепарина. Активность тромбопластина при этом снижается, что ограничит потребление прокоагулянтов.

Таким образом, антикоагулянтный эффект гепарина включает не только ингибирование прокоагулянтов, что общеизвестно, но и взаимодействие с циркулирующими ФКН.

Вклад ФКМ 1 гемокоагуляционную активность гомогенатов тканей. В гемокоагулологии традиционный объект исследований - гомогенаты тканей, являющиеся источниками тканевого тромбопластина, ускоряющего активацию протромбина по внешнему пути, что маскирует присутствие других про- и антикоагулян-

тов, находящихся в относительно небольших количествах.

Из полученных нами данных (табл. 3) видно, что свертывающая активность гомогенатов обусловлена преимущественно ФКМ.

Таблица 3

Свертывающая активность гомогенатов, суспендированных осадков и надосадочной жидкости, с. Контроль (время рекальцифи-кации субстратной плазмы) - 364+8,3 с

Активность

Ткань -

гомогената осадка надосадочной жидкости

Печень 61±3,0" 76+2,3" 168±15~

Легкие 36+4,0" 33+2,0" 444+21"

Почки 50±1,6" 58±1,7" 318+11"

Сердце 72±2,4" 81±2,9~ 334±16

Аорта 52+2,6" 55+3,1" 206±13~

Селезенка 85±7,6" 131±15,3" 448±32~

Мозг 41±3,0" 57+4,3" 218±21~

Мышца 76+3,5" 108+5,6" 249±16~

Желудок 1020±25 " 35±2,5" 995±27"

Тонкий кишечник 992±26 " 38±3,0" 824±24"

Толстый кишечник 125+7,6" 34±3,0" 369±10

Примечание: знак """ - достоверно отличающееся значение.

Видимо, при оценке коагуляционных свойств тканей наиболее важно учитывать ее активность, связанную с ФКМ, которые, могут ускорять непрерывно осуществляющийся на низком уровне процесс свертывания. Растворимые компоненты клеток существенного для организма количества коагулянтов не содержат, однако, могут искажать результаты определения активности ФКМ. Методически неверно судить об активности НМЧ по активности гомогенатов. Изучать гемокоагуляционные свойства надо-садков, следует после освобождения от НМЧ. При исследовании тромбопластической активности ФКМ различного происхождения следует освобождаться от растворимых коагулоактивных веществ.

Влияние антиоксидантов на тромбопластическую активность тканей, циркулирующих в крови ФКМ и цельных эритроцитов. Принимая во внимание зависимость интенсивности непрерывного

тромбиногенеза, протекающего в организме на низком уровне /А.Ш.Вышевский, 1984/, от активности неполного и тканевого тромбопластинов, которая, в свою очередь, определяется состоянием клеточных мембран /Д.М.Зубаиров, 1978/ и учитывая влияние экстремальных воздействий на состояние последних, реализующееся через активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ) /У.Прайер, 1979/, можно было ожидать, что применение антиоксидантов окажет ограничивающее влияние на тромбиноге-нез. В качестве антиоксидантов использовали комбинацию витаминов А, Е, С и Р.

Было установлено, что дополнительное введение витаминов снижает тромбопластическую активность эритроцитов на фоне нормы, уменьшая, видимо, их вклад в поддержание гемостати-ческого потенциала. Вместе с тем, витаминизация существенно ослабляет реакцию эритроцитов на тромбинемию. Эффект витаминного комплекса на эритроциты можно связать с его способностью лимитировать интенсивность радикальных процессов и повышать стабильность мембран.

Введение тромбина вместо тромбопластина невитаминизиро-ванным животным увеличило активность тканевого тромбопластина плазмы на 32%, в то время как у витаминизированных животных не вызвало роста тромбопластической активности в плазме.

Таким образом, способность исследуемых витаминов ограничивать гемокоагуляционные сдвиги, вызванные тромбином, может отчасти объясняться изменением реакций клеток-носителей апопротеина III на тромбинемию.

Изучение тромбопластической активности тканей при витаминизации выявило достаточно пеструю картину. Введение витаминов сопровождалось приростом общей тромбопластической активности в печени, почках и легких. В почках и легких это обус-

ловлено увеличением активности тканевого тромбопластина, в печени - неполного. В остальных органах изменения не выходили за пределы ошибки измерения. В ответ на введение тромбина у невитаминизированных животных изменений общей тромбоплас-тической активности не выявилось, в то же время наблюдался прирост активности тканевого тромбопластина в ткани печени, почек и селезенки и снижение - в ткани легких и мышце. У витаминизированных животных, после введения тромбина наблюдали прирост общей тромбопластической активности в ткани мозга и легких (за счет тканевого тромбопластина). В мышечной ткани прирост общей активности можно рассматривать как достаточно высокий, т.к. одновременно в этой ткани наблюдали уменьшение активности тканевого тромбопластина. В тканях селезенки и почки наблюдалось небольшое снижение активности тканевого тромбопластина, не отразившееся на общей тромбопластической активности.

Введение тромбина на фоне витаминов привело к изменениям в большинстве исследуемых органов, причем все они касаются только тканевого тромбопластина. Количественная оценка интенсивности этих сдвигов позволила обнаружить их малую значимость: пределы изменений колеблются от 7,8 до 42,8% относительно контроля и еще в меньшей степени относительно группы животных, которым тромбин вводили без предварительной витаминизации. Можно лишь констатировать, что в результате предварительной витаминизации несколько повышается способность тканей внутренних органов реагировать на тромбинемию изменением активности тканевого тромбопластина.

6. ВЫВОДЫ

1. В плазме крови человека и лабораторных животных присутствуют надмолекулярные частицы, осаждение которых при скоростном центрифугировании сопровождается снижением общей свертывающей активности плазмы в 2-2,5 раза.

2. Надмолекулярные частицы плазмы не компенсируют дефицита факторов плазмокоагуляции II, V, VII, VIII, IX, X и XII, не влияют на контактную фазу свертывания и фибринолиз, обнаруживая свойства неполного и тканевого тромбопластинов, а также способность связывать гепарин.

3. Активность надмолекулярных частиц выше в венозной крови по сравнению с артериальной, их удаление устраняет различия в свертываемости крови, следовательно, частицы обуславливают региональную мозаичность гемостатического потенциала.

4. Надмолекулярные частицы, поступающие в кровь извне, независимо от ткани, из которой происходят, устраняются из венозного кровотока преимущественно легкими, из артериального - преимущественно при прохождении через капиллярную сеть печени. Их гемокоагуляционная активность в кровотоке увеличивается при тромбинемии, что ограничивается предварительным введением витаминов-антиоксидантов.

5. Основной коагулоактивный компонент тканевых гомогена-тов и околоплодных вод - надмолекулярные частицы, в связи с чем для изучения свертывающей активности гомогенатов и биологических жидкостей необходимо отделять частицы, маскирующие влияние других факторов на свертываемость.

СПИСОК

научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Терсенов O.A., Галенко О.В., Мелихова Г.В., Стасенко С.Я., Усольцева В.А. Тромбопластическая активность околоплодных вод и плаценты // "Некоторые вопросы клинической и экспериментальной гемокоагулологии": Сб. трудов. - Тюмень, 1984. - С. 118-121.

2. Терсенов O.A., Платонов Е.В., Галенко О.В. О судьбе маркированного радиойодом фактора III при введении в кровоток // Мат. конф. по хим. и хим. технол.: - Тюмень, 1985. -С. 188-188.

3. Терсенов O.A., Галенко О.В., Платонов Е.В. Циркуляция тромбопластина в кровотоке при внутриартериальном введении // "Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины": Сб. трудов. - Тюмень, 1985. - С. 58-58.

4. Бьшевский А.Ш., Терсенов O.A.., Галенко О.В., Платонов Е.В. Значение надмолекулярных образований, циркулирующих в кровотоке, в поддержании гемостатического потенциала // Ге-

матол. и трансфузиол. - 1985. - К 8. - С. 23-25.

5. Терсенов O.A., Галенко О.В., Платонов Е.В. Активность тромбопластина в различных участках кровообращения // Конф. молодых ученых по пробл. химизации основных отраслей народного хозяйства Тюменской области. - Тюмень, 1986. - С. 111-111.

6. Терсенов O.A., Галенко О.В., Платонов Е.В. Фактор III (тканевой тромбопластин), участие в формировании свертывающего потенциала крови

// "Научно-технический прогресс и здравоохранение Кузбасса": Тез. докл. к XI съезду врачей Кузбасса. - Кемерово, 1986. -Т. II, часть 1. - С. 249-251.

7. Терсенов O.A., Михалева И.В., Галенко О.В., Платонов Е.В., Бышевский А.Ш. Циркуляция экзогенного тромбопластина в кровотоке, роль гепарина // Гематол. и трансфузиол. - 1987.

- N 9. - С. 32-35.

8. Бышевский-А.Ш., Терсенов O.A., Мухачева И.А., Михалева И.В., Галенко О.В., Платонов Е.В. О роли циркулирующего в крови фактора III в регуляции ее агрегатного состояния // Всес. конф.: "Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике": Тез. докл. - М., АНН СССР, 1987. - С. 141-141.

9. Бышевский А.1., Михалева И.В., Галенко О.В., Терсенов O.A. К механизму инактивации гепарина тромбопластином (фактором III) // Укр. биох. журн. - 1987. - Н 4. - С. 3-8.

10. Бышевский А.Ш., Терсенов O.A., Михалева И.В., Шафер В.М., Галенко О.В., Платонов Е.В. Роль циркулирующих в крови обломков клеточных мембран в гемостазе // "Процессы биоэнергетики и структурно-функциональные свойства в норме и в условиях патологии": Сб. трудов. - Саратов. - 1987. - С.11-14.

11. Мухачева И.А., Терсенов O.A., Михалева И.В., Бышевский А.Ш., Галенко О.В. Способ очистки плазмы от гепарина. Авторское свидетельство N 1371208 от 01.10.87 г.

12. Терсенов O.A., Платонов Е.В., Галенко О.В., Бышевский А.Ш. Гемокоагуляционная активность циркулирующих в крови надмолекулярных образований при воздействиях, изменяющих свертывающую активность // Гематол. и трансфузиол. - 19S8. -N 11. - С. 31-34.

13. Платонов Е.В., Галенко О.В. Бестромбопластиновая плазма, некоторые ее свойства // "Механизмы регуляции гемостаза на уровне молекулярных взаимодействий": Сб. трудов. -Свердловск, 1988. - С. 55-59.

14. Галенко О.В., Умутбаева А.К., Платонов Е.В. Активация протромбинового комплекса разными концентрациями фактора III (тканевого тромбопластина) // "Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины": Сб. трудов. - Тюмень, 1988.

- С. 69-69.

15. Терсенов O.A., Платонов Е.В., Галенко О.В., Умутбаева А.К. Активация протромбинового комплекса фактором III различного происхождения // "Актуальные проблемы фармации Западной Сибири и Урала": Сб. трудов. - Свердловск, 1989. - С. 46-49.

16. Бышевский А.Ш., Галян С.Л., Соловьев В.Г., Галенко О.В., Ельдецова С.Н., Шафер В.М. Влияние комбинации витами-

\ нов А, Е, С и Р на гемокоагуляционные свойства эритроцитов и ^Д агрегацию тромбоцитов при тромбинемии // Укр. биох. журн. -\ 1992. - Т. 64, N 2. - С. 85-91.

wV 17. Бышевский А.Ш., Терсенов O.A., Галенко О.В. Исследо-

вание свертывающей активности тканевых гомогенатов // "Обмен \ V \ веществ в норме и патологии": Сб. трудов. - Тюмень, 1992. -W \С. 18-18.