Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное изучение свойств белков оболочки ряда представителей группы тобамовирусов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение свойств белков оболочки ряда представителей группы тобамовирусов"

Г Б ОД

1 МЛР 1996

—г-—

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

АБУ-ЕД Мохаммед Махмуд

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ БЕЛКОВ ОБОЛОЧКИ РЯДА ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ГРУППЫ ТОБАМОВИРУСОВ

03.00.05 - Вирусология

Автореферат '. диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета МГУ

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук Е.Н.Добров

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук С.К.Завриев доктор биологических наук В.В.Месяижииов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт вирусологии РАМН

Защита диссертации состоится

в час. мин. на заседашш Специализированного совета

Д 053.05.70. при Московском государственном университете им.

М.В.Ломоносова

по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы,-МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Биологического факультета МГУ им. М.ВЛомоиосова

Автореферат разослан "_" февраля 1996 г.

Ученый секретарь ■

Специализированного совета

кандидат химических наук

Общая характеристика работы.

Дктуялынмр> к "N- Белок оболочки (БО) вируса табачной мозаики (ВТМ) представляет собой классическую модель для изучения процессов упорядоченной агрегации белковых молекул. Несмотря на свой сравнительно небольшой молекулярный вес (17-4 кД), БО ВТМ способен формиропать в растворе значительное число агрегатов различной структуры, в также избирательно узнавать гомологичную РНК в процессе сборки вирусных частиц in vitro и in vivo. Большинство упорядоченных агрегатов, образуемых белком ВТМ, принадлежат к двум основным типам - к типу спиральных агрегатов и к типу цилиндрических агрегатов. К первому типу принадлежат в частности сами вирионы ВТМ и спиральный вирусоподобный реполимеризованный белок (РПБ), а ко второму -ток называемые парные (двуслойные) 205-диски и А(48)-белок, представленный смесью двуслойных тримеров и лентамеров. Переход между различными видами и типами агрегатов БО ВТМ in vitro контролируется величиной рН, температурой, ионной силой и составом среды. Природа механизмов, определяющих переход субъединиц БО ВТМ из конформации, характерной для агрегатов цилиндрического типа, в конформацию, характерную для агрегатов спирального типа, остается не вполне понятной. Судя по данным рентгеноструктурного анализа с разрешением 2.8А - 2.9Á (Bloomer et al. 1978; Namba et al. 1989), структура полипептидного скелета субъединиц в агрегатах обоих типов весьма сходна, по ориентация боковых цепей, особенно в области аксиальных (вертикальных) межсубъединичных контактов существенно отличается.

Особенно значительные различия . между субъединицами в цилиндрических и в спиральных -агрегатах обнаруживаются В области третичной структуры молекул БО ВТМ, располагающейся на расстоянии около 70Á от оси вириона или парного диска и включающей, в частности остатки 19-22, 52-54, 66-68 и 138-140 ("область 7оА"). В субъединицах нижнего слоя 208-диска боковые цепи заряженных остатков D19", Е22", К53+ и К68+ ориентированы "вверх* и формируют основной центр аксиальных межсубъединичиых контактов.

• В субъединицах вирионов ВТМ боковые цепи этих остатков ориентированы "вниз" и образуют между собой 2 пары внутрисубъединичных солевых мостиков, стабилизирующих структуру субъединицы (Bloomer et al. 1978; Namba et al. 1989).

Пип, и 1яп»чн msrjfnnuamifl- Целью нашей работы явилось изучение возможной роли области 70А в регуляции перехода между агрегатами БО ВТМ цилиндрического и спирального типа. Для этого мы сравнивали ряд свойств БО дикого U1 штамма ВТМ, нового мутанта ВТМ по белку оболочки ts2l-66 (несущего замены 121 .-*■ Т и D66 -* G) и БО родственного ВТМ вируса хленой крапчатой

мозаики огурцов (ВЗК.МО), резко отличающегося от штамма U1 по первичной структуре области 70Ä.

Няучияп ипяи^ш. R ходе исследования были обнаружены существенные различия в способности формировать упорядоченные и неупорядоченные агрегаты разных типов у БО штамма UI и мутанта ts2I-66 (с аминокислотными заменами в области 70Д) как при пермиссивных, так и при непермиссивных температурах. Показано также, что эти два белка существенно отличаются по характеру модификации лизин-специфическим реагентом тршштробензол-сульфоновои кислотой, (оба остатка лизина в БО ВТМ локализуются в области 70 А). Полученные данные позволили сделать вывод, что область 70 А является наиболее термолабильным участком молекулы БО ВТМ и высказать предположение о возможном механизме структурных перестроек в субъеднницах этого белка при переходе между цилиндрическими и спиральными агрегатами. Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора и экспериментальной части, включающей описание исмолькшанных материалов и методов, полученных результатов и их обсуждения. Работа завершается выводами и списком литературы /^/ссылок). Работу иллюстрируют 22 рисунка и 8 таблиц. Общий объем диссертации WfCTp* страниц.

^iipofiaimn pafinnj 4 Результаты работы были представлены на меж-

дународной конференции (Ялта, 1994) и апробировались на научном семинаре кафедры вирусологии биологического факультета МГУ. По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. I. Некоторые характеристики мугаптя ts21-6fi.

Новый спонтанный температуро-чувствительный мутант ВТМ, названный позднее ts21-66, был выделен, на кафедре вирусологии к.б.н. С.И.Малышенко. При выращивании в климокамерах при пермиссивной (24°С) и непермиссивной (33°С) температурах этот мутант имел коэффициент температуро-чувствнтельности около 0.05. Мутант образовывал мелкие некрозы на зараженных листьях растений N.sylvestris и не индуцировал хлорозов на листьях N.tabacum var Samsun (при 24°С).

Ген бедка оболочки мутанта клонировали с помощью обратной транскрипции - цепной полимеразной реакции и секвенировали дидезокси-методом (клонирование и се книро ванне гена БО мутанта проводилось к.б.н. А.Г.Соловьевым). В гене БО мутанта обнаружено 2 нуклеотидиые замены по сравнению с геном БО дикого (UI) штамма ВТМ, и обе эти замены привод."-.".!«, к заменам в аминокислотной последовательности. В 21-ом положении кодон АУА (Иле) оказался замещенным на АЦА (Тре) и р 66-ом положении кодон

ГАЦ (Асп)— на ГГЦ (Глн). Замена D66 G характерна для известного умеренно-течпературо-чуасгоителыюго мутанта №116.

Хотя положения аминокислотных замен в первичной структуре БО ts21-66 сильно удалены друг от друга, в третичной структуре белка (судя по данным рентгеноструктуриого анализа [Namba et al. 1989, Bloomer et al. 1978]) обе эти замены располагаются рядом и входят в состав интересующей нас области Интересно, что в "области располагается и значительное большинство

других известных ts-мугаций по гену БО ВТМ (остатки 19-20, 66 и 139-140). Эти данные указывают на то, что область 70А может играть важную роль в определении термостабильностн БО ВТМ.

2Температурная чуястннтрльиость йрлкз пбплпчки ts2l-66.

Далее мы исследовали термостабильиость изолированных препаратов БО мутанта ts21-66. В большинстве опытов для этой цели использовали препараты БО ВТМ, выделенные стандартным ацетатным методом. Воздействие температуры на БО ts21-66 исследовали с помощью нескольких методов и прежде всего, для этой .цели использовали так называемый "рН5-тест", разработанный Г.Йокушем {Jockusch 1966, Jockusch et al. I969|.

Сущность этого теста состоит п том, что препараты БО ВТМ (в 0.008М фосфатном буфере рН7.5 в опытах Йокуша) прогревают в течение 20 мин. при последовательно повышающихся температурах, после каждой температурной точки отбирают аликвоту белка, доводят её рН до 5.1, выдерживают при 0°С о течение 20 мин., центрифугируют при 1300g и определяют долю белка, остающуюся в супернатанте. Иативный БО ВТМ при рН5.1 формирует упорядоченные спиральные вирусоподобные агрегаты реплимеризованного белка (РПБ), которые не осаждаются при 1300g. Однако, после прогрева при всего 40°С препараты БО штамма U1 утрачивают способность формировать упорядоченные спиральные аргегаты при рИ5.1 и вместо этого образуют при рН5.1 крупные неупорядоченные агрегаты, осаждающиеся при 1300g. Таким ■ образом, в этом тесте определяется воздействие нафевания (при рН7.5) на способность белка правильно формировать РПБ при доведении рН до 5.1. Заслуживает внимание низкая величина температуры (всего 40°С), при которой Б'О U1 утрачивает способность формировать РПБ. В случае исследованных Йокушем ts-мутантов ВТМ по'БО эта температура была ещё ниже и для белка самого термолабильного мутанта (Nil 18) она составляла всего 25°С. По мнению Йокуша, утрата способности формировать РПБ была "связана с полной или частичной денатурацией молекул белка" [Jockusch et al. 1969].

В наших экспериментах в 0.008 М фосфатном буфере рН7.5 (ФБ-7.5) температура агрегации БО U1 в тесте Йокуша составляла 38°С. Для белка ts2l-66 эта величина составляла 34°С (Рис.1). Мы проводили также аналогичные опыты

с обоими белками в 0.05М ФБ-7.0 и в 0.05М боратном буфере (ББ) рН8.0 и 8.6 (ББ использовался п опытах по модификации белков тринитробензодсульфоновой кислотой, см.ииже). В 0.05 М ФБ-7.0 температура агрегации в этом тесте для белков 1)1 и и21-66 составляла соответственно 37° и, 33% а в ББ-8.0 и ББ-8.6 - 38° и 34° (Рис.1).

Рис.1. Тест на осаждение при рН5.1 с белком оболочки штамма UI и мутанта ts21-66.

Д - БО ts21-66, - А - БО штамма U1 в 8тМ ФБ рН7.5; □ - БО ts21-66, - ■ - БО U1 о 0.05М ФБ рН7.0; О - БО ts2i-66, - • - БО U1 в 0.05М ББ рН8.6.

Судя по данным кругового дихроизма [Taniguchi & Taniguchi, 1975, см.также rn.lVl полная денатурация молекул БО ВТМ происходит при значительно более высоких температурах (около 70°), и, тогда из данных "рН5-теста" можно сделать вывод, что утрата способности формировать РПБ при подкислении до рН5.1 определяется локальной денатурацией какого-то наиболее термолабильного домена молекулы БО ВТМ. Тот факт, что ts-мугации по БО ещё больше снижают температуру агрегации и значительное большинство этих мутаций локализуется в области 70А, позволяет высказать предположение, что таким наиболее термолабильным доменом молекулы БО ВТМ является именно область 70А.

Кроме того нами был специально разработан новый простой гест, позволяющий фиксировать формирование крупных неупорядоченных агрегатов БО ВТМ непосредственно в ходе прогрева. Было обнаружено, что если препараты БО U1 (0.2 Мг/мл) прогревать в 0.05М ФБ-7.0 (этегг буфер является оптимальным для самосборки ВТМ in vitro и формирования двухслойных 20S-

агрегатов) и измерять спектры поглощения п области 240-350 им, примерно до 36° никаких изменений в спектрах не наблюдается. Но затем в сравнительно узком температурном интерпале .происходит очень сильное увеличение оптической плотности по всем этом спектральном интервале. Характер этого увеличения не осшшяет сомнений в том, что оно вызвано резким увеличением мутности. Между 36° и 46° мутность препарата, измеряемая по величине оптической плотности при 320 им (где белок не обладает собственным поглощением) увеличивалась с примерно 0.01 оптач.ед. до примерно 1.2 оитич.ед. Затем величина мутности выходила на плато и потом снова падала из-за коагулниии крупных игрегатоп белка.

Кривые зависимости оптической плотности при 320 нм от температуры для данного белка при данных условиях (рН, ионная сила, концентрация белка) оказались хорошо воспроизводимыми и из них можно было рассчитать температуру термической агрегации (ТТА), как температуру, соответствующую 50% полного прироста оптической плотности при 320 нм. Для белка (Л в 0.05М

разных буферных растворах (концентрация белка- 0.2 Мг/мл).

- О - ЕО 1521-66 п 0.05М ФБ рН7.0; -'О - БО Ш в 0.05М ФБ рН7.0;

- в - БО ВЗКМО в 0.05М ФБ рН7.0;

- Д - БО ВЗКМО п0.1М пирофосфатном буфере рН7.2; -0- БОи21-6бв8шМ ФБрН7.5;

- Х- БО штамма 111 в 8тМ ФБ рН7.5.

Для белка ^21-66 кривая прироста мутности имела точно такой же характер, но величина ТТА оказалась на 6.5" ииже (36.5°). Следует отметить, что данный тест

позволяет измерять способность белка формировать крупные неупорядоченные агрегаты непосредственно в ходе прогрева в данном буфере, а не при условиях формирования РПБ, как в тесте Йокуша.

Величины ТТЛ для БО U1 и ts2!-66, измеренные по увеличению мутности оказались соответственно на 6° и на 3.5° выше, чем значения температуры агрегации измеренные в том же буфере в тсстс Йокуша (37° и 33°). Следовательно, в 0.05М ФБ-7.0 формирование крупных неупорядоченных агрегатов происходит при температурах на несколько градусов более высоких, чем it, при которых происходят изменения структуры, приводящие к утрате этими белками способности формировать упорядоченные спиральные агрегаты.

Однако такая ситуация наблюдается только в 0.05М ФБ-7.0. В растворах низкой ионной силы (в 0.008М ФБ-7.5 и в 0.01М ФБ-8.0) конечная величина прироста оптической плотности при 320 нм составляла для обоих белков около 0.3-0.5 оптич.ед., а величина ТТЛ равнялась 65°-70° (Рис.2). Т.е. при этих условиях неупорядоченная агрегация белка происходила, по'всей вероятности, только при наступлении полной денатурации молекулы белка.

На основании результатов этих опытов, а также аналогичных экспериментов с БО ещё одного тобамовируса - вируса зелёной крапчатой мозаики огурцов (ВЗКМО; см. Рис.2) и соответствующих цельных вирусов, был сделан вывод, что неупорядоченная термическая агрегация наступает либо при полной 'денатурации молекул, либо при их частичной денатурации при условиях среды, соответствующих формированию крупных упорядоченных агрегатов (РПБ или 20S-cTpyicryp).

3. Ссдимеета1шш111ык-хагакт.с1шеп1кп HQ l^l-fifi.

Агрегационные свойства БО ts21-66 при пермиссивньгх температурах исследовали с помощью аналитического центрифугирования. Известно, что БО штамма . UI в растворах низкой ионной силы при слабо щелочных рН и температурах 4°-20° существует в растворе в форме так называемого A(4S) белка, представляющего собой смесь двуслойных тримеров и пентамеров. При рН7.0 ионной силе 0.1 и 20* БО U1 формирует двуслойные 208-структуры, играющие ключевую роль в процессе инициации самосборки in vitro.

Белок оболочки ts21-66 в растворах низкой ионной силы (0.01М ФБ, ББ или ТРИС-буфер рН8.0) вместо 4S-arperaTOB образовывал только 2.5S а1регаты и не формировал 20S-arperaTOB в 0.05М С Б-7.0 при 20° (Таблица I). 2.5S-агрегаты по всей вероятности соответствуют Ьднослойным димерам белка. Таким образом, мутационные повреждения в БО ts21-66 приводят к утрате этим белком способности образовывать двуслойные агрегаты цилиндрического (дискового) типа даже при пермиссивных температурах.

Таблиц» 1. Коэффициента седиментации БО тобамовирусов в различных __буферных системах при 20°С _¡_

Белки 0.01 М ФБ рН8.0, 20°С 0.05М ФБ рН7.0, 20°С 0.1 пирофосфат рН7.2., 20"С

БО 1Л 3.7 Б (100%) 3.6 Э (40%) 21.2 8 (60%) 3.8 Б (30%) 22.4 Э (70%)

БО 1521-66 2.4 в (100%) 2.5 Э (100%) 2.5 в (50%) 23.4 в (50%)

БО ВЗКМО 2.7 Б (100%) 2.7 Б (100%) 2.8 Э (40%) 24.2 в (60%)

Примечание: приведены средние значения из 5-8 опытов. Процентное' соотношение компонентов составляющих фракции указаны в таблице.

4-Спектры кругового лихрпшмя ВО К21-66.

Известно, что разные агрегационные состояния БО ВТМ могут быть дифференцированы на основании формы их спектров кругового дихроизма (КД) в области 240-300 нм (в "ароматической" области) [СН>Ьгоу е1 а1. 1975]. Спектры КД в этой области препаратов БО Ш и ^21-66 в 0.01М ФБ-8.0 оказались совершенно одинаковыми (Рис.3). Из этого следует, что мутационные изменения в БО 1x21-66 при комнатной температуре не приводят к каким-либо изменениям в конформации и/или окружении остатков ароматических аминокислот, хотя два остатка триптофана (17 и 52) и три остатка тирозина (70, 72, 139) находятся в непосредственной близости к мутировавшим остаткам. Из этого также следует, что 2.55 и 4Б агрегаты не отличаются по спектрам КД в этой области.

Рис 3. Спектры кругового дихроизма белков 1521-66 и дикого ВТМ в области 240-300 нм.

_ БО дикого ВТМ.

...... БО &21-66.

При 20" препараты БО Ш и 1821-66 не отличались и по спектрам КД в "дальнем" ультрафиолете (200-240 нм). При нагревании интенсивность полос КД при 208 и 218 нм в спектрах обоих белков уменьшалась более или менее монотонно из-за постепенного ослабления вторичной структуры (рис.4). Не наблюдалось резкого изменения спектров КД белка Ш при 38° и белка й21-66 при 34°, что свидетельствует о лишь частичной денатурации белков при этих условиях. [8] «ю-3

Рис. 4. Спектры кругового дихроизма белков мутанта ts21-66 (А) и дикого ВТМ (В) при разных температурах d области 200-240 нм.

Спектр КД реполимеризованного белка U1 в области 240-300 нм резко отличается от спектра 48-белка [Dobrov et al. 1975]. Белок мутанта ts21-66 после инкубации при рН5.5 приобретал такой же спеетр КД в этой области, как и ре-полимеризоватшый белок штамма U1. Из этого следует, 'по мутационные замены в БО ts2I-66 не препятствуют формированию этим белком нормальных спиральных агрегатов при пермиссивных темлературах( рис 5).

дЕ>Ю'

Рис.5. Спектры кругового дихроизма

ЧЛОЧ trUTTV

ii4\>u.M(t<vvi V

реполимерн ВТМ (1) и ts21-66 (2) в 0.05М ФБ рН5.5 в области 240-300нм.

Для дальнейшего изучения роли области 70А в регуляции упорядоченной агрегации БО ВТМ мы использовали тринитробензолсульфоновую кислоту (ТНБС) - агент, обеспечивающий специфическую модификацию Б-аминогрупп остатков лизина в белках [Satake, Takebe 1960]. Молекула БО ВТМ содержит всего 2 остатка лизина (К.53 и К68) и оба эти остатка входят в состав области 70А. N-концевая аминогруппа БО ВТМ ацетилирована и поэтому не реагирует с ТНБС. Главным достоинством ТНБС, как модифицирующего агента является то обстоятельство, что образующиеся в результате реакции тринитрофенильные производные лизина обладают новой мощной полосой поглощения о максимумом в районе 350 ни и поэтому за ходом реакции ТНБС с белком можно легко следить по увеличению поглощения при этой длине волны.

Известно, что с ТНБС реагируют только депротонированные Е-аминог-руппы лизина [Satake, Takebe, 1960; Fields, 1971]. Величины рКа Б-аминогрупп остатков лизина в белках обычно лежат между 9.3 и 10.2 и поэтому реакция ТНБС с белками происходит с приемлемой скоростью только при щелочных РН,

Мы измеряли кинетические кривые прироста оптической плотности при 350 им в ходе модификации белка ВТМ ТНБС при разных температурах (от 25° до 43°С), разных рН (8.0 и 8.6) и разных соотношениях ТНБС : 8-амшюгруппы (от 16 : 1 до 40 : 1). Из полученных пеличин OD350 рассчитывали величины констант скорости реакций второго порядка к2 по методу Филдза [1971]. Для этого строили графики зависимости lg(OD35Qi KO(f - СЮз^ ккущ.) от времени и из полученных прямых определяли полупериод реакции т^. Величины К2 рассчитывали из уравнения к2 = 1п2 : ( Tyj х [TNBS] ), где [TNBS]- исходная концентрация ТНБС ( рис.бБ).

Было обнаружено, что при соотношении ТНБС : аминогруппы - 40 : 1 рН8.0 и 30° белок U1 и белок ts21-66 реагируют с ТНБС сходным образом: реакция в вышеназванных координатах (Рис.бА кривая 1.,рис.бБ прямая 1) описывается одной прямой (носит однокомпонентный характер), конечная величина OD350 оказывается очень близкой к расчётной для полной реакции двух Е-аминогрупп на молекулу белка (£350 = 13000 М"1, см-1), и величины к2 для белков U1 и ts21-66 оказываются почти одинаковыми (1.24 и 1.58 М"1, мин-1, см. Таблицу 2). Это значит что при рН8.0 и 30° Е-аминогруппы обоих остатков лизина в каждом из белков реагируют с ТНБС с одинаковой (в пределах точности метода) скоростью и эта скорость примерно одинакова для обоих белков.

Рис.:. Модификация белка оболочки ВТМ ТНБС . (А) Зазисимость оптической плотности при 350 нм от времени реакции; 5С БО мутанта 1521-66, 4шМ ТНБС, 0.05М ББ-рН8.0, кривая 1-30°С, кривая 2-3 • и А - конечные величины оптической плотности при 350 нм (через 24 часа (Б) Расчет констант скорости реакции ТНБС с аминогруппами лизина в 1521-66 (данные с рис.6(А)). Прямая 1-30°С, прямая 2 - "медленный" компон реакции при 32°С, прямая 2' - "быстрый" компонент реакции при 32°С.

Однако при повышении температуры до 32° картина существенно из нялась. Характер реакции белка Ш с ТНБС оставался однокомпонентны! наблюдалось лишь небольшое увеличение К2, связанное с повышением темпе туры. В случае же БО йИ-бб зависимость 1е(ООз5о1 кон. - ОО350> текут.) от 1 мени реакции в начальной часта утрачивала линейный характер (Рис.бБ).

В этом случае в соответствии с методом Филдаа конечную линейную чг кривой экстраполировали к нулевому времени (Рис.бБ прямая 2) рассчитывали из неё одну величину К2 (которая в данном случае оказывал равной примерно 1.9 М-1, мин*1). Затем, соответствующие этой пря« значения (при малых временах) вычитали из исходной кривой и рассчитан вторую (более высокую) величину кг из полученной прямой 2* на рис.бБ данном случае - 12.5 М"', мин"1). Следует отметить, что величины прирс ООзад для обоих компонентов оказывались одинаковыми и соответствуюиу полной модификации одной Б-аминогруппы лизина на молекулу бе; Рассчитанная таким образом величина к2 для медленно модифицирующег остатка лизина в белке &21-66 была почти такой же как для (обоих) остат лизина в БО Ш при тех же условиях, а величина к2 для второго (быс модифицирующегося) остатка лизина - примерно в 6 раз больше.

При дальнейшем повышении температуры (вплоть до 43°) характер ре ции обоих белков с ТНБС при рН8.0 не изменялся (Рис.7). Оба остатка лиз! в белке Ш реагировали с одинаковой (и несколько увеличивающейся повышением температуры) скоростью. В- случае же белка Ьй1-66 г

температурах от 32° до 43* сохранялся двухкомпонентный характер реакции и величины К2 для обоих компонентов также постепенно увеличивались с температурой (данные приведены в Таблице 2). Таким образом, при рН8.0 повышение температуры до 32° приводит к резкому увеличению реактивности в отношении ТНБС одного из двух остатков лизина в белке мутанта й21-66, но не в белке дикого штамма 1/1.

30 ' 35 40 (ОС

Рис7. Зависимость величин К2 от температуры для реакции БО штамма Ш и 1521-66 с ТНБС при рН 8.0. Условия те же, что и на рис.6 -О- белок III, -Л- и -Л'- белок й21 -66.

Иная картина наблюдалась в том случае, когда реакцию обоих белков с ТНБС проводили при рН8.б (Рис.8.). Мутантный белок и в этом случае давал двухкомпонентную реакцию, начиная с 32° (см. также Таблицу 2). Но при этом рН переход к двухкомпонентной реакции (при 36") наблюдался и в случае белка дикого штамма (рис.8, Таблица 2). При этом величина К2 для быстро реагирующего остатка лизина в БО Ш оказывалась более или менее близкой к величине К2 для более реактивного остатка в белке мутанта -66. Следовательно, при 36° какие-то изменения происходят и в белке III, но эти изменения проявляются в повышенной реактивности к ТНБС только при повышении рН до 8.6.

Таким образом, в БО &21-66 при 32®, а в БО Ш при 36° происходят какие-то существенные структурные изменения, приводящие к резкому увеличению реактивности одного из остатков лизина п5 отношению к ТНБС. Сле -

рис.8. Зависимость величин К2 от температуры для реакции БО Ш и 1521-66 с

ТНБС при рН8.6. За исключением рН, условия те же, что и на рис.7.

-О- и-О'- белок Ш,

-Д- и -Д'- белок 1821-66. . •

Таблица №2 Величина констант скорости второго порядка К2 (М-'мин."1) реакции ТНБС с остатками лизина в белке оболочки 111 и 1521-66.

Белки, рН

20°С

25°С

30-С

36°С

40°С

белок Ш, РН8.0

1.24 ±0.11

1.79 ± 0.17

2.72 ± 0.20

белок 1521-66, рН8.0

1.58 ±0.10

2.48 ± 0.18 15.5 ± 0.43

3.88 ± 0.18 18.8 ± 0.30

белок 1)1, рН8.6

0.26 ± 0.05

0.79 ± 0.08

3.07 ± 0.06

5.16 ± 0.59 30.3 ± 3.72

.6.39 ±0.50 37.4 ± 3.20

белок 1521-66, рН8.6

0.71 ± 0.05

2.21 ± 0.10

3.60 ± 0.30

6.36 ± 0.67 49.5 ± 3.08

7.74 ± 0.55 50.12 ± 3.45"

Приведены средние величины из 4-7 опытов и стандартные ошибки среднего.

дует подчеркнуть, что обе эти температуры оказываются всего на 2° ниже, чем температуры, при которых соответствующие белки утрачивают способность формировать РПБ (см.Гл.И). Поскольку оба остатка лизина в БО ВТМ располагаются в области полученные данные, по нашему мнению, подтверждают предположение о том, 'по утрата белками способности формировать РПБ связана именно с локальной денатурацией области 70А.

Если последовательное разупорядочиванис области 70А приводит сперва к утрате БО ВТМ способности (¡юрмировать двуслойные цилиндрические агрегаты, а затем - к утрате способности формировать РПБ, можно предположить, что эта область играет роль "переключателя" при переходе от цилиндрического к спиральному типу агрегации. По современным представлениям переход от дисков к спиралям регулируется за счёт формирования двух межсубъсдиничных карбоксил-карбоксилатных пар [Namba et al, 1989 ]. Одна из этих пар, аксиальная карбоксил-карбоксилатная пара Е50" - D77" располагается на расстоянии

58Д от оси вириона, т.е. примерно в 10А от области 70А. Можно предположить, что в белке UI формирование этой пары нарушает ориентацию "вверх" (характерную для аксиальных контактен дискового типа) заряженных остатков D19 , Е22~, К53+ и К68+ области 70А и заставляет эти ,остатки принять ориентацию "вниз", характерную для агрегатов спирального (вирноиного) типа. З.а структурная перестройка приводит к формированию внутрисубъедшшчных пар зарядов D19 , Е22~ - К53+, Кб8+ и переходу к спиральному типу агрегации.

При рН8.б оказалось возможным измерить скорость реакции БО ВТМ с ТНБС и при температурах ниже 30' (при 20° и 25°). При рН8.0 это было невозможно из-за того, что не удаётся использовать соотношения ТНБС : Е-аминогруппы в реакционной смеси большие, чем 40 : 1 из-за слишком сильного поглощения при 350 нм в контрольной кювете (Это поглощение обусловлено небольшой примесыо пикриновой кислоты даже в персочищенных препаратах ТНБС).

Было обнаружено, что при рН8.6 и 25° и БО U1, и БО ts21-66 модифицируются ТНБС ло одпекомпопгитной схеме (как и при 30°), т.е. оба остатка лизина в каждом из белков модифицируются с одинаковой скоростью. Однако, если в случае БО ts21-66 при 25° наблюдалось лишь незначительное уменьшение скорости модификации по сравнению с 30° (соответствующее обычному температурному коэффициенту реакций близкому к 2), то в случае БО U1 при 25° величина K2 была почти в 4 раза ниже, чем при 30° (си. Рис.8., Таблицу 2). При 20° для обоих белков отмечалось спижате величин к2 ещё пример но в 3 раза по сравнению с 25° (Таблица 2).

Из этих данных следует, что при 20° оба остатка лизина в обоих белках защищены от модификации ТНБС, но в БО ts2!-66<CTenenb этой защиты ниже,

чем в БО Ш. Этот факт, по-видимому, отражает частичное розупорядочивание. области 70А в мутантном белке, проявляющееся и в утрате способности образовывать двуслойные цилиндрические агрегаты (см.гл.Ш). При нагревании до 25° происходит некоторое разрыхление этой области в обоих белках, приводящее к трехкратному увеличению значений kj- При этом для БО ts21-66 достигается тот уровень доступности для ТНБС, который имеет место (для "медленного" остатка лизина) о районе 30°-40°. В случае же БО U1 при 25° ещё сохраняется некоторая степень защиты обоих остатков лизина от модификации. Эта зашита полностью снимается только при 30°, когда скорость модификации обоих остатков лизина в обоих белках становится почти одинаковой (см. Рис.8, и Таблицу 2).

В составе вирионов U1 и ts21-66 остатки лизина оказались полностью устойчивыми к модификации ТНБС. Модификация наблюдалась только при • температурах выше 50°, когда начиналось термическое разрушение вирусных частиц.

6- Образование белпк-белковых сшивок при модификации ТНБС белков

пйплпчкн тпбампвиигепа

В ходе изучения действия ТНБС на БО ВТМ было обнаружено, что обработка ТНБС при низких соотношениях ТНБС : Е-аминогруппы приводит к формированию стабильных (вероятно, ковалентных) димеров. По данным электрофореза в полиакриламидном геле молекулярная масса этих димеров составляла 35 кД. Образования тримеров, тетрамеров и других мультимеров никогда не отмечалось. Димеры в равной мере образовывались и на БО U1, и на БО ts21-66. В ходе инкубации димеры накапливались постепенно и после 90 мин. инкубации при 36°, рН8.6 и соотношении ТНБС : е-аминогруппы равном Г : 1 в форме димеров обнаруживалось до половины белка (Рис.9.). При увеличении соотношения до 16 : 1 (или 40 : 1) количество димеров резко уменьшалось (рис.10). И, наоборот, при уменьшении соотношения до 0.33 : 1 (т.е. всего 0.67 молекулы ТНБС на молекулу белка) в форму димеров переходил почти весь белок (правда после суток инкубации при рН8.6 и 36"; рис.10 ). Наблюдалось, по крайней мере, качественное соответствие между уровнем Модификации остатков лизина и уровнем димеризации белка. При условиях, при которых не наблюдалось прироста оптической плотности при 350 нм, не наблюдалось и формирования димеров БО ВТМ. Обработка белков соответствующими концентрациями продуктов расщепления ТНБС пикриновой кислоты или сульфита . натрия не приводила к образованию димеров. Димеризо ванный БО ВТМ эффективно осаждался в изоэлектрической точке (рН4.6) и димеры не диссоциировали после удаления свободного ТНБС и продукШв его разложения.

1 2 3 4 5

«74525 -17.4 -12.3 -

С23Э

*ис.9. Образование димеров БО ВТМ при реакции с ТНБС. Электрофорез в диссоциирующем 15% ПААГ. Инкубация 50цМ белка штамма Л с 0.1 тМ ТНБС при 1=36°С и рН8.6 в течение 0 (дорожка 1), 15 (2), 30 (3), 60 4) и 90 мин (5); дорожка 6-инкубация белка 1821-66 с ТНБС в тех же условиях в ечение 90 мин.

1 2 3 4 5

67 ■

6 7 8 9 10

45 ■

67-

25

45

17-4 —► «К» €Ш8> СЕЭ «2Э

12.3

25 —» 17.4 —► еда, 12.3 —

гс. 10. Влияние соотношения ТНБС : белок на эффективность образования (мсров. Условия те же, что и на рис.9, но концс!прация ТНБС составляла 6тМ (дорожки 1-5) и ЗЗцМ (дорожки 6-10). На дорожках 1-5 время 1кубацин с ТНБС соответственно 0, 15, 30, 60 и 90 мин; на дорожках 6-10 - 0, 5, 2, 5, и 24 часа соответственно.

Формирование димеров наблюдалось и при обработке ТНБС препаратов БО другого представителя группы тобимоиирусоп - иируса зеленой крапчатой мозаики (и-урцои. В то же время обработки ТНБС прспиратои опальбумина не приводили к образованию димеров. Не образовывилось димеров и при обработке ТНБС препаратов цельного ВТМ (Ш или 1x21-66).

Поскольку ТНБС не относится к числу бифункциональных агентов, механизм образования димеро» остается непонятным. Эффективная димеризацня только при низких соотношениях ТНБС : белок может объясняться тем, что некий быстро образующийся промежуточный продукт димеризацни должен процитировать с некой торой функциональной группой (иминогруипой?), которая значительно быст|>сс реагирует со свободным ТНБС. Скорее пссго димеризацня каким-то образом связана с реакцией ТНБС с остатками лизина в БО ВТМ, но ' нельзя полностью исключить, и того, что она определяется какими-то побочными реакциями (с цисгсином? с оксиамичокислотами?).

Кроме того, димеризании, возможно, подвергаются только белки, молекулы которых склонны к упорядоченной агрегации. Определение локализации сшивок и молекулах БО ВТМ сильно способствовало бы установлению их природы.

Большинство ранее выделенных мутантов ls-мутантон но БО ВТМ, как и мутант IS2I-66, индуцируют образование некрозов на инфицированных листьях растений Nicotianu sylvestris, несущих ген N\ В то же время штамм Ш пызывает системную инфекцию на этом хозяине. По современным представлениям «1и>рмнрот>пис некрозов представляет собой защитную реакцию растения-хозяина и включение системы индукции некрозов происходит за счет узнавания какого-то вирусного (или вирус-специфического) компонента. Для N' -системы несколько лет назад было показано, что таким компонентом является именно БО, п недавно Cnlvcr et ni. |1994| было высказано предположение, что способность штамма U1 избегать включения хозяйской системы некротической реакции определяется способностью БО этого штамма формировать стабильные крупные упорядоченные агрегаты (РПБ или 20S - "диски"). Переход к некротической реакции, но мнению этих авторов, вызывают те мутации в БО, которые понижают стабильность спиральных агрегатов (или дисков).

Результаты данной работы позволяют высказать предположение, что именно область 70Ä япдмстея детерминантом, определяющим исход взиимодей-епшя вирус-хозяин в этой системе. Этот эффект может быть либо прямым, либо косвенным. В нервом случае именно дестабилизированная структура "дискового

типа" области 70Á может быть мишенью, непосредственно узнаваемой клеточной системой индукции некрозов. Во втором случае клеточный индуктор может узнавать как нормальную, так и дестабилизированную структуру области 70А, но в случае штамма UI эта структура (частично) маскируется зз счет формирования двуслойных структур (4S и 20S).

Недавно было показано, что еще п двух тобамонирусных системах (индукция хлорозоп на N.tabacimi var Samsuti штаммом UI к индукция некрозов на Capsicum chínense L-* вирусом крапчатой мозаики перца) именно аминокислотные остатки области 70А (19 и 138, соответственно) определяют характер симптомов инфекции (Banerjce et al. 1995; Berzal-Herranz et al. 1995).

пыпопы

1. Охарактеризован новый температуро-чувстпительный мутант ВТМ по гену белка оболочки ts21-66. Показано, что белок оболочки (БО) этого мупиш содержит две аминокислотные замены (I2I-+T и D66->G), причем обе эти замены локализуются в одной и той же области третичной структуры молекулы БО ВТМ, на расстоянии примерно 7оД от оси вириока.

2. Показано, что БО ts21-66 даже при пермиссивных температурах не способен образовывать двухслойные агрегаты цилиндрического типа, (4S А-белок и 20S парные диски), и формирует в этих условиях 2.5S агрегаты, вероятно, представляющие собой однослойные димеры.

3. Обнаружено, что после прогрева при 33°-34"С и рН 7.0-8.6 БО ts21-66 утрачивает способность формировать упорядоченные агрегаты спирального типа при доведении рН до 5.1. Белок дикого (U1) штамма ВТМ утрачивал эту способность после прогрева при 37в-384С.

4. БО ВТМ всего содержит 2 остатка лизина (К53 и К68) и оба эти остатка располагаются в области 70Д (недалеко от остатков 21 и 66). Показано, что прогрев при 32°С и рН8.0 приводит к резкому (примерно в 6 раз) увеличению доступности одного из остатков лизина в БО ts21-66 для тршштробензолсульфоновой кислоты (ТНБС) - специфического реагента на 6-аминогруппы остатков лизина. В случае БО штамма U1 повышение реакционной способности одного из остатков лизина по отношению к ТНБС наблюдалось лишь при 36"С и более высоком значении рН (рН8.6).

5. На основании полученных данных делается вывод, что область 70А . является наиболее термолабильной обласгыо молекулы БО ВТМ. и прогрессивное локальное разупорядочивание этой области за счет мутационных замен и небольшого повышения температуры приводит к утрате БО ВТМ сперва способности формировать упорядоченные агрегаты цилиндрического типа, а затем, и упорядоченные агрегаты спирального типа (и вирионы). Обсуждается возможная роль области 70А в регуляции перехода субъединнн БО ВТМ от цилиндрического к спиральному типу агрегации.

Основные результата диссертации имоиеиы и следующих публикация»

1. М. Абу-Ед , С.В. Куст, И.О. Макеева, В.К. Новиков, Е.Н. Дсбров, - Изучение процесса термической агрегации белков оболочки нескольких представителей группы тобамовирусов, Молек. Генет. Микробиол. Вирусод. - 1994, - N 3.- С. 27-33.

2. Abu-Eid М., S.V. Kust, V.K. Novikov, А. V. Bulat, E.N. Dobrov, -Trinitrobenzensulfonic acid modification of tobamovirus coat proteins, Abstracts of International conference "Fundamental and applied problems in phytovirology", Ukraine Crimea, Yalta, 22-26 MAY, 1994, page 4.

3. M. Абу-Ед, С.В. Куст, Е.Н. Доброе, - Модификация белков оболочки тобамовирусов тринитробезолсульфоновой кислотой, Мсшек. Генет. Микробиол. Вирусол. - 1996, N2, в печати.