Сравнительное изучение роли белка и полисахаридов в молекулярной организации клеточной поверхности археи Halobacterium salinarium и клеточной стенки некоторых видов дрожжей

Карпова, Елена Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительное изучение роли белка и полисахаридов в молекулярной организации клеточной поверхности археи Halobacterium salinarium и клеточной стенки некоторых видов дрожжей
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение роли белка и полисахаридов в молекулярной организации клеточной поверхности археи Halobacterium salinarium и клеточной стенки некоторых видов дрожжей"

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи

Карпова Елена Витальевна

□03055948

Сравнительное изучение роли белка и полисахаридов в молекулярной организации клеточной поверхности археи На1оЬас1егшт хаИпапит и клеточной стенки некоторых видов

дрожжей.

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 2007 ^ ^

003055948

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии биологического факультета Московского Государственного Университета им М В Ломоносова

Научные руководители доктор биологических наук,

профессор, чл -корр РАН И.С. Кулаев (03 00 07-микробиология), доктор биологических наук Т.С. Калебина (03 00 03-молекулярная биология)

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Т.А. Белозерская, доктор биологических наук Н В. Потехина

Ведущая организация Институт микробиологии

им. С.Н. Вииоградского РАН

Защита состоится 13 февраля 2007 года в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501 001 21 по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп 12, Биологический факультет, ауд М-1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ

2006 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Пискункова H Ф

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Одним из важнейших компартментов клетки микроорганизмов является клеточная поверхность (КП), в состав которой входит клеточная стенка (КС), цитоплазматическая мембрана и, в некоторых случаях, периплазматическое пространство КС представляет собой внешнюю часть КП Она играет роль наружного скелета клетки, выполняет защитную функцию и осуществляет комплекс взаимоотношений клетки с окружающей средой Таким образом, КС является важной и многофункциональной органеллой клетки, которая отражает основные особенности микроорганизма, в зависимости от условий его обитания и принадлежности к той или иной филогенетической группе Это делает КС весьма интересным объектом для изучения

Основными структурными компонентами КС микроорганизмов являются белки различной степени гликозилирования и полисахариды Следует отметить, однако, что компонентный состав КС микроорганизмов различной видовой и таксономической принадлежности может существенно отличаться (Kandier, Konig, 1993, Khs, 1994, Калебина, Кулаев, 2001)

Белки выполняют двоякую функцию в КС ферментативную, участвуя во встраивании структурных компонентов в КС и функцию структурного модуля Для исследователей белки КС, также, могут являться важным маркером для изучения процессов эволюции Последнее можно отнести, например, к белкам, относящимся к семейству коллагенов Как известно, именно коллагены являются важными структурными белками высших эукариот животного происхождения В связи с этим интересно было бы проследить, присутствуют ли белки с коллагеноподобными последовательностями в белках КС микроорганизмов, находящихся на разных стадиях эволюционного развития Основанием для поиска таких белков в составе КП микроорганизмов явились работы М В Нурминской (Нурминская и др , 1994), выполненные в нашей лаборатории Помимо этого, сравнительное исследование белкового состава КС микроорганизмов, относящихся к разным филогенетическим группам, даст возможность проследить основные этапы эволюции КС у разных микроорганизмов

Другой структурный компонент КС - полисахариды служат опорным материалом жестких клеточных стенок (хитин, глюкан, целлюлоза), выполняют защитные функции (капсульные полиахариды), а также служат в качестве энергетического резерва клетки (Вагабов, 1997) Гидрофильные полисахариды способствуют поддержанию водного баланса клеток Особенно важную роль играют полисахариды в образовании клеточных поверхностей, характеризующихся набором различных типов молекул полисахаридов,

входящих в их состав Так, например, КС грибов - оомицетов состоят, в основном, из целлюлозы и глкжана, а не хитина, как у большинства других мицелиальных грибов

Таким образом, сравнительное изучение роли основных структурных компонентов в молекулярной организации КП микроорганизмов из разных филогенетических групп является важной и актуальной в настоящее время задачей Особенно актуальным является изучение КП архей, сравнительно недавно охарактеризованного домена живых существ, в первую очередь, в контексте сравнения присутствующих на их поверхностях белков и полисахаридов с компонентами КС дрожжей - представителей низших эукариот Цели и задачи исследования. Целью данной работы явилось сравнительное изучение роли основных структурных компонентов, а именно белков и полисахаридов, в молекулярной организации КП археи Halobacterium salinarium и КС дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorphi и Candida utilis

В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи

1 Поиск коллагеноподобных последовательностей в белках КП археи Halobacterium salinarium и КС дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha и Candida utilis

2 Сравнительный анализ роли белка и полисахаридов КС дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha и Candida utilis в поддержании ее прочности

3 Выявление возможности существования близких структурных мотивов в построении молекулярного ансамбля клеточной поверхности археи Halobacterium salinarium, и дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha и Candida utilis

Научная новизна работы. Показано присутствие в белках КП археи Н salinarium и КС дрожжей Н polymorpha и С utilis сайтов для гидролиза клостридиопептидазой Clostridium histolyticum В результате сравнительного анализа вклада белковых и полисахаридных компонентов в формирование структурной целостности КС дрожжей продемонстрировано, что в КС дрожжей 5 cerevisiae более значимую роль играют полисахариды, тогда как в клеточной стенке дрожжей Я polymorpha и С utilis основная структурная роль принадлежит белкам Полученные результаты могут свидетельствовать о возможном существовании в клетках архей (древних прокариот) и некоторых дрожжей (низших эукариот) коллагеноподобных последовательностей, столь характерных для коллагенов высших эукариот животного происхождения Проведенное в рамках данной работы исследование структурных компонентов КП археи Я salinarium и КС дрожжей S cerevisiae, Н polymorpha и С utilis позволяет лучше понять основные принципы строения их клеточных оболочек

Практическая значимость работы Выявление присутствия коллагеноподобных последовательностей в белках КП археи Я salinarium и КС дрожжей Я polymorpha и С utilis является весьма важным для прикладной фармакологии и медицины Исследование

строения и свойств коллагеноподобных модулей в КС дрожжей позволит эффективнее бороться с дегенеративными заболеваниями млекопитающих, связанными с нарушением структуры коллагеновых волокон Кроме того, это будет способствовать более интенсивному использованию дрожжей в биотехнологических процессах, в частности, при производстве «клонированного коллагена» Применяемый в данной работе высокоспецифичный тест с использованием бактериальной клостридиопептидазы Cl histolyticum позволяет быстро и эффективно выявить присутствие коллагеноподобных последовательностей в белках КП археи Я salinarium и КС дрожжей Я polymorpha и С utilis Этот тест может существенно облегчить работу по идентификации коллагеноподобных белков в КС других микроорганизмов, а также позволит более детально проследить эволюцию коллагенов

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на конференциях "Ломоносов - 2000» международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам, Международный симпозиум в Пущино, 2000, Yeast Genetics & Molecular Biology Meeting, University of Washington, Seattle, USA 2000,1 Съезд микологов России, Москва, 2002, III съезд Российского биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002, Yeast Genetics @ Molecular Biology Meeting, University of Wisconsin, Madison, 2002, FEMS Congress of European Microbiologists, Slovema, 2003 Публикации По материалам диссертации опубликовано 9 работ Структура диссертации Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы» Объем работы составляет 134 стр, включая 54 рисунка и 7 таблиц

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Культуры микроорганизмов В качестве объекта исследования использовали следующие микроорганизмы архея Halobacterium salinarium штамм ET-1001 (Институт биохимии им Макса Планка, лаборатория проф Остерхельда, Германия), дрожжи Sacchoromyces cerevisiae - штамм DBY746 - любезно предоставлен чл -корр РАН M Д Тер-Аванесяном (Кардиологический центр, Москва), штамм DBD8 (Abgl2р) с делегированным геном, кодирующим глюкантрансферазу Bgl2p - ранее получен в нашей лаборатории Даниэлой Лауринавичюте, штамм YB110 (Achs3) с делегированным геном, кодирующим хитинсинтетазу Chs3 - любезно предоставлен Б Сантос (Йельский университет, США), штамм (Abgl2p Achs3) с двумя делегированными генами, кодирующими глюкантрансферазу Bgl2p и хитинсинтетазу Chs3 - любезно предоставлен Г Фоминовым (Кардиологический центр, Москва) , дрожжи Hansenula polymorpha -

штамм DL1-L - любезно предоставлен М О Агафоновым (Кардиологический центр, Москва), штамм ábgl2p с делетированным геном, кодирующим глюкантрансферазу Bgl2p - получен в нашей лаборатории Дмитрием Соболевым, дрожжи Candida utilis - штамм ВКМ У-174 (Всесоюзная Коллекция Микроорганизмов, ИБФМ РАН, Пущино)

Приготовление препаратов КП Н salinarium Клетки археи Н salinarium разрушали двумя способами с помощью постепенного понижения концентрации солей (25%(4,ЗМ) NaCl, 0,2% КС1, 0,3% цитрат Na, 2% MgSC>4x7H20) и в растворе солей того же состава с использованием стеклянных шариков баллотини Далее полученный препарат КП промывали основным раствором солей (25%(4,ЗМ) NaCl, 0,2% КС1, 0,3% цитрат Na, 2% MgS04x7H20) 3 раза, хранили при температуре 4 °С Степень чистоты полученного препарата КП контролировали с помощью светового микроскопа и измеряя оптическую плотность при 280 нм (Mescher, Strominger, 1976 с некоторыми модификациями)

Приготовление препаратов КС дрожжей Клетки дрожжей разрушали с помощью стеклянных шариков баллотини (Sigma) КС дрожжей отмывали - 1 раз 0 05 М трис-НС1 рН 7 5 буфером с 4 мМ СаСЬ, 3 раза раствором 1% сахарозы, 3 раза раствором 1% NaCl, 3 раза 0 05 М трис-HCl буфером рН 7 5 с 4 мМ СаС1г Все процедуры разрушения клеток проводили при охлаждении, клеточные стенки от внутриклеточного содержимого отделяли центрифугированием, степень чистоты полученного препарата клеточных стенок контролировали с помощью светового микроскопа, а также измеряя оптическую плотность промывного раствора на спектрофотометре LKB Biochrom Ultrospec II UV/Visible при длине волны 280 нм Препарат КС хранили при температуре 4 °С в 0 05 М трис-HCl буфере (рН 7 5) (Mendoza, Villanueva, 1963, Калебина и др, 1998)

Микроскопические методы В работе использовали методы фазово-контрастного изображения клеток с использованием светового микроскопа фирмы LOMO, электронной микроскопии - клетки (клеточные стенки) фиксировали 5% глутаровым альдегидом в присутствии 5% диметилсульфоксида, с последующей фиксацией 1% OsOí (Zubatov et all, 1979 с некоторыми модификациями) (обработку клеточных стенок археи Н salinarium проводили в присутствии 4,3 М NaCl (Stoeckenius, Rowen, 1967 с модификациями)) - исследование полученных образцов проводили на электронном микроскопе Hitachi-IIF Использовали, также, метод прижизненного окрашивания клеток дрожжей калькофлуором белым (CFW) (Sigma), взаимодействующим с хитиновыми фибриллами (Brutt et all, 1989) с последующим исследованием их на световом микроскопе Axioskop 40 FL фирмы Zeiss

Выделение белков из клеточных стенок SDS-экстрагируемую фракцию белков получали, прогревая образец в течении 5 мин при 100°С с буфером Лэмли (Mrsa

et al ,1999), содержащим 0,2 М трис-HCl, рН 7,6, 6% SDS, 10% р-меркаптоэтанола,20% глицерина и 0,02 М ЭДТА (Laemmli, 1970)

Фракции белков, ковалентно связанные с КС получали после полного удаления SDS-экстрагируемой фракции NaOH-экстрагируемую фракцию получали обрабатывая полученный на центрифуге Весктап (4000 об \ мин в течении 1 мин) осадок 50 мМ NaOH в течение ночи при 4°С Ламинариназо-экстрагируемую фракцию белков получали гидролизуя КС после удаления SDS-экстрагируемой фракции ламинариназой (pl,3 глюканазой (Sigma) в 0 1 М Na-ацетатном буфере, рН 5 5 при 37°Св течении 4 часов (Mrsa et al ,1999)

Анализ белков Белки КС (КП) анализировали ПААГ-электрофорезом в денатурирующих условиях в 8-12% геле (Laemmli, 1970) При электрофоретическом анализе белков использовался маркер фирмы "Amersham Pharmacia Biotech", состоящий из белков с определенной молекулярной массой (kDa) миозин (220), фосфорилаза b (97), альбумин бычьей сыворотки (66), овальбумин (45), карбоангидраза (30), ингибитор трипсина (20,1), лизоцим (14,3)

Получение очищенного препарата клостридиопептидазы Очистку коммерческого препарата клостридиопептидазы из С/ histolyticum фирмы «Serva» проводили с помощью электрофореза в не денатурирующих условиях при 4°С и напряжении 170В в течение 7 часов (Балаевская, 1989) В полученных препаратах фермента определяли протеолитическую (с казеином) и коллагеназную активности (Балаевская, 1989)

Другие методы Для обработки КС использовали следующие ферменты трипсин (ICN) - 1мг фермента на 1 о е (D540) КС, очищенный препарат клостридиопептидазы из С/ histolyticum фирмы «Serva» - 10 мкл раствора фермента в 0,05 М трис-HCl буфере с добавлением 0,025% СаСЬ (рН 7,6) на 1 о е (D540) КС Биотинилирование белков осуществляли в 50мМ калий-фосфатном буфере рН=8 0, содержащем 10 мг/мл NHS-LC-биотина (сульфосукцинимидил-б-(биотинамидо)гексонат) (ICN) (Mrsa, 1997) После электрофореза белки, в зависимости от задачи, либо окрашивали с помощью нитрата серебра, либо идентифицировали с помощью Вестерн-блот анализа по стандартной методике (Михайлов и Симирский, 1991)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 1. Использование клостридиопептидазы Clostridium histolyticum для выявления коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной поверхности (клеточной стенки) микроорганизмов.

На первом этапе наших исследований нами были проведены эксперименты по выявлению присутствия коллагеноподобных последовательностей в белках КП археи Я

salinarium и КС дрожжей S cerevisiae, Н polymorpha и С utilis Для этого нами был использован высокоспецифичный тест - бактериальная клостридиопептидаза Clostridium histolyticum (Nordwig et all, 1971) фирмы «Serva» Перед использованием в экспериментах данный коммерческий препарат клостридиопептидазы подвергался электрофоретической очистке от примесных протеолитических ферментов, присутствующих в нем Далее проводили процедуру проверки качества очистки выделенного препарата коллагеназы В наших экспериментах использовали только те препараты коллагеназы, в которых детектировали коллагеназную активность, но не было обнаружено неспецифической протеолитической активности

В связи с тем, что одним из следующих этапов нашей работы была обработка КП галофильной археи Н salinarium , выращиваемой в среде с повышенным содержанием солей (25%(4,ЗМ) NaCl, 0,2% КС1, 0,3% цитрат Na, 2% MgS04x7H20) препаратом коллагеназы, была проведена проверка активности этого фермента в буферах с разной концентрацией NaCl - препарата соли с наибольшей концентрацией в используемом буфере

В результате этого эксперимента было показано, что активность коллагеназы в буфере с содержанием NaCl в концентрации ЗМ и более значительно снижается В связи с этим при подготовке прераратов КП Н salinarium для обработки их коллагеназой необходимо провести процедуру отмывки их от солей

1.1. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной поверхности археи Halobacterium salinarium.

Археи, и в частности галобактерии, сочетают в себе признаки как прокариотических так и эукариотических клеток С прокариотами их объединяет отсутствие ядра и митохондрий, а также некоторое сходство в строении поверхностных слоев, с эукариотами - сходство строения рибосом (Konig, 1988) Кроме того, одним из белков КП облигатно-галофильных архей рода Halobacterium является мажорный гликопротеин, по способу гликозилирования и по составу олигосахаридов подобный гликопротеинам эукариотической, в частности животной, клетки Особенно интересно, что в молекуле этого гликопротеина присутствует кластер треониновых остатков гликозилированных дисахаридами по типу, характерному для молекул коллагена животных клеток (Kandler, Konig 1993) Помимо этого, было показано, что полная структура галобактериального мажорного поверхностного гликопротеина напоминает эукариотические протеогликан-коллагеновые комплексы (Wieland 1988) Данный факт позволил предполагать, что сходство с коллагеном может быть обнаружено не только в способе гликозилирования данного гликопротеина, но и в самих аминокислотных последовательностях белков, формирующих КП Н salinarium Это, в свою очередь, могло

бы свидетельствовать о возможном эволюционном родстве архей, в частности Н. ваНпапит, с клетками эу кар нот.

Таким образом, целыо этой части работы был поиск коллагепоподобных последовательностей в белках Ш архси Я заИпапит штамм ЕТ-1001. Дня этого мы провели эксперимент по воздействию высошшецифичного в отношении коллагена фермента клостридиопептидазы на изолированные клеточные поверхности (К11) этого микроорганизма.

Как было сказано ранее, перед обработкой ЮТ археи Н. хаИпагпт клострилиопептидазой необходимо отмыть препарат КП от солей (25%(4,ЗМ) ЫаС1, 0,2% КС1, 0,3% цитрат N¡1, 2% М§80^х7Н20). При сравнении фотографий электронной микроскопии препарата КП, приготовленного без отмывки от солей (РиеЛ А) и отмытых от них (РиеЛ Б) можно видеть, что при понижении солевой концентрации происходит лизис КП. Этот факт подтверждается данными, описанными в литературе (МезсЬег, 51готтцег, ! 974; МеаеЬег, 8(гоппп£ег; 1976).

Рис. I. Электронная микроскопия клеточных поверхностей археи Halobacterivm suHnariwn.

А- препарат КП , полученный путем механического разрушения клеток с помощью стеклянных шариков баллотини в растворе солей;

Б - препарат КП , полученный пугем механического разрушения клеток с помощью стеклянных шариков баллотини и отмытый от солей (25%(4,ЗМ) NaCl, 0,2% KCl, 0.3% цитрат N.i, 2% MgS0,,x7H;0) 0,05 и трис HCl буфером с добавлением Ca "* ( см. «Материалы и методы»);

В - препарат КП , полученный путем механического разрушения клеток с помощью стеклянных шариков баллотини , отмытый от солей (25%(4,ЗМ) NaCl, 0,2% KCl, 0,3% цитрат Na, 2% MgSOjx?! !,0) 0,05 М трис НС! буфером с добавлением Ca "" н проинкубированный в 0,05 М трис HCl буфере с добавлением Ca 2* 20 мин. при 37 "С , затем 30 мин. при 45 "С без добавления клостридиопептидазы (условия инкубации КП микроорганизмов с кпострндиопептидазой были разработаны в нашей лаборатории к, б. н. О.В. Алексеевой);

Г -препарат КП , полученный путем механическою разрушения клеток с помощью стеклянных шариков баллотини , отмытый от солей (25%(4,ЗМ) NaCl, 0,2% KCl, 0,3% цитрат Na, 2% MgSOjx7H,0) 0,05 М трис HCl буфером с добавлением Ca 3" и проинкубированный 20 мин. при 37 "С , затем 30 мин. при 45 "С в присутствии клостридиопептидазы (условия инкубации КП микроорганизмов с клостаилиопептилазой были оазоаботаны в нашей лэбопатопии к. 6. н. О.В. Алексеевой}.

В результате обработки отмытых от солей (25%{4,ЗМ) NaCI, 0,2% KCl, 0,3% цитрат Na, 2% Мс80,|х7Нг0) КП К salinarium клостридиопептидазой в них происходят существенные структурные нарушения (Рис.1 В и Г). КП опытного образца выглядит более деструкгурироюанной (рис. ] Г) по сравнению с контрольным (без халлагеназы) образцом (рис, IB). В среде инкубации (рис. 1Г) накапливались сильно фрагмситироваиные элементы КП.

Поскольку, как было сказано в обзоре литературы, главным структурным компонентом КП данного вида архей является гликопротеин с молекулярной массой 194 kDa (Mescher, Strominger, 1974), мы предположили, что в результате действия клостридиопептидазы именно этот белок подвергается лизису. Для проверки этого предположения нами был проведен электрофоретический анализ белкового состава КП используемого в этой работе штамма ET 1001 Н. salinarium. Результаты этого анализа представлены на рисунке 2 .

1 2 3 4 М (kDa)

] 94 kDa —> т* '—г •— !30 kDa —> V W" №Da —5» U —- —97

69kDa 4

sOtctM 40 kDa

- -66

ig- w. - 45

— 30

■ — 20,1

Рис. 2. Электрофорез ц ПААГ белков, экстрагированных из клеточной поверхности На1оЬааегшп1 ¡сЛтагШп штамм ЕТ1001, отмытых от солей :

1 - без обработки клостридиопептидазой, хранящиеся при 4 °С;

2 - без обработки клостридиопептидазой, инкубация 20 мин. при 37 °С, затем 30 мин. при 45 "С,

3 - после обработки клостридиопептидазой, инкубация 20 мин. при 37 "С, затем 30 мин. при 45 "С;

4 - препарат клостридиопептидазы.

М - маркер фирмы "АтегзЬаш РЬагтяЫа ВЫесЬ", состоящий из белков с определенной молекулярной массой (см. «Материалы и методы»).

При сравнении электрофореза белков КП используемого нами штамма И. $аНпагтт с данными представленными в литературе (МезсЬег ,81гот^ег, 1974; МезсЬег, Э^отпщег, 1976а) нами было обнаружено, что высокомолекулярный белок (гликопротеин) с молекулярной массой 194 ЬОа подвергся гидролизу эндогенными ферментами в процессе выделения КП без солей (Рис. 2(1)), поскольку на дорожке ПААГ появляются дополнительные полосы белка, не описанные в работе Мешер и Стромнигер (МексЬег , Ей'оттдег , 1974 ). Факт гидролиза этого мажорного гликопротеина КП И. заИпагшт в данных условиях был описан в литературе (МезсЬег , Бкот^ег, 1976а). При

инкубации препарата КП в буфере, не содержащем солей, по-видимому, происходит подобный гидролиз (рис 2 (2)) Это можно предположить, поскольку в препарате уменьшается количество белков с молекулярными массами 80, 69, 50 и 40 kDa, представленных на дорожке 1 (рис 2 (1)) Количество же белков с молекулярными массами 130 и 23 kDa не уменьшается (рис 2 (2)) Это еще раз подтверждает тот факт, что сочетание понижения концентрации солей и повышения температуры при нашем способе получения препарата КП приводит к гидролизу некоторых белков КП Таким образом, исследовать действие клостридиопептидазы можно в дальнейшем только на те белки, которые не подвергаются самопроизвольной деградации Этими белками, по результатам наших исследований (рис 2), являются белки с молекулярной массой 130 и 23 kDa

Далее нами было проведено сравнение белков контрольного (не обработанного клостридиопептидазой) (рис 2 (2)) и опытного (обработанного клостридиопептидазой ) (рис 2 (3)) образцов, полученных из КП Я salinarium В результате этого сравнения было показано, что при действии клостридиопептидазы количество белка с молекулярной массой 23 kDa остается неизменным и исчезает белок с молекулярной массой 130 kDa Полученные результаты позволяют предположить наличие коллагеноподобных последовательностей в данном белке (130 kDa)

Следующим этапом нашей работы был анализ аминокислотных последовательностей белков КП Я salinarium в компьютерной базе данных В результате поиска коллагеноподобных фрагментов среди известных на настоящее время аминокислотных последовательностей белков археи Я salinarium было обнаружено, что в геноме этого вида археи присутствует белок с неизвестной локализацией и функциями, так называемый «гипотетический белок» (VNG), а именно VNG0361C (рис 3) При анализе аминокислотной последовательности этого белка было обнаружено, что она содержат потенциальные сайты для гидролиза клостридиопептидазой (рис 3)

VNG0361C (ЗЗЗаа)

241 pglnylyfv îpmplwlatg lfaaysifvs gtggigaggv aqlahlaglg îgllygaklk

301 regarapnel qfgggpgggm ggpggpggpg rrr f f '

t t t t t

Рис 3 Фрагменты аминокислотной последовательности белка археи Halobacterium salinarium, обнаруженного в компьютерной базе данных (http //www nebí nlm nih gov/suti!s/genom_table cgi) Стрелками обозначены сайты для возможного гидролиза клостридиопептидазой В скобках указано количество аминокислот, входящих в состав белка

В настоящее время точных данных о локализации белка, представленного на рисунке 3 нет Сказанное позволяет предположить, что данный белок, возможно, локализован в толще КП В этом случае, в свою очередь, можно сделать предположение,

что, либо представленный в базе данных фрагмент (333 аа) белка является частью обнаруженного нами белка с молекулярной массой 130 kDa, либо данная последовательность принадлежит присутствующему в КП эндогенному ферменту, например, протеиназе, которая активизируется после действия клостридиопептидазы Дальнейшая активность гипотетической протеиназы в свою очередь может являться причиной значительных структурных изменений (Рис 1)

Таким образом, можно предположить, что белок, содержащий коллагеноподобную последовательность, а именно VNG0361C (рис 3) локализован в КП Следовательно, представленные в этой главе данные свидетельствует в пользу наличия коллагеноподобных последовательностей в белках КП Н salinarium Этот факт является весьма важным как для характеристики самих белков, так и с эволюционной точки зрения

Кроме того, при прослеживании эволюционных отношений интересным также является то, что полисахаридная часть гликопротеина КП Н salinarium (194 kDa) имеет мотивы, напоминающие хитин, входящий в состав КС эукариот Высокомолекулярная гликозаминогликановая цепь, входящая в состав этого гликопротеина состоит из повторяющихся сульфатированных пентасахаридных блоков, включающих jV-ацетил-глюкозамин (Konig, 1988, Paul et al 1986)

На основании представленных выше фактов для прослеживания эволюционных отношений между прокариотическими и эукариотическими микроорганизмами логичным и весьма интересным было бы провести исследования роли белка и полисахаридов в молекулярной организации КС низших эукариот

1 2. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белах клеточной стенки дрожжей.

На первом этапе работы логичным и весьма интересным было бы провести поиск коллагеноподобных последовательностей в белках КС низших эукариот

При выборе объекта такого рода исследований мы остановились на микроорганизмах, относящихся к царству грибов Это обусловлено тем, что грибы имеют своеобразное строение клетки, сочетающее, как особенности растительной клетки (наличие клеточной стенки, вакуолей, способность к синтезу витаминов), так и животной (наличие хитина в КС, запасных углеводов в форме гликогена и трегалозы)

Особое положение среди грибов занимают дрожжи, которые широко используются в научных исследованиях как модель эукариотической клетки В последнее время в литературе появились весьма интересные факты, говорящие о том, что по структуре и способам встраивания белки КС некоторых видов дрожжей напоминают фибриллярные

белки высших эукариот (Wösten, 2001) На начальном этапе выполнения данной работы была сделана попытка решить вопрос о присутствие белков с коллагеноподобными последовательностями в КС дрожжей

В наших экспериментах по идентификации коллагеноподобных белков мы использовали хорошо изученную группу аскомицетных дрожжей, наиболее ярким представителем которой являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae

В качестве объекта для сравнения мы использовали дрожжи, принадлежащие к роду Pichia, а именно Pichia angusta (Hansenula polymorpha) и Pichia jadmii (Candida utilis) (рис 4) В скобках приведены традиционные названия дрожжей Как известно, эти виды дрожжей достаточно далеко удалены на филогенетическом древе от S cerevisiae (рис 4)

Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae

Kluyveromyces

Рис 4 Обобщенное филогенетическое древо аскомицетных дрожжей, построенного по результатам, представленным в статье Куртзмана и Робнета (КиЛгшап , ЯоЬпеИ, 1998)

1.2.1. Идентификация коллагене подобных последователь ноетей в белках клеточной стенки дрожжей Saccharotnyces cerevisiae, Hanseaula polymorpha и Candida utilis .

Ранее в нашей лаборатории были проведены опыты по обработке изолированных КС дрожжей С. utilis клостридиопептидазой (Nurminskaya et. al., 1993). В результате этих экспериментов было показано, что клостридиопептидаза нарушает структуру КС этого вида дрожжей, что свидетельствует в пользу наличия я этой структуре коллагеноподобных последовательностей.

В связи с этим весьма интересным было бы провести эксперимент по воздействию на изолированные КС дрожжей Н. polymorphs и S. cerevisiae высокоспецифичного для коллагена фермента клостридиопептидазы из Clostridium histolyticum. Результаты этого опыта продемонстрированы на рисунке 5 .

На этом рисунке видно, что клостридиопептидаза не влияет на структуру КС S. cerevisiae. Однако, в результате действия этого высокоспецифично го в отношении коллагена фермента происходят изменения в КС И. polymorpha, которые связаны с гидролизом этой органеллы клетки в области почечного рубца. Изменений же в латеральной КС этого вида дрожжей не наблюдалось.

Таким образом, представленный на рисунке 5 результат может свидетельствовать о присутствие белков с кол л агено подобны ми последовательностями в КС дрожжей Н. polymorpha в первую очередь в зоне почечного рубца,

Интактные КС КС, обработанные коллагеказой из Clostridium histolyticum

Рис. 5. Электронные микрофотографии клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae(h) и Hansenula polymorpha (Б).

О,1 Брм

По имеющимся на сегодняшний день данным, важными структурными компонентами КС дрожжей являются белки ковалентно связанные с полисах аридным каркасом клетки (Каледина, Кулаев, 2005), К такой группе относятся белки GP1- и PlR-семейств. Однако, как следует из результатов предыдущего опыта (рис.5) GPi-белки не должны являться предметом нашего исследования при поиске кол л агент, подобных последовательностей, поскольку они составляют основной матрикс наружного электрон но-плотного слоя КС, который не разрушается пол действием клоетридиопептидазы.

Кроме того, при сравнении белковых фракций КС дрожжей S. cerevisiae, H. polymorpha и С. Mis было обнаружено, что в отличие от GPl-белков, PIR-бслки КС дрожжей Н. polymorpha при электрофорезе в ПААГ выглядят единой окрашенной зоной, соответствующей совокупности белков, невыявляемых в виде отдельных полос. Одним из объяснений такого нерасхождения PIR-белков при электрофорезе может быть более высокая степень щннозилирования белков КС H. polymorpha . Однако, можно также предположить, что существует и другое объяснение этого факта. Вероятным является то, что белки PIR-семейства способны собираться в комплексы, подобные комплексам сетчатого коллагена высших эукариот,

С целью проверки последнего предположения мы провели эксперимент по сравнительному анализу степени расхождения фракции PIR-белков КС //. polymorpha при разных условиях инкубации (рис. 6).

66 k Da 57 к Da

—. — 66 --45

Рис. 6 Вестерн-блот анализ Р1К-белков клеточной стенки дрожжей Натепи1а ро!утогр!т, разделенных электрофоретически к ! 0% ПААГ:

1 -инкубация при I = 4"С в течении 30 минут;

2 - инкубация при I = 4°С В течении 6 часов;

3 - иикубация при I = 37 °С в течении 30 минут;

4 - инкубация при I =37 "С в течении 6 часов,

М - маркер фирмы "АгпегйЬат РЬагтаЫа Вклеек', состоящий из белков с определенной молекулярной массой (см.»Материалы и методы»)

На картине электрофореза можно видеть, что при инкубации РЕЯ-белков при (=4°С на дорожке ПААГ индивидуальные полосы белков практически отсутствуют (рис. 6 (1)). Это

может быть сзязано с тем, что Р!К-белки КС дрожжей Н. ро1утогрИа вероятно имеют своеобразную конфигурацию, подобную фибриллярным белкам. Как известно, такая конфигурация белка не способна раскручиваться при 1=4°С (Степанов. 1996), а значит и входить в гель. При увеличении времени инкубации Р1К-белков при той же температуре ¡1а дорожке ПЛАТ можно видеть совокупность белков, невыявляем ых в виде отдельных полос и формирующих окрашенную зону в области молекулярных масс от 220 до 60 к!)а (Рис. 6 (2)). Инкубация же РЖ-белков при 37 °С в течение 30 минут приводит к появлению на дорожке ПААГ отдельных белковых полос с молекулярными массами 66 и Ы кОа (рис. 6 (3)) , а в течение б часов и еще одной отдельной полосы белка с молекулярной массой 78 кйа (рис. 6 (4)).

Таким образом, результаты этого Эксперимента позволяют сделать предположение о способности Р1Я-б ел ко в КС И. ро!утогр1т собираться в комплексы, возможно напоминающие комплекс!,1 сетчатого коллагена. Следовательно, целесообразно было бы провести поиск коллагеноподобных последовательнотеЙ в белках РЖ-ссмсйства КС этого вида дрожжей.

Для этого следующим этапом нашей работы являлось выделение РЖ-белков из КС дрожжей Н. ро1утогрИи н воздействие на них клостридиопептидазой (рис. 7).

Рис.7. Вестерн-бяот анализ обработанных и необработанных клостридиопептидазой PIR-белков

клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae (А) и fiansemila polymorpha (В). ! - клостридиопетидаза;

2- препарат PIR-бсков, проинкубированный в течеие 4 часок при 37 "С и затем 2 часа при 45 "С в присутствии глостриДИОпептидазы (условии инкубации белков с клостридиопептидазой были разработаны в ходе выполнения данной работы); 3 - препарат PIR-беков, проинкубированный в течение 4 часов при 37 "С и затем 2 часа при 45 °С

без добавления клостридиопептидазьг; М - маркер фирмы "Amersham Pharmacia Biotech", состоящий из белков с определенной молекулярной массой (ем. «Материалы и методы») Электрофоретическос разделение PIR-белков проводилось в 7 % ПААГ.

Можно видеть, что при действии Хтсстридиопентидазы па PlR-белхи Я polymorpha подвергается гидролизу представленная на элсктрофореграмме неразрывная совокупность белков. Гидролиза PlR-белков КС дрожжей S. cerevisial под действием клостридиопептидазы не происходит, что подтверждается результатами компьютерного

анализа генома этого вида дрожжей в банке данных (в этом геноме коллагеноподобных последовательностей не выявлено)

В результате поиска коллагеноподобных последовательностей в компьютерной базе данных дрожжей Н polymorpha выяснилось, что в белках PIR2p, Sedlp и Tiplp присутствуют сайты для возможного гидролиза клоктридиопептидазой (рис 8) Локализация белка PIR2p в зоне почечного рубца КС следует из литературных данных (Sumita et al, 2005) Белки Sedlp и Tiplp являются белками КС

PIR2p ( aal

241 kkegalamtl kdgilydseg rigsivanrq fqfdjgpppqa,garyadgwsi spdgylaign

301 dtifyqclsg tfynlydqsi ggqcnkvhlk avelvdc

Sedlp (131 aa)

61 gattltitdc pctkkkvitt ttvttipaks staassvaas sapvistaen agakvgaagl

121 aalagaaafl I f f

Tip1p (283 aa^

181 asssahvhsh aaestsaves tsaahshaae sssaahshav esssaahvhs haaesssaah

241 shaagsssaa snssghistf Sjgaigaklavg agacjivglaa Ilm

Рис 8 Фрагменты аминокислотных последовательностей белков клеточной стенки дрожжей Hansenula polymorpha обнаруженных в компьютерной базе данных (http //www nebí nlm nih gov/entrez/query fcgi CMD=search&DB=protein) Стрелками обозначены сайты возможного гидролиза клостридиопептидазой

Представленные на рисунке 8 последовательности крайне не продолжительны и с трудом могут рассматриваться как коллагеноподобные Однако, сведения о последовательностях PIR-белков Я polymorpha, представленные в базах данных этого вида дрожжей достаточно скудны Это позволяет предположить, что обнаруженные нами первичные последовательности белков, гидролизуемых клостридиопептидазой еще не определены

Таким образом, результаты исследований, представленные на рисунках 5, 7 и 8, свидетельствуют в пользу наличия сайтов для возможного гидролиза клостридиопептидазой в белках КС дрожжей Я polymorpha, в том числе и во фракции PIR-белков КС этого вида дрожжей

Следует отметить, что при использовании клостридиопептидазы для гидролиза PIR-белков дрожжей С utihs также было обнаружено гидролизующее действие этого фермента Однако, поиск аминокислотных коллагеноподобных последовательностей для белков КС С utilis, производимый во время выполнения данной работы, не дал результатов Несмотря на это, с определенной долей вероятности можно предположить,

что в белках КС дрожжей С utilis, в частности, в PIR-белках, также присутствуют коллагеноподобиые последовательности

Итак, для КС близкородственных видов дрожжей Я polymorpha и С utilis были получены данные, свидетельствующие в пользу присутствия в них белков с коллагеноподобными последовательностями Кроме всего прочего, этот факт может являться подтверждением родства этих микроорганизмов

Необходимо сказать, что результаты, описанные выше, находят свое логическое подтверждение в данных, представленных в недавнее время в литературе Эти данные свидетельствуют о присутствии коллагеноподобных последовательностей как в аминокислотной цепи одного из белков клетки дрожжей Я polymorpha (Brum et al 2002), так и в последовательности нуклеотидов генома дрожжей Pichia pastoris ( Pakkanen et al 2003)

Следует также отметить, что у белков 5 cerevisiae, геном которых известен полностью, коллагеноподобиые последовательности отсутствуют и случаев гидролиза этих белков клостридиопептидазой не обнаружено Это говорит о высокой специфичности используемого нами теста с клостридиопептидазой на присутствие коллагеноподобных последовательностей в исследуемых белках

12 2 Проверка чувствительности клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis и Hansenula polymorpha к протеолитической деградации с использованием фермента трипсина.

В связи с тем, что главной функцией коллагена является образование нерастворимых фибрилл высокой прочности (Степанов, 1996), можно предположить, что и белки, содержащие коллагеноподобиые последовательности, обладают такими свойствами и подобной конфигурацией Основываясь на этом предположении и с целью подтверждения экспериментов, описанных в предыдущей главе, было бы целесообразно провести обработку изолированных КС дрожжей S cerevisiae, С utilis и Я polymorpha протеолитическим ферментом трипсином Как известно, этот фермент гидролизует связи К-Х, R-X в аминокислотной цепи белка и не способен гидролизовать белки, образующие высоко прочные фибриллы, в которых сайты для гидролиза трипсином не доступны для этого фермента (Степанов, 1996)

Итак, далее мы определили чувствительность КС S cerevisiae, С utilis и Я polymorpha к протеолитической деградации с использованием трипсина На рисунке 9 продемонстрированы результаты воздействия этого фермента на КС дрожжей с использованием метода электронной микроскопии

Интаетные КС

.. ■Г

м.

КС, обработанные трипсином

0.15|Ш | —

. I

# -

Ш 0,15[)

а к

0,15^«-

'-А

Рис.9. Электронные микрофотографии клеточных стенок дрожжей НассЬаготусез сегеуШае (А), Сапс1Ша и1М|5(В) и Итиепи1а ро!утогр1ш (В), до и после обработки трипсином . Обработку КС трипсином (1С"Ы) проводили из расчета 5мг фермента на 1 о.е КС в 0.05М Трис-НС1 буфере, рН 7.В. Полученную суспензию инкубировали при 37°С в течении 2 часов. * Фотографии, представленные на рис.9Б предоставлены 0.13, Алексеевой.

На электронных микрофотографиях можно видеть, что внешний вид КС £ сете\isiae после обработки трипсином в целом не сильно отличается от интактных КС (рис 9А). Однако, в КС дрожжей С. и(/& и Я ро1утогрИа, обработанных этим ферментом, произошли достаточно серьезные изменения ((рис 9 Вн В). Элсктроннолдотнын внешняя маннопротеиновый слой этой оргаиеллы клетки у данных видов дрожжей становился тоньше, а глюкановый матрикс КС - становился более рыхлым. Следует, также, обратить внимание на то, что в КС дрожжей Н. ро!утогрИа после действия трипсина не наблюдается ярко выраженной слоистости, присущей ннтактной КС. Однако, в КС С иИШ подобные нарушения менее выражены. Таким образом, на основании этого эксперимента можно сказать, что действие трипсина на КС дрожжей сегеУ1$1ае, С. иШИ и Н. ро!утогр}ю различно. Это, вероятно, может свидетельствовать о различиях и в структурной организации КС этих видов дрожжей, что подтверждают результаты экспериментов по поиску коллагеиоподобных последовательностей в белках КС дрожжей 5 сегеуШае, Н. ро!утогрЬа и С. иНЩ

Кроме того, основываясь на результатах эксперимента, представленного на рис.9, можно говорить о более значимой роли белков в поддержании структуры КС Н.

pofymorpha no сравнениию с дрожжами S. cerevisiae. КС дрожжей С. utilis в этом смысле , по-видимому, занимает промежуточное положение,

2. Изучение роли цолнсахаридных компонентов клеточной стенки дрожжей в ее структурной организации.

Еще одним важным структурным компонентами КГ! микроорганизмов являются Полисахариды и их производные. Особенно важную роль играют углеводные цепи, которые присутствуют в КС дрожжей и составляют около 60 % от всей массы КС, Однако, у разных видов дрожжей количество и качество этих структурных компонентов в КС может отличаться. В спязн с этим интересно было бы проследить значимость полисах аридных компонентов в КС дрожжей, принадлежащим разным филогенетическим группам.

2.1. Сравнительный анализ уровня хитина в клеточных стенках дрожжей Saccliaromyces cerevisiae, Candida, milis и Hansen ala pofymorpha.

На первом этапе исследования роли полисахаридов в структурной организации КС дрожжей мы остановились на сравнительном анализе уровня хитина в КС 5. cerevisiae, Н. pofymorpha и С. utilis.

На рисунке 10 представлены результаты флуоресцентной микроскопии окрашенных калькофлуором белым (CFW) клеток дрожжей (CFW - флуоресцентный краситель, который, связываясь с хитином, не вводится в клетку, поэтому его удобно использовать для прижизненного окрашивания клеток). Анализируя представленные данные можно сказать, что в КС дрожжей S. cerevisiae уровень хитина существенно выше, чем в КС Н. pofymorpha и С. utilis.

Рис. [0. Сравнение штаммов дрожжей ЗассЬаготуфЩ сеп\цзше (А), СапйШа. иИШ (Б) и Натепи1в ро!утагр1>а (В) по результатам флуоресцентной микроскопии после обработки этих клеток специфическим для хитина флуоресцентным красителем калькофлуором белым.

Помимо этого, при сравнительном анализе фотографий флуоресцентной микросколии клеток дрожжей Я polymorpha н С. utilis обнаружился интересный факт, В КС дрожжей С. ulilis наблюдается свечение в зоне почечного рубца, что говорит о Повышенном количестве хитина в этой области КС (рис. ] 0). Этот результат хорошо согласуется с данными экспериментов, но действию трипсина на КС этих видов дрожжей (рис.9). По результатам экспериментов, представленных на этом рисунке белковые компоненты КС дрожжей С. utilis равномерно распределены по КС (рис 9 Б), тогда как в КС дрожжей Н. polymorpha они в основном сосредоточены в зоне почечного рубца (рис 9 В). Следовательно, можно предположить, что меньшее количество белка в почечном рубце КС дрожжей С. ulilis компенсируется хитином (рис 10 Б).

Таким образом, результаты, представленные на рис. 9 л 30 говорят как о разной компановке структурных компонентов в КС дрожжей S. cerevisiae, С. ulilis и Н. polymorpha, так и о различной их роли в КС этих видов дрожжей.

2.2. Изучение роли глюка нтрансфераЗЫ Bgl2p в формировании молекулярной структуры клеточных стенок дрожжей Hansemtla polymorpha и Saccharomyces cerevisiae.

Ранее s нашей лаборатории на примере дрожжей 5. cerevisiae было «оказано, что структурный модуль КС — ПШисахарид-белкОВЫй комплекс, в состав которого входят хитнн и белки, встраивается в КС с участием глнжантра нефе разы Bgl2p (Kalebina et. all.,2002). На основании этого, на следующем этапе работы были проведет,! сравнительные исследования роли ппокантрансфераэы BgI2p в формировании молекулярной структуры КС дрожжей Н. polymorpha и S, cerevisiae

Анализируя клетки родительского и мутантного по гену BGL2 штамма дрожжей И. polymorpha можно видеть, что форма клеток мутанта hbgllp более округлая, чем у родительского штамма DL-1 и имеет неровные очертания (рис. 11). Этот факт может свидетельствовать о том, что при нарушении механизма сборки полисахарид-белкового комплекса КС теряет свою жесткость, вследствие чего клетка изменяет форму.

DL-I

ii.bg/2p

Рис. 11. (разово-контрастиос изображение клеток дрожжей Hansemtla polymorpha.

На электронных микрофотографиях, представленных на рисунке 12, можно видеть различия в структуре латеральной КС родительского штамма ВЦ и Abgl2p-lAy^mтй , которые связаны с увеличении количества белка в КС при делеции гена ВС ¿2 у дрожжей И . ро1утогрНа. Это проявляется в увеличении электронной плотности в этих зонах КС у мутантного штамма.

DL-I

Abg/2p

Рис. 12. Электронные микрофотография материнского рубца клетки родительского штамма ОН и штамма с делегированным геном В(ЗЬ2 (ЛЬ%!2р) дрожжей Нап$епи1а ро1утогрИа„

Кроме того, заметны существенные различия в структуре почечного рубца, У родительского штамма хорошо выражен плотный почечный рубец, имеющая фибриляную структуру и отделенный от цитоплазмы мембраной. В клетке же мутантного штамма рубец практически отсутствует и наблюдается разрастание цитоплазматического содержимого, окруженного мембраной, в пространство, занимаемое в норме материалом вторичной септы (Рис. 12). Эти результаты еще раз подтверждают значимость полисахарид-белкового комплекса, в формировании которого принимает участие глюкаитрансфераза В§12р, как в структурной организации КС, гак и в процессе почкования клеток этого вида дрожжей.

В связи с представленными выше результатами о роли белка в организации КС дрожжей Я. ро1утогрЪа весьма интересно было бы проследить роль изучаемого нами пали сахарил-белкового комплекса в молекулярной организации КС 5. се^рмкиге. Это связано с тем, что этот вид дрожжей находится на другой ветви филогенетического древа аскомицетных дрожжей.

DB V 746

Рис. 13. Фазово-контрастное изображение клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae .

DBY 746 - родительский штамм, &bg!2 - вутвнтный штамм, лишенный глшкантрансфераза Bgl2p

Для этого нами был исследован мутаптный штамм ДЬ%12р дрожжей ,5. сегеуШае. При микроскопическом исследовании родительского (ПВУ74б) и мутаитного по гену ВС 12 штаммов с использованием фазового контраста можно видеть, что у этих штаммов не происходят существенных изменений в размере и форме клеток мутантного штамма по сравнению с родительским (Рис. 13).

С помощью метода флуоресцентной микроскопии с использованием специфичного для хитина красителя калькофлуора белого, удалось выявить, что в КС мутанта Дbgl2p происходит повышение уровня хитина (рис 14), Этот результат подтверждается биохимически. Следовательно, при нарушении встраивания глюкана в КС дрожжей 5. сегемШае включается хитиновый механизм компенсации, количество этого полисахарида увеличилось у мутанта.

Рис. 14, Флуоресцентная микроскопия окрашенных калькофлуором белым (СР\\') клеток дрожжей ЗассЪаготусез еегстшае . 1313V 746 - родительский штамм, Дь%12 - мугантный штамм, лишенный глюкамтра нефе раза В§12р.

Сравнительный анализ скорости роста родительского штамма ОВУ746 и мугШтного по гену ВЫг штамма дрожжей 5. сетфЫШе не выявил существенных отличий.

Электронно-микроскопическое исследование этих штаммов, представленное на рисунке ¡5, показало, что КС мутанта по сравнению с родительским штаммом имеет менее плотную структуру, как внешнего маннопротеинового слоя, так и внутреннего глюканового. Подобный эффект наблюдается и в области почечного рубца клетки. Помимо этого, как КС мутантной клетки, так и слой, покрывающий её почечный рубец, обладает большей электронной плотностью по сравнению с родительским штаммом ОВУ74б (рис. 15). Это может свидетельствовать об увеличении количества белка и этих клеточных структурах, выявляемого при электронной микроскопии КС дрожжей как более электрон но-плотный слой.

Таким образом, результат!,I электронно-микроскопичкского исследования (рие.15), в совокупности с результатами флуоресцентной микроскопии, представленными на рисунке 14, говорят о том, что при нарушении встраивания исследуемого нами полисахарид-белкового комплекса в КС дрожжей X сегеуШае происходит заметная реорганизация этой клеточной органеллы. Происходящее при этом повышение уровня хитина в КС способствует поддержанию формы клетки. Однако, можно предположить, что в

результате такого повышения количества хитина в КС нарушаются жизненно-важные процессы в клетке этого вида дрожжей, т е, происходит как бы репарация мутантных клеток дрожжей £ сегеутае хитином

ЭВУ 746

0,15ум

Рис 15 Электронные микрофотографии клеток родительского штамма ОВУ746 и штамма, мутантного по гену ВСЬ2 {Abg¡2p) дрожжей ЗассИаготусея сегеутае

2.3. Исследование морфологии двойного мутанта по генам В0.2 и СНБЗ дрожжей •УоссЛяго/яусет сегеркше.

На основании описанного в предыдущей главе результата интересно было бы проследить значимость глюкантрансферазы Bgl2p для поддержания молекулярного ансамбля КС дрожжей £ сегеутае, у мутанта не только лишенного гена Ва,2, но и с нарушенным синтезом хитина (геном СЖ5), т е , у двойного мутанта Лbgl2pAchsЗ

Другими словами штамм Abg!2pAchsЗ дрожжей £ сегеутае сравним со штаммом Abgl2p дрожжей Н ро1утогрИа, поскольку эти дрожжи лишены возможности компенсировать отсутствие важных структурных компонентов КС за счет повышения уровня хитина (Лауринавичюте и др, 2000)

На фоне того, что в клетках дрожжей АсИзЗ 5 сегечтае, лишенных возможности синтезировать хитин латеральной КС происходят серьезные нарушения (уродливая форма клеток, нарушения структуры КС, нарушение процесса почкования) (рис 16), клетки двойного мутанта имеют правильную форму (рис 16 А) Однако при детальном рассмотрении латеральная КС Abgl2pAchsЗ-мyтaнтa отличается более аморфной структурой и имеет большую толщину по сравнению с родительским штаммом (рис 16 Б)

Помимо этого, в КС двойного мутанта происходят серьезные нарушения в зоне почечного рубца (рис 16 В), сравнимые с таковым в клетках штамма М%!2р Н. ро1утОгрка (рис. 12). Этот результат говорит о существовании серьезные перестроек а КС двойного мутанта дрожжей 5. сегехШае.

А Б В

Сие. 16. Микроскопическое исследование клеток дрожжей йассИаготусез сеге\>Ыае: А - фазовая микроскопия клеток; 1> -- электронная микроскопия латеральной клеточной стенки; В -электронная микроскопия почечного рубца клетки.

Описанное выше наблюдение еще раз подтверждает высказанное предположение о том, что в клетках дрожжей 8. сеГ^Шйе по сравнению с дрожжами И, рЫутогрИа хитин имеет большее значение для формирования молекулярного ансамбля КС.

В результате проведенных в рамках этой работы исследований было выявлено, что прокариот.чческий микроорганизм - облигатно-галофйльяач ярхея Я. заНпапшп имеет некоторые общие черты строения клеточной поверхности с низшими эукариотами. Несмотря на простоту строения КС этого микроорганизма, в её состав входят элементы таких структурных компонентов, как коллаген и хитии, характерных для высших эукарног. Эти данные еще раз подтверждают современные представления о том, что именно археи (по крайней мере, некоторые из них) являются предками эукарнотических клеток (ОзЫгпа,! 994).

В отличие от археи Н закпапит, дрожжи имеют более сложноорганизованную КС, в состав которой входят как белковые (гликопротеиновые), так и полисахаридные компоненты Соотношение этих компонентов КС у разных видов дрожжей различно

Таким образом, по-видимому, у древних архей и у низших эукариот важную роль в молекулярной организации КС, несмотря на малое количество, играют белки с коллагеноподобными последовательностями и хитин соответственно Причем у дрожжей с низким содержанием хитина коллагеноподобные последовательности также выявлены и играют важную структурную роль До сих пор эти соединения считали важными компонентами клеток, в основном, высших эукариот животного происхождения

ВЫВОДЫ.

1 Воздействие высокоспецифичного в отношении фибриллярного белка коллагена фермента клостридиопептидазы Clostridium histolyticum на клеточные поверхности микроорганизмов, в частности, археи Halobacterium salinarium и дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha и Candida utilis является простым и эффективным методом для выявления присутствия коллагеноподобных последовательностей в белках этой части клетки

2 С помощью клостридиопептидазы Clostridium histolyticum в белках клеточной поверхности облигатно-галофильной археи Halobacterium salinarium обнаружены коллагеноподобные последовательности Этот факт является важным как для характеристики самих белков, так и с эволюционной точки зрения

3 С использованием высокоспецифичного теста - бактериальной клостридиопептидазы было продемонстрировано, что в клеточных стенках дрожжей с низким содержанием хитина, а именно Hansenula polymorpha и Candida utilis присутствуют белки с коллагеноподобными последовательностями, которые не были обнаружены в белках клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae с относительно высоким содержанием хитина

4 Нарушения структуры клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вызванные делецией глюкантрансферазы Bgl2p, компенсируются хитином, в то время, как «хитиновая» компенсация при подобных нарушениях в клеточной стенки дрожжей Hansenula polymorpha отсутствует

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 Карпова Е В, Калебина Т С, Кулаев И С Обнаружение коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной поверхности Я sahnarium II Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов - 2000", Выпуск 4, с 33

2 Karpova Е V . Kalebina Т S Identification of collagen-like sequences in cell envelope proteins of Halobacterium sahnarium II International symposium, Pushchino, 2000, (program and abstracts), p 67

3 Kalebina T S , Launnavichiute D К, Karpova E V , Nasonov V V, Bovin N V, Kulaev IS// On the role of Saccharomyces cerevisiae cell wall glucantransferase Bgl2p in the formation of the cell wall molecular assembly Yeast Genetics & Molecular Biology Meeting, University of Washington, Seattle, USA 2000, (program and abstracts) p 82

4 Калебина T С , Карпова E В . Кулаев И С Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной оболочки Halobacterium sahnarium II Микробиология 2001,Т 70, №4с 574-575

5 Карпова Б В .Лауринавичюте ДК, Соколов СС, Агафонов МО, Калебина ТС Электронно-микроскопический и биохимический анализ изменений в клеточной стенке, обусловленный мутациями в генах BGL2 и CHS3 S cerevisiae и РМТ1 Н polymorpha //I Съезд микологов России (тезисы докладов), Москва, 2002 с 164

6 Карпова Е В . Алексеева О В , Аверина Т А, Федорова Н В , Назимов И В , Моренков О С , Баратова Л А, Калебина Т С Новый подход к изучению локализации и структурной роли белков клеточной стенки дрожжей Candida utilis II III съезд биохимического общества (тезисы научных докладов), Санкт-Петербург, 2002, с 79

7 Karpova Е V . Kalebina Т S , Suzina N Е , Launnavichiute D К, Duda V I,

Kulaev I S The compensating effect of the BGL2 disraption m Saccharomyces cerevisiae cells lacking CHS3 II Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Washington, Madison(program and abstracts), 2002, pi 13

8 Karpova E V . Kalebina T S , Kulaev I S Revealing of collagen-like sequences m the microorganisms of different taxonomic groups // FEMS Congfess of European Microbiologists, Slovema (Abstract book), 2003, p 174

9 Калебина T С , Плотникова T A, Карпова E В . Кулаев И С Новое фенотипическое проявление делеции гена глюкантрансферазы Bgl2p клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae //Микробиология 2006, Т 75, №5, с 717-719

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карпова, Елена Витальевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Клеточная поверхность Архей. 6 1. Клеточная поверхность археи На1оЬааегшт %а1тагшт

1.1. Мембранные белки На1оЬас(егшт за1тагшт.

1.2. Гликопротеин Б-слоя клеточной поверхности На1оЬас1епит ьаИпапит

1.2.1. Аминокислотный и карбогидратный анализ.

1.2.2. Гликозилирование.

1.2.3. Липидная модификация. 19 II. Клеточная поверхность микроорганизмов, относящихся к домену Эукариоты.

1. Клеточная стенка дрожжей.

1.1. Белки.

1.1.1. Белки, нековалентно связанные с клеточной стенкой дрожжей.

1.1.2. Белки, содержащие гликозилфосфоинозитольный якорь (ОР1 - белки). 31 Ы.З.Белки, содержащие внутренние повторы в аминокислотной последовательности (РШ-белки).

1.2. Глюкан.

1.2.1. р-1,3-глюкан.

1.2.2. р1,6-глюкан.

1.3. Хитин. 41 ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 44 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 45 1. Используемые в работе штаммы микроорганизмов.

2. Состав сред для выращивания микроорганизмов и условия культивирования.

2.1. Среда для выращивания археи На!оЬас(егшт мйтагшт

2.2. Среда для выращивания дрожжей

2.3. Условия выращивания микроорганизмов.

3. Приготовление препаратов клеточных стенок

3.1. Приготовление препаратов клеточных стенок археи НаЬЬаШпит закпапит, используя постепенное понижение концентрации солей

3.2. Приготовление препаратов клеточных стенок археи НаЬЬаШпит ьаНпапит с использованием стеклянных шариков баллотини.

3.3. Приготовление препаратов клеточных стенок дрожжей с использованием стеклянных шариков баллотини.

4. Микроскопические методы. 48 4.1. Метод фазового контраста 48 4.2 Метод флуоресцентной микроскопии.

4 3. Электронная микроскопия клеток (клеточных стенок) дрожжей.

4.4. Электронная микроскопия клетосных поверхностей Halobacterium bahnarium.

5. Фракционирование белков клеточной стенки.

5 1. Получение фракции нековалентно связанных с клеточной стенкой белков. 50 5 2 Получение фракции ковалентно связанных с клеточной стенкой белков

6. Электрофоретические методы.

6.1. Электрофорез в денатурирующих условиях.

6.1.1. Окраска белков при помощи красителя Кумасси.

6.1.2. Окраска белков при помощи нитрата серебра.

6.2. Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану

Вестерн-блот анализ).

7. Биотинилирование белков.

8. Получение очищенного препарата клостридиопептидазы. 54 8.1. Электрофорез коллагеназы в неденатурирующих условиях. 54 8 2. Подготовка субстрата коллагена для определения коллагенолитической активности клостридиопептидазы.

8.3. Определение коллагенолитической активности клостридиопептидазы с помощью электрофореза в денатурирующих условиях 55 8 4. Определение протеолитической активности в препаратах коллагеназы по гидролизу окрашенного казеина.

9. Обработка клеточных стенок микроорганизмов протеолитическими ферментами.

9.1. Обработка клеточных стенок микроорганизмов трипсином.

9.2. Обработка клеточных стенок микроорганизмов клостридиопептидазой. 56 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 57 1. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной поверхности археи Halobacterium salinanum и клеточной стенки некоторых видов дрожжей.

1.1 Очистка коллагеназы Clostridium histolyticum с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях.

1.1.1. Проверка коллагенолитической активности полученного препарата клостридиопептидазы.

1.1.2. Проверка присутствия в очищенном препарате клостридиопептидазы протеолитической активности.

1.1.3. Определение влияния присутствия NaCl в среде инкубации на активность коллагеназы.

1.2. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной поверхности археи Halobacterium salinarium.

1.2.1. Подбор оптимальных условий для выделения клеточных поверхностей археи Halobacterium salinarium.

1.2.2. Воздействие клостридиопептидазы на клеточные поверхности Halobacterium salinarium

1.3. Идентификация коллагеноподобных последовательностей в белках клеточной стенки дрожжей.

1.3.1. Подбор оптимальных условий для выделения клеточных стенок дрожжей.

1.3.2. Воздействие клостридиопептидазы на клеточные стенки дрожжей.

1.3.3. Сравнение состава белковых фракций клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenulapolymorpha и Candida utilis

1.3.4. Воздействие клостридиопептидазы на фракцию PIR-белков клеточных стенок дрожжей Hansenula polymorpha и Candida utilis

1.3.5. Проверка чувствительности клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha и Candida utilis к протеолитической деградации использованием фермента трипсина.

1.3.6. Изучение роли О-гликозилирования белков в поддержание структурной целостности клеточной стенки дрожжей.

2. Изучение роли полисахаридных компонентов клеточной стенки дрожжей в структурной организации этой органеллы клетки.

2.1. Сравнительный анализ уровня хитина в клеточной стенкие дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha и Candida utilis. 2.2 Изучение роли глюкантрансферазы Bgl2p в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей Hansenula polymorpha и Saccharomyces cerevisiae.

2.3. Изучение структурной роли хитина в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae

2.4. Исследование морфологии двойного мутанта дрожжей Saccharomyces cerevisiae с нарушенными генами BGL2 и CHS

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное изучение роли белка и полисахаридов в молекулярной организации клеточной поверхности археи Halobacterium salinarium и клеточной стенки некоторых видов дрожжей"

Одним и* важнейших компартментов клегки микроорганизмов является клеточная поверхность (KII), в состав которой входит клеточная стенка (КС), цитоплазматическая мембрана и, в некоторых случаях, перишшматическое пространство. КС представляет собой внешнюю часть КП Она играет роль наружного скелета клетки, выполняет защитную функцию и осуществляет комплекс взаимоотношений клетки с окружающей средой Таким образом, КС является важной и мнотфункциональной органеллой клетки, которая офажает основные особенности микроорганизма, в зависимости от условии его обитания и принадлежности к той или иной филогенетической группе Это делает КС весьма интересным объектом для изучения.

Основными структурными компонентами КС микроорганизмов являются белки различной степени гликозилировапия и полисахариды Следует отметить, однако, что компонентный состав КС микроорганизмов различной видовой и таксономической принадлежности может существенно отличаться (Kandier, Konig, 1993, Klis, 1994, Калебина, Кулаев, 2001)

Белки выполняют двоякую функцию в КС: ферментативную, участвуя во встраивании структурных компонентов в КС и функцию структурного модуля Для исследователей белки КС, также, могут являйся важным маркером для изучения процессов эволюции Последнее можно отнести, например, к белкам, относящимся к семейству коллагенов Как известно, именно колла1епы являются важными структурными белками высших эукариот животного происхождения В связи с этим интересно было бы проследить, прису1ствуют ли белки с коллагепоподобными последовательное ¡ями в белках КС микроорганизмов, находящихся на разных стадиях эволюционного развития Основанием для поиска таких белков в составе КП микроорганизмов явились работы М В Нурмипской (Нурминская и др , 1994), выполненные в нашей лаборатории Помимо этого, сравнительное исследование белкового состава КС микроорганизмов, относящихся к разным филогенешческим группам, даст возможность проследить основные этапы эволюции КС у разных микроорганизмов

Другой струк1урныи компонент КС - полисахариды служат опорным материалом жес1ких кчеточных стенок (хитин, глюкан, целлюлом), выполняют защитные функции (капсульные иолиахариды), а также служат в качестве энергешческого резерва клетки (BaiaöoB, 1988) Гидрофильные полисахариды способствуют поддержанию водного баланса клеток Особенно важную роль играют полисахариды в образовании клеточных поверхностей, характеризующихся набором различных типов молекул полисахаридов, входящих в их состав Так, например, КС грибов - оомицегов состоя!, в основном, из целлюлозы и глюкана, а пе хитина, как у большинства дру!их мицелиальных грибов

Таким образом, сравнительное изучение роли основных структурных компонентов в молекулярной организации КП микрооршнизмов из разных филогенетических групп является важной и актуальной в настоящее время задачей Особенно актуальным является изучение КП архей, сравнительно недавно охарактеризованною домена живых существ, в первую очередь, в контексте сравнения присутствующих на их поверхностях белков и полисахаридов с компонентами КС дрожжей - представителей низших эукариот

Обзор литературы.

I. Клеточная поверхнос1ь Архей.

Важным открытием в области микробиологии явилось выявление нового домена живой природы - Архей (Архебактерии) (Wose et all., 1990)

Следует отметить, что па филогенетическом древе (рис 1) домен Архей разделен на два царства Кренархеоы и Эвриархеота (рис 1) Царство Крснархеота представляв собой достаточно roMoiennoe сообщество, включающее сравнительно узкую ipynny экстремально термофильных архей. Эвриархеоты (от греческою eurys - широкий) включает все архейные типы, основными из которых являются метаногены и их фенотипически близкие формы.

В результате исследования особенностей жизнедеятельности и ор[анизации клеточных структур у представителей этого домена жизни было выяснено много интересных с эволюционной точки зрения фактов.

Самой удиви 1ельной особенностью архей является их обитание в экстремальных условиях жизни, в связи с этим некоторые гены у представителей домена Архея являются уникальными, как было показано в результате проведенных генетических и биохимических экспериментов (Graham etal, 2000) Поэтому они могут выживать в среде, которая до последнего времени считалась неприемлемой для поддержания жизни (Lubberi 1995) Следует отметить, что микроорганизмы, обитающие в таких экстремальных ареалах, как правило, лишены возможности конкурировать с другими группами микроорганизмов Поэтому архей гораздо менее нуждаются в молекулярной адаптации с помощью мутаций, чем другие микроорганизмы, например бактерии Следовательно, архей не без основания относят к «low-clock» (медленно эволюционирующим) организмам Таким образом, они могут больше походить на своих предков, чем эукариоты и бактерии (Lubben, 1995) Благодаря этому изучение структурных и биохимических особенностей клеток архей и, в частности, их КП особенно важно для прослеживания эволюционных отношений между доменами

Помимо этого археи не являются однородным сообществом организмов Некоторые типичные преде ивители живут при экстремально высоких температурах (термофилы) или при высокой концентрации солеи (галофилы), тогда как другие обладают уникальными метаболистическими путями, подобный метановым сообществам, которые требуют стро! их анаэробных условии (метаногепы) (Lubben, 1995 )

1 акое разнообразие в предпочтении к необычным условиям обитания говорит и о возможности существования различных типов КП внутри домена Археи.

IIa основании исследования полимеров КП было построено филогенетическое древо Архей (рис. 1) Как видно на этом рисунке разные археи не обладают одним и тем же компонентом в составе клеточной стенки (Kandier, Konig, 1998).

Полимеры клеточной стенки и клеточной поверхности

Л I! С II Л Г Л lulococtui" ILlIrrfuclcr 1Ш

КЛгоооюсси*4 МгIhano . LaUcriun Arelix

КСЛКТЛ * мезофилы умеренные термофилы

4hanopUmjsO "Vtharxuplrlllie^ Hettunoi»rctiu*

Euryarchaeota ltemoplas«^ l клгипосмт1^ t I jannaschii 7 i<incus „ 3 Ihcrwlllholro 4 vannicf!I

Hu rmoirxrus

H II л | jrr js

ПАИШЛ. псевдомуреин ф сульфатированный гетерополисахарид щ метанохондроитин глюкозаминогликан

О гликопротеин S-слоя Q протеин S-слоя д протеин оболочки гликокаликс гипертермофильиая линия

Рис I. Распространение клеточно-стеночных и клеточно-поверхностных полимеров среди архей (Kandier, Konig, 1993)

Это факт говорит о том, что общий предок в домене Археи не обладал специфическим клеточно-поверхносгным полимером Таким образом, в огличие от ситуации, обнаруженной в бактериальном домене, где, по крайней мере, муреин является наиболее широко распространенным и характерным полимером для КП бактериальных клеток, компоненты КП Археи эволюционировали независимо у различных систематических групп Подобная ситуация обнаружена в домене Эукариот (Kandier, Konig, 1998)

1ем не менее, в систематике архей присутствует кршерии, применяемый среди представителей домена Бактерии - реакция клеток на окрашивание по методу Грама По этому критерию археи делят на грамположительные и грамотрицательные

При отсутствии муреина в КП архей, ригидная КП в грамиоложительных археях сформирована полимерами отличной химической природы (псевдомуреном, метанохондраитином или i етерополисахаридом) (Kandier, Konig, 1998).

Для грамотрицательных архей, к которым относится преобладающее количество видов, не существует типичного профиля КП Общим в строении их КП является присутствие одинарного поверхностного слоя, который содержит протеиновую или i ликопротеиновую субъединицу и может выполнять функции, аналогичные экзополисахаридному гликокаликсу (гликопротеиновому комплексу, включенному в наружную поверхность цитоплазматическои мембраны в животных клетках) (Kandier, Konig, 1998)

На основании вышесказанного можно заключить, что КГ1 различных представителей домена археи обладают уникальными структурными и биохимическими особенностями, которые имеют отличительные черты и некоторое подобие как внутри домена Археи, так и на междоменном уровне

Следовательно, дальнейшее, более подробное описание особенностей КП Архей целесообразно проводить на примере одного, наиболее характерного и хорошо изученного к настоящему времени представителя лого уникального домена жизни. Таковой является облигатно-галофильная архея Halobaclerium salinarium, принадлежащая царству Эвриархеоты .

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Карпова, Елена Витальевна

выводы.

1. Воздействие высокоспецифичного в отношении фибриллярного белка коллагена фермента клостридиопептидазы Clostridium histolyticum на клеточные поверхности микроорганизмов, в частности, археи Halobactermm salinarium и дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha и Candida utilis является простым и эффективным методом для выявления присутствия коллагеноподобных последовательностей в белках этой клеточной органеллы.

2. С помощью клостридиопептидазы Clostridium histolyticum в белках клеточной поверхности облигатно-галофильной археи Halobactermm salinarium обнаружены коллагеноподобные последовательности. Этот факт является важным как для характеристики самих белков, так и с эволюционной точки зрения.

3. С использованием высокоспецифичного теста - бактериальной клостридиопептидазы было продемонстрировано, что в клеточных стенках дрожжей с низким содержанием хитина, а именно Hansenula polymorpha и Candida utilis присутствуют белки с коллагеноподобными последовательностями, которые не были обнаружены в белках клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae с относительно высоким содержанием хитина.

4. Нарушения структуры клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вызванные делецией глюкантрансферазы Bgl2p, компенсируются хитином, в то время, как «хитиновая» компенсация при подобных нарушениях в клеточной стенки дрожжей Hansenula polymorpha отсутствует.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В результате проведенных в рамках этой работы исследований было выявлено, что прокариотический микроорганизм - облигатно-галофильная архея Н ясАтапит имеет некоторые общие черты строения клеточной поверхности с низшими эукариотами. Несмотря на простоту строения КС этого микроорганизма, в ее состав входят элементы таких структурных компонентов, как коллаген и хитин, характерных для высших эукариот. Эти данные еще раз подтверждают современные представления о том, что именно археи (по крайней мере, некоторые из них) являются предками эукариотических клеток (ОзЫша,1994).

В отличие от археи Н заИпапит, дрожжи имеют более сложноорганизованную КС, в состав которой входят как белковые (гликопротеиновые), так и полисахаридные компоненты. Соотношение этих компонентов КС у разных видов дрожжей различно.

Таким образом, по-видимому, у древних архей и у низших эукариот важную роль в молекулярной организации КС, несмотря на малое количество, играют белки с коллагеноподобными последовательностями и хитин соответственно. Причем у дрожжей с низким содержанием хитина коллагеноподобные последовательности также выявлены и играют важную структурную роль. До сих пор эти соединения считали важными компонентами клеток, в основном, высших эукариот животного происхождения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карпова, Елена Витальевна, Москва

1. Вагабов В М (1988) Биосинтез у1леводных компоненюв клеточной стенки дрожжей // Пущино ОНТИ НЦБИ АН СССР

2. Калебина 1С, Кулаев И С (2001) Роль белков в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей II Успехи биол Химии 141 С 105-130

3. Калебина ТС., Нурминская MB, Чжан С, Чертов ОЮ, Руденская ГН, Степанов ВМ, Кулаев И С (1994) Про1еиназы с различной субстрашой специфичностью в струк1урных изучениях клеточной стенки дрожжей С utihs II Биоорг Химия Т 20, с 627-634

4. Лауринавичюте Д К, Бовин НВ, Насонов В В, Моренков ОС, Калебина I С, Кулаев И С (2000) Влияние нарушения гена BGL2 на структурные изменения в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae //Докл Акад Наук Т372, № 3, с. 407-409

5. Михайлов AT, Симирский ВII (1991) Методы иммунохимическою анализа в биологии развшия //М, Наука, с 287

6. Нурминская MB, Калебина ТС, Ройтберг М.А, Кулаев И С (1994), Распространение в геномах микроорганизмов фрагментов гомологичных кДНК про al(l) кочлагена цыпченка IIМикробиология Т 63, вып 1, с. 86-89

7. Северина Л О (1995) Бактериальные S-слои // Микробио шгия Т 64, №6, с 725-733

8. Степанов В М (1996) Молекулярная биология Структура и функции белков (Под редакцией академика А С Спирина) Москва «Высшая шкоча» (1996)

9. Abeijon С , Orlean Р, Robbins Р W , Ilirschberg С В (1989) Topography of glycosylation m yeast // Proc Natl Acad Su USA Vol 86, pp 6935-6939

10. Aguilar-Uscanga B, Francois JM (2003) A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation // Lett Appl Microbiol Vol 37, pp 268-274

11. Alloush HM, Lopez-Ribot J M ,Masten В J, Chaffin WL (1997) 3-phosphoglycerate kinase a glycolytic enzyme protein present in the cell wall of Candida albicans // Microbiology Vol 143, pp 321-330

12. Andrews P D , Stark M J R ( 2000) Dynamic, Rholp-dependent localization of Pkclp to sites ofpolari/ed growth //J Cell Sci Vol 113, pp 2685-2693

13. Ash J , Domínguez M , Bergeron J J M , Thomas D Y., Bourbonnais Y (1995) The yeast proprotein convertase encoded by YAP3 is a glycophosphatidylinositol-anchored protein that locali/cd to the plasmamembrane IIJ Bwchem Vol 270 pp 20847-20854

14. Ballou С E (1990) Isolation, characterization, and properties of Saccharomyces cerevisiae mnn mutants with nonconditional protein glycosylation defects // Melh hnzymol Vol.185, pp. 440-470

15. Bahler J (2005) Cell-cycle control of gene expression in budding and fission yeast // Annu Rev Genet Vol 39, pp 69-94

16. Blaurock A F , Stoeckcnius W , Oesterhelt D , Scherphof G (1976) Structure of the cell envelope of Halobaclenum halobium //J Cell Biol Vol 71, pp 1-22

17. Bond M D, Van Wart HF (1984) Relationship between the individual collagenases of Clostridium histolytieum evidence for evolution by gene duplication J/Biochemistry V 23, no 13, pp 3092-3099

18. Bond M D , Van Wart II F (1984 a) Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolytieum // Biochemistry V 23, pp 3085-3091

19. Bond M D , Van Wart H E , Steinbrink D R (1985) Substrate Specificity of ß-Collagenase from Clostridium histolyticum II J Biol Chem V 260, no 5,pp 2771-2776

20. Brown J I , Bussey II (1993) The yeast KRL9 gene encodes O-glycoprotein involved in cell surface ß-glucan assembly II Mol Cell Biol Vol 13, pp 6346-6356

21. Bruin E C, Werten M W 1 , Laane C, de Wolf T A (2002) Endogenous prolyl 4-hydroxylation in Hansenula polymorpha and its use for the prodaction of hydroxylated recombinant gelatin //TEMS V I, pp 291-298

22. Butt T M , Hoch H C , Staples R C , Leger R J S (1989) Use of fluorochromes in the study of fungal cytology and differentiation //Exp Mycol V 13, pp 303-313

23. Cabib h , Bowers B (1971) Chitin yeast budding localization ol chitin in yeast bud scars// J Biol Chem Vol 241, no I, pp 152-159

24. Cabib E, Drgonovd J, Drgon 1 (1998) Role of small G protlins in ylast cell POIARIZA i ION AND WAIL biosynthesis//ANNU RFV BlOCIlFM VOL 67, 307-333

25. Cabib E, Duran A (2005) Synthase Ill-dependent chitin is bound to different acceptors depending on location on the cell wall of budding yeast II.J Biol Chem Vol 280, no 10, pp 9170-9179

26. Cabib E, Parkas V /1971) The control of morphogenesis, an en/ymatic mechanism for the initiation of septum formation in yeast // Proc Natl Acad Sei USA Vol 9, pp.2052-2056

27. Cabib F, Bowers B, Roberts RL (1983) Vectorial synthesis of a polysaccharide by isolated plasma membranes // Proc Natl Acad Sei USA Vol 80, pp 3318-3321

28. Cabib E, Sburlati a, Bowers B, Silverman SJ (1989) Chitin synthase 1, an auxiliary enzyme for chitin synthesis in Saccharomyces cerevisiae // J Cell Biol Vol 108, pp 16651672

29. Cabib E, Silverman SJ, Shaw JA (1992) Chitinase and chitin synthase 1-counterbalancing activities in cell separation of Saccharomyccs cerevisiae // J Gen Microbiol. Vol 138, pp 97-102

30. Cabib L , Roh D H , Schmidt M, Crotti L.B, Varma A (2001) The yeast cell wall and septum as paradigms of cell growth and morphogenesis //./ Biol Chem. Vol 276, pp 1967919682

31. Cappellaro C, Baldermann C, Rachel R, Tanner W (1994) Mating type-specific cell-cell recognition of Saccharomyces cerevisiae cell wall attachment and active sites of a- and «-agglutinin IILMBOJ Vol 13, pp 4737-4744

32. Cappellaro C, Mrsa V, Ianner W (1998) New potential cell wall glucanases of Saccharomyces cerevisiae//J Bacteriol Vol 180, pp 5030-5037

33. Caro LHP, Smits G J, Van Egmond P , Chapman J W , Klis F M (1998) Transcription of multiple cell wall protein-encoding genes in Saccharomyces cerevisiae is differently regulated during the cell c>clc IIFEMS Microbiol Lett Vol 161, no 2, pp 345-349

34. Caro I H P , Tettelin H , Vossen J H , Ram A 1 J , Van Den Ende H , Klis F M In silieio identification of glycosyl-phosphatidylinositol-anchored plasma-membrane and cell wall proteins of Saccharomyces cerevisiae II Yeast Vol 13 pp 1477-1489

35. Casanova M , Chaffin W L (1991) Phosphate-containing proteins and glycoproteins of the cell wall of Candida albicans II Infect Immun Vol 59, no3,pp 808-813

36. Chaffin W J , Lopez-Ribot J L , Casanova M , Go/albo D , Martinez J P. (1998) Cell wall and secreted proteins of Candida albicans, identification, function and expresion // Microbiol Mol Rial Rev Vol 62, 130-180

37. Charalambous BV, Keen JN, McPherson MJ (1988) Collagen-like sequences homotrimcrs of a bacterial hydrolase // EMBO J Vol 7, no. 9, pp 2903-2909.

38. Cho K Y, Doy C II, Mercer L II (1967) Ultrastructure of the Obligate Halophihc Bacterium Halobactet mm halobium IIJ Bacterial Vol 94, no 1, pp 196-201

39. Choi W J , Santos B , Duran A , Cabib E (1994) Are yeast chitin synthases regulated at the transcriptional or the posttranscnptional level //Mol Cell Biol Vol 14, pp 7685-7694

40. Cid V J , Duran A , del Rey T , Snyder M P , Nombela C., Sanchez M (1995) Molecular basis of cell integrity and morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae II Microbiol Rev Vol 59, pp 45-386

41. Con/elmann A, Riezman H, Desponds C, Bron C (1988) A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an mositol-contaimng phospholipid // EMBO J Vol 7, pp 2233-2240

42. Conzelmann A, Puoti R L, Lester L, Desponds C (1992) Two different types of lipid moieties are present in glycerol phosphatidylinositol-anchored membrane proteins of Saccharomyces cerevisiae // EMBO J Vol 11, pp 457-466

43. Cui X , Shin H , Song C , Laosinchai W , Amano Y , Brown J R M. (2001) A putative plant homolog of the yeast beta-l,3-glucan syntase subunit FKS1 from cotton (Gossypium hirsutum I ) fibers //Planta Vol 213, pp 223-230

44. De Groot, P W , De Boer, A D , Cunningham, J, Dekker, H L , De Jong, I , Hellingwerf, K J (2004) Proteomic analysis of Candida albicans cell walls reveals covalently bound carbohydrateactive enzymes and adhesins // Lukaryot Cell Vol 3, pp 955-965

45. De Groot PWJ, Hellingwerf KJ, Klis TM (2003) Genomewide identification of fungal GPI proteins II Yeast Vol 20, pp. 781-796

46. DeGrootPWJ , Ram A F , Klis F M (2005) Features and functions of covalently linked proteins in fungal cell walls //Fungal Genetics and Biology V 42, pp 657-675

47. Delley P A , Hall M N (1982) Cell wall stress depolarizes cell growth via hyperactivation of RHOI//J Cell Biol Vol 147, pp 163-174

48. Duffus JII, I evi C, Manners DJ (1982) Yeast cell-wall giucans II Adv Microb Physiol Vol 23,pp 151-81

49. Ecker M, Deut/mann R, Lehle L, Mrsa V, Tanner W ( 2006) PIR-proteins of Saccharomyces cerevisiae are attached to beta -1,3-glucan by a new protein-earbohydrate linkage IIJBwlChem V 281, no 17, pp 11523-11529

50. Frnst J F , Prill S K -II (2001) O-glycosylation II Medical Microbiology Vol 39 67-74

51. Garcia-Rodriguez L J, Trilla J A , Castro C , Valdivieso M H , Duran A , Roncero C (2000) Characterization of the chitin biosynthesis proccss as a compensatory mechanism in the fksl mutant of Saccharomyces ccrcvisiae // FEBSI etts, V 478, pp 84-88

52. Gaynor h C , Mondesert G , GriMMe S J, Reed S I, Orlean P , Emr S D (1999) MCD4 encodes a conserved endoplasmic reticulum membrane protein essential for glycosylphosphatidyhnositol anchor synthesis in yeast // Mol Biol Cell .Vol.10, pp 627648

53. G ebb ink M. r B G, Claessen D, Barend B , Dijkhuizen L, Wosten Han A ( 2005 ) Amyloids-a functional coat for microorganisms II Microbiology V 3, no 4, pp 333-341

54. Gentzsch M, Tanner W (1996) The PMT gene family protein glycosylation in Saccharomyces cerevisiae is vital // FMBOJ Vol. 15, pp 5752-5759.

55. Gentzsch M, Tanner W (1997) Protein O-glycosylation in yeast protein-specific mannosyltransferases // Glycobwlogy Vol 7, pp 481-486

56. Graham DF, Overbeek R, Olsen GJ, Woese CR (2000) An archaeal genomic signature // Proc Natl AcadSu U S A V 97, no 7, pp 3304-8

57. Helenius A, Aebi M (2001) Intracellular Runction of/V-hnked glycans //Science Vol 291, pp 2364-2369

58. Herscovics A , Orlean P (1993) Glycoprotein biosynthesis in yeast // FASEB J Vol 7, pp 540-550

59. Hounsell h T , Davies M J, Renouf D V (1996) O-linked protein glycosylation structure and function II Glycoconj J Vol 13 19-26

60. Hoyer L I , Scherer S , Shatzman A R , Livi G P (1995) Candida albicans AI SI domains related to a Saccharomyces cerevisiae sexual agglutinin separated by a repeating motif // Mol Microbiol Vol 15, pp 39-54

61. Hu Y, Webb F , Singh J, Morgan B A , Gainor J A , Gordon I D , Siahaan T J (2002) Rapid determination of Substrate Specificity of Clostridium histolyticum ß-Collagenase Using an Immobilized Peptide Library II J Biol Chem V 277, no 10, pp 8366-8371

62. Immervoll 1 , Gentzsch M , fanner W (1995) PMT3 and PMT4, two new members of the protein-O-mannosyltranslerase gene family of Saccharomyces cerevisiae II Yeast Vol 11, pp 1345-1351

63. Jigann Y, Odani T (1999) Mannosylphosphate transfer to yeast mannan // Biochim Bwphys Acta V 1426, pp 335-345

64. Jung C-M, O Matsushita, S Katayama, J Minami, J Sakurai, A. Okabe (1999) Identification of Metal Ligands in the Clostridium histolyticum Colli Collagenase // J Bacteriol V 181, no 9, pp 2816-2822

65. Kalebina T S , Sokolov S S , Arbatskii N P , Agafonov M O ,Plotmkova T A , Sobolev D F ,Gellissen G,Kulaev IS (2003) Is the chitin repair mechanism universae in yeast// Antone Van Leeuw. V 84(3), pp 179-184

66. Kandier O, Konig H (1993) Cell envelope of Arhaea: structure and chemistry // 7he Biochemist}y of Arhaea (Archabacteria) Vol 8, pp 223-259

67. Kandier O , Konig II (1998) Cell wall polymers in Archaea (Archebacteria; //CMLS Cell and Molecular Life Sciences Vol 54, pp 305-308

68. Kapteyn J C , Hoyer I L , Ilecht J E , Mullcr W H , Andel A , Vcrkleij A J , Makarow M , Van Den Ende II, Klis T.M (2000) The cell wall architecture of Candida albicans wildtype cells and cell wall-defective mutants // Mol Microbiol Vol 35, pp 601-611

69. Kapteyn J C , Van Den bnde H , Klis F M (1999a) The contribution of cell wall proteins to the organization of the yeast cell wall // Biophys Biothem Ada Vol 1426, pp 373-383

70. Karlstrom A, Jacobsson K, Guss B (2006) SclC is a member of a novel family of collagenlike proteins in Streptococcus equi subspecies equi that are recognised by antibodies against SclC // Vet Microbiol V 114, pp 72-81

71. Kaur R, Domergue R, /upancic ML, Cormack BP (2005) A yeast by any other name Candida glabrata and its interaction with the host // Curr Opin Microbiol Vol 8, pp 378384

72. Kessel M , Wildhaber I, Cohen S , Baumcister W (1988) 1 hree-dimcnsional structure of the regular glycoprotein layer of Halobacierium volcanu from the Dead Sea LMBO J , v 7, 1549-1554

73. Kitagaki II, Shimoi H, Itoh K /1997) Identification and analysis of a static culture-specific cell wall protein, Tirlp/Srplp in Saccharomyces cerevisiae II Eur J Biochem Vol 249, pp 343-349

74. Klein C, Garcia-Rizo C, Bisle B, Sheffer B , Zischka II, Pfeiffer F Siedlcr T, Oesterhelt D (2005) The membrane proteome of Halobacierium salinarium 11 I'roteomics V 5, pp 180-197

75. Klis T M (1994) Review cell wall assembly in yeast // Yeasl Vol 10, no 7, pp 851-869

76. Klis FM, Mol P, Helhngwerf K, Brul S (2002) Dynamics of cell wall structure in Saccharomyces cerevisiae //PFMS Vol 738, pp 1-18

77. Klis FM, Caro LI I, Vossen JH (1997) Identification and characterization of a major building block in the cell wall of Saccharomyces cerevisiae II Bwchem Sot Trans Vol 25, pp 856-860

78. Klis 1 M, Boorsma A, De Groot PW (2006) Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae // Yeast V 23, no 3,pp 185-202

79. Kloda A, Martinac B (2002) Common evolutionary origins of mechanosensitive ion channels in Archaea, Bacteria and cell-walled Eucarya // Archaea V 1, pp 35-44

80. Kobayashi T, Nishizaki R, Ikezawa H (1997) I he presence of GPl-linked protcin(s) in an archaeobacterium, Sulfolobus acidocaldanus, closcly related to eukaryotes // Biochim Bwphys Ada V 1334, no l,pp 1-4.

81. KonigH (1988) Archaeobactenal cell envelopes CAN IIJ Microbiol V 34, pp 395-406

82. Kono 1 (1968) Purification and partial characterization of collagenolytic en/ymes from Clostridium histolyticum // Biochemistr V 7, no 3, pp 1106-1114

83. Kopecka M (1986) Assembly of microfibrills in vivo and in vitro fron (l-3)-|3-D-glucan from yeast cell walls //Arch Microbiol Vol 143, pp 387-395

84. Kopecka M , Phaff H J, Tleet G II (1974) Demonstration of a fibrillar component in the cell wall in the yeast Saccharomyces cerevisiae and its chemical nature // J Cell Biol V 62, pp 66-76

85. Kornacker MG, Pugsley AP (1990) Molecular characterization of pulA and its product, pullulanase, a secreted enzyme of Klebsiella pneumoniae IJNF5023 // Mol Microbiol V 4, no 1, pp 73-85

86. Koval S T (1988) Paracrystalline protein surface arrays on bacteria II Can J Microbiol V 34, pp 407-414

87. I aemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 II Nature Vol 227, pp 680-685.

88. I ehle I , Bause L (1984) Enzymatic N-glycosylation and ()-glycosylation of synthetic peptide acceptors by dohchol-linked sugar derivatives in yeast II Biochim Biophys Acta Vol 799, pp 246-251

89. Lipke P, Ovalle R (1998) Cell wall architecture in yeast new structure and new challenges IIJ Dacleriol Vol 180, pp 3735-3740

90. Lubbcn M (1995) Cytochromes of archaeal electron transfer chains (Review) //Biochim et Biophys Ada Vol 1229, pp 1-22

91. Lussier M, Gentzsch M, Sdicu A-M , Bussey H, Tanner W (1995) Protein O-glycosylation in yeast The PM12 gene specifies a second protein O-mannosyltransferase that functions in addition to the PM11-encoded activity IIJ Biol Chem Vol 270, pp 2770 -2775

92. Manners D J , Masson A J, Patterson J C (1974) The heterogeneity of glucan preparation from the walls of various yeasts IIJ Gen Microbiol Vol 80, pp 411-417

93. Manners D J , Masson A J , Patterson J C (1973) I he structure of a beta-(l lead to 3)-D-glucan from yeast cell wall // Biochem J Vol 135, pp 19-30.

94. Matsushita O , Jung C -M , Minami J , Katayama S , Nishi N , Okabe A (1998) A study of the collagen-binding domain of a 116-kDa Clostridium histolyticum collagenase IIJ Biol Chem V 273, pp 3643-3648

95. Matsushita O , Jung C -M, Katayama S , Minanu J , Iakahashi Y , Okabe A (1999) Gene Duplication and Multiplicity of Collagenases in Clostridium histolyticum // J Bacteriol V 181, no 3, pp 923-933

96. Matsushita O , Koide T, Kobayashi R, Nagata K , Okabe A Substrate (2001) Recognition by the Collagen-binding Domain of Clostridium histolyticum Class I Collagenase IIJ Biol Chem V 27, pp 8761-8770

97. H6MescherM F, Strominger JI (1976 A) Structural (shape-maintaining) role of the cell surface glycoprotein of Halobacterium salinarium //Proc Natl AcadSci USA V 73, no 8, pp 2687-2691

98. Mescher M F , Strominger J L , Watson S.W (1974) Protein and carbohydrate composition of the cell envelope of Halobacterium salinarium II J Bacteriology V 120, no 2, pp 945954

99. Molano J , Bowers B , Cabib L (1980) Distribution of chitin in the yeast cell wall A structural and biochemical study //J Cell Dial Vol 85, pp 199-212

100. Montijn R C , Vink F , Muller W II, Verkleij A J , Va Den Lnde H , Henrissat B , Klis F M. (1999) Localization of synthesis of |}l,6-glucan in Saccharomyces cerevisiae IIJ Bacteriol V 181, pp 7414-7420

101. Mookhtiar K A , Van Wart H L (1992) Clostridium histolyticum collagenases a new look at some old en/ymes // /Matrix Suppl V 1, pp 116-26

102. Mouassite M , Camougrand N , Schwob E , Demaison G , Laclau M , Guenn M (2000) I he 'SUN' family yeast SUN4/SCW3 is involved in cell septation // Yeast Vol 16, pp 905919

103. Mrsa V , Seidl T, Gent/sch M , Tanner W (1997) Specific labelling of cell wall proteins by biotynilation Identification of four covalently linked O-mannosylated proteins of Saccharomyces cerevisiae II Yeast Vol 13, pp 1145-1154

104. Mrsa V , Tanner W (1999) Role of NaOH-extractable cell wall proteins Ccw5p, Ccw6p, Ccw7p and Ccw8p (members of the Pir protein family) in stability of the Saccharomyces cerevisiae cell wall II Yeast Vol 15, pp 13-820

105. Nakayama K , Teng Y , Tamaka A , Jigann Y (1998) 1 he involvement of mnn4 and mnn6 mutations in mannosyl phosphorylation of O-linked oligosaccharide in yeast Saccharomyces setevisiae. II Biochim Biophys Acta Vol 1425 255-262

106. Nurminskaya M V , Kalebina T S , Nurminsky D I, Kulaev I S (1993) Analysis of Candida utilis genomic DNA, homologous to cDNA of chicken Al(l) collagen gene// Arch Microbiol Vol 160, pp 329-331

107. Olden K , Bernard B A , Humphries M J , Yeo T-K , White S I , Bauer H C (1985) Function of glycoprotein glycan III IBS V 10, pp 78-82

108. Osumi M (1998) The ultrastructure of yeast cell wall structure and formation // Micron Vol 29, pp 207-233

109. Pakkanen 0, Ilamalainen F-R, Kivinkko K I, Myllyharju J (2003) Assembly of stable human type I and III collagen molecules from hydroxylated recombinant chains in the yeast Pichia pas torn IIJ Biol Chem ,V 278, no 34, pp 32478-32483

110. Paul G , Lottspeich F, Wieland F (1986) Asparaginyl-N-acetylgalactosamine // J Biol Chemistry V 261, no 3,pp 1020-1024

111. Paul G, Wieland F (1987) Sequence of the Halobacterial glycosaminoglycan II J of Biological Chemistry V 262, no 20, pp 9587-9593

112. Pohlschroder M, Pnnz W, Hartmann H ,Beckwith J (1997) Protein translocation in the three domains of life variation on a theme //Cell V91,pp 563-566

113. Pohonlle A, Schweighofer K, Wilson M A. (2005) lhe origin and early evolution of membrane channels //Astrobiology V 5, no 1, pp 1-17

114. Popolo L and Vai M (1999) The Gasl glycoprotein, a putative wall polymer cross-linker // Biophys Biochem Acta Vol 1426, pp 385-400

115. Reynolds F S (1963) The use of lead citrate of high pH as an electronopaque stain inelectron microscopy//J Cell Biol V 17, pp 208-212.

116. Rocmer T, Bussey H (1991) Yeast p-glucan synthesis KRF6 encodes a predicted type II membrane protein required for glucan synthesis in vivo and for glucan synthase activity in vitro // Proc Natl Acad Sci USA Vol 88, 11295-11299

117. Sara M , Sleytr U B (2000) S-layer proteins IIJ Bacteriol V 182, no 4, pp 859-868

118. Schaffer C, Messner P (2001) Glycobiology of surface layer proteins Biochimic, v 83, №7,pp 591-599

119. Schaffer C , Messner P (2004) Surface-layer glycoproteins an example for the diversity of bacterial glycosilation with promising impacts on nanobiotechnology (Review) // Glycobiology V 14, no 8, pp 31R-42R

120. Schreiner R, Schabel L, Wieland F (1994) Novel N-glycosylation in eukanotes laminin contains the lineage unit P-glucosylasparagine IIJ of Cell Biology VI24, no 6, pp 10711081

121. San Segundo P, Correa J, de Aldana CR, del Rey F (1993) SSG1, a gene encoding a sporulation-specific 1,3-beta-glucanase in Saccharomyces cerevisiae //J Bacteriol Vol 175, no 12, pp 3823-37

122. Severina L 0 , Pimcnov N V , Plakunov V K (1991) Glucose transport into the extremely halophilic archaebactena II Arch Microbioligy V 115, pp 131-136

123. Schreuder MP (1994) In largeting of proteins to the ccll wall oi yeast and possible applications 109

124. Sentandreu R, Northcote DH (1968) Ihe structure of a glycopeptide isolated from the yeast cell wall//./ Biochem Vol 109,419-432

125. Sharon N (1984) Glycoproteins II TIBS V 9, pp 198-202

126. Shaw J A, Mol PC, Bowers B, Silverman SJ, Valdivieso MH, Duran A, Cabib E (1991) The function oi chitin synthases 2 and 3 in the Saccharomyces cercvisiae cell cycle // J Cell Biol Vol 114, pp 113-123

127. Shimoi H, Kitagaki II, Ohmori H, Iimura Y, Ito K Sedlp is a major cell wall protein of Saccharomyces cerevisiae in the stationary phase and is involved in lytic enzyme resistance J Bacteriol (1998) Vol 180, pp. 3381-3387

128. Sleytr U B , Messner P (1983) Crystalline surfacc layers on bacteria II Ann Rev Microbiol V 37, pp 311-339

129. Sleytr U B , Messner P (1988) Crystalline surface layers in procanotes (Mimreview) // J of Bacteriology V 170, no 6, pp 2891-2897

130. Sleytr U B , Sara M (1986) Ultrafiltratijn membranes with uniform pores from crystalline bacterial cell envelope layers (Mimreview) // Applied Microbiology and Biotechnology V 25, pp 83-90

131. Stoeckcnius W , Rowcn R (1967) A morphological study of Halobacterium halobium and its lysis in media oi low salt concrntration IIJ Cell Biol Vol 34, pp 365-393

132. Stokke B I , Elgsaetr A, Hara C, Kitamura S, Takeo K (1993) Physicochemical properties of 1-6 branched 1-3 P-D-glucans // Biopolymers Vol 33 561-573

133. Strahl-Bolsinger S , Gentzsch M , Tanner W. (1999) Protein O-mannosylation // Biochem Biophys Acta Vol 1426,297-307

134. Tanner W, Lehle 1 (1987) Protein glycosylation in yeast // Biochim Biophys Acta Vol 906 81-99

135. Teparic R , Stuparevic I, Mrsa V (2004) Increased mortality of Saccharomyces cerevisiae cell wall protein mutants //Microbiology Vol 150, pp 3145-3150

136. Timpel C , Strahl-Bolsinger S , Ziegelbauer K, Frnst J F. (1998) Multiple function of Pmtlp-mediated protein O-mannosylation in the iungal pathogen Candida albicans IIJ Biol Chem Vol 273, pp 20837-20846

137. Valdivieso Mil, Ferrario L , Vai M , Duran A , Popolo L. (2000) Chitin synthesis in dgasl mutant of Saccharomyces cerevisiae IIJ Bacteriol, V. 182(17), pp 4752-4757

138. Valentin L , Herrero F , Pastor F 1J, Sentandreu R (1984) Solubilisation and analysis of mannoprotein from the cell wall of Saccharomyces cerevisiae IIJ Gen Microbiol Vol 130, pp 1419-1428

139. Verstrepen KJ, Jansen A, I ewitter F, Fink GR (2005) Intragenic tandem repeats generate functional variability II Nat Genet V 37, pp 986-990

140. West C M (1986) Current ideas on the significance of protein glycosilation // Mol Cell Biochem V 72, pp 3-20

141. Wieland T (1988) Structure and biosynthesis of prokaryotic glycoproteins // Bwchimie V 70, no 11, pp 1493-504

142. Wieland F, Heitzer R, Schaefer W (1983) Asparaginylgllucose. novel type of carbogidrate linkage // Proc Natl Acad USA V 80,pp. 5470-5474

143. Wolters G H , Vos-Scheperkeuter G H , Lin II C , van Schilfgaarde R (1995) Different roles of class 1 and class II Clostridium histolyticum collagenase in rat pancreatic islet isolation // Diabetes V 44, no 2, pp 227-233

144. Wose C R , Kandier ü , Wheelis M (1990) Towards a natural system of organisms proposal for the domains Archaea, Bacteria and bucarya // Proc Natl Acad Sei USA V 87,pp 4576-4579

145. Wösten HAB (2001) Hydrophobins1 Multipurpose Proteins // Annu Rev Microbiol Vol 55, pp 625^16

146. Zubatov A S , Rainina B J , Buchwalov J B , I usifov V M (1979) A cytochemical study of the localisation of acid phosphatase in Saccharomyces cerevisiae at different growth phases //1hstochem J V. 11, no 2, pp 299-3101. Благодарности.

147. В первую очередь мне хотелось бы поблагодарить моих научных руководителей -Игоря Степановича Кулаева и Татьяну Сергеевну Калебину за руководство данной работой, а также советы и помощь в ее написании.

148. Также я хочу поблагодарить Нину Александровну Шанину за консультации при проведении экспериментов с использованием электрофоретических методов

149. Я очень признательна Даниеле Лауринавичюте, Ольге Алексеевой, Святославу Соколову, являющихся сотрудниками нашей лаборатории во время выполнения данной работы, за помощь в экспериментальной работе и поддержку

150. Благодарю также всех сотрудников и преподавателей кафедр молекулярной биологии и микробиологии, которые содействовали мне в выполнение диссертационной работы.

Информация о работе

Карпова, Елена Витальевна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Сравнительное изучение роли белка и полисахаридов в молекулярной организации клеточной поверхности археи Halobacterium salinarium и клеточной стенки некоторых видов дрожжей - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы