Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль белков в молекулярной организации клеточной стенки дрожжей Candida utilis

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль белков в молекулярной организации клеточной стенки дрожжей Candida utilis"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

РОЛЬ БЕЛКОВ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ДРОЗШЕЙ Candida util is C3.00.C3 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

на правах рукописи

Москва, 1994 г

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова

Научные руководители - Член-корреспондент РАН,

профессор И.С.Кулаев. Кандидат биологических наук, н.сотр. Т.С.Калебина

Официальные оппоненты - Доктор биологических наук

. Г.Г.Честухкна Доктор биологических наук В.М.Вагабов

Ведущая организация - Институт биохимии им.А.Н.Баха РАН

£0

Защита состоится "/3 " аекаУ^ " 1994 г. в /У часоЕ на заседании Специализированного Совета'Д.098.12.01 при государственном научно-исследовательском Институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва, 1 -й Дорожнь»

проезд, д. 1). '

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЮ генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Автореферат разослан "2Ь 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета:

кандидат биологических наук В.И.Щербакова

Актуальность темы. Изучение поверхности клеток микроорганизмов является в настоящее время одной из актуальных проблем молекулярной биологии. Клеточная стенка, покрызашая всю поверхности клетки дрожжей, является полифункциональной органел-лой , которая несет нагрузку по осуществлению всего комплекса взаимоотношений между микроорганизмом и окружающей его средой. Она составляет наружный скелет клетки, ответственный за поддержание ее формы. Клеточная стенка, как пограничная зона клетки, активно участвует в процессе транспорта различных соединений из внешней среды з цитоплазму и обратно, з иммунологических реакциях клетки, в осуществление контроля метаболических процессов факторами внезней среды. Клеточная стенка содержит большое количество гидролаз и играет' актизную роль ка начальных стадиях питания клетки, а также , в условиях голодания, сама может служить источником запасных питательных веществ. Все это делает клеточную стенку дрожжей весьма интересным объектом для исследователей, работающих в области молекулярной биологии клеточной поверхности.

Несмотря на сказанное, знания, которыми исследователи располагают в этой области весьма неполны и зачастую противоречивы. До настоящего времени отсутствует модель структуры клеточной стенки дрожжей, соответствующая многообразию функций этой органеллы. Бесспорным в настоящий момент является лишь тот факт, что основными структурными компонентами клеточной стенки дрожжей являются полисахариды( глюкан, мачнан, хитин) и белки ( в основном маняропротеины). Строение полисахаридов изучено достаточно подробно, однако большинство вопросоз, касающихся их молекулярной организации з структуре клеточной

стенки остается невыясненным. Наименее изученным в зтом отношении компонентом клеточной стенки дрожжей являются белки.

В настоящее время в составе клеточной стенки дрожжей насчитывают более 30 белков различной степени гликовилирования (Pastor,, et al,1934; Valentin, et al 1984; Casanova, Chaffin, 1991). Полагают, что эти белки заполняют пространство между, углеводными фибриллами, а также формируют отдельный слой, располагающейся ближе к наружной поверхности этой органеллы (Frevert;Ballou,1335; Калебика, Кулаев.1991). У некоторых из этих белков обнаружена ферментативная активность (Natario,1982; Sentandreu, et al 1934;She pherd,1987; Klebl,Tanner, 1939 ). Наиболее изученными ферментами клеточкой стенки дрожжей являются инвертаза, фосфатаза и некоторые глю-канззы. Сункц>!и остальных белков изучены весьма слабо, до кас-тояцегого времени сущестЕозат лишь ряд достаточно разрозненных литературных' данных,тщательный анализ которых одна-со, на наш взгляд, позволяет предполагать, что белки играют весьма существенную роль в перечисленных выше процессах, идущих с участием клеточкой стенки'дрожжей. .

Сказанное со всей очевидностью свидетельствует о том, что изучение белков клеточной стекки дрожжей является актуальным научным исследованием и монет существенно расширить фундаментальные знания относительно строения зтои органеллы, а также будет весьма полезно для решения важных практических вопросов: в промышленности - культивирование дрожжей с заданными параметрами клеточной стенки и создание комплексов лити-ческих ферментов, наиболее эффективно лпзируюших клеточные

стенки этих микроорганизмов; в медицине - лечение и профилактика микозов животных и человека.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение роли мажорных белков клеточной стенки дрожжей СапсЦсЗа иППэ в поддержании целостной структуры этой органеллы.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

- обнаружение мажорных белков, входящих в состав клеточк стенки дрожжей С. и^Пэ на разных стадиях роста культуры;

- выяснение структурной роли обнаруженных белков;

- выделение и частичная характеристика указанных белков;

Научная новизна работы. Выделены и частично охарактеризованы два новых белка клеточной стенки дрожжей С.иЬШз. Впервые получены денные, свидетельствующие о возможности существования v дсожжен стоуктуоннх белков, скрепляющих отдельные молекулы полисахаридов или лаже крупные полксахаридкые блоки в единую структуру клеточной стенки. Предложена новая модель структуры клеточной стенки дрожжей.

Практическая ценность работы. Настоящая диссертация содержит экспериментальные данные, которые имеют важное значение д.чя обоснования технологии производств, основанных на мик-. робиологических синтезах и для направленного получения дрожжей с разной толщиной клеточных стенок. Результаты данной работы могут быть использованы также в медицине - для создания комплексных подходов в лечении и профилактике микозов, а также для получения из клеточных стенок дрожжей эффективных иммуностимуляторов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на заседании кафедры молекулярной биологии МГУ (1993) и на симпозиуме " Химия протеолитических ферментов Москва, 1993. .

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 работы.

Структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела "Материалы и методы", раздела "Результаты и обсуждение". Диссертация изложена на _страницах содержит _■ рисунков и_ таблиц. Список литературы включает ___ наименовании, из них на иностранных языках_.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура дрожжей Candida utilis ВКМ Y-74 была любезно представлена В.К.Голубевым (ИБ£М РАН, Пущино). Дрожи выращи-eaiii на жидкой питательной среде, содержащей (г/л): (№U)2 SO4 -2.5; MgS04x7H20 -0.7;NaCl - 0.5; Ca(N03)¿ - 0.6; KH2PO4. - 1.0; KiHPOf- 0.01;дрожжевой экстракт (Difco) - 5.0; глюкоза - 8.0.

Выращивание проводили при температуре'24°С в условиях аэрации на качалке(200об/'мин) в колбах объемом 700 мл при объеме среды культивирования 200 wji(ErmaKova,et al, 1981).

В работе использовали трипсин(КФ 3.4.21.4), (BIO RAD), субтшшзин(КФ 3.4.21.14) Theririoactinomyces vulgaris (TV) (Stepanov,et al,1981) и субтилизин Bacillus subtil is штамм 72 (72) (АкпароЕ и др.1979).

Получение препарата клеточных стенок. Клетки дрожжей отделяли от культуральной жидкости центрифугированием ( 5000 g, 15 мин, 4°С ) и дважды отмывали дистиллированной водой. Раз-

рушение клеток проводили в вибромиксере со стеклянными шариками ( 3 мин, 4°С). Клеточные стенки отделяли от неразрушенных клеток и внутриклеточного содержимого центрифугированием в градиенте сахарозы и многократным промыванием с последовательной сменой растворов (1% NaCl,10% сахароза,вода,50 мМ трис-НС1 , рН7,6). Степень чистоты получаемого препарата клеточных стенок контролировали в фазово-контрастном микроскопе. В работе использованы препараты клеточных стенок,содержащие не более 3% неразрушенных клеток.В основу получения клеточных стенок положен метод,описанный ранее (Mendoza, Villanueva,1S53).

■ В некоторых случаях проводили . дополнительные процедуры по деяшияаггаии полученного препарата клеточных стенок смесью бутанол:вода(0.7:1.0) (Klebl, Tanner,1989).

Лротеолитическуа активность феоментов определяли по расщеплению окрашенного казеина (ОКА-АС, КШ"Ферментас") (Каверзнева, 1871), а также синтетического субстрата сериновых протеи-наз г-А1а-А1а-Ьец-рКА(Люблинская и др. 1977).

Активность трипсина определяли с использованием в качестве субстрата Bz-OL-Arg-pNA(Erlanger,et al,1961).

Гкдролазные активности,ассоциированные с клеточными стенками и клетками дрожжей определяли с использованием субстратов n-î'JP-a-D-мачнопирачозида Шапой-ОК'р) и п-МР-|3-0-глюкопкранози-

Дс1 i,aivpi u¡sp; паьuu, ruuLdicii isoo; ,ииигешчс^лил иуиыушил

аминопептидаз p-Ala-NA, p-Arg-NA,p-Leu-NA (Frey,Ro9hm,1979) и по нарастанию з среде инкубации редуцирующих Сахаров после гидролиза соответствующего субстрата (^1,3-гхюкана, хитина, сахарозы ) (Jamienson/ et al 1959).

Электрофорез белков в полиакриламкдном геле (PAGE) проводили по методу jl3mj.mn(Kin^,Laen"u*nli 1971).Гликопротеины детектировали в пслиакриламкдном геле по методу Ракусен(Racusen 1979). При этом зоны гликопротеиноз,содержащих более 1% углевода, проявляются в виде красных полос.

Определение N-концевой последовательности аминокислот проводили после электропереноса белка с полиакриламидного геля на поливинклиден дифлуорид (PVDF) • - мембрану (У.ИНроге) (Laemmli, 1970; Matsudaira,19S7) на секзенаторе Applied Biosystems 475А (США).

Кнгибирование протеолкткческой активности ферментов проводили с использованием ингибитора сериковых протекназ. Фенид-метилсульфонклфторкда(Р1(БР) (Venitsu.Sugiyaxa 1972).

Зкстракциа белков клеточной стенки дрсикей проводили одним кз следующих методов: 10 мМ тряс-KCl буфером, содержащим 5Й меркаптоэтачола (0>,Е) и 3% SDS (100'С) (Chaffiri,Stocco,19S3 ); 8 M мочевиной в дистиллированной воде (100°С) (Elorza, et al,1985); 10 мМ трис-KCl буфером, рН 8,0, содержащим 50 мМ EDTA. (100сС) (Klebl,Tanner 1989); 10 мМ трис-HCl буфером, рН 8,0, содержащим 1 мМ PMSF, (100'С ); дистиллированной водой (100°С). Продолжительность экстракций варьировала в зависимости от возроста используемых клеток и объема гкстрагекта.

Концентрацию белка определяли по методу Лоури(Ьсгсгу,1951).

Общее содержание углеводов в клеточных стенках дрожжей определяли по методу Максименко(1975).

Кгозлек?р;г-:ескую точку определяли с использованием амфо-литоз-носителей Pharralyte £-10 (Огтерман, 1933).

Очистку белка с М- 33 кДа из клеточной стекки дрожжей С.utilis (мажорного структурного белка — МЗРЗЗ), проводили, на колонке с целлюлозой DEAE-52 (Torosantucci, 1990) и на колонке с сефадексом G-200 (Molina, 1987).

Очистку белка с М 116 кДа из клеточной стенки дрожжей С. utilis (мажорного структурного белка-МБРИб) проводили электропереносом с полиакрилачидного геля на PVDF-мембрану (Cnertov, 1990).

Электронная микроскопия клеточных стенок дрожжей: клеточные стенки дрожжей дважды про»,швали 0,1 М какодилатным буфером рН 7,2 и проводили фиксацию 5Z глютароЕЫм альдегидом в течение 2-х часов в присутствии 5% (объемные соотношения) диметилсуль-фоксида (Zubatov, et al 1979) и 1 М сахарозы. После этого клеточные стекки отмывали 0,1 М какодилатным буфером рН 7,2 и проводили постфиксаиию 1Z OsO* в течение 6 часов. Клеточные стенки обезвоживали в спиртах и заключали в аралдит. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-III, контрастировали свинцом по Рейнольдсу и анализировали в микроскопе HU-I1F' (Hitachi) при ускоряющем напряжении 75 кв (Reynolds,1963).

После инкубации клеточной стенки с ферментами,супернатан-ты отделяли от осадка центрифугированием. Наносили супернатан-ты на медные сеточки, добавляли краску (фосфорко-вольфрамовую кислоту) и выдерживали в течение 2 мин. Осторожно убирали лишнюю краску и высушивали препарат при комнатной температуре. Его также анализировали в микроскопе HU-IIF ( Hitachi ) при ускоряющем напряжении 75 кв.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Обнаружение мажорных белков клеточной стенки дрожжей C.utilis.

Изолированная меточная стенка дрожжей C.utilis содержит белки с M от 20 до 300 кДа к более (рис.1 ). На данном этапе работы нами было показано,что количество большинства из этих белков в значительной степени зависит от способа '. получения клеточных стенок дрожжей, способа экстракции белков из препарата клеточных стенок и стадии роста культуры дрожжей, из клеток которой были получены клеточные стенки(рис.2).

Единственный белок, который всегда обнаруживал свое присутствие в качестве мажорного компонента смеси белков, экстрагируемых из клеточных стенок дрожжей C.utilis это белок с M 33 кда.

В дальнейшем нами был обнаружен еде один белок, с M около 116 кДа часто присутствующий в качестве мажорного компонента среди белков, экстрагируемых из клеточных стенок дрожжей С. utilis полученных из клеток на стадии середины логарифмического роста культуры и позднее.данный белок также иногда обнаруживался и на более ранних стадиях роста культуры, однако его количество ( по сравнен:® с количеством других белков) не позволяло выделять его как мажорный в"мододых" клеточных стенках.

Следует особо отметить, что оба белка особенно •- ...доминировали на общем фоне остальных экстрагируемых из клеточной стенки белков в том случае, когда для экстракции были использованы клеточные стенки после•процедуры делшощигадаи(ркс.

2 3).

Оба белка были названы нами мажорными структурными белками клеточной стенки дрожжей С.^Шз (МЗРЗЗ и МЗР116). Дальнейшая работа была направлена на изучение этих белков.

I¡.Изучение структурной роли МЗРЗЗ методом протеолпза с использованием трипсина и субтклизинов

Для изучения структурной роли МЗРЗЗ нами были Еыбрачы "молодые " клеточные стенки, практически не содержащие белок МЗР116.

Субтилизин ТУ и субтилизин 72 обладают способностью дест-руктурирозать изолированные клеточные стенки дрожжей, что приводит к значительному снижению оптического поглощения суспензии клеточных стенок при инкубации с этими протеиназами (рис.3). При этом субтилизнны полностью удаляют из состава клеточной стенки белковые компоненты (рис.4а,в; табл.1). При действии на целые клетки эти ферменты если и не лидируют их полностью, то, по кражей мере,сильно изменяют проницаемость клеточкой стенки исследуемых дрожжей, вызывают усиленный переход икзертазы из пернплазмагическсго пространства го внешнюю среду (табл.2).

действие трипсина сопровождается не столь значительными структурными изменениями в клеточной стенке дрожжей. Эта про-теиназа не вызывает уменьшения оптического поглощения суспензии клеточных стенок (рис.3.) и практически не приводит к усилению выхода инвертазы из клеток (табл. 2). В то же время,

- 10 -

Рис.1. Градиентный электрофорез в PAGE (4-22%) в денатурирующих условиях белков, экстрагированных из клеточных стенок дрожжей С.utilis. (12 ч. роста- культуры; экстракция 3% SD3,5% рМЕ)

116 кДа

33 кДа

* ~

i« t -

— 116 кДа

ЗЗкДа

Рис.2. Электродзооев в PAGE (10%) в денатурирующих условиях белков, экстрагированных из клеточных стенок дрожжей C.utilis (экстракция 31 SDS,5% ФМЕ). а: недедипидизиро-ваннад клеточная стенка ( 4 ч. роста куль туры); б: неделипидизированнач клеточная стекка (12ч. роста культуры); в: делипи-дизированная клеточная стенка (12 ч. роста ку ль туры/.

Рис.3. Изменение оптического поглощения суспензии клеточных стенок дрожжей C.utilis при инкуба- 1 ции их с субтилпзином TV(1) (ана логичные результаты получены при использовании субтилизина 72 ), трипсином (2) и в контрольном об разце без ферментов (3).Количество добавляемых ферментов было уравнено по активности относительно их специфических пептидных субстратов: Z-Ala-Ala-Leu-pNA для субтилизпнов; BZ-D, L-Arg-pHA-для трипсина.

Рис.4. Электрофорез в РА6Е(10%) в денатурирующих условиях белков,экстрагированных из клеточных стенок дрожжей С.иНПэ (4 ч. роста культуры; экстракция 3% 303,5%?МЕ). а: контроль, клеточная стенка, б: клеточная стенка после гидролиза трипсином при 37"С в течение 90 мин. в: клеточная стенка после гидролиза субтилизином при 37"С в течение 90 мин.(количество добавляемых ферментов было уравнено по активности относительно их специфических пептидных субстратов).

Табл.1. Содержание белков и углеводов в клеточной стенке дрс -жей C.utilis после гидролиза сериновыми протеиназами с различной субстратной специфичностью.

Фермент Углеводы, % Белки, %

в клеточной в гидро- в клеточной в гидро-

стенке лизате стенке лизате

контроль 100 0 100

трипсин 73+3 26±2 15±2 85±2

субтилизин 62+3 38±2 0 100

Табл.2.Влияние протеиназ на экспорт и накопление в среде инвер-тазы и белка из клеток дрожжей C.utilis ( количество добавляемых ферментов было уравнено по активности относительно специфических пептидных суострзтов) •

Фермент Активность инвертазы в среде инкубации. Уд.(Е/мг белка) Суммарн.(Е) белок в среде мкг/мл

трипсин 58.2 1.26 22

субтилизин 72 33.0 1.55 19

субтилизин TV 177.0 3.70 21

контроль 53.1 1.25 23

Ттт

I 1

33 кДа

3. 5 в

злектрофоретический анализ белкоз, остающихся з составе клеточной стенки дрожжей после действия на нее трипсина (рис.4.б) демонстрирует, что эта протеиказа оставляет нетронутым всего 1 белок MSP33, з то время кач все остальные белки трипсин гидро-лизует практически полностью.

Акат/.з общего содержания углеводов к белков в меточных стенках до -и после обработки субтклизинами и трипсином продемонстрировал весьма существенные различия в количестве углеводов, закрепленных в клеточной стенке с помощью трипсин-устойчивого к гидролизуемых трипсином белков, "з результатов, представленных з табл. 1, видно, что полное удаление белкоз из клеточной стенки дрожжей (обработка субтилизиком) сопровождается переходом в раствор только 28% углеводов ( условно зту часть углеводов можно обозначить как фермент-элиминируемые углеводы - ОЗУ).Вместе с тем при обработке трипсином в клеточкой стекке наряду с трипсин-устойчивым белком,составляющим примерно 15% ст общей массы белка, сохраняется окало трети углеводов из группы ©ЗУ. Это обстоятельство весьма убедительно свидетельствует о важной структурной роли трипсин-устойчивого белка.

Электронная микроскопия клеточных стекок, обработанных протеиназами показала, что клеточная стенка (рис.5а) после обработки трипсином (рис.56) становится тоньше. Электрсноплотный наружный слой згой органеллы (по данным литературы в значительней степени обогащенный белками) становится почти в два раза тоньше, а рыхлый (по данным литературы в больщикстве своем углеводный) матрнкс становится чуть менее плотным. Таким

а

е

чч - ' ; • - ву': ~ - "1 г-чя

г

ил

1

Г

• *

. .5. 1

'<Л

Рис. 5. Электронная микроскопия клеточных сте-кск дро?кей С.йН!з (4 ч. роста культуры) после пиролиза протеиназгми при 37 * С е течение ТО мин.(количество добавляемых сегментов было уравнено по активности относительно их специфических пептидных субстратов, а: кнтактная клеточная стенка; б: клеточная стенка после гидролиза трипсином; в: клеточная стенка после гидролиза сустплнсннс:.! IV; г: фрагменты клеточной ст-нни ( стрелки ) после гидролиза субтклпокнсм ТУ.

образом, действие трипсина, который гидролизует основную массу белков изолированной клеточной стенки дрожжей и оставляет нетронутым в ее составе практически всего только один белок MSP33 в целом не изменяет структуры клеточной стенки. Внешний вид ее в электронном микроскопе не очень сильно отличается от интакт-ной. Эти данные подтверждают отсутствие изменений в оптической плотности суспензии клеточных стенок дрожжей после обработки трипсином.

После обработки субтилизином (рис.бв) клеточная стенка выглядит.совершенно деструктурированной. В среде инкубации накапливаются сильно фрагментироваяные элементы клеточной стенки (рис.5г), в которых уже отсутствует злектроноплотный белковый компонент и виден только рыхлый углеводный матрикс.

Полученные результаты объясняются тем, что субтилизин, в отличие от трипсина, гидролизует не только основную массу белков клеточной стенки дрожжей, но и MSP33, который был устойчив к действию трипсина.

Таким образом на первом этапе нашей работы мы подтвердили предположение о том, что изучаемый белок является важным структурным белком клеточной стенки дрожжей C.utilis.

На следующем этапе нашей работы мы предприняли попытку выделить в гомогенном состоянии и охарактеризовать МЗРЗЗ.

111.Выделение и характеристика MSP33.

На данном этапе работы была разработана схема очистки белка MSP33 , представленная на рис.6. В результате очистки,

сопровоядазЕвйся значительная -потерями белка был получек злектрофоретически гомогенный препарат MSP33 (рис.7). Свойстза данного белка представлены з табл 3. Данный белок впервые обнаружен в клеточной стенке дрожжей C.utilis.

■ Определение аминоконцевой последовательности выделенного белка показало, что он на протяжении 15 аминокислотных остатков проявляет значительное (60%) сходство с белком из клеточной стенки дрожжей Saccharoisyces cerevisiae (Psc) (рис.8) (Klebl, Tanner 1989).

В последнее время в литературе активно обсуждается, но до конца еще не выяснена роль Psc з клеточной стенке дрожжей 3.cerevisiae. Высокая степень гомологии, наблюдаемая з амкко-кокцезой области исследуемого нами белка M3F83 из кяеточн стенки дрожжей C.utilis и Psc из клеточной стен S.cerevisiae, а также сходство их молекулярных масс позволяет предположить, что выделенный нами белок аналогичен Psc из клеточной стенки дрсжжей 3.cerevisiae.

В отличие от авторов, впервые описавших Psc из клеточной стенки дрожжей 3.cerevisiae ка-; зкзоглюканазу, гидролпзукщую ламинарии с образованием глюкозы (Klebl,Tanner 1989) в наших экспериментах ш не обнаружили заметной глюканазной активности у белка MSP33 ни на одной из стадий его очистки ни с одним из использованных субстратов.

Впоследствии оказалось, что Рзс из клеточной стенки дрожжей о.cerevisiae не является ^кзоглтзканазси. Данная активность была определена у него ошибочно (i.'rsa, et ai 1993).

- i6 -

Рис.6. Схема выделения белка МЗРЗЗ из клеточной стенки дрожжей C.utilis (4 ч. роста культуры).

1 стадия: препарат белков,экстрагированных из клеточной стенки

(буфер - 10 мМ трис-HCl рНВ.О) после обработки трипсином.

2 стадия: хроматография на колонке с ДЕДЕ - 52 целлюлозой ( 10

мМ трис- НС1 рНЗ.О, 1 мМ PM3F),злюция NaCl при 4'С.

3 стадия: диализ против еоды,концентрирование полиэтиленглико-

лем, диализ против буфера 50 мМ ацетат натрия рН5.3.

4 стадия: хроматография на колонке с сефадексом G-200 (50 ыМ

ацетат натрия рН 5.3, 4°С).

5 стадия: диализ против воды, лиофильное высушивание.

Рис.7. Электрофорез в PAGE (10%) в дена-¡ турируших условиях белков, из клеточных ; стенок дрожжей C.utilis (4 ч. роста культуры) на разных стадиях очистки, а: препа рат белков на 1" стадии очистки (рис. 6).'. б: препарат белка на 5 стадии очистки(рис.6) в: метчики: 1 - карбоангидраза (29 кДа), 2 - глицелин-3-фосфат-дегидрогеназа, ( 36: кДа), 3 - оватьбумкн (45 кДа), 4 - бычий : альбумин (66 кда).

a í &

1* 2 3* 4 5 6 7 8 9 10 11* 12 13* 14* 15

1. Val-Gly-Asp-Leu-Ala-Phe-Asn-Leu-Gly-Val-Gln-Asn-Ser-Ala-Gly

2. Ile-Giy-Glu-Leü-Ala-Phe-Asn-Leu-Gly-Val-Lvs-Asn-Asn-Asp-Gly Рис.8. К - концевая последовательность основного структурного белка ¡VÍSP33 из клеточной стенки*дрожжей C.utilis(i) к белка из клеточной стенки дробей S.cerevisi&e (2)(Klebl,Tanner 1989).

щр -4

«0 -3 ■¿■i

Отмеченный факт является дополнительным подтверждением сходстза указанных белкоз, выделяемых из клеточных стенок двух видов дрожжей з систематическом отношении достаточно далеко отстоящих друг от друга. Не исключено, что 1/.ЗРЗЗ, так же как и Рзс из клеточкой стенки дрожжей Б.сегеухзхае обладает слабой эндоглюканазной активностью(Ь^гза et а! 1933). В нагих экспериментах на всех стадиях очистки препарат МЗРЗЗ проявлял следы глюканазкой активности при использовании в качестве субстрата лихенана.

Из литературы известно, что Рзс из клеточной стенки дрожжей З.сегеу1з1ае иммунологическими методами обнаруживайся также и у некоторых других видов дрожжей ( БП, еЬ а! 1931). Исходя из этого можно предположить,. что аналогичные структурные белки достаточно широко распространены и присутствие их з составе клеточной стенки дрожжей язляется скорее правилом, чем исключением.

Дальнейшее изучение К'БРЗЗ показало, что он устойчив к действии трипсина только если находится в составе клеточной стенки. Если обрабатывать трипсином выделенный белок, то зта протеиназа гидролизует его. Поскольку подавляющее большинство остальных белков клеточной стенки практически полностью гндро-лизуется трипсином при обработке изолированной клеточной стенки без предварительной их экстракции можно утверждать, что и с наружной я с внутренней сгсрзкы этой органеллы исследуемый белок экранирован от действия трипсина углеводным компонентом.

По всей вероятности данный белок локализуется не с поверхности , а в толще клеточной стенки, причем так;а; образом,

что скрепляет между собой крупные углеводные блоки, поскольку вплоть до его полного- гидролиза субтилизином клеточная стенка дрожжей сохраняет свою первоначальную форму. После гидролиза субтилизином MSP33, находящегося в клеточной стенке, в среде инкубации накапливаются крупные фрагменты клеточной стенки, состоящие из углеводов и практически не содержащие белка.

Наши представления о закреплении MSP33 в структуре клеточной стенки дрожжей С.util is суммированы на рисунке 9.

Предлагаемый нами способ объединения глюкановых блоков в единую структуру клеточной стенки может обеспечивать одновременно и прочность их скрепления и относительную подвижность друг относительно друга. Указанная подвижность может создаваться как за счет конформационной подвижности самого М5РЗЗ так и, возможно, за счет активации его зндоглюканазнсй активности. Гидролиз фибрилл глюкана белком MSP83 (локализованном в "узловых" точках скрепленная этих фибрилл) может позволять клетке " ослаблять" при необходимости отдельные участки клеточной стенки. Подобная необходимость может возникать,например, при росте клетки и, соответственно, растяжении клеточной стенки или при встраивании в "клеточную стенку новых структурных элементов таких, например, как синтезированные de novo поверхностные рецепторы и другие структуры.

IV. Выделение и частичная характеристика MSP116.

Ранее было показано, что состаЕ клеточной стенки дрожжей C.utilis существенно изменяется в процессе роста культуры (

Табл.З. Свойства белка МЗРЗЗ из клеточной стенки дрожжей' С.иЦПз

изученные свойства МЗР£Э

молекулярная масса 33 кЛа

изоточка 5.1

содержание углеводоз менее 1%

ферментативная активность:

субстрат: окрашенный казеин(Ферментас) нет

субстрат: лихенин (НП0"Фермент", Вильнюс) ■ нет

субстрат: -окрашенный лихенин

(НПО "Фермент", Вильнюс) нет

субстрат: 'п-№:(3 -О-глюкопиракозида

(СЬетаро1) нет

субстрат: лпхенан (31дтла) следы

субстрат: п-КР-о(-0-манксппранозида(сЬе!ларо1) нет

Рис. 9. Схема клеточной стекки дрожжей С.-иИНэ (стрелка показывает внешнюю поверхность клеточкой стенки).а: иктактная клеточная стенка, б: клеточная стенка после действия трипсина, в.-Фрагмент клеточной стенки после действия субтидиекна.1.майнан; 2. трипсин чувствительные белки; 3. (31, с - глюкащ 4. трипсин устойчивый белок; 5. ферменты: б. §1.0- глюкан; 7. хитин.

Калебина, Кулаев 1985). В связи с этим было интересно более подробно исследовать содержание MSP116 в клеточных стенках этих дрожжей на разных стадиях роста культуры. С этой целью клеточные стенки выделяли из клеток дрожжей, находящихся на ранней логарифмической фазе роста культуры (4 часа роста), в

середине логарифмической фазы роста (6 часов роста) и в конце

«

логарифмической/начале стационарной стадии роста культуры (12 и 16 часов роста культуры соответственно). Было показано.что исследуемый белок наряду с MSP33 всегда присутствует в клеточных стенках дрожжей C.utilis, находящихся в стадии стационар-' ной фазы роста культуры.Было показано, также,- что в клеточных стенках дрожжей, полученных из клеток культуры, находящейся ка ранней'логарифмической стадии роста, МЗР115 либо возсе отсутствует либо присутствует в следовом количестве.MSP116 был выделен нами из клеточных стенок, полученных из клеток, культуры находящихся на стационарной стадии-роста культуры по схеме, представленной на рис 10.

Определение N-концевой аминокислотной последовательности MSP116 и последующий компьютерный анализ данных выявили значительное сходство N-концевого фрагмента этого белка с последовательностью аминокислот в Н-концеЕой области рецептора альфа-фактора из мембраны S.cerevisiae(pnc.ll). Ранее такой белок из клеточной стенки дрожжей, в частности C.utilis, не выделяли.

Ранее во многих работах (Duel et aMS57;'Mendoza, .. Villa-meva 1952; Phaff 1S53;. Звягинцева,Рубан 1972;Калебина, Кулаев,' 1985) единодушно отмечалось наличие общей закономерности,которая состоит в том, что в молодом возрасте культуры клетки

дрожжей значительно чувствительнее к внешним воздействиям чем з стаиконарнсй фазе,причем, например, потеря чувствительности к литическому действию ферментов происходит часто за очень короткий промежуток времени (Вгокл,1971). Объяснения этому явлению в литературе кет,однако предполагается, что возникновение устойчивости связано с качественными или количественными изменениями в строении клеточных стенок дрожжей (Впжп 1971; Кале-бина, Кулаев 1955).

Следует особо отметить, что так же как и МЗРЗЗ, ?,'ЗР11б обнаруживается в составе клеточной стенки дрожжей, обработанной трипсином, но не детектируется после обработки последней такими протеиназами,■ как субтилкзин (рис.12).

До настоящего момента в литературе отсутствуют данные о том,что в проиессе"старения" культуры в. клеточной стенке дрожжей накапливаются новые ( не присутствовавшие в ее составе на ранних стадиях роста) белковые и углеводные (в1,3 - глюкан, @1,6 глюкан или хитин) компоненты.

Не исключено, что возникновение устойчивости клеточных -стенок к гидролизу связано с укреплением структуры клеточной стенки дрожжей белками,ранее отсутствовавшими в этой органелле и накапливающимися в ней в стационарной фазе.Одним из таких белков является, по-вилимому, МЗР116.

В задачи данной дпссерталионнси работы не входила подробная характеристика белка МЗР11б. Б настоящий момент зта работа продолжается на кафедре молекулярной биологии ¡>ГУ, где проводится также определение полкой первичной последовательности выделенных в данной работе белков },(2РЗЗ и МЗРПб.

Рис.10. Схема выделения белка MSP116 кз клеточной стенки дрожжей C.utilis.

1 стадия: препарат белков, экстрагированных(буфер - 3% SDS,

5% Р ME)из клеточной стенки после обработки трипсином

2 стадия: препаративный электрофорез в PAGE (10%) в денатури-

рующих условиях.

3 стадия: электроперенос на PVDF-мембрачу.

1* 2 3 4 5 6 7* 8 9* 10* .

1. Ala-Thr-Ile-Thr-Phe-Asp-Asp-Leu-"X"-Ser

2. Ser-Thr-Ile-Thr-Phe-Asp-Glu-Leu-Gln-Gly

Рис.11. N-концевые последовательности основного структурного белка MSP116 из клеточной стенки дрожжей C.utilis (1) и-рецептора'альфа-фактора из мембраны дрсякжей S.cerevisiae (2).

г ifp^a^!

Рис. 12. Электрофорез в PAGE (10%) в:.де- ,

натурнруюших' условиях белков, экстраги- цб кЛа * рованных из клеточных стенок дрожжей С. utilis ( 12 ч. роста культуры; экстракция 3% SDS, 5%£МЕ). а: контроль, клеточная стенка, б: клеточная стенка после гидролиза трипсином при 37'С в течение 90 мин в: клеточная стенка после гидролиза субтилизином при 37°С в течение 90 мин. ( количество добавляемых ферментов было уравнено по активности относительно их специфических пептидных субстратов).

ЗкДа*

5 '

^Гт в

ВЫВОДЫ

1. В клеточных стенках дрожжей с.utilis обнаружен v.ar.op-ный белок MSP33,количество которого не зависит от стадии роста культуры. Показано,что' этот белок имеет важное значение для структурной организации клеточной стенки.

2. Выделен злектрофоретический гомогенный препарат MSP33. Показано,что по N-концевой последовательности,молекулярной массе (ЗЗкДа) и значению изозлектрической точки(р1, 5.1) дачный белок близок одному из белкоз клеточной стенки S.cerevisiae.

3. В клеточных стенках дрожжей C.utilis обнаружен белок MSP116,количество которого з значительной степени зависит от стадии роста культуры: данный белок практически не обнаруживается в клеточных стенках дрожжей полученных из клеток, находящихся на ранней логарифмической стадии роста культуры и всегда присутствует в качестве мажорного компонента в клеточных стенках дрожжей C.utilis у клеток в стационарной фазе роста куль- -туры.

4. Белок KSP116 с молекулярной массой 116 кЛа выделен из клеточных стенок дрожжей C.utilis г . -.и частично охарактеризован. Показано, что он имеет значительное сходство M - концевого фрагмента с последовательностью аминокислот в N - ксн-цевсй области рецептора альфа-фактора из мембраны S. cerevisiae.

5. Ка основании полученных данных представлена новая гипотетическая схема строения клеточной стенки дрожжей, учптыва-

ющая возможную роль белков в структурной организации этой ор-ганеллы.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Калебина Т.е..Нурминская М.В., Чертов О.Ю., Чжан Силин, Ру-денская Г.Н., Степанов В.М., Кулаев И.С. "Об отличии действия субтилизинов,трипсина, и коллагеназы .на белки клеточной стенки дрожжей C.utilis".// III Симпозиум "-Химия протеолитичееккх ферментов". Тез.докл., с.75, Москва,1993.

2. Калебина Т.С., Нурминская М.В., Чжан Силин, Чертов О.Ю., Руденская Г.Н., Степанов В.М., Кулаев И.С. " Протеиназы с различной субстратной специфичностью в структурных исследованиях клеточной стенки дрожжей".// Биоорганическая Химия. 1994, Т.20, N.4, с.527-634.