Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование устойчивости дрожжей к высоким концентрациям кобальта

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование устойчивости дрожжей к высоким концентрациям кобальта"

Научно-исследовательский проекгно-конструкторский _институт прикладной биохимии_

На правах рукописи

КАСПАРОВА Сюзанна Георгиевна

ИССЛЕДОВАНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ДРОЖЖЕЙ К ВЫСОКИМ КОНЦЕНТРАЦИЯМ КОБАЛЬТА

Специальность 03.00.23 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена в Московской сельскохозяйственной академии им. К. Д. Тимирязева,.

Научный руководитель — доктор биологических наук Тонева-Давидова Е. Г.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор Ерошин В. К.; кандидат технических наук, доцент Марквичев Н. С.

Ведущее предприятие — Российский государственный университет медицины, г. Москва.

Защитч состоится •■/б 1993 г.

— час. на заседании специализированного

совета 0.98.07.01 Научно-исследовательского про-ектно-конструкторского института прикладной биохимии.

Отзывы на автореферат, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 125299, Москва, ул. К. Цеткин, д 4/6, НИИбиохиммашпроект,'ученому секретарю.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИбиохиммашпроекта.

Автореферат разослан Э ' 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

И; И. ГУСЕВА

в

л ■ ;r

ВВЕДЕНИЕ.

В результате антропогенной деятельности в последнее время m земле произошло существенное перераспределение химических элементов. В среде обитания живых организмов - водоемах и почтенном слое, значительно повысилась концентрация тяжелых металлов, и хотя микроколичества многих из. них (Zr,, Си, Со, мп, t-e) являются жизненно необходимыми, большие концентрации этих элементов весьма toi .сични. В литературе накоплен материал свидетельствующий о . что адаптанионная способность и устойчивость к этим металлам у одноклеточна организмов, в том числе у дрок-май, значительно более высока, чем у многоклеточных (Belliveau, 1987).. Кроме того установлено, что некоторые микроорганизмы способны накапливать очень большие количества тяжёлых металлов

о

(Quinn,1981; Ross,1936). Но механизмы, обеспечивающие накопление и резистентность микроорганизмов к тяжелым металлам, изучены недостаточно. В тоже время их исследование представляет как научный, так и практический интерес, поскольку полученные знания могут быть использованы для разработки способов очистки как природной среды, так и детоксикации живых организмов.

НМУо настоящей работы является изучение механизмов, обеспечивающих устойчивость дрожжей к тяжелым металлам, в частности к кобальту. Кобальт является одним-из типичных тяжалих металлов. О одно»: стороны, это необходимый микроэлемент питания для живых организмов, с другой. - он весьма токсичен, если присутствует в.среде обитания в высоких концентрациях.

В работе решались следующие основное задачи: ■ исследование поступления, накопления и локализации кобальта ь клетках дрожжей; - изучение сорбционной способности г.ютспли

стенок дрожжей к кобальту; - выявление низкомолекулярных белков, специфически связывающих кобальт; - разработка на основании полученных сведений биотехнологических приёмов очистки растворов.

Научная новизна работа Впервые при помощи метода радиоактивных индикаторов проведено сравнительное исследование

я*

поступления, накопления и локализации Со в метках дрожжей, отличающихся по степени устойчивости к высоким концентрациям кобальта. Обнаружено, что продолжительная адаптация дротаэй к кобальту вызывает существенное повышение сорбционной способности клеточных стенок дротай к металлу и снижение эффективности его транспорта в клетку. Уровень накопления кобальта в клетках устойчивого к кобальту штамма ниие, чем у неустойчивого при одинаковых условиях культивирования. Показано, что поглоданный кобальт у исследованных штаммов локализован в основном (на 75-77%) в растворимой фракции. Относительное содержание кобальта в клеточных стенках у резистентного штамма в два раза выше, чем у менее устойчизого. Установлено, что у исследуемых штаммов, независимо 9'г источника углерода, в растворимой фракции содержатся низкомолекулярные 'кобальт-связывающие белки, которые по некоторым своим характеристикам подобны металлотионеинам. Впервые показано, что сорбция металлов клеточными стенками .зависит не только от содержания белковых компонентов, а определяется структурной организацией всего белково-углеводного комплекса, степени диссоциации и доступности для металлов отрицательно заряженных групп.

Исследование сорбционной способности лиофилизироваяных клеточных стенок показало, что они ведут себя как карбоксильный катионит и имеют довольно высокую ёмкость поглощения двух- и' трёхвалентных металлов, при этом могут работать как в водных,

Tai: » а спиртовых растворах.

Практическое значение работы. Предложено и экспериментально обосновано использование клеточных стенок дротаей, являющихся отходом при производство ц»тохрома-С и других биологически активных веществ в ¡качестве сорбента, который монет быть использован для очистки загрязнённых металлами пишдвих растворов, про-мачленних стоков и других гладкостей. На это преддовэнне получен патент.

Сбнаруяенчкэ нпзко>,шокудярные бзлки, специфически свяэн-ваюгаю кобальт, в перспективе могут бить использованы а медицине при создании препарата для детоксикации. Как известно, инъекция низкомолекулярных белков целесообразна Нами разработана первая стадия очистки препарата низкомолекулярных кобадьт-содеркашцх белков.

Апробация работа. Результаты исследований били представлены на Международном симпозиуме по биотехнологии в Лейпциге (1988), Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма " (Пущино,1989), XV Интернациональном специализированном симпозиуме по дрожжам в Риге (1991).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), материалов и методов исследования, экспериментальной части, включающей результаты исследований и их обсуждение (3 главы), выводов и списка литератур» ( наименований). Работа излонена на 125 стр. машинописного текста, включает 27 таблиц и 29 рисунка.

'Л *

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили дрожжи Candida utilis штамм РСЕ-651, Torulopsis famata щтамм 0-3 и О-г.А, облалпияиа

- б -

повышенной устойчивостью к кобальту, а также образцы лиофилизи-рованных клеточных стенок дрожжей Pichia membranosfaciae. Культуры С. util is и T. famata были получены из коллекции культур "ВШ01синтевбелок". Периодическое культивирование осуществляли на жидкой минеральной среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу для обоих штаммов дрожжей T. fanata и С. uti lis, а также этиловый спирт для культуры С. ut il is. Концентрация субстрата в среде составляла 1%.

Для исследования процессов сорбции, транспорта и локализации кобальта в клетках дрожжей применяли метол радиоактивных индикаторов, являющийся одним из наиболее эффективных способов изучения механизмов на клеточном уровне. В зависимости от цели

Zb £+

эксперимента в работе были иснольгованы сульфаты Со , Mn , Zn ,

меченые радиоактивными изототми'Со, соответственно, а

^ч за.

тасже глюкоза, меченая г и минеральные, соли. млч<ч«-1е Р я :-.. Радиоактивность металлов измеряли на радиометре Компью-Гамма ( LKB. Швеция) а радиоактивность^', ЗГ5. "с в образцах - в диоксановом сцинтидляторе на бета-спектрометре LKB 12ЛÇ) (Швеция).

НатиЕНые дроковые клеточные стенки получали методом ди4> ференциального центриЛугированиюя. Супероксид- дисмутазную активность определяли согласно методике (Chung. 1938). Концентрацию бежа определяли по методу Лоури и епектрофотометрически (Дарбре, 1989').

Лля еыл"Л?ния ниаком-ш кулярных Со-оьязываших белков m: • ноль? звали и-гилы г^льФильтрпции. ионообменной хроматографии i ВЗЖХ ( высокой!»-ктивной KxiwcTHOti хроматографии).

- 7 -

результаты исслзйэвдш и нх обсшше.

Накопдеклэ кобальта в дрожжевых {слетках.

:L_ Рост дрожуэа при высоких концентрациях ксбальта и его накопление в биомассе.

Устойчивость микроорганизмов к кобальту и способность на капливать его в биомассе изучали на примере двух видов дроюгвй Candida util is и Torulopsis famata. Использовали промышленный штамм С. util is, ¡гатор^й является продуктом "эприна". Дрожки T. famata были представлены двумя вариантами: 0-3 и 0-ЗК, которые отличались меж^У собой-по степени устойчивости к кобальту (штамм

Таблица. 1

Накопление биомассы дрожжей (мг/мл) в зависимости от концентрации кобальта в питательной среде.

Со2+,мг/л С. util is T. fanata 0-3 T. famata О-ЗК

0 5,54iO,OS 4,83±0,07 4,6710,07

0,1 5.5010,22 5,42±Q,26 5.4010,33

1 5,43±0,14 5,37±0,13 5,5110,10

5 4,78+0,08 5,10±0,09 5,7310,10

10 4,12+0,32 5,08±0,05 5,93+0,06

20 4,7610,03 4,81±0,11 5,7910,52

37 4,4610,07 4,8110,13 6,0610,10

72 4,36+0,05 4,7010,16 6,69+0,28

85 г» 4,13+0,12 4, 40±0,08 7,52*0,34

120 1,34+0,15 4,0010,06 6,3110,15

210 1,39i0,08 3,о0+0,19 5,40+0,11

530 0,85+0,21 2,09+0,11 3,47+0,10

O-L'K был получен из штамма 0-3 путём . длительной адаптации lia средах с высоким содержанием кобальта). Концентрация кобальта в среде менялась от 0 до 530 мг/л. В конце культивирования определяли прирост Окомзссы и содержание кобальта в ней радиометрическим способом. Как видно из полученных данных (табл.1), у С. ut i)is

ï*

снижение прироста биомассы наблюдалось укз при концентрации Со в среде 5 мг/л, "а при концентрациях 37-85 мг/л оно достигало '¿0-2.5%. Более высокие концентрации 120-530 ыг Со/л практически полностью подавляли рост культуры. В токе время, для обоих вариантов дрож-

Таблкца

Накопление кобальта (ыг/г) в биомассе дрожжей в зависимости от его концентрации в среде.

Î* Со , мг/л С. util is Т. fareata 0-3 T. famata 0-3K

0,1 0,020 0,015 0,020

1 0,214 0,070 0,085

5 , 1,060 0,261 0,286

10 £,049 0,463 0,443

. 20 1,644 0,734 0,606

37 " 1,817 1,090 0,792

72 2,710 10,000 3,457

85 6,310 13,400 5,728

120 10,000 21,000 7,139

210 - 50,000 41,400 22,360

530 509,000 127,000 106,000

Примечание: относительная ошибка измерений не более +.3Z.

}5Эй ' T. fa.TV3.ta с повигениэм концентрации Со" в питательной среде

наблюдалась етк.чуляц:;я роста культуры. Подавление роста штамма

0-3 начиналось с концентрации кобальта 85 «г/л, в то

воем как сук.естчепное снижение роста у устойчивых к кобальту

' z*

дрокжзй T. faaiata О-ЗХ было зафиксировано только при 530 tir Со/л.

Исследуемые дролаевие культуры (табл. 2) ' накапливали различное

количество кобальта в биомассе при одинаковой концентрации его в

л*

среде. Как при физиологически безвредных концентрациях Со для всех культур (10 №/л), так и при икгибг.руюедх концентрациях (530 мг/л) уровень аккумуляции кобальта в биомассе устойчива к кобальту дроккзй T. farcata в 5 раз кимэ, чем у С. ùtilis. Это свидетельствует о том, что зта культура долгота обладать специальным механизмом, препятствующем поступлению кобальта внутрь клетки. Этот результат согласуется с'данными работы (Surovritz,^ 1S84), где было показано, что чувствительные культуры дрожжей аккумулировали больше ионов металла,- чем резистентные к данному металлу штаммы.

2. Сорбция кобальта дрожмэвыми клетками. Изучение сорбции кобальта проводили с клетками дрожжей исследуемых штаммов, находящимися в экспоненциальной фазе роста. Инкубирование проводили при t>30*C в течение 5 мин (впемя, достаточное для достижения сорбционного равновесия), исходные концентрации кобальта в среде - О, 5, 10, 20, БО, 100 мгСо'/л. Концентрацию металла в клетках и растворе определяли радиометрически. Построение на основании подученных данных кинетические кривые имели характерный выпуклый вид. Математическая обработка их покакала, что процесс сорбции кобальта дрожжевыми клетками трех рассмотренных культур хорошо описывается уравнением типа изотермы сорбит Згейнллих'а S Ко (рис.1). :ло согла^уг*ея с по л vœu-'

Рис. 1. Квазиизотерма сорбции кобальта клетками дрожжей: 1 - С. utilis; 2 - T. famata 0-3; 3 - T.famata 0-3K

i*

ними раннее данными для сорбции Со дрожками С.guilliermondil (Давидова, 1986). Расчёт сорбцибнной емкости дрожжевых клеток показал, что у T.famata О-ЗК она была примерно в два раза выше, чем у С.utilis и T.famata 0-3. На процесс сорбции большое влияние оказывало присутствие в опытной среде посторонних ионов металлов, рН среды. Сорбция кобальта дрожжами С. utilis была значительно ниже, если инкубация прйводилась в водной среде, где присутствовали другие ионы металлов или г ольшое количество ионов водорода ( низкие рН)'. •

Ъ. Транспорт ионов кобальта в дрожжевую клетку. Исследование транспорта ионов кобальта в клетки проводили в 50 мМ ЮС-буфере, рН 5,5. Объем инкубационной среды составлял

- 11 - ... 20 мл,- концентрация целых клеток - 2 мг/мл, Ь в опыте 30*С.. Выло установлено, что транспорт Со в клетки дрожжей является энергозависимым процессом. Поступление кобальта из раствора существенно подавлялось в отсутствии источника углерода - глюкозы, так и при налички в срере ингибиторов дыхания (НаМг) • или АТФазы (ДЭС),, а такяо с понижением температуры.

• При изучении кинетики транспорта Со определяли динамику включения кобальта в дрожяевые клетки (т - 2 мг/л) ■ при разных

; I* .,

концентрациях Со в среде: 2, 5, 10, 20, 40 мг/л - для культур С. иШ1з и Т. Гата1а 0-3; И б, 10, 20,. 50, 100 мг/л - для штамма Г. ГатаЬа 0-ЗК. Инкубацию проводили в МЭС-Оуфере, рН 5,5, 30 мин.

; 1 К '

< ■ ( I - -У '

/ ,

Я . /• 1 я.о чо (<,1)

*0 ......1 - * 1 4 к С* ' Л У $ В

Рис.2. Линеаризированная ферма кинетические црмвих вкля-'.чения кобальта в метки дрожтей: 1 - г. и1 Н 1з;' 2 Т. Гавкал 0-3; 3 - Т. ГлккЛа О-Я!!

Расчёт кинетики транспорта кобальта (рис.2) показал, что для всех трех культур она подчиняется уравнению инхаэлиса-Ыенте-на. Максимальные скорости транспорта у С. utilis, Т. ГагаЬа 0-3 и резистентного штамма О-ЗК близки и составляпг 1,70, 1,63'и 2,20 мкмоль/г-мин соответственно. Однако, константы Ыихаэлиса отличаются значительно - -0,15, 0,34 и 0,85 f,à! соответственно. 5го означает, что половина максимальной скорости поступления Со" в клетки дро;ккей О-ЗК достигается при концентрации кобальта в среде в 2,5 раза выеэ, чем для исходной культуры 0-3,' и в 5,7 раз выше в сравнении с С. utiiis, то есть механизм транспорта Сог*в дрожжевые клетки T. Famata О-ЗК менее эффективен, и, следовательно, • можно предположить, что повышение устойчивости культур к высоким концентрациям кобальта, сопровождается снижением эффективности внутриклеточного транспорта Со*Г Этот факт может послужить объяснением низкого уровня накопления кобальта в клетках дрожжей T. famata О-ЗК во время культивирования их на среде с повышенным содержанием этого металла.

я* „х*

Сравнительное исследования транспорта Со и Zn у Культуры

С. utilis показали^ что скорость включения ионов цинкз почти в

2 раза превышает скорость включения ионов, кобальта. Для выявления

специфичности системы транспорта этих металлов было изучено пове-

■ дение каждого иона при инкубации дрожжевых клеток в среде, содер-■ л* ж*-

жашей смесь ионов Со и Zn в двух аналогичных вариантах: в одном

гг ег

случае меченым в смеси был Со , а в другом - Zn. металлы вносили

в эквимолярных концентрациях. Установлено, что тип ингибирования для этих катионов различен. Как видно из данных таблицы 3, кон' стакта Михаэлиса.при добавлении Со в среду с меченым Zn, увеличивалась почти в 7 раз, что говорит о значительном снижении эффек-

1* 'АК-

тивности транспорта Zri под влиянием Со . Ингибирующий эффект под

дейетБиеи кобальта наблюдался и при нзуче-пин транспорта Zn у культуры S. cerevisiae ( Mi i te, 1987). 1.ЙКСИ-мальная скорость транспорта при добавлении цинка в среду с м-эчо-пым кобальтом уменьшалась в 4 раза Этот результат свидетельствует о том, что перенос Со1'1' но.-ет осуществляться транспортной системой пинка, а сан цинк не использует систему переноса кобальта, но оказывает ингибирукящй эффект на скорость его включения. При изучении влияния ионов

на транспорт Со у культуры С. util is в аналогичных условиях было

Л* 4-t-

установлено, что f,!n ингибирует поступление Со в клетку, по это

ннгпбирование носит неконкурентный характер.

4¡_ Внутриклеточная локализация Со*в дрожжевых клетках. Для выяснения локализации поглощённого металла внутри клетки было проведено сравнительное исследование распределения Со в клетках изучаемых дрожжей, выращенных при различных концентрациях последнего в среде. Как видно из полученных данных (табл. 4) у С. ut i lis независимо от концентрации кобальта в сроде, основная часть его - 75% сосредоточена в растворимой белковой фракции.- Однако, для культуры T. famata 0--3K наблюдается несколько иная картина. Так, при концентрации кобальта в среде 100 мг/л основная часть его - 58% находится в клеточных стенках и только Р.-'Х кгб.".чм"л содержится п рлстлоримой Фрги-яии, в то вр.?-

Таблица

Кинетические константы для транспорта lO.'k Qíf Z Дроблен С. util is.

Варианты V ,1-КМОЛЬ/Г'МШ К , мН

"Со 2. 5 0,625

•г*

Со + Zn 0,6^5 0. 2ВЗ

f"*Zn 2: 5 0.172

г->

Zn + Co 2. 5 1.250

Таблица

Внутриклеточное распределение поглоданного кобальта (%).

|фракции Гомоге- Клеточные Мембран- Раствори-

нат стенки ная фр. мая .фр.

С. ut ills (2 мгСо/л) 100 ' 11,1 ■13,5 75,3

С. ut ills (10 мгСо/л) 100 . я.г 14,8 . 75,9

Т famata (10 мгСо/л) 100 9,5 13,2 77,3

T.famata (100 мгСо/л) 100 57,6 19,7 22,7

мя как при концентрации 10 мгСо/л дрожжи T. fairata О-ЗК имеют та-газе же процентное соотношение кобальта между исследуемыми фракциями, как и С.uttlis.

Существенное увеличение содержания кобальта именно в клеточных стенках при высоких его концентрациях в среде у культуры

Т. famta О-ЗК может служить дополнительным свидетельством того, 1

что клеточная стенка обеспечивает в значительной степени резистентность этих дрожжей к металлу. Однако, не исключена воз-3 можность существования еще дополнительного механизма, предотвращающего окислительное действие металла в клетке.

Одним из возможных механизмов может быть действие супе-роксиддисмутазы (СОД). Б связи с этим мы провели сравнительное определение активности СОД у дрожжей С.ut lis и .T.famata О-ЗК. Так как СОД является Си,7,п-зависимым ферметом в одном из исследуемых вариантов в питательную среду добавляли ZnSO^ и CuSO^ в концентрации 10 мг/мл , в другом. - эквимолярное количество CoSO^ Как видно из данных таблицы 5, при наличии в среде цинка и

- 1Б

мели у обеих культур активность СОД (си.гп-зависимой) существенно возрастала в сравнении с контролем.. Присутствие кобальта в среде в зквимолярном количестве не способствовало повышению активности СОД. Однако, у резистентного штамма T. famata 0-ЗК как в контроле, так и в двух рассмотренных нами вариантах активность. СОД была в 1,5-3^6 раза выше, чем у С. utilis.

Таким образом, высокая устойчивость дрожжей T. famata 0-ЗК к высоким концентрациям кобальта в питательной среде обеспечива-

Таблица 5;.

Определение активности супероксиддисмутазц ( СОД).

С. ut 111 T. famata 0-ЗК

варианты__:__

Е/мл фр. Е/мг белка Е/Мл Фр. Б/мг белка

контроль 15,4 3,5 20 9,3

Zn + Си 111,1 17,4 50 25

Со 14,3 3,4 25 12

ется прежде всего повышенной сорбционной способностью клеточной стенки, снижением эффективности транспорта метаААа внутрь клетки, преимущественной локализацией кобальта в клеточных стенках. Не исключена также вероятность участия СОД в механизме устойчивости данной культуры к тяжёлым металлам.

Клеточные стенки дрожжей как ОиосорОент тяжёлых металлов.

Ъ- сорбции кобальта изолированными клеточ-

ными стенками.,

Эксперименты были проведены с нативными клеточными стенками дрожжей С. ЛI Из и Т. Гал^а 0-ЗК. Выло установлено, что

процесс сорбции кобальта дрокхэвнш кхэточниыи стенками обеих культу]• хороко описывается уравнение« изотзрш сорбции Фрейндли-"ха, и сорбцконная ёыкость клаточних стенок' Т. Га!па1а почти в ; раза выяе, чем у стенок С. йШэ. Таким образом, высокая ре зистептноеть дрогой Т. ГеггаЬа к- кобальту в значительной степени определяется именно атпм свойством их клеточных стенок, которые служат надажиш барьером ка пути поступления больших количеств ¡юбадьта в клетку.

I

Псследованк, дкна»,с!к;5 сорбции меченого кобальта клеточиы-Ш^стенкамя из раствора, содержащего 40 1!КгСо/ш, показало, что динамическое равновесие в распределении кобальта мекду твердой и гадкой .фазами при теьяературе 30° С и постоянном перемешквалии устанавливается в течение 1 шш. Скорость десорбции меченого кобальта при после дующей инкубации клеточных стенок в растворе немеченого' СоЗО^., то есть скорость эквивалентного изотопного обмена оказалась аналогичной. Скорости сорбции и десорбции ионов та-когЬ порядка обычно характерны для процессов ионного обмена, а не, комплексообразования.

Было установлено, что при трёх-пятикратном переносе клеточных стенок, содержащих меченый кобальт, в растворы солей немеченых металлов и последующей инкубацией в течение 10 мин., меченый кобальт может быть полностью десорбирован за счёт обмена на ионы других металлов. В той» время пятикратная инкубация клеточных стенок в воде (рН 6,6) в-аналогичных условиях снижала

содержание кобальта в стенках не более, чем на 10Х (рис.3). Как

я*

видно из кривых десорбции Со , представленных на рис. 4., трёхвалентные ионы.(А15*) быстрее всего десорбируют ионы Со**", а одновалентные (На*" ) - медленнее всего. Исключение составл;;т только ионы водорода. Изменение рН от 5,6 до 2,0 считано сорбцию ко-

бальта на 95%, а при рН 1,0 не только покы кобальта, по и /М^нэ сорбируется клеточными стенками дрохкэй. Эти данные указывает на наличие конкуренции за сорбционныз места между катионами и рзз-

Йа основании установленных различий в сорбции кобальта.и

других ионов металлов был построен следующий сорбЭДганный ряд для

клеточных стенок С, utilis: t

■ з+ з* i* t*■ t* t* i* t* + +

Fe > Al > Mi > Zn > Mn > Fe >' Cu > Ca > Mg > Со > Ba > Ma > К

Полученный нами ряд очень близок к сорбционному ряду, характерному для карбоксильных ионообменных смол (Volesky,1987), то есть для слабых катионитов.

Механизм сорбции кобальта клеточными стенками. Химический состав клеточных стенок исследуемых нами культур С. utilis и T. famata 0-ЗК неизвестен, поэтому было проведено

сравнительное определение содержания основных групп органических компонентов клеточных стенок (полисахаридов, белков и липидов), а также содержание серы и фосфора радиометрическим способом. Для этой цели дрожжи обоих видов культивировали на средах, содержащие меченую*С глюкозу или минеральные соли, меченые*^ и^Р.

Шло установлено, что клеточные стенки культуры T. famata содержат значительно больше белка, серы и фосфора, чем стенки дрожжей С. utilis. Содержание серы в целых клетках T. famata было почти в 4 раза выше, чем у С. utilis. Клеточные стенки этой культуры таюке характеризовались более высоким относительным содержанием серы и фосфора по сравнению с С. utilis.

Дня того, чтобы выяснить, какое участие в сорбции металлов могут принимать отдельные компоненты клеточной стенки, нами было проведено исследование изменения сорбции кобальта клеточными стенками после их химической или ферментативной обработки, позволявших удалить ,те или иные компоненты (Давидова, 1992). Полученные после обработки фрагменты немеченых стенок инкубировали

s* »

в растворе CoSOy, меченого Со при t=30 С в течение 10-20 минут.

г*

Использовали растворы, содержащие 40-50 ыкгСо/мл. Параллельно аналогичной обработке подвергали клеточные стенки, тотально ме-ченыеАС, ■'§, что позволило контролировать степень разрушения структуры и изменения состава стенок.

. Как видно из данных, приведённых в табл. 7, трипсин специфически разрываюдий пептидную связь между лизином и аргинином, гидролизовал 145 массы клеточных стенок С. utilis и 20°: - Т. famata. Однако, сохранение высокого содержания серы в указанных препаратах - 60% и 707., соответственно, показывает, что трипсин полностью не удаляет белковую часть стенок. Частично удалгется самый верхний слой стенок, содержаний гак г.-лок, так « тннчч

при тем содэршше белка з верхнем слое стояки T. fœratd tira, чем у С. utilis. Эта обработка, как видто пз таблицу б, \\а влияла на сорбцпокнуп способность клеточшя стенок С. utilis, по у Т. Га-mata енкгапа сорбция кобальта на 30%. Обработка клеточти стопок

Сорбита кобальта $раг»эятауи жеточнах сте.'ю,': ~рогтай (

С. utilis ; . T. farata 0-СН

Варианты

*>, l-SitTCo/W /л ><j;rCo/k.r '7.

Контроль 4,73 ICO 7,54 100

SDS 4.78 101 5,10. , 08,4

Трипсин 4,97 10с . 5,24 69,5

Проназа Р 4,01 84.9 . ... 4,58 СО, 7

Проназа Е 2,42 52,2 2,97 33,4

Дитиотреитол 4,60 97 7, Б£ 101

Ацетон (щелоч. ) 6,87 145 10,5 139

Хлороформ: метанол

1:1 2,51 53,1 - -

Этанол 4,64 . 98 7 Л 99

Серный эфир 3,88 82 6/il 81

3D3 снимала большую часть белково-маннанового слоя стенок (масса углерода снижалась на 27% у с. util is и на 40% у T. famata), но также не удаляла полностью белковую часть. Эта обработка также не влияла существенно на сорбционную способность стенок

îi.

С. ut i lis, но у T. famata снижала сорбцию Со* на 32%- (табл.6). К более заметному снижению уровня сорбции кобальта приводил глубо-

Г

кий гидролиз стенок проказами Р и К. После обработка кровгзаЛ Е сорбция кобальта у С. ut-tiis снижалась на 50%, а у T. faaiata - ва 60%. Именно эта обработка и вызывала наибольшее разрузенке и гидролиз клеточных стенок - удалялось 60-65% серосодэржичк соединений и 50% углерода идя массы газточных. стенок (табл. 7).

Таблица 7..

Содержание химичеешк элементов в Фрагментах клеточных стенок, обработанных ферментами или хкмкчзскиш реагентами, в % от суммарного количества.

С. ut i 1 i s I. f errata О- ЗК

Обработга

С S Р С S Р

SDS 72,5 79,5 - 60,2 66,0 -

Трипсин 86,3 61,6 - 80,0 69,1 -

Пронаэа Р ti, 5 55,7 72,9 57,3 45,8 70,4

Пр9наза Б 53,9 35,4 - 51,0 43,1 -

Ацетон (иелоч) 88,8 87,8 77,7 88,3 80,9 78,0

Дитиотреитол »9,9 - . 107 - -

Хлороформ:

метанол 1:1 83,1 - • - 86,6 - -

При обработке клеточных стенок смесью хлороформа с метанолом, при которой практически полностью удаляются липиды и разрушается структура клеточной стенки, также значительно (на 50Х) снижается уровень сорбции кобальта (табл.6). Обработка стенок щелочным ацетоном существенно повышала уровень сорбции кобальта - на 40% у С. иЦ 1 й АЫ у Т.гаша1а' Эффект обработки щелочным ацетоном

н отсутствие его при обработке нейтральным ацетоном, • возможно, обусловлен «огызеяпем отрицательного заряда меточных стенок за счёт более подпой диссоциации ионных групп и увеличении их доступности.

Тая;:м образом, сорбция металлов меточными стенками дрок-лей прегде всего определяется структурной организацией -клеточной стекки в целом. В значительной степени она обусловлена белковой частью, что согласуется с результатами работы (Oda, 1989; Wakatsuki, 1688), однако нами установлено, что это бз.зки не только поверхностного белкого-маннаиового слоя, но и нижних слоев, связанных с глюканами.

Аналогичное исследование сорбции кобальта и других тп~а-лых металлов было проведено на промышленном образце клеточных стенок Pichia mernbrarioefaciae. На основании полученных данных предложено использовать их в ютестве сорбента для очистки растворов от тяжёлых металлов.

Низкомолекулярные белки, специфически связывающие кобальт.

Для выявления химической формы, С которой находится кобальт в растворимой фракции исследуемых дрожжей было проведено фракционирование её при помощи метода гельфильтраций на колонках с сефадексами G-50 и G-10. Белки, связывающий кобальт, были обнаружены как в высокомолекулярной (ММ 15800Q-670000 Д), так и в низкомолекулярной (Mi ниже' 17000 Д) фракциях. Однако,основное количество меченого кобальта, отмечалось во фрациях белков с молекулярной массой ниже 17000 Л (рис.4). Как видно из полученных данных (табл.8), низкомолекулярные белки дрожжей С.utilis содержат на порядок больше кобальта, чем низкомолекулярные белки дрожжей T. famata. '

После дальнейшей очистки фракций низкомолекулярных белков

о ЧХ

\а

О-1

нсоз-

а) т

пезо

■■. 11 •

■и

II

и и

'! I

И

\

\

•1 »

и

1} 11

II

И

! \

1

» * I

1 \

А

'Л

£О

V

\

V

1а

со

60

Рис. 4. . ГелЦильтрация белков растворимой фракции дрожжей ■ ' С, иИ£и на колонке сефадекса $ -50

57

со;

230км

на колонке с сефадексом в-10 удельное содержание кобальта в них увеличивалось в 1,5-2 раза.

Таблица

Распределение кобальта между фракциями растворимых белков.

Фракции

С. ut 11 i s T. famata О- 3K

Z мгСо/л 10 мгСо'/л 10 мгСо/л 100" мгСо'/л

% wCoh Z мгСо/г Z мгсё/г Z мгСо/г

BMB 8,5 0,24 12 2,35 25 0,45 38 2,3О

1MB 91,5 S,61 88 12,3 75 1,65 62 6,67

Однако, эти фракции были неоднородп' \ Так, при помощи ВЭЖХ, Шло установлено, что для С. util is низкомолекулярная фракция состояла из трёх белков с ММ 4500, 1800, 1000 Д.

Для определения гомогенности белковых фракций, выделенных из С. ut i lis и T. famata методом гельфильтрации, была также использована ионообменная хроматография (рис.5,6). Фракции низкомолекулярных белков, выделенные из дрожжей С. util is (рис.6) и Т. famata (рис.5) неоднородны. Профили радиоактивности И злшии при 230, 250 и ПОД им для двух культур сильно отличались!1 Как видно из рис. 5 и б, из растворимой фракции белков дрожжей С, ut i lis при помощи ионообменной хроматографии можно выделить две фракции

низком»•лвкуляршж Оо-связмвакмшх белков, а из T. fàmata - одну.

t*

Показано, что для препаративного выделения Co-содержащих г^жов црдрсообразно на первой стадии использовать метод ультра-|Гильтр'!Ции с после дун ицей гельфнльтрацией на сефадексе G-10.

- s -

ВЫВОДА

1. Установлено, ■ что устойчивость дрояжей к высоким концентрациям кобальта обеспечивается главным образок повышением сорбцн-огшой способности меточной стенки, снижением эффективности транспорта металла и низким уровнем накопления его в иягозоле.

2. При росте дрожпей па средах, содердап.их высокие концентрации кобальта, в биомассе накапливается значительное количество металла. Уровень его аккумуляции зависит от вида дроязкей, концентрации металла в питательной среде, фазы роста, содержания микроэлементов и источника углерода.

3. Показано, что весь поглощенный кобальт, как у С. utilis, так и уТ. famata при концентрации кобальтг в среде до 10 мг/л преимущественно локализован в цитозоле, где связан с растворимыми белками. В меточных стенках обнаруживается 9-11% поглощённого кобальта, однако, у резистентного штамма T. famata О-ЗК при высокой концентрации кобальта в среде (100 мг/л) основное количество металла - 57% аккумулируется в клеточной стенке.

4. Установлено, что изолированные клеточные стенки дрожжей как нативные, так и лиофилизированные- обладают свойствами слабого катионита. Ёмкость сорбции по отношению к .двух-* и трёхвалентным металлам в водных и спиртовых растворах значительно выше, чем у таких сорбентов, как сефадекс G-10 или активированный уголь.

5. Сорбпионная способность клеточной стенки дрожжей к тяжелым металлам определяется не. просто белковыми компонентами, а структурной организацией всего белково-углеводного комплекса и доступностью для металлов отрицательно заряженных фуккциональных групп.

6. Предложено использовать клеточные стенки, являющиеся отходом при производстве цитохрома-С, в качестве сорбента для очистки пищевых растворов, промышленных стоков и других жидкостей.

7. Установлено, что основное количество кобальта, локализованного в растворимой фракции дрожжевых клеток, связано с низкомолекулярными белками. Низкомодекулярная фракция Со-содержащих бел ков неоднородна. Она состоит из нескольких подфракций, отличающихся по молекулярной массе и изозлектрической точке. Фракции низкомолекулярных Со-содефжащих белков С. utilis и T. famata ne адекватны. Они отличатся удельным содержанием кобальта и компонентным составом.

8. Показано, что для препаративного выделения Со-содержащих белков целесообразно на первой стадии использовать метод ультра фильтрации с последующей гельфильтрацией на сефаде-ксе G-10.

СПИСОК РАБОТ, ОПУШШКОВАШШ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

' 1. Давидов Е. Р. , Давидова Е. Г., Каспарова С. Г. , Береговых В. В. ' //Заявка на патент H 4820976/26 от 22.05. 90.

2., Давидова ЕЛ'. , Каспарова С. Г. Сорбция тяжёлых металлов клеточными стенками дрожжей //Микробиология.- 1992.- т. 61, врп.5.- С. 102'-1 Сб..

3. Давидова Е. Г. , Каспарова С. Р. О природе сорбции металлов клеточными çгенками дрожжей / /Микробиология. - 1992. - т. 61, вып. 6. - С.

• . .4. Каспарова С. I'., Давидова Е. Г. Сорбция и транспорт ионов кобальта в клетки дрожжей //Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Регуляция микробного метаболизма". - Пущине. - 1989, ■12-14'июня. - 98 с.

5. Каспарова С. Г., Давидова Е. Г. Накопление и внутриклеточное распределение кобальта в клетках дрожжей//Известия ТСХА. —1990. —вып. 1. —С. 119—122.

6. Каспарова С. Г., Давидова Е. Г., Рачинский В. В., Ермолаев А. В. Выделение и хроматографический анализ металлотионеинов дрожжей// Известия ТСХА. — 1990. —вып. 4 —С. 207—210.

7. Каспарова С. Г., Давидова Е. Г. Кинетика транспорта Со в клетках дрожжей//Известия ТСХА. —1991. —вып. 3. —С. 189—193.

8. Каспарова С. Г„ Давидова Е. Г., Диканская Э. М Устойчивость к высоким концентрациям кобальта и его аккумуляция в клетках дрожжей// Прикладная биохимия н микробиология —1991. —т. 27, вып. 6. —С. 877—884.

9. Davidova Е. G., Kasparova S. G., Davidov Е. R. Cobalt-binding proteins in the yeast//XV Inter Spec. Symp of Yeast—Riga. —1991, 30 Sept.—6 Oct.

10. Toneva-Davidova E. G., Belov A. P., Casparova S. G.//Abstracts 4-th Leipzig Symposium on Biotechnology, Cell envelope-mediator and sign of cellular productivities. —1988. —p„ 12.

Заказ 656

Объем 1,75 п. л.

Тираж 100

Типография МХТИ им. Д. И. Менделеева