Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии гетерологичных генов, кодирующих рекомбинантные белки

Вячеславова, Алиса Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии гетерологичных генов, кодирующих рекомбинантные белки
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии гетерологичных генов, кодирующих рекомбинантные белки"

На правах рукописи

Вячеславова Алиса Олеговна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ А (ПЮ ПА СТЕШиМ-О П ОС I' Е ДО ВАН IЮ Й ТРАНЗИЕНТНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ

Специальность 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 НОЯ 2012

Москва 2012

005055609

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Голденкова-Павлова Ирина Васильевна

Официальные оппоненты:

Дейнеко Елена Викторовна доктор биологических наук, профессор, Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, лаборатория биоинженерии растений, заведующая лабораторией

Демин Илья Николаевич кандидат биологических наук, Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева Российской академии наук, лаборатория зимостойкости, научный сотрудник

Ведущая организация:

Филиал института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Защита состоится « 14 » ноября 2012 года в 16-30 на заседании диссертационного совета Д220.043.10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, тел./факс: (499) 976-24-92, e-mail: genetics@timacad.ru

Автореферат разослан « 12 » октября 2012 г.

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время трансгенные растения широко используются как модели для изучения фундаментальных исследований по изучению физиологической роли растительных генов и для решения прикладных задач по созданию устойчивых форм сельскохозяйственных культур, а также для продукции рекомбинантных белков в растениях. Успех в этих направлениях, прежде всего, связан с эффективностью экспрессии перенесенного гена (трансгена) в растениях. Эффективность экспрессии трансгена обуславливается рядом факторов: кодоновым составом трансгена; регуляторными элементами, контролирующими его экспрессию; интеграцией трансгена в определенные участки генома растений и рядом других. Сейчас, помимо стабильной экспрессии целевых генов исследователями широко используется транзиентная экспрессия этих генов как эффективный подход для изучения регуляторных элементов и физиологической роли генов растений, а также для использования растений как продуцентов целевых белков. При транзиентной экспрессии с использованием агробактерий, в основном, используют обычные экспрессионные векторы, полученные на основе бинарных Тьплазмид, которые, помимо целевого гена содержат и селективные гены. Для преодоления эффекта «замолкания» трансгена исследователи используют подход, основанный на ко-трансформации растений вектором, несущий ген белка р19 вируса томатов, супрессор посттранскрипционного замолкания генов. Несмотря на значительные успехи в области создания и изучения трансгенных растений, наши познания в отношении генетических факторов, которые оказывают влияние на эффективность экспрессии генов в растениях, еще весьма ограничены. Следует подчеркнуть, что решение важных научных и прикладных задач с использованием экспрессии гетерологичных генов в растениях затруднено, прежде всего, за счет значительных пробелов в понимании генетических детерминант, которые обуславливают эффективную экспрессию гетерологичных генов в растениях. Следует также отметить, что важную роль в исследованиях по созданию и изучению трансгенных растений играют экспрессионные вектора, используемые для трансформации растений. Сейчас предложены и используются целый спектр экспрессионных векторов для трансформации растений, однако, наряду с преимущества эти вектора имеют и недостатки, которые могут сказаться на эффективности экспрессии трансгена.

Цель исследования: провести сравнительное изучение экспрессии гетерологичных генов в растениях различных родов и выяснить, какие генетические детерминанты являются ключевыми в обеспечении эффективности экспрессии гетерологичных генов в растениях. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи: 1. Провести поиск генетических детерминант, которые потенциально способны влиять на уровень экспрессии гетерологичных генов с использованием биоинформатических подходов.

2. Провести модификацию нуклеотидных последовательностей модельных генов и клонирование новых регуляторных элементов.

3. Сконструировать серию модульных экспрессионных векторов дл изучения экспрессии гетерологичных генов в растениях.

4. Провести апробацию модульных векторов, в которых экспрессия модельных генов с различным кодоновым составом контролируется различными регуляторными элементами.

Научная новизна работы. Проведен сравнительный анализ генетических детерминант, которые потенциально способны влиять на уровень экспрессии гетерологичных генов в растениях. Впервые экспериментально показано, что GC-богатые последовательности в 5'-концевой области генов вносят значительный вклад в уровень экспрессии гетерологичных генов в растениях. Показана возможность достоверного увеличения экспрессии гетерологичных генов за счет использования лидерных сигналов транспорта и локализации их белковых продуктов в эндоплазматическом ретикулуме. Показана взаимосвязь между кодоновым составом гетерологичных генов и уровнем их экспрессии в растительных клетках.

Апробация результатов работы. Результаты проведенных исследований были представлены на международных и российских конференциях: Международная научная конференция «Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Минск, 2010), III Всероссийский симпозиум «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2010), 2-я Международная школа-конференция молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Звенигород, 2011), International conference «Plant Transformation Technologies II» (Vienna, 2011); конференция «Современные аспекты генетической инженерии растений» (Киев, 2011); 12-я научная конференция молодых ученых «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2012); Международная научная конференция «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (Минск, 2012).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, включая 12 таблиц и 61 рисунок. Список цитируемых литературных источников включает 269 наименований.

2. Основное содержание работы

Глава 1. Обзор литературы. В обзоре литературы приведены современные данные о подходах к экспрессии гетерологичных генов в растениях, а также проведен анализ особенностей растительных экспрессионных векторов. Особое внимание уделено исследованию генетических детерминант, обуславливающих высокую экспрессию перенесенного гена (трансгена) на разных уровнях: транскрипция, трансляция, стабильность белка.

Глава 2. Материалы и методы. В работе использованы стандартные процедуры молекулярного клонирования, которые выполнялись согласно методическому руководству Sambrook et al. (2001). В работе использовали растения табака Nicotiana benthamiana и Nicotiana excelsior, выращенные до 6 недельного возраста.

В работе использованы штамм Е. coli XL 1-Blue ("Stratagene", США) и штамм агробактерий GV3101. Клетки Е. coli выращивали при 37°С, а клетки агробактерий - при 28°С на среде LB. Процедура агроинфильтрации проводилась по методу инъекции агробактериальной смеси с помощью шприца в листовую пластину.

Анализ полученных растений после агроинфильтрации проводили на четвертые сутки путем выделения суммарного растворимого белка из листьев путем растирания свежей или замороженной растительной ткани в жидком азоте в 50 мМ Tris-HCl (рН=8.0) буфере.

Активность лихеназы определяли, используя лихенан (Megazyme, Ирландия) в качестве субстрата. Определение восстанавливающих Сахаров, освобождающихся из субстрата, проводили по методу Вуда и Бхат [Wood Т.М. et al., 1988].

Концентрацию восстанавливающих Сахаров определяли по калибровочному графику, построенному по глюкозе. За единицу активности принимали количество фермента, образующее 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров (как эквивалент глюкозы) за 1 мин (в пересчете на 1 мг белка).

Количество белка в препаратах определяли по методу Bradford [Bradford, М. А., 1976], используя Bio-Rad dye reagent (BioRad, США) и БСА (Sigma, США) для построения калибровочной кривой.

Энзимограммы получали окрашиванием геля после разделения белков, содержащего лихенан согласно методу Тизер и Вуд [Teather R. et al., 1982], с некоторыми модификациями. Определение активности лихеназы на чашках проводили по методу Бегуин [Begiun Р., 1983].

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы «Statistica for Windows 9.0» (применяли t-критерий Стьюдента для независимых выборок, Р=0,05) и графопостроителя «Microsoft Office Excel 2007».

Глава 3. Результаты и обсуждения.

3.1 Поиск генетических детерминант, позитивно влияющих на уровень транскрипции, трансляции и стабильности целевых белков в растениях

Ключевым регуляторным элементом, от которого зависит уровень транскрипции, является промотор, который, как правило, расположен в 5'-концевой области генов. Для поиска промоторов растений, которые могут позитивно сказаться на экспрессии гетерологичного гена, был проведен поиск с использованием базы данных FlowerPlantGene и сопровождающего программного обеспечения. Для этого проведен сравнительный анализ данных по уровню экспрессии генов Arabidopsis и данные о генах этого растения. Проведенный анализ позволил установить, что наивысший уровень экспрессии выявлен для гена AT1G67090, кодирующего малую субъединицу рибулозо-бисфосфат карбоксилазы. Следует отметить, что ген AT1G67090 относится к генам «домашнего хозяйства», которые обычно характеризуются высоким уровнем экспрессии. На основании этого, промотор гена AT1G67090, имеющий наивысший уровень экспрессии в растении в целом, и в листьях, в частности, может быть использован как регуляторный элемент, позитивно влияющий на уровень транскрипции гетерологичных генов в растениях.

В качестве потенциальных промоторов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии, могут быть использованы и промоторы вирусов. Один из таких промоторов - 35S РНК CaMV (промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты) - широко используется как промотор для высокоэффективной экспрессии гетерологичных генов в растениях.

Другими регуляторными последовательностями, которые могут позитивно повлиять на уровень транскрипции генов в растениях, являются GC-богатые последовательности. Известно, что в геномах млекопитающих имеются протяженные последовательности, обогащенные GC-парами, которые обозначают как CpG-островки. CpG-островки представляют собой GC-богатые последовательности (60-70% содержания GC), длиной не менее 200 п.о. с большим числом динуклеотидов CpG. CpG-богатые области, которые ассоциированы с 5'-концевой областью генов, в частности, генов «домашнего хозяйства», описаны и у растений [Meza et al., 2002]. Для выяснения частоты встречаемости CpG-богатых областей в геноме растений был проведен биоинформационный поиск с использованием данных и программного обеспечения базы данных FlowerPlantGene. База данных FlowerPlantGene содержит информацию о полноразмерных геномах растений {Arabidopsis и кукуруза) и программное обеспечение для поиска и отображения локализации произвольных последовательностей на хромосоме и в блоках произвольной длины.

Как было показано по результатам анализа, в геноме Arabidopsis thaliana GC-богатые последовательности не представлены, по сравнению с геномом

кукурузы. Среднее содержание GC-nap в геноме арабидопсиса составляет в среднем 24,3%, а в геноме кукурузы - в среднем 39%.

Ключевую роль в эффективности трансляции оказывает окружение AUG кодона - инициирующего кодона трансляции. Предполагается, что оптимальный контекст для инициации трансляции у животных и растений -AACAATUGC. Такая консенсусная последовательность (последовательность Козак [Kozak, 1986]), играющая важную роль в инициации трансляции у эукариот, включает 4-6 нуклеотидов, предшествующих старт-кодону, и 1-2 нуклеотида непосредственно после старт-кодона. Особую роль в данной последовательности играют нуклеотиды в положениях -3 и +4. Следует подчеркнуть, что для выяснения роли нуклеотидов в — 3 и +4 положениях из окружения инициирующего кодона в обеспечении высокого уровня экспрессии необходим сравнительный анализ данных частоты встречаемости нуклеотидов в этих положениях и уровня экспрессии генов растений.

С использованием программного обеспечения базы данных FlowerPlantGene для совокупности генов с различным уровнем экспрессии рассчитана частота каждого нуклеотида (А, Т, G или С) в положении - 3 и +4 из окружения инициирующего кодона.

Для анализа взаимосвязи между нуклеотидами в -3 и +4 положениях из окружения инициирующего кодона и уровнем экспрессии, были сформированы три группы генов с уровнем относительной экспрессии. Согласно такому разделению 88,7%, 8,2 и 3,1% генов арабидопсиса имеют уровни экспрессии от О до 50, от 51 до 100 и от 101 и выше, соответственно. Проведенный анализ позволил выявить следующие закономерности: у 68,4% и 67,6% генов с уровнем относительной экспрессии от 51 до 100 и от 101 и выше, соответственно, в положении - 3 встречается нуклеотид А, а в положении +4 -нуклеотид G (с частотой от 0,6 и до 0,9); у 1,4% генов с уровнем относительной экспрессии от 0 до 51 в положении -3 встречается нуклеотид А, а в положении +4 - нуклеотид G (с частотой от 0,6 и до 0,9).

Последующий анализ генов растений с использованием программного обеспечения базы данных FlowerPlantGene позволил выяснить, что нуклеотид G в положении +4 встречается у более 50% генов разных видов растений.

Одним из основных правил жизни белкового продукта является правило «N-конца» (N-end rule), которое гласит: время полу-жизни белка определяется конкретным N-концевым аминокислотным остатком его полипептидной цепи [Bachmair et al., 1986; Varshavsky, 1996; Hu et al., 2005; Tasaki and Kwon, 2007]. Таким образом, были выделены дестабилизирующие а.о., определяющие время жизни белка. Интересно, что у дестабилизирующих аминокислотных остатков (а.о.) есть своя иерархия: некоторые а.о., названные первичными дестабилизирующими а.о., непосредственно узнаются убиквитин-лигазами, другие (вторичные и третичные) - требуют дополнительной модификаций перед узнаванием системой убиквитинирования [Worley et al., 1998]. К третичным дестабилизирующим а.о. относятся глутамин (Gin), аспарагин (Asn) и цистеин (Cys), к вторичным - глутаминовая (Glu) и аспарагиновая (Asp) кислоты; а к первичным - аргинин (Arg), лизин (Lys), гистидин (His), лейцин

(Leu), изолейцин (Не), фенилаланин (Phe), триптофан (Тгр), тирозин (Туг) и пролин (Pro). К стабилизирующим аминокислотным остаткам относятся метионин (Met), глицин (Gly), валин (Val), треонин (Thr), серин (Ser) и аналин (Ala) [Worley et al., 1998]. Анализ генов растений с использованием программного обеспечения базы данных FlowerPlantGene позволил выяснить некоторые закономерности распределения вторых кодонов в кодирующих областях генов растений разных видов. Для анализа были выбраны только кодоны, первый нуклеотид которых начинается с нуклеотида G. Среди вторых кодонов, первый нуклеотид которых начинается G, для генов арабидобсиса, кукурузы и риса к стабилизирующим аминокислотным остаткам принадлежат 35,2%, 39,8% и 44,9%, соответственно. При этом, отмечена высокая частота встречаемости второго кодона аланина у генов разных видов растений.

Таким образом, проведенный поиск нуклеотидных последовательностей, которые могут позитивно влиять на уровень транскрипции, трансляции и стабильности целевых белков в растениях с использованием биоинформационного анализа созданной базы данных и анализа литературы позволяет сделать следующие заключения: 5'-область гена AT1G67090, имеющего наивысший уровень экспрессии в растении в целом, и в листьях, в частности, может быть использована как регуляторный элемент, позитивно влияющий на уровень транскрипции гетерологичных генов в растениях; промоторы вирусов могут быть тестированы в качестве потенциальных регуляторных элементов, способных в значительной степени увеличить уровень транскрипции целевых генов в растениях; GC-богатые области, ассоциированные с генами растений, характеризующимися высоким уровнем экспрессии, могут быть потенциальными регуляторными элементами, позитивно влияющими на уровень транскрипции гетерологичных генов в растениях; нуклеотид А в -3 и нуклеотид G в +4 положениях из окружения инициирующего кодона могут играть ключевую роль в увеличении эффективности трансляции генов растений; свойства второго кодона в последовательности белка могут в значительной степени повлиять на стабильность белкового продукта в растениях.

3.2. Создание модульных векторов для апробации регуляторных элементов с использованием бирепортерных генов

3.2.1. Конструирование бифункциональных репортерных генов licB::rfp и egfp::licB и их апробация в бактериальных клетках

В качестве репортерных генов нами предложены бирепортерные гены, имеющие транскрипционно-трансляционное слияние гена, кодирующего термостабильную лихеназу с геном, кодирующим красный флуоресцентный белок (licBiirJp), и с геном зеленого флуоресцентного белка (egfpv.licB). Для создания бирепортерных генов первоначально была проведена ПЦР. В качестве матрицы для создания плазмид, несущих бирепортерные гены, были использованы плазмиды pQE30-LicBM3 (из коллекции лаборатории), pQE30-EGFP (из коллекции лаборатории) и Gateway® TagRFP-AS-C (ЗАО «Евроген», Россия), а также специально подобранные олигонуклеотидные

последовательности. Методами молекулярного клонирования были полученные бактериальные вектора р(}ЕЗО-ЕОРР-1лсВМЗ и рОЕЗО-исВМЗ-ИРР, которые затем были апробированы в бактериальных клетках на функциональность всех репортерных генов. Корректность сборки бактериальных векторов была

подтверждена рестрикционным анализом.

Первоначально, бактериальные трансформанты, несущие плазмидные вектора, были проанализированы методом чашечного теста для того чтобы показать, что лихеназа в составе гибридных белков сохраняет свои основные свойства (рис. 1).

Рисунок 1. Чашечный тест бактериальных трансформантов: р()Е30-ЫсВМЗ-ЯРР, р(}ЕЗО-ЕОРР-1лсВМЗ, рРЕЗО-КЕР, р(?Е30-ЕСРР, К+ -положительный контроль (рС>ЕЗО-ЬшВМЗ), К- - отрицательный контроль (рОЕЗО).

Для того чтобы показать, что красный флуоресцентный белок в составе гибридного белка сохраняет свои основные свойства, бактериальные трансформанты, несущие плазмидный вектор рС)Е-ЬюВМЗ-11РР, были проанализированы методом флуоресцентной микроскопии (рис. 2).

Рисунок 2. Флуоресцентная микроскопия бактериальных трансформантов: р(5ЕЗО-ЬюВМЗ-РЕР - сконструированный плазмидный вектор; К+ положительный контроль (рС?Е30-КЕР); К- - отрицательный контроль (р()Е30-1лсВМЗ).

Для того чтобы показать, что зеленый флуоресцентный белок в составе гибридного белка сохраняет свои основные свойства, бактериальные трансформанты, несущие плазмидный вектор р(2Е-ЕОРР-1ЛсВМЗ, были проанализированы методом чашечного теста (данные в автореферате не приводятся).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в составе гибридных белков сохраняют свои основные свойства как лихеназа, так и красный флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок — активность, термостабильность и способность к флуоресценции, соответственно.

Для того, чтобы доказать, что в клетках прокариот происходит образование гибридных белков, белковые бесклеточные лизаты были проанализированы методом энзимограмм (рис. 3).

«Л»

70 55 40 35 25

Рисунок 3. Энзимограмма белковых бесклеточных лизатов: ЫЬ - рС>ЕЗО-ЕОРР-ПсВМЗ, - рС)ЕЗО-[лсВМЗ-1Ш\ К - рС)ЕЗО-ПсВМЗ, М - маркер белкового веса (кЮа).

Как видно из представленных данных (рис. 3), в клетках бактерий образуются гибридные белки, молекулярная масса которых соответствует теоретически рассчитанной - около 52 кДа. (ЬюВМЗ - 25 кДа, ИКР - 27 кДа, ЕвРР - 27 кДа).

3.2.2 Описание и создание модульных векторов серии рРС'С и р УЮ-Б

Первоначально, на основе данные анализа литературных источников, а также с учетом недостатков экспрессионных векторов, которые предложены и используются в настоящее время, нами разработаны и сконструированы две серии модульных экспрессионных векторов.

В первой серии векторов, обозначенной нами как рРвв, предлагается учесть большинство факторов, способных обеспечить эффективную

К ЯЬ ЬЯ ЬЯ ья яь м

экспрессию гетерологичных генов в растениях, а именно: окружение инициирующего А ТО кодона целевого гена; последовательности, кодирующие стабилизирующие аминокислоты во втором положении после инициирующего кодона; локализация и состав кодонов, терминирующих транскрипцию; оптимальный состав области полиаденилирования.

Базовый вектор этой серии имеет небольшой размер и предназначен для клонирования целевых генов и регуляторных элементов, поскольку модульная структура вектора позволят легко проводить замену регуляторных элементов, контролирующих экспрессию гетерологичного гена в растениях, таких как промоторы, последовательности лидерных пептидов, последовательности 3'- и 5'-НТО, важных для эффективной экспрессии трансгена, а также целевых генов (рис. 4).

Рисунок 4. Модульные экспрессионные вектора pPGG (A), pVIG-S (В). R1 - Sad', R2 - Spei; R3 - Sphï; R4 - Kpnl; R5 - Apal: R6, R13 - BamHl; R7 -EcoRl; R8 - Smal; R9 - Xbal; RIO - Hpaï; RI 1 - Xhol; R12 - Sali; LB и RB -левая и правая граница Т-ДНК области; oriV - точка начала репликации для агробактерий; Атрг — кассета устойчивости к ампицилину; Капг - кассета устойчивости к канамицину; pUC ori - точка начала репликации для E.coli; 35S - CaMV 35S промотор; polyA - сигнал полиаденирования; Nos - промотор нопалин синтетазы; NOS Т - терминирующая последовательность гена нопалин синтетазы.

На основе базового вектора этой серии сконструированы модульные вектора серии pPGG, в которых клонированы последовательности разных бирепортерных генов (gfp::licB, licB::rfp), а также регуляторных элементов, такие как лидерные последовательности экстенсина Lex (обеспечивает вынос белка в апопласт растительной клетки) [Piruzian E.S. et al., 2002.; Э.С.Пирузян и др., 2000; Jouzani G. S., Goldenkova I. V., 2008], малой субъединицы РБФКЮ Lch (обеспечивает транспорт белка в хлоропласты) [Э.С.Пирузян и др., 2000] и последовательности, обеспечивающие транспорт белка и его удержание в эндоплазматическом ретикулуме LeB4 и SRKDEL [Alanen H. I. et al., 2011]. Помимо этого, в 5'-НТО была клонирована (ОС)п-обогащенная последовательность (рис. 5). Следует подчеркнуть, что между последовательностями репортерных генов включен сайт рестрикции, что дает возможность использовать любой репортерный ген для трансрипкционно-трансляционного слияния с последовательностями целевых генов.

•j pUC ori —1 Amp' J-

pPGG 1A

{ m H R2~^ R3 м УДУ

RS I Hfp'ueamJ I Rr K^T PQ'v* H Rd HW18H R11

■H

pPGG 2A —fail и И «¡1 pPGG 2B —I tn H ю »5 I и» |R151 швм^-ют j ri fj i»i)A

pPGG 2C

pPGG 2D —| «1 Ц м }По Ш^Гяч t^'fll

1ТГ[

U-RFP j file [ S/WDei I l.ylyA Й RS ННЮНЯП

__у_^^^

pPGG ЗА —ГюТтТм « I w-ucat« | т wwAlf^jjigKiii}

pPGG 3B —j И1 H на л R3 R* СП R5 [ ил |ris| ofp-йсамз ] ri ^ рЫуА H Ra ^rio^'rh [—

ppgg зс —f^rprjf" »{К"'

Rl I Ш | Rib) GfP-Uc tW) j Ra [-. polyA И RB H Ь K" H

pPGG 3D

pPGG 3E —

R4 40C]n I R4 E5l R5 QFP— UcBHl | RT И Rft H рЫуА H H RIO H R11 h

Рисунок 5. Серия модульных векторов на основе вектора pPGG. R1 — Sad; R2 - SpeI; R3 - Sphl; R4 - Kpnl; R5 - Apal; R6 - BamHl; R7 - EcoRl; R8 -Smal; R9 - Xbal; RIO - Hpal; Rll - Xhol; R14 - Sail; R15 - Pstl; R16 - Hindlll; LicBM3 - ген, кодирующий термостабильную лихеназу Clostridium thermocellum; RFP - ген tagRFP, кодирующий красный флуоресцентный белок; GFP - ген egfp, кодирующий зеленый флуоресцентный белок; LeB4 - лидерный сигнал гена LeB4 (легумина типа В4) гороха Vicia faba; KDEL -последовательность в 3'-концевой области целевого гена, кодирующая аминокислоты С-концевой области белка; lex - лидерный сигнал гена экстенсина моркови; lch - лидерный сигнал, способный направлять продукт целевого гена в хлоропласта; (CG)n - последовательность, обогащенная CG нуклеотидами; 35S - CaMV 35S промотор; polyA - сигнал полиаденирования.

Вторая серия векторов, обозначенная нами pVIG-S (рис. 6), предназначена для клонирования экспрессионных модулей векторов серии pPGG и для изучения стабильной экспрессии гетерологичных генов в растениях. Вектор pVIG-S сконструирован на основе плазмиды р1СН6692. Этот вектор имеет размер 6342 п.н. В Т-ДНК область вектора включены следующие последовательности: селективный ген nptll, экспрессия которого

контролируется Pnos промотором и nos терминатором; последовательность полилинкера, включающая уникальные сайты с интегрированным между ними случайной последовательности ДНК, для простой процедуры переноса экспрессионного модуля из вектора pPGG. На основе базового вектора pVIG-S были сконструированы вектора для изучения исследуемых регуляторных элементов (рис. 6).

pVIG-S 1А

rD-i

NOS T I I^^Mj HI Fl^j R« I ATq5| R! I RFP^LtcBMl | Я7 Я» Ц polyA~|j R9

_oriV_J-f~Amp' [-fpUCort \

pVIG-S 2A pVIG-S 2B

pVIG-S 20 pVIG-S 2D

43H

HUH"

pVIG-S 3C

фь

pVIG-S ЗА

pVIG-S ЗВ

pVIG-S 3D

pVIG-S 3E(1

pVIG-S 3E(2

Huf R4 I ATG 1 R5 I L/еВШ - RFP | R7 polyA |-f~R9~]

Kuf R1 РИ-^Н R* ¡ATO I R5 I Ich [ R12 | LteBMJ ■ RFP [ R7 Ц R8 Ц polyA Ц R9 нЦД-

Karf ^ R4 ЦАТО I R5 | lex | R12 [ t<cBM3. RFP | R7 К~Я8~Ц polyA H RM ЬДД-

и^ф^чR1 ff-s^r4Iat°IRsI gfp•LicBm IR7Hrbf(р°'Уа -

""[^^ЯД]" R1 R< I ATOlj R5 I Ich |R12| QFP-LlcBW I R7 f{ R8 \\ polyA R9

R4 I ATG I R5 I lex | R12 | GFP • LICBM3 \ R7 |-j R8 fl polyA [■) R10

njjjm^rfyï

R4 ЦУДЦ R5 I LeB4 | R121 GFP • R8 | SRKDEL | polyA~H RH

I R5 I GFP- UCBJUJ I R8 Ц~рЫуА Ц Я11

R5 ¡GFP - LicBWjj R7 H p polyA j R11

Рисунок 6. Серия модульных векторов на основе вектора pVIG-S для стабильной экспрессии трансгена. RI - Sacï; R2 - Spei; R4 - Kpnl; R5 - Apal; R6 - BamHl; R7 - EcoRl; R8 - Smal; R9 - Xbal; RIO - Hpa\; Rl 1 - Xhol; R14 - Sali; R15 - Pstl; R16 - Hindlll; LicBM3 - ген, кодирующий термостабильную лихеназу Clostridium thermocellum; RFP - ген tagRFP, кодирующий красный флуоресцентный белок; GFP — ген egfp, кодирующий зеленый флуоресцентный белок; LeB4 - лидерный сигнал гена LeB4 (легумина типа В4) гороха Vicia faba; KDEL - последовательность в 3'-концевой области целевого гена, кодирующая аминокислоты С-концевой области белка; lex — лидерный сигнал гена экстенсина моркови; Ich - лидерный сигнал, способный направлять продукт целевого гена в хлоропласта; (CG)400, (GC)2000 - последовательности, обогащенные CG нуклеотидами разной длины и композиции; 35S - CaMV 35S промотор; polyA - сигнал полиаденирования; LB и RB - левая и правая граница Т-ДНК области; oriV - точка начала репликации для агробактерий; Amp1" -кассета устойчивости к ампицилину; Капг — кассета устойчивости к канамицину; pUC ori - точка начала репликации в E.coli; Nos - промотор нопалин синтетазы; NOS Т - терминирующая последовательность гена нопалин синтетазы.

3.3. Апробации модульных векторов с репортерными генами и различными регуляторными элементами

Для того чтобы продемонстрировать обеспечение экспрессии бирепортерных генов в составе сконструированных векторов серии рУЮ-Б, полученными экспрессионными векторами проведена трансформация агробактериального штамма ОУЗЮ1 и далее полученными агробактериальными трансформантами была проведена агробактериальная инфильтрация растений табака N. ЪепЛат1апа.

Эффективность процесса агроинфильтрации оценивали по флуоресценции зеленого флуоресцентного белка, который экспрессируется в составе бирепортерного белка (СРР::Ь1сВ) (рис.7).

Рисунок 7. Флуоресценция зеленого флуоресцентного белка в листьях растений табака Мсойапа ЬепЛагтапа через 4 дня после агроинфильтрации.

Через 4 суток после агроинфильтрации из зараженных частей листьев готовили белковые экстракты. Первоначально белковые экстракты были

проанализированы методом чашечного теста на наличие лихеназной активности (рис. 8).

Рисунок 8. Чашечный тест на активность

• лихеназы в белковых листьях растений табака МсоНапа ЬепАапиапа через 4 дня после агроинфильтрации. Ряд А - лунка А1 - белковый лизат бактериального трансформанта, экспрессирующего

белковые лизаты контрольных растений; ряд В - белковые лизаты растений с агроинфильтрацией вектором 358-1_с1>0-Ь; ряд Г - белковые лизаты растений с агроинфильтрацией вектором 358-Ьех-С-Ь; ряд Д - белковые лизаты растений с агроинфильтрацией вектором 358-ЬеВ4-0-Ь-К1)ЕЬ; ряд Е —белковые лизаты растений с агроинфильтрацией вектором 358-81-С-Ь и 358-82-С-Ь.

Как видно из результатов, представленных на рисунке 8, активность лихеназы выявлена в белковых лизатах, полученных из листьев растений табака после агроинфильтрации.

Для доказательства синтеза в растениях белковых продуктов бирепортерного гена, белковые лизаты, полученных из листьев растений табака после агроинфильтрации, проанализированы методом энзимограмм (рис. 9).

Рисунок 9. Пример энзимограмм на активность лихеназы в белковых лизатах, полученных из листьев растений табака МсоНапа ЬепЛатгапа через 4 дня после агроинфильтрации. 1, 2 и 3 -белковые лизаты растений после

агроинфильтрации векторами 358-1лсВ, 358-С-Ь и 358-ЬеВ4-в-1-КВЕЬ.

Как видно из результатов, представленных на рисунке 8, в листьях растений табака Шсойапа ЬепЛситапа происходит образование белкового продукта бирепортерного гена.

Для сравнительного анализа эффективности тестируемых регуляторных элементов был определен уровень накопления бирепортерного белка в листьях растений табака МсоНапа Ьем1шпйапа при агроинфильтрации. Оценку уровня накопления рассчитывали по активности лихеназы, как части бирепортерного белка, в перерасчете на суммарный растворимый белок.

На рисунке 10 представлены суммируемые результаты тестирования эффективности регуляторных элементов.

Рисунок 10.

Сравнительный анализ

эффективности регуляторных элементов, тестированных в растениях табака ШсоНапа Ьеп1Иат1апа при агроинфильтрации

1 2 3

52 кДа

25 кДа

Сравнительный анализ эффективности регуляторных элементов

—

! * 1 Г—1 1 1

353-0-1 355-|с1ьв-1 35S.leX.G-L 35S-l.eB4.G-l.- 355-51-0-1 355^2-0-1. __КОЕЬ

Как видно из результатов, представленных на рисунке 10, все тестированные регуляторные элементы обеспечивают более высокий уровень накопления белкового продукта бирепортерного гена в растительных клетках по сравнению с контролем. При этом уровень накопления белкового продукта бирепортерного гена при использовании лидерного сигнала, обеспечивающего транспорт и удержание белкового продукта в эндоплазматическом ретикулуме (358-ЬеВ4-0-Ь-КХ)Е1_), превышает такой контроля (358-0-Ь) приблизительно в 2,5 раз, при использовании лидерных сигналов для локализации в хлоропласты (358-1сЬ-0-Ь) и межклеточном пространстве растительных клеток (358-1ех-0-Ь) — на 0,2 и 0,5 раза. При тестировании 5'-нетранслируемых ОС-богатых областей разной дойны и композиции (358-8(размер 405 п.н., ОС-содержание 62,0) и 358-81-О-Ь (размер 2025 п.н., ОС-содержание 62,5) в отношении их эффективности обеспечивать высокоэффективную экспрессию, и, как следствие, накопление белкового продукта показано, что эти регуляторные последовательности обеспечивают высокий уровень накопления белкового продукта бирепортерного гена, который в 2,5 и 3,5 раза, превышает таковой для контроля.

Таким образом, проведенное тестирование регуляторных элементов с использованием репортерных систем позволило сделать следующее заключение: в растениях после агроинфильтрации происходит образование гибридного белкового продукта бирепортерного гена, в составе которого зеленый флуоресцентный белок и термостабильная лихеназа сохраняют свои основные свойства; выбранные регуляторные элементы обеспечивают более высокий уровень накопления белкового продукта в растениях, по сравнению с растениями после агроинфильтрации вектором, не несущим дополнительных регуляторных элементов; определен рейтинг апробированных регуляторных элементов в отношении обеспечения уровня накопления белкового продукта

бирепортерного гена: 358-82-0-Ь-----> 358-81-0-Ь----->358-ЬеВ4-0-Ь-КБЕЬ

-—> 358-81-0-Ь----->358-Ьех-0-Ь-----> 358-ЬсЫЗ-Ь.

3.4. Анализ последовательностей модельных и целевых генов и модификация их кодонового состава

Для анализа нуклеотидных последовательностей рекомбинантных белков-носителей, а также модельных и целевых белков с было разработанно программное обеспечение базы данных Р1о\уР1ап!Оепе, которое позволяет оценить необходимость модификации последовательности гетерологичного гена для увеличения эффективности его экспрессии в растениях.

Первоначально, мы протестировали программное обеспечение базы данных Р1о\уР1аШОепе с использованием нуклеотидной последовательности красного флуоресцентного белка (ИГР), которая имеет оптимальный кодоновый состав для экспрессии в эукариотах, в целом, и в растениях, в частности (ЗАО «Евроген», Россия). В качестве контроля использовали нуклеотидную последовательность этого же белка, размещенную в ЫСВ1 (Ь^:/Аулулу.псЫ.п1ш.п!Ь.еоу/писсоге/ЕР606900.1') до модификации. Результаты проведенного анализа представлены на рисунке 11.

АТС втс АвТ ААА вот вАА ОАв ТТС АТТ ААА вАв ААС АТС САТ АТС ААО ТТА ТАС АТО ОАО

ввА АСТ втс ААТ ААТ САС САС ТТТ ААО ТСТ АСА ТСА ОАв ввт ОАО ЭОА ААв ССА ТАС ОАО

ОвА АСС САА АСТ АТС АСА АТС ААА ОТА ОТС вАв ООА ввт ССТ СТТ ССА ТТТ ест ТТТ вАТ

АТА СТА ОСА АСА АвТ ТТС АТС ТАТ ввт ТСС АОв АСС ТТС АТТ ААС САТ АСТ САв ОвА АТС

ССТ ОАС ТТС ТТТ ААА САв ТСТ ТТТ ССТ ОАА вОТ ТТТ АСА Твв вАв Авв втт АСС АСТ ТАС

эле 6АС овт ввА втс ТТС АСА вСА АСС САС вАС АСТ ТСА ТТА САА вАТ вОА ТСС СТА АТА

ТАС ААТ вте ААА АТТ Авв вот ОТС ААТ ТТС ССТ АвТ ААС ввА ССА втт АТО САв ААв ААА

АСА СТА вот ТОО вАА ест ААТ АСТ вАА АТС ттс ТАС ССТ всс вАС ООА ООТ ТТА вАА овт

АвА ТСС вАС АТС всс стт ААО СТА ОТС ООА ввт ОвА САС ТТС АТС ТСТ ААС ТТТ ААА АСС

АСА ТАТ Авв ТСТ ААО ААО ССА вСА ААО ААТ СТА ААА АТС ССТ ввт втт ТАС ТАТ ОТО ОАС

САТ АОА СТА ОАА Авв АТА ААА 6АА ОСА ОАС ААА ОАА АСТ ТАС ОТО ОАО САА САТ ОАв ОТС

всс ОТС вСТ Авв ТАТ ТСС вАС ТТА ССТ ТСС ААО СТА вот САС ААА ТТС ААС

■г*'¿чу V V » V

АТО АвС ОАв СТО АТТ ААО ОАв ААС АТС САС АТС ААв СТС ТАС АТО ОАв вве АСС втв ААС

ААС САС САС ТТС ААО ТСС АСА ТСС вАО ООС ОАА вве ААО ССС ТАС вАО овс АСС САО АСС

АТО АОА АТС ААО втс втс ОАО ввс вое ССТ СТС ССС ТТС ОСС ТТС ОАС АТС СТС ОСТ АСС

АО С ТТС АТС ТАС ввс АО С АСА АСС ТТС АТС ААС САС АСС САО ООС АТС ССС ОАС ТТС ТТТ

ААО САО ТСС ТТС ССТ вАв ООС ТТС АСА ТСО ОАО АОА втс АСС АСА ТАС вАА вАС воо ООС

втв ста АСС ест АСС САв вАС АСС АвС СТС САв вАС авс ТСС СТС АТС ТАС ААС вте ААв

АТС АвА овв втс ААС ТТС ССА ТСС ААС вве ССТ вте АТС САО ААв ААА АСА СТС вве тсв

ОАО всс ААС АСС вАО АТС СТО ТАС ССС ОСТ ОАС ООС овс СТС ОАА вое АвА АвС ОАС АТС

всс ств ААв СТС втс ООС ООО ввс САС ств АТС тсс ААС ТТС ААО АСС АСА ТАС АОА ТСС

ААО ААА ссс ест ААО ААС СТС ААО АТС ссс вве втс ТАС ТАТ вте ОАС САС АвА СТС вАА

АвА АТС ААв вАО ОСС ОАС ААА вАв АСС ТАС втс ОАО САв САС вАО втв ест вте всс АвА

ТАС ТСС вАС стс ССТ АОС ААА стс ово САС ААв ТСА

|„||||

йк

¿штормя

Рисунок 11. Нуклеотидные последовательности модифицированного К.РР (А) и нативного ЯБР (Б) и результаты сравнительного анализа нуклеотидной последовательности модифицированного (А) и нативного (Б) гена ЛРР по кодоновому составу в сравнении с кодоновым составом генов растений. Синие столбцы — средние значения кодонового состава генов растений, красные столбцы — кодоновый состав гена ПНР.

17979797

Как видно из представленных данных нуклеотидная последовательность модифицированного варианта RFP не содержит редких для растений кодонов, в отличие от последовательности нативного RFP, для которого характерны значительные отличия в кодоновом составе по сравнению с таковым растений. Выравнивание нуклеотидных последовательностей модифицированного и нативного RFP показало, что в последовательности модифицированного варианта RFP произведены значительные замены одних нуклеотидов на другие (рис. 12).

gw_tagrfp ATGGTGAGTAAAGGTGAAGAGTTGATTAAAGAGAACATGCATATGAAGTTATACATGGAG 60

ncbitagrfp ---ATGAGC---------GAGCTGATTAAGGAGAACATGCACATGAAGCTGTACATGGAG 48

gw_tagrfp GGAACTGTCAATAATCACCACTTTAAGTGTACATCAGAGGGTGAGGGAAAGCCATACGAG 120

ncbitagrfp GGCACCGTGAACAACCACCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGCAAGCCCTACGAG 108

gw_tagrfp GGAACCCAAACTATGAGAATCAAAGTAGTGGAGGGAGGTCCTCTTCCATTTGCTTTTGAT 180

ncbitagrfp GGCACCCAGACCATGAGAATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCTCCCCTTCGCCTTCGAC 168

gw_tagrfp ATACTAGCAACAAGTTTCATGTATGGTTCCAGGACCTTCATTAACCATACTCAGGGAATC 240

ncbitagrfp ATCCTGGCTACCAGCTTCATGTACGGCAGCAGAACCTTCATCAACCACACCCAGGGCATC 228

gw_tagrfp CCTGACTTCTTTAAACAGTCTTTTCCTGAAGGTTTTACATGGGAGAGGGTTACCACTTAC 3 00

ncbitagrfp CCCGACTTCTTTAAGCAGTCCTTCCCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGAGTCACCACATAC 288

gw_tagrfp GAGGACGGTGGAGTCTTGACAGCAACCCAGGACACTTCATTACAAGATGGATGCCTAATA 3 60

ncbitagrfp GAAGACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACACCAGCCTCCAGGACGGCTGCCTCATC 34 8

gw_tagrfp ncbitagrfp

TACAATGTGAAAATTAGGGGTGTGAATTTCCCTAGTAACGGACCAGTTATGCAGAAGAAA 4 20 TACAACGTCAAGATCAGAGGGGTGAACTTCCCATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAA 4 08

gw_tagrfp ncbitagrfp

ACACTAGGTTGGGAAGCTAATACTGAAATGTTGTACCCTGCCGACGGAGGTTTAGAAGGT 480 ACACTCGGCTGGGAGGCCAACACCGAGATGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGGAAGGC 468

gw_tagrfp ncbitagrfp

AGATCCGACATGGCCCTTAAGCTAGTCGGAGGTGGACACTTGATCTGTAACTTTAAAACC 540 AGAAGCGACATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGGGCCACCTGATCTGCAACTTCAAGACC 528

** ***** * *

gw tagrfp ncbitagrfp

ACATATAGGTCTAAGAAGCCAGCAAAGAATCTAAAAATGCCTGGTGTTTACTATGTGGAC 600 ACATACAGATCCAAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCCGGCGTCTACTATGTGGAC 588

gw_tagrfp ncbitagrfp

CATAGACTAGAAAGGATAAAAGAAGCAGACAAAGAAACTTACGTGGAGCAACATGAGGTC 660 CACAGACTGGAAAGAATCAAGGAGGCCGACAAAGAGACCTACGTCGAGCAGCACGAGGTG 648

дъг^адг£р ncbitagrfp

Рисунок 12. Результат выравнивания нуклеотидных последовательностей модифицированного и нативного RFP в программе С1и51а1\¥, где gw tagrfp -последовательность модифицированного варианта РРР, ncbitagrfp -последовательность нативного RFP.

GCCGTCGCTAGGTATTGCGACTTACCTTCCAAGCTAGGTCACAAATTGAAC 711 GCTGTGGCCAGATACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAAGT-GA-- 696

Ранее было продемонстрировано, что модифицированный RFP эффективно экспрессируется в растительных клетка. Полученные данные позволяют предположить надежность результатов анализа с использованием программного обеспечения базы данных FlowPlantGene.

Аналогичным образом были проанализированы последовательности нативных вариантов генов, кодирующих интерферон-альфа-А2, циклически перестановленную термостабильную лихеназу и зеленый флуоресцентный белок, а также были оптимизированы соответствующие гены по кодоновому составу.

Далее методом ферментативного синтеза были сконструированы целевые модельные гены с оптимизированным кодоновым составом.

3.5. Создание модульных векторов, несущих модельные и целевые гены с модификациями кодонового состава и без модификации

Для экспериментальной проверки роли соответствия кодонового состава генов для их эффективной экспрессии в растениях, были сконструированы модульные вектора, несущие модельные и целевые гены с модификациями кодонового состава и без таковой: оптимизированный и неоптимизированный по кодоновому составу ген, кодирующий интерферон-альфа-А2 и оптимизированный и неоптимизированный по кодоновому составу ген, кодирующий термостабильную лихеназу.

Поскольку интерферон не обладают ферментативными активностями, за счет которых можно проводить простую оценку их накопления в растениях, нами сконструированы гибридный ген, в котором неоптимизированный целевой ген, а также этот ген с оптимизированным кодоновым составом, имеет транскрипционно-трансляционное слияние с последовательностью гена, кодирующего термостабильную лихеназу.

Полученные оптимизированные и неоптимизированные

последовательности модельного (inf-A2::licBM3) и целевого (licBM3-CP) генов затем были клонированы в модульные вектора pPGG и pVIG-S с помощью методов молекулярного клонирования (рис. 13).

pVIG-S 5А

-INOS Tl Karf R1 R4 IATQJ R5 I INF - LicBM3 I R8 H polvA -IR9 l-j " f

Рисунок 13.

Ofiv H~AmpH-|pUCori"l-' Серия

pr'%S 5B л______ ___ rm модульных

-p Host KafllJ^^MlttB^ R4|AT9:1 R5 I торЦ-исВМЗ 1 R8 -polyA'-RIO'r-j I— векторов на

VIG S 7A основе

-Вншв R1 H^TrTI ATS I R5 I CN99 "ТШ polyA -R9-|' |- p VIG ^ ДЛЯ

pVIG-S 7B стабильной

-f^t-NOS T

IWTfMvAHRii

экспрессии трансгена.

3.6. Сравнительный анализ экспрессии модельных и целевых генов с оптимизированным и неоптимизированным кодоновым составом в растениях табака

Для того чтобы экспериментально проверить насколько кодоновый состав гетерологичных генов влияет на эффективность их экспрессии была проведена агробактериальная инфильтрация растений табака разных родов N. benthamiana и N. excelsior.

Для удобства интерпретации и восприятия полученных результатов линий растений N. benthamiana, трансфецированных сконструированными векторами, были обозначены нами следующим образом: B-IN-Lic (вектор pVIG-S-5A); B-INop-LicB (вектор pVIG-S-5B); В-СР (вектор pVIG-S-7A) и В-СРор (вектор pVIG-S-7B), а для линии растений N. excelsior - E-IN-Lic (вектор pVIG-S-5A); E-INop-LicB (вектор pVIG-S-5B); Е-СР (вектор pVIG-S-7A) и Е-СРор (вектор pVIG-S-7B).

Полученными экспрессионными векторами проведена трансформация агробактериального штамма GV3101 и далее полученными агробактериальными трансформантами проведена агроинфильтрация растения Nicotiana benthamiana и N. excelsior.

Для доказательства синтеза в растениях белковых продуктов гетерологичных генов, белковые лизаты, полученных из листьев растений табака после агроинфильтрации, проанализированы методом энзимограмм (рис. 14).

j jy[ 2 3 4 Рисунок 14. Пример энзимограммы

на активность лихеназы в белковых лизатах, полученных из листьев растений табака Nicotiana benthamiana и N. excelsior через 4 дня после агроинфильтрации. 1, 2, 3, 4 - белковые лизаты растений после агроинфильтрации векторами Е-СР, B-IN-Lic, B-INop-LicB и E-INop-LicB; М - маркер молекулярных масс.

Как видно из результатов, представленных на рисунке 14, при экспрессии гетерологичных генов в листьях растений табака Nicotiana benthamiana и N. excelsior, происходит образование белков, молекулярная масса которых соответствует теоретически рассчитанной - 25 кДа (для лихеназы - Е-СР) и 49 кДа (для интерферона-альфа-2А - B-IN-Lic, B-INop-LicB и E-INop-LicB).

Для сравнительного анализа эффективности тестируемых регуляторных элементов был определен уровень накопления бирепортерного белка в листьях растений табака Nicotiana benthamiana и N. excelsior при агроинфильтрации. Оценку уровня накопления рассчитывали по активности лихеназы, как части бирепортерного белка, в перерасчете на суммарный растворимый белок.

На рисунках 15 и 16 представлены суммируемые результаты тестирования экспрессии гетерологичных генов с оптимизированным и неоптимизированным кодоновым составом в различных видах растений табака.

Сравнительный анализ эффективности экспрессии гетерологичных генов с разным кодоновым составом в растениях табака №сог/ала ЬетЬат/апа

0,5 т 0,45

0,4

S " 0,35

3 к 0.3

7 » 0 ?5

с ■ С - 0,2

* £ ? 1 0,15

I ш 0,1

0,05

а. >> 0

B-INOP-LICB

Рисунок 15. Сравнительный анализ эффективности экспрессии гетерологичных генов с разным кодоновым составом в растениях табака МсоНапа ЬепОшпиапа при агроинфильтрации.

Сравнительный анализ эффективности экспрессии гетерологичных генов с разным кодоновым составом в растениях табака Nicotiana excelsior

О 0,6 ■ X

1«. 0.5 ■

0 а.

1 ; 0.4 ■

11 о.з ■

С я

I 2 0,2 -

3 i

£ " 0,1 -

E-INop-UcB

Рисунок 16. Сравнительный анализ эффективности экспрессии гетерологичных генов с разным кодоновым составом в растениях табака Nicotiana excelsior при агроинфильтрации.

Как видно из результатов, представленных на рисунках 15 и 16, при экспрессии в растениях табака гетерологичных генов с оптимизированным кодоновым составом отмечается достоверное увеличение уровня накопления соответствующего белкового продукта в растительных клетках по сравнению с

накоплением белкового продукта гетерологичного гена с неоптимизированным для экспрессии в растениях кодоновым составом.

Таким образом, сравнительное тестирование экспрессии гетерологичных генов с оптимизированным кодоновым составом и без оптимизации в растениях табака разных видов позволило сделать следующее заключение: в растениях табака после агроинфильтрации происходит образование белковых продуктов гетерологичных генов; отмечается достоверное увеличение уровня накопления белковых продуктов исследованных гетерологичных генов с оптимизированным для эффективной экспрессии кодоновым составом по сравнению с гетерологичными генами без оптимизации кодонового состава; отмечена сходная зависимость увеличения уровня накопления белковых продуктов исследованных гетерологичных генов с оптимизированным для эффективной экспрессии кодоновым составом для растений табака двух разных видов.

Выводы

1. С использованием биоинформатических методов и анализа литературных данных проведен поиск генетических детерминант, которые потенциально способны влиять на уровень экспрессии гетерологичных генов, и предложены для последующей апробации несколько регуляторных элементов, а именно, лидерные последовательности генов, которые обуславливают транспорт белкового продукта в различные компартменты растительной клетки, СО-богатые области, которые обычно локализованы в 5'-области высоко экспрессируемых генов в растениях, а также кодоны для второй аминокислоты в последовательностях белков и целый ряд других последовательностей.

2. Сконструированы синтетические регуляторные элементы, которые потенциально способны влиять на уровень экспрессии гетерологичных генов: лидерные последовательности для транспорта целевого белка в хлоропласта и апопласты, сигнальные последовательности для локализации целевого белка в эндоплазматическом ретикулуме, СО-богатые последовательности различного размера и композиции.

3. Сконструированы серии модульных векторов, в которых учтены большинство факторов, обуславливающих эффективную экспрессию генов в растений.

4. Продемонстрировано, что СО-богатые последовательности в 5'-нетранслируемой области обеспечивают достоверное увеличение уровня экспрессии бирепортерных генов, по сравнению с уровнем экспрессии этих же генов без такой последовательности.

5. Показано, что достоверное увеличение уровня экспрессии бирепортерных генов обеспечивают лидерные сигналы транспорта и локализации белкового продукта в эндоплазматическом ретикулуме.

6. Показано, что кодоновый состав модельных гетерологичных генов, оптимизированный на основании анализа кодонового состава растений, обуславливает достоверное увеличение уровня накопления белковых продуктов исследуемых генов.

Публикации по материалам работы:

Статьи

1. Vyacheslavova А.О.. Berdichevets I.N., Shimshilashvili H.R., Romanov E.A., Mustafaev О., and Goldenkova-Pavlova I. A series of modular vectors for cloning of target genes and regulatory elements for providing stable and effective expression of heterological genes in plants (Серия модульных векторов для клонирования целевых генов и регуляторных элементов для обеспечения стабильной и эффективной экспрессии гетерологичных генов в растениях) // In Vitro Cell and Developmental Biology - Plant, 2011, № 47, C. 549-550.

2. Вячеславова A.O.. Мустафаев O.H., Тюрин A.A., Шимшилашвили X.P., Бердичевец И.Н., Шаяхметова Д.М., Голденков М.А., Фадеев B.C., Шелудько Ю.В., Голденкова-Павлова И.В. Серия модульных векторов для стабильной и транзиентной экспрессии гетерологичных генов в растениях //Генетика, 2012,- Т. 48, № 9.- С. 1046-1056.

3. Вячеславова А.О.. Бердичевец И.Н., Тюрин A.A., Шимшилашвили Х.Р., Мустафаев О., Голденкова-Павлова И.В. Экспрессия гетерологичных генов в растительных системах: новые возможности // Генетика, 2012.- Т. 48, № 11,- С. 1067-1079.

Избранные тезисы докладов

4. Фадеев B.C., Шимшилашвили Х.Р., Бердичевец И.Н., Вячеславова А.О.. Голенкина С.А., Гордукова М.А., Бабыкин М.М., Зинченко В.В., Ралдугина Г.Н., Голденкова-Павлова И.В. Разработка новых подходов создания трансгенных растений, перспективных для фотобиотехнологии //Материалы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», Звенигород, 8-12 сентября 2008 года,- С. 422-423.

5. Вячеславова А.О.. Голденкова-Павлова И.В. Разработка молекул-носителей для целевых пептидов как основа создания новых безопасных вакцин и наработка терапевтических белков //Материалы Международной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты. /Под редакцией Н.П. Максимовой.- Минск: Издательский центр БГУ, 2008,- С. 289-291.

6. Вячеславова А.О.. Голденкова-Павлова И.В. Генно-инженерные подходы для создания молекул-носителей целевых пептидов // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» /Отв. ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев //http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2009/genet-2009.pdf.- С.5.

7. Вячеславова А.О. Генно-инженерные подходы для разработки молекул-носителей целевых пептидов медицинского назначения как основа создания безопасных мультивалентных вакцин //Международная научная конференция «Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий», 25-29 октября 2010 года,- Минск, 2010,- С. 9.

8. Вячеславова А.О.. Бердичевец И.Н., Шимшилашвили Х.Р., Савчин Д.В., Голденкова-Павлова И.В. Серия модульных векторов для клонирования целевых генов и регуляторных элементов с целью обеспечения стабильной и эффективной экспрессии гетерологичных генов в растениях // III Всероссийский симпозиум «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности».- Москва, 2010.- С. 29.

9. Vyacheslavova О.А.. Gerasymenko I.M., Sakhno L.O., Sindarovska Y.R., Sheludko Y.V., Goldenkova-Pavlova I.V. Thermostable lichenase of Clostridium Thermocellum as a perspective reporter and carrier for expression of heterologous proteins (Термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum как перспективный репортер и молекула-носитель для экспрессии гетерологичных белков) // International conference «Plant Transformation Technologies II». Vienna, Austria, 2011.- C. 29.

10. Вячеславова A.O.. Шимшилашвили X.P., Бердичевец И.Н., Тюрин А.А., Мустафаев О., Голденкова-Павлова И.В. Серия модульных векторов для клонирования целевых генов и регуляторных элементов с целью обеспечения стабильной и эффективной экспрессии гетерологичных генов в растениях //12-я Молодежная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии».- Москва, 2012.- С. 27-28.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность и благодарность своему научному руководителю - доктору биологических наук Ирине Васильевне Голденковой-Павловой за всестороннюю поддержку и бесценную помощью при выполнении научной работы; автор также выражает свою благодарность всем сотрудникам группы геномики растений в лице Мустафаева Орхана, Шимшилашвили Христины, Бердичевец Ирины, Фадеева Виталия, Тюрина Александра, Шаяхметовой Динары за помощь на всех этапах подготовки и проведения научной работы.

Автор также выражает благодарность сотрудникам ФГБУН Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН в лице Оксаны Леонидовны Коломиец и Виктора Евгеньевича Спангенберга за длительное и плодотворное сотрудничество и помощь в освоении ряда методик.

Отдельную благодарность автор выражает к.б.н. Юрию Всеволодовичу Шелудько и к.б.н. Ирине Герасименко, предоставившим ценный материал для работы.

Искреннюю и сердечную благодарность автор выражает своей семье, в первую очередь Булгаковой Ирине Витальевне и Шендяпину Семену Сергеевичу за неоценимую поддержку, понимание и огромное терпение.

Подписано в печать. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 Экз. Заказ № 2096 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вячеславова, Алиса Олеговна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Подходы к экспрессии гетерологичных генов в растениях

1.1.1. Стабильная экспрессия

1.1.2. Транзиентная экспрессия

1.2. Обзор генетических детерминант, обуславливающих 21 высокую экспрессию трансгена на разных уровнях: транскрипция, трансляция, стабильность белка

1.2.1. Регуляторные элементы, позитивно влияющие на уровень 22 транскрипции

1.2.2. Процессинг и сплайсинг пре-мРНК

1.2.3. Регуляторные элементы, позитивно влияющие на уровень 26 трансляции

1.2.4. Регуляторные элементы, позитивно влияющие на 30 стабильность белка

1.3. Векторы для экспрессии гетерологичных генов в растениях

Глава 2. Материалы и методы

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1.1 Поиск генетических детерминант, позитивно влияющих на 62 уровень транскрипции в растениях

3.1.2 Поиск генетических детерминант, позитивно влияющих на 72 уровень трансляции в растениях

3.1.3. Поиск генетических детерминант, позитивно влияющих на уровень стабильности белков в растениях

3.2. Создание модульных векторов для апробации регуляторных элементов с использованием бирепортерных генов

3.2.1. Конструирование бифункциональных репортерных генов

ИсШЛЪ-rfp и egfp-licBM

3.2.2 Апробация функционировании сконструированных 85 бирепортерных генов в бактериальных клетках

3.2.3 Описание и конструирование модульных векторов серии 88 pPGG и pVIG-S

3.2.4. Клонирование бирепортерных генов и регуляторных 93 последовательностей в базовый модульный вектор серии pPGG

3.2.5. Клонирование бирепортерных генов и регуляторных 95 последовательностей в базовый модульный вектор серии pVIG-S

3.3. Апробации модульных векторов с репортерными генами и 97 различными регуляторными элементами

3.4. Анализ последовательностей модельных и целевых 102 генов и модификация их кодонового состава

3.4.1 Анализ нуклеотидной последовательности гена, 110 кодирующего рекомбинантный белок-носитель термостабильную лихеназу (LicBM3-CP)

3.4.2 Анализ и модификация нуклеотидной последовательности 113 гена, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP)

3.4.3 Анализ и модификация нуклеотидной последовательности 115 гена, кодирующей интерферон-альфа-2А

3.4.4 Модификация кодонового состава нуклеотидных 118 последовательностей, кодирующих модельные и целевые белки

3.5. Создание модульных векторов, несущих модельные и 123 целевые гены с модификациями кодонового состава и без модификации

3.5.1. Конструирование вектора, несущего транскрипционно- 123 трансляционное слияние гена, кодирующего интерферон-альфа

2А с оптимизированным и неоптимизированным кодоновым составом, и гена, кодирующего термостабильную лихеназу.

3.5.2. Клонирование последовательностей, кодирующих 125 гибридные гены infHeo-licBM3 и infonT-licBM3, и гены, кодирующих рекомбинантную термостабильную лихеназу с оптимизированным и неоптимизированным кодоновым составом, в вектора серии рРвв и рУЮ-Б.

3.6. Сравнительный анализ экспрессии модельных и 127 целевых генов с оптимизированным и неоптимизированным кодоновым составом в растениях табака разных видов Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии гетерологичных генов, кодирующих рекомбинантные белки"

В настоящее время трансгенные растения широко используются как модели для изучения фундаментальных исследований по изучению физиологической роли растительных генов и для решения прикладных задач по созданию устойчивых форм сельскохозяйственных культур и продукции рекомбинантных белков в растениях. Успех в этих направлениях, прежде всего, связан с эффективностью экспрессии перенесенного гена (трансгена) в растениях. Эффективность экспрессии трансгена обуславливается рядом факторов: кодоновым составом трансгена; регуляторными элементами, контролирующими его экспрессию; интеграцией трансгена в определенные'участки генома растений и рядом других.

Сейчас, помимо стабильной экспрессии целевых генов исследователями широко используется транзиентная экспрессия этих генов как эффективный подход для изучения регуляторных элементов и физиологической роли генов растений, а также для использования растений как продуцентов целевых белков. При транзиентной экспрессии с использованием агробактерий, в основном, используют обычные экспрессионные векторы, полученные на основе бинарных Тьплазмид, которые, помимо целевого гена содержат и селективные гены. Для преодоления эффекта «замолкания» трансгена исследователи используют подход, основанный на ко-трансформации растений вектором, несущий ген белка р19 вируса томатов, супрессор посттранскрипционного замолкания генов.

Несмотря на значительные успехи в области создания и изучения трансгенных растений, наши познания в отношении генетических факторов, которые оказывают влияние на эффективность экспрессии генов в растениях, еще весьма ограничены.

Следует подчеркнуть, что решение важных научных и прикладных задач с использованием экспрессии гетерологичных генов в растениях затруднено, прежде всего, за счет значительных пробелов в понимании генетических детерминант, которые обуславливают эффективную экспрессию гетерологичных генов в растениях. Следует подчеркнуть, что важную роль в исследованиях по созданию и изучению трансгенных растений играют экспрессионные вектора, используемые для трансформации растений. Сейчас предложены и используются целый спектр экспрессионных векторов для трансформации растений, однако, наряду с преимущества эти вектора имеют и недостатки, которые могут сказаться на эффективности экспрессии трансгена.

1. Провести поиск генетических детерминант, которые потенциально способны влиять на уровень экспрессии гетерологичных генов с использованием биоинформатических подходов.

4. Провести апробацию модульных векторов, в которых экспрессия нативных и модифицированных модельных генов контролируется различными регуляторными элементами.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Вячеславова, Алиса Олеговна

Выводы

2. Сконструированы синтетические регуляторные элементы, которые потенциально способны влиять на уровень экспрессии гетерологичных генов: лидерные последовательности для транспорта целевого белка в хлоропласты и апопласты, сигнальные последовательности для локализации целевого белка в эндоплазматическом ретикулуме, СО-богатые последовательности различного размера и композиции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вячеславова, Алиса Олеговна, Москва

1. Голденкова И.В. (2002а) Новые репортерные систему для изучения регуляции экспрессии генов // Диссертация доктора биологический наук, ИОГен РАН. Москва.

2. Голденкова И.В. Репортерные системы: возможности для изучения различных аспектов регуляции экспрессии генов // Успехи современной биологии. 2002. № 6. С. 515-526.

3. Голденкова-Павлова И.В., Мирахорли Н., Маали А.Р. и др. Экспериментальные модели для создания трансгенных растений, устойчивых к стрессовым факторам. Цитология и генетика. 2007. № 3. С. 44-49.

4. Зверлов В.В. Изучение структуры гена лихеназы Clostridium thermocellum Ф7 и характеристика продукта данного гена // Дисс. канд. биол. наук. -1993. ИМГ РАН. - Москва.

5. Комахин P.A., Абдеева И.А., Салехи Джузани Г.Р. и др. (2005) Термостабильная лихеназа как трансляционный репортер // Генетика, Т. 41. № 1. С. 31-40.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. // Молекулярное клонирование. М. Мир. 1984.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984). Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование // «Мир», Москва.

8. Патрушев JI. И. Экспрессия генов// Москва: Наука, 2000. 527 с.

9. Пирузян Э.С., Голденкова И.В., Мусийчук К.А.и др. Новая репортерная система, основанная на высокой термостабильности лихеназы, для изучения регуляции экспрессии генов у растений // Физиология растений. 2000. Т.37. №3. С.382-389.

10. Ю.Фадеев B.C., Шимшилашвили X. Р., Гапоненко А.К. Индукционная, регенерационная и баллистическая восприимчивость различных генотипов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L) // Генетика. 2008. Т.44. №9. С. 1257-1267.

11. Щелкунов С.Н., Константинов Ю.М., Дейнеко Е.В. Транспластомные растения // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011. Т. 15. № 4. С. 808-817.

12. Abu-Arish, A. Three-dimensional reconstruction of Agrobacterium VirE2 protein with single-stranded DNA/ A. Abu-Arish, D. Frenkiel-Krispin, T. Fricke, et al.// J Biol Chem 2004. - V.279. - P.25359-25363.

13. Alvarez, M.L. Higher accumulation of Fl-V fusion recombinant protein in plants after induction of protein body formation/ M.L. Alvarez, E. Topal, F. Martin and G.A. Cardineau // Plant Mol. Biol. 2010. - V.72. - P.75-89.

14. Arakawa, T. Synthesis of a cholera toxin В subunit-rotavirus Nsp4 fusion protein in potato/ T. Arakawa, J. Yu, and W.H.R. Langridge // Plant Cell Rep. 2001. - V.20. - P.343-348.

15. Askolin, S. Overproduction, purification, and characterization of the Trichoderma reesei hydrophobin HFBI/ S. Askolin, T. Nakari-Seta " la " and M. Tenkanen // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V.57. - P.124—130.

16. Attardi, G. Biogenesis of mitochondria/ G. Attardi, G. Schatz // Annual Review of Cell Biology 1988. - V.4. - P.289-331.

17. Aziz, M.A. Transformation of an edible crop with the pagA gene of Bacillus anthracis/ M.A. Aziz, D. Sikriwal, S. Singh, S. Jamgula, P.A. Kumar and R. Bhatnagar // FASEB J. 2005. - V.19. - P.1501-1503.

18. Bachmair, A. The degradation signal in a short- lived protein / A. Bachmair and A. Varshavsky // Cell. 1989. - V. 56. - P. 1019-1032.

19. Bachmair, A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue / A. Bachmair, D. Finley and A. Varshavsky // Science. 1986. - V. 234.-P. 179-186.

20. Bai, L. Gene regulation by nucleosome positioning / L. Bai and A.V. Morozov // Trends Genet. 2010. - V.26. - P.476-483.

21. Baker, R.T. Yeast N-terminal amidase. A new enzyme and component of the N-end rule pathway / R.T. Baker and A. Varshavsky // J. Biol. Chem. -1995. V. 270. - P. 12065-12074.

22. Bailas N. Transient expression of the plasmid pCaMVCAT in plant protoplasts following transformation with polyethyleneglycol / N. Bailas, N. Zakai, A. Loyter. // Experimental Cell Research 1987 - V. 170 - 1.1 - P. 228-234.

23. Baneyx, F. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli / F. Baneyx, M. Mujacic // Nat. Biotechnol. 2004. - V. 22. - P. 1399-1408.

24. Bayer, E.A. Cellulose, cellulases and cellulosomes / E.A. Bayer, H.R. Chanzy, R. Lamed and Y. Shoham // Current Opinion in Structural Biology -1998. -V. 8.-P. 548-557.

25. Belknap, W. pBINPLUS/ARS: an improved plant transformation vector based on Pbinplus/ W. Belknap, D. Rockhold, K. McCue // Biotechniques. 2008. -V.44. - №6. - P.753-756.

26. Benchabane, M. Preventing unintended proteolysis in plant protein biofactories/ M. Benchabane, C. Goulet, D. Rivard, L. Faye, V. Gomord and D. Michaud // Plant Biotechnol. J.-2008.-V.6.-P. 633-648.

27. Bionda, T. Chloroplast Import Signals: The Length Requirement for Translocation In Vitro and In Vivo/ T. Bionda, B. Tillmann, S. Simm, K. Beilstein, M. Ruprecht, and E. Schleiff// J. Mol. Biol. 2010. - V. 402. -P.510-523.

28. Bionda, T. On the impact of precursor unfolding during protein import into chloroplasts/ T. Bionda, T. Sato, M. S. Sommer, T. Endo, E. Schleiff // Mol. Plant 2010. - V.3. - P.499-508.

29. Bishopp, A. Signs of change: hormone receptors that regulate plant development / A. Bishopp, A.P. Mahonen and Y. Helariutta // Development. -2006. V. 133.-P. 1857-1869.

30. Boehm, R. Bioproduction of therapeutic proteins in the 21st century and the role of plants and plant cells as production platforms/ R. Boehm // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007. - V. 1102.-P.121-134.

31. Boothe, J. Seed-based expression systems for plant molecular farming / J. Boothe, C. Nykiforuk, Y. Shen, S. Zaplachinski, S. Szarka, P. Kuhlman, E. Murray, D. Morck and M.M. Moloney // Plant Biotechnol. 2010. - V. 8. -P.525-528.

32. Bradford, M. A. Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding / M. A. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - V.72. - P.248-254.

33. Buratowski, S. Progression through the RNA polymerase II CTD cycle / S. Buratowski // Mol. Cell. 2009. - V.36. - P.541-546.

34. Cairns, B.R. The logic of chromatin architecture and remodelling at promoters / B.R. Cairns // Nature. 2009. - V.461. - P. 193-198.

35. Cañizares, M.C. Use of viral vectors for vaccine production in plants. Immunol/ M.C. Cañizares, L. Nicholson and G.P. Lomonossoff // Cell Biol. -2005.-V.83.-P.263-270.

36. Carrozza, M.J. Histone H3 methylation by Set2 directs deacetylation of coding regions by Rpd3S to suppress spurious intragenic transcription/ M.J. Carrozza et al. // Cell 2005. - P. 123, 581-592.

37. Chen Q.J. A Gateway-based platform for multigene plant transformation / Chen Q.J, Zhou HM, Chen J, Wang XC. // Plant Mol Biol 2006 - V.62: - P. 927-936.

38. Cheung, V. Chromatin- and transcription-related factors repress transcription from within coding regions throughout the Saccharomyces cerevisiae genome / V. Cheung et al. // PLoS Biol. 2008. - V.6. - P.277.

39. Chikwamba, R. Expression of a synthetic E. coli heatlabile enterotoxin B subunit (LT-B) in maize/ R. Chikwamba, J. McMurray, H. Shou, B. Frame, S.E. Pegg, P. Scott, H. Mason, K. Wang // Molecular Breeding 2002. - V.10. -P.253-265.

40. Chrispeels, M.J. The Golgi apparatus mediates the transport of phytohemagglutinin to the protein bodies in bean cotyledons/ M.J. Chrispeels // Planta. 1983. -V. 158. - P.140-151.

41. Churchman, L.S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution/ L.S. Churchman and J.S. Weissman, // Nature 2011. -Y.469. - P.368-373.

42. Coleman, C.E. The maize gamma-zein sequesters alpha-zein and stabilizes its accumulation in protein bodies of transgenic tobacco endosperm / C.E. Coleman, E.M. Herman, K. Takasaki and B.A. Larkins // Plant Cell 1996. -V.8. - P.2335-2345.

43. Conley, A. J. Induction of protein body formation in plant leaves by elastin-like polypeptide fusions/ A. J. Conley, J. J. Joensuu, A. Richman, R. Menassa and J.E. Brandle II BMC Biology. 2009. - V.7. - P.48.

44. Conley, A. J. Protein body-inducing fusions for high-level production and purification of recombinant proteins in plants/ A. J. Conley, .T. J. Joensuu, A Richman and R. Menassa // Plant Biotechnology Journal. 2011. - V.9. -P.419-433.

45. Conley, A.J. Optimization of elastin-like polypeptide fusions for expression and purification of recombinant proteins in plants/ A.J. Conley, J.J. Joensuu, A.M. Jevnikar, R. Menassa, J.E. Brandle // Biotechnol Bioeng. 2009. -V.103. - P.562-573.

46. Coutu, C. pORE: a modular binary vector series suited for both monocot and dicot plant transformation/ C. Coutu, J. Brandle, D. Brown, K. Brown, B. Miki, J. Simmonds, D.D. Hegedus // Transgenic Res. 2007. - V.16. - №6. -P.771-781.

47. Curtis, W.: US20046740526 (2004).

48. D'Aoust, M.-A. The production of hemagglutinin-based virus-like particles in plants: a rapid, efficient and safe response to pandemic influenza / M.-A.

49. D'Aoust, M.M.-J. Couture, N. Charland, S. Tre' panier, N. Landry, F. Ors, and L.-P. Ve' zina // Plant Biotechnol. 2010. - V. 8. - P.607-609.

50. Dafny-Yelin M. The ongoing saga of Agrobacterium-host interactions/ M. Dafny-Yelin, A. Levy, T. Tzfira // Trends Plant Sci 2008. - V.13 - P.102-105.

51. Daniell, H. Medical molecular farming: production of antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants/ Daniell, H., Streatfeld, S.J., and Wycoff, K.// Trends Plant Sci. 2001. - V.6. - №5. - P.219-226.

52. De Amicis, F. Improvement of the pBI121 plant expression vector by leader replacement with a sequence combining a poly(CAA) and a CT motif / F.De Amicis, T. Patti, S. Marchetti // Transgenic Res. 2007. - V.16. - №6. -P.731-738.

53. Doran, P.M. Foreign protein degradation and instability in plants and plant tissue cultures/ P.M. Doran // Trends Biotechnol,- 2006,- V.24.- P.426-432.

54. Dorokhov Y., Skurat, E., Klimyuk, V., Gleba, Y.: W003020938A2 (2003).

55. Earley K.W. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. / Earley K.W., Haag J.R., Pontes O. // Plant J. 2006. - V.45.-№4,- P.616-629.

56. Enfors, S.O. Control of in vivo proteolysis in the production of recombinant proteins/ S.O. Enfors// Trends Biotechnol.- 1992,- V.10.-P.310-315.

57. Erwin, R.L., Grill, L.K., Pogue, G.P., Turpen, T.H., Kumagai, M.H.: US6846968 (2005).

58. Esposito, D. Enhancement of soluble protein expression through the use of fusion tags/ D. Esposito, D.K. Chatterjee // Curr. Opin. Biotechnol. 2006. -V.17. - P.353-358.

59. Evangelista, R.L. Process and economic evaluation of the extraction and purification of recombinant beta-glucuronidase from transgenic corn / R.L. Evangelista, A.R. Kusnadi, J.A. Howard and Z.L. Nikolov // Biotechnol. Prog. 1998.-V. 14. - P.607-614.

60. Fischer, R. Plant-based production of biopharmaceuticals / R. Fischer, E. Stoger, S. Schillberg, P. Christou and R.M. Twyman // Curr. Opin. Plant Biol. -2004. -V. 7. P. 152-158.

61. Furtado, A. Analysis of promoters in transgenic barley and wheat /A. Furtado, R. J. Henry, A. Pellegrineschi// Plant Biotechnology Journal 2009. - V.7. -P.240-253.

62. Garbarino, J.E. Isolation of a polyubiquitin promoter and its expression in transgenic potato plants/ J.E Garbarino, T. Oosumi and W.R. Belknap // Plant Physiol. 1995,- V.109.-P.1371-1378.

63. Garger, S.J., Turpén, T.H., Kumagai, M.H.: US20056887696 (2005).

64. Garger, S.J., Turpén, T.H., Kumagai, M.H.: US20056890748 (2005).

65. Geli, M.I. Two structural domains mediate two sequential events in Gamma.-zein targeting: protein endoplasmic reticulum retention and protein body formation/ M.I. Geli, M. Torrent and D. Ludevid // Plant Cell. 1994. - V.6. -P.1911-1922.

66. Giddings, G. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals / G. Giddings, G. Allison, D. Brooks and A. Carter // Nat. Biotechnol. 2000. - V. 18. -P.1151-1156.

67. Gil, F. High-yield expression of a viral peptide vaccine in transgenic plants/ F. Gil, , A. Brun, A. Wigdorovitz, R. Catala, J.L. Martinez-Torrecuadrada, I.

68. Casai, J. Salinas, M.V. Borca and J.M. Escribano // FEBS Lett. 2001. -V.488. - P.13-17.

69. Gieba Y. Magnifection-a new platform for expressing recombinant vaccines in plants/ Y. Gieba, V. Klimyuk, S. Marillonnet // Vaccine. 2005. - V.23. -P.2042-2048.

70. Gieba Y. Viral vectors for the expression of proteins in plants/ Y. Gieba, V. Klimyuk, S. Marillonnet // Curr Opin Biotechnol. 2007. - V.18. - P. 134-141.

71. Gieba, Y. Magnifection a new platform for expressing recombinant vaccines in plants / Y. Gieba, V. Klimyuk, S. Marillonnet // Vaccine 2005. - V. 23. -P.2042-2048.

72. Gomez, N. Expression of immunogenic glycoprotein S polypeptides from transmissible gastroenteritis Coronavirus in transgenic plants/ N. Gomez, C. Carrillo, J. Salinas, F. Parra, M.V. Borca and J.M. Escribano // Virology -1998. V.249. - P.352-358.

73. Graciet E. Structure and evolutionary conservation of the plant N-end rule pathway / E. Graciet, F. Mesiti and F. Wellmer. // The Plant J. 2010. - V. 61.-P. 741-751

74. Hakanpa J. Atomic resolution structure of the hfbii hydrophobin, a self-assembling amphiphile/ J. Hakanpa A. Paananen, S. Askolin, T. Nakari-Seta, T. Parkkinen, M. Penttila ", M.B. Linder, and J. Rouvinen // J. Biol. Chem. -2004. V.279. - P.534-539.

75. Hanna, J. A proteasome for all occasions / J. Hanna and D. Finley // FEBS Lett. -2007. -V. 581. P. 2854-2861.

76. Hanton, S.L., Matheson, L.A., Chatre, L., Rossi, M., Brandizzi, F. Post-Golgi protein traffic in the plant secretory system / S.L. Hanton, L.A. Matheson, L. Chatre, M. Rossi, F. Brandizzi // Plant Cell Reports 2007. - V.26. - P. 14311438.

77. Hefferon, K.L. Biopharmaceuticals in plants toward the next century of medicine/ K.L. Hefferon// CRC Press. 2010. - P.435.

78. Hellens, R. A guide to Agrobacterium binary Ti vectors/ R. Hellens, P. Mullineaux and H. Klee // Trends Plant Sci. 2000. - V.5. - P.446-451.

79. Hel!wig S. Plant cell cultures for the production of recombinant proteins/ S. Hellwig, J. Drossard, R.M. Twyman, R. Fischer // Nat. Biotechnol. 2004. -V.22. - P.1415-1422.

80. Herman, E.M. Protein storage bodies and vacuoles/ E.M. Herman and B.A. Larkins // Plant Cell. 1999. - V.l 1. - P.601-614.

81. Hernandez-Garcia. Isolation and transient expression of GmERF promoters BMC/ Hernandez-Garcia et al.// Plant Biol. 2010. - P.237.

82. Hershko, A. BasicMedical Research Award. The ubiquitin system / A. Hershko, A. Ciechanover and A. Varshavsky // Nat. Med. 2000. - V. 6. - P. 1073-1081.

83. Hiatt, A. Production of antibodies in transgenic plants / A. Hiatt, R. Cafferkey and

84. K. Bowdish // Nature 1989. - V. 342. - P.76-78.

85. Hondred, D. Use of ubiquitin fusions to augment protein expression in transgenic plants/ D. Hondred, J.M. Walker, D.E. Mathews and R.D. Vierstra // Plant Physiol. 1999. - V.l 19. - P.713-724.

86. Hood, E.E. Commercial production of avidin from transgenic maize: characterization of transformant, production, processing, extraction and purification / E.E. Hood, D.R. Witcher, S. Maddock et al. // Molecular Breeding 1997. - V.3. - P.291-306.

87. Hood, E.E. Molecular fanning of industrial proteins from transgenic maize / E.E. Hood, A. Kusnadi, Z. Nikolov and J.A. Howard // Adv. Exp. Med. Biol. -1999.-V. 464.-P.127-147.95. http://www.cambia.Org/daisy/cambia/585#dsy585pCAMBIA5105

88. Hu, R.G. The N-end rule pathway as a nitric oxide sensor controlling the levels of multiple regulators / R.G. Hu, J. Sheng, X. Qi, Z. Xu, T.T. Takahashi and A. Varshavsky // Nature. 2005. - V. 437. - P. 981-986.

89. Huang, N. Bioactive recombinant human lactoferrin. derived from rice / N. Huang,D. Bethell, C. Card, J. Cornish, T. Marchbank, D. Wyatt, K. Mabery and R. Playford // In Vitro Cell. Dev. Biol. 2008. - V. 44. -P.464-471.

90. Hur, J. Identification of a promoter motif involved in Curtovirus sense-gene expression in transgenic Arabidopsis/ J. Hur, E. Choi, K.J. Buckley, S. Lee, K.R. Davis// Mol. Cells 2008. - V.26. - №2. - P. 131-139.

91. Inaba, T. Protein trafficking to plastids: one theme, many variations/ T. Inaba, D.J. Schnell // Biochemistry Journal 2008. - V.413. - P.15-28.

92. Jiang, C. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics/ C. Jiang and B.F. Pugh // Nat. Rev. Genet. 2009. - V.10. - P.161-172.

93. Joensuu, J.J. Hydrophobin fusions for high-level transient protein expression and purification in Nicotiana benthamiana/ J.J. Joensuu, A.J.

94. Conley, M. Lienemann, J.E. Brandle, M.B. Linder and R. Menassa // Plant Physiol. 2010. - V.152. - P.622-633.

95. Joensuu, J.J. Transgenic plants for animal health: plant-made vaccine antigens for animal infectious disease control /J.J. Joensuu, V. Niklander-Teeri and J.E. Brandle // Phytochem. Rev. 2008. - V.7. - P.553-577.

96. Juven-Gershon, T. The RNA polymerase II core promoter the gateway to transcription/ T. Juven-Gershon et al. // Curr. Opin. Cell Biol.- 2008.- V. 20.-P.253-259.

97. Karimi M., A GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation / Karimi M., Inze D., Depicker A. // Trends Plant Sci. 2002. -V. 7. - P. 193-195.

98. Kim, H. Gene-specific RNA polymerase II phosphorylation and the CTD code/ H. Kim et al. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2010. - V.17. - P.1279-1286.

99. Kim, T.G. Synthesis and assembly of a cholera toxin B Subunit SHIV 89.6p Tat fusion protein in transgenic potato/ T.G. Kim, R. Ruprecht and W.H.R. Langridge // Protein Expr. Purif. 2004. - V.35. - P.313-319.

100. Kogan, M.J. Self-assembly of the amphipathic helix (VHLPPP) 8. A mechanism for zein protein body formation/ M.J. Kogan, I. Dalcol, P. Gorostiza, C. Lopez-Iglesias, M. Pons, F. Sanz, D. Ludevid and E. Giralt // J. Mol. Biol. 2001. - V.312. - P.907-913.

101. Kogan, M.J. Supramolecular properties of the proline-rich gamma-zein n-terminal domain/ M.J. Kogan, I. Dalcol, P. Gorostiza, C. Lopez-Iglesias, R. Pons, M. Pons, F. Sanz and E. Giralt // Biophys. J. 2002. - V.83. - P.l 194— 1204.

102. Kohl,T.O. Expression of HPV-11L1 protein in transgenic Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum / T.O. Kohl, I.I. Hitzeroth, N.D. Christensen and E.P. Rybicki // BMC. Biotechnol. 2007. - V.7. - P.56.

103. Koya, V. Plant based vaccine: mice immunized with chloroplast-derive anthrax protective antigen survive anthrax lethal toxin challenge/ V. Koya, M. Moayeri, S.H. Leppla and H. Daniell // Infect.Immun. 2005. - V.73. -P.8266-8274.

104. Kozak M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes / M. Kozak // Cell. -1986.-V. 44.-P. 283-292.

105. Kusnadi, A.R. Production and purification of two recombinant proteins from transgenic corn / A.R. Kusnadi, E.E Hood, D.R. Witcher, J.A. Howard and Z.L. Nikolov // Biotechnol. Prog. 1998. - V. 14. - P.149-155.

106. Kwak, M.S. A strong constitutive gene expression system derived from ibAGPl promoter and its transit peptide/ M.S. Kwak, M.J. Oh, S.W. Lee, J.S. Shin, K.H. Paek, J.M. Bae // Plant Cell Rep. 2007. - V.26. - №8. - P. 12531262.

107. Kwon, Y.T. An essential role of N-terminal arginylation in cardiovascular development / Y.T. Kwon, A.S. Kashina, I.V. Davydov, R.G. Hu, J.Y. An, J.W. Seo, F. Du and A. Varshavsky // Science. 2002. - V. 297. - P. 96-99.

108. Lacroix, B. A case of promiscuity: Agrobacterium's endless hunt for new partners / B. Lacroix, T. Tzfira, A. Vainstein,V. Citovsky // Trends Genet -2006. V. 22. - P.29-37.

109. Lacroix, B. Agrobacterium gets its T-DNA expressed in the host plant cell / B. Lacroix, J. Li, T. Tzfira, V. Citovsky // Physiol Pharmacol. 2006. - V. 84. -P.333-345.

110. Lacroix, B. Will you let me use your nucleus? How Agrobacterium gets its T-DNA expressed in the host plant cell / B. Lacroix, J. Li, T. Tzfira, V. Citovsky // Can. J. Physiol. Pharmacol. 2006. - V.84. - P.333-345.

111. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature 1970. - V.227. - №259. - P.680-685.

112. Lahtinen, T. Hydrophobin (HFBI): a potential fusion partner for one-step purification of recombinant proteins from insect cells/ T. Lahtinen, M.B.1.nder, T. Nakari-Seta " la " and C. Oker-Blom // Protein Expr. Purif. 2008.- V.5. P. 18-24.

113. Larkins, B.A. Synthesis and processing of maize storage proteins in Xenopus laevis oocytes/ B.A. Larkins, K. Pedersen, A.K. Handa, W.J. Hurkman and L.D. Smith // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V.76. -P.6448-6452.

114. Larrick, J.W. Producing proteins in transgenic plants and animals/ J.W. Larrick and D.W. Thomas // Curr. Opin. Biotechnol. 2003. - V.12. - P.411-418.

115. Lee L-Y. T-DNA Binary Vectors and Systems / L-Y. Lee and S.B. Gelvin // Plant Physiology 2008 - V. 146 - P.325-332

116. Lee, M.J. RGS4 and RGS5 are in vivo substrates of the N-end rule pathway / M.J. Lee, T. Tasaki, K. Moroi, J.Y. An, S. Kimura, I.V. Davydov and Y.T. Kwon II Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102. - P. 15030-15035.

117. Li, B. The role of chromatin during transcription/ B. Li et al. // Cell- 2007.- V.128.-P.707-719.

118. Li, J. Uncoupling of the functions of the Arabidopsis VIP1 protein in transient and stable plant genetic transformation by Agrobacterium / J. Li, A. Krichevsky, M. Vaidya, T. Tzfira, V. Citovsky // Proc Natl Acad Sci USA -2005,-V. 102 P.5733-5738.

119. Liang, J. Cloning and characterization of the promoter of the 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase gene in Arachis hypogaea L / J. Liang, L. Yang, X. Chen, L. Li, D. Guo, H. Li, B. Zhang // Biosci Biotechnol Biochem. -2009.-V.73. -№9.-P.2103-2106.

120. Lichty, J.J. Comparison of affinity tags for protein purification/ J.J. Lichty, J.L. Malecki, H.D. Agnew, D.J. Michelson-Horowitz and S. Tan // Protein Expr. Purif. 2005. - V.41. - P.98-105.

121. Lickwar, C.R. The Set2/Rpd3S pathway suppresses cryptic transcription without regard to gene length or transcription frequency/ C.R. Lickwar et al. // PLoS ONE 2009. - V.4. - e4886.

122. Lin L. Efficient linking and transfer of multiple genes by a multigene assembly and transformation vector system / Lin L, Liu YG, Xu X, Li B // Proc Natl Acad Sci USA 2003 - V. 100 - P. 5962-5967.

123. Lin, H.H. Effects of the multiple polyadenylation signal AAUAAA on mRNA 3'-end formation and gene expression/ H.H Lin, L.F. Huang, H.C. Su, S.T.Jeng// Planta 2009. - V.230. - №4. - P.699-712.

124. Linder, M. Surface adhesion of fusion proteins containing the hydrophobins HFBI and HFBII from Trichoderma reesei/ M. Linder, G.R. Szilvay, T. Nakri-Seta " la " , H. Soderlund and M. Penttila " // Protein Sci. 2002. - V.l 1. -P.2257-2266.

125. Linder, M.B. Hydrophobins: the protein-amphiphiles of filamentous fungi/ M.B. Linder, G.R. Szilvay, T. Nakari-Seta and M.E. Penttila 7/ FEMS Microbiol. Rev. 2005. - V.29. - P.877-896.

126. Liu, D. Design of gene constructs for transgenic maize / D. Liu // Methods Mol Biol. 2009. - V.526. - P.3-20.

127. Liu, Z. Creation and analysis of a novel chimeric promoter for the complete containment of pollen- and seed-mediated gene flow/ Z. Liu, C. Zhou, K. Wu // Plant Cell Rep. 2008. - V.27. - №6. - P.995-1004.

128. Llop-Tous, I. Relevant elements of a maize gamma-zein domain involved in protein body biogenesis/ I. Llop-Tous, S. Madurga, E. Giralt, P. Marzabal, M. Torrent and M.D. Ludevid // J. Biol. Chem. 2010. - V.285. - P.35633-35644.

129. Lorence, A. Gene transfer and expression in plants / A. Lorence, R. Verpoorte // Methods Mol Biol. 2004. - V. 267. - P.329-350.

130. Lu, J. Activity of the 5' regulatory regions of the rice polyubiquitin rubi3 gene in transgenic rice plants as analyzed by both GUS and GFP reporter genes/ .J. Lu3 E. Sivamani, X. Li, R. Qu // Plant Cell Rep. 2008. - V.27. -№10.-P. 1587-600.

131. M. Bevan. Binary Agrobactenum vectors for plant transfomation / M. Bevan // Nucleic Acids Research 1984 - V.12.

132. Ma L., RMDAP: A versatile, ready-to-use toolbox for multigene genetic transformation / L. Ma, J. Dong, Y. Jin, M. Chen, X. Shen, T. Wang. // PLoS ONE 2011 -V. 6-P.19883.

133. Ma, J.K. Antibody processing and engineering in plants, and new strategies for vaccine production / J.K. Ma, P.M. Drake, D. Chargelegue, P. Obregon and A. Prada // Vaccine 2005. - V. 23. - P. 1814-1818.

134. Ma, J.K. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants/ J.K. Ma, P.M. Drake, and P. Christou// Nat. Rev. Genet.- 2003,- V. 4,- P.794-805.

135. MacRae, A.F. Expression of His-tagged Shigella IpaC in Arabidopsis/ A.F. MacRae, J. Preiszner, S. Ng and R.I. Bolla // J. Biotechnol. 2004. - V.l 12. -P.247-253.

136. Margaritis, T. Poised RNA polymerase II gives pause for thought / T. Margaritis and F.C. Holstege // Cell 2008. - V.133. - P.581-584.

137. Marillonnet S., Engler, C., Muhlbauer, S., Herz, S., Werner, S., Klimyuk, V., Gleba, Y.: W006003018A2 (2006).

138. Martinez-Alonso, M. Learning about protein solubility from bacterial inclusion bodies / M. Martinez-Alonso, N. Gonzalez-Montalban, E. Garcia-Fruitos, A. Villaverde // Microb. Cell Fact. 2009. - V. 8. - P.4.

139. Mason, H.S. Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants / H.S. Mason, D.M. Lam and C.J. Arntzen // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1992. -V. 89. -P.l 1745-11749.

140. Mason, H. Virus-like particles production in green plants / H. Mason, L. Santi, Z. Huang // Methods 2006. - V.40. - №1. - P.66-76.

141. Mayer, A. Uniform transitions of the general RNA polymerase II transcription complex/ A. Mayer et al. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2010. - V.l7. - P.1272-1278.

142. McCormick, A.A, Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants / A.A, McCormick, M.H. Kumagai, K. Hanley, et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. - V. 96. - P.703-708.

143. Menassa, R. A self-contained system for the field production of plant recombinant interleukin-10/ R. Menassa, V. Nguyen, A. Jevnikar and J. Brandle // Mol. Breed.- 2001.-V. 8.- P.177-185.

144. Menkhaus, T.J. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants/ T.J. Menkhaus, Y. Bai, C. Zhang, Z.L. Nikolov and C.E. Glatz// Biotechnol Prog. 2004. - V.20. - №4 - P. 1001-1014.

145. Meyer, D.E. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides/ D.E. Meyer, A. Chilkoti // Nat. Biotechnol. 1999. -V.17. -P.1112-1115.

146. Meza, T. J. A human CpG island randomly inserted into a plant genome is protected from methylation / T. J. Meza, E. Enerly, B. Boru, F. Larsen, A. Mandal, R. B. Aalen and K. S. Jakobsen // Transgenic Res.- 2002. V.ll. -P.133-142.

147. Miki B. Selectable marker genes in transgenic plants: applications, alternatives and biosafety / Miki B., McHugh S. // J. Biotechnol. 2004. -V.107. - P.193-232.

148. Mishra, S. Ubiquitin fusion enhances cholera toxin B subunit expression in transgenic plants and the plant-expressed protein binds gml receptors more efficiently/ S. Mishra, D.K. Yadav and R. Tuli // J. Biotechnol. 2006. -V.127. -P.95-108.

149. Molina, A. High-yield expression of a viral peptide animal vaccine in transgenic tobacco chloroplasts/ A. Molina, S. Hervas-Stubbs, H. Daniell, A.M. Mingo-Castel and J. Veramendi // Plant Biotechnol. J. 2004. - V.2. -P.141-153.

150. Moloney, M., Boothe, J. and Van Rooijen, G. (2008) Oil bodies and associated proteins as affinity matrices. US7332587. US Patent.

151. Moon, J. The ubiquitin-proteasome pathway and plant development / J. Moon, G. Parry and M. Estelle // M. Plant Cell. 2004. - V. 16. P. 3181-3195.

152. Nallamsetty, S. A generic protocol for the expression and purification of recombinant proteins in Escherichia coli using a combinatorial His6-maltose binding protein fusion tag/ S. Nallamsetty, D.S. Waugh // Nat. Protoc. 2007. - V.2. -P.383-391.

153. Nandi, D. The ubiquitin-proteasome system / Nandi D., Tahiliani P., Kumar A. and Chandu D. // J. Biosci. 2006. - V.5. P. 137-155.

154. Narasimhulu SB. Early transcription of Agrobacterium T-DNA genes in tobacco and maize / S.B. Narasimhulu, X.B. Deng, R. Sarria, S.B. Gelvin. // Plant Cell 1996. - V.8. - P.873-886.

155. Obregon, P. HIV-1 p24-iminunoglobulin fusion molecule: a new strategy for plant-based protein production/ P.Obregon, D. Chargelegue, P.M. Drake, A. Prada, J. Nuttall, L. Frigerio and J.K. Ma // Plant Biotechnol. J. 2006. -V.4.- P. 195-207.

156. Oguro, T. Structural stabilities of different regions of the titin 127 domain contribute differently to unfolding upon mitochondrial protein import/ T. Oguro, K. Yagawa, T. Momose, T. Sato, K. Yamano, T. Endo // J. Mol. Biol. -2009.-V.385.-P.811-819.

157. Paananen, A. Structural hierarchy in molecular films of two class II hydrophobins/ A. Paananen, E. Vuorimaa, M. Torkkeli, M. Penttila " , M. Kauranen, O. Ikkala, H. Lemmetyinen, R. Serimaa and M.B. Linder // Biochemistry. 2003. - V.42. - P.5253-5258.

158. Parmenter, D.L. Production of biologically active hirudin in plant seeds using oleosin partitioning/ D.L. Parmenter, J.G. Boothe, G.J. van Rooijen, E.C. Yeung and M.M. Moloney // Plant Mol. Biol. 1995. - V.29. - P. 1167-1180.

159. Patel, J. Elastin-like polypeptide fusions enhance the accumulation of recombinant proteins in tobacco leaves/ J. Patel, H. Zhu, R. Menassa, L. Gyenis, A. Richman, J. Brandle // Transgenic P.es. — 2007. — V.16. — P.239-249.

160. Paul, J. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants/ J. Paul // New Phytologist 2008. - V.179. - P.257-285.

161. Peitsch, Protein modelling by E-Mail / M.C. Peitsch // Bio/Technology. -1995,--P. 658-660.

162. Pelechano, V. A complete set of nascent transcription rates for yeast genes/ V. Pelechano et al. // PLoS ONE. 2010. - V.5, el5442.

163. Pompa, A. Retention of a bean phaseolin/maize gamma-zein fusion in the endoplasmic reticulum depends on disulfide bond formation/ A. Pompa and A. Vitale // Plant Cell. 2006. - V.18. - P.2608-2621.

164. Ramon, N. M. Interdependence of the peroxisome-targeting receptors in Arabidopsis thaliana: PEX7 facilitates PEX5 accumulation and import of PTS1 cargo into peroxisomes/ N. M. Ramon, B. Bartel // Mol. Biol. Cell 2010. -V21. - P.1263-1271.

165. Rando, O.J. Genome-wide views of chromatin structure/ O.J. Rando and H.Y. Chang // Annu. Rev. Biochem. 2009,- V.78.- P.245-271.

166. Rice, J. Plant-made vaccines: biotechnology and immunology in animal health / J. Rice, W.M. Ainsley and P. Showen // Anim. Health Res. Rev. -2005.-V. 6.-P. 199-209.

167. Rigano, M.M. Expression systems and developments of plant-made vaccines / M.M. Rigano, A.M. Walmsley // Immunol. Cell Biol. 2005. - V. 83. - P.271-277.

168. Rigano, M.M. Oral immunogenicity of a plant-made subunit tuberculosis vaccine / M.M. Rigano, S. Dreitz, A.P. Kipnis, A.A. Izzo and A.M. Walmsley // Vaccine. 2006. - V.24. - P.691-695.

169. Rodenburg, K.W. Single-stranded DNA used as an efficient new vehicle for transformation of plant protoplasts / K.W. Rodenburg, M.J. de Groot, R.A. Schilperoort, P.J. Hooykaas // Plant Mol. Biol. 1989. - V.13. - P.711-719.

170. Rojo, E. What is moving in the secretory pathway of plants? / E. Rojo, J. Denecke // Plant Physiology 2008. - V147. - P. 1493-1503.

171. Rubio, V. An alternative tandem affinity purification strategy applied to arabidopsis protein complex isolation/ V. Rubio, Y. Shen, Y. Saijo, Y. Liu, G.

172. Gusmaroli, S.P. Dinesh-Kumar and X.W. Deng // Plant J. 2005. - V.41. -P.767-778.

173. Ruiz-Medrano, R. Vascular expression in Arabidopsis is predicted by the frequency of CT/GA-rich repeats in gene promoters/ R. Ruiz-Medrano, B. Xoconostle-Ca'zares, Byung-Kook Ham, G. Li, and W.J. Lucas // The Plant Journal. 2011. - V.67. - P. 130-144.

174. Rybicki, E.P. Plant-produced vaccines :promise and reality / E.P. Rybicki // Drug Discov.Today 2009a. - V.14. - P. 16-24.

175. Sahdev, S. Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies / S. Sahdev, S.K. Khattar, K.S. Saini // Mol. Cell. Biochem. 2008. - V. 307. -P.249-264.

176. Saier, M.H.J. Protein secretion and membrane insertion systems in gramnegative bacteria/ M.H.J. Saier // Journal of Membrane Biology 2006. -V.214. - P.75-90.

177. Sainsbury, F. pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants/ F. Sainsbury, E.C. Thuenemann, G.P. Lomonossoff // Plant Biotechnol J. 2009. - V.7. - №7. -P.682-693.

178. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, F.F. Fritsch, T. Maniatis // N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1989.

179. Sandelin, A. Mammalian RNA polymerase II core promoters: insights from genome-wide studies / A. Sandelin et al. // Nat. Rev. Genet.- 2007.- V.8.-P.424-436.

180. Scheller, J. Forcing single-chain variable fragment production in tobacco seeds by fusion to elastin-like polypeptides/ J. Scheller, M. Leps, U. Conrad // Plant Biotechnol. J. 2006. - V.4. - P.243-249.

181. Scheller, J. Purification of spider silk-elastin from transgenic plants and application for human chondrocyte proliferation/ J. Scheller, D. Henggeler, A. Viviani, U. Conrad // Transgenic Res. 2004. - V.13. - P.51-57.

182. Schillberg, S., Twyman, R.M., Fischer, R.// Vaccine. 2003. - V.23. -P. 1764-1769.

183. Seila, A.C. Divergent transcription: a new feature of active promoters/ A.C. Seila et al. // Cell Cycle 2009. - V.8. - P.2557-2564.

184. Seki, M. Transient expression of the beta- glucuronidase gene in tissues of Arabidopsis thaliana by bombardment-mediated trans formation/ M. Seki, A. Iida, H. Morikawa // Mol. Biotechnol. 1999. - V.l 1. - P.251-255.

185. Sheludko, Y.V. Agrobacterium-Mediated Transient Expression as an Approach to Production of Recombinant Proteins in Plants / Y.V. Sheludko // Recent Patents on Biotechnology 2008. - V.2.

186. Skerra, A. Use of the strep-tag and streptavidin for detection and purification of recombinant proteins/ A. Skerra and T.G.M. Schmidt // Methods Enzymol. 2000. - V.326. - P.271-304.

187. Sorensen, H.P. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli/ H.P. Sorensen, K.K. Mortensen // J. Biotechnol.- 2005. V.l 15. - P. 113-128.

188. Sparrow, P.A. Pharma-Planta: road testing the developing regulatory guidelines for plantmade pharmaceuticals / P.A. Sparrow, J.A. Irwin, P.I. Dale, R.M. Twyman and J.K. Ma // Transgenic Res. 2007. - V. 16. - P.147-161.

189. Streatfield, S.J. Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants/S.J. Streatfield // Plant Biotechnol. J. 2007. - V.5. - P.2-15.

190. Streatfield, S.J. Corn as a production system for human and animal vaccines/ S.J. Streatfield, J.R. Lane, C.A. Brooks et al. // Vaccine 2003. -V.21. - P.812-815.

191. Tasaki, T. The mammalian N-end rule pathway: new insights into its components and physiological roles / T. Tasaki and Y.T. Kwon // Trends Biochem. Sci. 2007. - V. 32. - P. 520-528.

192. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems/ K. Terpe // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2003. V.60. - P.523-533.

193. Thangaraj, H. Dynamics of global disclosure through patent and journal publications for biopharmaceutical products / H. Thangaraj, C.J van Dolleweerd, E.G. McGowan and J.K Ma // Nat. Biotechnol. 2009. - V. 27. -P.614-618.

194. Tinland, B. Agrobacterium tumefaciens transfers single-stranded transferred DNA (T-DNA) into the plant cell nucleus / B. Tinland, B. Hohn, H. Puchta. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V.91. - P.8000-8004.

195. Tirosh, I. Two strategies for gene regulation by promoter nucleosomes/ I. Tirosh and N. Barkai // Genome Res. 2008 18, 1084-1091

196. To, K.Y. Introduction and expression of foreign DNA in isolated spinach chloroplasts by electroporation / K.Y. To, M.C Cheng, L.F Chen, S.C Chen // Plant J. 1996. - V. 10. - P.737-743.

197. Torrent, M. Protein body induction: a new tool to produce and recover recombinant proteins in plants/ M. Torrent, I. Llop-Tous and M.D. Ludevid // Methods Mol. Biol. 2009. - V.483. - P. 193-208.

198. Trupkin, S.A. The serine-rich N-terminal region of Arabidopsis phytochrome A is required for protein stability/ S.A. Trupkin, D. Debrieux, A. Hiltbrunner, C. Fankhauser, J.J. Casal // Plant Mol Biol. 2007. - V.63. - №5. - P.669-678.

199. Twyman, R.M. Molecular fanning in plants: host systems and expression technology / R.M. Twyman, E. Stoger, S. Schillberg, P. Christou and R. Fischer // Trends Biotechnol. 2003. - V. 21. - P.570-579.

200. Tzfira, T. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology / T. Tzfira,V. Citovsky // Curr Opin Biotechnol. -2006.V. 17. P.147-154.

201. Tzfira, T. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium / T. Tzfira, M. Vaidya, V. Citovsky // Nature 2004. - V. 431 - P.87-92.

202. Urry, D.W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers/ D.W. Urry // J. Phys. Chem. B. 1997. - V. 101. - P. 11007-11028.

203. Urry, D.W. Entropic elastic processes in protein mechanisms. I. Elastic structure due to an inverse temperature transition and elasticity due to internal chain dynamics/ D.W. Urry // J. Protein Chem. 1988. - V.7. - P. 1-34.

204. Varshavsky, A. The early history of the ubiquitin field / A. Varshavsky // Protein Sci. 2006. - V. 15. - P. 647-654.

205. Varshavsky, A. The N-end rule: functions, mysteries, uses / A. Varshavsky // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - P. 12142-12149.

206. Venters, B.J. and Pugh, B.F. How eukaryotic genes are transcribed / B.J. Venters and B.F. Pugh // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.- 2009,- V.44.-P.117-141.

207. Vergunst, A.C. VirB/D4-dependent protein translocation from Agrobacterium into plant cells /A.C. Vergunst,B. Schrammeijer, A. den Dulk-Ras, C.M. de Vlaam, T.J. Regensburg-Tuink, P.J. Hooykaas // Science 2000 -V. 290. - P.979-982.

208. Vierstra, R.D. The ubiquitin-26S proteasome system at the nexus plant biology / R.D. Vierstra // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009. - V. 10. - P. 385397.

209. Wagner, B. Plant virus expression systems for transient production of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana / B. Wagner, H. Fuchs, F. Adhami, Y. Ma, O. Scheiner, H. Breiteneder // Methods 2004. - V. 32. -P.227-234.

210. Walker, J.M. A ubiquitin-based vector for the co-ordinated synthesis of multiple proteins in plants/ J.M. Walker, R.D. Vierstra // Plant Biotechnol J. -2007. V.5. - №3. - P.413-421.

211. Wally, O. Comparative expression of beta-glucuronidase with five different promoters in transgenic carrot (Daucus carota L.) root and leaf tissues/ O. Wally, J. Jayaraj, Z.K. Punja // Plant Cell Rep. 2008. - V.27 - №2. - P.279-87.

212. Wang, H. Glutamine- specific N-terminal amidase, a component of the N-end rule pathway / H. Wang, K.I. Piatkov, C.S. Brower and A. Varshavsky // Mol. Cell. 2009. - V. 34. - P. 686-695.

213. Wang, X. The SC3 hydrophobin self-assembles into a membrane with distinct mass transfer properties/ X. Wang, F. Shi, H.A. Wosten, H. Hektor, B. Poolman and G.T. Robillard // Biophys. J. 2005. - V.88. - P.3434-3443.

214. Watson, J. Expression of Bacillus anthracis protective antigen in transgenic chloroplasts of tobacco, a non-food/feed crop/ J. Watson, V. Koya, S.H. Leppla, H. Daniell // Vaccine 2004. - V.22. - № 31-32. - p.4374-4384.

215. Waugh, D.S. Making the most of affinity tags/ D.S. Waugh // Trends Biotechnol. 2005. - V.23. - P.316-320.

216. Wessels, J.G.H. Hydrophobins: proteins that change the nature of the fungal surface/ J.G.H. Wessels // Adv. Microb. Physiol. 1997. - V.38. - P. 1-45.

217. Wever, W. The 5' untranslated region of the VR-ACS1 mRNA acts as a strong translational enhancer in plants/ W. Wever, E.J. McCallum, D. Chakravorty, C.I. Cazzonelli, J.R. Botella // Transgenic Res. 2009.

218. Willmitzer, L. Transcription of T-DNA in octopine and nopaline crown gall tumours is inhibited by low concentrations of alpha-amanitin / L. Willmitzer, W. Schmalenbach, J. Schell // Nucleic Acids Res 1981. - V. 9 - P.4801-4812.

219. Witcher, D.R. Commercial production of beta-glucuronidase (gus): a method system for the production of proteins in plants/ D.R. Witcher, E.E. Hood, D. Peterson et al. // Molecular Breeding 1998. - v.4. - P.301-312.

220. Wo " sten, H.A.B. Hydrophobins, the fungal coat unraveled/ H.A.B. Wo " sten and M.L. de Vocht // Biochim. Biophys. Acta 2000. - V.1469. - P.79-86.

221. Wu, H. Immunization of chicken swith VP2 protein of infectious bursal disease virus expressed in Arabidopsis thaliana / H. Wu, N.K. Singh, R.D.1.cy, K. Scissum-Gunn and J.J. Giambrone // Avian Dis. 2004. - V.48. -P.663-668.

222. Yang, L. The 3'-untranslated region of rice glutelin GluB-1 affects accumulation of heterologous protein in transgenic rice / L. Yang, Y. Wakasa, T. Kawakatsu, F. Takaiwa // Biotechnol Lett. 2009. - V.31. - №10. - P. 16251631.

223. Yusibov, V.M. Association of single-stranded transferred DNA from Agrobacterium tumefaciens with tobacco cells / V.M. Yusibov, T.R. Steck, V. Gupta, S.B. Gelvin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994. - V.91. - P.2994-2998.

224. Zhao, J. Nutraceuticals, nutritional therapy, phytonutrients, and phytotherapy for improvement of human health: a perspective on plant biotechnology application / J. Zhao // Recent Patents on Biotechnology 2007. - V.l. - P.75-97.

225. Zhong, S. Improved plant transformation vectors for fluorescent protein tagging/ S. Zhong, Z. Lin, R.G. Fray, D. Grierson // Transgenic Res. 2008. -V.l7. - №5. - P.985-989.

Информация о работе

Вячеславова, Алиса Олеговна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии гетерологичных генов, кодирующих рекомбинантные белки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы