Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное исследование субстратно-ингибиторной специфичности глутатионтрансфераз

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование субстратно-ингибиторной специфичности глутатионтрансфераз"

АКАДЕМИЯ НАУК СОЮЗА ССР ШСШЕУТ. ЗВОЛЩИОННОЙ ФЙЭЖШЗГИИ И ЕИОХИЛЖ им. IUI .СЕЧЕНОВА

На правах рукописи Ш 577.152.2

СТУЖВДИЙ Андрей Владиславович

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЩ^ТРАТШ-^ШГШГГОШОЙ СШЩИШЧНОСТИ ГЛУТАТИОНТРАНСФЕРАЗ-

03.00.04 - биохимия

t

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соксканиэ ученой степени кандидата биологических наук

Ленинград - 1991

Работа выполнена в лаборатории функциональной биохимик беспозвоночных Института эволюционной физиологии и биохимии им. ИЛ .Сеченова All СССР

Научный руководитель -доктор биологических наук, профессор А Л.Хованских

Официальные оппоненты -' доктор биологических наук, профессор А.П.Бресткин доктор медицинских наук, профессор С .С Лихайлов

Ведущее учреждение -Институт токсикологии ЫЗ СССР

Защита состоится 19S. J2.00

часов

на заседании. специализированного совета K002.89.0I при Институте эволюционной Физиологии и бжшшш им» IIJ.; .Сеченова АН СССР по адресу 194 223, Ленинград-223,пр-т М.Тореза,44 -

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Автореферат разослан

Ученый серфвтарь специализированного совета

К002.89.0Г кандидат биологических наук

Актуальность теет. В последнее время пристальное внимание припекают системы метаболизма ксенобиотиков в организме животных, го связано с интенсификацией применения разнообразных искусствен-и: ых соединений з качестве пестицидов, лекарственных препаратов, такие с возрастающим загрязнение!-? окружающей среды отходами про-зводства. Б соответствующие системы метаболизма входит и систе-а глутатионтрансйераз (Ш 2.5.1.18, ГГ), занимавшая одно из кшо-эвых положений в биотраксйормации чужеродных соединений. ГТ ка-ализирует нуклеофкльше реакции восстановленного глутатиона (Г-sH) широким кругом электроРпльных соединении: замещение подвижных томов л группировок; пряное присоединение Г-sK по кратным связал с расцеплением оксираноЕЫх достигав; восстановление гидроперэ-исей и эндопероксидов до соотвехствущих спиртов; изомеризация ^играцяя двойкой связи, цис-транс-изомеризаиия относительно еойной связи); нптроредуктазные реакции; тиолиз. С индукцией ГТ о многих случаях связано развитие резистентности членистоногих пестицидам и снижение эфо.екнтностн лекарственных црепаратов организме человека и зпзотнкх. Регуляция актагвноати зтого фер-ента в организме осуществляется множеством способов. Однако с очки зрения практического применения особый интерес цредстааяя-т синтетические ингибиторы и активаторы фермента, которые позволяй бы подавлять ш активировать метаболизм ксенобиотиков ж ем сашм снижать ш повышать устойчивость к ним .организма, то se время-набор эё&еклтнкх и специфичных ингибиторов ГТ на энный момент ограничен, и, что самое глазное, одшсторонен: очти все они представляют собой нереакщюнносшсобнне аналоги -sH либо второго, алектрофзльного субстрата. Поэтому актуальны ледухзщие задачи:, исследование механизма взаимодействия ГТ с ив-::битора:.йц; расширение круга ингибиторов фермента за счет новых лассов соединений; решение вопроса об избирательности этих ин-ибиторов.

Цель и основные задачи работы. Целью работы является выявление ходств п различий ГТ из двух источников - злаковой тли (фермент оторой ранее не изучался) и печени крнсы, при помощи ингибиторов ового, неизученного класса азиатов. Б ходе работы были поставлены еяедущие конкретные задачи: I. Дать субстратно-икгибиторнуа характеристику ГТ злаковой тли . печени крысы.

2. Установить -даханизг,. действия ингибиторов нового типа ■ азшинов.

3. Определить степень избирательности субстратов и ингиб; для ГТ злаковой тли и печени крысы. .

Научная новизна. Впервые изучена суйстратда-ингибиторная дафичность ГТ цитрзолькой фракции гошгената злаковой тли. I чены в качестве эжекторов ГТ из двух источников представите нового класса электронейтральшх полиазотистых 1,3-диполей -азиатов. Установлено, что в растворе "роисходат кэыплексооС зование шяду Г-sH и азшанами, и тленно эти комплексы обла; наибольшим ингибйруищш действием на ГТ. Обнаружено, что I-? Емвдоазшнны претерпевают каталитическое разложение под дейс Г-SH и других тиолов. Обнаружен принципиально новый тип peas катализируемой ГТ - н-дезокигенирование к-океццов, разработ метод ее измерения. Впервые кинетически дифференцирована акт кость ГТ, ответственная за тиояиз п-нитрофенилацетата, от т. глутатпон з-грширшареразной активности ГТ печени крысы. В лека сходства и различия двух йердентов при помощи ггошщипяа новых ингибиторов п субстратов.

Научно-практическое.значение. Данные о сходствах и различ; двух ферментов шгут быть использованы ъ поисках ингибиторов еого класса, которые могли бы служить, синергистами пестивдцш и/или цролонгаторааи- действий лекарственных препаратов. На о( реакции и-дезоксигенирования резазуркна разработан новый мете колоримзтряческого определения активности ГТ.

Ахшобахргя р^ЗотыЛате-риаяы диссертации докладывались на Вс союзном семинаре "Химия физиологически активных соединений" (Черноголовка,. 1989), на X съезде Всесоюзного энтошлогическс общества (Ленинград, 1989), па конференции молодых ученых "Сс ременные проблемы получения лекарственных препаратов" (Ленинг 1990). По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на стра ыашношеного текста и состоит из введения, обзора литературы пяти глав с изложением экспериментальных данных, обсуждения р зргьтатоа, изводов и списка литературы (214 работ).В работе и ведено рисунков и таблиц.

оббекш и методика. исследования

Объектами исследования слузшш: крыса лабораторной популяции Вистар и злаковая тля (Schlzaphia gramina RondJ. Ферыентнке препараты готовили следующим образом. Печень самцов щис (вес животных около 200 г) перфузировали сразу после вскрытия холодным (4°С) раствором KCI (1,35 %, в/о) и гомогенизировали с 4 объемами 0,011.I К-йостатного буфера, рН 7,4 , содержащего 1,15 % KCI, 10 Ш ЭДТЛ и I Ш дигаотрэйтод. После б-кратного разбавления этим же раствором гомогенат поагедоватальш центрифугировали: 20 гяга при 10 000 g , осадок отбрасывали, затем I час при 100 OOCfe. Пажученный сзпернатазт использовали в кгчестве ферментного препарата.

' Стандартное определение активности ГГ проводили го методу Хабига с соавт. (Habig е.а., 1374) с использованием 2,4-динитро-хзгорбензола (ДНХБ) в качестве субстрата. Измерения вели на двух-лучевом регистрирующем спектрофотометра Сиекзрд М40 (Карл Цейсс йена, ГДР) - при регистрации шозгроз тглочэннг, кяи на спвкт-рофотометре СФ-46 (Щ10). Реакционная: смзсь содержала 0,1 М К-фо статный буфер с вэобходшлнгл звячзшзм рН, наснпдазсщую концентрацию Г-ffl, различие концентрации субстрата, ингибитора и Ферментного препарата. Объем иробн - 3 ш з стандартной кварцэ-вой хазвете. Концентрации белга опрэдагшяи но методу Лоури, с бычьим сывороточным альбуминов з качзстзо стендарта. Аетпшость Фермента выраката в нансмонк ирзвразгенного субстрата з минуту на миллиграмм белка з прсбз. ЕпЕэшчеегае игралзтра ферментативных реакций определяла графически,, та Ла2нуи2еру~Бзрку, используя для проведения: арямаг вззегэнзуэ линеЗвуа регрессия (та -iciason, I9GI). Тли ИЕгийированЕа определяли тагке гр^ически, а дгойзсс обратшсс координатах (¿Edd ДР54), вэЕеггнтз ЕНГйбярова-гнзл - по мзтоду Диксона (тал ), тайга с щязлзнаннеи взвешенной лшзйзоЗ рзгресспи.

Ззисякввв н-геттоилггашнз сЕзхезкрована з дагйорагориа Функ-цпсяалыэИ íeanasna беснозгсночннх ЗЭ5Б га. НЛ.Сечвнова канд.

■cs.-r-x A„A<.Cy2opos*.5.": ¡ другие гзтеропнкпгчзсЕиа ингибитора ГТ -:: глеетрезяшш органически соединений Института

'-гтг^—есг'-чго синтез?, и утлеппчпЕ АН КасССР. Остальные. соедине-- ;~Л£;зр~есгло згродугты, з случае необходимости подзергазтпи-•i-zt г.С'~о'::~ггельЕоа счнсзже.

- в -

ЕОШТАЗН ИССЗДЩЗАНШ И ОБСЛОШШШГ

X. Субстратная спегоуТ'нчкость глугаткотгоакстетаз пэд использо-• зании стакяатугках субстратов.

В настоящей работе впервые установлена активность ГТ в исто-зольной фракции гоиогената злаковой тле. Данные по субстратной специфичности ГГ тли (приведенные в табл.1) показывают, что на: более эффективен катализ реакции ДНХБ (0,15 шкадь»ШЕ~^тлг~"''), Использование его близкого аналога 3,4-дашгорнитробензола (ДХШ приводит к резкому сникению активности. К субстратам, прояеибпг внеокув активность в кагализе ГГ злаковой или относится п-нитр< бензиябршзд (НЕБ), т.е. заютное место в сб;^ай активности щтс зольной ГТ тли заншлезт т.н. гдутаглок б-слгл^аткидтропз^е-разн: аззаэносаь, ЕасшвызеЗ удалыюй ггзиыюсть«; очеъшжоя 2 от-восскаа Ореглсуяхфсйталепна (ВО®) и зтакрпноией кпелотн (сК)„ ъ го т вреаз гпшхентранЕх насыщения <£ердегха этими субстратами (ВО ВСДЕГЧЕНг К,) достаточно низки, что позволяет иезользовать Н>2 в качестве ивж&Егора этой ГТ. Использование в ¡таком s6 качество SK зогрущштальш) из-за вазовой скорости его н®|ершЕга-TiiBHoro ьзазкодс^сгвкя с Г-еН.

СуйстаатЕпя специфичность ГТ' иг почеш: етнсы была аналогична (табл.!). Б частности, пс:<еьгсцек удельная акяЕшость_1Т печени хгрысн наблюдается тазго с ЖСБ (1,5 ишиь.шеГ? кг--1-). Этот пс казаяель на порядок прзвуишт еоотаетстзущук величину для ГТ ¡злаковой тли, вероятно в сгазг с теьл, что для цргтотовлвшея рентного препарата тли брали целых насеко-осс, тогда как в случг крысы - отдельный орган, е наибольшие еодерганцеы ГТ. Сбредает внимание шеокая активность ГТ тли и юэкок ш отдашеняв к НЕБ. В то не время наблюдаются и некоторые отличия. Tat*., ЭК, в отношении шторой фермент тли оказался наименее э&Фяешкнм, з даш случае ваашйод&йствует с Г-зН почти с такой ае свэростьо, как г. ДШБ. Нааленае ке зффектившн в данном случае является БСО.

2. Новне грошгекпае субстраты глутатионтоанс^ерлзы.

В данной работе наряду с известными субстрат ами ГТ использовали новые, в том числе специально синтезированные - глгщпдил-резоруфин (ГРР)-и ргзазуран (РА). По аналогии с пзвестани cjö-стргтет,- ГТ 7-гл:зззд1Лок';пг51:аг^п:о:л (Ei»tcul» a.a.,IS89), сиделось, что реанш с Г-SH приведет г; «Зрсзовггнпз СдуорзстЗУ-

Таблица I.

Субстратная специфичность ГТ злаковой тли и печени крысы.

тля крыса

Субстрат — V, % V, % • Км*

2,4-дан!пг Зензол Ш юхлор-ЗШ ' 100 •1.4-ЛГ3 100 1.5-1СГ4

3,4-диклорштро-Зензол (ДХНБ) 1,5 ' 8,7-Ю-5 2,9 5.8-1СГ4

а-нитробензил— Зшшд (НЕБ) II 1Д-Ю"4 15 5,2-Ю-5

1—нитрошгоидин— Н-оксид 1ШШ0) 4,0 1.8-пг4 0,7 6,8-Ю-5

5оо1лсульфофтатеия (БСФ) 0,5 1,5-КГ4 0,4 1,0-ГО"5

зтакриновая кислота >ЭК) 0,4 2,4-Ю-5 2,5 2,2-Ю-4

1-нитрофешигацетат [НФА) .13 2,3-Ю-3 8 3,0 -ДГ4

хливддарезорурс! [ГРР) 0 - 1,0 4,3-Ю-4

зезазурин (РА)х; 2,0. . - ■ 8,5 -

Скорость реакций измерена при [з}= 5,0-Ю-6 1.1 (

зщего соединения (резоруйина), что-дата бы зззмолность чувстви-•ельного определения т.н. глутатион 3'-азюксизфансферазЕой актив-гости'ГТ. Однако вопреки озвданийьг, .как ¡ршентативная, так и на-)ермеятатшзная реакции идут иначе, чем с гяштаияпншкугёаригом. [о-видимому, з -конькзгат Г-зН с ГРР обладает неожиданно высокой лабильностью и в данных условиях не.гидролиз уется. Нигге показа-[а воздакная схема реакции л ее' отличия от ранее предтлагавшэй-

но' и

Второй хртаогенвйй субстрат ГТ - РА, который, как бьшо установлено , в -.гоиоугстки luáí подвергается " и-дазокскгешгровавт по следувдей схеме:

о

"O'^S^'O

t f-SS-f ,

о

где Г-as-r • — :окцслешхй хлутагиок. .'Спекгрегшьвне. даннне приведены на рис.1,- Реавдза'жаЕШПгзЕруется-ТТ зяш к крысы, Катализ ГТ реакций к -дезокспгентжовашя не описан в литературе ítiiq существу яняяэтся.швш 'яда /активности ГТ. 15шмк саоваыи, новны является не только ojtíwtpai ; <но • В;«8и .даш. .кггшнзфувшй реакции, оба хрошг&дщх 'суйстрага .исю.гьзоЕгаа: .в.'-анализе : субстратно^кЕги-

A üjöj

0,75

.0,25

ода

о J

573 -598 ■ 7.00 Я, мм

с:-: е-

Рис.1, Кинетика изиененкя. спектра поглощения веакцнонно

си, содержащей 0,0025 Ш PA, I tU Г-зН~в 0,I_î.î lWocs'-w ном ôyœepe, pH ,S,5.. Шк даглощения иа водке ü28 ir.: со. ответствует РА. и в пооцеесе реакции уменьвается,-пик ■ на всаше 573 ^соответствует р^зору^пну -(продукт; и" в ■ процессе реакции уввдитавоется. Регистрацию спектров вели в .течение б izmr время регистрации около 40 с .

_ э -

3. Ингибнтоонзя специфичность глутатдонтраксшерзз при использо-

ванга ингибиторов — аналогов с;?бстратоз.

Ингибиторные исследования активности И тли и печени крысы проводили, используя катализируемую зтиш трансферазами реакцию Г-ЯН с ДНХБ. В качестве ингибиторов использован набор гетероциклических производных (таЗл.24!.

Два производных пиперидина с 1фатными связями в боковых цепях (ШГ-67 ,Ш1-67 и ГЕН-70) являются ингибитора:® ГТ конкурентного тша, третье - смешанного. Производные хгшшшлфосфоновой кислоты (ЕС-7,ИЗ-8,Г2Б-2 и ГП>-5) не пЕгибиругат ГТ, либо относятся к ингибиторам смешанного типа. Соединения этой группы, ш ингиби-рущие ГТ - йосфодиэ.фиры, в которых к остатку О-лропзал-О-хининяз!-уосйоновой кислоты присоединены радикалы: лупишиг (Г£С~7) иди ментол (ГЗС-8). Соединение ШБ-5 является ингибитором средней сшш, ГЛБ-2 уступает ш степени ипгибированкя почти на 2 порядка. Производное эфедрина (ГЭ-15) является слабим ингибитором ГТ адако-вой тли.

Альтернативный субстрат Н>5 и аналог галсвдзЕмеЕфнннх бензолов. (субстратов ГТ) дихлортолуод СТО), как я следовало ожидать, ингпбировали ГТ тли и кршн по нзшсзрентному типу, врете?.? НЭ на порядок. превосходил ДИ по знгийиругщеЁ способностк.

Таблица. 2.

Ингибиторная специфичность ГТ злааоЕой тет к штанг крксн.

шщр вещества

щзнса

ааш

тип ингпбнр. Е^Л тип ЕНГЕЙЗр.

1,97 -1СГ4

1,4-пг3

зд-иг4

2,4-Ю-4 5,4-Ю"4 >10~2

1,2-Ю-4 '3,0 «ДГ5 4,4*10"® ЛГ ЯГ

[¡Г-57

пэ-ет

т:а-70 713-85

7Ш-8 16-15

¿ЕБ-2 ЗСФ

яг

к к с н

с я

необратимое

К -К

2, £0-10" 8 5ГО «ЮГ 4,10-ЗЕТ*.

>10"2 4,6 • ПГ4 7,0. • ЯГ5 '

1(Г

' Ю"*

н

КС.'

а

с с с к

к.

Типы обратимого янгпбктзованЕяг К-конкусентноз, Неконкурентное, -тесанное. " ~

При анализе аналогичных взаимодействий с ГТ печанн крнсн отмечено больше сходства, чем различай. Так, практически равны константы ЕЕГибцроаатя ГГ таш и 1фЕсы соединением ГЕН-67. Не являются ингибиторами ни того,-ни другого фермента соединения ГШ-7 и ГЕС-8, Еонстанш ингибирсвания юторах больше их растворимости. В Евгибированш обоих фзрлентсш соединением ШБ-2 присутствует необратимая компонента, которая • больше в случае фермента крысн, ко в обоих случаях зто ингибироваше слабо. Определенной спещ-фичностьа з отношении И здзысн отличалось соединение ГЕу-15 , и осебашэ ЗЕШ, когда различия в константах бнли около порядка.

4. Лпонзводнне азншгов - новый класс эдаекторов глутатионтранс-гоэоая.

4.1 Взаимодействие подназотиетнх соединений с глутатпоном и друначк яВ-соагшквнгтш/я.

Вначале бнйо предпринято детальное изучение нефэрмзнтатиБШх взгнадо£огвЕЁ нового класса полиазотистых соединений - азишнов (см. нее®)," с Г-£Е,-

о

о

i ^ Д.

R H»

I Pà Ph

п Pfc

и Рп Et

ЗУ - Pb- Pr

or f-y»-* (Q^ й

о я

-Т Е R'

у Ph -Pli

. Soi Toi

SU Pr Pr

»

Установлено, что I-фгадшидоазмикн (соединения 1-У) в присутствии Г-5Н цретерпевавт химическое превращение. Спектр продукта данной реакции по форме и волоаенпш максимума совпадает со спектром продукта термического и катализируемого щелочами разложения соответствующего азимина. Реакция сопровождается наделением газообразного продукта, л доходит до юнца с заведомым молярным недостатком Г-SH, что говорит о каталитическом характера процесса. Получззншгэ даннне, таким образом, говорят о том, что в реакции с Г-SH происходит раалокениз азкшна но следующей схеме:

0 » R'

A f> ■ о

бразозашем И.И'-дазаиещзнного фтагощшгда и газообразного та. Реакция разяозеззя азниант идет в две стадпг, что стчзт-о показано спэктралыахп дазззла (рис.2).'При дсйазяенли твора Г-5II к раствору аззгсяа немедяекээ исчезает хгшахггзрна!! : ажша на волне 220 нм, тогда как нарастание пзгз продукта лщается не ранее, чем через 10-20 гяш, в зазнснглзсти от уча-уэдэго в реакции аззкппа. Зтп спектральные дакппз, а такзе аяитятасша ^аратстзр взаимодействия, говорят о том, что в творепрз слабокислой реаэтш среди происходит образование шгексов 1-4таяЕ!гвдоазпшзоз с Г-зЗ, затем - распад комплекса азлояением азншпа.

А 1,0

0.5

Рис.2. Спзктрн поглощения юмпоновгов роагдаоннай саеои. I - Г-GH, ID"4 М» 2 - I, o-ICT2 М, 3 ~'азн-~

тлхн I + Г-Я э тох ае кмщентргцшас» непосредственно после смеияшания, 4 - продукт разлоЕезпгг азпыина I»

Чтобы ВЫЯСНИТЬ РОЛЬ ОТДедЬПЕХ ^уНЯХгОНаЛЕЕЫХ rpjCT ЕО 3~'£И?Л0-;стзии с Г-21, была проведена серия экспериментов с гадслвЕн-соединенней. При заыене Г-зН другими зП-соедпнаншза, а дасуяьфцдауп, шяснилось» что вое испытаннее зтшн катализа-от разлозеняе 1^1;таяшяпоазпиинов с различной скоросгю. В то время дисульфиды не оказывали никаюто действия на азшикн. зга образом была выяснена определявшая роль зН-гуудпн Г-SH в зсштреннои взадаодейетваи» Для соответствующего анализа фунз-знальных групп азпминов такге проведеш опыты с коделвнеЯ

соединениями. Известно, что аналогом азиминовой группировки с точки -зрения распределения электронной плотности является азоксигрушга:

я" «'

азимшш азоксисоодинения

Поэтетлу для моделирования азиминовэй группировки в эксперимэн был вачт азоксибензол. Установлено, что это соединение такае I разует комплекса с Г-еН, что вызывает изменения в спектре пог. щения сыглси реагентов в коротковолновой области. Предполагало! также, что возможна реакция н-дезоксигенирования, но азоксиси зал оказался устойчивым. В то яе время одно из модельных соедз нений, резазурин, действительно подвергалось я-дезоксзгенироБ; нею в присутствии Г-еН. Эти данные, а такие то, что ни цроизвс кые фталиавда, ни производные бензола не склонны к киящекеоос разоззнию с Г-еН в исследованной области рй, говорит -об опреде лящай роли аздыикоБой группировки в исследованных процессах.

Для дальнейшей работы было взято 2 ряда азямшов, кроме I-фталаддоазииииов (соад. 1-У) - 1-.(2-ыет1Вииназол-4-он-3-зл)-азвшшн (соед. У1-УШ), которые не разлагаются под действием ти олов.

4.2 Производные .аазмишв как субстраты глттатионтранссТ'ераз.

Было исследовано взаимодействие соединений 1-УЛ с системой печени крысы и злаковой ш. Следовато ответить на.вопрос: не : дякися ли эта. азгмиш субстраташ фершнта? Выяснилось в что в присутствии ферментных препаратов злакэвой тага' и печени крысы есть кзмзторозч устарение реакции раздоаашя соединений 1-У, о} ко эффект., наблкдаем лишь при болнних количествах ферквшга и д?п таланом времени наблюдение. Соединения У- УП не является субстт таш ГГ. Скорости.этих- реакций зависят от зааесишедай а и Н'. В неферменгавишой-рееада с наибольшей скоростью разлагается азншн I (дайешлаамещеннай)» В .рд^агшшёеншгазжшюв при пер ходе от 2-иетал-^-а;енилза1,':ещэнЕого к, 2-атшгзаыещеяш1лу старость реакции увеличивается, а. при дальнейшем удлинение' алкалькой цэв несколько скисается. Б сяучаа реакции с участием фермента печен кркс!Г закономерности сТжтичесжи обратные, а с участием ГГ с. и: -сходны с несеризнтазкЕйнгч' процессом.

Азтаннн., :ззк -инрЕбЕтотн -ззтат^ятоакс&враз.

Ез литература.известно (ciariJSinclBis 1933), что комплексы [ могут пнгпбкювать IT. В настоящее время такие .ингибиторы .ставлены единственна!,! веществом -.кскпдексом Г-^Н с.триштро-юлогл. Однако этот. комплекс • образуется при "ецсокес значениях ■ свыше 9,0 , что-тыхцс^-гарггдка .фкюзолгеескЕа условий и ;ает ценность полученннх результатов.

ервач серия экспериментов' по ^нгибировгайа ГГ. а&шинаш пеона па ферменте печеш-врысн с ЕсшзьзоганЕок ЛНХБ. в качестве тройшхьного субстрата, Усаоззагэгих опытов, а именно: время я проведения.реакций (около 2 хан) .в эаапчестзо ферментного арата (0,065 кг го белку) ■ тзвашш! пренебречь ракгозенгем .азшшза (азэлшн.УI-УШ не разлагелтся под действием Г-SH). зено, что воздействие Г-сТлгс^шяздсгзггнсв на IT соответстзу-хемс обратгыого 'ини^ированш, гпрпч-м го »рглг дреднгмерзнно ельной пзжкубацЕн - ойнаруягззгась -госгегвкнаг peassrasCBs §эр-а, совпадающая по времэкп с 'реасозенгем ззг.зна. Интийирова-по формальной схеме-относится.к .смешанному иди гаккурентному при вариглиях' хгаяпштргяги ■ При изменениях кэндазтрешш нгбдэдается другая картава. При его -концентратах' свыше I tM азиминаХл 5 Штт-взжяжаД график в двойных- сбрсзнг: канатах теряет, линейность я степень тормо-зння резго зозраста-ЕЬ-вцдпмому, это говорит об" обратвмостп'процесса ншшевсо— зования и о том, что.коксталта- ассоциации достаточно.низка, увеличении концентрации Г-sH-разновеске смещается в сторону зования.ингиблрувдего фермент икднгеяса Г-SH.

збиоательгость действия, азиатов.

:я более полной характеристики обоих йерментов (приникая во акне-пх широкие • субстратные специфичности)-целесообразно 1ть плишйе .-аззшшов 'на йерыентатЕВЕЫе -реакщш различных по 1ескйй природе субстратов. Полученные реззотьтаты приведены

5л. 3.

1ализ полученных результатов можно проводить по следувдим зетрам: а), в пределах каздого ряда соединений, б) гланду ря-соединений, в) исжху psaкнрщ.зд. разяютЕК суб стразов, г) меа-С. различных организмов С-.тли и .крысы ). ~

Таблица 3. •

Избирательность азиминов в отношении различных глутатионтрансфераз и катализируемых ими реакций. .

краса тля

АЗШИНЫ , днхб ;.ша раа>- /днхв. нфа • ■ Н»

В к н' Р% Р^О р%0 ■

<о> 1 °б% П СЕз ш с^ 1у сдку С6Н5 4,10 2,15 2,10 3,57 6*24 5,82 4,11 4,48 - 4,85 4,68 4,50 4,70 ■ 5,т:-5,0 зл 3,0' 4,81 4.1= 3,4: ■ •3,7 ■ 4,5 4,5' 4,9-

<о> ■о* V у N Р%о2)

V ■ vi сндсцн^ сндс^н^ уп сд!^ с3н7 2,39 2 >62 4,42 •4,12 - 4,26 5,18 - 2,3 ' 2,3 зле з,о злз 4,0 -

1)р150 при [5] = 2,5 • Ю~6 М ( «1'^)

2)Р150 при [$] =

Измерения реакций при высоких концентрациях РА невозможны из-за высокого молярного коэффициента экстшшши как стбстпата. так и продукта.

а) Соединения I-I7 по знгкблргщпгл свойствам распредаяяззтся ;едуквдгл образом. Азили I является наиболее сшоаш ингибитором. ' печена хсрнсы и злаютой тли во всех кататизируемнх реаюдах. тана в молекуле йешшьшго радикала на метальный приводит к ;зному сяявеипи шгкбпрушцпх свойств, дальнэ&пее наращивание ¡пи й'до Cglî^ приводит к повышению степени тормокенаяг реакции случае ГТ печени крысы. Пои катализе т.н. тиолиза ША такого узкого снижения шпллбпровання не отмечается, как и резкого по-ззения при переходе к азимкну ЗУ, хотя он и показывает несколь-| большую степень тспмо::сения, чем азшлин Ш.

Средн. соединений У-Уь аапвксаеЛ ингибируэдей способностью Угадает дипропияы-юе г.ролсюдкое (соединение УП). В связи с этим едует отметить, что диалкгхпроазводше Х-фтшшвдоазпьина .»З-дпэЗутйлОталгс.вдоазигшО наиболее энергично взаимодействует Г-31 без участия фермента, с разложением азимина (реакция идет .столько быстро, что измерения активности фермента в стандарт-х условиях невозможны). Отсюда следует, что дяаякипзахлещенше тглнны по-видимому наиболее склонны к ксглатексообразованию с зЯ. Вероятно, с этал свойством и связана высокая ингшЗкрргзая есобность соединения УП в пределах ряда 1-(2-^лекакиназой1-4-ан-ил)аз:п.!1тл:ов. 3 этом не ряду соеданвнзй переход от дпфешягьного днтолглыюму производному приводит к не значит еяьвшу усилению гпбпрованпя глк в реакции с ДЕШЗ, так и с ША, при участии они Серментов »

0} Наиболее; щебжх для сравнения пара соедшении I и У, различался только готоропшшяеекпа заместителем при атома Я1 азвш-зой грутшировзс''.. Соединение I проявляет Ш5Г2бзрушдуг>. способ— сть, в средне?.' на 2 порядка вэегяшвдзв торшаение, вызываемое эдти-грнпэм у. Зтс каблтдается во ecsx каталпзируйшх реакциях :с для "еемзпта cssn, cas а крнсн.

2) 17рл анализе згадансиерносжей, получению, при. ингибиторном г-йдовзъ::: различных глутагсоЕтраяейеразЕЕг. раакцвй, обращают себя sH¡i:rsne два вазнкг обстоятельства. Зонзервых,. ингибятор-I сГ/:1огт:::з"ость азплинсз из отношашз к реаяда. тиолиза ША гз. rr-'c-c'-Bíi-nro енеэ, чвм в случае реаяпди с ДБХВ. Так дифехдпь-; гро-ззетгаов (гзпм I) проявило ■ IÎO-кратщпз оовшйгчшеть, • ;го '"5т:г:С5:'1Ильне:: акало?, оказался э 4G00 раз более саецифич— : гпг-ибпгер-тд тноднзг Н5А.- Несколько мэкее спе^дзйгчнвми.пнги-

биторама оказались пропилъные производные 17 и УЛ.

Во-вторых, для зтвх двух активностей ГГ существенно разлзг оказалась зависимость эффективности азишнов от их структуры. Так, б случаз реакции с Д11ХБ для группы 1-1У наблкздалось pe3j снизение эффективности при переходе от дафешльного к феншп.к ному производному (см. пункт а) ). Этнлфенильное производное была столь se малоэффективна,!, как и азигдш П,.и только для i пилфенильного аналога ( азтзин 1У ) вновь отмечена повышение тивности. Б случае реакции с ISA хотя качественно картина бы; подобной: соединение I по эффективности существенно превосхо; аткильнне ироизводнне Ш-1У), однако среди алкильных произвол сашм слабны ингибитором был азишн ¡И,, причем мзтилы-ый (Ш ; проппкьшй (1У) аналоги превосходили его, соответственно, в í и 2,5 раза. В ряду У-УП ингибирующая эффективность азимхнов отшЕэкиэ к двум видам активности (по ША и ЛЕСБ) качествен!! сходная:- алкаш-го s производное СУП) тлеет преимущество перед 3Z2.2I аналогам* (У sJI). Однако , если в случае активности и это прешлузцестЕО всего 10-Ератное, то для активности по ДНХБ достигает 85-100 раз.

Некоторнз из списанных зффектоз наблндалгся и при участии реакции шерменга злаковой тли. Так, наиболее шщнш ингибито зтого фермзнта таzciz ясгязтся дЕфсшшзаиецзыны£ азалии 1. 0;п другие закономерности отклоняется от свойственных ферменту i чени крнсы.

г) Сравнение ингкбирования исследованиши соединениями фе тов ш и 1фысы говорит о том, что методу ними имеются замет! различия. Во-цервых, яонкпгаздая Г-£Н и ДКХБ, катализируемая тли, тормозится соединениями 1-1У сильнзэ, а соединениями У-слабее, чем ври участии ГТ печени крнса. И б том и в другом чае,. наивысшие различия б консгеахах негибирозания цреБшахк рядок (соединения I и Ш соответственно).

Однако наиболее резкие отличия в ингибировашш ГТ крыш i иш набдадащся цри переходе к ВЗ?А в качества субстрата» Ее; при участии б реакции фермента шчзнж крнсы (см. пункт з) ) блюдачось резкое увеличение силы ингибиторов как в ряду 1-Г так и в ряду У-УП, то при катализе этой se реакции ГГ тли с пень тормояения либо уватичивается крайне незначительно ( з 2 „0 - 2,5 раза'ч либо дата угленхааьхся (ai единения I и П),

Таким образом, при сравнении ингибировання азгишака ГТ злаковой таи и печени крысы выводы следует делать с учетом использованного субстрата, и ингибиторы "класса азшиноз в таких условиях позволяет выявить различия глеэду ферментами из различных источников.

ВЫВОДЫ

1. Впервые изучена активность ГТ в цитозольной фракции гоыо-гената злаковой тли. Величина удельной активности фермента составила 0,15 ынлоль-1.!Ен~^ {при использовании стандартного субстрата 2,4-диннтрохлорбензола). Изучение реакций с другими субстратами показало, что НЕИыеныпую активность ГТ злаковой тли проявляет в отношении субстратов этакриновой кислоты и бромсульйо-фталеина. В отличие от ГГ печени крысы для фермента злаковой тли отмечена более высокая относительная скорость превращения 4-нзт-ропнридин-N-оксида и отсутствие реакции с глшдэдилрезоруфх-шогл.

2. Обнаружен новый класс ингибиторов глутатнонтраясфераз -злектронейтралькые пслназотистые диполи - айШЕИ р;да 1-фталини-доазикинов и 1-(2-5лэтклхиназол-4-он-3-ил)азш.!Енол. Установлен механизм ингпбировация глутатионтрансферазных реакций азимингш, предусматривающий образование комплексов азклиноз с юостановленным глутатионоы, которые, з свою очередь, оказывает шзгибгрущэе воздействие на фермент.

3. Впервые кинетически дифференцирована тиолнзная активность глутетионтрансферазы печени крысы (по п-нитрофенияацетату), от глутатпон Б -арилтраксёеразной активности (по 2,4-динитрохлорбен-золу): в ряду азимшов выявлены эуйективные ингибиторы тиолизной активности кермента печени крысы. Глутатиоктрансфераза злаковой тли подобной специфичности не проявила.

4. Обнаружен принципиально новый тип глутатионтрансферазной реакции - в-дезокспгегщрованпв в-оксидов. В качестве субстрата для выявления к зперения этой активности предложен резазурин. Ла основе открытой реакции разработан высокочувствительны!! метод определения активности фермента.

5. Предлонен новый эпоксидный субстрат глутатионтрансферазы -глглдздшрэзору^ин. Обнарзисен аномальный ход реакции менду восстановленным глутатионом к глпццдзлрезоруйинои (как с участием фермента, так и без него), варагаищайоя в повышенной стабильности эбразующегося коньюгата.

Список работ. опубл:лсованных по материалам диссертант

1. Стузювский А.З.,Суворов А.Л. ¿.'.алзель Е.Б..Розенгарт Е.Б., Хованских А.Е. Взаимодействие и-гетершазгслшов с глутатион-трансйеразной систеьшй печени крысы // Доклады АН СССР, 1930,-T13I3 ,J.U.-С .235-239

2. Стуловсккй A.B., Суворов /ид., йайзель Е.Б., Розенгарт Е.В Хованских A.Ü. Ззаишдекствкй глутатпонтоагс^еразной систсж печени крысы с 1-фталшпдоазш;1нг1£1 // Укр. бпохш. яуте. 193; r.63,J,:i.^C.7I-?4 '

3. ¡Дайзель Е.Б..Стуловский À.B. Довансккх A.B.,Крас ав:ша Л .П. ¡Х;.:етцер Н.В. Сравнительное исследование свойств глутатаон-в-трапсйеразы тлей и :ix энтойо(-агов // Тр. I съезда Всесоизн. э топологического общества, JI.; IS9I.

4. Стуловский A.B., Суворов л.А. Конструирование ингибиторов глутагионтраысГ/еэаз на основе комплексов глутатиола с азшаша Всесовзн. се;л:кар "лилия ддзпологичсски активных соединений". Тез. докл., Черноголовка, 1989.

5. Стузювский 1.2., Суворов A.A. Взаимодействие н-гетерилаз:г.: нов с глутатионтоанаТ.ер&зной с:;сте:.юй печени крыса //Ков]/, лодых ученых "Современные проблемы получения лекарственных пр паратов"т Тез. докл., Л.; ИЗО

Подписано в печать 7.03.91г. Формат бумаги 60x84 1/16. Бумага гипографсгаяГ'1 Печать'"РОТАПРИНТ". Объём'1,0. Тираж 100 эн

Заказ 147 -

Ротапринт общества "Знание" УзССР Ташкент, ул.А.КаднрлДЗ.