Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Различные аспекты субстратной специфичностихолинэстераз некоторых тихоокеанских кальмаров.Сравнительно-кинетический анализ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Различные аспекты субстратной специфичностихолинэстераз некоторых тихоокеанских кальмаров.Сравнительно-кинетический анализ"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ им. И.М.СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

РГБ ОД

БАСОВА 7 - дпг 2000

Наталия Евгеньевна

УДК 577.15.152

Различные аспекты субстратной специфичности холинэстераз некоторых тихоокеанских кальмаров. Сравнительно-кинетический анализ

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 03.00.04 - БИОХИМИЯ

А ВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 2000

Работа выполнена в лаборатории функциональной биохимии беспозвоночных (заведующий - профессор А.Е.Хованских) Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН (директор - академик В.Л.Свидерский)

Научный руководитель заслуженный деятель науки РФ

доктор биологических наук, профессор А.Е.Хованских

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н.Я.Лукомская доктор биологических наук, профессор А.В.Арутюнян

Ведущая организация: Институт токсикологии МЗ РЕ

Защита состоится " 16 " мая 2000 г. в " " часов

на заседании Диссертационного совета К 002.89.01 при Институте эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. М.Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова РАН.

Автореферат разослан * апреля 2000 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

кандидат биологических наук Л.В.Зуева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Фермент - это "работающий" белок, и поэтому наиболее адекватным и информативным методом исследования является кинетический анализ ферментативного катализа. В течение нескольких десятилетий этот метод развивался, совершенствовался и успешно применялся в сравнительной энзи-мологии холинэсгераз (ХЭ), что нашло отражение в работах А.П.Бресткина и его школы (1997). Как и для любого фермента, наиболее важной характеристикой каталитических свойств ХЭ является их субстратная специфичность. В классическом варианте это зависимость скорости ферментативного гидролиза от структуры субстрата. Однако понятие субстратной специфичности нельзя ограничить только структурным аспектом. Роль субстрата важна в процессе обратимого торможения ониевыми эффекторами, в реакции необратимого угнетения ХЭ в присутствии субстрата ("защитный эффект субстрата"). Такое расширительное представление субстратной специфичности должно быть особенно актуальным и информативным в сравнительно-энзимологи-ческих исследованиях.

Цель исследования:

Провести кинетический анализ различных аспектов субстратной специфичности холинэстераз ряда дальневосточных кальмаров из семейств СШаз^ерЬ1(Зае и Gonatldae.

Задачи исследования:

1. Провести систематическое изучение структурного аспекта субстратной специфичности холинэстераз дальневосточных кальмаров.

2. Исследовать влияние природа фермента (в том числе холинэстеразы тихоокенанского кальмара Тойагойез рас1?1сиз), а также структуры субстратов и фосфорорганических ингибиторов на кинетику "защитного эффекта субстрата" (снижение эффективности ингибиторов в присутствии субстратов).

3. Исследовать влияние структуры субстратов на кинетический механизм обратимого торможения холинэстераз разных животных (в том числе холинэстераз дальневосточных кальмароз) под действием ряда ониевых ингибиторов.

Основные положения, выносите на защиту.

1. На основании сопоставления кинетических параметров

ферментативного гидролиза 18-ти различных по структуре субстратов холинзстераза тихоокеанского кальмара Toâarodes ра-cl/lcus не монет быть однозначно классифицирована ни как ацетилгидролаза ацеталхолина (НФ 3.1.1.7), никак ацилгидро-лаза ацилхолинов (Ш 3.1.1.8).

2. При сравнении кинетических параметров ферментативного гидролиза тиохолиновых субстратов холинэстераз кальмаров 5-ти видов семейства Gonatidae выявлены как количественные, так и качественные различия.

3. Сравнение кинетических параметров, рассчитанных на основании уравнения Бресткина при кинетическом анализе антихолинэстеразного действия разных фосфорорганических ингибиторов в присутствии различных субстратов ("защитного эффекта субстрата"), выявляет существенную роль природы фермента (в том числе холинэсгеразы тихоокеанского кальмара Тобагойез paclficus), а такке структуры субстратов и ингибиторов.

4. Количественные и качественные различия в кинетическом механизме обратимого торможения холинэстераз разных животных (в том числе ферментов дальневосточных кальмаров) наблюдаются при использовании различных но структуре субстратов.

Научная новизна исследований.

Впервые предложена расширенная концепция субстратной специфичности холинэстераз, включавдая наряду с влиянием строения субстрата на ферментативную активность также важную роль структуры субстрата в реализации кинетических механизмов обратимого антихолинэстеразного действия ониевых ингибиторов и "защитного аффекта субстрата" при необратимом угнетении фосфорорганическими ингибиторами в присутствии субстратов.

Впервые эта концепция.рассмотрена для холинэстераз разных хивотннх, в том числе для ряда дальневосточных кальмаров из семейств Ornmtreptilâae и Gonatidae.

Впервые изучен механизм обратимого антихолинэстеразного действия специально синтезированной группы производных бенз-имидазолия с делокализованным зарядом в катионной группировке молекулы ингибитора и влияния на этот процесс природы фермента и структуры субстрата.

Теоретическое и практическое значение работы. Развивае-

мыв в работе представления о многогранности понятия субстратной специфичности холинэстераз являются существенным вкладом в сравнительно-энзимологические исследования ферментов животных, стоящих на разных уровнях эволюционного развития.

Обнаруженные межвидовые различия в субстратной специфичности холинэстераз 5-ти видов кальмаров семейства Gonatidae, включающие промысловые вида, являются важными практическими рекомендациями при использовании энзимологического способа определения таксономической принадлежности океанических головоногих моллюсков.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на XXXIII Международном Конгрессе физиологических наук (Санкт-Петербург, 1997 г.), на И Международном Симпозиуме по сравнительной электрокардиологии (Сыктывкар, 1997 г.), на общеинститутских конкурсах молодых ученых (1998, 1999 гг.), на заседании отдела эволюции медиаторных структур ИЭФиБ.

Публикации. Основные результаты диссертации отражены в 6-ти статьях и 2-х тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и библиографии, включающей 190 наименований. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста, иллюстрирована 2-мя рисунками и 19-тьга таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Феркенты. В качестве источников ферментов использовали очищенные препараты ацетил-ХЗ эритроцитов человека (НФ 3.1.1.7) и бутирил-ХЭ сыворотки крови лошади (НФ 3.1.1.8) с удельной активностью, соответственно, 1.2 и 9.6 ед. (Пермский НИИ вакцин и сывороток). Тихоокеанский кальмар Тобаго-des paclflcua - из северо-западной акватории Тихого океана. Командорский кальмар Berryteuthía mglater - из разных зон ареала обитания: Лрибылово-Аляскинский (57° с.ш. 175° з.д.) ("восточные") и Олюторо-Наваринский (61° с.ш. 176° в.д.) ("западные") р-ны Берингова моря, акватория Северо-Куриль-ских о-вов (49° с.ш. 155° в.д.) ("южные"). Кальмары семейства Gmntlúae, входящие в 3 рода: Berryteuthis (B.maglster и B.anontchos), Gonatus (G.temtschatlcua и G.tinro) и Gonatop-з1з (G.borealta), были собраны на НИС "Профессор Кизеветтер"

в разных зонах акватории Берингова моря: Олютерский залив, Восточная Камчатка, Северше Курильские острова. Свежевылов-Л8ННЫХ кальмаров (в каждом случае 5-7 половозрелых особей обоего пола) замораживали целиком при -18° и доставляли в ТИНРО (Владивосток), где определяли их таксономическую принадлежность, после чего извлекали зрительные ганглии, которые хранили при -18°. Источником фермента был центрифуга? (800 g, 15 мин) водного гомогената (3 мг/мл) ганглионар-ной ткани.

В качестве субстратов использованы коммерческие препараты ("Chemapol", "Signa", "Ыегк") ацилхолинов [формоил- (ФХ), ацетил- (АХ), пропионил- (ПрХ), бутирил- (БХ),валерил- (ВХ), изобутирил- (ИзоБХ), ацетоацетил-(АцАХ), кротонил- (КрХ), ацетилтио- (АТХ), пропионилтио-(ПрТХ), бутирилтио- (БТХ)З, ацетил- (АМеХ) и ацетилтио-р-метилхолин АТМвХ), ацетаты фенола (ФА) и N-метил-оксиэтилшперидиния (АЛ), индофенилаце-тат (ИФА), 2,6-дихлорфенолиндофенилацетат(ДЙФА) и 2,6-дихлорфенолиндо-о-крезилацетат (ДИКА).

В качестве обратимых ингибиторов (см. табл.5) использованы коммерческие препараты фирма "Chemapol", производные а.оьбис (триметш1ашошометил)олигодиметш1силоксандихлоридов, синтезированные С.В.Кирпиченко, бензимидазолиниййодид и соли бензимидазолия, синтезированные А.В.Ельцовым и М.З.Гершовичем.

Холгнэстеразнув активность определяли методом непрерывного потенциометрического титрования при pH 7,5.Определение активности ХЭ при постоянной концентрации субстрата осуществлялось с помощью двух ультрамикробюреток (Яковлев ,1965).

Для определения холинэстеразной активности при одновременной взаимодействии фермента с субстратом и ФОИ реакционную смесь, содержащую ХЗ'И субстрат, в течении 1-2 минут титровали раствором КаОН, затем добавляли ингибитор и продолжали титрование еще 8-10 минут. На основании значений бимолекулярных констант kj-j, определенных при разных концентрациях субстратов, строили зависимость в координатах ^(Кц + CSD/Ky от CSI-

В случае хроиогенных субстратов ферментативную активность определяли с использованием метода дифференциального фотоме-трирования.

Для определения величин V и Кц в работе использован аналитический метод Вресткина (Brestkin et al.,1969).

Об эффективности обратимых ингибиторов судили по величине обобщенной ингибиторной константы К^ и ее конкурентной (К i) и бесконкурентной (К^) составляющим. Величины ингибито-рных констант (средние величины из 5-6 определений) вычисляли графически и выражали в виде рК{ = -lg К^ и т.д. По соотношению величин рКг и рК{ определяли тин торможения: конкурентный — 0), смешанный (рК{ > pKf}, неконкурентный (рК{ = рК£) бесконкурентный (рК{ — 0).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Структурные аспекты субстратной специфичности голинзстераз

В табл.1 суммированы кинетические параметры гидролиза субстратов различной структуры (см. Методы) под действием ХЭ тихоокеанского кальмара. Для сравнения приведены данные по гидролизу этих эфиров под действием АХЭ эритроцитов человека и БуХЗ сыворотки крови лошади. В гомологическом ряду холино-вых эфиров от ФХ до ВХ наблюдалось монотонное снижение скорости гидролиза. Величина ас/Км, в определенной мере характеризующая начальную стадию сорбции субстрата, была аномально низкой у ФХ. Функциональные изменения в ацильной цепи: разветвление (ИзоЕХ), введение карбонильной группы (АцАХ) или двойной сеязя (КрХ) такге сопровоздалось резким снижением скорости гидролиза. В случае тиохолиновых производных зависимость скорости гидролиза от структуры ацильной группы как внутри ряда, так и при сравнении с кислородными аналогами была значительно менее выраяенной. Неожиданным оказался эффект р-метильной группы в холиновой части молекулы эфира: АМеХ гидролизовался немногим медленнее, чем АХ, но при этом имел в 25 раз более низкую величину ас/Км, а АТМеХ оказался лучшим из исследованных субстратов ХЭ кальмара, почти в 2 раза превосходя по' скорости гидролиза АТХ и АХ. Замена в молекуле АХ триме тиламмониевой группировки на N-метилпипери-диниевую (АП) сопровождалась почти 4-кратным снижением скорости гидролиза. Среди гидрофобных, несодаркащих катионной группировки субстратов, только ФА гидролизовался в 1.5 раза быстрее, чем АХ, правда при в 10 раз более низкой величине

Таблица 1

Кинетические параметры субстратной специфичности (активность каталитического центра ас,мин-1 ¡отрицательный логарифм константы Михазлиса рКм;ас/Км,!Г1 мин-1 ) холинэстеразы кальмара Т.рас*./1сиз (КХЭ), ацетилхолинэстерззк эритроцитов человека (АХЗ) и бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади (БуХЭ)

Суб- ас <10 4)

стра-

ты КХЭ ахэ БуХЭ КХЭ )ахэ БуХЭ КХЭ | ахэ | БуХЭ

фх 14 <-> 25 12 2.36 2.96 1.77 0.3 2 0.1

ах 11 (+> 38 6.5 4.35 3.82 2.96 20 20 0.6

ПрХ 8.9 (-) 26 13 4.00 3.82 3.00 9 15 10

БХ 7.2 (+) 0 18 4.11 - 3.00 10 0 0.2

ИзоБХ 3.0 (+) 15 6.9 4.62 4.00 3.21 10 15 0.1

АцАХ 2.3 (+) 0 - 4.37 - - 5 0 -

ВХ 0 0 1.9 - - 3.70 0 0 0.1

КрХ 0 0 1.2 - - - 0 0 -

АМеХ 9.2 (+) 10 0.32 2.92 2.92 2.89 0.8 0.8 0.03

АТХ 11 (+) 32 3.8 4.18 4.12 3.70 20 40 2

ПрТХ 10 (-) 18 6.0 4.20 4.11 3.89 15 25 5

БуТХ 9.0 (-) 1.6 8.5 4.09 - 3.77 10 - 5

АТМеХ 19 (-) 21 6.5 3.82 4.22 3.77 15 35 4

ап 2.9 (+) 19 0.30 4.05 3.30 4.40 3 4 0.8

ФА 16 (-) 31 9.0 3.05 3.60 2.44 2 10 0.3

ИФА 1.5 (-) 5.0 0.30 3.38 3.24 3.10 0.4 0.9 0.03

дифа 0.80(-) 4.0 0.90 3.89 3.62 3.80 0.6 2 0.6

ДИКА 0.14<-) 2.1 0.20 З.ТО 3.40 4.00 0.07 0.5 0.2

Примечание : Названия субстратов см. Метода.

Тормозсение избытком субстрата: есть(+), нет(-) ас/Км. Скорость гидролиза индофениловых производных была

существенно ниве.

Таким образом,можно прийти к ряду заключений. Во-первых, ХЭ кальмара Г.pacificus обладает широким спектром субстратной специфичности, напоминая в большей степени БуХЭ, чем АХЗ. Во-вторых, по гидролитической эффективности ХЭ кальмара Т.pacificus занимает промежуточное положение между АХЗ и БуХЭ. В-третьих, ХЭ кальмара T.paciflcua проявляет свойственную АХЗ чувствительность к торможению избытком субстрата, однако это наблюдалось не для всех холиновых эфиров, не говоря уже о гидрофобных субстратах. В-четвертых, у ХЭ кальмара T.pacifions зависимость "структура-активность" для отдельных групп субстратов отличалась иногда от АХЭ, иногда от

БуХЭ, а иногда от них обеих.

Анализ данных табл.2, где впервые изучена груша редко встречающихся представителей семейства Gonattdae, проведен как сравнение кинетических параметров холинзстеразного гидролиза тиохолиновых субстратов. Величины ас для ХЗ кальмаров по отношению к АТХ и ПТХ оказались близкими, в то время как по величине aQ в случае БТХ ХЭ G.ba/realia на порядок превосходила ХЗ G.tinro. Интересно отметить, что сам порядок ве-

Таблица 2

Сравнение кинетических параметров (активность каталитического центра ас-(10л), мин-1; вс/Км-(108), М_1мин"1) гидролиза тиохолиновых субстратов под действием исследованных ХЭ

Источник фермента Параметры Субстраты

АТХ ПТХ БТХ

Todarodes paci/lcua а а°(от) 11 100 20 10 90 15 9 80 10

Berryteuthls maglster а ас(отн) ас°/КМ 8 100 0.4 5 60 0.4 3.5 45 0.5

BerryteutMa anonichos а а°(от) 9 100 5 6.5 75 5 7 во 4

Gorntua kmtschaticua а а°(от) 2 100 0.2 Л 200 0.2 3.5 175 1

Gonatus tlnro а а°(огт) 5 100 0.5 2.5 50 0.2 1 20 0.1

Gonatopsi9 boreal is а а? (от) 9 100 3 8 90 2 11 125 0.5

АХЭ эритроцитов человека а а? (от) ' 32 100 10 18 55 25 1.6 5

БуХЭ сыворотки крови лошади & аг(ат) 4 100 2 6 150 5 8 200 5

личин ас оказался таким же, как и в случае БуХЭ и существенно ниже (для АТХ и 1ГГХ), чем у АХЭ. Вторым количественным показателем является величина отношения ас/Км, которая пропорциональна константе к (схема 1) и в определенной мере отражает сродство субстрата к ферменту .ХЭ кальмаров семейства Gonattdae существенно уступают как ХЭ T.paciflcus, так и ХЭ млекопитающих. Интересную качественную информацию дает соотношение величин а (отн). В случае АХЭ с удлинением зцильного радикала субстрата ас(отн) резко снижалась, а в случае БуХЭ возрастала. В какой-то мере напоминают БуХЭ ферменты G.kam-tschaticus и G.borealIs, а ближе к АХЭ оказались ХЭ G.tlnro и B.magister (хотя, в последнем случае, скорость гидролиза БТХ была лишь в 2 раза ниже, чем АТХ). В то же время ферментативная активность ХЭ T.paciflcus и B.anonich.os практически не зависела ог удлинения ацильного радикала. Это является свидетельством своеобразия свойств ХЭ кальмаров.

Кинетический анализ "защитного эффекта субстрата"

для холинэстераз разного происхождения Согласно А.П.Бресткину (1964) реакция ХЭ с ФОН в присутствии субстрата предполагает взаимодействие ФОИ не только со свободной (Е), но и с ацилированной ХЭ (ES') (схема 1):

Е + 5 ЕБ —К'

+ ТТ Р + <1>

I ~1 1 I

1 к4 Р2 I

Е1 ♦-----------------------------------223'I

Было выведено уравнение (2), позволившее количественно оценить индивидуальные константы скоростей отдельных реакций. к^д.^+Ю!)/^ - к, + а.к^В]/!^ (2)

где'к^ - константа скорости реакции I со свободной ХЭ; а-к5 -величина, пропорциональная константе скорости реакции I с ацилированной ХЭ, а = ^/(к^}^)- Из (2) следует:

^1.3= кл"Км/(Км+[33) + а-^-ИЗ/а^+И]) (3)

При (Б] = (3) принимает вид: а = к^/2 + а-1^/2. Тогда реакция с ацилированной ХЭ (а,Ж): а"= 100'а-к5/(кд+а-к5).

Величина отношения к11 о/к11 3 может быть названа "суммарны* защитным эффектом субстрат'".

При введении ФОИ в реакционную смесь, содержащую ХЭ и субстрат, ингибитор взаимодействует только со свободной ХЭ (СЕ?с), концентрация которой нихе исходной в (К^СБ] )/Км раз. Это и есть "первичный защитный эффект, субстрат", который связан с природой фермента и со структурой субстрата (величина Км), но не должен зависеть от структуры ФОИ.

Чувствительность свободной ХЭ к действию ФОИ оказалась иной (как правило, более низкой: кд < к^ о), чем у ХЭ, не бывшей в контакте с субстратом. Это можно*рассматривать как "вторичный защитный зффеюп субстрат", который связан как с природой фермента, так и со структурами субстрата и ФОИ.

В ряде случаев возможно взаимодействие ФОИ не только со свободной, но и с ацилированной ХЭ,однако эта реакция идет с меньшей скоростью, чем со свободным ферментом (к5 < кд) из-за пространственных затруднений при сорбции. Этот эффект можно назвать "третичным защитным эффектом субстратакоторый также зависит от природы фермента и от строения субстра-

Таблица 3

Влияние структуры субстрата на различные компоненты защитного эффекта при торможении БуХЭ под действием Сз^о (СН3 )Р (о (он2 )2зо2н5

Параметры гидролиза Защитный эффект субстрата

Субстраты Суммарный %1.о/5С11.3 Первичный №м+13]>/км Вторичный Третич-

а *П.ОЛД ный

do4!, мин ' и 13] = 10~2М Е3]/К. =10™ [S]=10-2M а, %

ФХ АХ ПХ БХ ВХ АТХ ПТХ БТХ ФА 12 6.5 10 14 1.9 3.8 6.0 8.5 6.4 17 1.2 1.0 1.0 0.8 1.8 1.3 1.7 4.8 10 12 15 19 9 12 14 3 1.5 10 12 15 11 8 12 14 9 11 11 13 7 9 7 3 1.5 2 3 3 2.5 3.5 4 1 17 8.5 0 0 10 7 2.5 0

та и ФОИ.

Анализ данных табл.3 позволяет заключить: 1) Не обнаружено корреляции мевду параметрами ферментативного гидролиза и защитного эффекта исследованных субстратов. 2) Суммарный защитный эффект при одинаковой концентрации субстрата (tS]=10"2M) возрастал в ряду АХ < ИХ < БХ < ВХ, а при одинаковой степени насыщения фермента субстратом ([S]/1^=10) эта зависимость была несколько иной: АХ < ПХ < БХ > ВХ. 3)В случае одинаковой степени насыщения фермента субстратом (iSJ/KM=10) величина первичного защитного эффекта должна быть равной 11, что не соответствует полученным экспериментальным данным. 4) Вторичный защитный эффект имел тенденцию к возрастанию по мере удлинения ацильного радикала как у холиновых, так и у тиохолиновых субстратов АХ < ПХ < БХ = ВХ и АТХ < ПТХ < БТХ. 5) Третичный защитный эффект у холиновых субстратов снижался АХ > ПХ и отсутствовал у БХ и ВХ. Для тиохолиновых субстратов снижение наблюдалось во всем ряду АТХ > ПТХ > БТХ. 6) Для формоилхолина (ФХ) не удалось выявить суммарный защитный эффект. 7) Фенилацетат (ФА) проявил

Таблица 4

Влияние природы фермента на разные компоненты защитного эффекта (ФОИ - C^OiCHgJPiOJSCCH^SCgHj.)

Ферменты Субстраты Параметры Защитный эффект субстрата

¿ЗД^А мин 1 V юМ Суммарный ^IX.S Первичный Vtsi *м Вторичный . *11.о V Третичный а, %

CS3 % =1 [S3 =10 {33 =1 n

АХ 6.5 1.2 5 10 2 11 3.5 22

БуХБ ПХ 10 1.0 6 15 2 11 3.5 14

НС 14 1.0 7 25 2 11 4.5 5.5

AY4 АХ 30 0.1 14 30 2 11 8 14

АЛО ПХ 22 0.1 12 25 2 11 7.5 20

АХ 11 0.06 55 80 2 11 25 20

нхэ ПХ 9 0.11 25 55 2 11 8 б

БХ 7 0.08 20 70 2 11 5.5 0

небольшой суммарный защитный эффект, который, видимо, полностью реализуется как первичный эффект.

На основе анализа данных табл.4 можно заключить: 1) Суммарный защитный эффект изученных субстратов как при высоких, так и при низких концентрациях существенно зависел от природы фермента: он был наибольшим у ХЗ кальмара, ниже у АХЭ и наименьшим у БуХЭ. 2) Суммарный защитный эффект был разным у различных ферментов в зависимости от структуры субстрата: для БуХЭ - АХ > ПХ > БХ и для АХЭ - АХ > ПХ вне зависимости от концентрации субстрата, а для ХЭ кальмара эффект зависел от концентрации субстрата: при низких АХ > ПХ > БХ, при высоких - АХ > БХ > ИХ. 3) Первичный защитный эффект при одинаковой степени насыщения фермента субстратом (ЕБ]/]!^) также величина постоянная. Во всех случаях первичный защитный эффект был ниже (а в случае ХЭ кальмара существенно ниже) суммарного эффекта. 4) Вторичный защитный эффект для ХЭ кальмара снижался в ряду АХ»ПХ>БХ (АХвЗ раза превосходил ПХ); у БуХЭ и АХЭ он практически не зависел от структуры субстрата. Следует отметить, что АХ снижал чувствительность ХЭ кальмара по отношению к ФОЛ в 25 раз (!). 5) Третичный защитный эффект у различных ферментов по-разному зависел от структуры субстрата: для БуХЭ и ХЭ кальмара коэффициент "сГ снижался в ряду АХ > ПХ > БХ, причем для ХЭ кальмара в присутствии БХ ФОИ не взаимодействовал с актированной ХЭ; для АХЭ "а" для АХ был выше, чем для ПХ.

Влияние структура субстрата на иехавизк обратного торможения

холинэстераз разного происхождения

Обратимый ингибитор (I) ХЭ может взаимодействовать не только со свободным (Е), но и с ацилированным ферментом (Е5*) согласно схеме (4): ■

к1 ^

Е + Б » ЕЗ -—*- ЕЗ' -»• Е + Рэ ,

+ ТГ7 чр + 2

I -1 I <4>

Ч П

Е1 ЕБЧ

где ЕБ - сорбционный фермент-субстратный: комплекс Михаэлиса,

Ш и Е3'1 - сорбционные фермент-ингибиторный и ацилфермент-ингибиторный комплексы. Скорость (у^) холинэстеразного гидролиза субстратов (Б) в присутствии обратимого ингибитора (I) выражается уравнением (5):

У1 = V- [Б1 / {%•( 1 + Ш/^) + [БЫ1 + СП/Яр), (5) где V - максимальная скорость реакции; К^ - константа Михаэ-лиса; К1 и А^ - конкурентная и бесконкурентная ингибиторяые константы, = + кз)/^,. При СБ] = К^ уравнение

(5) принимает вид:'

= V / 12 + [13(1/^ + иГ±)} = V / (2 + Ш/^) (6)

где 1/Я1=1/Й1+1/Л|. Обобщенная ингибиторная константа 11 предложена А.П.Брвсткшш для сравнительной оценки антиферментной эффективности обратимых ингибиторов, проявляющих разный тип торможения. Если СБ] = К^, то 7 = 2-уо (уо - скорость холинэстеразного гидролиза субстрата в отсутствие обратимого ингибитора), и уравнение (6) после несложных преоб-

Таблица 5

Формулы и названия обратимых ингибиторов

Сокращения

Формула

Название

I N(0^)^-1 ■ Тетраметиламмониййодид

II {Г(С21^)д-1 Тетраэтиламмониййодид

III (СН3)3НС5^СНг0Н -I Холинйодвд

а,№=Бис (триметиламмониометил )олигодиметилсилоксандихлорида

I?

V

VI

VII

VIII

IX

X

XI

(СН3 )3ЖШ251(СН3 )2031 (СН3 )2СНгй(СН3 )3 -2С1"

(СН3)3ЫСН2(СН3)г0]3Б1(СН3)2СН2К(СН3)3.201"

+/снг 1 Бензимидазолиниййодид

сн/ чсн3

Соли бензимвдазолия

= н; вг = ког; x = i"

= с6н5; Й2 = Н: х = сю;

№

= = н; х = сюл

= сн3: пг = н; x = с] = н! = x = i"

разований принимает вид (7): й± = [11/2-(УоА1 - 1) (7) Необходимые для расчета значения уо и определяются из зависимости 1/у от 1ЛБ]. Видимо, существенную роль должна играть природа исследуемых ферментов, субстратов и ингибиторов.

Таблица 6

Торможение моноаммониевыми соединениями гидролиза различных субстратов под действием холинэстераз разного происхождения

Ингибиторы

Ферменты

Суб-ст-ра-ты

II

III

Параметры ингибировашя

Р*1

Рк1

рК!

Р*±

р!'

Р*±

рЯ±

АХ БХ АТХ ФА ИФА

_____Ш1

АХ АТХ ФА.

АХ БуХ АТХ ФА

ИЖД

ДЙФА

КХЭ

АХЭ

БуХЗ

2.88 2.40 2.24 2.92 2.90 .3^00

3.49 3.58

3.50

3.10

2.51 2.44 3.33 3.10 3.20

2.88 2.40 2.24 2.92 2.38 2.56

3.49

3.32

3.50

3.10

2.51 2.44

3.33 2.90 2.87

2.75

2.89

1.90

3.00 3.00

2.96 2.36 2.60 2.92

3.59 3.40 3.88

3.24 2.68 2.72 3.20

2.96 2.36 2.60 2.92

3.59 3.12 3.88

3.24 2.49 2.72 3.08

2.05

1.78 1.90

3.64 2.64

3.59 3.14

2.96

3.70

4.26

3.38 2.74

2.80 3.26 3.34

3.51 2.42

3.14 2.81 2.51

3.54

4„00

3.38 2.63

2.44 3.00 3.10

1.48 1.88

2.43 3.00 2-88

2.43 2^55

1.55

2.65 3.15 3.18

Т

Т

Т

Примечание: р21, рй1Г рК^ - отрицательные логарифмы величин

обобщенной ингибиторкой константы и ее конкурентной и бесконкурентной составляющих; Т - тип торможения: К- конкурентный; С - смешанный; Н - неконкурентный. Формулы субстратов (табл. 1) КХЭ - ХЭ тихоокеанского кальмара, Т. рас1/1сиа.

В табл.6 проанализирован механизм обратимого торможения различных ХЗ моноониевыми ингибиторами (структуру см. табл.5). При взаимодействии с БуХЭ 1-111 при конкурентно-смешанном характере торможения гидролиза холиновых субстратов были неконкурентными ингибиторами гидролиза гидрофобных субстратов (ФА, ИФА, ДЙФА). Практически идентично БуХЭ вела себя ХЭ тихоокеанского кальмара: I и III были неконкурентными ингибиторами процесса гидролиза ИФА и ДОМ, в то время,

как при гидролизе остальных субстратов I - III были ингибиторами конкурентно-смешанного типа действия. АХЗ проявила к I - III, которые также были ингибиторами конкурентно-смешанного типа действия, более высокую чувствительность.

Таблица 7

Торможение бисаммониевыми соединениями холинэстераз разного происхождения (субстраты - ацетилтиохолин и бутирилтиохолин)

I Субстраты |

Фер- Инги- Ацетилтиохолин Бутирилтиохолин

менты бито- Па] эаметры ингибирования

ры рKl TT ря1 рй 1 TT

"юж. -кхэ IV V 3.71 4.75 3.66 4.57 3.00 4.28 С Н 2.66 3.36 2.53 3.06 2.56 3.25 Н Н

д "за- та- IV V 3.52 5.54 3.50 5.45 2.05 4.71 С с 2.50 4.32 2.18 4.00 2.39 4.26 Н Н

Тег "вос-ш точные" IV V 3.68 5.12 3.57 5.00 2.64 4.36 с с 2.87 4.10 2.55 3.78 2.45 4.07 Н Н

КХЭ Т.ра-сШ5У§___ IV V 4.00 4.92 3.65 4.77 3.44 4.39 Н Н 2.59 3.40 2.03 3.00 2.47 3.35 Н н

АХЭ IV V 3.92 5.34 3.92 5.34 - К К -

БуХЭ IV V 5.64 7.77 5.17 7.34 5.46 7.55 н н 4.94 6.98 4.36 6.39 4.78 6.78 н н

В табл.7 тестированы бисаммониевые ингибиторы (IV и V), которые при торможении гидролиза АТХ, проявили по отношению к изученным ХЭ практически весь спектр типов тормозящего действия. Во всех случаях V по антихолинэстеразной эффективности был более сильным ингибитором, чем IV. Однако степень превосходства зависела ог природа фермента: для БуХЭ и ХЭ "западных" особей кальмара B.magister это различие было 100-кратным, в остальных случаях - 10-30-кратным. При гидролизе БуТХ IV и V оказались неконкурентными ингибиторами, но менее эффективными, чем в случае гидролиза АТХ, причем это в определенной степени также зависело от природы фермента, что коррелирует с данными табл.6, где наблюдалось снижение эффективности ингибиторов I - III при ферментативном гидролизе

БХ по сравнению с гидролизом АХ.

Согласно современным представлениям, наличие в структуре АХ локализованного триметиламмониевого катиона обеспечивает большую скорость прохождения молекулы эффектора в полости активного центра АХЭ, причем ось этой полости совпадает с осью электрического поля фермента. Для выяснения влияния делокализации заряда впервые в качестве обратимых ингибиторов ХЭ различного происхождения исследованы специально синтезированные соли бензимидазолиния (VI) и беизимидазолия [(VII)-(XI)]. Наиболее близким к аммониевым ионам с локализованными катионами является соединение (VI), содержащее не ароматический имидазолиновый цикл. Для остальных соединений (VII-XI) характерна делокализация положительного заряда по всей ароматической бензимидазольной системе. Можно с известной долей вероятности предположить, что делокализация тем больше, чем меньше электрофильность катиона, и тогда степень делокализации положительного заряда в молекуле снижалась в ряду: (VII)—.(VIII)—>(П),(Х)—>(Х1).

Как видно из табл.8, только в случае АХЭ (вне зависимости от структуры субстрата) уменьшение антиферментной эффективности было симбагно снижению степени делокализации-положительного заряда в молекуле ингибитора. Причем такая зависимость наблюдалась как для интегрированной величины

эффективности (рК{), так и в случае сравнения величин бесконкурентной ингибиторной константы рК(. По отношению к БуХЭ можно отметить определенное преимущество ароматической структуры ингибиторов I (VII)-(XI)] перед неароматической (VI), причем этот эффект также не зависел от природы субстрата (в случае 1ТГХ общий уровень ингибиторной активности, как и случае АХЭ, был ниже). Вызывает удивление, что введение в молекулу ингибитора еще одной арильной группировки (VIII) не сказалось на его анти-БуХЭ эффективности. Чувствительность ХЭ ганглиев тихоокеанского кальмара к исследованным соединениям в присутствии АТХ была в 25-40 раз ниже, чем у АХЭ и практически не зависела от степени делокализации заряда в молекуле ингибитора. А вот при переходе к ПТХ уменьшение антиферментной эффективности было симбатно снижению степени

Таблица 8

Ингибирование производными бензимидазолия (см. табл.5) гидролиза ацетилтиохолина (АТХ) и пропионилтиохолина (ПТХ) под действием холинэстераз различного происхождения

Ферменты Субстраты Параметры Ингибитор

VI VII VIII П X XI

КХЭ Г.ра- АТХ РК4 3.62 3.59 2.36 С 3.96 3.92 2.89 С 4.24 4.21 3.15 0 3.89 3.85 2.80 С 3.74 3.70 2.77 С 3.68 3.66 2.59 С

cifi-сиз ПТХ рк£ ^¡гр 1 3.51 3.43 3.40 Н 3.80 3.70 3.68 Н 3.55 3.47 3.45 Н 3.39 3.25 3.21 Н 3.33 3.26 3.20 Н 3.17 3.06 3.00 Н

АХЭ АТХ Рк£ ^/р i 4.85 4.57 4.55 Н 5.55 5.26 ___Б_ 4.85 4.57 __Б_ 4.49 4.28 4.10 ___Н_ 4.48 4.19 ___Б_ 4.05 3.89 Б

ПТХ рк< 4.23 3.01 4.05 Н-Б 4.95 4.76 Б 4.15 4.02 Б 4.01 3.17 3.90 Н-Б 3.88 3.65 Б 3.60 3.47 Б

БуХЭ АТХ рК, ТТ( | 3.72 3.60 3.12 С 4.08 3.80 Б 4.66 4.34 Б 4.26 4.01 3.89 Н 5.17 4.89 Б 4.64 4.35 Б

ПТХ рК, | ?Т( I 3.11 3.00 3.02 Н 3.43 3.30 Б 4.02 3.94 Б 3.66 3.22 3.54, Н-Б 4.60 4.49 Б 3.94 3.79 Б

делокализации положительного заряда в молекуле ингибитора (подобно АХЗ). Таким образом, присутствие другого субстрата качественно изменило характер зависимости. Следует учесть уникальность этого ряда ингибиторов: здесь с изменением структуре меняется степень электростатического взаимодействия с активной поверхностью фермента. Это позволяет трактовать полученные данные с кошлендовских позиций влияния субстрата на конформацшо активного центра фермента.

Так были впервые обнаружены специфические для каадой из исследованных ХЭ влияния природы субстратов на характер процесса обратимого торможения ферментов животных, стоящих на

разных ступенях эволюционного развития.

вывода

1. Предложена расширенная концепция субстратной специфичности холкнэстераз, включающая, кроме общепринятой зависимости активности фермента от структуры субстрата, влияние строения субстратов на механизм обратимого торможения разных холинэс-тераз под действием ониевых ингибиторов, а также "защитную роль" различных субстратов в процессе необратимого угнетения холинэстераз фосфорорганическими ингибиторами.

2. Проведен кинетический анализ влияния структуры 18-ти различных субстратов (эфиры холина, тиохолина и аммониевых гетероциклических соединений, ацетаты фенола и производных индофенолов) на величины кинетических параметров процесса ферментативного гидролиза под действием холинэстеразы зрительных ганглиев тихоокеанского кальмара ТобагсхЗез рас1/1сиз. Выявлены элементы сходства и существенных отличий от ацетил-холинэстеразы эритроцитов человека и бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади, тем самым подтверждено представление о своеобразии свойств фермента тихоокеанского кальмара.

3. При исследовании структурных аспектов субстратной специфичности у 5 видов кальмаров семейства СопаИсЬе, входящих в 3 рода : Beггt/íeuíЛíз ífl.шgísíeг и В.апапЮъоз), Сопа№ (О.&тЛасЬаХьсиз и О.Ипго) и Сста№рз1з (О.оогеаНз), выявлены межвидовые различия в сем. Сопаийае, которые могут быть рекомендованы в качестве теста для сравнительно-энзимологического метода определения таксономической идентификации головоногих моллюсков.

4. Ныла логически уточнена разработанная А.П.Бресткиным кинетическая схема "защитного эффекта субстрата" - снижение антихолинэстеразной эффективности фосфорорганических ингибиторов в присутствии субстрата. Влияние строения субстрата на реакционную способность холинэстераз существенно зависело от природы фермента и структуры ингибитора. Холинэстераза тихоокеанского кальмара оказалась наиболее ковформационно лабильной под воздействием субстратов.

5. Впервые проведенное кинетическое исследование роли субстратов в механизме процесса обратимого антихолинэстеразного

действия показало, что разная структура субстрата приводит как к количественным (величины ингибиторных констант), так и к качественным (тип тормозящего действия) изменениям. 6. Исследование обратимого торможения разных холинэстераз под действием специально синтезированной группы производных бензимидазолия с делокализованным зарядом в присутствии различных субстратов выявило существенные различия между ферментами, причем и здесь проявилось своеобразие свойсте хо-линэстеразы тихоокеанского кальмара.

Публикации по материалам диссертации

1. Видовые различия в субстратной специфичности холинэстераз дальневосточных кальмаров семейства Ganatiäae // ДАН. 1995. Т.342. Jfö. С.703-704 (соавторы А.Е.Хованских И др.).

2. Различные аспекты субстратной специфичности холинэстеразн зрительных ганглиев тихоокеанского кальмара Гodarodea рас ifi-сиз // Ж. эволюц. биохим. и физиол. 1996. Т.32. №4. с.384-392 (соавторы А.Е.Хованских и др.).

3. Новые ингибиторы ферментов обмена нейромедиаторов холи-нергической и моноаминергической систем // IV International symposium on comparative electrocardiology. 1997. Syktyvkar, Komi, Russia. Сравнительная электрокардиология-97. Сыктывкар. 1997. С.110-111 (соавторы А.Е.Хованских и др.).

4. Comparative studies oí the enzymes of neuromediator metabolism in cholinergic and monoaminergic systems oí squids and mammals // XXXIII Intern. Congress oí Physiol. Sei. St.Petersburg. 1997. P.072.12 (соавторы А.Е.Хованских и др.).

5. Взаимодействие холинэстеразн особей командорского кальмара Berryteuthia mgister из разных зон ареала обитания с они-евыми обратимыми ингибиторами // Ж. эволщ. биохим. и физиол. 1997. т.33. Jí 3. с.371-382 (соавторы А.Е.Хованских и др.).

6. Производные бензимидазолия с делокализованным зарядом в катионной группировке в качестве обратимых ингибиторов холинэстераз различного происхождения // ДАН 1997. Т.355. Jí 1. С. 123-125 (соавторы Е.В.Розенгарт и М.З.Гиршович).

7. Защитный эффект субстрата: действие различных по структуре фосфорорганических ингибиторов на холинэстеразы разных

животных в присутствии различных субстратов // ДАН 2000. Т.370. ЖЗ. С.399-402. (соавторы А.Е.Хованских и др.). 8. Кинетический анализ "защитного эффекта субстрата" для холинэстераз разного происхождения // Ж. эволюц. биохим. и физиол.2000.Т.36.С.97-101.(соавторы А.Е.Хованских и др.).