Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная оценка биологической дозиметрии на основе анализа стабильных и нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная оценка биологической дозиметрии на основе анализа стабильных и нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека"

На правах рукописи

ШЕПЁЛЬ Наталья Николаевна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА РЕТРОСПЕКТИВНОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ДОЗИМЕТРИИ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА СТАБИЛЬНЫХ И НЕСТАБИЛЬНЫХ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

03.00.01 - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□345660Э

Обнинск • 2008

003456609

Работа выполнена в лаборатории радиационной щггогенетики Государственного учреждения - Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук.

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор Севанькаев Александр Васильевич Кандидат физико-математических наук Хвостунов Игорь Константинович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Спирин Евгений Викторович Кандидат биологических наук Антощина Маргарита Михайловна

Ведущая организация:

ФГУ - Российский научный центр рентгенорадиологии Росмедгехнологий

Защита диссертации состоится 09 декабря 2008 г. в II00 часов на заседании совета

Д 001.011.01 при Государственном учреждении - Медицинский радиологический научный центр РАМН по адресу: 249036, Калужская область, город Обнинск, ул. Королева, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ - Медицинский радиологический научный центр РАМН.

Автореферат разослан « б » ноября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Палыга Г.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В настоящее время ионизирующие излучения находят широкое применение в энергетике, промышленности, медицине. При этом, в аварийных ситуациях, нередко имеют место случаи переоблучения людей. Как показывает пример Чернобыльской катастрофы, не всегда удается установить дозы облучения у пострадавших лиц методами физической дозиметрии. Поэтому актуальной проблемой является разработка надежных методов биологической дозиметрии. В настоящее время детально разработано применение анализа нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека в целях биологической дозиметрии острого, часто неконтролируемого облучения. Однако в отдаленные сроки после облучения в связи с элиминацией клеток, несущих нестабильные аберрации, определение доз по данному типу аберраций может быть неточным, как правило, заниженным. Наиболее перспективным для этих целей является анализ стабильных аберраций (транслокаций), определяемых методом флюоресцентной in situ гибридизации (FISH), поскольку данный тип аберраций длительное время сохраняется в клетках крови человека. Так, у лиц, переживших атомную бомбардировку в Хиросиме и Нагасаки, средняя частота стабильных аберраций практически не изменялась с течением времени и сохранялась на повышенном уровне при повторных обследованиях (Awa A.A., 1975).

К настоящему времени за рубежом разработан и успешно применяется ряд методов оценки доз в отдаленный период после облучения, основным из которых является цитогенетический метод - анализ стабильных хромосомных аберраций (транслокаций) в лимфоцитах периферической крови с помощью FISH-метода. Вместе с тем, временн'ые и дозовые границы метода биологической дозиметрии, основанного на анализе частоты стабильных аберраций хромосом, остаются предметом интенсивных научных исследований. Одна из основных проблем на этом пути - выбор адекватной калибровочной зависимости измеряемой частоты стабильных аберраций в отдаленном периоде от величины индивидуальной поглощенной дозы. Богатый опыт, накопленный при использовании нестабильных хромосомных аберраций, измеряемых непосредственно после облучения в остром периоде для оценки поглощенной дозы, оказывается неприменим для ретроспективной биологической дозиметрии в отдаленном периоде. Причина заключается в различных механизмах формирования аберраций хромосом, которые приводят к существенным отличиям в дозовых зависимостях для стабильных и нестабильных аберраций. В этом аспекте проблемы исключительную ценность приобретают прямые долговременные наблюдения динамики как нестабильных, так и стабильных аберраций хромосом у лиц, подвергшихся острому аварийному облучению в различных дозах.

Помимо цитогенетического метода в нашей стране изначально получил развитие метод биологической дозиметрии, основанный на изменении динамики форменных элементов периферической крови в острый пострадиационный

период (Пяткин E.K. и др., 1980). Первоначально данный метод был разработан для условий острого равномерного у-облучения всего тела человека. Позднее, на основе анализа клинических наблюдений за пострадавшими в аварии на Чернобыльской АЭС, были внесены определенные поправки для учета изменения динамики гематологических показателей в отдаленный период (Нугис В.Ю., 2003; Пяткин Е.К. и др., 1990). Кроме того, для ретроспективной дозиметрии применяется метод ЭПР-спектроскопии образцов эмали зуба человека

Сопоставление результатов перечисленных методов, полученных в совместных исследованиях, было использовано в работе Sevan'kaev А. V. et al., 2006 для уточнения возможностей цитогенетического метода. Развитию и совершенствованию цитогенетического метода ретроспективной биодозиметрии на основе учета стабильных аберраций хромосом человека путем анализа результатов долговременного наблюдения группы лиц с острым облучением посвящено настоящее исследование.

Цель исследования. Сравнительная оценка использования анализа стабильных и нестабильных аберраций хромосом в лимфоцитах крови лиц, подвергшихся аварийному облучению, для определения поглощенных доз в отдаленный период.

Задачи исследования.

1. Выполнить экспериментальное исследование с облучением in vitro донорской крови у-источником 60Со для построения калибровочной дозовой зависимости выхода стабильных и нестабильных радиационно-индуцированных хромосомных аберраций.

2. Сформировать группу лиц с острым аварийным облучением и известными индивидуальными дозами, осуществить забор крови для культивирования лимфоцитов и последующего цитогенетического анализа в течение отдаленного периода (от 5 до 30 лет после облучения).

3. Провести статистический анализ динамики частоты нестабильных аберраций в течение отдаленного периода.

4. Рассчитать индивидуальные дозы облучения для лиц из сформированной группы на основе анализа частоты нестабильных хромосомных аберраций, наблюдаемых в лимфоцитах крови как вскоре после облучения, так и в отдаленный период после облучения.

5. Сопоставить расчеты доз, полученные по ранним и поздним цитогенетиче-ским данным с целью совершенствования метода ретроспективной биологической дозиметрии, основанной на анализе частоты стабильных аберраций (транслокаций), определяемых методом FISH.

6. Провести сравнительную оценку ретроспективной биологической дозиметрии на основе анализа выявляемых аберраций в наблюдаемой группе аварийно облученных лиц.

Научная новизна. Впервые получены данные о динамике частот нестабильных и стабильных аберраций хромосом у людей, подвергшихся аварийному облучению в различных дозах и проходящих регулярное клинико-цитогенетическое обследование за период наблюдения более 30 лет.

Установлено, что, несмотря на длительный период времени после радиационного воздействия, в лимфоцитах крови облученных лиц присутствуют нестабильные аберрации хромосом (дицентрики и центрические кольца). Частота данных аберраций существенно превышает спонтанный уровень, что позволяет использовать их для ретроспективной биоиндикации радиационного воздействия в период до 30 лет (в нашем случае) после облучения.

Показано, что в лимфоцитах периферической крови облученных лиц в отдаленный пострадиационный период наблюдается высокая частота стабильных аберраций (транслокаций), уровень которых значительно превышает уровень наблюдаемых нестабильных аберраций. Повышенная частота стабильных аберраций (транслокаций) в обследованной группе количественно соответствует степени тяжести перенесенного радиационного поражения, что позволяет использовать данный тип аберраций для ретроспективной оценки дозы и степени тяжести радиационного поражения. Полученные данные по частоте транслокаций позволили провести корректировку в зависимости от времени и уточнение формы дозовой зависимости выхода транслокаций при облучении in vivo.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Частота нестабильных аберраций хромосом (дицентриков и центрических колец) в лимфоцитах периферической крови лиц, облучившихся в диапазоне доз 0,5-10 Гр с высокой мощностью дозы, сохраняется в течение длительного времени (до 30 лет в нашем случае) на уровне, превышающем спонтанный, что позволяет использовать их для ретроспективной биоиндикации радиационного воздействия.

2. При этом частота стабильных аберраций (транслокаций) превышает не только спонтанный уровень, но и наблюдаемый уровень нестабильных аберраций, и по истечении 5-8 лет после облучения не зависит от времени, но зависит от начальной дозы, что позволяет использовать частоту транслокаций для индивидуальной ретроспективной биологической дозиметрии.

3.Дозовая зависимость транслокаций, полученная в опытах in vitro, существенно отличается от наблюдаемой аналогичной зависимости в группе облученных лиц (in vivó), что исключает использование данных при облучении in vitro в качестве калибровочной кривой.

Практическая значимость. Впервые на представительной группе лиц показано, что транслокации, наблюдаемые в отдаленный период после облучения, являются достоверными радиационными маркерами, а их сравнительно высокий уровень и соответствие степени тяжести радиационного поражения, т. с. полученным дозам облучения, позволяет использовать их для ретроспектив-

ной биологической дозиметрии острого облучения в диапазоне доз от 0,5 до 10 Гр.

Принимая во внимание определяющую роль транслокаций в онкогенезе, в частности, в развитии гемобластозов, наблюдаемый у обследованных лиц повышенный их уровень позволяет с определенной вероятностью оценивать риски развития онкологических заболеваний в отдаленный пострадиационный период. В целом, полученные новые данные послужат уточнению разрабатываемого метода ретроспективной биологической дозиметрии, а также позволят выявлять лиц с повышенным уровнем стабильных аберраций и на их основе выделять группы повышенного канцерогенного риска, в частности, гемобластозов.

Апробация диссертации. Основные результаты диссертационной работы были представлены и докладывались на Международной конференции «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков» (Москва, 2000), научно-практической конференции «Наследие Чернобыля», (Калуга, 2001), Международной конференции «Чернобыльские чтения-2008» (Гомель, 2008).

Апробация диссертации состоялась на научной конференции экспериментального радиологического сектора ГУ-МРНЦ РАМН 18.09.2008 г. (протокол № 232)

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 8 публикациях: 3 статьях, 5 тезисах докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста, включая 11 таблиц и 13 рисунков, и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Список литературы включает 118 наименований, из них 49 отечественных и 69 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследованные группы.

Объектом исследования служили образцы крови участников ЛПА ЧАЭС (10 чел.), которым проводилось цитогенетическое обследование с 1986 г. и регулярно проходящих клинико-цитогенетическое обследование при ежегодном диспансерном обследовании в 6-ой клинической больнице ФГУ ФМБЦ им. А.И.Бурназяна ФМБА России (Москва), а также индивидуально облученные лица в результате различных радиационных инцидентов (7 чел.) и участники испытаний ядерного оружия на Новой Земле (5 чел.). На каждого человека было выполнено от 1 до 15 последовательных цитогенетических анализов. Для выявления частоты структурных мутаций проведено культивирование образцов крови, приготовление препаратов хромосом, окрашивание их рутинным методом и ме-

тодом FISH с последующим анализом на световом и флюоресцентном микроскопах.

Методы регистрации аберраций хромосом в лимфоцитах крови чела-

века.

Культивирование лимфоцитов периферической крови проводили по стандартной методике, рекомендуемой МАГАТЭ (IAEA, 2002).

Анализ нестабильных аберраций проводили при стандартной окраске препаратов по Гимза. Анализировали аберрации хромосомного типа - ацентрические фрагменты, центрические кольца и дицентрики. На каждого обследуемого анализировали, как правило, по 1000 метафаз.

При анализе стабильных аберраций хромосом методом FISH использовали прямомеченные ДНК-пробы для хромосом 2, 3 и 8 и непрямомеченные ДНК-пробы (Опсог) для хромосом 2,4 и 12 (Севанькаев А. В. и др., 2004). Препараты хромосом анализировали на флюоресцентном микроскопе. На каждого обследуемого анализировали от 833 до 3542 метафаз. Согласно данным (Захаров А. Ф., 1982), суммарное содержание ДНК в хромосомах составляет: (1) хромосомы 2, 3, 8, доля генома 19.4% , (2) хромосомы 2, 4, 12, доля генома 18.8%, (3) хромосомы 2, 3, 5, доля генома 20.7%.

Методы статистической обработки результатов.

При статистической обработке полученных результатов применялись стандартные методы статистического анализа (Бейли Н., 1964). При этом использовали пакеты прикладных программ Statistica 6.0 и Origin 6.0. В качестве критерия значимости для проверки гипотезы о равенстве средних показателей исследуемой и контрольной групп использовалась Z-статистика, без дополнительных предположений о дисперсиях исследуемых распределений. Средние величины рассчитывали как частоты хромосомных нарушений на 100 метафаз по группе, а стандартная ошибка среднего - по теореме о взвешенной дисперсии среднего с учетом числа проанализированных метафаз. Стандартная ошибка индивидуальных показателей рассчитывалась в предположении пуассонов-ского распределения аберраций по клеткам. Соответствие распределений аберраций по клеткам распределению Пуассона проверялось с помощью U-критерия (Edwards A.A. et al., 1979). Для получения интервальных оценок дозы использовалась методика, рекомендованная МАГАТЭ (IAEA, 2002), которая основана на учете 95%-ных доверительных интервалов как для индивидуальной ошибки единичного измерения, так и для зоны регрессии среднего хода регрессионной зависимости. Интервальные оценки доз по методу Qdr были выполнены в соответствии с методикой (Salassidis К. et al.,1998.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Иссчедование стабильных и нестабильных аберраций in vitro.

Для исследования выхода нестабильных и стабильных хромосомных аберраций в зависимости от дозы была использована венозная кровь 4-х здоровых

доноров в возрасте от 29 до 37 лет. Гепаринизированные образцы крови были облучены при комнатной температуре источником у-излучения ^Со (мощность дозы 0,56 Гр/мин.). Облучение проводили в диапазоне доз от 0 до 4 Гр. Из полученных образцов готовили препараты для методики стандартного окрашивания хромосом и для метода FISH. Для каждого донора анализировали от 300 до 1500 клеток в зависимости от дозы. На рис. 1 представлена дозовая зависимость in vitro частоты дицептриков на 100 клеток при стандартной окраске хромосом.

140 120 100 80 60 40 20

-Калибровка

---95 % интервал

• Собственные данны^Т -МАГАТЭ, 2001

2 3 4 5

Доза, Гр.

Рис.1. Зависимость частоты дицентриков от дозы in vitro при стандартной окраске хромосом. Пунктирной линией изображен 95% доверительный интервал.

Для сравнения, на этом же рисунке приведена дозовая кривая, рекомендуемая МАГАТЭ для биодозиметрии. Хорошее согласие с международными рекомендациями гарантировало достоверность расчетов дозы в настоящем исследовании. Уравнение полученной регрессии имеет вид:

Y = C+aD+PD', где Y- выход дицентриков на 100 клеток, С - спонтанный уровень дицентриков, D- доза облучения, Гр. Коэффициенты уравнения регрессии: С=0,02±0,02 , а=4,02±0,15 ; р=3,08±0,30

Поскольку максимальная доза облучения в исследовании in vitro не превышала 4 Гр, а в обследованной группе максимальная доза была 8,7 Гр, полученные данные были экстраполированы на больший диапазон ( до 8 Гр) с помощью полученного уравнения регрессии. Метод Qdr.

По методу Qdr доза оценивается по количеству числа дицентриков и центрических колец на клетку, содержащую, по крайней мере, одну нестабильную аберрацию. Параметр Qdr рассчитывали по формуле, предложенной Sasaki

(IAEA, 2002): Qdr=Ydr /(l-exp(-Ydr - Yacc)), где Ydr-частота дицентриков и центрических колец, Уасс-частота ацентрических фрагментов. Эти параметры представлены зависимостью «доза-эффект» in vitro со следующими уравнениями регрессии:

Yiir =(0,02±0,02)+(3,61±0,38) D+(4,17±0,22) D2;

Уасе =(0,34+0,01)+(1,69±0,07) D+(l,70±0,03) D2, где D - доза облучения. На рис. 2 приводится дозовая зависимость Qdr. Пунктирной линией обозначен 95 % доверительный интервал. Как видно из рис.2, в области доз менее 1 Гр зависимость резко изменяется: значительное увеличение частоты аберраций хромосом не приводит к существенному изменению величины дозы, что может приводить к большим погрешностям в оценке доз в диапазоне до 1 Гр.

Доза, Гр

Рис.2. Зависимость частоты дицентриков и центрических колец от дозы in vitro. Пунктирной линией обозначен 95% доверительный интервал.

Данные FISH-анализа.

При окраске препаратов по методу FISH использовали молекулярные зонды к хромосомам 2, 3 и 8. Частота полных транслокаций в контроле составила 0,65±0,50 на 100 клеток на геном, частота всех транслокаций составила 0,74±0,5 на 100 клеток на геном. Оценив частоту транслокаций, в образовании которых

участвуют окрашенные пары хромосом, определяли частоту транслокаций на

р

геном по формуле, предложенной Lukas J.N. и соавт. (1992): Fe = р —— ,

2,05* fp •( I — tp)

где Fg - частота транслокаций на весь геном; Fp - частота обнаруженных

транслокаций с участием трех окрашенных хромосом; fp - доля генома, включенная в анализ. На рис. 3 приведена дозовая зависимость транслокаций, после облучения in vitro при анализе методом FISH (частота суммы полных и неполных транслокаций на 100 клеток на геном и дицентриков, наблюдаемых при стандартной окраске хромосом. Из рис. 3 видно, что частоты дицентриков и транслокаций in vitro не показали значимых отличий, что согласуется с теоретическими представлениями об одинаковой частоте их 06pa30Banm(Lucas J.N., 1996).

юоо

100

10,

0.1

- Полные +неполные транслокации, метод FISH

- 9- Дицентрики, стандартный метод J8

я'

Л

0,1

Рис. 3. Дозовые зависимости частоты дицентриков и транслокаций (полных и неполных), определяемых при стандартной окраске и методом FISH, соответственно.

Доза, Гр

ю

Анализ аберраций стандартно окрашенных хромосом j' исследуемых групп лиц.

Объектом исследования являлась группа из 22 человек, подвергшихся острому, неконтролируемому, относительно равномерному облучению в возрасте 20-50 лет в различных дозах, вызвавших развитие острой лучевой болезни 1-4 степени тяжести. На каждого из пострадавших имелись данные биодозиметрии, выполненные различными методами: гематологические, физические, ЭПР-спектроскопия эмали зубов и/или цитогенетические. На каждого обследуемого за период наблюдения более 22 лет было выполнено от 1 до 15 обследований рутинным методом и от 1 до 5 - методом FISH. Параллельно 19 пострадавшим была оценена полученная доза по гематологическим показателям. У 11 из 22 пострадавших была выполнена цитогенетическая биодозиметрия по дицентри-кам в ранний период после облучения. Время, прошедшее с момента облучения до 1-го цитогенетического анализа, у этих лиц составило от нескольких дней до 1,5 месяцев. На рис. 4 представлены результаты сравнения степени тяжести острой лучевой болезни (ОЛБ) у этих 11 пострадавших с наблюдаемой у них частотой дицентриков непосредственно после облучения. Видно, что наблюдается хорошее соответствие между степенью тяжести ОЛБ и частотой дицентриков в ранний период после облучения. В отдаленный период частота трансло-

каций коррелирует со степенью тяжести перенесенной ОЛБ, что позволяет использовать данный показатель для ретроспективной оценки степени тяжести радиационного поражения.

1000

I Цидентрики 1986 г. ШИ Транслокации (полные+неполные)

Рис. 4. Сопоставление степени тяжести ОЛБ и частоты дицентриков и транслокаций у обследованных лиц

01

О

1*1

jdMlk

D9 OS D10 D4 018 D3 D2 D7

D5 08 D1

|ОЛБ-4| ОЛБ-3

ОЛБ-2

|ОЛБ-1|

Самая высокая частота дицентриков наблюдалась у индивидуума D9 с диагнозом ОЛБ-4. Как явствует из сопроводительных документов, он был оператором на 4-ом энергоблоке ЧАЭС и находился в течение 3 ч в непосредственной близости от взорвавшегося реактора. Доза, приписанная ему по раннему цитогенетическому анализу, составляла 8,7 Гр. Самая низкая частота дицентриков наблюдалась у индивидуума D1, соответственно и степень тяжести ОЛБ у него была самая низкая (ОЛБ-1). Согласно сопроводительным документам, это инженер ЧАЭС, находившийся в течение 30 мин на расстоянии около 60 м от реактора, доза по дицентрикам у него равнялась 0,8 Гр. Как видно на рис. 4, из общей закономерности несколько выпадают случаи D3 и D2. Хотя оба они имели диагноз ОЛБ-2, однако наблюдаемые у них уровни дицентриков более соответствовали степени тяжести ОЛБ-3. По результатам анализа частоты дицентриков в острый период им были приписаны дозы 3,6 Гр и 2,8 Гр, соответственно. Возможно, сравнительно более высокий уровень дицентриков был связан с индивидуальной радиочувствительностью организмов.

Впоследствии, в целях оценки динамики нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови обследуемых лиц в течение, примерно, 20 лет после облучения, брались образцы крови на цитогенетический анализ. При оценке полученных результатов в качестве контроля использовали опубликованные данные (Севанькаев А. А., 1982; IAEA 2001; Воробцова И. Е. и др., 2000) по спонтанной частоте аберраций хромосом у клинически здоровых людей соответствующей возрастной группы. На рис. 5. изображена зависимость частоты дицентриков у обследуемых лиц в зависимости от времени после облучения. При этом, в зависимости от величины полученных доз, все обследованные были разделены на 3 группы- с относительно невысокими дозами ( 1,0-

3,2 Гр), средними дозами (3,2 - 4,2 Гр) и высокими дозами (4,2-12,3 Гр). Сплошными линиями изображены линейно-квадратичные функции, описывающие динамику дицентриков с течением времени после облучения, где У-выход дицентриков на 100 клеток, Ь время после облучения.

Малые дозы, диапазон 1,1 -3,2 Гр. 1000,

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Время после облучения, лет

Средние дозы, диапазон 3,2-4,2 Гр. 1000,

Время после облучения, лет

Рис. 5. Зависимость частоты дицентриков от времени после облучения у обследуемых лиц из 3-х групп - с относительно малыми дозами ( 1-3,2 Гр), средними дозами (3,2-4,2 Гр) и высокими дозами (4,3-12,3 Гр). — спонтанный уровень частоты дицентриков (0,02 дицентриков на 100 клеток).

Для всех 3-х групп прослеживается общая закономерность: с увеличением времени после облучения частота дицентриков существенно снижается. Причем спад имеет двухфазный характер: вначале отмечается быстрый спад частоты дицентриков, после чего это снижение замедляется. При этом скорость снижения уровня дицентриков зависит от величины поглощенной дозы: чем больше доза, тем более выраженный начальный спад частоты дицентриков. Продолжительность фазы быстрого спада частоты дицентриков снижается в зависимости от дозы в пределах от 3,6 до 0.4 года. Длительность следующей фазы -замедленного снижения уровня дицентриков - прослеживается на всем периоде нашего наблюдения. При этом частота дицентриков у обследованных лиц так и не достигала спонтанного уровня, достоверно превышая его даже спустя 50 и более лет после облучения. Анализ динамики нестабильных аберраций в пострадиационный период позволяет заключить, что ретроспективная оценка дозы по частоте дицентриков с приемлемой погрешностью возможна лишь, примерно, в течение 1 года после облучения. В дальнейшем эта оценка резко снижается и становится недостоверной. Но, поскольку частота дицентриков остается повышенной в пострадиационный период в течение длительного времени,

Большие дозы, диапазон 4,3-12,3 Гр.

то она может являться эффективным индикатором факта радиационного воздействия в прошлом.

Для каждого обследуемого индивидуальные поглощенные дозы были оценены двумя методами - по частоте индуцированных дицентриков по in vitro дозовой кривой и методом Qdr, и было проведено сравнение обоих методов. На рис.6 представлены результаты исследований на примере двух пострадавших -D1 (с относительно малой дозой 0,8 Гр, диагноз: ОЛБ-1) и D9 (с самой большой поглощенной дозой 8,7 Гр; диагноз ОЛБ-4).

Рис. 6. Дозы облучения у лиц с различной степенью ОЛБ, оцененные цитогенетическим методом (по дицентрикам) и методом Qdr. а) пострадавший D1, ОЛБ-1, доза 0,8 Гр; б) пострадавший D9, ОЛБ-4, доза 8,7 Гр.

При анализе рассчитанных доз можно сделать вывод, что но мере увеличения времени взятия крови на цитогенетический анализ после облучения, оценка дозы оказывается все более заниженной. Через 2-3 г. оценить дозу этими методами невозможно. Метод оценки дозы по дицентрикам показал себя математически более устойчивым к погрешностям исходных данных по сравнению с методом Qdr, особенно при увеличении периода времени после облучения и в случае малых доз. Возможная причина этого заключается в более высоких требованиях метода Qdr к точности оценки исходных частот всех типов аберраций. Известно, что процесс распознания центрических колец и парных фрагментов является менее надежным по сравнению с дицентриками. Поэтому, несмотря на декларированные преимущества метода Qdr (IAEA 2002), к таким оценкам дозы необходимо относиться с известной долей осторожности, контролируя их применением других методов, например, по частоте транслокаций.

Для длительных сроков после облучения метод также может служить лишь детектором радиационного воздействия.

Анализ стабильных аберраций методом ПЕН у обследованной группы лиц.

Была изучена динамика частоты полных транслокаций от времени, прошедшего после облучения у обследованных лиц (рис. 7).

Аналогично рис. 5, все обследованные были разделены на 3 группы по величине полученных ими доз. Для сравнения динамических процессов на график нанесена сплошной линией линейно-квадратичная функция, описывающая динамику дицентриков (см. рис. 5).

Малые дозы, диапазон 1,1 - 3,2 Гр.

ь

я У

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Время после облучения, лет

Средние дозы, диапазон 3,2 - 4,2 Гр.

0 5 10 15 20 25 3 Время после облучения, лет

Большие дозы, диапазон 4,3 -12,3 Гр.

О 5 10 15 20 25 30 Время после облучении, ле|

Рис. 7. Зависимость частоты полных транслокаций от времени после облучения у обследуемых лиц. Пунктиром обозначен спонтанный уровень частоты транслокаций, сплошной линией - аппроксимация зависимости частоты дицентриков от времени.

Аналогично были выполнены исследования зависимости частоты суммы всех транслокаций от времени после облучения. Исследования показали, что в лимфоцитах крови аварийно облученных лиц частота транслокаций остается практически постоянной спустя длительное время после облучения. Ее количественное значение существенно превышает спонтанный уровень, и по истечении 5-8 лет после облучения частота транслокаций практически не зависит от

времени, но зависит от начальной дозы, что позволяет использовать ее для индивидуальной ретроспективной биологической дозиметрии.

Используя цитогенетические данные тех обследованных, для которых имеются как оценки дицентршсов в ранний период после облучения, так и результаты анализа транслокаций в отдаленный период, были оценены соответствующие дозовые зависимости, представленные на рис. 8. Сопоставление имело целью установить насколько пригодна калибровочная зависимость частоты ди-центриков, обычно применяемая для биологической дозиметрии в острый период, в случае анализа стабильных аберраций (транслокаций) в отдаленный период. Из рис. 8 видно, что частота транслокащш в отдаленный период следует линейно-квадратичной зависимости, которая существенным образом отличается от наблюдаемой частоты дицентриков в ранний период. Если учесть, что при облучении дицентрики и транслокации индуцируются примерно с одинаковой вероятностью, то в отдаленном периоде первоначально индуцированных транслокаций и дицентриков не наблюдалось бы в силу элиминации лимфоцитов из циркулирующей крови. Следовательно, наблюдаемые у обследованных лиц в пострадиационном периоде транслокации поступают в периферическую кровь из облученного костного мозга.

Доза, Гр.

Рис. 8. Дозовая зависимость частоты аберраций нестабильных (дицентрики) и стабильных (сумма полных и неполных транслокаций) в лимфоцитах крови обследованных лиц. Сплошными линиями показаны регрессионные зависимости.

Была построена дозовая зависимость частоты радиационно-индуцированной компоненты наблюдаемых транслокаций. Данная компонента

была получена путем вычитания из наблюдаемой частоты спонтанного фона, зависящего от возраста обследованных (Воробцова И. Е. и др., 2000). Оцененная дозовая зависимость радиационно-индуцированных транслокаций у обследованных лиц имеет вид:

Y = (2,52±0,19)D + (1,34±0.02)D2, где Y- выход аберраций на 100 клеток на геном, D- доза облучения, Гр. Результаты представлены на рис. 9 в сопоставлении с in vitro дозовыми зависимостями выхода аналогичных аберраций (транслокаций) по данным различных авторов.

Доза, Гр.

Рис.9 Дозовая зависимость суммы полных и неполных транслокаций в лимфоцитах крови обследованных лиц. Сплошной линией показана регрессионная зависимость. Для сравнения приведены in vitro дозовые зависимости по данным различных авторов.

Частота транслокаций в отдаленном периоде описывается линейно-квадратичной функцией, которая существенным образом отличается от наблюдаемой в ранний период частоты дицентриков.

ВЫВОДЫ

1. У лиц, подвергшихся острому аварийному облучению в диапазоне доз 0,5-10 Гр и перенесших острую лучевую болезнь различной степени тяжести (1-IV степень), частота радиационных хромосомных маркеров (дицентриков и центрических колец) в лимфоцитах периферической крови сохраняется в пострадиационный период на повышенном уровне в течение длительного времени, что может быть использовано для ретроспективной биоиндикации радиационного воздействия.

2. Дииамика снижения частоты нестабильных аберраций (дицентриков) с течением Бремени после острого облучения имеет двухфазный характер и зависит от величины дозы. Чем больше доза, тем более резким является начальный спад частоты дицентриков, при этом быстрая фаза спада характеризуется параметром 1-4 года, медленная - 20-40 лет.

3. Частота стабильных аберраций (транслокаций) у обследованных лиц существенно превышает спонтанный уровень в пострадиационный период и по истечении 5-8 лет после облучения практически не зависит от времени, но зависит от начальной дозы, что позволяет использовать данный тип аберраций для индивидуальной ретроспективной биологической дозиметрии.

4. Частоты нестабильных аберраций (дицентриков) в ранний период и стабильных аберраций (транслокаций) в лимфоцитах периферической крови в отдаленный пострадиационный период количественно соответствует степени тяжести острой лучевой болезни, что позволяет использовать частоту транслокаций для ретроспективного уточнения степени тяжести радиационного поражения.

5. Дозовая зависимость стабильных аберраций (транслокаций), полученная в опытах in vitro, существенно отличается от наблюдаемой аналогичной зависимости в группе облученных лиц (in vivo), что исключает использование зависимостей in vitro в качестве калибровочных для целей биодозиметрии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

l.Sevankaev A.V., Khvostunov I.K., Mikhailova G.F., Shepel N. N. et al Novel data set for retrospective biodosimetry using both conventional and FISH chromosome analysis after high accidental overexposure /'/ Applied Radiation and Isotopes.-2000,-V. 52.-P. 1149-1152.

2. Михайлова Г.Ф. Хвостунов И.К., Шепель H.H., Семенова Т.Г., Потетня О.П., Цепенко В.В., Севанькаев A.B. Перспективы использования стабильных хромосомных аберраций в ретроспективной биологической дозиметрии. // Наследие Чернобыля: Материалы научно-практической конференции (под ред. В.А. Игнатова), Калуга: "Облиздат", 2001, с. 60.

3. Sevan'kaev, A.V., Lloyd, D.C., Edwards, A.A., Khvostunov, I.K., Mikhailova, G.F., Golub, E.V., Shepel, N.N., Nadejina, N.M., Galstian, I.A., Nugis, V.Yu., Barrios, L., Caballin, M.R. and Barquinero, J.F. A cytogenetic follow-up of some highly irradiated victims of the Chernobyl accident. // Radiation Protection Dosimetry, 2005.-V. 113.-P. 152-161.

4. Севанькаев A.B., Михайлова Г.Ф., Потетня О.И., Цепенко В.В., Хвостунов И.К., Голуб Е.В., Пятенко B.C., Поздышкина О.В., Шепель H.H., Матвеенко Е.Г., Боровикова М.П., Омарасхабов Н.О. Результаты динамического цитогене-тического наблюдения за детьми и подростками, проживающими на радиоак-

тивно-загрязненных территориях после Чернобыльской аварии. // Радиационная биология. Радиоэкология, 2005, Т.45, № 1 , С.5-15.

5. Sevan'kaev A.V., Khvostunov, I.K., Lloyd, D.C., Voisin, Ph., Shepel, N.N., Galstian, I.A., Dudochkina, N. E., Nadejina, N.M., Nugis, V.Yu. The chromosomal aberrations assay for biological dosimetry a long time after exposure. // Чернобыльские чтения-2008: Материалы международной научно-практической конференций под ред. А. В. Рожко), Беларусь, Гомель. «Сож», 2008, С. 248-252.

6. Шепель Н. Н., Цихмистер А. С., Хвостунов И. К., Севанькаев А. В. Особенности применения цитогенетического метода для биологической дозиметрии неконтролируемого облучения человека.// Вестник российской военно-медицинской академии, С.-Петербург, 2008, №3 (23), с. 189.

7. Sevan'kaev А. V., Khvostunov I. К., Mikhailova G. F., Golub Е. V., Potetnya O.I., Shepel N. N., Nugis V.Yu., Nadejina N. M. Novel data set for retrospective bio-dosimetry using both conventional and FISH chromosome analysis at high dose level of accidental exposure / International Conference on Biodosimetry and 5th International Symposium on ESR Dosimetry and Applications Obninsk / Moscow, June 2226,1998, Book of abstracts, p. 132.

8. Shepel N.N., Khvostunov I.K., Potetnya O.I., Semeonova T.G., Sevan'kaev A.V. et al The estimation of life-time period of lymphocytes that contain unstable aberrations based on the study of group of persons with high doses for the improvement of past exposure biodosimetry. / International Symposium on Prolonged Radiation Actions: Possible Biological Indicators, Tchelyabinsk, Russia, 14-16 March 2000, P. 121.

Подписано в печать 29.10.2008 Формат А-5. Тираж 100 экз. Заказ № 327

Отпечатано в типографии «Оптима-пресс» г. Обнинск, ул. Гурьянова, д. 21

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шепель, Наталья Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Современные представления о биодозиметрии

1.2 Биологическая дозиметрия по частоте нестабильных аберраций 13 хромосом в лимфоцитах периферической крови человека

1.2.1 Спонтанный уровень аберраций хромосом в лимфоцитах 16 периферической крови

1.2.2 Сравнение выходов аберраций хромосом в лимфоцитах при 23 облучении in vitro и in vivo

1.2.3 Элиминация хромосомных аберраций после облучения in vivo

1.3 Другие методы биологической дозиметрии

1.3.1 ЭПР-спектроскопия эмали зубов

1.3.2 Гематологический метод

1.4 Калибровочные кривые

1.5 Практическое применение биодозиметрии в аварийных ситуациях

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 37 2.1 Характеристики обследованных групп 37 2.2Типы аберраций хромосом

2.3 Методика культивирования лимфоцитов крови и приготовление 41 препаратов для анализа нестабильных аберраций хромосом

2.4 Метод флуоресцентной in situ гибридизации клеток (FISH)

2.5 Критерии учета и анализ аберраций

2.6 Метод Qdr

2.7 Статистическая обработка результатов.

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 46 3.1 Исследование нестабильных и стабильных аберраций in vitro.

3.1.1 Результаты анализа нестабильных аберраций хромосом

3.1.2 Оценка калибровочной зависимости для метода Qdr

3.1.3 Результаты анализа аберраций хромосом методом FISH.

3.2 Исследование частоты нестабильных и стабильных аберраций 57 хромосом у лиц с ОЛБ с целью последующей оценки индивидуальных Доз.

3.2.1 Анализ выхода нестабильных аберраций в исследуемой группе 57 лиц.

3.2.2 Анализ стабильных аберраций хромосом методом FISH у 60 обследованных лиц.

3.2.3 Оценка индивидуальных доз у обследованных лиц. 69 3.2.4. Анализ соотношения степени тяжести ОЛБ и цитогенетических 71 нарушений у обследованных лиц.

4.2 Повышенный уровень радиационных маркеров как индикатор 74 радиационного воздействия

4.3 Роль цитогенетического метода биодозиметрии в уточнении 76 диагноза острой лучевой болезни

4.4 Перспективы и проблемы использования стабильных аберраций 80 (транслокаций) для ретроспективной биологической дозиметрии

Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 Спонтанный уровень хромосомных аберраций

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная оценка биологической дозиметрии на основе анализа стабильных и нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека"

Актуальность проблемы.

На протяжении всей истории существования нашей планеты, все живое на Земле, включая и человечество, находилось под постоянным воздействием

1 I I различных ионизирующих излучений природного и космического происхождения. Однако стремительный научно-технический прогресс позволил людям самим создавать и использовать источники ионизирующих излучений в различных целях: для получения энергии, в медицинских, исследовательских, военных целях и др. В связи с этим, уже в начале XX в. имели место случаи неконтролируемого облучения человека. К концу 50-х годов было известно около 500 таких случаев, а к концу XX века счет пострадавших от ионизирующих излучений уже шел на миллионы. Очевидно, что для оценки медицинских последствий облучения необходимо иметь подробную дозиметрическую информацию о величине и мощности дозы, о длительности облучения, о расстоянии от источников облучения до пострадавших и др. Как показывает практика, в большинстве случаев неконтролируемого аварийного облучения такая информация отсутствует. Поэтому единственными источниками получения необходимых данных становятся методы биологической дозиметрии.

Одним из наиболее разработанных и широко используемых методов биодозиметрии является метод, основанный на анализе частоты нестабильных хромосомных аберраций. Известный с 1960-х годов, этот метод уже достаточно хорошо исследован. Как показал опыт ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС, практически единственным и достаточно надежным методом оценки аварийных доз облучения у пострадавших оказался метод биологической дозиметрии на основе анализа хромосомных аберраций (дицентриков и центрических колец) в лимфоцитах периферической крови или пунктатах клеток костного мозга. В настоящее время данный метод дозиметрии широко и успешно используется во всем мире и является международно признанным методом биологической дозиметрии в случаях острого (аварийного), чаще всего неконтролируемого облучения. Однако, данный метод биодозиметрии успешно применяется в сроки, не превышающие 3-4 месяца после облучения. Для более длительных сроков он не подходит из-за резкого снижения его точности вследствие постепенной элиминации аберрантных клеток из периферического кровяного русла. Так, перед исследователями встала проблема поиска новых методов, позволяющих проводить реконструкцию полученных доз спустя длительное время после облучения.

В последнее время в стране сложилась крайне острая проблема, связанная с необходимостью оценки доз облучения у значительной части населения. Это, прежде всего, касается ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС, наибольшей когорте людей, подвергшихся облучению в сравнительно высоких дозах. После снятия грифа «секретности» к ним присоединилась многочисленная когорта «переоблучившихся» лиц, часть из которых перенесла острую или хроническую лучевую болезнь. Это работники ядерно-химических предприятий (ПО «Маяк» - Челябинск, радиохимический комбинат - Томск и др.), участники испытания ядерного оружия на Семипалатинском полигоне и Новой Земле, уволенные с военной службы участники ликвидации аварий на корабельных ядерных установках и других ядерных объектах и т.д.

Кроме нестабильных аберраций при радиационном воздействии в геноме клеток индуцируются и долгоживущие повреждения, которые могут служить маркерами облучения в отдаленный пострадиационный период. До недавнего времени количественно оценить их практически не представлялось возможным. Появление метода многоцветной флуоресцентной окраски хромосом (FISH-метод) позволяет идентифицировать данный тип аберраций.

Многочисленные цитогенетические исследования подтвердили, что транслокации действительно являются долгоживущими биомаркерами радиационного воздействия при облучении человека. Авария на Чернобыльской АЭС, а также внештатные ситуации на промышленных и исследовательских ядерных установках и другие случайные переоблучения людей показывают, что существует острая проблема ретроспективной оценки полученных доз, принявшая в последние годы социальный характер. Появившаяся возможность определения радиационно-индуцированных транслокаций в лимфоцитах периферической крови человека через много лет после облучения позволяет в определенной степени справиться с этой задачей, используя цитогенетический метод для ретроспективной оценки доз.

Связь работы с научными программами и темами НИР.

Данное исследование выполнено в рамках следующих НИР ГУ-МРНЦ РАМН: НИР «Изучение частоты генных и структурных мутаций в соматических клетках больных с различными формами гемобластозов и больных ОЛБ в отдаленный период», № Гос. per. 01.9.60 000 665, (1996-1999 гг.); НИР «Изучение структурных соматических мутаций у населения, проживающего на радиоактивно-загрязненных территориях Калужской области и подвергшихся внутриутробному облучению во время аварии на Чернобыльской АЭС» (20032005 гг.) . № Гос. per. 01.20.03 03632; «Анализ результатов долговременного медицинского и цитогенетического обследования группы лиц с диагнозом ОЛБ различной степени тяжести в отдаленный период после острого облучения с целью выявления закономерностей выхода стабильных и нестабильных аберраций хромосом» № Гос. per. 0120.0 602189 (2006-2010 ), а также в рамках международного проекта INTAS 97-1152 «А long-term follow up study of cohort of highly irradiated victims of the Chernobyl accident to improve dose assessment for past exposures by analyzing changes in the yields of stable and unstable chromosomal aberrations», 1999-2001. Аннотация диссертации рассмотрена и утверждена Ученым Советом ГУ-МРНЦ РАМН (протокол № 5 от 19.05.2000 г).

Цель исследования

Целью данной работы является сравнительная оценка использования стабильных и нестабильных аберраций хромосом в лимфоцитах крови лиц, подвергшихся аварийному облучению, для определения поглощенных доз в отдаленный период после облучения.

Задачи исследования

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Выполнить экспериментальное исследование с облучением in vitro донорской крови у-источником б0Со для построения калибровочной дозовой зависимости выхода стабильных и нестабильных радиационно-индуцированных хромосомных аберраций.

2. Сформировать группу лиц с острым аварийным облучением и известными индивидуальными дозами, осуществить забор крови для культивирования лимфоцитов и последующего цитогенетического анализа в течение отдаленного периода (от 5 до 30 лет после облучения).

3. Провести статистический анализ динамики частоты нестабильных аберраций в течение отдаленного периода.

4. Рассчитать индивидуальные дозы облучения для лиц из сформированной группы на основе анализа частоты нестабильных хромосомных аберраций, наблюдаемых в лимфоцитах крови вскоре после облучения, а также в отдаленный период после облучения.

5. Сопоставить расчеты величин доз, полученных по ранним и поздним цитогенетическим данным с целью уточнения границ применимости метода ретроспективной биологической дозиметрии, основанного на анализе частоты стабильных аберраций (транслокаций), определяемых методом FISH.

6. Провести оценку возможности ретроспективной биологической дозиметрии на основе анализа выявляемых аберраций (нестабильных и стабильных), с учетом полученных данных, в наблюдаемой группе аварийно облученных лиц.

Научная новизна

Впервые были получены данные о динамике частот нестабильных и стабильных аберраций хромосом у людей, подвергшихся аварийному облучению в больших дозах и проходящих ежегодное клинико-цитогенетическое обследование за период наблюдения более 30 лет.

Установлено, что, несмотря на длительный период времени после радиационного воздействия, в лимфоцитах крови присутствуют нестабильные аберрации хромосом в форме дицентриков и центрических колец, частота которых существенно превышает спонтанный уровень, что позволяет использовать эти показатели для ретроспективной биоиндикации радиационного воздействия в период до 30 лет после облучения.

Показано, что в лимфоцитах периферической крови облученных лиц в отдаленный пострадиационный период наблюдается высокая частота стабильных аберраций (транслокаций), уровень которых значительно превышает уровень наблюдаемых нестабильных аберраций. Повышенная частота стабильных аберраций (транслокаций) в обследованной группе однозначно коррелирует со степенью тяжести перенесенного радиационного поражения и исходными дозами, что позволяет использовать данный тип аберраций для ретроспективной биологической дозиметрии. Полученные данные по частоте транслокаций позволили провести корректировку в зависимости от времени после облучения и уточнение дозовой зависимости выхода транслокаций при облучении in vivo.

Впервые на представительной группе лиц показано, что стабильные аберрации (транслокации), наблюдаемые в отдаленный период после облучения, являются достоверными радиационными маркерами, а их сравнительно высокий уровень позволяет использовать их для ретроспективной биологической дозиметрии острого облучения в диапазоне доз от 1 до 10 Гр.

Принимая во внимание определяющую роль транслокаций в онкогенезе, в частности, в развитии гемобластозов, наблюдаемый у обследованных лиц повышенный их уровень позволяет с определенной вероятностью оценивать риски развития онкологических заболеваний в отдаленный пострадиационный период. В целом, полученные новые данные послужат уточнению разрабатываемого метода ретроспективной биологической дозиметрии, а также выявлению лиц с повышенным уровнем стабильных аберраций и на их основе выделению групп повышенного канцерогенного риска, в частности, гемобластозов.

Практическая значимость

В результате проведенных исследований уточнена область применимости использования различных типов аберраций хромосом (стабильных и нестабильных) для биологической дозиметрии; оценена возможность надежной ретроспективной оценки доз по таким цитогенетическим показателям, как дицентрики и транслокации в отдаленные сроки после облучения. На примере обследованной группы лиц апробированы методы биодозиметрии, позволяющие определить полученные индивидуальные дозы облучения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Частота нестабильных аберраций хромосом (дицентриков и центрических колец) в лимфоцитах периферической крови лиц, облучившихся в диапазоне доз 0,5-10 Гр с высокой мощностью дозы, сохраняется в течение длительного времени (до 30 лет в нашем случае) на уровне, значительно превышающем спонтанный, что позволяет использовать их для ретроспективной биоиндикации радиационного воздействия.

2. При этом частота стабильных аберраций (транслокаций) превышает не только спонтанный уровень, но и наблюдаемый уровень нестабильных аберраций, и по истечении 5-8 лет после облучения не зависит от времени, но зависит от начальной дозы, что позволяет использовать ее для индивидуальной ретроспективной биологической дозиметрии.

3. Дозовая зависимость стабильных аберраций (транслокаций), полученная в опытах in vitro, существенно отличается от наблюдаемой аналогичной зависимости в группе облученных лиц (in vivo), что исключает использование данных при облучении in vitro в качестве калибровочной кривой.

Апробация результатов диссертации

Предварительная защита диссертации состоялась на научной конференции экспериментального радиологического сектора ГУ МРНЦ РАМН. Основные результаты диссертационной работы были представлены и докладывались на научно-практической конференции «Наследие Чернобыля», (Калуга 2001), Международной конференции «Проблемы радиационной генетики на рубеже веков» (Москва, 2005), Международной конференции «Чернобыльские чтения 2008» (Гомель, 2008), Международной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии», (Санкт-Петербург, 2008 г.).

Опубликование результатов

Основные положения диссертации отражены в 8 публикациях: 3 статьях, 5 тезисах докладов.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Шепель, Наталья Николаевна

ВЫВОДЫ

1. У лиц, подвергшихся острому аварийному облучению в диапазоне доз 0,510 Гр. и перенесших острую лучевую болезнь различной степени тяжести (1-1V степень) частота радиационных хромосомных маркеров (дицентриков и центрических колец) в лимфоцитах периферическом крови сохраняется в пострадиационный период на повышенном уровне в течение длительного времени, что может быть использовано для ретроспективной биоиндикации радиационного воздействия.

2. Динамика снижения частоты нестбильных аберраций (дицешриков) с течением времени после острого облучения имеет двухфазный характер и зависит от величины дозы. Чем больше доза, тем более резким являеюя начальный спад частоты дицентриков, при этом быстрая фаза спада характеризуеiся параметром 1-4 года, медленная - 20-40 лет.

3. Частота стабильных аберрации (транслокаций) у обследованных лиц существенно превышает спонтанный уровень в пострадиационный период и по истечении 5-8 лет после облучения практически не зависит от времени, но зависит от начальной дозы, что позволяет использовать ее для индивидуальной ретроспективной биологической дозиметрии.

4. Частоты нестабильных аберрации (дицентриков) в ранний период и стабильных аберраций (транслокаций) в лимфоцитах периферической крови в отдаленный пострадиационный период количественно соответствует степени тяжести острой лучевой болезни, что позволяет использовать частоту транслокаций для ретро-спекшвного уточнения степени тяжести острой лучевой болезни.

5. Дозовая зависимость стабильных аберраций (транслокаций), полученная в опытах in vitro, существенно отличается от наблюдаемой аналогичной зависимости в группе облученных лиц (in vivo), что исключает использование зависимостей in vitro в качестве калибровочных для целей биодозиметрии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шепель, Наталья Николаевна, Б.м.

1. Бейли Н. Статистические методы в биологии. М: Мир, 1964. — 260 с.

2. Баранов А. Е. Оценка дозы и прогнозирование динамики количества нейтрофилов периферической крови по гематологическим показателям у-облучения человека // Мед. Радиология.-1981. Т. 19, № 10. С.46-50.

3. Биологическая индикация радиационного воздействия на организм человека с использованием цитогенетических методов // Снигирева. М.: 2007. 28 с.

4. Бочков Н.П. Хромосомы человека и облучение. // М.: Атомиздат. — 1971. 168 с.

5. Бочков Н.П., Журков B.C., Яковенко К.Н., Кулешов Н.П. Культура лимфоцитов как тест-объект для изучения генетических последствий у лиц, контактирующих с мутагенами // Докл. АН СССР. 1974. Т. 218. №2. - С. 463-465.

6. Бочков Н.П., Чеботарев А.Н., Катосова Л.Д., Платонова В.И. База данных для анализа количественных характеристик частоты хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов периферической крови человека // Генетика. 2001. Т.37. №4. С. 549-557.

7. Воробцова И.Е., Михельсон В.М., Воробьева М.В. и др. Результаты цитогенетического обследования ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС, проведенного в разные годы // Радиац. Биология. Радиоэкология. 1994. Т.34. №6.-С. 798-803.

8. Воробцова И.Е., Такер Дж.Д., Тимофеева Н.М. и др. Влияние возраста и облучения на частоту транслокаций и дицентриков, определяемых методом

9. FISH, в лимфоцитах человека // Радиационная биология. Радиоэкология. -2000. Т.40. № 2. С. 142 - 148.

10. Дубинина Л.Г. Культура лейкоцитов человека как тесг-система при анализе мутагенности факторов среды //Генетические последствия загрязнения окружающей среды. М.: Наука, 1977. - С. 89-95.

11. Захаров А. Ф., Бенюш В. А., Кулешов Н. П., Барановская Л. И. Хромосомы человека (атлас) // АМН СССР. М.: Медицина, 1982. - 264 с.

12. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1980. 292 с.

13. Любимова Н. Е., Воробцова И. Е. Влияние возраста и низкодозового облучения на частоту хромосомных аберраций в лимфоцитах человека // Радиационная биология и радиоэкология. 2007. Т.47. №1. — С.80-85.

14. Моссэ И. Б. Современные проблемы биодозиметрии // Радиационная биология и радиоэкология. 2002. Т.42. №6. - С.661-664.

15. Нугис В. Ю. Цитогенетические критерии оценки дозы равномерности острого внешнего гамма-облучения организма человека по результатам исследования культивируемых лимфоцитов. Диссер. д-ра биол. наук, Том 1, Москва, 2002 , 303 с.

16. Нугис В. Ю. Дудочкина Н. Е. Закономерности элиминации аберраций хромосом у людей после острого облучения по данным культивированиялимфоцитов периферической крови в отдаленные сроки // Радиационная биология. Радиоэкология. 2007. Т.46. №1. - С.5-15.

17. Нугис В. Ю. Дудочкина Н. Е. Цито генетические показатели в отдаленные сроки после острого облучения людей. Компьютерный метод ретроспективной оценки дозы. // Радиационная биолошя. Радиоэкология. -2007. Т.47. №1. С.74-79.

18. Пилинская M.J1., Дыбский С.С. Частота хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови детей, проживающих в районах с различной радиоэкологической обстановкой // Цитология и Генетика. 1992. Т. 26. №2.-С. 11-17.

19. Пяткин Е. К., Баранов А. Е. Биологическая индикация дозы с помощью анализа аберраций хромосом и количества клеток в периферической крови // Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. Сер. Радиационная биология, 1980, Т.З. С.103-179.

20. Е. К. Пяткин, В. Ю. Нугис. Зависимость выхода аберраций хромосом от дозы при облучении лимфоцитов человека in vitro и in vivo // Медицинская радиология. -1986. № 9.-С. 30-35.

21. Рубанович А. В., Г. П. Снигирева, В. А. Шевченко и др. Теория и практика построения калибровочных кривых в биодозиметрии // Радиационная биология и радиоэкология. 2006. Т.46. №4. - С.447-456.

22. Севанькаев А. В., Жербин Е. А., Лучник Н. В., Обатуров Г. М., Козлов В. М., Тятте Э. Г., Капчигашев С. П. Цитогенетические эффекты, индуцируемые нейтронами в лимфоцитах периферической крови человека in vitro // Генетика.-1979. Т.15. №6.-С.1046-1060.

23. Севанькаев А.В., Козлов В.М., Гузеев Г.Г., Измайлова Н. Н. Частота спонтанных хромосомных аберраций в культуре лейкоцитов человека // Генетика. 1974. Т. 10. № 6. - С. 114-120.

24. Севанькаев А. В., Лучник Н. В. Влияние гамма-облучения на хромосомы человека. Сообщение VIII. Цитогенетический эффект низких доз при облучении in vitro // Генетика.-1977. Т.8. №3. С. 524-531.

25. Севанькаев А.В. Некоторые итоги цитогенетических исследований в связи с оценкой последствий Чернобыльской аварии // Радиационная биология. Радиоэкология. 2000. Т.40. №5. - С.589-595.

26. Севанькаев А.В. Радиочувствительность хромосом лимфоцитов человека в митотическом цикле. М: Энергоатомиздат: 1987. - 160 с.

27. Севанькаев А. В., Насонов А. П. Биологическая дозиметрия по хромосомным аберрациям в культуре лимфоцитов человека.// Методические рекомендации Обнинск: 1979. - 15 с.

28. Урбах Ю.В. Биометрические методы. Статистическая обработка опытных данных в биологии, сельском хозяйстве, медицине. М: Наука, 1963. -415 с.

29. Цыб А. Ф., Будагов Р. С., Замулаева И. А. и др. Радиация и патология // М.: Высшая школа, 2005. 341 с.

30. Чеботарев А.Н., Бочков Н.П., Катосова Л.Д., Платонова В.И. Временные колебания спонтанного уровня хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов периферической крови человека // Генетика. 2001. Т.37. №6. — С. 848-853.

31. Anderson R.M., Marsden S.J., Wright E.G. et al. Complex chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes as a potential biomarker of exposure to high-LET a-particles//Int. J. Radiat. Biol. 2002. Vol.76. №1. - P.31-42.

32. Andersson H.C. The spontaneous frequency of chromosomal aberrations and sister-chromatid exchanges in cultured peripheral lymphocytes of a single blood donor sampled more than 200 times // Mutat. Res. 1993. Vol.286. №2. - P. 281292.

33. Awa A. A., Nakano M., Ohtaki K., Kodama Y. et all. Factors that determine the in vivo dose-response relationship for stable chromosome aberrations in A-bomb survivors // J. Radiat. Res.-1992. V. 33: supplement, P. 206-214.

34. Awa A. A., Sofimi Т., Honda Т., Itoh M. Neriishi M., Otake M. Relationship between the radiation dose and chromosome aberrations in atomic bomb survivors of Hiroshima and Nagasaki //Radiation Research. 1978. Vol.19. - P. 126-140.

35. Bauchinger M., Schmidt E., Dresp J. Calculation of the dose rate dependents of the dicentric yield after 60Co y-irradiation of human lymphocytes // IJRB- 1979. V.35- P.229-233.

36. Bender M.A., Preston R.J., Leonard R.C. et al. Chromosomal aberration and sister-chromatid exchange frequencies in peripheral blood lymphocytes of a large human population sample // Mutat. Res. 1988. Vol. 204. - P. 421-433.

37. Bender M.A., Preston R.J., Leonard R.C. et al. Chromosomal aberration and sister-chromatid exchange frequencies in peripheral blood lymphocytes of a large human population sample, II. Extension of age range // Mutat. Res. 1989. Vol. 212. - P. 149-154.

38. Bender M. A., Awa A. A., Brooks A. L., Evans H. J. et al. Current status of cytogenetic procedures to detect and quantify previous exposures to radiation // Mutation Research. 1988. Vol.196. - P. 103-159.

39. Bogen К. T. Reassessment of human peripheral T-lymphocyte lifespan dedused from cytogenetic and cytotoxic effects of radiation. // Int. J. Radiat. Biol. -1993. V. 64. №2. P. 195-204.

40. Brady J.M., Aarestad N. О., Swartz H. M. In vivo dosimetry by electron spin resonance spectroscopy // Health Phisics 1968. V. 15. - P. 43 - 47.

41. Brandom W.F. Chromosome aberrations yields in somatic cells of plutonium workers//Health Phys. 1982. Vol. 43. №1. - P.l 11-115.

42. Buckton K.E., Hamilton G.E., Paton L. and Langlands A.O. Chromosome aberrations in irradiated ankylosing spondylitis patients // Eds. Evans H.J., Lloyd D.S. Mutagen-Induced Chromosome Damage in Man. Edinburgh: University Press. -1978.-P. 142-150.

43. Buckton K.E. Chromosome aberrations in patients treated with X irradiation for ankylosing spondylitis // Eds. Ishihara T. and Sasaki M.S. Radiation-induced chromosome damage in man. New York: Alan R Liss Inc. - 1983. - P. 491-511.

44. Carbonell E., Peris F. et al. Chromosomal aberration analysis in 85 control individuals // Mutat. Res. 1996. V. 370. - P. 29-37.

45. Cigarran S., Barrios L., Barquinero J.F. et al. Relationship between the DNA content of human chromosomes and their involvement in radiation-induced structural aberrations, analysed by painting // Int. J. Radiat. Biol. 1998. V. 74. №4. p. 449-455.

46. Cigarran S., Barquinero J.F. Barrios L.,et al. Cytogenetic analysis by fluorescence in sity hybridization (FISH) in hospital workers occupationally exposed to low levels of ionizing radiation // Radiation Research. 2000. V.155. — P. 417-423.

47. Dolphin G.W. The biological problem in the radiological protection of workers exposed to 239Pu//Health Phys., 1971. V.20. - P. 549-557.

48. Dolphin G.W., Lloyd D.C., Purrott R.J. Chromosome aberration analysis as a dosimetric technique in radiological protection // Health Phys., 1973. V.25. — P. 7-15.

49. Dosemetric and medical aspects of the radiological accident in Goiania in 1987. Biological dosimetry chromosomal aberration analisis for dose assessment // Int. Atomic Energy Agency. Viena. - 1998. - P. 57-69.

50. Edwards A. A. The use of chromosomal aberrations in human lymphocytes for biological dosimetry. // Rad Res.- 1997. V148, Soppl.5- P. 39-44.

51. Edwards A.A., Lindholm C., Darroudi F et al. Review of translocations detected by FISH for retrospective biological dosimetry applications // Radiat. Protect. Dosim. 2005. Vol. 113. No.4. - P. 396 - 402.

52. Fabry L., Lemaire M. Dose response relationships for radiation induced chromosome aberration in human lymphocytes in vivo and in vitro II Strahlenther. and Onkol. 1986. Vol.162. №1. - P. 63-67.

53. Finnon P., Moquet J.E., Edwards A.A., Lloyd D.C. The 60Co gamma ray dose-response for chromosomal aberrations in human lymphocytes analysed by FISH; applicability to biological dosimetry // Int. J. Radiat. Biol. 1999. Vol.75.-P.1215-1222.

54. Ganguly B.B. Cell division, chromosomal damage and micronucleus formation in peripheral lymphocytes of healthy donors: relation to donor's age // Mutat. Res. 1993. Vol.295. - P. 135-148.

55. Granath F., Grigoreva M., Natarajan A. T. DNA content proportionality and persisrcnce of radiation-induced chromosomal aberrations studied by FISH // Mutation Research 1996. Vol.336. - P. 145-152.

56. Hayata I. Biological dosimetry by chromosome analysis // «Радиация и риск». 1996, вып. 7. - стр. 72-75.

57. IAEA, Vienna, 1986, Technical Report Series No 260, Biological dosimetry: Chromosomal aberration analysis for dose assessment. 68 p.

58. Kadhim M.A., Lorimore S.A., Townsend K.M. et al. Radiation-induced genomic instability: delayed cytogenetic aberrations and apoptosis in primary human bone marrow cells // Int. J. Radiat. Biol. 1995. V.67. № 3. - P. 287-293.

59. Kasuba V., Sentija K., Garaj-Vrhovac V., Fucic A. Chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes from control individuals // Mutat. Res. 1995. V. 346. №4.-P. 187-193.

60. Landi S., Frenzilli G., Milillo P.C., Cocchi L., Sbrana I., Scapoli C., Barale R. Spontaneous sister chromatid exchange and chromosome aberration frequency in humans: the familial effect // Mutat Res. 1999. V.444. ls.2. - P. 337-345.

61. Leonard A., Rueff J., Gerber G.B., Leonard E.D. Usefulness and limits of biological dosimetry based on cytogenetic methods // Radiat. Protect. Dosimetry. -2005. V. 115.N. 4. P. 448-454.

62. Lloyd D.C., Purrott R.J., Dolphin G. W. et al. The relationship between chromosome aberrations and low LET radiation dose to human lymphocytes // Int. J. Radiat. Biol. 1975. V.28. № 1. - P. 75-90.

63. Lloyd D.C., Edwards A. A., Prosser J.S. et al. A collaborative exercise on cytogenetic dosimetry for simulated whole and partial body accidental irradiation // Mutat Res. 1987. V. 179. - P. 197-208.

64. Lloyd D.C., Purrott R.J., Reeder E.J. The incidence of unstable chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes from unirradiated and occupation ally exposed people // Mutat. Res. 1980. V. 72. - P. 523-532.

65. Lloyd D.C., Edwards A. A.,Leonard A. et al. Chromosomal aberrations in human lymphosytes induced in vitro by very low doses of X-rays // Int. J. Radiat. Biol. 1992. V.61. № 3. - P. 335-343.

66. Lucas J.N. Chromosome translocations: a biomarker for retrospective biodosimetry // Environmental Health Perspectives. 1997. V.105. Suppl 6.- P. 1433-1436.

67. Lucas J.N., Awa A.A., Straume T. et al. Rapid translocation frequency analysis in human decades after exposure to ionizing radiation // Int. J. Radiat. Biol.- 1992. V. 62. P. 53-63.

68. Lucas J.N., Poggensec M., Straume T. The persistence of chromosome translocations in a radiation worker accidentally exposed to tritium // Cytogenet. Cell Genet. 1992. N 60. - P. 255-256.

69. Lucas J.N., Hill F., Burk C., Fester T. and Straume T. Dose-response curve for chromosome translocations measured in human lymphocytes exposed to 60Co gamma rays // Heals Physics. -1995. V.68. P. 761-765.

70. Moorchead P.S., Nowell P.C., Mellman W.J. et al. Chromosome preparation of leukocytes cultured from human peripheral blood // Exptl. Cell. Res. 1960. V.20. №3. - P. 613-616.

71. Nakano M., Kodama Y., Ohtaki K. et al. Detection of stable chromosome aberrations by FISH in A-bomb survivors: comparison with previous solid Giemsa staining data on the same 230 individuals // Int. J. Radiat. Biol. 2001. V. 77. №9. -P. 971-977.

72. Nugis V. Yu., Filushkin I. V., Chistopolskij A. S. Retrospective dose estimation using the dicentric distribution in human peripheral lymphocytes // Appl.Radiation and Isotopes. 2000. V. 52. - P. 1139 - 1144.

73. Padovani L., Caporossi D., Tedeschi B. et al. Cytogenetic study in lymphocytes from children exposed to ionising radiation after Chernobyl accident // Mutat. Res. 1993. V. 319. - P. 55-60.

74. Popp S., Remm В., Hausmann M. et al. Towards a cumulative biological dosimeter based on chromosome painting and digital image analysis // Kerntechnik.- 1990. V. 55. №4. P. 53-63.

75. Ramalho А. Т., Nascimento С. N. The fate of chromosomal aberrations in 137Cs-exposed individuals in the Goiania radiation accident // Health Physics -1991. V. 60. No l.-P. 67-70.

76. Ramsey M.J., Moore D.H. 2nd, Briner J.F., Lee D.A., Olsen L., Senft J.R., Tucker J.D. The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting // Mutat. Res. 1995. V. 338. № 1-6.-P. 95-106.

77. Rodriguez P., Montro A., Barquinero J. F. et al. Analysisi of translocations in stable cells and their implications in retrospective biological dosimetry. // J. Radiat. Res.-2004. V. 162.-P. 31-38.

78. Rossner P, Sram R.J., Bavorova H., Ocadlikova D., Cerna M., Svandova E. Spontaneous level of chromosomal aberrations in peripheral blood lymphocytes of control individuals of the Czech Republic population // Toxicol. Lett. 1998. V. 96-97.-P. 137-142.

79. Rossner P., Bavorova H., Ocadlikova D., Svandova E., Sram R.J. Chromosomal aberrations in peripheral lymphocytes of children as biomarkers of environmental exposure and life style // Toxicol. Lett. 2002. V.134. Issue 1-3. - P. 79-85.

80. Salomaa S., Sevan"lcaev A.V., Zhloba A.A. et al Unstable and stable chromosome aberrations in lymphocytes of people exposed to Chernobyl fallout in Bryansk. Russia // Int. J. Radiat. Biol. 1997. V. 71. - P. 51-59.

81. Scarpato R., Lori A., Panasiuk G., Barale R. FISH analysis of translocations in lymphocytes of children exposed to the Chernobyl fallout: preferential involvement of chromosome 10 // Cytogenet. Cell Genet. 1997. V. 79. № 1-2. - P. 153-156.

82. Schmid E., H. Braselemann, U. Nahrstedt. Comparison of y-ray indused dicentric yields in human lymphocytes measured by conventional analysis and FISH //Mutat. Res. 1995. V.348. P125-130.

83. Schmid E., Bauchinger M., Bunde E. et al. Comparison of the chromosome damage and its dose response after medical whole-body exposure to 60Co y-rays and irradiation of blood in vitro // Int. J. radiat. Biol. 1974.V. 26. N 1. - P. 31-37.

84. Schmid E., Schlegel D., Guldbakke S., Kapsch R.-P., Regulla D. RBE of nearly monoenergetic neutrons at energies of 36 keV-14,6 MeV for induction of diccntrics in human lymphosytes // Radiat. Environ. Biophys. 2003. V. 42. — P. 87-94.

85. Sevankaev A.V., Tsyb A.F., Lloyd D.C., Zhloba A.A., Moiseenko V.V., Skryabin A.M., Climov V.M. "Rogue" cells observed in children exposed to radiation from the Chernobyl accident // Int J. Radiat. Biol. 1993. V. 63. № 3. - P. 361-367.

86. Sevan'kaev A. V., Lloyd D. C., Edwards A. A., Moiseenko V. V. High exposure to radiation received by workers inside the Chernobyl sarcophagus // Rad. Protect. Dosimetry. 1995. V. 59. № 2. - P. 85-91.

87. Sevan'kaev A. V., Lloyd D. C., Edwards A. A. et al. A survey of chromosomal aberrations in lymphosytes of Chernobyl liquidators // Rad. Protect. Dosimetry. -1995. V. 58. № 2 P. 85-91.

88. Sevan'kaev A. V., Lloyd D. C., Edwards A. A., Nugis V. Yu., Mikhailova G. F. et al. Protracted overexposure to a 137Cs source: 1. Dose reconstruction // Rad. Protect. Dosimetry. -1999. V. 81. № 2 P. 85-90.

89. Sevan'kaev A., Lloyd D. C., Edwards A. A., Khvostunov I., Shepel N. et all. A cytogenetic follow-up of some highly irradiated victims of the Cernobyl accident.// Rad. Protect. Dosimetry. 2005. V. 113. № 2. - P. 152-161.

90. Sorokine-Durm I., Whitehouse C., Edvards A. The variability of translokation yields amongst control populations // Rad. Protect. Dosimetry. 2000. V. 88. № 1. -P. 92-99.

91. Stephan G., Pressl S., Koshpessova G., Gusev B.I. Analysis of FISH-painted chromosomes in individuals living near the Semipalatinsk nuclear test site //Radiation Research. 2001. V. 155. - P. 796-800.

92. Straume Т., Lucas J. A comparison of the yields of translocations and dicentrics measured using fluorescence in situ hybridization // Int. J. Radiat. Biol.1993. V. 64. P.185-187.

93. Tanaka K., Popp S., Fischer C. et al. Chromosome aberration analysis in atomic bomb survivors and Thorotrast patients using two- and three-colour chromosome painting of chromosomal subsets // Int. J. Radiat. Biol. 1996. - V.70. -P. 95-108.

94. Tawn E.J., Cartmel C.L., Pyta E.M.T. Cells with multiple chromosome aberrations in control individuals // Mutat. Res. 1985. - V. 144. - P. 247-250.

95. Thierens H., De Ruyclc K, Vral A., de Gelder V., Whitehouse C. A., Tawn E. J., Boesman I. Cytogenetic biodosimetry of an accidental exposure of a radiological worker using multiple assays// Rad. Protect. Dosimetry. 2005. V. 113(4). - P. 408414.

96. Tucker J.D., Lee D.A., Ramsey M.J. et al. On the frequency of chromosome exchanges in a control population measured by chromosome painting// Mutat. Res.1994. V. 313.-P. 193-202.

97. Tucker J.D., Morgan W.F., Awa A.A. et al. PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting//Mutat. Res.1995. V. 347.-P. 21-24.

98. Tucker J.D., Ramsey M.J., Lee D.A. et al. Validation of chromosome painting as biodosimeter in human peripheral lymphocytes following acute exposure to ionizing radiation in vitro II Int. J. Radiat. Biol. 1993. V.64. - P. 27-37.

99. Venkatachalam P., Solomon F.D., Prabhu В. K. Estimation of dose in cancer patients treated with fractionated radiotherapy using translocation, dicentrics andmicronuclei frequency in peripheral blood lymphocytes. // Mutat. Res. 1999. - V. 429.-P. 1-12

100. P. Voisin, R. G. Assael, A. Heidary, R. Varzegar, F. Zakeri, V. Durand and 1. Sorokine-Durm. Mathematical methods in biological dosimetry: the 1996 Iranian accident // Int. J. Radiat. Biol. 2000. V. 76. - P. 1545-1554.

101. Whitehouse C. A., Edwards A. A., Tawn E. J. et al. Translocation yields in peripheral blood lymphocytes from control populations // Int. J. Radiat. Biol. -2005. V. 81. N2.-P. 139-145.