Стабильные и нестабильные хромосомные аберрации в лимфоцитах крови человека, индуцируемые излучениями с разными ЛПЭ

Репин, Михаил Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Стабильные и нестабильные хромосомные аберрации в лимфоцитах крови человека, индуцируемые излучениями с разными ЛПЭ
ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Стабильные и нестабильные хромосомные аберрации в лимфоцитах крови человека, индуцируемые излучениями с разными ЛПЭ"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ РАДИОЛОГИИ И АГРОЭКОЛОГИИ

19-2000-250

На правах рукописи УДК 577.346: 577.217

ГГ5 ОД РЕПИН 2 5 ДЕК 23СЗ ; '

Михаил Васильевич

СТАБИЛЬНЫЕ И НЕСТАБИЛЬНЫЕ ХРОМОСОМНЫЕ АБЕРРАЦИИ В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ИНДУЦИРУЕМЫЕ ИЗЛУЧЕНИЯМИ С РАЗНЫМИ ЛПЭ

Специальность: 03.00.01 —радиобиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

¿С^

ЭЛ.«-*0**

Обнинск 2000

Работа выполнена в Отделении радиационных и радиобиологических исследований Объединенного института ядерных исследований. Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Е.А. Красавин кандидат биологических наук Р.Д. Говорун. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор A.B. Севанькаев

доктор биологических наук С.А. Гераськин.

Ведущая организация: Институт общей генетики, г. Москва.

Защита диссертации состоится 13 декабря 2000 г. в 13 ч 00 мин. на заседании Диссертационного совета по радиобиологии Д 120.81.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 249020, Калужская обл., г. Обнинск ВНИИСХРАЭ, Диссертационный совет Д 120.81.01.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной радиологщ и агроэкологии.

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу: 249020, Калуж екая обл., г. Обнинск, ВНИИСХРАЭ, Диссертационный сове-Д 120.81.01.

Автореферат разослан " Od " ноября 2000 г

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Eili4.i2>L} о FW о

Санжарова Н.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Проблема биологического действия ионизирующих излучений с разными физическими характеристиками является весьма актуальной в радиобиологии. Это обусловлено необходимостью решения многих задач: радиоэкологических проблем; вопросов нормирования лучевых нагрузок у лиц, работающих в смешанных полях ионизирующих излучений; про-элем радиационной безопасности космических полетов человека; использования источников ионизирующих излучений для лучевой терапии онкозаболеваний и др.

Наименее изученным является мутагенное действие плотноионизирующих излучений, прежде всего, на клетки высших эукариот, в том числе человека, практически не изучены закономерности образования стабильных хромосомных мутаций при действии ионизирующих излучений разного качества. Иссле-ювание этих закономерностей представляется весьма важным, поскольку стабильные аберрации способны длительно сохраняться в популяциях облученных клеток. С ними связано, по общепризнанному мнению, разяитие мутагенных процессов в организме и канцерогенез.

Количественный учет стабильных хромосомных аберраций может также осматриваться как один из надежных способов для разработки и применения методов биодозиметрии, особенно в отдаленные сроки после лучевого воздей-;твия. Классические цитогенетические методы, применяемые в биодозимет-)ии, основаны на учете нестабильных хромосомных аберраций (дицентрики и сольца). Возможность оценки поглощенной дозы при этом ограничивается >стрым периодом после лучевого воздействия. Большим достижением явилась >азработка техники флуоресцентной гибридизации in situ — FISH-метода. Он юзволяет выявлять стабильные аберрации хромосом (транслокации) в клетках. 3 настоящее время во многих научных лабораториях с использованием FISH-1етода ведутся исследования образования стабильных и нестабильных аберра-шй хромосом в клетках человека при действии рентгеновских и у-лучей. Толь-:о в последние годы начали появляться единичные работы по исследованию табильных хромосомных аберраций, возникающих в клетках человека при [ействии плотноионизирующих излучений.

Реализация программы длительных космических полетов человека также [оставила задачу детального изучения биологического действия протонов ре-ятивистских энергий, составляющих основную часть спектра космических

излучений.

Учитывая актуальность, научную и практическую значимость изучения генетического действия ионизирующих излучений разного качества, а также неполноту сведений в этой области, мы провели исследование закономерностей формирования стабильных и нестабильных аберраций хромосом в лимфоцитах человека при действии разных видов ионизирующих излучений широкого диапазона линейной передачи энергии (ЛПЭ).

Цель и основные задачи исследования. Целью исследования явилось сравнительное изучение количественных и качественных закономерностей образования стабильных и нестабильных аберраций хромосом в лимфоцитах крови человека с использованием Р1БН-техники и стандартного метафазного метода анализа при действии ионизирующих излучений, различающихся по ЛПЭ в широком диапазоне: у-лучей, ускоренных протонов с энергией 1 ГэВ (ЛПЭ -0,218 кэВ/мкм) и ионов азота 14Ы с энергией 50МэВ/нуклон (ЛПЭ -77 кэВ/мкм).

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

— изучить дозовые зависимости частоты образования стабильных аберраций хромосом в лимфоцитах крови человека, детектируемых Р15Н-методом, при у-облучении и действии ускоренных протонов и ионов азота |4Ы,

— изучить дозовые зависимости частоты образования разных видов нестабильных аберраций хромосом в лимфоцитах крови человека, детектируемых стандартным метафазным и Р18Н-методами, при действии у-лучей, протонов и ионов азота |4М,

— провести сравнительный анализ выявленных закономерностей индукции стабильных и нестабильных аберраций хромосом в лимфоцитах человека при действии исследованных видов ионизирующих излучений,

— провести оценку ОБЭ протонов с энергией 1 ГэВ и ускоренных ионов азота по цитогенетическим показателям,

— оценить возможность использования теста "стабильных аберраций хромосом" для целей биологической дозиметрии.

Научная новизна. В работе впервые:

— исследованы Р1БН-методом закономерности образования стабильных и нестабильных аберраций хромосом-1 и -2 при облучении лимфоцитов крови человека разными дозами ускоренных протонов с энергией 1 ГэВ,

— исследованы Р18Н-методом закономерности образования стабильных и

нестабильных аберраций хромосом-1 и -2 при облучении лимфоцитов крови человека разными дозами ускоренных ионов азота 14N с энергией 50 МэВ/нуклон (ЛПЭ -77 кэВ/мкм),

— исследованы стандартным метафазным методом нестабильные хромосомные аберрации в лимфоцитах крови человека при облучении разными дозами протонов с энергией 1 ГэВ,

— исследованы стандартным метафазным методом нестабильные хромосомные аберрации в лимфоцитах крови человека при облучении разными дозами ускоренных ионов азота 14N с энергией 50 МэВ/нуклон,

— предложена модифицированная методика для пересчета уровней аберраций отдельных хромосом, детектируемых FISH-методом, на геномные частоты хромосомных аберраций, применимая для случаев использования нескольких флуорохромов одновременно и для разных геномов. Она была применена для расчета геномных частот аберраций в лимфоцитах крови человека, облученных ускоренными ионами азота HN и протонами с энергией 1 ГэВ, на основе данных FISH-анализа аберраций хромосом-1 и -2.

Научно-практическая значимость работы. Исследования стабильных хромосомных аберраций после воздействия ионизирующих излучений разного качества имеют фундаментальное значение для установления количественных и качественных закономерностей их формирования в клетках человека. Результаты работы могут быть использованы для радиобиологического обоснования применения разных видов ионизирующих излучений в лучевой терапии новообразований, для научного обоснования предельно допустимых уровней облучения человека при воздействии ионизирующих излучений с разными значениями ЛПЭ, при разработке и применении методов непосредственной и ретроспективной биодозиметрии.

Публикаиии и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 9 работ. Основные результаты доложены на Межд. симп. "Radiation Biology and its Application in Space Research. Mutation Induction by Ionizing Radiation" (Brno, ¿R, 1994); Раб. совещ. "Современные проблемы радиобиологии" (Дубна, 1996); Межд. симп. "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии" (Москва-Дубна, 1997); Межд. раб. совещ.: NATO-Advanced Research Workshop "Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation" (Brno, CR, 1997); Межд. раб. совещ. "10л Annual Space Radiation Health Investigators' Workshop" (Upton, N.-Y., USA, 1999); на семинарах Отде-

ления радиационных и радиобиологических исследований ОИЯИ, Дубна. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 106 страницах, состоит из введения, 4 глав и выводов, содержит 8 таблиц и 19 рис. Список литературы включает 147 названий на русском и английском языках.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы лимфоциты человека, выделенные из свежевзятой крови здоровых доноров (23-40 лет, $ и <$). Культивирование лимфоцитов и приготовление препаратов для цитогенетического анализа проводили по общепринятой методике.

у-облучение лимфоцитов проводили в стеклянных флаконах (по 3 мл плазмы крови): для последующего FISH-анализа — у-лучами 137Cs в дозах 1-7 Гр (мощность дозы 3,6 Гр/мин), для анализа стандартным метафазным методом — у-лучами 60Со в дозах 0,5-5 Гр (мощность дозы -0,7 Гр/мин). Облучение лимфоцитов ионами азота l4N с энергией 50 МэВ/нуклон (ЛПЭ ~77 кэВ/мкм) проводили на ускорителе тяжелых ионов У-400М ОИЯИ в дозах 0,5-3 Гр (мощность дозы — 6 Гр/мин) с помощью физико-дозиметрической установки "Геном" (Череватенко А.П., 1986, 1989), обеспечивавшей формирование пучка, определение ЛПЭ частиц и дозы облучения в биообъекте, автоматическую смену образцов. Облучение лимфоцитов протонами с энергией 1 ГэВ (ЛПЭ ~0,218 кэВ/мкм) проводили в эппендорфовских пробирках на синхрофазотроне ОИЯИ в дозах 0,15-3,6 Гр. Поток протонов при поглощенной дозе в 1,0 Гр составил 2,7Ы09 частиц/см2 (Timoschenko G.N. et al., 1999).

Препараты для анализа стандартным метафазным методом подвергали гидролизу 5N HCl (10 мин при ~20°С), окрашивали 15 мин 3% раствором Гимза на фосфатном буфере (pH 6,8). Для учета хромосомных аберраций использовали световые микроскопы. Для гибридизации in situ хромосомы-1 использовали биотинилированные пробы ДНК ("Cambio", UK), для хромосомы-2 — дигок-сигенированные пробы ДНК ("Oncor", UK), для выявления центромер -— флуоресцеиновые пан-центромерные пробы ДНК ("Cambio", UK). Процедуры проводили согласно инструкциям фирм. Для FISH-анализа лимфоцитов использовали компьютеризированные флуоресцентные микроскопы ("Zeiss", "Leica", Germany; "Hamamatsu", Japan). Хромосомные аберрации классифицировали в соответствии с общепринятой номенклатурой и модифицированным вариантом PAINT-системы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цитогенетический анализ лимфоцитов крови человека свидетельствует о выраженном повреждающем воздействии у-лучей, ускоренных протонов и ионов азота на хромосомный аппарат клеток.

Клетки с хромосомными аберрациями

Данные по частотам клеток с хромосомными аберрациями, детектируемыми в облученных лимфоцитах стандартным метафазным методом в геноме в целом или ИБН-методом в хромосомах-1 и -2, приведены на рис. 1 и 2. Они :видетельствуют о высокой частоте повреждений хромосом-1 и -2. Вместе с гем, по уровням клеток с аберрациями хромосомы-1 или -2 существенных от-тичий не отмечено.

При воздействии протонами и у-лучами наблюдается линейный характер дезовой зависимости частоты образования клеток с хромосомными аберра-1иями при анализе обоими методами. Не отмечено существенных различий по щнному показателю при действии у-излучения и протонов высоких энергий. 1астота аберрантных клеток после облучения ионами азота свидетельствует об IX высокой эффективности. Частоты клеток с аберрациями хромосомы-1 и :ромосомы-2 резко увеличиваются уже при дозах 0,5-0,75 Гр, достигая 45%

Доза, Гр Доза, Гр

ис. 1. Дозовые зависимости частоты кле- Рис. 2. Дозовые зависимости частоты клеток

эк с аберрациями хромосом-1 (темные с хромосомными аберрациями после облуче-

тчки) и -2 (светлые значки) после облу- ния лимфоцитов крови человека у-лучами (• )

гния лимфоцитов крови человека у-луча- протонами ( □) и ионами азота N ( Д )

и ( • ), протонами (■□) и ионами азота (стандартный метафазный метод) N (Ад) (Р18Н-метод)

(рис. 1). В последующем при увеличении доз до 3 Гр эффекты линейно возрастают до уровня -65%. При анализе стандартным метафазным методом зависимость частоты образования клеток с аберрациями от дозы облучения ионами азота имеет линейный характер на начальном участке кривой, но при дозах >2 Гр наблюдается отклонение от линейности со снижением уровня эффекта.

При действии редкоионизирующих излучений в диапазоне исследованных доз в клетках наблюдалось повреждение только одной из двух гомологичных хромосом. При действии ионов 14N число клеток с обоими поврежденными гомологами существенно повышалось. Среди проанализированных клеток после облучения дозами 0,5-1,5 Гр обнаружено 4-7% клеток с обеими поврежденными хромосомами-1 и 7-11% клеток с поврежденными хромосомами-2. С увеличением дозы до 3 Гр их число возрастало до 20-30%. Кроме того, в 0,8% проанализированных клеток были выявлены дицентрики из гомологичных хромосом-1. Доля клеток с обоими поврежденными гомологами от общего числа аберрантных клеток составила 12-14% для хромосом-1 и 17-20% для хромосом-2, достигая 30-40% при дозе 3 Гр, то есть суммарно число клеток с аберрациями обоих гомологов этих хромосом увеличивалось от почти 30% до 60% и более при увеличении дозы ионов азота от 0,5 до 3 Гр.

Общее число хромосомных аберраций

Данные по общему числу хромосомных аберраций, детектированных в лимфоцитах крови человека FISH- и стандартным метафазным методами, приведены на рис. 3 и 4. Видно, что при действии протонов и у-лучей зависимость эффекта от дозы облучения описывается линейно-квадратичной функцией. Выявлена высокая эффективность ионов азота, при этом зависимость эффекта от дозы облучения приближается к линейной.

Кривые зависимости общего числа аберраций от дозы облучения протонами по уровням эффекта существенно не отличаются от у-излучения как при FISH-анализе отдельных хромосом-1 и -2, так и при стандартном метафазном исследовании генома в целом. После облучения лимфоцитов ускоренными ионами азота 14N наблюдаются высокие уровни повреждения хромосом-1 и -2. Частоты их аберраций резко увеличиваются уже при воздействии в дозах 0,5— 0,75 Гр. При метафазном анализе повреждений хромосом генома в целом выявлено снижение эффекта при наиболее высокой дозе облучения (3 Гр). Нами

Рис. 3. Дозовая зависимость общего числа абер- Рис. 4. Дозовая зависимость общего числа раций хромосомы-1 в лимфоцитах крови чело- хромосомных аберраций в лимфоцитах кро-века после облучения у-лучами (• ), протона- "и человека после облучения у-лучами (• ), ми ( □) и ионами азота ( Д) (Р^Н-метод) протонами ( □ ) и ионами азота (Д )

(стандартный метафазный метод)

не отмечено существенных различий по уровню аберраций, возникающих в хромосомах-1 и -2, после облучения как протонами, так и ионами азота.

Стабильные аберрации хромосом: транслокацин и инсерции

Основную часть стабильных аберраций хромосом-1 и -2 в лимфоцитах крови человека, облученных исследованными видами излучений, составили транслокации. Были найдены лишь единичные инсерции в хромосомах-1 и -2 и только после облучения ионами |4Ы в дозе 3 Гр их частота оказалась повышенной до 13 на 100 проанализированных клеток. Не отмечалось существенных различий по уровню транслокаций, индуцируемых в хромосомах-1 и -2. После /-облучения транслокации составляли до 45% от общего числа аберраций, выявляемых в хромосомах-1 Р18Н-методом. Близко к такому уровню их количество и после облучения протонами. Но их доля от общего числа аберраций, индуцированных ионами азота, оказалась равной -25%.

При действии у-лучей и протонов наблюдается линейно-квадратичная зави-:имость частоты транслокаций от дозы облучения (рис. 5). При этом не отменно существенных количественных отличий при их воздействии. Наиболее шсокий уровень транслокаций хромосом-1 и -2 выявлен при действии ионов вота, причем зависимость эффекта от дозы описывалась линейной функцией.

о о

I 10

X о

0 1 2 3 4 -5 6 7 8 Доза, Гр

Рис. 5. Дозовые зависимости частоты транслокаций хромосомы-1 после облучения лимфоцитов крови человека у-лучами (в ), протонами с энергией 1 ГэВ (в ) и ионами азота N (* )

Нестабильные хромосомные аберрации

Полученные данные по частоте образования нестабильных аберраций хромосом в лимфоцитах крови человека после воздействия исследованными видами излучений свидетельствуют о том, что наибольшее число хромосомных аберраций, выявляемых при анализе стандартным метафазным методом, составляют дицентрики (до -40% от общего числа). Кроме того, отмечена высокая частота образования интерстициальных делеций, сопоставимая с выходом фрагментов. Для фрагментов характерна линейная зависимость эффекта от дозы для всех видов излучений. Дозовые зависимости частоты образования дицентриков и интерстициальных делеций при действии протонов и у-лучей описываются линейно-квадратичной функцией, а при действии ионов азота она близка к линейной. По сравнению с воздействием у-лучей и протонов с энергией 1 ГэВ облучение лимфоцитов ионами азота 14Ы сопровождалось увеличением образования и дицентриков и интерстициальных делеций.

При анализе Р18Н-методом также были выявлены разные виды нестабильных аберраций хромосом-1 и -2 лимфоцитов человека. Ионы азота индуцировали наибольшее число разных видов таких аберраций: при действии даже в невысоких дозах наблюдалось значительное повышение частоты их образования по сравнению с воздействием редкоионизирующими излучениями. Вместе с тем, обращает внимание весьма низкий уровень выявляемых колец. Частота

>бразования дицентриков повышалась с увеличением дозы облучения до мак-имума в 10-13% при наибольших исследованных дозах всех видов излучений. 1ри этом в случае облучения протонами и у-лучам и частота образования ди-(ентриков характеризовалась линейно-квадратичной зависимостью от дозы, вровень дицентриков, образующихся с участием хромосомы-1, оказался более ысоким в случае облучения прогонами по сравнению с у-лучами.

После облучения ионами азота при Р18Н-анализе отмечены высокие часто-ы образования фрагментов хромосом-1 и -2 — до 50% всех выявленных аберраций. Уже при воздействии наименьших доз (0,5-0,75 Гр) фрагментоз хромо-ом-1 и -2 оказался резко повышенным. Для всех видов излучений характерна инейная зависимость частоты фрагментов от дозы облучения. По данному юказателю не выявлено существенных количественных отличий при воздей-твии протонами и у-лучами.

ОБЭ протонов и ионов азота |41Ч

В таблице сведены данные по ОБЭ ускоренных протонов и ионов азота |4Ы [0 сравнению с у-излучением. Коэффициенты ОБЭ определены по разным ци-

Таблица. Коэффициенты ОБЭ протонов с энергией 1 ГэВ и ионов азота (оценка по разным цитогенетическим тестам)

Тест Протоны, 1 ГэВ Ионы азота

Р^Н-метод Стандартный мета-фазный метод Р18Н-метод Стандартный мета-фазный метод

Клетки с аберрациями хромосом 0,9 1,0 3,4 2,0

Общее число аберраций хромосом 1,4 0,9 6,0 2,6

Транслокации 1,1 — 3,1 —

Дицентрики 1,7 0,9 5,2 2,3

Интерстициальные делеции — 1,0 — 2,5

Фрагменты 0,7 1,0 5,7 2,0

тогенетическим показателям. Приведенные данные свидетельствуют о том, чтс по большинству тестов протоны с энергией 1 ГэВ (ЛПЭ -0.218 кэВ/мкм) пс своей эффективности сходны с у-излучением. Коэффициенты ОБЭ протонов близки к единице — 0,9-1,1. Единичные показатели несколько превышали эти величины, что, вероятно, определяется некоторыми методическими особенностями. В несколько раз более эффективными являются ионы азота с ЛПЭ -77 кэВ/мкм. При этом более высокие значения коэффициентов ОБЭ были получены по данным FISH-анализа. Если при метафазном анализе нестабильных хромосомных аберраций в геноме в целом коэффициенты ОБЭ ионов азота, оценка которых проведена по разным тестам, находились в пределах 2,02,6, то по данным FISH-анализа хромосом-1 и -2 они оказались более высокими и составили от 3,1 до 6,0.

Математические подходы для сопоставления частот хромосомных

аберраций, выявляемых FISH- н стандартным метафазным методами

В нашем исследовании были выведены формулы, позволяющие рассчитать геномные частоты образования транслокаций FT, дицентриков Fü и фрагментов Fa путем пересчета на полный геном их частот Ft, Fd и Fa, детектируемых при окрашивании "и" хромосом в разные цвета:

где С( — доля /-ой хромосомы в геноме, N — общее число хромосом в геноме. По этим формулам был проведен пересчет на полный геном частот абер-

раций хромосом-1 и -2, исходя из их доли в геноме (С, = 0,082 и С2 =0,08 )•

Сравнение геномных частот образования дицентриков, определенных стандартным метафазным и FISH-методами, показывает аналогичный характер их зависимостей от дозы облучения при воздействии соответствующими видами ионизирующих излучений. Однако при облучении лимфоцитов человека разными дозами у-лучей отмечено превышение в 2,5-5 раз частоты образования дицентриков, определенных стандартным метафазным методом, над частотой образования дицентриков, пересчитанных на полный геном по данным, полученным для хромосом-1 и -2.

При сравнении частот образования транслокаций хромосом-1 и -2, пересчитанных на полный геном, и частот образования дицентриков, определенных стандартным метафазным методом, выявлен аналогичный характер их дозовых зависимостей при воздействии соответствующими исследованными видами излучений. Однако показано превышение геномных частот образования транслокаций над уровнем дицентриков.

Что касается фрагментов, то полученные данные свидетельствует о превышении пересчитанных на полный геном частот образования фрагментов, детектированных FISH-методом в хромосомах-1 и -2, над их частотами, выявленными стандартным метафазным методом: после у-облучения в исследованных дозах в 3,9-6,3 раза, после воздействия протонами в 2,2-4,8 раза и ионами азота в 21-25.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В проведенном исследовании проанализирована частота разных видов аберраций хромосом в лимфоцитах крови человека после их облучения у-лучами, ускоренными протонами с энергией 1 ГэВ (ЛПЭ -0,218 кэВ/мкм) и ионами азота l4N с энергией 50 МэВ/нуклон (ЛПЭ -77 кэВ/мкм) с использованием FISH-техники и стандартного метафазного метода исследования. FISH-методом были выявлены стабильные аберрации хромосом-1 и -2, основную часть которых составили транслокации.

Частота образования транслокаций, выявленных при воздействии разных доз у-облучении, в 3-5 раз превышала частоту образования дицентриков, детектированных FISH-методом в хромосоме-1. Полученные результаты находятся в соответствии с ранними данными Lucas J.N. et al. (1989), отмечавшими при разных дозах у-лучей такие превышения в 1,2-9 раз, Cremer Т. et al. (1990)

— в 1-12 раз и Natarajan А.Т. е/ а1. (1992) — в 1,5-9 раз. Однако авторы предполагают, что это обстоятельство связано, вероятнее всего, с затрудненным выявлением центромер (и соответственно дицентриков) при анализе "окрашенных" хромосом, что могло привести к сдвигам в соотношении между этими аберрациями в случае, если дицентрик оценивался как простая транслокация (нереципрокная). При облучении лимфоцитов протонами, которые являются редкоионизирующим излучением и по своей эффективности аналогичны воздействию у-лучей, Р1БН-анализ хромосом был проведен нами с дополнительным окрашиванием их центромерных регионов флуоресцентным красителем при использовании пан-центромерных проб. Величины соотношений между транслокациями и дицентриками для хромосомы-1 после облучения в дозах свыше 1 Гр хотя и оказываются сниженными по сравнению о у-излучением, тем не менее, выход транслокаций оставался примерно в 1,4 раза более высоким, чем дицентриков. Причем, при облучении в дозах менее 1 Гр были обнаружены только транслокации. Что касается воздействия ускоренными ионами азота 14Ы (ЛПЭ ~77 кэВ/мкм), то, как и при у-облучении, соотношение между транслокациями и дицентриками составило в среднем около 3,5. Превышение уровня транслокаций над дицентриками было отмечено также РиББе! К. е1 аI. (1997) при ИБН-анализе хромосом-4 и -8 в фибробластах человека, облученных ионами |2С (ЛПЭ -16,2 кэВ/мкм) и рентгеновскими лучами: в 1,7 и в 2,4 раза соответственно.

Сопоставление полученных нами данных показало, что при воздействии всеми исследованными видами ионизирующих излучений в дозах более 1 Гр пересчитанные на полный геном частоты транслокаций, детектированных ИБН-методом в хромосомах-1 и -2, примерно в 2 раза выше, чем частоты дицентриков, выявленных в лимфоцитах стандартным метафазным методом.

Как видно на рис. 5, частоты образования транслокаций увеличиваются с дозой при воздействии как у-лучами, так и ионами азота в диапазоне исследованных доз. Что касается дицентриков, то в случае облучения клеток ионами азота их частоты достигают максимума (соответствующего примерно одному дицентрику на клетку), который наблюдается при дозе 1,5 Гр при анализе И8Н-методом или 2 Гр при анализе стандартным метафазным методом, и затем снижаются. Тенденция к снижению их частот отмечается также при анализе стандартным метафазным методом у-облученных лимфоцитов в высоких дозах (5 Гр). Такое снижение, очевидно, определяется выраженной задержкой

целения или более поздним вступлением в митоз клеток, содержащих более одного дицентрика. Отражением этого может служить также наблюдаемое отклонение от линейности дозовой зависимости частот клеток с хромосомными аберрациями (со снижением их уровня) при аналогичных величинах доз облучения ионами азота или у-лучами (рис. 2).

Наблюдаемые различия в геномных частотах образования фрагментов, детектируемых разными методами, возможно, определяются методическими особенностями FISH-аналнза метафазных клеток. При этом затруднена идентификация таких аберраций хромосом как интерстициальные и хроматидные делеции и их дифференцировка от свободных фрагментов хромосом. Однако если сравнивать пересчитанные на весь геном частоты фрагментов хромосом-1 и -2, выявленных FISH-методом, с суммой частот интерстициальных делеций, хромосомных и хроматидных фрагментов, детектированных стандартным ме-тафазным методом в геноме, то они остаются повышенными в среднем в 1,21,4 раза в случаях облучения у-лучами и протонами и в 8 раз при облучении ионами азота l4N.

Результаты такого рассмотрения подтверждают предположение о более высокой вероятности повреждения хромосом-1 и -2 по сравнению с другими хромосомами генома при воздействии ионизирующими излучениями, особенно плотноионизирующих. Что касается последних, то в имеющихся единичных работах (Griffin C.S. et а!., 1995) также был отмечен высокий уровень фрагментов, не связанных с обменами, при изучении FISH-методом хромосомных аберраций в фибробластоидных клетках человека после облучения а-частицами.

К настоящему времени накапливаются данные, которые указывают на разную радиочувствительность отдельных хромосом в геноме человека при воздействии редкоионизирующнх излучений. Причем она не может быть объяснена только на основе предположения о пропорциональности радиочувствительности хромосом их длине. Так, конденсированный хроматин в эмбриональных фибробластах китайского хомячка оказывается более резистентным к радиаци-онно-индуцированным повреждениям по сравнению с неконденсированным хроматином (Natarajan А.Т. et ai, 1994). Ранее это было отмечено для лимфоцитов человека (Vyas R.X. et al., 1991). Выявлено различие в кинетике репарации хромосом: процессы репарации проходят более быстро в эухроматине, чем в гетерохроматине (Sliepcevic P. and Natarajan А.Т., 1994). В нашем исследова-

нии (Ьика§оуа Е. е/ а/., 1997; 1999) также наблюдалась высокая индукция аберраций в хромосоме-1 по сравнению с У-хромосомой при облучении лимфоцитов нейтронами (Е « 7 МэВ) и у-лучами. Принимая во внимание эти результаты, можно предположить, что наблюдаемая в наших экспериментах высокая частота аберраций в хромосомах-1 и -2 по сравнению с остальным геномом может определяться эухроматиновой структурой этих хромосом. Кроме того, полученные в последнее время данные с применением Р18Н-техники "окрашивания" отдельных хромосом непосредственно в интерфазных ядрах клеток показывают, что хромосомы в них специфически плотно упакованы и занимают строго отграниченную территорию в клеточном ядре (СгетегС. ег а/., 1996). Отсюда следует предположение, что вероятность образования аберраций между хромосомами, граничащими в ядре клетки друг с другом, будет выше, чем между хромосомами, имеющими те же физические длины, но пространственно разделенными друг от друга.

Таким образом, на данный момент ясно, что различие в радиочувствительности отдельных хромосом не может быть объяснено только на основе их физической длины. Эти обстоятельства наряду с другими, связанными с особенностями используемых методов, могли сказаться и на различиях в коэффициентах ОБЭ протонов с энергией 1 ГэВ и ионов азота 14Ы, рассчитанных нами по разным цитогенетическим показателям при анализе стандартным метафазным и Р18Н-методами (табл.).

Для суждения об уровне симметричных обменных аберраций во всем геноме может быть полезным установление соотношения между фракцией транслокаций и фракцией дицентриков и колец, выявляемых в хромосомах-1 и -2 Р1БН-методом. Так, по полученным нами данным, не отмечено существенных количественных отличий между ними при Р18Н-анализе обеих хромосом в лимфоцитах, облученных протонами или ионами азота в дозах >1 Гр. Доли этих видов аберраций составили при облучении протонами около 35 %, а ионами азота — около 25 %. Мы можем предположить, что такие соотношения между фракциями симметричных и несимметричных обменов сохранятся и во всем геноме. Было суммировано количество транслокаций, пересчитанных на весь геном, исходя из их уровней в хромосомах-1 и -2, с общим числом аберраций, детектированных стандартным метафазным методом во всем геноме, и рассчитаны доли транслокаций и доли дицентриков и колец от такого суммарного числа хромосомных аберраций. Действительно, при воздействии редкои-

онизирующими излучениями (у-лучами, протоны с энергией 1 ГэВ) доли этих видов аберраций от их общего числа составили около 30-35 %. При воздействии ионами азота доля дицентриков и колец также имела близкие значения — в среднем 27 %. Но доля транслокаций оказалась существенно более высокой и в среднем составила 48 %. Видимо, не исключается вероятность того, что воздействие излучений с высокими плотностями ионизации обеспечивает некоторые преимущества для формирования симметричных обменных аберраций по сравнению с несимметричными.

ВЫВОДЫ

1. Исследованы классическим метафазным и РГБИ-методами закономерности образования нестабильных и стабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении ионизирующими излучениями с разными физическими характеристиками: у-лучами в дозах 1—7 Гр, ускоренными протонами с энергией 1 ГэВ (ЛПЭ -0,218 кэВ/мкм) в дозах 0,15-3,6 Гр и ионами азота 14Ы с энергией 50 МэВ/нуклон (ЛПЭ -77 кэВ/мкм) в дозах 0,53,0 Гр. Выявлены количественные и качественные особенности их действия по цитогенетическим показателям.

2. Установлена с использованием Р18Н-метода высокая частота стабильных аберраций хромосом-1 и -2 (транслокации и инсерции) при действии ионизирующих излучений разного качества. Основная часть стабильных аберраций представлена транслокациями хромосом. Данный тип нарушений составляет значительную часть от общего числа хромосомных аберраций: при у-облучении и действии протонов их вклад достигает -40^4-5%, при облучении ионами азота на их долю приходится -25%.

3. В экспериментах с использованием Р1БН-метода выявлен линейно-квадратичный характер зависимостей от дозы общего числа хромосомных аберраций, частоты дицентриков и транслокаций хромосом-1 и -2 при действии редкоионизирующих излучений и показан линейный характер дозовых зависимостей для числа клеток с аберрациями и частоты фрагментов. Аналогичный характер дозовых зависимостей получен при анализе хромосомных аберраций классическим метафазным методом.

4. Облучение ускоренными ионами азота характеризуется линейным характером дозовых зависимостей разных цитогенетических показателей при оценке классическим метафазным и ИБН-методами. По тесту частоты образо-

вания аберрантных клеток и дицентриков хромосом при дозах >2 Гр отмечено отклонение от линейности со снижением величин радиационно-индуцированных эффектов.

5. Установлено отсутствие различий между хромосомой-1 и хромосо-мой-2 по частотам повреждений при действии излучений, различающихся по ЛПЭ в широком диапазоне (протоны и ионы азота).

6. Показано, что частота образования транслокаций, выявленных FISH-методом, превышает частоту возникновения дицентриков хромосом-1 и -2 в 4,3; 1,4 и 3,5 раз при действии у-лучей, протонов и ионов азота соответственно.

7. Выявлена методом FISH высокая частота образования фрагментов хромосом-1 и -2 (до 50% от общего числа хромосомных аберраций) при облучении клеток ионами азота. При действии у-лучей и протонов доля фрагментов составляет -25%.

8. Проведена оценка относительной биологической эффективности протонов с энергией 1 ГэВ и ионов азота с энергией 50 МэВ/нуклон. Коэффициенты ОБЭ протонов и ионов азота по выходу транслокаций составляют 1,1 и 3,1 соответственно. По другим цитогенетическим показателям коэффициенты ОБЭ протонов близки к единице. Коэффициенты ОБЭ ускоренных ионов азота находятся в пределах 2,0-2,6 при стандартом метафазном методе и 3,1-6,0 при анализе хромосом FISH-методом.

9. Предложен модифицированный математический метод для пересчета на полный геном частот транслокаций, дицентриков и фрагментов, выявляемых FISH-методом при "окрашивании" флуоресцентными красителями в разные цвета нескольких пар хромосом. Анализ результатов экспериментальных данных свидетельствует о более высокой радиочувствительности хромосом-1 и -2 среди других хромосом генома человека.

10. Получены калибровочные кривые по частоте стабильных аберраций (транслокаций) хромосомы-1, которые могут быть использованы для целей биологической дозиметрии в случаях неконтролируемого облучения человека у-лучами, высокоэнергетичными протонами, а также тяжелыми ионами с ЛПЭ в пределах 70-80 кэВ/мкм. В исследованных диапазонах доз точность оценки дозы редкоионизирующих излучений составляет 7-15%, для ионов азота -20%.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. LukaSov^ Е., Repin M.V., Govorun R.D., Krasavin Е.А., Horneck G., Kozubek S., 1995, Human lymphocytes chromosome-1-aberrations induced by y-rays identified by fluorescence in situ hybridization. In: "Radiation Biology and its Application in Space Research. Mutation Induction by Ionizing Radiation." Eds. S. Kozubek, G. Horneck. Proc. of the Symp., 10-12.11.1994, Nedvedice, Czech Republic. Kiramo, 1995, pp. 250-255.

I. Репин M.В., Говорун Р.Д., Лукашова E., Красавин E.A. и КозубекС., 1996, Стабильные и нестабильные хромосомные аберрации в лимфоцитах крови че-товека in vitro после у-облучения. // Радиац. биология и радиоэкология. Т. 36. Вып. 6. С. 848-851.

3. Репин М.В., Говорун Р.Д., Лукашова Е., Козубек С. и Красавин Е.А., 1997а, FISH-анализ стабильных и нестабильных аберраций хромосомы-1, индуцируемых у-лучами и ускоренными ионами азота в лимфоцитах крови человека. // Гез. Межд. симп. "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии", 22-25 января 1997, Москва, Дубна. С. 54.

I. Репин М.В., Говорун Р.Д., Красавин Е.А., Лукашова Е. и Козубек С., 19976, 715Н-анализ стабильных и нестабильных аберраций хромосомы-1, индуцируемых у-лучами и ускоренными ионами азота в лимфоцитах крови человека. — Гр. Межд. симп. "Проблемы биохимии, радиационной и космической биоло--ии", 1997, Дубна. Том 2. С. 49-56.

>. LukaSovd Е., Kozubek S., Govorun R.D., Kozubek М., Kroha V., Ryznar L. and lepin M.V., 1997, Aberrations induced by three different kinds of radiation in :hromosomes 1, 2 and Y human lymphocytes. // Abstr. NATO-Advanced Research tVorkshop: "Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radia-ion". 6-10 October, 1997, Brno, Czech Republic, p. 48.

). Krasavin E.A., Govorun R.D., Fedorenko B.S., Petrov V.M., Kozubek S., ^ukdSovd E., Repin M.V. and Druzhinin S.V., 1997, Cytogenetic effects of heavy ons in human lymphocytes. JINR, El9-97-170, Dubna, 1997, 14 pp.

Govorun R.D., LukaSovd E., Kozubek S., Repin M.V., Krasavin E.A. and Croha V., 1988, Induction of aberrations in human lymphocytes by y-rays and fast leavy ions. //JINR. E-19-98-31. Dubna, 1997, 19 pp.

!. Krasavin E., Govorun R., Repin M., Tymoshenko G., Lukashova M. and Ko-:ubek S., 1999, Chromosomal aberrations in human lymphocytes induced by 1 GeV

protons in vitro. In: 10th Annual Space Radiation Health Investigators' workshop, BNL, NASA, USRA. 13-16 June, Upton, N.Y., USA., 1999, p. 38. 9. LukàSovâ E., Kozubek S., Govorun R.D., Repin M.V., Ryznar L., Krasavin E., KozubekM. and Kroha V., 1999, Aberration induced in chromosomes 1, 2 and Y of human lymphocytes by three types of different LET value as detected by FISH. In: NATO Science Series 2: Environmental Security, Vol. 55. Eds.: Baumstark-Khan C., Kozubek S. and Horneck G., Kluwer Academic Publishers, 1999, pp. 195-202.

Рукопись поступила в издательский отдел 26 октября 2000 года.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Репин, Михаил Васильевич

Список условных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

Глава 2. Биологические материалы и методы исследования.

2.1. Получение лимфоцитов крови человека.

2.2. Физические характеристики излучений и условия облучения.

2.2.1. Гамма-облучение.

2.2.2. Облучение ускоренными ионами азота 14N.

2.2.3. Облучение протонами с энергией 1 ГэВ.

2.3. Культивирование лимфоцитов после облучения. Приготовление препаратов клеток для цитогенетического анализа.

2.4. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH-метод).

2.5. Анализ лимфоцитов метафазным и FISH-методами.

Глава 3. Результаты исследования.

3.1. Клетки с хромосомными аберрациями.

3.2. Общее число хромосомных аберраций.

3.3. Типы хромосомных аберраций.

3.3.1. Стабильные аберрации хромосом: транслокации и инсерции.

3.3.2. Анализ нестабильных хромосомных аберраций стандартным метафазным и FISH-методами.

3.3.3. ОБЭ протонов и ионов азота 14N.

3.3.4. Математические подходы для сопоставления частот хромосомных аберраций, выявляемых FISH- и стандартным метафазным методами.

3.4. Калибровочные кривые для оценки доз по тесту "стабильные аберрации хромосом".

Глава 4. Обсуждение результатов.

Выводы.

Список условных сокращений

ДНК — Дезоксирибонуклеиновая кислота

ЛПЭ — Линейная передача энергии

ОБЭ — Относительная биологическая эффективность

РНК — Рибонуклеиновая кислота

DAPI — 4',6-диамидино-2-фенилиндол

FISH — Fluorescence in situ hybridization

FITC — Fluoresceinisothiocyanate

MFISH— Multiple fluorescence in situ hybridization

PAINT — Protocol for Aberration Identification and Nomenclature

Terminology PBS — Фосфатно-солевой буфер PI — Пропидиум иодид SSC — Стандартный раствор цитрата натрия

Введение Диссертация по биологии, на тему "Стабильные и нестабильные хромосомные аберрации в лимфоцитах крови человека, индуцируемые излучениями с разными ЛПЭ"

Актуальность проблемы. Проблема биологического действия ионизирующих излучений с разными физическими характеристиками является весьма актуальной в радиобиологии. Это обусловлено необходимостью решения многих задач: радиоэкологических проблем, вопросов нормирования лучевых нагрузок у лиц, работающих в смешанных полях ионизирующих излучений, проблем радиационной безопасности длительных космических полетов человека, использования различных источников ионизирующих излучений для лучевой терапии онкологических заболеваний и др.

Наименее изученным является мутагенное действие плотноионизирующих излучений. Прежде всего, это касается исследования закономерностей и механизмов индукции мутаций у клеток высших эукариот — клеток млекопитающих и человека. Практически не изучены закономерности образования стабильных хромосомных мутаций при действии излучений разного качества. Исследование закономерностей и механизмов такого типа повреждений генетических структур представляется весьма важным, поскольку стабильные аберрации способны длительно сохраняться в популяциях облученных клеток и с ними связывается инициация ряда онкологических заболеваний. Так, в настоящее время установлена корреляция между возникновением хронической миелоид-ной лейкемии, острой миелоидной лейкемии, промиелотической лейкемии, лимфомы Беркитта и наличием транслокаций между различными хромосомами: <9; 22), 1(21; 8), 1(17; 15), <8; 14), соответственно.

Реализация программ длительных космических полетов человека ставит задачу детального изучения биологического действия протонов релятивистских энергий, составляющих значительную часть спектра космических излучений. В этой связи крайне важно определить биологическую эффективность таких излучений на основе различных показателей и, прежде всего, на основе учета индукции стабильных хромосомных аберраций. Количественный учет стабильных хромосомных нарушений в клетках организма может рассматриваться и как один из надежных способов для разработки и применения методов биологической дозиметрии, особенно в отдаленные сроки после лучевого воздействия на человека при случайных неконтролируемых облучениях организма.

Широко известные классические цитогенетические методы, применяемые для целей биологической дозиметрии, основаны на учете таких аберраций, как дицентрики и кольца (Moorhead P.S. et al, 1960; Hungerford D.А., 1965). Измерив частоту таких аберраций в клетках облученного организма или ткани и сравнив с калибровочной кривой, полученной для соответствующих клеток и вида излучения, можно определить дозу, полученную организмом в результате облучения. Однако возможность оценки поглощенной дозы при этом ограничивается острым периодом после лучевого воздействия, поскольку анализируемые хромосомные аберрации являются нестабильными и со временем быстро элиминируют из популяции облученных клеток.

Большим достижением явилась разработка в последние годы техники флуоресцентной гибридизации in situ (fluorescence in situ hybridization) — FISH-метода (Pinkel D. et al., 1986, 1988; Viscidi R.P. et al, 1986; Cremer T. et al, 1988). Он дает возможность выявлять отдельные хромосомы человека посредством их "окрашивания" с использованием специфических проб с уникальными нуклеотидными последовательностями ДНК этих хромосом (Collins С. étal., 1991; Krumlauf R. et al., 1982; Van Dilla M.A. étal, 1986). FISH-метод позволяет выявлять стабильные аберрации исследуемых хромосом в облученных и необлученных клетках. С его помощью рядом авторов (Léonard A. et al., 1998; Lindholm С. étal., 1998; Lucas J.N. et al, 1992; SalassidisK. et al, 1995) было показано, что стабильные хромосомные аберрации в клетках человека сохраняются даже спустя несколько десятков лет после облучения. Это привлекло к ним внимание, так как появилась возможность ретроспективной оценки дозы лучевого воздействия на человека.

В настоящее время во многих научных лабораториях проводятся исследования стабильных и нестабильных аберраций хромосом в клетках человека с использованием FISH-метода при действии рентгеновских и у-лучей. В последние годы появляются единичные работы по исследованию стабильных хромосомных аберраций, возникающих в клетках человека при действии плотноио-низирующих излучений: a-частиц (Griffin С.S. et al., 1995) и ускоренных тяжелых частиц (Durante M. et al., 1997; FüsselK. et al., 1997; Testará I. et al., 1997; Yang T.C. et al., 1997; Wu H. et al., 1997).

В связи с изложенным, учитывая актуальность, научную и практическую важность исследований генетического действия ионизирующих излучений разного качества, а также отсутствие достаточно полных сведений в этой области, нами было проведено исследование закономерностей формирования стабильных и нестабильных аберраций хромосом в лимфоцитах человека при действии излучений с разными ЛПЭ.

Цель и основные задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение количественных и качественных закономерностей образования стабильных и нестабильных аберраций хромосом в лимфоцитах крови человека с использованием FISH-техники и стандартного мета-фазного метода анализа при действии излучений, различающихся по ЛПЭ в широком диапазоне: у-лучей, протонов с энергией 1 ГэВ (ЛПЭ —0,218 кэВ/мкм), ускоренных ионов азота 14N (ЛПЭ -77 кэВ/мкм).

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: изучить дозовые зависимости частоты стабильных аберраций хромосом в лимфоцитах крови человека, детектируемых FISH-методом, при у-облучении и действии ускоренных протонов и ионов азота 14N, изучить дозовые зависимости частоты разных видов нестабильных аберраций хромосом в лимфоцитах человека, детектируемых стандартным мета-фазным и FISH-методами, при действии у-лучей, протонов и ионов азота 14N, провести сравнительный анализ выявленных закономерностей индукции стабильных и нестабильных аберраций хромосом в лимфоцитах человека при действии исследованных видов ионизирующих излучений, провести оценку ОБЭ протонов с энергией 1 ГэВ и ускоренных ионов азота 14И по цитогенетическим показателям, оценить возможность использования теста "стабильных аберраций хромосом" для целей биологической дозиметрии.

Научная новизна. В работе впервые: исследованы И8Н-методом закономерности образования стабильных и нестабильных аберраций хромосом-1 и -2 при облучении лимфоцитов крови человека разными дозами ускоренных протонов с энергией 1 ГэВ, исследованы И8Н-методом закономерности образования стабильных и нестабильных аберраций хромосом-1 и -2 при облучении лимфоцитов крови человека разными дозами ускоренных ионов азота 14Ы (Е=50 МэВ/нуклон), исследованы стандартным метафазным методом нестабильные хромосомные аберрации в лимфоцитах крови человека при облучении разными дозами протонов с энергией 1 ГэВ, исследованы стандартным метафазным методом нестабильные хромосомные аберрации в лимфоцитах крови человека при облучении разными дозами ускоренных ионов азота 14И (Е=50 МэВ/нуклон),

- предложена модифицированная методика пересчета уровней аберраций отдельных хромосом (транслокации, дицентрики, фрагменты), детектируемых ИБН-методом, на суммарные геномные частоты хромосомных аберраций, применимая для разных геномов и случаев использования нескольких флуоро-хромов одновременно. Она была применена для расчета суммарных геномных частот аберраций в лимфоцитах крови человека, облученных ускоренными ионами азота и протонами с энергией 1 ГэВ, на основе данных ИЗН-анализа аберраций хромосом-1 и -2.

Научно-практическая значимость работы. Исследования стабильных хромосомных аберраций после воздействия ионизирующими излучениями разного качества имеют фундаментальное значение для установления количественных и качественных закономерностей их формирования в клетках человека. 9

Результаты работы могут быть использованы для радиобиологического обоснования применения разных видов ионизирующих излучений в лучевой терапии новообразований, для научного обоснования предельно допустимых уровней облучения человека при воздействии излучений с разными значениями ЛПЭ, при разработке и применении методов непосредственной и ретроспективной биодозиметрии.

Заключение Диссертация по теме "Радиобиология", Репин, Михаил Васильевич

Выводы

1. Исследованы классическим метафазным и БКИ-методами закономерности образования нестабильных и стабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови человека при облучении ионизирующими излучениями с разными физическими характеристиками: у-лучами в дозах 1-7 Гр, ускоренными протонами с энергией 1 ГэВ (ЛПЭ -0,218 кэВ/мкм) в дозах 0,15-3,6 Гр и ионами азота с энергией 50 МэВ/нуклон (ЛПЭ ~77 кэВ/мкм) в диапазоне доз 0,5-3,0 Гр. Выявлены количественные и качественные особенности их действия по цитогенетическим показателям.

2. Установлена с использованием Р18Н-метода высокая частота стабильных аберраций хромосом-1 и -2 (транслокации и инсерции) при действии ионизирующих излучений разного качества. Основная часть стабильных аберраций представлена транслокациями хромосом. Данный тип нарушений составляет значительную часть от общего числа хромосомных аберраций: при у-облучении и действии протонов их вклад достигает -40-45%, при облучении ионами азота на их долю приходится ~25%.

3. В экспериментах с использованием Б^Н-метода выявлен линейно-квадратичный характер дозовых зависимостей для общего числа хромосомных аберраций, частоты дицентриков и транслокаций хромосом-1 и -2 и линейный характер дозовых зависимостей для числа клеток с аберрациями и частоты фрагментов при действии редкоионизирующих излучений. Аналогичный характер дозовых зависимостей получен при анализе хромосомных аберраций классическим метафазным методом.

4. Облучение ускоренными ионами азота характеризуется линейным характером дозовых зависимостей по разным цитогенетическим показателям при оценке классическим метафазным и ИЗН-методами. По тесту частоты образования аберрантных клеток и дицентриков хромосом при дозах >2 Гр отмечено отклонение от линейности величин радиационно-индуцированных эффектов.

5. Установлено отсутствие различий между хромосомой-1 и хромосомой-2 по частотам повреждений при действии излучений, различающихся по ЛПЭ в широком диапазоне (протоны и ионы азота).

7. Выявлена методом FISH высокая частота образования фрагментов хромосом» 1 и -2 (до 50% от общего числа хромосомных аберраций) при облучении клеток ионами азота. При действии у-лучей и протонов доля фрагментов составляет -25%.

8. Проведена оценка относительной биологической эффективности протонов с энергией 1 ГэВ и ионов азота с энергией 50 МэВ/нуклон. Коэффициенты ОБЭ протонов и ионов азота по выходу транслокаций соответственно составляют 1,1 и 3,1. По другим цитогенетическим показателям коэффициенты ОБЭ протонов близки к единице, а коэффициенты ОБЭ ускоренных ионов азота находятся в пределах 2,0-2,6 при стандартом метафазном методе и 3,1-6,0 при FISH-методе анализа хромосом.

9. Разработан математический метод пересчета на полный геном частот транслокаций, дицентриков и фрагментов, выявляемых FISH-методом для случаев "окрашивания" разными флуоресцентными красителями одной или нескольких пар хромосом. Анализ результатов пересчета экспериментальных данных свидетельствует о более высокой радиочувствительности хромосом-1 и -2 среди других хромосом генома человека.

10. Получены калибровочные кривые по частоте стабильных аберраций (транслокаций) хромосомы-1 для целей биологической дозиметрии в случаях неконтролируемого облучения человека у-лучами, высокоэнергетичными протонами, а также тяжелыми ионами с ЛПЭ в пределах 70-80 кэВ/мкм. Точность оценки дозы в исследованных диапазонах составляет 7-20%.

Заключение

Настоящее исследование является результатом работы, выполненной в Отделении радиационных и радиобиологических исследований Объединенного института ядерных исследований и в Лаборатории высокоточной цитометрии Института биофизики Академии наук Чешской республики (г. Брно). Оно стало возможным благодаря использованию пучков высокоэнергетичных заряженных частиц, генерируемых на базовых установках ОИЯИ — протонов релятивистских энергий на синхрофазотроне Лаборатории высоких энергий, ускоренных тяжелых ионов азота 14N на ускорителе У-400М Лаборатории ядерных реакций имени акад. Г.Н. Флерова, у-лучей на терапевтической установке "Рокус" Лаборатории ядерных проблем. Выражаю глубокую благодарность начальнику Отдела радиационных исследований ОРРИ ОИЯИ, кандидату физико-математических наук В.Е. Алейникову, кандидату физико-математических наук Г.Н. Тимошенко, В.П. Бамблевскому, А.П. Череватенко, В.П. Зорину, обеспечившим дозиметрию на этих пучках при облучении образцов с лимфоцитами крови человека. Приношу глубокую благодарность руководителю Лаборатории высокоточной цитометрии Института биофизики АН 4P доктору С. Козубеку, научным сотрудникам доктору Е. Лукашовой, А. Лишковой и всему коллективу сотрудников за предоставленную возможность выполнения работы по проведению FISH-анализа, помощь в овладении FISH-методикой, постоянное внимание и поддержку в ходе проведения работы по FISH. Самую искреннюю признательность и благодарность выражаю моим научным руководителям начальнику ОРРИ ОИЯИ доктору биологических наук, профессору Е.А. Красавину и кандидату биологических наук Р.Д. Говорун, которые своим содействием, постоянным вниманием и помощью, личным участием в этой работе сделали возможным ее выполнение.

В представленной работе излагаются результаты проведенных исследований по изучению количественных закономерностей выхода стабильных аберраций хромосом с использованием FISH-техники при воздействии излучений в широком диапазоне ЛПЭ и разных видов нестабильных аберраций хромосом при их анализе стандартным метафазным и FISH-методами; проведен сравнительный анализ полученных этими методами закономерностей индукции этих типов аберраций хромосом в лимфоцитах крови человека; проведена оценка ОБЭ ускоренных протонов с энергией 1 ГэВ (ЛПЭ -0,218 кэВ/мкм) и тяжелых ионов азота 14N (ЛПЭ -77 кэВ/мкм) по разным цитогенетическим показателям; предпринята попытка оценки возможности использования теста "стабильных аберраций хромосом (транслокаций)" для целей биологической дозиметрии при воздействии ионизирующих излучений, различающихся по ЛПЭ. Использование FISH-техники позволило получить качественно новую информацию о воздействии различающихся по ЛПЭ ионизирующих излучений на клетки человека.

Диссертационная работа изложена на 105 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырехглав и выводов, содержит 8 таблиц, 19 рисунков. Список литературы включает 148 названий, из которых 14 на русском и 1

134 на английском языках.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. LukasovaE., RepinM.V., GovorunR.D., Krasavin E.A., HorneckG.,

Kozubek S., 1995, Human lymphocytes chromosome-1-aberrations induced by y-rays identified by fluorescence in situ hybridization. In: "Radiation Biology and its Application in Space Research. Mutation Induction by Ionizing Radiation." Eds. S. Kozubek, G. Horneck. Proc. of the Symp., 1012.11.1994, Nedvedice, Czech Republic. Kiramo, 1995, pp. 250-255.

2. Репин M.B., Говорун Р.Д., Лукашова E., Красавин E.A. и Козубек С., 1996,

Стабильные и нестабильные хромосомные аберрации в лимфоцитах крови человека in vitro после у-облучения. // Радиац. биология и радиоэкология. Т. 36. Вып. 6. С. 848-851.

3. Репин М.В., Говорун Р.Д., ЛукашоваЕ., КозубекС. и Красавин Е.А.,

1997а, FISH-анализ стабильных и нестабильных аберраций хромосомы-1, индуцируемых у-лучами и ускоренными ионами азота в лимфоцитах крови человека. // Тез. Межд. симп. "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии", 22-25 января 1997, Москва, Дубна. С. 54.

4. Репин М.В., Говорун Р.Д., Красавин Е.А., Лукашова Е. и Козубек С.,

19976, FISH-анализ стабильных и нестабильных аберраций хромосомы-1, индуцируемых у-лучами и ускоренными ионами азота в лимфоцитах крови человека. —Тр. Межд. симп. "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии", 1997, Дубна. Том 2. С. 49-56.

5. LukasovaE., KozubekS., GovorunR.D., KozubekM., Kroha V., RyznarL. and RepinM.V., 1997, Aberrations induced by three different kinds of radiation in chromosomes 1, 2 and Y human lymphocytes. // Abstr. NATO-Advanced Research Workshop: "Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation". 6-10 October, 1997, Brno, Czech Republic, p. 48.

6. Krasavin E.A., Govorun R.D., Fedorenko B.S., Petrov V.M., Kozubek S.,

LukasovaE., RepinM.V. and Druzhinin S.V., 1997, Cytogenetic effects of heavy ions in human lymphocytes. JINR, El9-97-170, Dubna, 1997, 14 pp.

7. Govorun R.D., Lukasova E., Kozubek S., Repin M.V., Krasavin E.A. and

Kroha V., 1988, Induction of aberrations in human lymphocytes by y-rays and fast heavy ions. // JINR. E-19-98-31. Dubna, 1997, 19 pp.

8. Krasavin E., Govorun R., Repin M., Tymoshenko G., Lukashova M. and

Kozubek S., 1999, Chromosomal aberrations in human lymphocytes induced by 1 GeV protons in vitro. In: 10th Annual Space Radiation Health Investigators' workshop, BNL, NASA, USRA. 13-16 June, Upton, N.Y., USA., 1999, p. 38.

9. Lukâsovâ E., Kozubek S., Govorun R.D., Repin M.V., Ryznar L., Krasavin E., KozubekM. and Kroha V., 1999, Aberration induced in chromosomes 1, 2 and Y of human lymphocytes by three types of different LET value as detected by FISH. In: NATO Science Series 2: Environmental Security, Vol.55. Eds.: Baumstark-Khan C., Kozubek S. and HoraeckG., Kluwer Academic Publishers, 1999, pp. 195-202.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Репин, Михаил Васильевич, Дубна

1. Воробцова И.Е. и Богомазова А.Н., 1995, Стабильные хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови лиц, пострадавших в результате аварии на ЧАЭС. Радиационная биология. Радиоэкология. Т. 35. Вып. 5, 636-639.

2. Герасименко В.Н., Говорун Р.Д. и Рыжов Н.И., 1980, Действие ускоренных ионов бора, углерода и неона на хромосомы лимфоцитов человека in vitro. Радиобиология. Т. XX. Вып. 2, 206-211.

3. Говорун Р.Д., Рыжов Н.И., Смирнова O.A., ПортманА.И., ЭрцгреберГ. и

4. Айхорн К., 1982а, Действие тяжелых ионов на клетки млекопитающих. Сообщение 1. Цитогенетические эффекты при облучении клеток китайского хомячка ускоренными ионами гелия, углерода и неона. Радиобиология. Т. XXII. Вып. 5, 648-653.

5. Говорун Р.Д., Смирнова O.A. и Рыжов Н.И., 19826, Действие тяжелых ионов на клетки млекопитающих. Сообщение 2. Оценка ОБЭ ускоренных ионов гелия, углерода и неона по цитогенетическим показателям. Радиобиология. Т. XXII. Вып. 6, 791-795.

6. ГольдманИ.Л. и Левина JI.Я., 1964, Анализ хромосом человека в лейкоцитах периферической крови. Бюлл. эксперим. биол. и мед. Т. 58, N 11, 103-107.

7. Лобачевский П.Н. и Фоминутых Е.В., 1991, Учет радиационноиндуцированной задержки деления клеток при исследовании индукции хромосомных аберраций (теоретические и экспериментальные основы подхода). Радиобиология. Т. 31. Вып. 1. 59-63.

8. Обухова Т.Н. и Домрачева Е.В., 1998, Регистрация стабильных аберрацийв лимфоцитах периферической крови методами G-дифференциального окрашивания хромосом и флюоресцентной in situ гибридизации. Радиационная цитогенетика. Т. 38. Вып. 6. 793-799.

9. Севанькаев A.B., 1987, Радиочувствительность хромосом лимфоцитовкрови человека в митотическом цикле. М., Энергоатомиздат. 159 с.

10. Севанькаев A.B. и Бочков Н.П., 1968, Влияние гамма-облучения на хромосомы человека. Сообщение 1. Зависимость частоты хромосомных аберраций от дозы при облучении in vitro. Генетика. Т. IV, N5, 130— 137.

11. Севанькаев A.B. и Козлов В.М., 1974, Митотическая активность лимфоцитов человека при облучении в различных стадиях клеточного цикла. Радиобиология. Т. 14, N 1, 117-119.

12. Севанькаев A.B. и Насонов А.П., 1978, Калибровочные дозовые кривыехромосомных аберраций лимфоцитов человека. Мед. Радиология. Т. 23, N6, 26-33.

13. Снигирева Г.П., Шевченко В.А. и Новицкая H.H., 1995, Использование

14. FISH-метода для реконструкции поглощенных доз, полученных участниками ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС. Радиационная биология. Радиоэкология. Т. 35. Вып. 5, 654-660.

15. Череватенко А.П., 1986, Физико-дозиметрический комплекс Геном дляобеспечения радиобиологических исследований на пучках тяжелых ионов ОИЯИ. Материалы V Всесоюзного совещания по микродозиметрии. Т. 1. Под ред. Н.Г. Волкова. —М.: Изд. МИФИ, 1986.

16. AwaA.A., NakanoM., Ohtaki К., KodamaY., Lucas J. and Gray J, 1992,

17. Factors that determine the in vivo dose-response relationship for stable chromosome aberrations in A-bomb survivors. J. Radiat. Res. (Tokyo), 33 (suppl.), 206-214.

18. Awa A.A., SofuniT., Honda T., ItohM., Neriishi S. and OtakeM., 1978,

19. Relationship between the radiation dose and chromosome aberrations in atomic bomb survivors of Hiroshima and Nagasaki. J. Radial Res., 19, 126-140.

20. BajerskaA. and LinieckiJ., 1975, The yield of chromosomal aberrations inrabbit leukocytes after irradiation in vitro and in vivo. Mutat. Res., 27, 271— 281.

21. Barquinero J.F., KnehrS., Braselmann H., FigelM. and Bauchinger M., 1998,

22. DNA-proportional distribution of radiation-induced chromosome aberrations analysed by fluorescence in situ hybridization painting of all chromosomes of a human female karyotype. Int. J. Radiat. Biol., 74, 315— 323.

23. Bauchinger M. and Götz G., 1979, Distribution of radiation induced lesions inhuman chromosomes and dose-effect relation analysed with G-banding. Radiation and Environmental Biophysics, 16, 355—366.

24. Bauchinger M., Salassidis K., Braselmann H., Vozilova A., Pressl S.,

25. Stephan G., Snigiryova G., Kozheurov V.P. and AkleyevA., 1998, FISH-based analysis of stable translocations in a Techa River population. Int. J. Radiat. Biol., 73, 605-612.

26. Bender M.A., Awa A.A., Brooks A.L., Evans H.J., Groer P.G., Littlefield L.G.,

27. PereiraC., Preston R.J. and Wachholz B.W., 1988, Current status of cytogenetic procedures to detect and quantify previous exposures to radiation. Mutat. Res., 196, 103-159.

28. Bender M.A. and GoochP.C., 1963, Persistent chromosome abrrations inirradiated human subjects. II. Three and one-half year investigation. Radiat. Res., 18, 389-396.

29. Boei J.J.W.A., Vermeulen S. and Natarajan A.T., 1996, Detection ofchromosomal aberrations by fluorescence in situ hybridization in the first three postirradiation divisions of human lymphocytes. Mutat. Res., 349, 127-135.

30. Brewen J.G. and GengozianN., 1971, Radiation-induced human chromosomeaberrations. II. Human in vitro irradiation compared to in vitro and in vivo irradiation of marmoset leukocytes. Mutat. Res., 13, 383-391.

31. BucktonK.E., 1976, Identification with G- and R-banding of the position ofbreakage points induced in human chromosomes by in vitro X-irradiation. Int. J. Radiat. Res., 29, 475-488.

32. BucktonK.E., 1983, Chromosome aberrations in patients treated with Xirradiation for ankylosing spondylitis patients. In: Radiation-Induced Chromosome Damage in Man, edited by T. Ishihara and M.S. Sasaki. (New York, A.R. Liss), 491-511.

33. BucktonK.E., Hamilton G.E., PatonL. and Langlands A.G., 1978,

34. Chromosome aberrations in irradiated ankylosing spondylitis patients. In: Mutagen-Induced Chromosome Damage in Man, edited by H. Evans and D. Lloyd. (Edinburgh University Press), 142-150.

35. BucktonK.E., Langlands A.G., Smith P.G. Woodcock G.E. and Looby P.C.,1971, Further studies on chromosome aberrations: Production after whole-body irradiation in man. Int. J. Radiat. Biol., 19, 369-378.

36. CeledaD., AldingerK., HaarF.-M., HausmannM., DurmM., LudwigH. and

37. CremerC., 1994, Rapid fluorescene in situ hybridization with repetitive DNA probes: Quantification by digital image analysis. Cytometry, 17, 1325.

38. CeledaD., Bettag U., Cremer C., 1992, PCR amplification and simultaneousdigoxigenin incorporation of long DNA probes for fluorescence in situ hybridization. Biotechniques, 12, 98-102.

39. Chen A.M., Lucas J.N., Hill F.S., Brenner D.J. and Sachs R.K., 1996, Proximityeffects for chromosome aberrations measured by FISH. Int. J. Radiat. Biol., 69,411-420.

40. Collins C., Kuo W.L., Segraves R., Fuscoe J., Pinkel D. and Gray J.W., 1991,

41. Construction and characterization of plasmid libraries enriched in sequences from single human chromosomes. Genomics, 11, 997-1006.

42. Cremer C., Münkel Ch., Granzow M., Jauch A., Dietzel S., Eils R., Guan X.-Y.,

43. Meitzer P.S., Trent J.M., Langowski J, and CremerT., 1996, Nuclear architecture and the induction of chromosomal aberrations. Mutat. Res., 366,97-116.

44. CremerC., RemmB., BischoffA. and Vollweiler T., 1992, Automateddetection of radiation-induced chromosome aberrations following fluorescence in situ hybridization. J. Radiat. Res., 33 (Suppl.), 189-205.

45. Cremer T., Lichter P., Borden J., Ward D.C. and Manuelidis L., 1988, Detectionof chromosome aberrations in metaphase and interphase tumor cells by in situ hybridization using chromosome specific library probes. Hum. Genet., 80, 235-246.

46. CremerT., Popp S., Emmerich P., Lichter P. and CremerC., 1990, Rapidmetaphase and interphase detection of radiation-induced chromosome aberrations in human lymphocytes by chromosomal suppression in situ hybridization. Cytometry, 11, 110-118.

47. DarroudiF., FominaJ., Meijers M. and Natarajan A.T., 1998, Kinetics of theformation of chromosome aberrations in X-irradiated human lymphocytes using PCC and FISH. Mutat. Res., 404, 55-65.

48. Dewey W.C., Humphrey R.M. and Jones B.A., 1964, Relationship betweenradiation-induced mitotic delay and doubling-time of cells. Int. J. Radiat. Biol., 8, 605-607.

49. DuManoirS., Speicher M.R., Joos S., Schröck E., Popp S., DöhnerH.,

50. Kovacs G., Robert-Nicoud M., Lichter P. and Cremer T., 1993, Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridization. Hum. Genet., 90, 590-610.

51. Durante M., Cella L., Furusawa Y., George K., Gialanella G., Greco O.,

52. Durante M., Furusawa Y., George K., Gialanella G., Greco O., Grossi G.,

53. Matsufuji N., Pugliese M. and Yang T.C., 1998, Rejoining and misrejoining of radiation-induced chromatin breaks. IV. Charged particles. Rad. Res., 149, 446-454.

54. DuranteM., GeorgeK. and YangT.C., 1996, Biological dosimetry byinterphase chromosome painting. Radiat. Res., 145, 53-60.

55. Edwards A.A., 1997, The use of chromosomal aberrations in humanlymphocytes for biological dosimetry. Radiat. Res., 148, 39-44.

56. Edwards A.A., Lloyd D.C. and ProsserJ.S., 1985, The induction ofchromosome aberrations in human lymphocytes by accelerated charged particles. Radiat. Prot. Dosimetry, 13, 205-209.

57. EilsR., Uhrig S., SaracogluK., SátzlerK., BolzerA., Petersen I.,

58. Chassery J.-M., GanserM. and SpeicherM., 1998, An optimized, fully automated system for fast and accurate identification of chromosomal rearrangements by multiplex-FISH (M-FISH). Cytogenetics and Cell Genetics, 82, 160-171.

59. Evans H.J., BucktonK.E., Hamilton G.E. and Carothers A., 1979, Radiationinduced chromosome aberrations in nuclear-dockyard workers. Nature (London), 277, 531-534.

60. Fernández J.L., Campos A., Goyanes V., Losada C., Veiras C. and

61. Edwards A.A., 1995, X-ray biological dosimetry performed by selective painting of human chromosomes 1 and 2. Int. J. Radiat. Biol., 67, 295-302.

62. Fernández J.L., Goyanes V., Losada L., Losada G. and Veiras C., 1994,

63. Cytogenetic dosimetry of ionizing radiations. Standardized calibration curves for X- and gamma-rays. Biomedical Letters, 49, 21-27.

64. FinnonP., Lloyd D.C. and Edwards A.A., 1995, Fluorescence in situhybridization detection of chromosomal aberrations in human lymphocytes: applicability to biological dosimetry. Int. J. Radiat. Biol., 68,429-435.

65. Galloway S.M., Berry P.K., Nichols W.W., Wolman S.R., SoperK.A.,

66. StolleyP.D. and Archer P., 1986, Chromosome aberrations in individuals occupationally exposed to ethylene oxide and in a large control population. Mutat. Res., 170, 55-74.

67. Gebhart E., Neubauer S., Schmitt G., Birkenhake S. and Dunst J., 1996, Use ofthree-color chromosome in situ suppression technique for the detection of past radiation exposure. Radiat. Res., 145, 47-52.

68. Gray J.W., Lucas J.N., PinkelD. and AwaA., 1992, Structural chromosomeanalysis by whole chromosome painting for assessment of radiation-induced genetic damage. J. Radiat. Res., 33 (Suppl.), 80-86.

69. Griffin C.S., Marsden S J., Stevens D.L., Simpson P. and Savage J.R.K., 1995,

70. Frequencies of complex chromosome exchange aberrations induced by Pu a-particles and detected by fluorescence in situ hybridization using single chromosome-specific probes, Int. J. Radiat. Biol., 67, 431-439.

71. HolmergM. and JonassonR., 1973, Preferential location of X-ray inducedchromosome breakage in the R-bands of human chromosomes. Hereditas, 74, 57-68.

72. Hsu T.C., Dewey W.C. and Humphrey R.M., 1962, Radiosensitivity of cells of

73. Chinese hamster in vitro in relation to the cell cycle. Exp. Cell Res., 27, 441-452.

74. Hungerford D.A., 1965, Leukocytes cultured from small inocula of wholeblood and the preparation of metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KC1. Stain Technol., 40, 333-338.

75. IAEA (International Atomic Energy Agency, Vienna), 1986. Biologicaldosimetry: chromosomal aberration analysis for dose assessment. Technical Report Series. 260.

76. Kallioniemi A., Kallioniemi O.-P., Sudar D., Rutovitz D., Gray J.W., Walman F.and Pinkel D., 1992, Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science, 258, 818-821.

77. KandaR. and Hayata I., 1996, Technical note: Comparison of the yields oftranslocations and dicentrics measured using conventional Giemsa staining and chromosome painting. Int. J. Radiat. Biol., 69, 701-705.

78. Kano Y. and Little J.B., 1986, Site-specific chromosomal rearrangementsinduced in human dipliod cells by X-irradiation. Cytogenetics and Cell Genetics, 41, 22-29.

79. Klever M., Grond-Ginsbach C., Scherthan H. and Schroeder-Kurth T.M., 1990,

80. Chromosomal in situ suppression hybridization after Giemsa banding. Hum. Genet., 86, 484-486.

81. KnehrS., Zitzelsberger H. and Bauchinger M., 1998, FISH-based analysis ofradiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems. Int. J. Radait. Biol., 73, 135-141.

82. KodamaY., NakanoM., OhtakiK., DongchampR., AwaA.A. and

83. NakamuraN., 1997, Estimation of minimal size of translocated chromosome segments detectable by fluorescence in situ hybridization. Int. J. Radiat. Biol., 71, 35-39.

84. KozubekS., LukasovaE., RyznarL., KozubekM., LiskovaA., GovorunR.D.,

85. Krasavin E.A. and Horneck G., 1997, Distribution of ABL and BCR genes in cell nuclei of normal and irradiated lymphocytes. Blood, 89, 4537-4545.

86. KrumlaufR., JeanpierreM. and Young B.D., 1982, Construction andcharacterization of genomic libraries from specific human chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 2971-2975.

87. LeaD.E., 1946, Actions of Radiations on Living Cells, University Press,1. Cambridge.

88. LeeC.L.Y. and Karma O.P., 1981, The pattern of radiation-inducedtransmissible aberrations in human cell culture. Human Genetics, 57, 380384.

89. Léonard A., DeknudtC. and Léonard E.D., 1988, Persistence of chromosomeaberrations in an accidentally irradiated subject. Radiat. Prot. Dosim., 22, 55-57.

90. LichterP., CremerT., Borden J., ManuelidisL. and WardD.C., 1988,

91. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries. Hum. Genet., 80, 224-234.

92. Lindholm C., TekkelM., VeidebaumT., IlusT. and SalomaaS., 1998,

93. Persistance of translocations after accidental exposure to ionizing radiation. Int. J. Radiat. Biol., 74, 656-571.

94. Littlefield L.G., McFee A.F., SalomaaS.I., Tucker J.D., InskipP.D.,

95. Lloyd D.C., Moquet J.E., OramS., Edwards A.A. and Lucas J.N., 1998,

96. Accidental intake of tritiated water: a cytogenetic follow-up case on translocation stability and dose reconstruction. Int. J. Radiat. Biol., 73, 543547.

97. Lloyd D.C. and PurrottR.J., 1981, Chromosome aberration analysis inradiobiological protection dosimetry. Radiat. Prot. Dosimetry, 1, 19-27.

98. Lloyd D.C., PurrottRJ., Dolphin G.W., Bolton D., Edwards A.A. and

99. Corp MJ., 1975, The relationship between chromosome aberrations and low-LET radiation dose to lymphocytes. Int. J. Radiat. Biol., 28, 75-90.

100. Lloyd D.C., Purrott R.J., Dolphin G.W. and Edwards A.A., 1976, Chromosomeaberrations induced in human lymphocytes by neutron irradiation. Int. J. Radiat. Biol., 29, 169-182.

101. Lucas J.N., Awa A., Straume T., Poggensee M., Kodama Y., Nakano M.,

102. OhtakiK., Weier H.-U., PinkelD., Gray J. and Littlefield G., 1992, Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation. Int. J. Radiat. Biol., 62, 53-63.

103. Lucas J.N., Chen A.M. and Sachs R.K., 1996a, Theoretical predictions on theequality of radiation-produced dicentrics and translocations detected by chromosome painting. Int. J. Radiat. Biol., 69, 145-153.

104. Lucas J.N., Hill F.S., Burk C.E., Cox A.B. and Straume T., 19966, Stability ofthe translocation frequency following whole-body irradiation measured in rhesus monkeys. Int. J. Raidat. Biol., 70, 309-318.

105. Lucas J.N., HillF., BurkC., Fester T. and Straume T., 1995, Dose-responsecurve for chromosome translocations measured in human lymphocytes exposed to 60Co gamma rays. Health Physics, 68, 761-765.

106. Lucas J.N., Tenjin T., Straume T., Pinkel D., Moore D.C. 2d, Litt M. and

107. Gray J.W., 1989, Rapid human chromosome aberration analysis using fluorescence in situ hybridization. Letter to the editor. Int. J. Radiat. Biol., 56,201.

108. Lukasova E., Kozubek S., Kozubek M., Kjeronska J., Ryznar L., Horakova J.,

109. KrahulcovaE. and HorneckG., 1997, Localisation and distance between ABL and BCR genes in interphase nuclei of bone marrow cells of control donors and patients with chronic myeloid leukaemia. Hum. Genet., 100, 525-535.

110. MatsumotoK., Ramsey M.J., Nelson D.O., Tucker J.D., 1998, Persistence ofradiation-induced tranlocations in human peripheral blood determined by chromosome painting. Radiat. Res., 149, 602-613.

111. Mayall B.H., CarranoA.V., Moore D.H. 2d, Ashworth L.K., BennetD.E. and

112. Mendelsohn M.L., 1984, The DNA-based human karyotype. Cytometry, 5, 376-385.

113. Moorhead P.S., No well P. C., Mellmann W.J., BattipsD.M., Hungerford D.A.,1960, Chromosome preparations of leukocytes cultured from peripheral blood. Exptl. Cell Res., 20, 613-616.

114. Morton N.E., 1991, Parameters of the human genome. Proc. Natl. Acad. Sci.1. USA, 88, 7474-7476.

115. NakanoM., NakashimaE., PawelD.J., KodamaY. and AwaA., 1993,

116. Frequency of reciprocal translications and dicentrics induced in human blood lymphocytes by X-irradiation as determined by fluorescence in situ hybridization. Int. J. Radiat. Biol., 64, 565-569.

117. Natarajan A.T., Ballajee A.S., Boei J.J.W.A., Chatterjee S., Darroudi F.,

118. GrigorovaM., NoditiM., OhH.J., SliepcevicP. and Vermeulen S., 1994, Recent development in the assessment of chromosomal damage. Int. J. Radiat. Biol., 66, 615-623.

119. Natarajan A.T., Santos S.J., Darroudi F., Hadjidikova V., Vermeulen S.,

120. Natarajan A.T., Vyas R.C, Darroudi F. and Vermeulen S., 1992, Frequencies of

121. X-ray-induced chromosome translocations in human peripheral lymphocytes as detected by in situ hybridization using chromosome-specific DNA libraries. Int. J. Radiat. Biol, 61, 199-203.

122. Natarajan A.T., VyasRC, WiegantJ., CuradoM.O., 1991, A cytogeneticfollow-up study of the victims of a radiation accident in Goiania (Brasil). Mutat. Res., 247, 103-111.

123. Nederlof P.M., van der Flier S., Wiegant J., Raap A.K., Tanke H.J., Ploem L.S.and van der Ploeg M., 1990, Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry, 11, 126-131.

124. Norman A., Sasaki M.S., Ottomana R.E. and Fingerhut A.G., 1966, Eliminationof chromosome aberrations from human lymphocytes. Blood, 27, 706-714.

125. Pandita T.K., GregoireV., DhingraK. and Hittelman W.N., 1994, Effect ofchromosome size on aberration levels caused by gamma radiation as detected by fluorescence in situ hybridization. Cytogenetic and Cell Genetics, 67,94-101.

126. PinkelD., LandegentJ., Collins C., Fuscoe J., SegravesR., Lucas J. and

127. Gray J., 1988, Fluorescence in situ hybridization with human chromosome-specific libraries: Detection of trisomy 21 and translocations of chromosome 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 9138-9142.

128. PinkelD., StraumeT. and Gray J. W., 1986, Cytogenetic analysis usingquantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2934-2938.

129. Popp S. and CremerT., 1992, Development of a biological dosimeter fortranslocation scoring based on two-color fluorescence in situ hybridization of chromosome subsets. J. Radial Res., 33 (Suppl.), 61-70.

130. Popp S., RemmB., HausmannM., LiihrsH., vanKaickG., CremerT. and

131. CremerC., 1990, Towards a cumulative biological dosimeter based on chromosome painting and digital image analysis. Kerntechnik, 55, 204-210.

132. Pressl S., Edwards A. and StephanG, 1999, The influence of age, sex andsmoking habits on the background level of FISH-detected translocations. Mutat. Res., 442, 89-95.

133. RamalhoA.T., CuradoM.P. and Natarajan A.T., 1995, Lifespan of humanlymphocytes estimated during a six year cytogenetic follow-up of individuals accidentally exposed in the 1987 radiological accident in Brazil. Mutat. Res., 331, 47-54.

134. RiedT., Baldini A., RandT.C. and WardD.C., 1992, Simultaneousvisualization of seven different DNA probes by in situ hybridization using combinatorial fluorescence and digital imaging microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1388-1392.

135. RitterS., NasonovaE., Kraft-Weyrather and Kraft G., 1994, Influence ofradiation quality on the expression of chromosomal damage. Int. J. Radiat. Biol., 66, 625-628.

136. RitterS., NasonovaE., Kraft-Weyrather and KraftG., 1996, Comparison ofchromosomal damage induced by X-rays and Ar ions with an LET of 1840 keV/mji in Grphase V79 cells. Int. J. Radiat. Biol., 69, 155-166.

137. Salassidis K., Braselmann H., Okladnikova N.D., Presll S., StephanG.,

138. SnigiryovaG. and Bauchinger M., 1998, Analysis of symmetrical translocations for retrospective biodosimetry in radiation workers of the Mayak nuclear-industrial complex (Southern Urals) using FISH-chromosome painting. Int. J. Radiat. Biol., 74, 431-439.

139. Salassidis K., Georgiadou-Schumacher V., Braselmann H., MullerP.,

140. Savage J.R.K, and Simpson R, 19946, FISH 'painting' patterns resulting fromcomplex exchanges. Mutat. Res., 312, 51-60.

141. ScarpatoR., LoriA., Panasiuk G. and BaraleR., 1997, FISH analysis oftranslocations in lymphocytes of children exposed to the Chernobyl fallout: preferential involvement of chromosome 10. Cytogenet. Cell Genet. 79, 153-156.

142. SchmidE., Bauchinger M., Bunde E., FerbertH.F. and LievenH.V., 1974,

143. Comparison of the chromosome damage and its dose response after medical whole-body exposures to 60Co y-rays and irradiation of blood in vitro. Int. J. Radiat. Biol., 26, 31-37.

144. SchmidE., BraselmannH. and NahrstedtU., 1995, Comparison of y-rayinduced dicentric yields in human lymphocytes measured by conventional analysis and FISH. Mutat. Res., 348, 125-130.

145. Scholz M., Ritter S. and Kraft G., 1998, Analysis of chromosome damagebased in the time course of aberrations. Int. J. Radiat. Biol., 74, 325-331.

146. Schröck E., du ManoirS., VeldmanT., Schoell B., Wienberg J., Ferguson

147. Smith M., Ning M.A., Ledbetter D.H., Bar-Am, I., Soenksen D., Garini Y. and Ried T., 1996, Multicolor spectral kariotyping of human chromosomes. Science, 273, 494-497.

148. Seabright M., 1973, High resolution studies in the pattern of induced exchangesin the human karyotype. Chromosoma, 40, 333-346.

149. Selleri L., Hermanson G.G., Enbanks J.H. and Evans G.A., 1991, Chromosomalin situ hybridization using yeast artificial chromosomes. Genet. Anal. Technol. Appl., 8, 59-66.

150. Sevan'kaev A.V., Lloyd D.C., Potetnya O.I., ZhlobaA.A., Moiseenko V.V. and

151. Edwards A.A., 1995, Chromosomal aberrations in lymphocytes of residents of areas contiminated by radioactive discharges from the Chernobyl accident. Radiat. Protection Dosimetry, 58, 247-254.

152. Simpson P.J. and Savage J.R.K., 1995, Estimating the true frequency of X-rayinduced complex chromosome exchanges using fluorescence in situ hybridization. Int. J. Radiat. Biol., 67, 37-45.

153. Sinha A.K., Linscombe V.A., Gollapudi B.B., Jersey G.C., Flake R.E. and

154. ParkC.N., 1986, Cytogenetic variability of lymphocytes from phenotypically normal men: influence of age, smoking, season and sample . storage. J. Toxicol. Environ. Health, 17, 327-345.

155. SliepcevicP. and Natarajan A.T., 1994, Distribution of X-rays induced G2chromatid damage among Chinese hamster chromosomes: Influence of chromatin configuration. Mutat. Res., 323, 113-119.

156. Snigiryova G., Braselmann H., Salassidis K., ShevchenkoV. and

157. Bauchinger M., 1997, Retrospective biodosimetry or Chernobyl clean-up workers using chromosome painting and conventional chromosome analysis. Int. J. Radiat. Biol., 71, 119-127.

158. Spiecher M.R., Ballard S.G. and WardD.C., 1996, Karyotyping humanchromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. Nature Genet., 12, 368375.

159. StraumeT., Langlois R.G., Lucas J., Jensen R.H., Bigbee W.L., RamalhoA.T.and Brandao-Mello C.E., 1991, Novel biodosimetry methods applied to victims of Goiania accident. Health Physics, 60, 71-76.

160. Straume T. and Lucas J.N., 1993, A comparison of the yields of translocationsand dicentrics measured using fluorescence in situ hybridization. Int. J. Radiat. Biol, 64, 185-187.

161. Straume T., Lucas J.N., Tucker J.D., BigbeeW.L. and Langlois R.G., 1992,

162. Biodosimetry for a radiation worker using multiple accays. Health Physics, 62, 122-130.

163. TestardL, DitrillauxB. and SabatierL., 1997, Chromosomal aberrationsinduced in human lymphocytes by high-LET irradiation. Int. J. Radiat. Biol., 72, 27-37.

164. Timoschenko G.N., Bamblevski V.R and Krylov A.R., 1999, The technique ofmeasuring of relativistic proton absorbed dose in thin biological samples. Preprint of the Joint Institute for Nuclear Research. Dubna, 1999.

165. TonomuraA., KishK. and SaitoF., 1983, Types and frequencies ofchromosome aberrations in peripheral lymphocytes of general populations, in: T. Ishihara and M.S. Sasaki (Eds.), Radiation Induced Chromosome Damage in Man, Liss, New York, pp. 605-615.

166. Tucker J.D., Breneman J.W., BrinerJ.F., EvekethG.G., Langlois R.G. and

167. Moore D.H. 2d, 1997, Persistence of radiation-induced translocations in rat peripheral blood determined by chromosome painting. Environ. Mol. Mutagen., 30, 264-272.

168. Tucker J.D., LeeD.A. and Moore D.H., 1995a, Validation of chromosomepainting. II. A detailed analysis of aberrations following high doses of ionizing radiation in vitro. Int. J. Radiat. Biol., 67, 19-28.

169. Tucker J.D., Morgan W.F., Awa A.A., Bauchinger M., BlakeyD.,

170. Cornforth M.N., Littlefield L.G., Natarajan A.T. and Shasserre C., 19956, A proposed system for scoring structural aberrations detected by chromosome painting. Cytogenet. Cell Genet., 68, 211-221.

171. Tucker J.D., Ramsey M.J., LeeD.A. and MinklerJ.L., 1993, Validation ofchromosome painting as a biodosimeter in human peripheral lymphocytes following acute exposure to ionizing radiation in vitro. Int. J. Radiat. Biol., 64, 27-37.

172. Tucker J.D. and Senft J.R., 1994, Analysis of naturally occurring and radiationinduced breakpoint locations in human chromosomes 1, 2 and 4. Radiat. Res., 140,31-36.

173. Van Dilla M.A., DeavenL.L., Albright K.L., Allen N.A., AubuchonM.,

174. Vijayalaxmi and Evans H.J., 1982, In vivo and in vitro effects of cigarettesmoke on chromosomal damage and sister-chromatid exchange in human peripheral blood lymphocytes. Mutat. Res., 92, 321-332.

175. Viscidi R.P., Connelly C.J. and YolkenR.H., 1986, Novel chemical method forthe preparation of nucleic acids for non-isotopic hybridization. J. Clinic. Microbiol, 23, 311-317.

176. VyasR.X., DarraudiF., Natarajan A.T., 1991, Radiation induced chromosomalbreakage and rejoining interphase-metaphase chromosomes of human lymphocytes. Mutat. Res., 249, 29-35.

177. WojcikA. and StrefferC., 1998, Comparison of radiation-induced aberrationfrequencies in chromosomes 1 and 2 of two human donors. Int. J. Radiat. Biol., 74, 573-581.

178. Wu H., Durante M., George K. and Yang T.C., 1997, Induction of chromosomeaberrations in human cells by charged particles. Radiat. Res., 148, 102-107.

179. Yang T.C., Wu H., George K.A., Durante M. and Craise L.M., 1997, Lethal andcytogenetic effects of iron particle. Abstracts of Eight Annual Space Radiation Health Investigators' Workshop (April 29-May 3, 1997), 20.

180. Yu C.K. and Sinclair W.K., 1967, Mitotic delay and chromosomal aberrationsinduced by X-rays in synchronized Chinese hamster cells in vitro. J. Nat. Cancer Inst., 39, 619-632.

Информация о работе

Репин, Михаил Васильевич
кандидата биологических наук
Дубна, 2000
ВАК 03.00.01

Диссертация

Стабильные и нестабильные хромосомные аберрации в лимфоцитах крови человека, индуцируемые излучениями с разными ЛПЭ - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы