Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика липопротеидов высокой плотности сосудистой стенки и плазмы крови человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика липопротеидов высокой плотности сосудистой стенки и плазмы крови человека"

;; \ б ОД РОССИЙСКАЯ АКАДШМ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

у 7 '

и 1 Ь "" НАУЧНО ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ЭКС1ШРШЕНТАШЮЙ №Ж1Ш

* на правах рукописи

1ШВШСКИЙ

Святослав Леонидович >

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИПОПРОТЕВДОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ СОСУ,ЧИСТОЙ СТЕНКИ И ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Специальность: 03.00.04 - Биахишя

АВТОРЕФЕРАТ диссертанта на сокскачтта ученой степена кандидата ьздицинсюа наук

Санкт-Петербург 1993

Работа выполнена в отделе биохимии Научно-исследовательского института аксперимег 'альной медицины РАМН (директор - академик РАМН Б.ИЛКАЧЕНКО).

Научный руководитель: академик РАМН А.Н.КЛИМОВ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

профессор И.Г.ЩЕРБАК доктор биологических наук' профессор М.Н.ПЕРЦЕВА Ведущее учереэдение: Санкт-Петербургский

НИИ кардиологии М^ И)

гтвдта диссертации состоится *_"__ 199_ г.

в_часов на заседании Специализированного Ученого совета

/ К 001.23.01 / го присуждению ученой степени кандидата наук при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН ш адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. а&вд. Ч.П.Павлова, 12

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЗМ РАКН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. И.П.Павлова, 12

Автореферат разослан ' "__®_199„ г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

О.Г.Куликова

Одна из основных, проблем клинической медицины - сердечнососудистые заболевания - в большинстве случаев имеют в своей морфологической основе атеросклероз, патогенез которого, несмотря на десятилетия интенсивных исследований, до конца еще не ясен. Наиболее признанной является "лхпвдная" или "липояротаид-ная" концепция возникновения ¡.того заболевания, которая предполагает ведущую роль нарушений лкшд^го (лшопротэидного) обмрна . в атерог"незр Составная частьв этой концепции является гипотеза"" об антиатерогенной функции ЛПВП, е$лрмулированная в работах братьев Миллер [Miller G., Miller N.. 1975J. После публикации этой работы ос»овное ряиман э уделялось ЛПВП плазмы, хотя предпринимались попытки к изучению и ЛЛВП сосудастой стенки. Так, рядом авторов [Hollander et al.,1979; Деяисеько А.Д.,1971] была показана идентичность ЛПВП аорты и плазменных ^ПВЛ по содержанию холестерина. фосфолишдов, триглицерядов, белка и по жирнокиг -лотному составу триглицеридов. Holi и соавтЛ1975], а также ряд других исследовчт^пей tBedo°?a et al,1989; Bocan et al., 1988; Carter et al.,198T], ус. ловили,что в сосудистой стенке иммуно-химическими методами определяйся высокие концентрации ало А, локализующегося вдоль коллагеновых и эластических мембре-% а также в липидном ядре бляшки. Вместе с тем данные о свойствах • ЛПВП как цельных частиц почти полностью отсутствовали. Поэтому целью данной работы явилось проведение сравнительного анализа ИПВП артериальной стенки и плазмы крови человека о уделегяем эсновного внимания свойствам ЛПВП как цельным частицам, и их функциональным особенностям.

Задачи исслед-вания. В задачи исследовашг входило: - изучить распределение по размерам частиц ЛПВП Стенки аорты

человека и сравнить подученные данные с результатами подобного *

анализа плазменных ЛОВИ;

- определить особенности взаиммотношений отдельных подклассов ЛПВП плазмы и артериальной стенки;

- изучить спектр субфракций ЛПВП, отличавдихся по вел.лине изоэлектрической точки, и определите особенности ЛПВП сосудистой стенки в этом отноиении;

- проанализировать проникновение ЛПВП в сосудистую стенку в норме и при развитии атеросклероза у экспериментальных животных;

- разработать метод оценки функциональной активности ЛПВП - их способности акцептировать холестерин и проанализировать холестерин-акцепторную способность ЛПВП аорты и плазмы, причем отдельно изучить гсобенюсти акцепции у ЛПВП плазмы здсровых лиц и лиц с ваболеваниями, ассоциированными с повышенной частотой атеросклероза;

- применяя метода математического моделирования, изучить вопрос о влиянии ЛПВП плазмы на возникновение и течение ИБС в популяции.

Научная новизна.полученных у иных заключается в следующем:

- впервые охарактеризовано распределение ЛПВП аорте по размерам частиц на основании данных электрофореза в градиенте поли-акриламида;

- обнаружены суОфракции ЛПВП аорты, резко отличающтеся по значению и&оэлектрической точки т плазменных ЛПВП;

- установлено, что в нормальных условиях и при патологии существуют две субоистемы, объясняющие увеличен..э размеров ЛПВП при инкубации с холестерином, однако лишь одна из них функционирует как в норме, так и при развитии заболеваний, ассоциирован-

ных с атеросклерозом;

- показано, что высокий уровень ХС ЖЕЗП плазмы являвтсл про-гвктивным в отношении развития ИБС, однако после возникновения коронарной патологии он практически утрачкваэт эту свою особенность. 1

Практическая значимость рг 'оты застается в том, что в-ходе •исследования был разработан просто?, тест для определения способности Лттбп акцагггироврть холестерин, выявлено нарушение холестерин-акцепторной функции этих частиц у лиц с ИБС & тяжелой патологией почек; показана возможность использования методов компонентного анализа для получения дополнительной информации при обработке денситометрических криках; разработаны компьютерные программы для анализа результатов разделения ЛПВП в градиенте полиакриламидного геля и проанализировано, значение ХС ЛПВП в вооникновертш и прогрессировали* ИБС.

Положения.выносимые на защиту

1. Аортальные ЛПВП отличаются от плазменных преобладанием наиболее мелких и наиг" 1лее крупных частиц, а такаю измененной изоэлектрической точкой.

2. ^модифицированные- ЛПВП быстро проникают в сосу лютую стенку и так же быстро удаляются из ноэ как в нормальных усло-% виях, так и при развитии акспер* ментального атеросклероза.

3. У большинства из обследованных лиц с ИБО ХС-акцепторная функция плазменные ЛПВП понижена. -■ <

4. В артериальной стенке человека задерживаются частицы ЛПВП с нарушенной способностью акцептировать ХС.

Апробация работы. Результаты работы бшш представлены на двух международных конферегциях: 3-ей Международной конференции ш

превентивной кардиологии (Осло,1933) и 62-ом конгрессе Европейского атеросклеротического общестра (Иерусалим,1993) Публикации По теме диссертации опубликовано 6 работ Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 214 страницах машинописного текста и включает введение, обзор . ите-ратуры, материалы и катода, результата и и* обсуждение (главы с 3 по 9) и заключение. Диссертация содержит 23 рисунка и II таблиц. Список литературы включает 158 источников, из них 28 работ принадлежит отечественным и 130 - зарубежным авторам.

Материал и метода В работе была использована интима аорты (грудной и бршной отделы), полуденные от Б9 мужчин и женщин 25-78 лет, а также плазма 1фови лиц с ИБС (II образцов), лиц с патологией почек (хронический глоь^рулонвфрит, 18 образцов) и здоровых доноров (13 образцов).

Липопротеида аорты выделялись экстракцией в физиологическом растворе, приготовленном на В20 с доведением ¿лотвости до 1,21 г/см3 сахарозой или вкстрвкци 1 в растворе, приготовленном на EjO, с доведением плотг юти до 1,21 г/см3 сухим КаВ" (в опытах по изучению акцепции) и послодуидим центрифугированием в ультрацентрифуге "Airfuge". ЛПВП плазмы выделялись последовательным центрифугированием в диапазона плотности NaBr 1,063-1,21 г/см3 на ультрьцентрифугах 15 или L8 или центрифугированием в "Alrfuge".

Распределение ЛПВП по размерам анализировалось при помощи нативного электрофореза в градиентном полиакриламадвом гел£ (ПЛАТ), распределение по изоэлектрическо» точке - изоэлектричео-

ким фокусированием в ПААГ. Атобелковый состав анализировался при помощи SDS-электрофореза в ПААГ и двумерного электрс пореза (электрофорез на ацетат-целлюлозе в первом направлении, SDS-алектрофорез - во втором). К другим методам анализа липопро-теидов относились электрофорез на агарозе, диск-электрофорез, иммунодиффузия и щлмунофикса! я.

Акцепция холестерина липопротеи^ми высокой плотности изучалась пр. инкубации последних с 4% холестерин-целитной смесью я анализом распределения ЛПВП по размерам в образцах, инкубировавшихся с холестерин-целитом и без него.

Для получения ЛПВП и им1 уноглооулинов, имепцих в своем составе радиоактивную метку, использовался метод мечения их при помощи уксусного ангидрида, содержащего I4C tMarsh,1978].

Проникновение ЛПВП в сосудистую стенку изучалось введением кроликам меченных ~ *С-ЛПВП, экстракцией ЛПВП в буферном растворе и определением радиоактивности раствора или хе введением здоровым животным и животным с экспериментальным атеросклерозом нативных ЛЕШ с послед, щей визуализацией этих частиц иммунопе-роксидазной реакцией.

Порученные результаты обрабатывались методами униваржантной статистики (t-тест, рассчэт доверительных интервалов (ЛИ), метод Тьски, корреляционный анализ) и многомерного статистического анализа (множественный линейный регрессионный анализ .компонентный и факторный, анализ). При моделировании использовалась марковская модель с наложением случайных ошибок по методу Монте-Карло.

Результата и обсуждение В ранее опуЛшкованных работах рядом ^зторов высказывалось предположение о чрезвычайно низком, на пределе чувствительности иммунологических, методов, содержании ЛПВП в аорте [Hollander et el,'■979 и др.З, поэтому вначвле было необходимо провести э"спе-рименты, направленные на детекцию ЛПВП в экстрактах интимы. Методом даск-электрофорезэ в аортальном экстракте удалось обнаружить общую фракцию ЛПВП в виде слабовырысенной полосы, занимавшей то же положение, что и ЛПВП плазмы крови. Ичмунодиффузия по Удину показала, что ч.стицы имеют в своем составе ano A-Í, т.е. эти частицы являются именно ЛПВП. Кроме того, было проведено определение количественного содержания ano А-1 в экстрактах интимы аорты. Согласно этим данным концентрация ano A-I в нормальной интиме составляет 0,19*0,04 мг/мг ХС, тогда как в пораженной атеросклерозом - 0,06±0,02 мг/мг ХС. Таким сзраэом, удалось обнаружить достоверное трехкратное падение содержания ano A-I в участках атеросклеротического поражения в расчете на мг ХС (разность составила 0,13 мг/мг ХС ,Э5%ДП = 0,07 - 0,19 мг ало A-1/мг ХС). Вместе с тем мот метод не давал гарантию, что анализируются именно частицы ЛПВП, а не только оставсчвся после их раглада апопротеикы. Поэтому были проведены експерименты с использованием электрофореза в градиенте ПААГ, дающие информацию о распределении частиц по размерам. Выяснено, что в экстракте инткш аор-ы содержатся цельные частицы ИШ во всем диапазоне размеров плазменных ЛПВП, от .¡твПдс до ЛШП^. При этом в сравнений с плазменными ЛПНП было отмечено обогащение липопротеид-ного спектра ЛПВП^^ и ЛПВП3о.Кроме того, размеры плазменных ЛПВПзс и ЛПВПзЬ были больше, чем размеры соответствующих аор-

талышх частиц (3,83 против 3,80 нм, р<0,05; 4,15 против 4,12 нм, р<0,05, соответственно).

Особый интерес представлял аналз связей распределения аортальных ЛПВП по размерам с причиной смерти, локализацией участка интимы, откуда были выделены |ПВП, и рядом других переменных. Полученные в ходе такого анализа „ ззультаты показывают,, что распределение ЛПВП по размерам зг"зисело от причины смерти и •локализащш (рис.1). Так, у лиц, погибших от осложнений атеро^ склероза, отмечалось Солее выраженное, нем у лы, умерших от других причин, накопление наиболее мелких ЛПВП. Отмеченное ранее накопление в инуиме наиболее крупных частиц ЛПВП сильнее всего отмечалось, как видно из рисунка, в участках макроскопически нормальной интимы.

Проведенный даскриминантный анализ различий распределения Пи ра мерам аортальнь.. и плазменных ЛПВП показгл.что получить функцию, достаточно точно разграничивающую ЛПВП плазмы и аорты было нельзя (х2® 1,51 при 3 ст. свободы, р=0,680). Однако выяснилось, что выведенная дискриминантная функция довольно точно классифицирует аортальные образцы (ошибка классификации составляет всего 2,8%), а наибольшее количество ошибок возникает при попытке отграничить плазменные образцы от аортальных (неправильно классифицируется 25% образцов). Иными словами, даскриминантный анализ показывает отсутствий принципиальных отличий в распределении по р /змерам ЛПВП плазмы и стенки аорты человека. Однако отсутствие подобных различий является не столько следствием полной идентичности распределен*^ по размерам ЛПВП двух групп, сколько результатом наличия среди плазменных ЛПВП образцов, распределение со размерам которых соответствует таковым у

ргшцденсиг.(отн.е' )

Рмс.1 Разность .п^нситограмм ЛПВП аорты

а)сиерть связана/не связана с атеросклероаои

б)атерос клеротичвс кап /нормальная интима

ЛПВП интимы аорты.Вместе с том проделешше вксзгеритин подняли ряд важных вопросов: так, было показано, что общая концентрация белка в ЛПВП достаточно слабо связана с концентрацией ало д-1, основного апооелка ЛПВП плазмы, и, кроме того, в данной работе было отмечено увеличение в сосудистой стэнкэ концентрации ЛПВПдс и ЛПВП^, тогда как некоторь авторы отмвтил& лишь увеличение содержания ЛПВПд [Денисенко А.Д., 1971]. Для ответа на вти. вопросы следует указать, что этими авторами для определения концентрации субфракций ЛПВП использовались цевтрифугационше методы разделения, т.е. частицы классифицировались по гидратиро-ванной плотногта, тогда ка? в данной работе основой для классификации были размеры частиц. Показано [Ваизэеппап et al,1939; Cllíton et al,19851, что замещение ano A-I на другие апобелки, в частности, сывороточный амилоид (SAA),npH остром инфаркте миокарда, припдат к разному возрастании плотности шстицы и такая частица (с размерами JUBIIg и соответствующим фосфолипидаым' и холестериновым составом) начинает флотировать только в плотности, превышавшей 1,125 i 'см3. Кроме того, удельный вес ano A-I в етих частицах резко снижается. Проведенные нами эксперименты с использованием электрофореза в градиенте ПААГ с добавлением SDS и двумерного электрофореза показывают, что для аортальных ЛПВП-характерно изменение соотношешг ano A-I/низкомолекулярные белки с 2-3 (в плазме) до 1,4 и даже до I. При этом данные двумерного электрофореза показывают, что в субфракциях ЛП, содержащих *елок с молекулярной массой 28 кДа (ano A-I), обнаруживается также и белок с молекуляшой массой около 15 кДа. Белок с такой молекулярной массой :э является нормальной состчвлявдей ЛПВП плазма (электрофорез выполнялся в присутствии дитиотреитола), однако

это значение слизко к молекулярной массе ало Т (апобелок ЛПВП при трввме ICaríson.Holmqulst, 19833) и ano SAA [Bendltt, Erlk-веп, 19773. Если предположить, что в аортальных ЛПВП также отмечается замещение ano A-I на другие, нехарактерные для плазмы Се л. ai, то нет ничего удивительного в расхождении полученных результатов с данными центрифугирования и отсутствием связи общей концентрации белка ЛПВП с содержанием ano A-I. Вместе с тем для таких апобелков характерно высокое значение изоэлектрм-ческой точки [Marhang et al,1982], что не может не сказаться на изоточке (ЮТ) цельных частиц. Поэтому были проведены эксперименты с изоэлектрическим фокусированием аортальных ЛПВП, которые показали их высокую гетерогенность по заряду с числом субфракций достигаюгим 35, и изоточкой, в основном, прев-циающей 4,7. Всего можно было выделить четыре группы ЛПВП аорты: I."Анодная" групп. - имевшая ИЭТ менее 3,75. На ее долю приходилось меньше всего ЛПВП (менее 5%) и встречалась она не во всех образцах ЛПВП аорта; 2."Основная" группа - с ИЭТ в пределах 4,7-4,9. Эта группа присутствовала во всех образцах,- причем в ее составе было довольно много субфракций (4-7), лежащих довольно тесно друг к другу; 3.""ромекуточная" груша - с ИЭТ от 5,0 до 6,0. Эа8 группа также присутствовала во всех образцах аортальных ЛПВП, хотя число суофракций в ней и варьировало. Эта подгруппа была весьма гетерогенна по ИЭТ и число суофракций в ее составе достигало 15-17; 4."Натодная" jpynna - с ИЭТ превышавшей 6,0. При изоэлектрическоы фокусировании в диапазоне рН 4,0-6,0 эта группа была представлена 3-5 субфракциями, однако они находились уже за пределами линейного участка градиента рН, поэтому для определения истинного числа субфракций в этой группе необходимо

сыло проведение изовлектрического фокусировщ. я в диапазоне рН 5,0-6,0. Подобные эксперименты показали, что "катодная" группа включает по меньшей мере 8 суСфрьлций, из которых несколько имеют ИЭТ близкую к 7,0.

"Катодаия" группа, охватывавшая, в среднем 22% всех ЛПШ аорты (95% ДИ= 18-26%), не обнаруживалась при газоэлектрическом фокусировании плазменных ЛПВП и весьма сильно зависела от содет>-кания ЛПВП "основной" группы (г=-0,793, р=0,000), причем эта связь не опосредовалась ни полом, ни возрастом умерши?, ни локалиг :цией участка аорты, из которого были выделены ,"ТВП.

Таким образом, в аорте действительно были выявлены ЛПВП o высокой изоточкой, которые, судя по данным корреляционного анализа, происходили из "основной" группы (или, по крайней мере, были очень тесно связаны с ней). Создается впечатление, что в аортб селективно задерживаются ЛПВП с измененным зарядом, что вполне объяснимо, если вспомнить, что эндотелий сосудов и соединительнотканный матрикс несут отр'щательннй заряд, а при растяжении сосуда генерируется отрицательный пьезопотенциал íFry,1972), и, значит, ЛПВП "катодной" группы будут в меньшей степени отталкиваться от вышеуказанных структур к в меньшей степени "выталкиваться" по направлению к адвентиции под действием пьезопбтевцйалв, чем более электроотрицательные ЛПВП "основной" группы. Однако в связи с етям возникает вопрос, проникают ли в стенку сосудов преимущественно ЛПВП с измененной иеоточкой,. или они лишь преимущественно задерживаются в ней? РШваяв етогр вопроса тем более Bajar», что, если проникают оба типа ча :тиц, <ю\ по способности плазменных ЛПВП акцептировать холвстериг можно судить о способности организм., удалять холестерин а" соиухдогой

стенки при помощи ЛОП Поэтому были проведены опыты по изучению проникновения в аорту кролика нативных ЛПВП плазмы человека.

Предварительные эксперименты с меченными *4С-ЛПВП показали, чтс эти частицы чрезвычайно быстро проходят сквозь стенку сосуда. Уже через 40 мин. после пикового значения (на пятой минута) содержание ЖВП в интиме составляет менее 0,1£ от максимальной величины. При этом довольно сильно меняется соотношение радиоактивности в плазме и сосудистой стенке. На пятой минуте в каздом миллиграмме ингида содержалось столько же ЛПВП, сколько в 0,024 мл плазш (22,5 имп/мин/мг прошв 920 имп/мин/мл), тогда как через 40 мин но миллиграм интимы преходилось уже столько же ЛПЗП, с :олько содержалось в 0,0006 мл плазш (0,007 имп/мин/мг против 120 кш/мин/мл). Опыты с введением нативных ЛПВП и последующим их выявлением в стенке иммуяоморфологическими методами показали, что и нативные ЛПВП очень быст^э проникают как в нормальную, так и в пораженную атеросклерозом стенку аорты. Причем в о0о"х случаях пик т концентрации отмечался через 5 мш после внутривенного введения, а к 15 минуте эксперимента ЛПВП 1 сосудистой стенке уже не обнаруживались. Основным препятствие* на пути прохождения ЛПВП сквозь сосудистую стенку явилась внутренняя эластическая мембрана, вдоль которой и обнаруживали^ ЛПВП у кроликов с экспериментальным атеросклерозом. Однако, ка] у этих, так и у нормальных животных через 5 мин после введена большая часть ЛПВП локализовалась в шдии. Тот факт, что нор мальные ЛПВП могут легко проникать в сосудистую стенку а лрохо дать черьэ все ее • слои указывает на важность изучения спосо Оностк ЛПВП плазм"• лиц о ИБС акцептировать холестерин и необхо димостъ определения особенностей холеотврин-акцепторной функци

тех ЛПВПв которые задерживаются в сте зсе сосуда. Поэтому были проведены ехспеример-ы по изучению акцепции холестерина при инкубации ЛПВП с холестерин-целитной смесью. . При инкубации лш.опротеидов, полученных из плазмы крови здоровых ^-норов, с холестерин-целитом наблюдается заметное среднее увеличение размеров частиц (табл.1). Так, в ходе инкубации радиус нормальных частиц ЛПВП в среднем увеличился на 0,18±0,02 нм (что было равноценно акцепции 3-4 молекул холестерина на частицу) . Увеличение средних размеров ЛПВП от лиц с патологией, часто отмечаемой при наличии атеросклероза, было значительно меньше выражено ( рпзность радиусов 0,03±0,03 нм, захват менее I молекулы холестерина на частицу) и не отличалось достоверно от нулевого значения, ¿оргальные ЛЦП даже скорее отдавали холестерин, чем его акцептировали, поскольку при инкубации с холестерин-целитом отмечалось уменьшение средних размеров частиц, хотя отличия от нулевых значений в это!, случае также не достигали статистической достоверности (разность радиусов -0,П±0,13 нм или потеря до 2 молекул ХС ча частицу). Следует , кроме того, заметить, что при инкубации аортальных ЛПВП отмечалась резкая потеря материала (из 10 проанализирванных образцов в двух после кнкубацт; количество ЛПВП падало ниже уровня детекции). Иными словами, в полном соотвтствии с теоретическими представлениями, наилучшая способность захватывать холестерин наблюдалась у ЛПВП плазмы здоровых лиц, а наихудшая, сочетамая-ся с нестабильностью частиц, - „ аортальных ЛПВП, выд;ленных ог лиц, больных атеросклерозом.

Следует заметить, что среда пациентов с ИБС, вошедггих в обследованную группу, в четырех случаях (36*) после инкус -.дж

Таблица I. Изменеш., радиуса частиц (в да) ЛЛВП отдельных субфракций после инкубации с холестерин-целитом

Плазма крови

Сусфракция Здоровые доноры ИБС' Аорта4

п=И 31=14 П=8

люпгь . ЛПШ^а ЛПВЛза ЛПВПзи ЛПВПзс 0И1110.0243 -о.ото.ою 0,000й 0.000*0,008 0,017*0,014 0,033*0,0113 0,020+0,023 0,008Ю,005 0,00440,003 3 0,012.0,006 0,004±0,030 -0,022±0,033 0,020±0,0И 0.0.-02 -0,014*0,028

£ллвп 3 0,18340,019 0,030*0,026 -0,106±0,128

1Включая больных с патологией почек

2Во всех образцах радиус частш до н после инкубации был одинаков

Достоверные (р<0,05) изменения размеров частиц в ходе инкубации

Использована инть^а как пораженных , так и непораженных атеросклерозом участков

размер» возрастали, причем в ¿той подгруппе среднее увеличен» диаметра было близко к таковому у нормальных ЛПВП <0,12 нм). Э1 результаты требовали дальнейшего анализа с целью установит! действительно ли у б-\леа чем трети пациентов с ИБС сохране! способность к нормальной акцепции холестерина. Поэтому данные ( акцепция холестерина были подвергнуты факторному анализу, кот< рнй показал, что .редане размеры ЛПВП в ходе инкубации с хода отерни-целитом могут увеличиваться двумя путями: за счет приро

га количества ЛШ^ при одновременна умег шении ЛПВПдЬ и ЛПВПзд и за счет уве^чения ЛПВ1^а при снижении ЛПВПдс(табл.2). При атом механизм прироста размеров за счет накопления ЛПВПзд был активен только в образцах, полученных из плазмы крови здоровых доноров. В остальных группах основным являлось увеличение концентрации ЛПВП^д за счет ЛПВП?С. Используя данные о средних размерах ЛПВП отдельных субфракций до и после инкубации, можно было установить, что слияние двух частиц ЛПВПд,, аорты (средний радиус 3,8 нм) приводит к образованию частицы с размерами ЛПВГ^д (средний радиус 4,8 нм). Поскольку слияние является довольно частым путем укрупнения ЛПВП можно было предположить, что именно им и объясняется существование второго механизма увеличения размеров ЛПВП при их инкубации с холестерин-целичом. Такой путь прироста средних радиусов частиц вряд ли можно считать ХС-опосредованным, поскольку фактически захвата дополшп _>лышх молекул ХС при нем не происходило. Поэтому в качестве критерия нормальной холестерин-акцепторной функции следовало признать увеличение средних размеров ЛПВП при одновременном увеличении концентрации ЛПВПзд. При использовании этого критерия можно было утверждать, что ЛПВП всех образцов плазмй здоровье доноров акцептируют холестерин, среди лиц с ИБС холестерин акцептируют только 18,2% образцов (95ЖДИ* 2,09 - 45,0*, р<0,001 для различий с плазмой здоровых доноров), среди пациентов с патологией почек - 18,8* обрвзцов (955ЩИ= 4,06-40,8», р<0,001) И среди аортальных ЛПВП способность к захвату дополнительных количеств Холестерина сохранилась лишь у 1и .3% образцов (95ЗДИ* 0,03 - 17,3», р<0,001). Таким образом, проведенный анализ показал, что у лиц с ИБС, как и при некоторых других аболеваниях, при кръ-'Ш 4ai.ro

Таблица 2 Резу.гътаты факторного анализа изменений концентраций субфракций ЛПВП аорты и плазмы после инкубации с ХС СуОфракцая Фактор I Фактор 2

ЛЛБП^ 0.125 йхШ1

тпга 0.911х 0.174 -0.8481

лпвпда 0.348

Л1ВПзЬ -0.130 -0.8821

ЛПВПдд -0.732 -0.572

*достоверная связь (р<0,05) с данным фактором

та атеросклероза повышена, холестерин-акцепторная функция ЛПВП i достаточной степени нарушена. Поэтому весьма логичным являете, предположение о том, что в таких случаях ЛПВП не могут адекввтн выполнять свою функцию - удалять ХС из стенки сосуда. Отметим что ранее снижение холестерин-акцепторной функции у плазменян ЛПВП при ИБС и патологических состояниях, тесно ассоциировании с этим заболеванием было обнаружено в лабораториях Н.В.Перовс (Perova et al.,1968; Шахов Ю.А. в совет,19901 и А.Н.Климое (Шло? et al., 19891.

Для проверки предположения о снижении значимости ЛПВП, к: протективного фактора при развитии ИБС, был проведен анага популяционных дянниг q роли ХС ЛПВП как анти-ри^л: фактора щ помощи методов компьютерного моделирования. Полученные результ! ты показывают, что высокий ХС ЛПВП препятствует развитию нов нефатальг'х случаев ИБС. Так, среди пациентов с ХС ЛПВП более мг/дл частота новых случаев шфаркта миокарда (ИМ) составля (по данным моделирования) 0,76±0,0491, тог^а как соответствупц

величина в груше с ХС ЛПВП менее 43 мх . дл дос-тгала 1,67±и,08* (р=0,000). В то же - ремя, данные компьютерного моделирования зокезали, что протективный эффект высокого ХС ЛПВП в значитель-аой степени исчезает доела развития ИБО, особенно ее тяжелых 5орм. Напри, эр, продолжительность предстоящей жизни пациентов, теренесших ИМ и имевдих высокий уровень ХС ЛПВП, оценивалась в [6,1 года <95ЖДИ= 15,4 - 16,8), а у лиц с низкими значениями этого показателя - в 21,2 года (Э5ЗДИ= 19,7 - 22,7). Похожие результаты были получены и для безболевой ишемии и для сочетания зтенокар"ии напряжения с шемическими изменениями ЭКГ. В целом ложно считать, что при высоких значениях ХС ЛПВП снижается вероятность развития ИБС. Наличие же ИБС, особенно ее тяжелых £юрм, снижает значимость ХС ЛПВП как предиктора п^одолжительнос-ги жизни, что в сочетании с ранее приведенными данными о снижении ХС-акцептирупцих способностей ЛПВП у лиц с узе имевдепя ИБС юзволяет ь^доолагать, что именно обратный транспс4.1 холестери-за является важнейшим в протективной функции атого класса липо-зротеидов.

Исходя из приведенных ранее данных об изменении холестерин-акцепторной функции у пациентов с ИБС, это "исчезнове те" анти-этерогенной функции не вызывает особого удивления. При атом здение способности ЛПБП акцентировать холестерин при уже развившейся ИБС можно связать с резким усилением их повреждение продуктами порикисяого окисления, от которых они аащищают .ЛШП [А.Н.Климов и соавт.,1987; ОЦг^ ег а1,1939; РапЬаюгаОД вг 1 11,1990] или с изменением их нормального апопротвинового состава. В контексте ранее полученных результатов последнее предаоло-юние представляется наиболее г ^основанным. Действе.¿льно, лри

развитии острого ИМ 'Bausserraan et al,1989] и при других стрес-сорных воздействиях на организм tCarlson. HolmqulBt.,1983; Parks, Rudel,1985] наблюдается замещение ало A-I на другие белки. Вполне возможно, что физиологической основой этой реакции является необходимость ускорить катаболизм ЛПВП, захвативших различные "вредные" вещества, например люшдаые гидроперикиси, т.к. действительно скорость катаболизма ЛПВП с замещенными на SAA адапротеинами выше, чем в норма гРагкз,Eudel, 1985J. Но такое замещение апобалков прив jw к снижению холестерин-акцепторной функции (для которой необходим ало A-I) и к облегчению з держки таких частиц в сосудистой стенке. Тегш образом формируется порочный круг - стрессорние воздействия, связанные с развитием ИБо, нарушают их нормальную функцию, а ЛПВП с нарушенной функцией не могут адекватно противодействовать прогрессированию атеросклероза и, соответственно, ИБО. Поэтому при печении ИБС необходимо следить не только и не столько за уровнем ХС ЛПВП, сколько пытаться улучшить функционирование ЛПВП - их способность к акцепции холестерина.

Вывода

1. Методом диск-электрофорезе в ПААГ с предокраской на лшшда (судан черный) в водных экстрактах интимы аорты человека удается обнаружить общую фракцию ЛПВП а виде слабовыраженной полосы. При електрофоретическом разделении в градиенте ПААГ ультрацентрифу-гатов ивтимальных экстрактов с последующей окраской на белок (Кумасси .-250) обнаруживаются частицы всех субфракций ЛПВП, при этом субфракционный спектр обогащен частицами ЖШПдс и ЛПВП^.

2. Методами даскриканантного анализа показано, что у ряде

иц с ИБС плазменные ЛПВП аналогичны по субфра- ^ионному спектру .1ВП аорты. Вместе с . эм аортальные ЛПВП отличаются от плазмен-ых по величине изоэлектрической точ.ш, причем для аортальных ПВП характерно появление частиц с высокой ИЭТ. . Нативные ЛПВП плазмы способны легко проникать во внутреннюю Золочку сосудистой стенки и удаляться из нее в течение 10 мин ак в нормальных условиях, так и при экспериментальном геросклерозе.

. Разработана методика оценки холестерин-акцепторной функции [ЮП с и-юльзованием холестерин-целитной смеси. . На основании факторного анализа холестерин-акцепторной ункции плазменных и аортальных ЛПВП установлено, что в кцепции холестерина принимают участие как минимум две убсистемы, одна из которых обеспечивает увеличение энцентрации ЛПВП^ за счет ЛЛВП^ и ЛПВПда, а другая - рост удержания ^ШВГ^д за счет ЛПВПдс. Увеличение разменов ЛПВП при акубации с холестерин-целитом у ядоровых лиц происходит при 1астии обеих субсистем, с преимущественш. д вовлечением первой, эгда как у больных ИБС функционирует только вторая субсистема. . Холестерин-акцепторная функция ЛПВП аорты й плазмы .лц с ИБС эникена.

. Данные - компьютерного моделирования показывают, что в эпуляции мужчин 40-59 лет Санкт-Петербурга после развития ИБО кокий уровень холестерина ЛПВП практически утрачивает свое зачение как показатель более благоприятного прогноза."

Список работ, опубликованиях по теме диссертации

1. Кузнецов А.С., Парфенова Н.С., Плавинский С.Л. Хроматофокусирование плазменных липопротеидов низкой плотности // .

Бюлл.эксп.биол.мед., 1990, т.108, N 9, 271-274

2. Плавинская С.И., Шестов Д.Б., Плавинский С.Л Гиповльфахолествринемия и ишемичэская болезнь сердца (подход < использованием факторного анализа)// Кардиология.- 1992.- т.32.-N 6.- C.I7-I9

3. Плавинский С.Л. Распределение по размерам липопротеидо высоко! плотности стенки аорты человека.// У|ф. Биох. журнал.- 1992,- т.64.-N4.- С.50-56

4. Климов i.H. .Гуревич B.C. .Никифорова • ¿.А. .Шаталина Л.В. .Кузьма А.А.,Плавинский С.Л..Тертова Н.П. Об антиоксидантной активностз ЛПВП In vivo.// Белл. експ. биол. мед.- 1992.- T.XCIX.- N 7.-С.40-4; 6. Klljnov А.Н., Gurevlch V.S., Nlkllorova Shatlllna L.V. Kusmln A.A., Plavlnaky S.L., Teryukova K.P. Antloxldatlve actlvlt; of high density lipoproteins In vivo// Atherosclerosis.-1993 v.100.- H 4.- ?.13-18

6. Zllmov A.N., Konstantlnov 7.0., Ilpovetsky B.M., Kuzne'eov A.S,

Ljzoveky V.T., Kuzmln A.A., PlavlnsKy S.L., Trufanov 7.F. Essentia

«

phospholipids and prevention ol coronary heart disease (CHD)/, Abetr. of the 3rd Int. Conf. Prev. Carl., Oslo, 27 June - 3 Jul; 1993, F.230