Сравнительная характеристика гуминовых кислот и грибных меланинов

Завгородняя, Юлия Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по геологии на тему
Сравнительная характеристика гуминовых кислот и грибных меланинов
ВАК РФ 04.00.03, Биогеохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика гуминовых кислот и грибных меланинов"

На правах рукописи

0<А, ¿/¿рс^Яб&С

ЗАВГОРОДНЯЯ Юлия Анатольевна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ И ГРИБНЫХ МЕЛАНИНОВ

Специальность 04.00.03 - биогеохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2000

Работа выполнена на кафедре химии почв факультета Почвоведения Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

профессор, доктор биологических наук Орлов Д.С.

Официальные оппоненты:

профессор, доктор биологических наук

Карпухин А.И. доцент, кандидат биологических наук Богатырев Л.Г.

Ведущая организация:

Почвенный институт им. В.В.Докучаева

Защита диссертации состоится

'2000 г. в 15 час. 30 мин.

в аудитории М-2 на заседании диссертационного совета по биогеохимии Д.053.05.57 МГУ им. М.В Ломоносова по адресу: 119899, г.Москва, Воробьевы горы, МГУ, факультет почвоведения. Ученый совет.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета, отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные печатью, просим присылать по указанному выше адресу.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета Почвоведения МГУ.

Автореферат разослан

диссертационного совета

Ученый секретарь

гу 7¿ 'с

Агапкина Г.И.

Г/0\2, Ъ^'О

/702&. ^ О

Актуальность работы. В образовании гуминовых кислот принимают участие различные органические соединения растительного, животного и микробного происхождения, поступающие в почву. Особое место среди них занимают меланины -высокомолекулярные темноокрашенные пигменты, продуцируемые многими почвенными грибами, отдельные представители которых встречаются в почвах всех зон.

По данным R.A.NicoIaus [1968], К.М.Запрометовой и др. [1971], А.А.Маламы [1975], Z.Filip et al. [1976], L.F.Linhares and J.P.Martin [1978], С.П.Лях [1981], S.Paim et at. [1990] и других авторов, некоторые грибные меланины сходны с гуминовыми кислотами по элементному составу, содержанию функциональных групп, ИК- спектрам, УФ- и видимым спектрам, ЯМР-спектрам, содержанию ароматических фрагментов, аминокислот и полисахаридов. Количество пигментов, попадающих с мицелием в почву, составляет сотые и тысячные доли миллиграмма на 1 грамм почвы и, с учетом неоднократного поступление мицелия в течении года, меланины могут составить значительную долю от органического вещества почвы. Это позволяет некоторым исследователям [Kang, Felbeck, 1964; Запрометова, Мирчинк, 1979; Звягинцев, Мирчинк, 1986] утверждать, что грибные пигменты могут в неизмененном виде не только включаться в стабильные фракции органического вещества почвы, известные как гуминовые кислоты и гумин, но и доминировать в их составе.

Сама по себе близость химического состава и свойств грибных меланинов и почвенных гуминовых кислот еще не говорит о структурном сходстве молекул этих групп веществ и не позволяет однозначно оценить роль пигментов в формировании гумуса. Вклад меланинов в гумусообразование, вероятно, во многом будет определяться их биохимической устойчивостью, способностью длительное время сохраняться в неизменном виде в почвенных условиях.

Цель работы: Дать сравнительную характеристику гуминовых кислот и грибных меланинов по их химическим свойствам и устойчивости к биодеградации.

Задачи: 1. Получить сравнительную характеристику химических свойств меланиновых пигментов и гуминовых кислот из дерново-подзолистой почвы, чернозема, бурого угля и торфа.

2. Определить скорость минерализации почвенными микроорганизмами грибных меланинов и гуминовых кислот. •

3. Изучить изменения в химическом составе и молекулярно-массовых распределениях меланинов и гуминовых кислот в процессе их деградации почвенными микроорганизмами.

4. Определить степень устойчивости меланинов и гуминовых кислот к биотическому и абиотическому разрушению.

Научная новизна работы. Впервые исследованы свойства гуминовых кислот из дерново-подзолистой почвы (ГКД), чернозема (ГКЧ), торфа (ГКТ) и угля (ГКУ) и меланинов из мицелия грибов Aspergillus niger (MA) и Cladosporium dadosporiodes (MK). Показано, что грибные меланины отличаются от гуминовых кислот более высокой молекулярной массой, повышенным содержанием кислых функциональных групп и низкой степенью окисленности.

Определена скорость минерализация гуминовых кислот и меланинов в условиях модельного эксперимента. Установлено, что при биодеградации гуминовых кислот снижается степень их полидисперсности и увеличивается их растворимость в воде. Получено, что при биодеградации грибных меланинов происходит сближение их элементного состава, молекулярных масс и оптических свойств со свойствами гуминовых веществ.

Показано, что скорость ферментного гидролиза протеазой близка для выделенных из почвы гуминовых кислот, и резко различается для исследованных меланинов. Установлено, что меланин Cladosporium dadosporiodes более устойчив к воздействию молекулярного кислорода по сравнению с ГК дерново-подзолистой почвы

Практическая значимость работы. Результаты работы могут быть использованы при изучении химического строения почвенных гуминовых кислот, для оценки устойчивости гумусовых веществ к разложению и прогнозирования изменения запасов органического вещества почв.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на международных конференциях студентов и аспирантов «Ломоносов-97» (1997 г.), «Ломоносов-98»(1998 г.), «Ломоносов-99»(1999 г.), на международном научном семинаре «Трансформация и гумификация органических материалов в почвах» (1997 г.), на заседании кафедры химии почв факультета почвоведения МГУ (1999 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на /Об страницах машинописного текста, включает /Л таблиц и А5 рисунков Список литературы включает работ, в том числе - на иностранных языках.

Работа выполнена при поддержке грантов ФЦНТП «Глобальные изменения природной среды и климата» проект 4.3.1. и РФФИ №99-04-48007.

ОБЪЕКТЫ II МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования были взяты следующие препараты ГК:

- гуминовая кислота из горизонта AI дерновой среднеподзолистой почвы на моренном суглинке, взятой с Лесной опытной дачи МСХА им. К.А.Тимирязева;

- гуминовая кислота из горизонта AI чернозема обыкновенного, взятого с 200-летней негасимой залежи Каменной степи, Таловский р-н, Воронежская обл.;

- гуминовая кислота из торфа (препарат фирмы Merck);

- гуминовая кислота из сильновыветрелого бурого угля Канско-Ачинского угольного бассейна (промышленный препарат гумата натрия ТУ 211-06-18-94).

Выделение препаратов гуминовых кислот. Препараты гуминовых кислот из дерново-подзолистой почвы и чернозема обыкновенного были выделены по стандартной методике [Орлов, Гришина, 1981]. Полученные препараты почвенных ПС, а также промышленные препараты гуминовых кислот из торфа и бурого угля очищали от органо-микералькых примесей высаливанием и переосаждением.

Выделение препаратов грибных меланинов. Мицелий грибов наращивали в течение 2-3 недель на жидкой питательной среде [Linhares, Martin, 1978] при температуре 20-25°С. Затем мицелий извлекали из сосудов, промывали дистиллированной водой и высушивали при температуре 40°С. Мицелий обрабатывали 0,1 н. NaOH и в полученном экстракте осаждали меланин HCl (рН-1-2). Для очистки от низкомолекулярных примесей меланины несколько раз переосаждали и промывали дистиллированной водой.

Химические свойства гуминовых кислот и меланинов. Элементный состав препаратов был определен на CHNS-анализаторе «Barlo Erba» 1106 (Т=1000°С). Спектры поглощения растворов в УФ- и видимой области снимали при рН~11-12 на спектрофотометре UV-260 Shimadzu; ИК-спектры были сняты на спектрофотометре ИКС-29 с применением KBr-техники [Орлов, Осипова, 1988]. Содержание углеводных компонентов в препаратах определяли по методу Дюбуа [Орлов, Гришина, 1981].

Общее содержание кислых функциональных групп рассчитывали по данным потенциометрического титрования, которое проводилось на рН-метре Horiba при 25+0,1 °С в атмосфере Ni при концентрации препаратов 0,5 мг/мл и ионной силе 0,1.

Молекулярно-массовые распределения препаратов были получены методом гель-фильтрации на геле Sephadex G-100. В качестве элюента использовали 0,025М Tris-HCI буфер (pH 8,2) с добавлением 0,1% додецилсульфата натрия, 0,05М NaCl и 0,02% NaN3. Все образцы предварительно пропускали через колонку с гелем Sephadex G-10 для очистки от низкомолекулярных примесей и переведения в Tris-HCI буфер.

Гидрофильно-гидрофобные свойства препаратов определяли методом гидрофобной хроматографии на октил-сефарозе CL-4B в 0,05М Tris-HCI буфере при ступенчатом градиенте 0,3% додецилсульфата натрия.

Схема эксперимента по биодеградации гуминовых кислот н меланинов. 70100 мг препарата смешивали с 20 г кварцевого песка, в полученную смесь вносили 200мг глюкозы, меченной |4С, в виде концентрированной глкжозо-минеральной смеси [Паников и др., 1982], и почвенный инокулят. Влажность полученной смеси доводили до 60% от ПВ и инкубировали 3 месяца в сосудах объемом 100 мл с герметичной крышкой при Т=25"С. Модельный эксперимент с некоторой степенью условности воспроизводит ежегодное поступление с растительным опадом в почву легкоминерализуемого органического вещества и его деструкцию в присутствии стабильных фракций гумуса.

Скорость минерализации ГК и меланинов рассчитывали по разности между суммарным количеством выделившейся из инкубационных сосудов ССЬ и количеством выделившегося ,4С02, источником которого являлась |4С-глюкоза или продукты метаболизма и лизиса выросшей на ней микробной биомассы, равномерно меченной 14С. Разложение ГК торфа, к которой была добавлена немеченая глюкоза, определяли по разности между эмиссией СО} из сосудов с ГК и эмиссией из контрольных сосудов. Контролем являлась смесь почвенного инокулята и глюкозы, внесенная в чистый песок.

После 2, 6 и 9 недель эксперимента инкубационные сосуды снимали и их содержимое последовательно обрабатывали водой (в отношении 1:5) и 0,1н. NaOH (в отношении 1:10). Щелочной экстракт подкисляли HCl, полученный осадок, который представлял собой собственно гуминовую кислоту или меланин, переосаждали и промывали водой. Количество углерода ГК или меланина, переходящее в экстракты определяли по разности между общим содержанием в них С и содержанием ИС, присутствие которого объясняется образованием при инкубации водо- и щелочерастворимых продуктов

микробного синтеза. Опыт проводили в 3-5-кратной повторности, доверительный интервал рассчитывали для Р=0,95.

Количество выделившегося С02 при минерализации гумнновых кислот и меланинов определяли абсорбционным методом с титриметрическим окончанием [Шарков, 1983,1984,1987; Иванникова, 1992].. В качестве поглотителя использовали 0,5н. КОН, избыток которого, не связавшийся с СОг, оттитровывали 1,0н. Н2504.

Измерение радиоактивности. Для определения активности 14С в растворах аликвоту раствора помещали в гелиевый сцинтиллятор и определяли радиоактивность смеси на жидкостном сцинтилляционном счетчике ЬКВ КаскВе1а 1217 с учетом поправок на гашение.

Ферментативная деструкция гуминовых кислот и меланинов. Деструкцию препаратов трипсином проводили в 0,05М Тп5-НС1 буфере с добавлением 0,03% тритона Х-100 при рН 8,2. Смесь, содержащую в 20мл буфера 8 мг трипсина и 40 мг исследуемого препарата, инкубировали 7 часов при Т=37±0, ГС. Через каждый час отбирали 1мл смеси, добавляли 1мл 10%ТХУ для остановки реакции, смесь оставляли на 10 мин для коагуляции, осадок центрифугировали 10 мин. при 2000з и измеряли оптическую плотность надосадочной жидкости при длине волны 280нм на спектрофотометре СФ-41. По изменению оптической плотности раствора, возникающей в результате отщепления от препарата низкомолекулярных кислоторастворимых продуктов, определяли динамику деструкции.

Облучение препаратов светом. Растворы гуминовой кислоты и меланина облучали светом с длиной волны 360-660 нм при рН~10. Облучение проводили в течении 1 часа в закрытой кювете с предварительной продувкой Аг и в открытой кювете в атмосфере кислорода. Оптическую плотность растворов ГК и меланина снимали на спектрофотометре СФ-46, ММ-распределения получали на геле БерЬаёех О-50Р (элюент - 0.025М Тп5-НС1 буфер (рН 8.2)+0,1% ДСН+0,05М №С1). Фракции ГК получали на геле 5ерЬас1ех 0-50Р в 0,05М ИаОН.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЛАНИНОВ ПОЧВЕННЫХ ГРИБОВ

Известно, что грибные меланины широко варьируют по своим свойствам. Для выбора меланина, который мог быть использован в последующих опытах, был проведен сравнительный анализ 15 темноокрашенных пигментов, образуемых почвенными

грибами (табл.1). Экстракцию пигментов проводили описанным выше методом с продувкой щелочных экстрактов

Таблица 1. Содержание и свойства грибных меланинов

Вид гриба Содержание меланина (%) p OOOI'-C Ё4 Ее Содержание фракций (%) с ММ

>150000 -70000 600012000

(¡liocladium calenulatum 0,3 0,033 6,9 23 63 14

Gilman 72

Aspergilliis cundidas Lmk.7 0,4 0,018 5,4 15 74 11

С ludosponwn cladosporiodes 0,2 0,011 3,8 20 40 40

de Vries 2

('ladosporium sp. 86 0,4 0,015 3,9 18 62 20

( '. cludosporiodes 90 0,6 0,026 4,0 36 56 8

Alternaría sp. 80 0,4 0,033 4,9 21 43 36

A. altérnala Keiss 38 0,5 0,033 5,0 11 67 22

Alternaría sp. 53 1,2 0,019 3,6 11 70 19

Ulucladium sp. 98 0,7 0,015 3,6 18 51 31

Ulticladium botrytts l'reussA2 1,2 0,018 3,2 30 60 10

Drechlera dematiadeae Bubuk. 20 1,5 0,049 4,8 27 47 26

Verticillium luterUium Herkely 95 1,9 0,056 9,8 28 32 40

l'emcil/ium sp. 79 2,3 0,038 7,9 31 55 14

Acremomum sp. AB 7,4 0,032 8,9 23 62 15

Stachybatryx aira С 'arda 1 9,2 0,041 6,5 2 84 14

Выход меланинового пигмента в исследованных грибах варьировал от 0,3 до По данным гель-фильтрации все полученные меланины состоят из трех фракций со среднсвесовыми молекулярными массами >150000, -70000 и 6000-12000 и имеют относительно низкую оптическую плотность по сравнению с почвенными ГК (Еиа0"00"40 составляли 0.01-0.05). Для молекулярного состава большинства меланинов характерно преобладание фракции с ММ-70000 и относительно невысокое содержание фракции с ММ-6000-12000 (<40%), что отличает их от почвенных гуминовых кислот, в составе которых низкомолекулярная фракция преобладает.

Использование при экстракции меланинов N2 в качестве газовой фазы позволяет избежать окисления пигментов кислородом воздуха. При выделении пигментов без продувки азотом наблюдались изменения в их оптических свойствах и ММ-распределениях (табл.2). Увеличение оптической плотности растворов меланинов можно объяснить появлением в ходе реакции с кислородом новых хромофорных группировок в молекулах пигментов. В ряде случаев такие реакции окисления могут сопровождаться разрушением макромолекул, что повышает долю низкомолекулярных фракций в составе

меланина. Полученные результаты указывают на зависимость свойств меланинов от процедуры их выделения из грибного мицелия.

Таблица 2. Содержание и свойства меланинов, экстрагированных из мицелия 0,1 п. N8011 с продувкой \2(1) и без продувки N¡(2)

Мела- Содержание фракций (%) с MM

Вид гриба нин и о 0(1 1*«C t-465 >150000 -70000 -40000 6000-

(%) 12000

Alternaría 1 0,5 0,033 5,0 11 67 - 22

altérnala Keiss 38 2 1,7 0,043 4,9 29 - 16 55

lllocladium sp. 98 1 0,7 0,015 3,6 18 51 - 31

2 3,3 0,052 3,8 4 13 - 83

Drechlera dema- 1 1.5 0,049 4,8 27 47 26

liadeue Bubuk. 20 2 2,6 0,056 3,8 21 - 19 60

Cladosporium 1 0,6 0,026 4,0 36 56 - 8

cladosporiodes 90 2 1,0 0,030 3,6 40 42 - 18

На основании полученных результатов для дальнейших исследований был отобран меланин Cladosporium cladosporiodes, молекулярные параметры и оптические свойства которого наиболее контрастно отличались от свойств гуминовых кислот и незначительно изменялись при экстракции в присутствии кислорода. Также был взят меланин гриба Aspergillus niger, хорошо изученный и описанный в литературе [Kang, Feibeck, 1965; Barbetta et all., 1967; Nicolaus, 1968 и др.]. Оба гриба являются космополитными и встречаются во всех зональных почвах, но для почв умеренной зоны Aspergillus niger встречается чаще в минеральных горизонтах, a Cladosporium cladosporiodes - в подстилках и органогенных горизонтах.

ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГРИБНЫХ МЕЛАНИНОВ И ГУМИПОВЫХ

КИСЛОТ

По элементному составу (табл.3) исследованные гуминовые кислоты и меланины в целом сходны между собой. Невысокие значения отношения Н:С (0,8-1,1) указывают на преобладание в составе ГК ароматических структур. ГК из торфа и угля отличаются от почвенных низким содержанием азота, а ГК угля и высокой степенью окисленности. Меланин Cladosporium cladosporiodes отличается от препаратов гуминовых кислот и меланина Aspergillus niger более высоким содержанием азота (7,2%) и низкой степенью окисленности, а широкое отношение Н:С указывает на значительное содержание алифатических компонентов в составе меланина.

Таблица 3. Элементный состав гуминовых кислот и меланинов (над чертой -масс.%, под чертой - ат.%)

Препарат Зола,% С Н N О Н:С О.С C:N Степень окисленности, ш

гкд 3,2 54.2 37.3 41,3 46 2,7 36,2 18,7 1,11 0,50 13,81 -0,10

ГКЧ 6,2 55,9 41,8 35,3 5J. 3,2 35,1 19,7 0,84 0,47 13,06 +0,10

ГКТ 1,9 51,2 35,9 м 40,7 2J3 1,7 41,2 21,7 1,13 0,60 21,12 +0,08

ГКУ 6,7 45,5 37,2 Ш 31,4 L2 0,6 50,4 30,9 0,84 0,83 62,00 +0,82

МА 1,7 54,5 37,3 Li 41,6 11 3,1 35,0 18,0 1,12 0,48 12,03 -0,15

МК 1,9 52,3 33,9 5J 45,2 12 4,0 34,7 16,9 1,33 0,50 8,48 -0,34

Спектр поглощения меланина Cladosporium cladosporiodes в УФ- и видимой

области (рис.1) так же, как и спектры поглощения всех ПС, имеет вид пологой кривой.

Однако на спектре меланина Aspergillus niger видны два четких максимума при длине

волны 300 нм и 420 нм. Коэффициент экстинкции (табл.6) меланина Aspergillus niger

значительно выше, чем у всех гуминовых кислот (0,176), что, вероятно, можно объяснить

наличием в молекуле пигмента большого количества сопряженных двойных связей.

Е465°()01%С меланина Cladosporium cladosporiodes значительно ниже, чем у всех ГК (0,03).

Рисунок 1. Спектры поглощения гуминовых кислот и меланинов в ультрафиолетовой и видимой области (концентрация растворов - ОД мг/мл, концентрация меланина Aspergillus niger - 0,05 мг/мл)

нм

Рисунок 2. Инфракрасные спектры гумнновых кислот и меланинов (см-1)

ИК-спектры всех препаратов имеют сходную форму (рис.2). Спектры ГК дерново-подзолистой почвы и меланина С1а<1о$рогЫт с1ас1о$рогю<1е$ несколько отличаются от остальных невысокой интенсивностью полосы при 1610 см"1, вызываемой колебаниями ароматических С=С связей, что при высокой интенсивности полос 2920 и 2860 см"1 (валентные колебания СН2-, СН3-групп) указывает на значительную долю алифатических компонентов в составе препаратов. Спектры этих препаратов характеризуются также наличием полосы поглощения при 1530см"', обусловленной присутствием амидных группировок. Наибольшую интенсивность имеет эта полоса на спектре меланина СЫохрогшт сЫо.чрпгЫех, что, вместе с высоким содержанием азота, свидетельствует о наличии большого числа пептидных фрагментов в составе пигмента.

По данным потенциометрического титрования количество кислых функциональных групп в меланинах выше, чем в гуминовых кислотах (табл.4). Причем меланины содержат вдвое больше кислых групп, титрующихся в диапазоне рН 8.0-10.5, в котором диссоциируют слабокислые фенольные группы. Для всех изученных препаратов титрование необратимо - наблюдается гистерезис. Соответственно, величины

общего содержания функциональных групп, определенные методом обратного титрования выше величин, определенных при прямом.

Таблица 4. Содержание функциональны! групп в гуминоаых кислотах и меланинах (по данным потенциометрического титрования)

Обратное титрование (ммоль(-Уг) Прямое титрование (ммоль(-)/г)

Препарат интервал рН общее интервал рН

обшее 4,0-5,0 1 5.0-7,0 7,0-8,0 8,0-10,5 4,0-7,5 7,5-10,0

ГКД 5.90 2,31 1,94 1,65 3,76 2,86 0,90

ГКЧ 6,04 2,34 2,06 1,64 3,95 2,87 1,08

ГКТ 5,80 2,42 1.69. 1,69. 3,92 2,40 1,52

ГКУ 5,60 2,40 1,60- 1,60- 3,98 2,79 1,19

МА 9,00 0,96 4,48 4,16 3,41 1,55 1,86

МК 10,56 0,64 | 3,20 1,92 4,80 2,50 1,25 1,25

Константы диссоциации ГК и меланинов в целом сходны между собой и находятся в пределах 4,4-4.7; 7.5-8.1; 9.6-9.9, но для меланина С1ш1охрогтт сЬЛохрогМеа установлено наличие четвертого типа функциональных групп с рК 6.3, который титруется в диапазоне рН 5.0-7.0 (табл.5). Таблица 5. Константы диссоциации гумнновых кислот и меланинов

Препарат Обратное титрование Прямое титрование

рК, рК2 РК, рК| рК, РК2

ГКД 4.6 - 7,7 9,8 5,1 9,5

ГКЧ 4,7 - 8,1 9,9 4,9 9,6

ГКТ 4,7 7,9 9,8 4,8 9,4

ГКУ 4,7 - 7,8 9,6 4,9 9,4

МА 4,4 - 7,5 9,9 5,1 9,4

МК 4,5 6,3 7,6 9,8 5,3 9,4

От гумнновых кислот меланины отличает более высокое относительное содержание в их составе высокомолекулярных фракций, причем наиболее высокомолекулярным является меланин С1ас1озрогшт с!ас!оьрогюс1е$ (табл.6). Таблица 6. Физико-химические свойства гумнновых кислот и меланинов.

Препарат г; 0 001'яС Е4/Еб Содержание фракций (%) с ММ Содержание утлеводов, % Содержание гидрофильной фракции, %

>150000 -70000 -10000

ГКД 0,075 4,6 7 21 12 3,6 53

ГКЧ 0,115 4,0 3 13 84 4,6 56

ГКТ 0,081 5,2 4 14 82 3,1 42

ГКУ 0,144 5,8 2 4 94 2,3 49

МА 0,176 2,9 8 30 62 5,0 -

МК 0,030 3,6 40 42 18 3,4 14

БИОДЕГРАДАЦИЯ ГРИБНЫХ МЕЛАНИНОВ И ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ В УСЛОВИЯХ МОДЕЛЬНОГО ЭКСПЕРИМЕНТА Скорость минерализации грибных меланинов н гумнновых кислот. Потребление внесенной глюкозы и рост микроорганизмов при инкубации начался на сутки раньше по сравнению с контрольным для вариантов с ГК чернозема, ГК угля, ГК торфа и меланином С1ас1о$рогтт с1ас!(арогнх!еь, что может быть связано со стимулирующим эффектом этих препаратов, обладающих по нашим данным [Орлов и др., 1997] биологической активностью. После 2-х недель инкубации, в течении которых вся глюкоза была минерализована или включена в микробную биомассу, в виде СО; выделилось около 70% внесенного |4С. После этого в выделяющемся СО: начинала нарастать доля нерадиоактивного С, источником которого являлись разлагающиеся препараты. За последующие 10 недель только около 10% внесенной радиоактивной метки выделилось в виде СОг вследствие эндогенного метаболизма меченной микробной биомассы и ее реутилизации. Рисунок 3. Минерализация гумнновых кислот и меланинов

14 21

35 42 49 56 63 70 77

84 91 сутки

—о— ГК чернозема —^—ГК дерново-подзолистой почвы

о ГК торфа —о— ГК угля

- о - меланин Aspergillus niger

- ^ - меланин Cladosporium cladosporiodes

По результатам эксперимента было установлено, что за три месяца было минерализовано и выделилось в виде С02 8.2% углерода ГК чернозема и 12.1% углерода ГК дерново-подзолистой почвы. Степень минерализации меланинов оказалась в два раза выше и составила 22.2 и 24.7% для меланина Aspergillus niger и меланина Cladosporium cladosporiodes, соответственно. Причем скорость разложения меланинов была особенно высокой в первые 4 недели. Наиболее устойчивыми к биодеградации оказались препараты ГК из торфа и угля - за 3 месяца было минерализовано всего 34% углерода (рис.3).

Изменение во фракционном составе грибных меланинов и гуминовых кислот при биодеградации. При разложении почвенных гуминовых кислот и ГК торфа после 2-х недель опыта происходит уменьшение содержания углерода гуминовых кислот в водном экстракте (рис.4), затем количество углерода водорастворимой фракции нарастает, причем наиболее интенсивно для ГК чернозема. Вероятно, за первые 2 недели в процессе кометаболизма происходит частичная минерализация компонентов водорастворимой фракции ГК, как наиболее доступных для действия микроорганизмов. В дальнейшем, при более глубокой деструкции молекул ГК от них отщепляются новые низкомолекулярные водорастворимые фрагменты (по данным гель-фильтрации на геле Sephadex G-100 их молекулярная масса не превышала 5 ООО). Содержание углерода в щелочных экстрактах ГК при этом снижается.

Для ГК угля изменения во фракционном составе в ходе инкубации были незначительны. Наблюдалось лишь небольшое снижение содержания углерода ГК в водном экстракте (рис.4).

Содержание водорастворимой фракции меланина Cladosporium cladosporiodes при инкубации увеличивается. Результаты хроматографии на геле Sephadex G-10, полученные для водного экстракта (рис.6), показывают, что водорастворимая часть меланина становится более низкомолекулярной и представляет собой, по-видимому, осколки, отщепленные от крупных молекул.

Наименее гидрофильный меланин Aspergillus niger в водную вытяжку практически не переходил.

Рнсунок4, Изменение содержания углерода гуминовых кислот и меланинов в экстрактах при инкубации

П ГК дерново-ползолистой почвы П ГК чернозема 0 ГК торфа О ГК угля

□ меланин Aspergillus niger

□ меланин Cladosporium cladosporiodes ,

Водный экстракт

и о

г g. to W ь

¡г

16.4

11,6 гУ

5 -

7,8 й

8.7

22,6

4.8 6,1

1,6

11,8 лз

11,2

14.5

5.2

1,3

100

с £ tj и

й I 90

^ С

5 С.

ü Ъ 1£

сутки инкубации Щелочной экстракт

98.4

97,6 93,9 т

99,1

95 2 93,4 93,0 о: о ' '

93,9 '

88,8

93.0 90,9 Т

81,1

98.7 94,8 if

92,4

88 2 88,8

IftW

сутки инкуоации

85,5

Изменение свойств грибных меланинов и гуминовых кислот при бнодеградацни По данным элементного анализа, во всех инкубированных препаратах практически не изменяется содержание азота, в гуминовых кислот несколько повышается содержание водорода (табл.7).

Таблица 7. Изменение элементного состава гуминовых кислот и меланинов (в ат.%) после инкубации (над чертой - до инкубации, под чертой - после инкубации)

Препарат с Н N О Н:С 0:С C:N Степень

окисленности, со

ГКД 37.3 41.3 22 18.7 1.11 0.50 13,81 -0.10

36,5 41,7 2,5 19,3 1,14 0,53 14,41 -0,08

ГКЧ 41,8 35.3 12 19.7 0.84 0.47 13.06 +0.10

39,0 36,9 3,2 20,9 0,95 0,54 12,08 +0,13

гкт 3S.9 40.7 LZ 21.7 1.13 0,60 21.12 +0.08

35,4 42,2 1,9 20,5 1,19 0,58 18,85 -0,03

ГКУ 37.2 31.4 и 30.9 0.84 0.83 62.00 +0.82

39,2 35,2 0,7 24,9 0,90 0,64 60,08 +0,37

МА 37.3 41.6 И 18.0 1.12 0.48 12.03 -0.15

38,2 39,5 2,9 19,4 1,03 0,51 13,12 -0,02

мк 33.9 45.2 4J) 16.9 1.33 0,50 8.48 -0.34

35,9 39,7 4,5 20,0 1,11 0,58 8,05 0,01

Для ГК угля после инкубации заметно снижается степень окисленности, что сопровождается некоторым снижением значения E46j°,oc"v' препарата (табл.8). Оптические свойства остальных гуминовых кислот существенно не изменяются. Наблюдается лишь небольшое понижение оптической плотности после двух недель инкубации (табл.8).

Для меланина Cladosporium ciadosрогiodes увеличивается содержание углерода и кислорода и снижается - водорода (табл.7). Увеличение степени окисленности меланина при инкубации сопровождается резким (более чем в 3 раза) повышением оптической плотности (табл.8), которая может быть вызвана появлением дополнительного количества хромофорных группировок в молекулах пигмента. Оптическая плотность меланина Aspergillus niger в ходе минерализации становится ниже, при этом отношение Н:С сужается. По-видимому при минерализации меланина Aspergillus niger разрушаются алифатические мостики, связывающие ароматические фрагменты молекулы, что вызывает укорачивание цепи сопряженных связей и снижение оптической плотности пигмента.

Во время эксперимента поступление |4С в осаждаемые кислотой фракции ГК и меланинов наблюдалось только на 16 сутки инкубации (рис.5). После 3 месяцев

инкубации небольшое количество С (2-3% от внесенного) было обнаружено только в

осадках ГК дерново-подзолистой почвы и меланина Aspergillus niger.

Рисунок 5. Поступление ЫС в гумнновыс кислоты и меланины во время инкубации.

' ® ОГК дерново-подзолистой почвы

ПГК чернозема S3 ГК угля

□ меланин Aspergillus niger

□ меланин Cladosporium cladosporiodes

3,8

2,2

'"■г4'

сутки инкубацин

После двух недель инкубации происходит незначительное повышение содержания высокомолекулярной фракции с ММ>150000 в составе ГК и меланинов (табл.8), что кореллирует с наличием в препаратах радиоактивной метки. Увеличение доли высокомолекулярных фракций может быть вызвано с одной стороны - включением в молекулы ГК и меланинов крупных фрагментов белка микробного происхождения (так называемое «фрагментарное обновление ГК»), с другой стороны - механическим соосажлением вместе с ГК или меланинами тех же фрагментов, которые при более длительных сроках инкубации минерализуются микроорганизмами.

В дальнейшем наблюдается снижение доли высокомолекулярных фракций и повышение содержания низкомолекулярной в составе всех препаратов (табл.8), что может свидетельствовать о меньшей устойчивости высокомолекулярных фракций к биодеградашга. Особенно интенсивно разрушаются высокомолекулярные фракции меланина С!аЖкропит с1ас1ихрогюЛе* - за время эксперимента их содержание

уменьшается в 2 раза, что, наряду с повышением оптической плотности, вызывает

сближение свойств пигмента со свойствами гуминовых кислот.

Таблица 8. Изменение оптических свойств и молекулярных масс гуминовых кислот и меланинов в ходе инкубации.

Препарат Время инкубации. т? ОООГ.С £-465 Ед/Е, Содержание фракций (%) с ММ

сутки >150000 -70000 -10000

гкд 0 0,076 47 7 21 72

16 0,070 4,о 10 18 72

47 0,074 4,7 7 16 77

91 0,077 4,6 4 13 81

ГКЧ 0 0,117 4,0 3 13 84

16 0,101 4,0 5 12 83

47 0,115 4,1 2 9 89

91 0,117 4,0 1 5 94

ГКТ 0 0,082 5,2 ■ 1 14 82

16 0,071 5,0 8 11 81

79 0,080 5,0 3 9 88

ГКУ 0 0,145 5,8 2 4 94

16 0,125 4,2 5 4 91

47 0,128 4,8 4 4 92

91 0,134 5,2 2 3 95

МА 0 0,179 3,0 (8)* (30) (62)

16 0,141 2,9 (Ю) 1 32) (58)

47 0,153 2,9 (8) (2'7) (65)

91 0,157 3,1 (6) (26) (68)

МК 0 0,030 3,8 40 40 20

16 0,041 3,6 42 44 14

47 0,080 3,7 29 24 47

91 0,096 3,7 22 28 50

* - в скобках приведены данные о молскулярно-массовом составе фрак ции меланина, не сорбирующейся на Сефадексах (-25% от общего веса)

На гель-хроматограммах почвенных ГК (рис.6) видно, что максимум пика низкомолекулярной фракции сдвигается в область более высоких мол екулярных масс, при этом сам пик становится уже и симметричнее, то есть при .минерализации понижается полидисперсность гуминовых кислот.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ГРИБНЫХ МЕЛАНИНОВ И ГУМ1ШО.В1>.'Х

КИСЛОТ

Многие почвенные грибы, бактерии и актиномицеты способны выделять I? окружающую среду протеолитические и целлюлолитаческие ферменты, сохраняющие

Рисунок 6. Изменение ММ-распределеннй ГК и меланина при инкубации

— до инкубации - после 16 суток инкубации

---после 47 суток инкубации ----после 91 суток инкубации

свою активность в почвенных условиях. За счет действия ферментов осуществляется биотическая деструкция гуминовых веществ и меланнновых пигментов в почвк [Мишустин, Никитин, 1961; МаЛиг, 1971]. Было исследовано разложение гуминовых кислот и меланинов под действием лротеолитического фермента трипсина.

Ферментолиз почвенных ГК протекал практически одинаково: выход кислоторастворимых продуктов постепенно нарастал и достигал максимума через 3 часа экспозиции, величина деструкции была одинакова для ГК чернозема и ГК дерново-подзолистой почвы (рис.7). Менее гидрофильные препараты ГК торфа и угля оказались заметно устойчивей к действию ферментов (примерно в 1.5 раза), что вместе с низким содержанием азота в их составе указывает на невысокое содержание пептидных компонентов.

Рисунок 7. Деструкция гуминовых кислот и меланинов трипсином (по выходу кислоторастворимых продуктов)

-0,05 - ------------------------------- — - -

0 60 120 180 240 300 360 420

время, мин

—л—ГК дерново-подзолистой почвы —о—ГК чернозема

- о - меланин Aspergillus niger

- л - меланин Cladosporium cladosporiodcs —о— ГК угля

о ■■ ГК торфа

Наименее устойчивым к действию трипсина оказался меланин Cladosporium cladosporiodcs, что, возможно, связано с высоким содержанием пептидных компонентов в

его составе, причем максимальный выход аминокислот наблюдался уже через 30 минут после начала реакции.

Меланин Aspergillus niger оказался весьма устойчив к воздействию трипсина, величина его деструкции сходна с полученной для ГК угля и торфа. Это может быть связано не только с низким содержанием пептидных компонентов в молекуле меланина, но и с особенностями его аминокислотного состава, так как трипсин предпочтительно расщепляет связи между остатками лизина и аргинина. Можно также предположить, что пептидные цепочки в молекуле меланина слишком короткие и не подвергаются атаке фермента.

В реакционной смеси ГК-фермент происходит не только протеолиз гуминовой кислоты, но и автолиз самого фермента, в результате чего в раствор поступает дополнительное количество отщепленных аминокислот. При ингибировании фермента гуминовой кислотой прекращается и его автолиз, и дополнительного увеличения оптической плотности за счет поступления продуктов расщепления трипсина не происходит. В контрольной же смеси автолиз трипсина идет в течение всего времени эксперимента, следовательно, оптическая плотность надосадочной жидкости продолжает нарастать, и измеряемая разность между оптической плотностью анализируемого и контрольного образца при этом будет уменьшаться.

Если оценивать степень ингибирования фермента по изменению разности оптических плотностей, то наиболее сильным ингибитором трипсина является ГК дерново-подзолистой почвы, затем идет ГК чернозема, ГК торфа и ГК угля. Степень ингибирования обратно коррелирует с содержанием низкомолекулярной фракции в составе ГК. Сильнее всего ингибирует фермент наиболее полидисперсная и высокомолекулярная гуминовая кислота.

При реакции меланина Aspergillus niger с трипсином через 2 часа выход кислоторастворимых продуктов достиг максимума, и оптическая плотность далее не изменялась, что указывает на отсутствие ингибирования фермента в растворе меланина.

УСТОЙЧИВОСТЬ МЕЛАНИНА И ГУМИНОВОЙ КИСЛОТЫ К ДЕЙСТВИЮ МОЛЕКУЛЯРНОГО КИСЛОРОДА

Абиотическим фактором, вызывающим деструкцию гуминовых кислот, может являться молекулярный кислород. В основном состоянии молекулярный кислород малоактивен, но может быть активирован различными агентами, одним из которых

является излучение в УФ-области спектра В отличие от УФ-света, энергии которого достаточно для возбуждения 02 или разрыва связей в молекулах ГК [ТюЬу, 1971; Ильин, Орлов, 1973], излучение в видимой области спектра не обладает достаточной энергией для инициирования этих процессов. Однако, поглощение квантов видимого света приводит молекулы ГК в возбужденное состояние, возбуждение может сниматься за счет передачи энергии на молекулы 0>, которые в свою очередь переходят в активное состояние (фотосенсибиллизаыия).

Рисунок 8. Изменение молекулярно-массовых распределений ГК дерново-подзолистой почвы и ее фракций при облучении светом исходная

- после облучения с предварительной продувкой Аг

----- после облучения без предварительной продувки Аг

И,,

О,,

Р.

ГК дерново-подзолистой почвы

С-50

ГК дерново-подзолистой

почвы фракция 1

С-50

ГК дерново подзолистой

почвы фракция 2

С-50

Воздействие молекулярного кислорода воздуха, активированного в результате реакций фотосенсибиллизации, вызывает снижение оптической плотности ГК дерново-подзолистой почвы на 10% (табл.9) и изменение ее ММ-распределения (рис.8). Причем, как показали опыты по облучению двух ее фракций с ММ>30000 и ММ-5000, в растворе ГК одновременно может происходить разрушение высокомолекулярных молекул и полимеризация низкомолекулярных, что на гель-хроматограммах проявляется в снижении высоты высокомолекулярного пика и сужении низкомолекулярного.

Таблица 9. Изменение оптических свойств гуминовой кислоты и меланина при облучении видимым светом.

(условия облучения: 1 - исходный образец; 2-в закрытой кювете с предварительной продувкой Аг; 3 - в открытой кювете без продувки Аг)

Препарат pH раствора r Q.MjV. E-tfö

1 9,99 0,825

ГКД 2 9,71 0,773

3 9,40 0,748

ГКД 1 9,99 0,827

фракция I 2 9,84 0,821

(ММ>30 ООО) 3 9,82 0,792

ГКД 1 9,97 0,349

фракция 2 2 9,86 0,315

(ММ~5 ООО) j 9,82 0,289

1 10,00 0,113

МК 2 9,96 0,112

3 9,92 0,110

Изменений оптических свойств и молекулярных параметров меланина Cladosporium chdosporaides под воздействием СЬ при облучении раствора светом не обнаружено. Это может объясняться тем фактом, что в клетках микроорганизмов меланины выполняют защитную функцию, предохраняя живые организмы от вредного воздействия повышенной радиации и инсоляции, и, следовательно, не должны разрушаться при интенсивном облучении.

ВЫВОДЫ

1. Темноцветные пигменты, выделенные из мицелия 15 различных штаммов почвенных грибов сильно варьируют по оптическим свойствам и молекулярным массам. Обшим для всех проанализированных пигментов является преобладание в их составе фракций с молекулярной массой больше 12 ООО.

2. Препараты меланинов грибов Aspergillus ntger и Cladosporium cladosportodes близки к препаратам гуминовых кислот из дерново-подзолистой почвы, чернозема, торфа и угля по элементному составу, содержанию углеводных компонентов и кислотно-основным свойствам, но отличаются от изученных ГК оптической плотностью, более высокой молекулярной массой и повышенным содержанием кислых функциональных групп.

меланинов в тех же условиях была в 2 раза выше, чем у почвенных ГК; было минерализовано 22,2% меланина Aspergillus niger и 24,7% меланина Cladosporium cludusponudcs.

4. Высокомолекулярные фракции гуминовых кислот менее устойчивы к микробному разложению по сравнению с низкомолекулярной фракцией. При биодеградации происходит отщепление от молекул ГК водорастворимых компонентов, и снижается степень полидисперсности гуминовых кислот.

5. В ходе инкубации меланины претерпевают разнонаправленные изменения в своем строении. Минерализация меланина Aspergillus niger сопровождается снижением его оптической плотности, что может быть связано с сокращением цепи сопряженных связей в молекуле пигмента. При минерализации меланина Cladosporium cladnsporiudes происходит разрушение его высокомолекулярных фракций, сопровождающееся появлением дополнительного количества кислородсодержащих хромофорных группировок, что ведет к резкому увеличению оптической плотности пигмента.

6. Глубина и скорость ферментативного гидролиза трипсином близки для почвенных гуминовых кислот, и резко различаются для меланинов. Наиболее устойчивым к действию трипсина оказался меланин Aspergillus niger, степень его устойчивости сходна с полученной для препаратов ГК из торфа и угля.

7. Являясь менее устойчивым, по сравнению с почвенными ГК, к микробному разложению, меланин Cladosporium cladosporiodes в то же время обладает высокой устойчивостью к абиотической деструкции под воздействием молекулярного кислорода.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Д.С.Орлов, В.В.Демин, Ю.А.Завгородняя «Влияние молекулярных параметров гуминовых кислот на их физиологическую активность», Доклады Академии наук, 1997, том 354, №6, с. 843-845

2. Ю.А.Завгородняя «Влияние молекулярных параметров гуминовых кислот на их биологическую активность», IV Всероссийская студенческая конференция «Экология и проблемы защиты окружающей среды». Тезисы докладов, Красноярск, 1997, с. 82

3. Ю.А.Завгородняя «Влияние молекулярных параметров гуминовых кислот на их биологическую активность», Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 97». Тезисы докладов. Почвоведение. В печати.

4. Ю.А.Завгородняя «Сравнительная характеристика физико-химических свойств грибных меланинов», Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 98». Тезисы докладов. Почвоведение, Москва, 1998, с. 24

5. Ю.А.Завгородняя «Минерализация гуминовых кислот из чернозема и дерново-подзолистой почвы», Докучаевские молодежные чтения «Почва. Экология. Общество.». Тезисы докладов. Почвоведение, Санкт-Петербург, 1999, с. 203

6. Ю.А.Завгородняя «Ферментативная деструкция гуминовых кислот и грибных меланинов». Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 99». Тезисы докладов. Почвоведение, Москва, 1999, с. 38

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Завгородняя, Юлия Анатольевна

Введение.

Глава 1. Меланиновые пигменты, их строение и роль в гумусообразовании.

Глава 2. Сравнительная характеристика меланинов почвенных грибов.

2.1 Химические свойства меланинов.

2.2 Влияние процедуры экстракции на свойства меланинов.

Глава 3. Выделение препаратов грибных меланинов и гуминовых кислот.

3.1 Выделение меланинов.

3.2 Выделение гуминовых кислот.

Глава 4. Химические свойства грибных меланинов и гуминовых кислот

4.1 Элементный состав.

4.2 Спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях.

4.3 Инфракрасные спектры.

4.4 Молекулярно-массовые распределения.

4.5 Гидрофильно-гидрофобные свойства.

4.6 Кислотно-основные свойства и содержание функциональных групп.

4.7 Содержание углеводов.

Глава 5. Биодеградация грибных меланинов и гуминовых кислот в условиях модельного эксперимента

5.1 Схема эксперимента.

5.2 Скорость минерализации грибных меланинов и гуминовых кислот.

5.3 Изменения фракционных составов грибных меланинов и гуминовых кислот при биодеградации.

5.4 Изменение свойств грибных меланинов и гуминовых кислот при биодеградации.

Глава 6. Ферментативный гидролиз грибных меланинов и гуминовых кислот.

Глава 7. Устойчивость меланина и гуминовой кислоты к действию молекулярного кислорода.

Выводы.

Введение Диссертация по геологии, на тему "Сравнительная характеристика гуминовых кислот и грибных меланинов"

Существующие концепции гумификации предполагают два основных пути трансформации в гумусовые кислоты высокомолекулярных соединений растительного и микробного происхождения, поступающих в почву. С одной стороны предполагается практически полный распад до мономеров и последующая их конденсация («конденсационная» гипотеза, изложенная в трудах W.Flaig [Flaig, 1964, 1988] и М.М.Кононовой [1963, 1972]). С другой стороны -постепенная трансформация высокомолекулярных компонентов и их дериватов в гумусовые кислоты путем ароматизации и карбоксилирования (гипотеза деградации биополимеров [Hedges, 1988] или «окислительного кислотообразования» Л.Н.Александровой [1970,1980]).

И в той, и в другой концепции в качестве источников гумусовых кислот рассматриваются самые разнообразные вещества: крупные фрагменты лигнина, белков, полисахаридов, дубильных веществ, нуклеиновых кислот. Общее направление гумификации определяется отбором таких биотермодинамически устойчивых соединений, которые в условиях биосферы, главным образом в корнеобитаемых слоях почв, способны создать необходимые экологические условия для обитания микроорганизмов, растений и почвонаселяющих животных [Орлов, 1993].

Среди всех поступающих в почву веществ особое место занимают меланины - высокомолекулярные темноокрашенные пигменты, продуцируемые многими, в том числе и почвенными, грибами. Являясь продуктами внутриклеточного синтеза, меланины в то же время близки по многим физическим и химическим свойствам к гуминовым кислотам. Это послужило причиной возникновения гипотезы о том, что грибные пигменты могут в неизмененном виде 3 включаться в стабильные фракции органического вещества почвы, известные как гуминовые кислоты и гумин. До настоящего времени остается дискуссионным вопрос о том, являются ли меланины прямыми предшественниками гуминовых кислот или выступают только как один из источников конденсированных структур в почве. Основной причиной, затрудняющей решение этого вопроса является чрезвычайная сложность и изменчивость состава и строения молекул меланиновых пигментов различных грибов [Лях, 1981].

Сама по себе близость химического состава и свойств грибных меланинов и почвенных гуминовых кислот еще не говорит о структурном сходстве молекул этих групп веществ и не позволяет однозначно оценить роль пигментов в формировании гумуса. Одним из путей решения этого вопроса может стать определение биохимической устойчивости гуминовых кислот и меланинов и исследование процесса их биодеградации.

Цель представленной работы - дать сравнительную характеристику гуминовых кислот и грибных меланинов по их химическим свойствам и устойчивости к биодеградации.

В задачи работы входило:

1. Получить сравнительную характеристику химических свойств меланиновых пигментов и гуминовых кислот из дерново-подзолистой почвы, чернозема, бурого угля и торфа.

2. Определить скорость минерализации почвенными микроорганизмами грибных меланинов и гуминовых кислот.

3. Изучить изменения в химическом составе и молекулярно-массовых распределениях меланинов и гуминовых кислот в процессе их деградации почвенными микроорганизмами. 4

4. Определить степень устойчивости меланинов и гуминовых кислот к биотическому и абиотическому разрушению.

Научная новизна работы. Впервые исследованы свойства гуминовых кислот из дерново-подзолистой почвы, чернозема, торфа и угля и меланинов из мицелия грибов Aspergillus niger и Cladosporium cladosporiodes. Показано, что грибные меланины отличаются от гуминовых кислот более высокой молекулярной массой, повышенным содержанием кислых функциональных групп и низкой степенью окисленности.

Определена скорость минерализации гуминовых кислот и меланинов в условиях модельного эксперимента. Установлено, что при биодеградации гуминовых кислот снижается степень их полидисперсности и увеличивается их растворимость в воде. Получено, что при биодеградации грибных меланинов происходит сближение их элементного состава, молекулярных масс и оптических свойств со свойствами гуминовых веществ.

Показано, что скорость ферментного гидролиза протеазой близка для выделенных из почв гуминовых кислот, и резко различается для исследованных меланинов.

Заключение Диссертация по теме "Биогеохимия", Завгородняя, Юлия Анатольевна

ВЫВОДЫ

1. Темноцветные пигменты, выделенные из мицелия 15 различных штаммов почвенных грибов, сильно варьируют по оптическим свойствам и молекулярным массам. Общим для всех проанализированных пигментов является преобладание в их составе фракций с молекулярной массой больше 12 ООО.

2. Препараты меланинов грибов Aspergillus niger и Cladosporium cladosporiodes близки к препаратам гуминовых кислот из дерново-подзолистой почвы, чернозема, торфа и угля по элементному составу, содержанию углеводных компонентов и кислотно-основным свойствам, но отличаются от изученных ГК оптической плотностью, более высокой молекулярной массой и повышенным содержанием кислых функциональных групп.

3. За три месяца в условиях модельного эксперимента в результате микробной деятельности было минерализовано (по углероду) 12,1% ГК дерново-подзолистой почвы, 8,2% ГК чернозема, 4,5% ГК торфа, 3,0% ГК угля. Скорость минерализации меланинов в тех же условиях была в 2 раза выше, чем у почвенных ГК; было минерализовано 22,2% меланина Aspergillus niger и 24,7% меланина Cladosporium cladosporiodes.

Cladosporium cladosporiodes происходит разрушение его высокомолекулярных фракций, сопровождающееся появлением дополнительного количества кислородсодержащих хромофорных группировок, что ведет к резкому увеличению оптической плотности пигмента.

Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю профессору кафедры химии почв МГУ д.б.н. Орлову Дмитрию Сергеевичу за постоянное внимание, проявленное к работе, и старшему научному сотруднику Института Почвоведения МГУ-РАН к.б.н. Демину Владимиру Владимировичу за помощь при проведении экспериментов и ценные научные консультации.

Автор благодарит доцента кафедры биологии почв МГУ к.б.н. Куракова Александра Васильевича за предоставленные культуры грибов и методическое руководство при постановке инкубационных экспериментов и старшего научного сотрудника Института Биохимии им. А.Н.Баха к.б.н. Телегину Таисию Александровну за помощь в проведении экспериментов по фотодеструкции.

Библиография Диссертация по геологии, кандидата биологических наук, Завгородняя, Юлия Анатольевна, Москва

1. Абу Эль-Нага С.А., Паников Н.С., Звягинцев Д.Г. Кинетический анализ кривых дыхания почв, обогащенных глюкозой//Вестн. МГУ. Сер. 17, почвоведение, 1983, №4, с.40-48

2. Александрова И.В. Взаимодействие структурных единиц и прочность их закрепления в молекулах гуминоподобных веществ // Почвоведение, 1993, №12, с.47-51

3. Александрова JI.H. Процессы гумусообразования в почве // Гумусовые вещества почвы. Записки ЛСХИ, 1970, т. 142, с.26-82

4. Александрова Л.Н. Органическое вещество почвы и процессы его трансформации. Л.: Наука, 1980, 288 с.

5. Александрова Л.Н., Люжин М.Ф. Влияние условий разложения на соотношение процессов минерализации и гумификации растительных остатков // Гумус и биологическая аккумуляция элементов в почве. Записки ЛСХИ, 1966, т. 105, с. 19-29

6. Аляутдинова Р.Х., Гагарин С.Г., Екатеринина Л.Н. Корреляция физиологической активности и физико-химических свойств гуминовых препаратов // Химия твердого топлива, 1991, №3, с. 16-21

7. Бамбалов H.H., Лукошко Е.С. Состав и свойства гуминовых кислот начального периода торфообразования//Химия твердого топлива, 1988, №5, с.3-7

8. Баталкин Г.А., Галушка А.М., Махно Л.Ю., Христева Л.А. О природе действующего начала физиологически активных гуминовых кислот // Тр. Межд. симп. IV и II комиссий МТО. Минск, 1982, с.115-119

9. БэйлиДж. Методы химии белков. М.: Мир, 1965, 284 с.

10. БриттонГ. Биохимия природных пигментов. М.: Мир, 1986,422 с.

11. Вильяме В.Р. Почвоведение. М., 1947

12. Вольнова А.И., Мирчинк Т.Г. Образование темноцветными грибами зеленого пигмента, сходного с фракцией Pg гуминовых кислот Р-типа // Почвоведение, 1972, №11, с. 140-145

13. Вольф Д.К., Легг Дж.О. Микробиология почвы // В кн.: Изотопы и радиация в сельском хозяйстве. Т.1. Почва-Растения-Влага. М.: Агропромиздат, 1989, с.120-15997

14. Горовая А.И., Орлов Д.С., Щербенко О.В. Гуминовые вещества. Киев.: Наукова думка, 1995, 304 с.

15. Григорьева К.В., Караваев Н.М. Влияние условий щелочной экстракции углей на состав гуминовых кислот//Доклады АН СССР, 1969, т. 188, №1, с. 160-169

16. ДетерманГ. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970

17. Драгунов С.С. Образование гуминовых кислот в различных природных условиях//В кн.: Генезис твердых горючих ископаемых. М., 1959, с.5-15

18. Блинов Н.П., Юрлова H.A. Меланиновый пигмент Auerobasidium (Pullularia) pullulans // Биол. науки, 1976, №7, с. 108-112

19. Жданова H.H. К экологии некоторых почвенных грибов//В кн.: Метаболиты почвенных микромицетов. Киев: Наукова думка, 1971, с.202-212

20. Жданова H.H., Василевская А.И. Экстремальная экология грибов в природе и эксперименте. Киев: Наукова думка, 1982,220 с.

21. Жданова H.H., Походенко В.Д., Гаврюшина А.И., Василевская А.И. Сочетание методов природной и экспериментальной экологии в изучении грибов сем. Dematiaceae //В кн.: Систематика, экология и физиология почвенных грибов. Киев: Наукова думка, 1975, с.83-86

22. Жмакова H.A., Наумова Г.В., Косоногова Л.В. Влияние окисления на физико-химические свойства гуминовых кислот торфа//В кн.: Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993, с.45-49

23. Запрометова K.M. О пигментах микроскопических темноокрашенных грибов // Вестник МГУ. Сер. биол., почвовед., 1971, №3, с.106-108

24. Запрометова K.M., Мирчинк Т.Г., Орлов Д.С., Юхнин A.A. Характеристика черных пигментов темноокрашенных почвенных грибов//Почвоведение, 1971, №7, с.22-30

25. Запрометова K.M., ЗеноваГ.М. К характеристике микрофлоры лесных подстилок и почв//В кн.: Закономерности развития почвенных микроорганизмов. Л., 1975, с.231-241

26. Запрометова K.M., Мирчинк Т.Г. Пигменты темноокрашенных грибов и их экологическая роль //В кн.: Микробные метаболиты. М.: МГУ, 1979, с. 193-209

27. Звягинцев Д.Г., Мирчинк Т.Г. О природе гуминовых кислот почв // Почвоведение, 1986, №5, с.68-75

28. Зенова Г.М., Лихачева A.A. О немеланоидных пигментах темноокрашенного пигментного комплекса хромогенных актиномицетов // Вестник МГУ. Сер. 17, почвоведение, 1980, № 1, с.60-6298

29. Иванникова Л.А. Применение абсорбционного метода для определения естественного потока С02 из почвы//Почвоведение, 1992, №6, с. 133-139

30. Измерение радиоактивности с помощью сцинтилляционных счетчиков. Техн. рук-во. Интертекник-Плезир, Франция

31. Ильин Н.П., Орлов Д.С. Фотохимическая деструкция гумусовых кислот // Почвоведение, 1973, №1, с.73-81

32. Кононова М.М. Органическое вещество почвы. М.: АН СССР, 1963, 314 с.

33. Кононова М.М. Проблема органического вещества почвы на современном этапе //В кн.: Органическое вещество целинных и освоенных почв. М.: Наука, 1972, с.7-29

34. Корнеева Г.А., Харченко C.B., Романкевич Е.А. Изучение ферментативного гидролиза казеина в морской воде //Изв. АН СССР. Сер. биол., 1990, №6, с.821-826

35. Корнеева Г.А., Романкевич Е.А. Активность гидролитических ферментов в морской экосистеме // В кн.: Биогеохимия пограничных зон Атлантического океана. М.: Наука, 1994,400 с.

36. Кузяков Я.В., Фокин А.Д., Князев Д.А. Участие нуклеиновых оснований и аминокислот в гумусообразовании // Известия ТСХА, 1989, вып.4, с.61-66

37. Кулеш Н.И., Красовская Н.П., Максимов О.Б. Генезис карбоксильных групп при гумификации лигнина // Почвоведение, 1983, №8, с.34-40

38. Кухаренко Т.А. Изменение структуры и свойств гуминовых кислот в углеобразовательном процессе //В кн.: Генезис твердых горючих ископаемых. М., 1959, с.319-337

39. Кухаренко Т.А., Екатеринина Л.Н. Сравнительное исследование растворимых и не растворимых в ацетоне фракций гуминовых кислот торфов, бурых и выветрившихся углей//Химия твердого топлива, 1968, №3, 12-18

40. Кухаренко Т.А., Екатеринина Л.Н. Биологическая активность и структура гуминовых кислот//Тр. Межд. симп. IV комиссии МТО. М., 1973, с.8-12

41. Кухаренко Т.А., Толчинская Р.Я., Чеснокова Т.В., Левина И.В. Особенности окисления бурых углей Канско-Ачинского бассейна в пласте // Химия твердого топлива, 1967, с.22-25

42. Л'Аннунциата М.Ф. Регистрация радионуклидов//В кн.: Изотопы и радиация в сельском хозяйстве. Т.1. Почва-Растения-Влага. М.: Агропромиздат, 1989, с. 160-24699

43. Лебедев К.К. О роли минеральных компонентов в формировании торфяных отложений//В кн.: Генезис твердых горючих ископаемых. М., 1959, с. 16-30

44. Лях С.П. Микробный меланиногенез и его функции. М.: Наука, 1981,275 с.

45. Лях С.П., Абызов С.С. Некоторые особенности микрофлоры Антарктики в связи со спецификой условий существования // Изв. АН СССР. Сер. биол., 1976, №2, с.252-262

46. Мажуль В.М., Прокопова Ж.В., Ивашкевич Л.С. Механизм действия гуминовых препаратов их торфа на структурное состояние мембран и функциональную активность дрожжевых клеток //В кн.: Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993, с. 151-157

47. Малама А.А. Физиологическая активность меланиновых пигментов // В кн.: Материалы к микробиологической конференции. Вильнюс, Литовское микробиол. о-во, 1972, с.40-41

48. Малама А.А., Буланов П.А., Данильчик Н.И., Храменко Г.Б., Гребенко В.В. Изучение меланинов микробного происхождения. П. Ступенчатая экстракция меланиновых пигментов // Вестник БГУ, серия П, 1970, №2, с.53-56

49. Малама А.А., Храменко Г.Б., Орлов Д.С., Юхнин А.А. Элементный состав и инфракрасные спектры меланиновых пигментов некоторых микроорганизмов // Известия АН СССР. Сер. биол., 1975, №5, с.766-768

50. Марфенина О.Е., Мирчинк Т.Г. Состав темноокрашенных грибов лесной подстилки и количество образуемого ими пигмента//Вестник МГУ. Сер. биол., почвовед., 1973, №5, с.86-89

51. Масько А.А., Галушко Н.А., Потоцкая Л.А. Гумус как иммобилизатор почвенных ферментов // Почвоведение, 1992, №1, с.76-79

52. Масюков А.В., Даныпина Л.М. Выявление и изучение гуминообразующих штаммов Aspergillus niger // Кубанский с-х ин-т. Труды, 1977, вып. 140, с.4-19

53. Менцель Р.Дж., Смит С.Дж. Плодородие почвы и питание растений //В кн.: Изотопы и радиация в сельском хозяйстве. Т.1. Почва-Растения-Влага. М.: Агропромиздат, 1989, с.26-60

54. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: МГУ, 1991, 304 с.

55. Мидгли Д., Торренс К. Потенциометрический анализ воды. М.: Мир, 1980, 512 с.

56. Милановский Е.Ю. Применение ионного детергента в гель-хроматографии гумусовых кислот почв//Почвоведение, 1984, №8, с. 142-146100

57. Милановский Е.Ю., Шеин Е.И., Степанов A.A. Лиофильно-лиофобные свойства органического вещества и структура почвы//Почвоведение, 1993, №6, с. 122-126

58. Мирчинк Т.Г. Почвенная микология. М.: МГУ, 1988, 220 с.

59. Мирчинк Т.Г., Степанова Л.Н., Демкина Т.С. Продуктивность грибной биомассы в лесных почвах Валдая//Вестник МГУ. Сер. биол., почвовед., 1976, №1, с.91-95

60. Мирчинк Т.Г., Демкина Т.С. Экология темноокрашенных грибов подстилки // Вестник МГУ. Сер. почвовед., 1977, №2, с.59-64

61. Мишустин E.H., Драгунов С.С., Пушкинская О.И. Роль микроорганизмов в синтезе перегнойных соединений почвы // Известия АН СССР. Сер. биол., 1956, №6, с. 83-94

62. Мишустин E.H., Никитин Д.И. Атакуемость гуминовых кислот почвенной микрофлорой // Микробиология, 1961, т.ЗО, вып.5, с.841-848

63. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука, 1971,404 с.

64. Мотовилова Л.В., Хренкова Г.М. Состав и свойства ГК, полученных при механодеструкции бурых углей //Химия твердого топлива, 1988, №2, с.36-41

65. Озерская С.М., Запрометова K.M., Мирчинк Т.Г. Характеристика состава комплексов микром и цехов лесных биогеоценозов Малинского стационара // Вестник МГУ. Сер. почвовед., 1977, №4, с.65-71

66. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв. М.: МГУ, 1974, 332 с.

67. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М.: МГУ, 1990, 325 с.

68. Орлов Д.С. Свойства и функции гуминовых веществ //В кн.: Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993, с. 16-27

69. Орлов Д.С., Гришина Л.А. Практикум по химии гумуса. М.: МГУ, 1981,272 с.

70. Орлов Д.С., Осипова H.H. Инфракрасные спектры почв и почвенных компонентов. М.: МГУ, 1988, 89 с.

71. Орлов Д.С., Кулаков В.В., Никифоров В.Ю., Аммосова Я.М., Бирюкова О.Н., Осипова H.H. Гуминовые препараты из высокозольных бурых углей Подмосковного бассейна //В кн.: Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993, с. 189-206

72. Орлов Д.С., Наумова Г.В., Аммосова Я.М., Лизунова А.Л., Осипова H.H. Сравнительная характеристика гуминовых препаратов опытно-промышленных производств//В кн.: Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993, с.207-218101

73. Орлов Д.С., Демин В.В., Завгородняя Ю.А. Влияние молекулярных параметров гуминовых кислот на их физиологическую активность // Доклады Академии наук, 1997, т.354, №6, с.843-845

74. Паников Н.С., Абу Эль-Нага С.А., Звягинцев Д.Г. Кинетика разложения глюкозы в почве // Почвоведение, 1982, №8, с.70-77

75. Паников Н.С., Садовникова Л.К., Фридланд Е.В. Неспецифические соединения почвенного гумуса. М.: МГУ, 1984, 144 с.

76. Плохинский Н.А. Алгоритмы биометрии. M.: МГУ, 1980,150 с.

77. Покуль Т.В., Парамонова Т.Г., Крюкова В.Н., Мицук Г.Е. Гуминовые вещества бурых углей Хандинского месторождения //В кн.: Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993, с.54-57

78. Практическая химия белка. М.: Мир, 1989, 623 с.

79. Стригуцкий В.П., Навоша Ю.Ю., Бамбалов Н.Н., Лиогонький Б.И. О природе парамагнетизма гумусовых веществ и перспективах применения метода ЭПР в почвоведении // Почвоведение, 1989, №7, с.41-51

80. ТэйтР.Ш. Органическое вещество почвы. М.: Мир, 1991,400 с.

81. Тэнфорд Ч. Физическая химия полимеров. М.: Химия, 1965, 772 с.

82. Фокин А.Д. Исследование процессов трансформации, взаимодействия и переноса органических веществ, железа и фосфора в подзолистой почве // Дисс. на соиск. уч. ст. докт. биол. наук. М., 1975

83. Фокин А.Д., Карпухин А.И. Включение продуктов разложения растительных остатков (меченных 14С) в гумусовые вещества//Почвоведение, 1974, №11, с. 72-78

84. Химическая энциклопедия. М.: Советская энциклопедия, 1990, т.2

85. Химическая энциклопедия. М.: Большая Российская энциклопедия, 1992, т.З

86. Христева Л.А. Роль гуминовой кислоты в питании растений и гуминовые удобрения // Труды Почв, ин-та им. В.В.Докучаева. М.: АН СССР, 1951, т.38, с. 108184

87. Христева Л.А. Стимулирующее влияние гуминовой кислоты на рост высших растений и природа этого явления // В кн.: Гуминовые удобрения: теория и практика их применения. Харьков: Харьк. ун-т, 1957, с. 75-94

88. Христева Л.А. О природе действия физиологически активных гумусовых веществ на растения в экстремальных условиях//В кн.: Гуминовые удобрения: теория и практика их применения. Днепропетровск: ДСХИ, 1973, т.4, с.3-14102

89. Шарков Й.Н. Исследование параметров раствора щелочи как абсорбента СО2 при определении дыхания почвы//Почвоведение, 1983, №1, с.132-138

90. Шарков И.Н. Определение интенсивности продуцирования С02 почвой абсорбционным методом // Почвоведение, 1984, №7, с. 136-143

91. Шарков И.Н. Сравнительная характеристика двух модификаций абсорбционного метода определения дыхания почвы//Почвоведение, 1987, №10, с. 153-157

92. Щербакова Т.А. Ферментативная активность почв и трансформация органического вещества (в естественных и искусственных фитоценозах). Минск: Наука и техника, 1983,222 с.

93. Alexander M. Natural selection and the ecology of microbial adaptation in a biosphere // Extreme environments. Mechanisms of microbial adaptation. New York: Acad. Press, 1976, p.3-25

94. Amato M., Ladd J.N. Formation and distribution of isotope-labelled biomass during decomposition of 14C and 15N labelled plant material // Soil Biol. Biochem., 1980, V.12, p.405-411

95. Barbetta M., Casnati G., Ricca A. Aspergilline // Rend. 1st. Lomb. Acad. Sci. Lett., 1967, V.A101, N 1, p.75-99

96. Boudot J.-P., Bel Hadi Brahim A., Steiman R., Seigle-Murandi F. Biodégradation of synthetic organo-metallic complexes of iron and aluminium with selected metal to carbon ratios // Soil. Biol. Biochem., 1989, V.21, N 7, p.961-966

97. Bull A.T. Chemical composition of wild-type and mutant Aspergillus nidulans cell walls. The nature of polysaccharide and melanin constituents // J. Gen. Microbiol., 1970, V.63, N 1, p.75-94

98. Butler J.H.A., Ladd J.N. Effect of extractant and molecular size on the optical and chemical properties of soil humic acids // Aust. J. Soil Res., 1969, V.7, p.229-239

99. Butler J.H.A., Ladd J.N. Importance of the molecular weight of humic and fulvic acids in determining their effects on protease activity // Soil Biol. Biochem., 1971, V.3, N 3, p.249-257

100. Cerri C.C., Jenkinson D.S. Formation of microbial biomass during the decomposition of 14C labelled ryegrass in soil // Journal of Soil Science, 1981, N 32, p. 619-626

101. Chen Y., Senesi N, Schnitzer M. Information provided on humic substances by E4/E6 ratios // Soil Sci. Am. J., 1977, Y.41, p.352-358103

102. Cheshire M.V., Mundie C.M., Shepherd H. Transformation of 14C glucose and starch in soil // Soil Biol. Biochem., 1969, V. 1, p.l 17-130

103. Davis H., Mott C.J.B. Titrations of fulvic acid fractions. I: Interactions influencing the dissociation / reprotonation equilibria//Journal of Soil Science, 1981, N 32, p.379-391

104. Dormaar J.F. Susceptibility of organic matter of chernozemic Ah horizons to biological decomposition//Can. J. Soil Sci., 1975, V.55, p.473-480

105. Ellis D. H., Griffiths D. A. The location and analysis of melanins in the cell walls of some soil fungi//Canadian Journal of Microbiology, 1974, N 20, p. 1379-1386

106. Ellis M.B. Dematiaceous hyphomycetes, England: C.M.I. Kew: Surrey, 1971

107. Filip Z., Semotan J., Kutilek M. Thermal and spectrophotometric analysis of some fungal melanins and soil humic compounds//Geoderma, 1976, N 15, p. 131-142

108. Filip Z., Alberts J.J. Adsorption and transformation of salt marsh related humic acids by quartz and clay minerals // The Science of the Total Environment, 1994, V.153, p. 141-150

109. Flaig W. Effects of microorganisms on the transformation of lignin to humic substances // Geochim. Cosmochim. Acta, 1964, V.28, p. 1523-1531

110. Flaig W. Generation of model chemical precursors//Humic Substances and their Role in the Environment. Chichester e.a., 1988, p.75-90

111. Flaig W., Reimer H. Contribution to the mechanism of the influence of substances from soil organic matter on plant growth // Trans. Int. Symp. Studies about Humus 'Humus et Planta V', Prague, 1971, p.519-526

112. Geis P.A., Wheeler M.H., Szaniszlo P.J. Pentaketide metabolites of melanin synthesis in the dematiaceous fungus Wangiella dermatitidis // Arch. Microbiol, 1984, N 137, p.324-328

113. Gonzalez-Vila F.J., Saiz-Jimenez C., Lentz H., Ludemann H.D. 13C Nuclear magnetic resonance spectra of fungal melanins//Ztschr. Naturforsch., 1978, C33, p. 291-293

114. Griffin D.M. Ecology of soil fungi. London: Chapman and Hall, 1972

115. Gulyas F., Szegi J. Comparative investigations on the pigment production of Aspergillus niger and Stachybotrys atra // Studies about Humus: International Symposium 'Humus et Planta VT, Prague, 1975, p. 181-186

116. Haider K.M., Martin J.P. Humic acid-type phenolic polymers from Aspergillus sydowi culture medium, Stachybotrys spp. cells and autoxidized phenol mixtures // Soil Biol. Biochem., 1970, V.2, N 3, p.145-156104

117. Haider K.M., Martin J.P. Mineralization of 14C-labeiled humic acids and of humic-acid bound 14C-xenobiotics by Phanerochaete chrysosporum // Soil. Biol. Biochem, 1988, V.20, N 4, p.425-429

118. Haworth R.D. The chemical nature of humic acid//Soil Science, 1971, V.Ill, Nl,p.71-79

119. Hedges J.I. Polimerization of humic substances in natural environments//Humic Substances and their Role in the Environment. Chichester e.a., 1988, p.45-58

120. Hignett R.A., Kirkham D.S. The role of extracellular melanoproteins of Venturia inaequalis in host susceptibility//J. Gen. Microbiol., 1967, V.48,N 2, p.207-210

121. Hinds A.A., Lowe L.E. Distribution of carbon, nitrogen, sulphur and phosporus in particle-size separates from gleysolic soils//Canadian Journal Soil Science, 1980, V. 60, p.783-786

122. Ito Y., Nanba H., Kumoda H. Melanin produced by Cohiolobus miyabeanus. I.The physical and chemical properties // J. Pharm. Soc. Jap., 1979, V.99, N 10, p. 1027-1036

123. Ivery D., Lange C.F., Merdinger E. Comparative study of Auerobasidium (Pullularia) pullulans and Rhodotorula glutinis pigments // Trans. III. State. Acad. Sci., 1975, V.68, N4, p.3 89-402

124. Kang K.S., Felbeck G.T. A comparison of the alkaline extract of tissues of Aspergillus niger with humic acids from three soils//Soil Science, 1965, N 99, p. 175181

125. Kiss S., Dragan-Bularda M., Pasca D. Activity and stability of enzyme molecules following their contact with clay mineral surfaces // Studia Univ. Babes-Bolyai. Biologia, 1986, V.31, N 2, p.3-29

126. Kumada K., Hurst H.M. Green humic acid and its possible origin as a fungal metabolite //Nature, 1967, V.214, N 5088, May 6, p.631-633

127. Kumada K., Sato O. Studies on the chemical properties of P-type humic acid // International Symposium 'Humus et Planta VI', Prague, 1967, p. 131-133

128. Ladd J.N., Butler J.H.A. Inhibition and stimulation of proteolytic enzyme activities by soil humic acids//Aust. J. Soil Res., 1969, V.7, N 3, p.253-261

129. Ladd J.N., Butler J.H.A. Humus-enzyme systems and synthetic organic polymerenzyme analogs // In: Soil Biochemistry. New York: Marcel Dekker, 1975, V.4, p. 143-194

130. L'Annunziata M.F. Radiotracers in agricultural chemistry. London: Acad. Press, 1979, 536 p.105

131. Linhares I.F., Martin J.P. Decomposition in soil of the humic acid-type polymers (melanins) of Eurotium echinulatum, Aspergillus glaucus sp. and other fungi // Soil. Sci. Soc. Am. J., 1978, V.42, p.738-743

132. Martin J.P., Richards S.J., Haider K. Properties and decomposition and binding action in soil of 'humic acid' synthesized by Epicoccum nigrum // Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 1967, V.31, p.657-662

133. Martin J.P., Haider K. Phenolic polymers of Stachybotrys atra, Stachybotiys chartarum and Epicoccum nigrum in relation to humic acid formation // Soil Science, 1969, N 107, p.260-270

134. Masini J.C. Evaluation of neglecting electrostatic interactions on the determination and characterisation of the ionizable sites in humic substances // Analytica Chimica Acta, 1993, V.283,p.803-810

135. Mason H.S. Structure of melanins // Pigment cell biology. New York: Acad. Press, 1959, p. 147-157

136. Mathur S.P. Characterization of soil humus through enzymatic degradation//Soil Science, 1971, V.11,N 3, p.147-157

137. Mato M.C., Olmedo M.G., Mendez J. Inhibition of indoleacetic acid-oxidase by soil humic acids fractionated on sephadex // Soil Biol. Biochem., 1972, V.4, p.469-473

138. McLaren A.D. The absorbtion and reactions of enzymes and proteins on kaolinite //J. Phys. Chem., 1954, V.58, p. 129-137

139. Meuzelaar H.L.C., Haider K., Nagar B.R., Marthin J.P. Comparative studies of pyrolysis-mass spectra of melanins, model phenolic polymers and humic acids // Geoderma, 1977, V.17, N 3, p.239-252

140. Nicolaus R.A. Melanins. Paris: Hermann, 1968, 310 p.

141. Paim S., Linhares L.F., Mangrich A.S., Martin J.P. Characterization of fungal melanins and soil humic acids by chemical analysis and infrared spectroscopy // Biology and Fertility of Soils, 1990, N 10, p. 72-76

142. Pridham J.B., Woodhead S. The biosynthesis of melanin in Alternaria // Phytochemistry, 1977, V.16, N 7, p.903-906

143. Reisinger O., Kilbertus G. Microorganismes intervenant dans la decomposition des cellules d'Auerobasidium pullulans (De Bary) Arnaud // Canad. J. Microbiol., 1974, V.20, N 3, p.299-306

144. Rice J.A., McCarthy P. Statistical evaluation of the elemental composition of humic substances // Org. Geochem., 1991, V.17, N 5, p.635-648106

145. Riffaldi R., Schnitzer M. Effects of diverse experimental conditions on ESR spectra of humic substances // Geoderma, 1972, V. 8, N 1, p. 1-10

146. Riffaldi R., Schnitzer M. Electron spin resonance spectrometry of humic substances // Soil. Sci. Soc. Amer. Proc., 1972, V.36, N 2, p.301-305

147. Rowley B.I., Pirt S.J. Melanin production by Aspergillus nidulans in batch and chemostat cultures // J. Gen. Microbiol., 1972, V.72, N 3, p.553-563

148. Saiz-Jimenez C., Martin F., Cert A. Low boiling-point compounds produced by pirolysis of fungal melanins and model phenolic polymers // Soil. Biol. Biochem., 1979, V.ll, N 3, p.305-309

149. Sankawa U., Shimada H., Sato T., Kinoshita T., Yamasaki K. Biosynthesis of scytalone // Tetrahedron Lett., 1977, N 5, p.483-486

150. Schnitzer M. Characterization of humic constituents by spectroscopy // Soil Biochemistry, 1971, V.2, p. 60-95

151. Schnitzer M. Humic substances: chemistry and reactions//In: Soil organic matter. Amsterdam: Elsevier, 1978, p. 1-64

152. Schnitzer M., Skinner S.I.M. Free radicals in soil humic compounds//Soil Science, 1969, V.108, N 6, p.383-390

153. Schnitzer M., Ortiz de Serra M.I., Ivarson K. The chemistry of fungal humic acidlike polymers and of soil humic acids // Soil Sci. Soc. Amer. Proc., 1973, V.37, N 2, p.229-236

154. Schnitzer M., Neyrod J.A. Further investigation on the chemistry of fungal humic acids // Soil Biol. Biochem, 1975, V.7, N 6, p.365-371

155. Senesi N., Sposito G., Martin J.P. Copper (II) and iron (III) complexation by humic acid-like polymers (melanins) from soil fungi // The Science of the Total Environment, 1987, V.62, p.241-252

156. Seto H., YoneharaH. Utilization of 13C-13C coupling in structural and biosynthetic studies. VIII. The cyclization pattern of a fungal metabolite, scytalone // Tetrahedron Lett., 1977, N5, p.487-488

157. Sowden F.J. Action of proteolytic enzymes on soil organic matter//Canad. J. Soil Sci., 1970, V.50, N 2, p.233-241

158. Steelink C., Tollin G. Free radicals in soil // Soil Biochemistry. New York: Marsel Dekker, 1967, p. 147-169

159. Stevenson F.J. Humus chemistry. Genesis, composition, reactions. New York: John Wiley and Sons, 1982107

160. Stipanovic R.D., Bell A.A. Pentaketide metabolites of Verticillium dahliae. 3. Identification of (-)-3,4-dihydro-3,8-dihydroxy-l(2H)-naphthalenone (-)-vermelone. as a precursor to melanin // J. Ogr. Chem., 1976, V.41, N 14, p.2468-2469

161. Stout J.D., Goh K.M., Rafter T.A. Chemistry and turnover of naturally occuring resistant organic compounds in soil//Soil Biochemistry, 1981, Y. 5, p. 1-73

162. Swifit R.S. Molecular weight, size, shape and charge characteristics of humic substances: some basic considerations // Humic substances II. In search of structure. New York: John Wiley and Sons, 1989, p.450-465

163. Takamatsu T., Yoshida T. Determination of stability constants of metal-humic acid complexes by potentiometric titration and ion-selective electrodes // Soil Science, 1978, V.125, N 6, p.377-386

164. TanK.H., SihanonthP., ToddR.L. Formation of humic acid like compounds by the ectomycorrizal fungus, Pisolithus tinctorius // Soil Sci. Soc. Am. J., 1978, V.42, p.906-908

165. TichyV. Biological activity of ultraviolet irradiated humic acids // Trans. Int. Symp. Studies about Humus'Humus et Planta V', Prague, 1971, p.553-556

166. Tokousbalides M.Ch., Sisler H.D. Effect of tricyclazole on growth and secondary metabolism in Pyricularia oryzae//Pestic. Biochem. Physiol., 1978, V.8, N l,p.26

167. Tokousbalides M.Ch., Sisler H.D. Site of inhibition by tricyclazole in the melanin biosynthetic pathway of Verticillium dahliae//Pestic. Biochem. Physiol., 1979, V.ll, N1, p. 64-73

168. ValmasedaM., Martinez A. T., Almendros G. Contribution by pigmented fungi to P-type humic acid formation in two forest soils // Soil Biology and Biochemistry, 1989, N 21, p.23-28

169. Webley D.M., Jones D. Biological transformation of microbial residues in soil //In: Soil Biochemistry. New York: Marcel Dekker, 1971, V.2, p.446-485

170. Wershaw R.L. A new model for humic materials and their interactions with hydrophobic organic chemicals in soil-water or sediment-water system // Journal of Contaminant Hydrology, 1986, N 1, p.29-45

171. Wheeler M.H., Tolmsoff W.J., Meola S. Ultrastructure of melanin formation in Verticillium dahliae with (+)-scytalone as a biosynthetic intermediate // Canad. J. Microbiol., 1976. V.22, N 5, p.702-711

172. Wheeler M.H., Stipanovic R.D. Melanin biosynthesis in Thielaviopsis basicola//Exp. Mycol., 1979, V.3, N 4, p.340-350108

173. White L.P. Melanin, a naturally occurring cation exchange material // Nature, 1958, V.182.N 1427, p.46-47

174. Wolf D.C., Martin J.P. Decomposition of fungal micelia and humic-type polymers containing 14carbon from ring and side-chain labeled 2,4-D and chlorpropham//Soil. Sci. Am. J., 1976, V.40, p.700-704

175. Zunino H, Borie F., Aguilera S., Martin J.P., Haider K. Decomposition of 14C-labelled glucose, plant and microbial products and phenols in volcanic ash-derived soils of Chile // Soil Biol. Biochem., 1982, V.14, p.37-43

Информация о работе

Завгородняя, Юлия Анатольевна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 04.00.03

Диссертация

Сравнительная характеристика гуминовых кислот и грибных меланинов - тема диссертации по геологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по геологии на тему Сравнительная характеристика гуминовых кислот и грибных меланинов ВАК РФ 04.00.03, Биогеохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика гуминовых кислот и грибных меланинов"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Завгородняя, Юлия Анатольевна

Введение Диссертация по геологии, на тему "Сравнительная характеристика гуминовых кислот и грибных меланинов"

Заключение Диссертация по теме "Биогеохимия", Завгородняя, Юлия Анатольевна

Библиография Диссертация по геологии, кандидата биологических наук, Завгородняя, Юлия Анатольевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по геологии на тему
Сравнительная характеристика гуминовых кислот и грибных меланинов
ВАК РФ 04.00.03, Биогеохимия