Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экологическая и биохимическая активность гиматомелановых кислот пелоидов

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Экологическая и биохимическая активность гиматомелановых кислот пелоидов"

На правах рукописи

Катунина Елена Евгеньевна

ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГИМАТОМЕЛАНОВЫХ КИСЛОТ ПЕЛОИДОВ

03 00 16 - экология 03 00 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Самара-2007

003173160

003173160

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский

университет»

Научные руководители

доктор биологических наук, профессор Аввакумова Надежда Петровна доктор биологических наук, профессор Шаталаев Иван Федорович

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Подковкин Владимир Георгиевич, профессор кафедры биохимии ГОУ ВПО «Самарский государственный университет»

доктор биологических наук, профессор Рябинин Вячеслав Евгеньевич, заведующий кафедрой общей и биоорганической химии ГОУ ВПО «Челябинская медицинская академия»

Ведущая организация

Институт экологии Волжского бассейна РАН

Защита состоится «_»_ 2007 года в _часов на заседании диссертационного совета К212 218 02 при ГОУ ВПО «Самарский государственный университет» по адресу 443011, Самара, ул Академика Павлова, 1, зал заседаний

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Самарского государственного университета

Автореферат разослан «_»_2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совета

Ведясова О А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Гумификация, как сложное биохимическое постмор-тальное изменение растительных и животных организмов, предохраняющее органические вещества от полной минерализации, является планетарным природным процессом Глобальными являются функции гуминовых веществ аккумулятивная, питательная, транспортная, физиологическая, протекторная Гумино-вые вещества (ГВ) присутствуют во всех природных средах планеты в воде, почве, горных породах, образуя жизненный фон человечества (Орлов ДС 1993, Кречетова ЕВ , 1995, Андреева ДБ, 2002, Гусева ТВ , 2002, Инишева Л И, 2006, Чемитдоржиева Г Д, 2007)

С ростом мирового производства увеличивается количество химических веществ, мигрирующих через атмосферу и гидросферу планеты, а в связи с этим все большее значение приобретает протекторная биосферная функция гуминовых веществ, которые практически необратимо поглощают многие из токсикантов антропогенного происхождения, детоксицируя почвы (Перминова И , 2000), растения (Спринчак Д В , Бокова Т И, 2002) и животные организмы (Бо-кова Т И, Грачева О Г , 2000) В настоящее время доказано участие гуминовых веществ в детоксикации пестицидов, тяжелых металлов, радионуклидов (Вар-шал Г М , 1990, Анисимова М А , 1997, Дударчик В М, 2002)

В последнее время исследователей различных областей наук все больше привлекают ГВ, в связи с тем, что они, являясь природными соединениями, обладают широким биологическим спектром действия Препараты гуминовых веществ используют в медицинской практике для лечения опорно-двигательной системы, воспалительных процессов различной природы, при стоматологических заболеваниях, в андрологии и т д (Гордиенко В Г, 1998, Аввакумова Н П , 2002, Баранцева Л Н, 2002, Антонюк Н В , 2005) Доказано, что специфические органические вещества являются стимуляторами роста растений, помогая усваивать необходимые минеральные элементы из почвы, в животноводстве они используются как биодобавки (Жилякова Т П, 2006), в промышленности для очистки сточных вод (Шаталаев И Ф и др 2002)

Гуминовые вещества пелоидов являются менее изученными из всех природных объектов, несмотря на все большее применение грязей с лечебной, профилактической, реабилитационной целями В составе низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, по мнению многих исследователей (Золотарева Т А 1988, Агапов А И , 1999) гуминовые вещества являются основным лечебным фактором, но механизм их действия изучен недостаточно Новая информация о возможностях гуминовых веществ позволит использовать уникальные биологически активные соединения лечебных грязей как источник лекарственных средств природного происхождения

Наиболее изученными группами гуминовых веществ являются гуминовые кислоты и фульвокислоты (Кухаренко ТА, 1960, Лодыгин ЕД, 2001) Гима-томелановые кислоты как один из важных компонентов гуминовых веществ изучены недостаточно, упоминания о них встречаются в единичных научных работах (Глебова Г И , 1980), несмотря на истечение почти двухсот лет со вре-

мени выделения (Гоппе-Зейлер, 1889 г) В отечественной и зарубежной литературе практически отсутствуют работы по изучению биологической активности гиматомелановых кислот пелоидов, что подтверждает необходимость их исследования В этой связи актуальным является не только изучение роли гиматомелановых кислот в протекторных свойствах гуминовых веществ, но и изучение биологической активности с целью получения и применения стандартизованного пелоидопрепарата

Цель исследования Изучить структурно-функциональные свойства, протекторное действие и биологическую активность гиматомелановых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей

Задачи исследования:

1 Выделить гиматомелановые кислоты из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей различных источников, провести их идентификацию по физико-химическим параметрам

2 Разработать методы качественного и количественного анализа гиматомелановых кислот пелоидов с целью стандартизации биологически активной субстанции

3 Исследовать структурно-функциональные свойства гиматомелановых кислот пелоидов с использованием хроматографических, титриметрических методов, капиллярного микроэлектрофореза, ИК-спектра, 'Н-ЯМР - спектра, ЭПР, адсорбции воды на гиматомелановых кислотах

4 Определить токсичность гиматомелановых кислот пелоидов при введении в организм

5 Охарактеризовать протекторные свойства гиматомелановых кислот пелоидов от воздействия тяжелых металлов in vitro и m vivo

6 Определить оптимальную дозу гиматомелановых кислот пелоидов при использовании их в качестве противовоспалительного средства

7 Охарактеризовать биологическую активность гиматомелановых кислот пелоидов по влиянию на воспалительные процессы различного генеза

Научная новизна. Изучены структурно-функциональные свойства гиматомелановых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей элементный состав, термодинамическая устойчивость, кислотно-основные и окислительно-восстановительные свойства

Впервые установлены молекулярные массы фракций гиматомелановых кислот пелоидов, соотношение гидрофильных и гидрофобных структурных фрагментов компонентов, адсорбционные свойства Получены новые сведения о структурной организации гиматомелановых кислот пелоидов методами ИК-спектроскопии, ЭПР, 'Н-ЯМР, капиллярного зонного электрофореза

Впервые методом ЯМР с ИГМП изучен процесс самодиффузии в водных растворах гиматомелановых кислот пелоидов, детализированы парамагнитные центры гиматомелановых кислот пелоидов

Впервые изучено взаимодействие гиматомелановых кислот пелоидов с ионами металлов, выявлены протекторные свойства в условиях химического

стресса, что доказывает участие гиматомелановых кислот в сохранении природного экологического равновесия

Охарактеризована токсичность гиматомелановых кислот пелоидов, установлена их принадлежность к IV классу токсичности Впервые установлена полимодальная зависимость противовоспалительного действия гиматомелановых кислот пелоидов

Выявлена противовоспалительная, иммунокоррегирующая и антиокси-дантная активность гиматомелановых кислот пелоидов

Получен блок новых данных о позитивном влиянии гиматомелановых кислот пелоидов на динамику воспалительного процесса в эксперименте

Практическая значимость. Важное значение имеют данные, характеризующие структурные фрагменты гиматомелановых кислот пелоидов, полидисперсность, полифункциональность Биогеохимическая постмортальная трансформация органических веществ исключает возможность наступления экологических катаклизмов за счет утилизации останков животного и растительного происхождения Образующиеся вещества служат энергопластическим материалом для микробных и растительных организмов и важную роль в этих процессах играют гиматомелановые кислоты, как наиболее восстановленная составляющая гуминовых веществ Связывая ионы тяжелых металлов гиматомелановые кислоты пелоидов способствуют сохранению экологического равновесия

Совокупность полученных сведений о составе, строении, физико-химических и биологических свойствах гиматомелановых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей является фундаментальной основой дальнейших исследований по использованию в медицинской практике как основы для антиоксидантных, противовоспалительных, иммуномодулирующих средств

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе

- кафедры общей, бионеорганической и биоорганической химии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» (акт внедрения от 25 09 2007 г ),

- кафедры химии фармацевтического факультета ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» (акт внедрения от 25 09 2007 г ),

Положения, выносимые на защиту:

1 Обоснование принадлежности гиматомелановых кислот пелоидов к классу гуминовых веществ биосферных объектов по общепринятым идентификационным критериям элементному составу, ИК-спектру, коэффициенту цветности

2 Обоснование предлагаемого качественного и количественного анализа как метода стандартизации биологически активной субстанции гиматомелановых кислот пелоидов

3 Результаты изучения структурно-функциональной организации гиматомелановых кислот пелоидов химическими и физико-химическими методами термодинамические функции, полидисперсность, амфифильность, полифунк-

циональность, кислотно-основные свойства, адсорбционная способность и способность к диффузии гиматомелановых кислот пелоидов

4 Совокупность информации об экопротекторных свойствах гиматомелановых кислот пелоидов при действии ионами тяжелых металлов

5 Обоснование биологической активности гиматомелановых кислот пелоидов по результатам влияния на воспалительные процессы различного гене-за

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на VIII Всероссийском конгрессе «Актуальные проблемы экологии человека» (г Самара, 2002), II, V, VI научно-практических конференциях «Медицинская экология» (г Пенза, 2003, 2006, 2007), Международном экологическом форуме «Сохраним планету Земля» (г Санкт-Петербург, 2004), V конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г Томск, 2004), V научной конференции молодых ученых «Региональная медицинская наука тенденции и перспективы развития» (г Самара, 2004), V общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов «Морфологические ведомости» (г Казань, 2004), X всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (г Самара, 2005), V научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (г Астрахань, 2006), VI Всероссийском съезде физиотерапевтов (г Санкт-Петербург, 2006), Межвузовской конференции молодых ученых «Аспирантские чтения 2006» (г Самара, 2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, главы, посвященной материалам и методам исследования, 4 экспериментальных глав, выводов, списка литературы Библиографический указатель включает 227 источников, в том числе 45 на иностранном языке Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц, 39 рисунков

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечены новизна и практическая значимость полученных результатов, изложены положения, выносимые на защиту

В первой главе приводится анализ литературных данных о структурной организации и групповом составе гуминовых веществ, биосферных функциях и исследованиях их биологической активности, в том числе связывающих и де-токсицирующих свойствах по отношению к различным классам экотоксикан-тов На основе литературного обзора сформулирован ряд нерешенных проблем анализа, строения и прогноза свойств гиматомелановых кислот пелоидов

Вторая глава посвящена описанию методики выделения гиматомелановых кислот из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, приводится описание методов определения структурной организации, протекторных свойств и биологической активности гиматомелановых кислот пелоидов

Третья глава посвящена идентификации гиматомелановых кислот пелои-дов по совокупности физико-химических критериев, предложены методики качественного и количественного анализа

В четвертой главе изложены результаты исследования физико-химических свойств гиматомелановых кислот с помощью методов хроматогра-фического анализа, 'Н-ЯМР, ЭПР, кислотно-основного титрования

Пятая глава посвящена исследованию связывающих и детоксицирующих свойств гиматомелановых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей по отношению к тяжелым металлам

В шестой главе приводятся результаты исследования биологической активности гиматомелановых кислот пелоидов на моделях воспаления разного генеза

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования пелоиды санатория «Сергиевские минеральные воды», препараты гиматомелановых кислот озер, находящихся на территории Самарской области (9 образцов), ветвистоусые рачки Daphnia magna, беспородные белые крысы массой 180-200 г , содержащиеся в стандартных условиях вивария (80 животных), ткань регионарных лимфатических узлов и селезенки крыс

Определение углерода, водорода, азота, кислорода в гиматомелановых кислотах проводили на анализаторе фирмы «Карло Эрба» модели 1106 По результатам элементного анализа рассчитывали степень окисленности и бензоид-ности, термодинамические характеристики

ИК-спектр гиматомелановых кислот был получен на спектрофотометре Specord-IPR методом KBr-техники Спектр регистрировали в диапазоне 4200400 см"1 с использованием дифракционной решетки

Спектры поглощения растворов гиматомелановых кислот определяли на фотоколориметре КФК-3 в диапазоне 310-800 нм

Молекулярно-массовое распределение гиматомелановых кислот осуществлялось методом гель-фильтрации на «Спектроме-203» (X = 280 нм), используя 0,05 М фосфатный буфер рН=8,2 с 0,1% раствором додецилсульфата натрия, чувствительность 0,1%, скорость элюирования- 10 см3/час, скорость самописца -0,5 мм/мин

Амфифильное фракционирование проводили на гидрофобизированном геле агарозы (Octyl Sepharosa CL-4B, Pharmacia) Для регистрации оптической плотности элюата (280 нм) использовали оптический блок хроматографа «МИ-ЛИХРОМ-1» Скорость фильтрации составляла 50 мл/час

Характер распределения заряженных фрагментов пелоидопрепаратов определяли методом капиллярного зонного электрофореза, который проводили на системе капиллярного электрофореза «Капель 103Р»

Эксперименты по измерению коэффициентов самодиффузии молекул в растворах гиматомелановых кислот с помощью ядерно-магнитного резонанса с импульсным градиентом магнитного поля выполнялись в институте физиче-

ской химии РАН на ЯМР-спектрометре, разработанном на кафедре молекулярной физики Казанского университета

Содержание функциональных групп кислотного характера в гиматомела-новых кислотах определяли потенциометрически Значения констант ионизации для кислых групп в пределах выделенных интервалов находили графически, построив зависимость рН от lg а/(1 - а) на основании уравнения Гендерсо-на-Хассельбаха

Изотермы адсорбции паров воды определяли в вакуумной адсорбционной установке с кварцевыми пружинными весами Давление паров воды задавалось давлением насыщенного пара над водой в ампуле, помещенной в ультра-криостат типа МК-70 (ГДР) Относительно высокие давления паров воды в системе (от 1 мм рт ст и выше) контролировали U-образным манометром с помощью катетометра КМ-8

Спектры 'Н-ЯМР гиматомелановых кислот пелоидов на ЯМР спектрометре Bruker АС-400, с рабочей частотой 400 МГц для ядра 'Н Ширина развертки спектра составляла около 10000 Гц (от 0 до 12 м д) В качестве внутреннего стандарта использовали сигнал остаточных протонов гексаметилдисилоксан, а растворителем служил диметилсульфоксид- d6 (ДМСО-<16) производства фирмы «Изотоп»

Спектры ЭПР образцов гиматомелановых кислот получены на спектрометре ВИГТ 421400 012 (производитель - КБ «Физэлектронприбор», г Самара) с рабочей частотой 9,3 ГГц Спектры сняты в диапазоне полей 3100-3800Гс при мощности СВЧ сигнала 100мВт и амплитуде ВЧ модуляции магнитного поля -0,5Гс Определение количества парамагнитных центров в исследуемых веществах производилось путем сравнения с эталонной мерой на основе дифенил-пикрилгидразила (ДФПГ)

Коагулирующую способность ионов металлов по отношению к гиматоме-лановым кислотам определяли прибавлением к 0,1%-ным растворам пелоидо-препарата различных количеств солей, содержащих ионы металлов, отнесенных к жестким (Mg2+, Ва2+, Са2+, Мп2+), мягким (Ag+, Ni2+, Со2+, Pb2+), средним (Zn2+, Cu2+) кислотам Льюиса Время экспозиции составляло до 48 часов Оптическую плотность растворов регистрировали фотоэлетроколориметрически на ФЭК-56 М после центрифугирования при 3000 об/мин в течение 2 минут

Экопротекторное действие гиматомелановых кислот исследовали на биологических тест-объектах, в качестве которых были выбраны ветвистоусые рачки Daphnia magna

Определение LD50 проводили на белых беспородных крысах, массой 180200 г, содержащихся в питомнике Рапполова на стандартном рационе и в стандартных условиях вивария Контрольной группе перорально вводили взвесь препарата в 1%-ном крахмальном клейстере и наблюдали в течение двенадцати дней Экспериментальной группе внутримышечно вводили 1%-ный раствор гиматомелановых кислот Наблюдения проводили в течение 12 дней

Острое воспаление вызывали путем однократного введения крысам 0,2см3 1% раствора каррагенина, которому предшествовала инъекция 0,2см3 растворов

гиматомелановых кислот пелоидов или физиологического раствора в том же объеме Наблюдали изменение объема лапки через 1, 2, 3, 24, 48 и 72 часа Оценивали изменение содержания общего пула лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов в крови, определяли концентрацию гемоглобина, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), количество нейтрофильных гранулоцитов (в том числе па-лочкоядерных и сегментоядерных), лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и ба-зофилов Для более детального изучения влияния препарата на макрофагально-фагоцитарную и иммунную системы определяли уровень с-реактивного белка (СРВ) и циркулирующих иммунных комплексов, содержание фибронектина, а также провоспалительных цитокинов (интерлейкин 1-ß и фактор некроза опухоли -а) в сыворотке крови, оценивали уровень спонтанной и стимулированной люминол-зависимой хемилюминесценции лейкоцитов

Хроническое иммунное воспаление моделировали у крыс субплантарным введением в правую заднюю лапу 0,1 мл адъюванта Фрейнда (взвесь БЦЖ 2,5 мг/мл в вазелиновом масле) Лечение начинали с 14-го дня после инъекции адъюванта Пелоидопрепарат объемом 0,1 мл в виде 0,1% водного раствора (рН=7,4) вводили ежедневно, контрольной группе вводили такое же количество физиологического раствора Воспалительная реакция оценивалась на 3, 7, 12 сутки после начала лечения (Newbould В В , 1963) по результатам гистологических, морфометрических исследований, а также состояния про-и антоксидант-ных систем

Морфологическое наблюдение осуществляли на автоматизированной аналитической системе, включающей микроскоп «Olympus СХ 21 FS 1», цифровую фотокамеру «Olympus» С - 4000 ZOOM и системный блок на базе процессора Intel Pentium 4 с использованием программы «Видео-тест-морфо»

Диеновую конъюгацию ненасыщенных высших жирных кислот и содержание малонового диальдегида определяли в сыворотке крови экспериментальных животных спектрофотометрически при длине волны 233 нм и 532 нм соответственно (Стальная И Д , 1977)

Активность каталазы в нмоль/мл*мин определялась в сыворотке крови с использованием 4,0% раствора молибдата аммония и спектрофотометрирова-нием на СФ-26 при 410 нм (Королюк С Н , 1988)

Активность супероксиддисмутазы определяли в сыворотке крови крыс спектрофотометрически на СФ-26 с 0,1% официнальным раствором адреналина Активность рассчитывали в условных единицах на миллилитр сыворотки За единицу активности принимали количество фермента, которое в указанных условиях ингибирует реакцию окисления адреналина на 50% (Гуревич В С с соавт, 1990)

Статистическая обработка результатов производились с использованием персонального компьютера на базе процессора Intel Pentium 4 и программ MS Excel ХР, S-Plus 2000 и Statistica 5 5

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификационными признаками гиматомелановых кислот являются элементный состав и показатели, рассчитанные на его основе, характер ИК-спектра, значения оптической плотности раствора

Результаты исследования элементного состава полученной субстанции свидетельствует об их принадлежности к гиматомелановым кислотам Изменения в элементном составе по сезонам года выражены слабо, для всех элементов сезонные колебания не выходят за пределы 10%, что позволяет использовать для исследования летние образцы гиматомелановых кислот (табл 1)

Таблица 1 - Средний элементный состав гиматомелановых кислот грязи озера Молочка в зависимости от сезона года (%%)

Определяемый показатель Весна Лето Осень

Углерод Масс 52,19±1,20 59,60+1,30 56,59+1,40

Мольн 32,41+0,60 36,33+0,95 34,71+1,10

Водород Масс 6,4б±0,20 6,58±0,35 6,55±0,40

Мольн. 48,14±0,90 48,10+1,20 48,16+1,50

Кислород Масс 38,08+1,20 31,5б±1,20 34,07±1,40

Мольн. 17,73±0,49 14,40±0,80 15,66±1,00

Азот Масс. 3,27±0,06 2,26+0,04 2,79+0,04

Мольн. 1,71 ±0,03 1,17+0,03 1,47±0,02

Н/С 1,48 1,31 1,39

О/С 0,55 0,40 0,45

Окисленность -0,39 -0,53 -0,49

Элементарная формула С19Н2!Ш,0 С31Н41Ш12 СмИззЛО,,

В ИК-спектрах поглощения гиматомелановых кислот пелоидов присутствуют все полосы поглощения, характерные для этой группы гуминовых веществ (рис 1)

сь о с, «о

•о ¡Г> о? °о £ —<

4000 3000 2000 1600 1200 800 см'

Рисунок 1 - Инфракрасный спектр гиматомелановых кислот пелоидов

В качестве метода идентификации гиматомелановых кислот предлагается спектрофотометрический анализ препаратов в диапазоне 310 - 600 нм, при этом выявляются два максимума поглощения - при длинах волн 350 и 380 нм (рис 2) Количественное определение гиматомелановых кислот пелоидов проводится по калибровочному графику при 380 нм

Рисунок 2 - Результаты фотометрирования 0,01% растворов гиматомелановых кислот при рН = 7,4

Разработанная методика качественного и количественного анализа гиматомелановых кислот позволит стандартизировать биологически активную субстанцию

Молекулярно-массовое распределение гиматомелановых кислот свидетельствует об их гетерогенности В их группе выделено три фракции, различающиеся по величине молекулярной массы (табл 2)

Таблица 2 - Молекулярно-массовое распределение гиматомелановых кн-слот пелоидов_

Номер фракции Молекулярная масса, а е.м. Содержание фракции %% Среднее значение М.м., а.е.м.

I 74480 8,70 27029,04

II 30200 41,84

III 16000 49,46

По экспериментальным данным в препаратах гиматомелановых кислот выявлено шесть пиков по выраженности гидрофильно-гидрофобных компонентов Из шести выделенных амфифильной хроматографией фракций две относятся к гидрофильным, четыре - к гидрофобным, однако представленность фракций 3, 5, 6 невелика и в итоге содержание гидрофобных фрагментов составляет 53,3%, а содержание гидрофильных - 46,7% (рис 3)

Различающиеся по амфифильным свойствам фракции гиматомелановых кислот выполняют в биосфере различную функциональную нагрузку Гидро-

фильные компоненты обусловливают миграцию органических и минеральных веществ в биосубстратах, в то время как малоподвижные гидрофобные компоненты гиматомелановых кислот способны существенно влиять на разнообраз-

Рисунок 3 - Фракционный состав гиматомелановых кислот пелоидов по данным гидрофобной хроматографии

Являясь полиэлектролитами, гиматомелановые кислоты несут большой рН-зависимый отрицательный заряд, обусловленный различными ионизированными группами На кривых обратного титрования препарата выделяются 2 точки эквивалентности рН, 8,2-8,8 и рНг 5,2 - 5,5 (рис 4а) На кривой прямого титрования для гиматомелановых кислот выделяется только одна точка эквивалентности при значениях рН 6,0-6,5 (рис 46)

V HCl, мл

(а)

Рисунок 4 - Кривые обратного (а) и прямого (б) потенциометрического титрования гиматомелановых кислот пелоидов

Анализ 'Н-ЯМР-спектра свидетельствует о сложной структуре и наличии разнообразных функциональных групп (рис 5) Обнаружены протоны алифатических структур, а-углеродных атомов при двойной связи, карбогидратов, спиртов, эфиров, альдегидных групп, атомы водорода ароматических структур, ассоциированные протоны гидроксильных, фенольных, карбоксильных групп

Характер ЭПР-спектра, представляющего собой одиночную линию с узкими синглетными симметричными линиями, свидетельствует о наличии в молекулах гиматомелановых кислот структур с системой сопряженных связей

7 Т

Рисунок 5 - 'Н-ЯМР спектр гиматомелановых кислот

По результатам компьютерной обработки определено количество парамагнитных центров в препарате гиматомелановых кислот, которое составляет 4,14 1017 спин на 1 г образца

Протекторная функция гиматомелановых кислот в значительной степени определяется их адсорбционной способностью, которая исследовалась нами по характеру изотермы адсорбции воды Получены изотермы адсорбции паров воды при температурах 22°С и 100°С на образцах гиматомелановых кислот откачанных при температурах опыта (рис 6) а, ммоль/г 121 0-

6 1 4

2 Н

* ж- - * ■ ■

0,0

0,2

0,4

0,6

0, £

1,0

Рисунок 6 - Изотермы адсорбции паров воды на образцах гиматомелановых кислот

Одной из важнейших экологических задач является установление протекторного действия гиматомелановых кислот по отношению к экотоксикантам, среди которых приоритетными являются тяжелые металлы Гиматомелановые кислоты активно соединяются с ионами тяжелых металлов и выводят их из рас-

твора в твердую фазу Анализ связывающей способности гиматомелановых кислот свидетельствует о большом разбросе данного показателя для различных металлов (табл 3) Если коагулирующую способность иона свинца принять за 100%, то для магния она составит всего 3,75%, для марганца - 14,95% Коагулирующая способность ионов серебра составляет всего 2,43% от аналогичного показателя свинца Коагулирующая способность ионов хрома (III) составила 74,77% Этот факт свидетельствует о прямой зависимости коагулирующей способности от величины заряда иона, которая, однако, не подчиняется правилу Дерягина Взаимодействие ионов металлов с гиматомелановыми кислотами носит сложный характер, в основе которого лежат процессы соле- и комплексооб-разования

Таблица 3 - Коагулирующая способность гиматомелановых кислот _ионами различных металлов*_

Характер иона С (иона) Ммоль-экв./г С (иона) Ммоль/г 1/С С (иона) Мг/г Оптическая плотность р-ра

АК+ 7,50 7,50 0,13 810,00 0,020

Си 0,75 0,375 2,67 24,00 0,025

n.2+ 2,00 1,00 1,00 59,00 0,065

Mg2+ 10,00 5,00 0,20 120,00 0,350

Со2+ 2,00 1,00 1,00 59,00 0,045

Мп2+ 2,50 1,25 0,80 68,75 0,065

РЬ2+ 0,375 0,187 5,35 38,71 0,050

Znz+ 4,00 2,00 0,50 130,00 0,100

Cai+ 2,50 1,25 0,80 50,00 0,065

ва1+ 1,25 0,625 1,60 85,63 0,035

CrJ+ 0,75 0,25 4,00 13,00 0,025

*В таблице приведены средние значения статистически обработанных результатов

Протекторные свойства гиматомелановых кислот т vivo определяли по изменению выживаемости дафний в растворах солей тяжелых металлов Установлено, что присутствие пелоидопрепарата в растворах солей металлов увеличивает время жизни дафний в 2-5 раз в зависимости от вводимого металла (рис 7)

На модели каррагенинового воспаления выявлена полимодальная противовоспалительная активность гиматомелановых кислот и установлена терапевтическая доза

Выраженность воспалительной реакции при введении каррагенина сопровождалась значительным изменением функциональной активности моноцитар-но-макрофагальной системы (табл 4)

Так, в фагоцитах значительно возрастал уровень миелопероксидазы данный фермент, определяющий бактерицидную активность клеток, выявлялся в 54,5±2,4% фагоцитов Более чем в 4 раза (до 0,520±0,033 мВ/с) увеличивался

Си l'l> Zn Cd Ag

Рисунок 7 - Результаты биотестирования с использованием Daphnia magna

уровень спонтанной хемилюминесценции фагоцитов, интенсивность которой характеризует исходный уровень окислительного метаболизма клеток. При этом способность лейкоцитов к усилению процессов генерации активных форм кислорода под действием опсонизированного зимозана возрастала незначительно, вследствие чего индекс стимуляции хемилюминесценции был снижен по сравнению с контрольными значениями, составляя в среднем 1,1±0,01.

С точки зрения изучения влияния гиматомелановых кислот на динамику хронического воспалительного процесса в модели адъювантного артрита, наблюдали за изменениями, протекающими в периферических органах иммуногенеза (лимфатических узлах, печени, селезенке), а также в про- и антиоксидант-ных системах организма. Анализ гистологических препаратов лимфатических узлов, печени и селезенки показал патологические изменения при моделировании адъювантного артрита. Применение гиматомелановых кислот в значительной степени снимает выраженность воспалительного процесса в исследуемых органах. Деятельность антиоксидантных ферментов контролировалась по активности супероксиддисмутазы и каталазы, а функции прооксидантных систем оценивали по выраженности диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот и концентрации малонового диальдегида в крови. При ежедневном введении физиологического раствора экспериментальным животным контрольной группы не наблюдалось значительных изменений в показателях антиоксидантных систем, в то время как прооксидантные процессы протекали более интенсивно. Диеновая конъюгация ненасыщенных высших жирных кислот возрастала с 0,54 моль/л до 0,66 моль/л, концентрация малонового диальдегида изменяется незначительно - с 42,29 нмоль до 43,86 нмоль или до 45,49 нмоль по значению медианы.

При адъювантном артрите (группа сравнения) наблюдается уменьшение активности супероксиддисмутазы, концентрации малонового диальдегида и нарастание диеновой конъюгации по срокам наблюдения (табл. 5).

Таблица 4 - Влияние пелоидопрепаратов на показатели периферической крови при каррагениновом отеке

Показатели Контроль Гиматомелановые кислоты Норма

Лейкоциты, кл х109/л 20,5±0,6* *12,3±1,6** 8,1 ±0,7

Эритроциты, кл хЮ'/л 4,5±0,1* 5,1±0,3 5,2±0,2

Тромбоциты, кл х109/л 438,6±24,5 428±19,6 415,5±30,6

Гемоглобин,г/л 102,4±8,6 101,3±6,9 112,3±5,8

СОЭ, мм/час 10,9±0,1* *6,8±0,6** 2,5±0,2

СРБ +4+ Ч'+ отр

Лимфоциты,% 54,4±4,8 65,\±6,6 68,4±5,9

Нейтрофилы,% 42,5±2,3 32,7±1,9** 31,5±2,9

- палочкоядерные 8,5±0,1* *4,8±0,4** 3,2±0,3

- сегментоядерные 35,8±2,7* 26,9±1,7** 25,8±2,2

Моноциты,% 2,2±0,1* 1,7±0,1** 1,8±0,09

Эозинофилы,% 1,9±0,2 2,0±0,2* 1,5±0,12

Базофилы,% 0,26±0,02 0,28±0,03 0,24±0,02

Миелопероксидаза,% 54,5±1,4* 56,6±3,3* 44,5±3,8

Хемилюминесценция лейкоцитов.

- спонтанная, тВ/с 0,520±0,03* *0,210±0,02** 0,125±0,01

- стимулированная, тВ/с 0,535±0,02* 0,385±0,01*+ 0,418±0,04

Индекс стимуляции 1,1±0,01* *1,8±0,1** 2,4±0,2

ИЛ-1р, икг/мл 43,3±2,0* *32,0±1,5** 22,5±1,6

ФНО-а, пкг/мл 40,7±2,4 *33,7±1,6** 34,8±2,0

Фибронектнн, мкг/мл 231,9±22,2 221,6±13,7 241,4±18,8

* - статистически значимые отличия показателей от нормативных (Р<0,05) ** - статистически значимые отличия показателей от контрольных (Р<0,05)

Под влиянием гиматомелановых кислот активность каталазы и суперок-сиддисмутазы снижается по срокам наблюдения, что позволяет говорить о включении пелоидопрепарата в биохимические реакции в качестве восстановителя (табл 6)

В модели адъювантного артрита ярко выражено преобладание проокси-дантных свойств по сравнению с системами антиоксидантной защиты Гимато-мелановые кислоты, наоборот, практически не изменяют активность суперок-сидцисмутазы, но снижают активность каталазы

Полученные результаты свидетельствуют о сложном полимодальном воздействии гиматомелановых кислот на различные стадии воспалительного процесса и способствуют нормализации баланса про- и анти-оксидантных систем организма

Таблица 5 - Изменение про- и антиоксидантных показателей крови __в модели адъюваитиого артрита_

Фермент Показатель 3 сут 7 сут 12 сут

Каталаза нмоль/л •мин М±ш 132,63 ± 3,05 126,32 ±5,50 133,28 ±2,94

Медиана 136,51 129,23 137,07

QrCb 130,30- 139,05 125,06 - 140,08 124,07 - 140,00

Р 0,12 0,16 0,004

СОД уел ед М+т 1,06 ±0,25 1,20 ±0,12 0,77 ± 0,08

Медиана 1,14 1,27 0,77

Q1-Q3 0,75-1,40 1,02-1,34 0,63 - 0,85

Р 0,0001 0,01 0,00002

ДК НВЖК моль/л М±т 1,04 ±0,18 0,70 ± 0,04 1,14 ±0,07

Медиана 1,16 0,65 1,09

Q1-Q3 0,83-1,40 0,62 - 0,74 1,02-1,23

Р 0,03 0,03 0,0008

МДА нмоль М±т 196,21 ± 8,52 190,14 + 17,96 156,88 ± 16,16

Медиана 203,81 183,80 189,94

Q1-Q3 187,01-213,01 165,14-208,21 113,81 - 191,10

Р 0,000001 0,00008 0,0002

Таблица 6 — Изменение про- и антиоксидантных показателей крови под влиянием гиматомелановых кислот

Фермент Показатель 3 сут. 7 сут 12 сут

Каталаза нмоль/мл» мин М±т 120,24 ±8,35 112,19 ±6,44 89,48 ± 7,68

Медиана 128,77 104,03 85,37

<3г<3з 105,47- 134,18 102,58- 119,52 89,48- 105,12

Р 0,47 0,14 0,002

СОД уел ед М±т 2,06 ±0,10 2,04 ±0,12 1,87 ±0,09

Медиана 2,02 2,01 1,26

(3г<3з 1,81-2,14 1,74-2,15 0,94 - 3,22

Р 0,69 0,6 0,7

дкнвжк моль/л М±т 0,37 ± 0,04 0,91 ± 0,05 0,46 ± 0,07

Медиана 0,36 0,85 0,49

<2.-(2з 0,33 - 0,36 0,84-0,92 0,30 - 0,64

р 0,02 0,07 0,09

МДА нмоль М+т 79,83 ± 10,27 70,08 ± 11,76 55,72 + 6,19

Медиана 70,36 54,21 49,99

СЗ.-Оз 67,86 - 77,86 50,95 - 75,36 48,06- 56,14

Р 0,0006 0,02 0,02

Совокупность полученных экспериментальных данных свидетельствует, что гиматомелановые кислоты пелоидов выполняют уникальную функцию по

поддержанию постоянства состава на макро- и микроуровнях и сохраняют экологическое равновесие

Гиматомелановые кислоты пелоидов поддерживают внутренний гомеостаз систем на организменном, клеточном и субклеточном уровнях, способствуя восстановлению физиологических функций при патологических состояниях и экстремальных ситуациях

ВЫВОДЫ

1 Результаты изучения элементного состава, характера ИК-спектра, спектров поглощения свидетельствуют о наличии гиматомелановых кислот в гумино-вых веществах низкоминерализованных иловых сульфидных грязей

2 Выявлено сходство гиматомелановых кислот пелоидов с аналогичной группой гуминовых веществ почв по элементному составу и степени бензоидно-сти, однако данные субстанции отличаются по степени окисленности, что обусловлено различными термодинамическими условиями их формирования

3 По элементному составу, молекулярно-массовому распределению, 'Н-ЯМР, ИК-, УФ-спектрам, содержанию функциональных групп, адсорбционной способности, характеру поведения в растворах имеют место закономерные отличительные особенности гиматомелановых кислот от других гуминовых веществ пелоидов

4 Разработана методика качественного и количественного анализа гиматомелановых кислот, позволяющая стандартизировать биологически активную субстанцию

5 Установлена принадлежность гиматомелановых кислот пелоидов к IV классу токсичности В экспериментах на модели каррагенинового воспаления доказана полимодальная дозозависимость противовоспалительной активности гиматомелановых кислот

6 Установлена протекторная способность гиматомелановых кислот пелоидов по отношению к ионам тяжелых металлов по результатам изучения их коагулирующей способности и влиянию на кинетические параметры рачков Daphnia magna в условиях химического стресса, вызванного этими металлами

7 Изучено влияние гиматомелановых кислот основные параметры крови, функции про- и антиоксидантных систем организма, органов иммуногенеза в условиях острого и хронического воспаления

Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

1 Катунина Е Е Дэнс-форез обоснованность, эндоэкологичность и эффективность нового метода электрогрязелечения пелоидопрепаратами / Воробьев Д В , Агапов А И, Романтеева Ю В // Гигиенические проблемы оптимизации окружающей среды и охраны здоровья населения Науч труды Федерального научного центра гигиены им Ф Ф Эрисмана Вып 17 -Самара, 2006 - С 139-142

Публикации в сборниках и материалах конференций

1 Катунина Е Е Методологические аспекты оценки экологического благополучия лечебных грязей и пелоидопрепаратов на их основе / Аввакумова НИ, Агапов А И // Актуальные проблемы экологии человека Труды VIII Всероссийского конгресса - Самара, 2002 - С 6-8

2 Катунина Е Е Исследование гумусовых кислот пелоидов методом капиллярного зонного электрофореза / Аввакумова НИ, Агапов АН, Аввакумова АА // Медицинская экология Материалы II научно-практической конференции -Пенза,2003 - С 76-79

3 Катунина Е Е Методология изучения процессов депонирования металлов в растительных организмах / Аввакумова Н П , Кривопалова М А // Сохраним планету Земля Доклады международного экологического форума - СПб , 2004 - С 422 - 427

4 Катунина, Е Е Влияние гиматомелановых кислот пелоидов на развитие острого воспаления / Аввакумова Н П , Семионова М А // Науки о человеке Материалы пятого конгресса молодых ученых и специалистов - Томск,

2004 - С 172-173

5 Катунина Е Е Исследование электронных спектров поглощения пелоидопрепаратов гуминового ряда / Аввакумова Н П, Семионова М А // Науки о человеке Материалы пятого конгресса молодых ученых и специалистов -Томск, 2004 - С 179-180

6 Катунина Е Е Противовоспалительная активность спирторастворимой фракции гуминовых веществ пелоидов // Региональная медицинская наука тенденции и перспективы развития Сб материалов докладов V научной конференции молодых ученых -Самара,2004 - С 489-491

7 Катунина Е Е Интегральная оценка влияния гуминовых пелоидопрепаратов на острое экссудативное воспаление / Аввакумова Н П, Лимарева Л В , Семионова М А // Человек и лекарство Тезисы докладов XI национального конгресса - М , - 2004 - С 775

8 Катунина Е Е Характеристика противовоспалительной активности в ряду гумусовых кислот пелоидов по результатам морфологических исследований / Аввакумова Н П, Российская В В , Семионова М А, Аввакумова А А // Морфологические ведомости Тезисы V общероссийского съезда анатомов, гистологов и эмбриологов - Казань, 2004 - С 4

9 Катунина Е Е Химико-фармацевтическая оценка гуминовых веществ лечебных грязей / Романтеева Ю В , Глубокова М Н //II Всероссийский съезд фармацевтических работников -Сочи, 2005 -С 130-131

10 Катунина Е Е Оценка влияния гиматомелановых кислот пелоидов на течение иммунного воспаления по результатам морфологических исследований И Аспирантский вестник Поволжья -2005 -№1 (9) - С 104-105

11 Катунина Е Е Роль гуматов в сохранении экологического равновесия / Аввакумова Н П , Романтеева Ю В , Захарова Е А, Глубокова М Н // Экология и здоровье человека Сб трудов X всероссийского конгресса - Самара,

2005 -С 7-10

-J

12 Катунина E E Динамика морфологических изменений в регионарных лимфатических узлах крыс с адъювантным артритом под влиянием гиматомела-новых кислот пелоидов / Аввакумова Н П // Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины Материалы научно-практической конференции - Астрахань, 2006 - С 127-129

13 Катунина ЕЕ Экопротекторная функция гиматомелановых кислот пелоидов биотестирование / Аввакумова Н П, Кривопалова МА, Глубокова М Н // Медицинская экология Сб статей V Международной научно-практической конференции Пенза, 2006 - С 63-65

14 Катунина Е Е Оценка биопротекторного действия гуминовых кислот в системе М2+ - Daphnia magna / Кривопалова МА, Аввакумова НИ, Захарова ЕА // Медицинская экология Сб статей V Международной научно-практической конференции - Пенза, 2006 - С 65-66

15 Катунина ЕЕ Обоснование эффективности пелоидопрепаратов гуминового ряда / Агапов А И, Аввакумова Н П, Глубокова М Н , Романтеева Ю В // Тезисы докладов VI Всероссийского съезда физиотерапевтов - СПб , 2006 -С. 74-75

16 Катунина ЕЕ Использование метода биотестирования для определения токсичности и протекторного действия гиматомелановых кислот // Аспирантские чтения 2006 Межвузовская конференция молодых ученых - Самара, 2006. - С. 253-257.

17 Катунина ЕЕ Парамагнитность в ряду гуминовых веществ пелоидов Медицинский вестник Башкортостана / Агапов АН, Сизяков ОМ, Романтеева ЮБ //Медицинский вестник Башкортостана 2006,-№1,Т4 -С 212-214

18 Катунина ЕЕ Разработка способа идентификации биологически активной субстанции «гиматомелановые кислоты пелоидов» / Аввакумова Н П, Кривопалова М А, Глубокова М Н // Медицинская экология Сб статей VI Международной научно-практической конференции Пенза, 2007 - С 5-7

19 Катунина Е Е. Оценка влияния гиматомелановых кислот пелоидов на периферические органы иммуногенеза // Медицинская экология Сб статей VI Международной научно-практической конференции - Пенза, 2007 - С 44-45

Подписано в печать 8 октября 2007 г Формат 60x84/16 Бумага офсетная Печать оперативная Объем 1 п л Тираж 100 экз Заказ №/438 443011 г. Самара, ул Академика Павлова, 1 Отпечатано УОП СамГУ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Катунина, Елена Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ГУМИНОВЫЕ ВЕЩЕСТВА И ИХ ФУНКЦИИ В БИОСФЕРЕ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурная организация гуминовых веществ.

1.2. Групповой состав гуминовых веществ.

1.3. Протекторные свойства гуминовых веществ.

1.4. Биологическая активность гуминовых веществ.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Этапы проведения исследования, характеристика объекта исследования

2.2. Методика выделения и очистки гиматомелановых кислот пелои

2.3. Методы идентификации гиматомелановых кислот пелоидов.

2.4. Методы исследования структурной организации гиматомелановых кислот пелоидов.

2.5. Методы исследования экопротекторных свойств гиматомелановых кислот пелоидов.

2.6. Методы исследования биологической активности гиматомелановых кислот пелоидов.

2.7. Статистическая обработка результатов исследований.

Глава 3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ГИМАТОМЕЛАНОВЫХ КИСЛОТ ПЕЛОИДОВ.

3.1. Идентификация гиматомелановых кислот пелоидов.

3.1.1. Элементный состав гиматомелановых кислот пелоидов.

3.1.2. Электронные спектры поглощения растворов гиматомелановых кислот пелоидов.

3.1.3. Характеристика ИК-спектра гиматомелановых кислот пелои

3.2. Стандартизация гиматомелановых кислот пелоидов.

3.2.1. Качественный анализ гиматомелановых кислот пелоидов.

3.2.2. Количественный анализ гиматомелановых кислот пелоидов

Глава 4. ФИЗИКО - ХИМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ГИМАТОМЕЛАНОВЫХ КИСЛОТ ПЕЛОИДОВ.

4.1. Термодинамические функции гиматомелановых кислот пелоидов

4.2. Полидисперсность гиматомелановых кислот пелоидов.

4.2.1 Исследование молекулярно-массового распределения гиматомелановых кислот пелоидов.

4.2.2 Изучение гидрофильно-гидрофобных свойств гиматомелановых кислот пелоидов.

4.2.3 Исследование гиматомелановых кислот пелоидов методом капиллярного электрофореза.

4.3. Кислотно-основные свойства структурных фрагментов гиматомелановых кислот пелоидов.

4.4. Характеристика 'Н-ЯМР-спектра гиматомелановых кислот пелоидов

4.5. Характеристика спектра ЭПР гиматомелановых кислот пелоидов

4.6. Характеристика коэффициента самодиффузии гиматомелановых кислот пелоидов.

Глава 5. ПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА ГИМАТОМЕЛАНОВЫХ КИСЛОТ ПЕЛОИДОВ ПО ОТНОШЕНИЮ К ТЯЖЕЛЫМ МЕТАЛЛАМ.

5.1. Адсорбционная способность гиматомелановых кислот пелоидов

5.2. Определение порога агрегации гиматомелановых кислот пелоидов ионами металлов.

5.3. Протекторное действие гиматомелановых кислот пелоидов в условиях химического стресса.

Глава 6. ВЛИЯНИЕ ГИМАТОМЕЛАНОВЫХ КИСЛОТ ПЕЛОИДОВ

НА ПРОЦЕССЫ ВОСПАЛЕНИЯ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА.

6.1. Определение токсичности препарата гиматомелановых кислот пелоидов.

6.2. Влияние гиматомелановых кислот пелоидов на процесс острого каррагенинового воспаления.

6.3. Характеристика иммунотропного действия гиматомелановых кислот пелоидов.

6.4. Влияние гиматомелановых кислот пелоидов на процесс хронического воспаления.

6.5. Характеристика влияния гиматомелановых кислот пелоидов на про- и антиоксидантные процессы в модели адъювантного артрита.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экологическая и биохимическая активность гиматомелановых кислот пелоидов"

Актуальность темы. Гумификация, как сложное биохимическое по-стмортальное изменение растительных и животных организмов, предохраняющее органические вещества от полной минерализации, является планетарным природным процессом. Глобальными являются функции гуминовых веществ: аккумулятивная, питательная, транспортная, физиологическая, протекторная. Гуминовые вещества (ГВ) присутствуют во всех природных средах планеты: в воде, почве, горных породах, образуя жизненный фон человечества (Орлов Д.С. 1993; Кречетова Е.В., 1995; Андреева Д.Б., 2002; Гусева Т.В., 2002; Инишева Л.И., 2006; Чемитдоржиева Г.Д., 2007).

С ростом мирового производства увеличивается количество химических веществ, мигрирующих через атмосферу и гидросферу планеты, а в связи с этим все большее значение приобретает протекторная биосферная функция гуминовых веществ, которые практически необратимо поглощают многие из токсикантов антропогенного происхождения, детоксицируя почвы (Перми-нова И.В., 2000), растения (Спринчак Д.В., Бокова Т.И, 2002) и животные организмы (Бокова Т.И., Грачева О.Г., 2000). В настоящее время доказано участие гуминовых веществ в детоксикации пестицидов, тяжелых металлов, радионуклидов (Варшал Г.М., 1990; Анисимова М.А., 1997; Дударчик В.М., 2002).

В последнее время исследователей различных областей наук все больше привлекают ГВ, в связи с тем, что они, являясь природными соединениями, обладают широким биологическим спектром действия. Препараты гуминовых веществ используют в медицинской практике для лечения опорно-двигательной системы, воспалительных процессов различной природы, при стоматологических заболеваниях, в андрологии и т.д. (Гордиенко В.Г., 1998; Аввакумова Н.П., 2002; Баранцева Л.Н., 2002; Антонюк Н.В., 2005). Доказано, что специфические органические вещества являются стимуляторами роста растений, помогая усваивать необходимые минеральные элементы из почвы; в животноводстве они используются как биодобавки (Жилякова Т.П.,

2006), в промышленности для очистки сточных вод (Шаталаев И.Ф. и др. 2002).

Гуминовые вещества пелоидов являются менее изученными из всех природных объектов, несмотря на все большее применение грязей с лечебной, профилактической, реабилитационной целями. В составе низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, по мнению многих исследователей (Золотарева Т.А. 1988; Агапов А.И., 1999) гуминовые вещества являются основным лечебным фактором, но механизм их действия изучен недостаточно. Новая информация о возможностях гуминовых веществ позволит использовать уникальные биологически активные соединения лечебных грязей как источник лекарственных средств природного происхождения.

Наиболее изученными группами гуминовых веществ являются гуминовые кислоты и фульвокислоты (Кухаренко Т.А., 1960; Лодыгин Е.Д., 2001). Гиматомелановые кислоты как один из важных компонентов гуминовых веществ изучены недостаточно; упоминания о них встречаются в единичных научных работах (Глебова Г.И., 1980), несмотря на истечение почти двухсот лет со времени выделения (Гоппе-Зейлер, 1889 г.). В отечественной и зарубежной литературе практически отсутствуют работы по изучению биологической активности гиматомелановых кислот пелоидов, что подтверждает необходимость их исследования. В этой связи актуальным является не только изучение роли гиматомелановых кислот в протекторных свойствах гуминовых веществ, но и изучение биологической активности с целью получения и применения стандартизованного пелоидопрепарата.

Цель исследования: Изучить структурно-функциональные свойства, протекторное действие и биологическую активность гиматомелановых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей.

Задачи исследования:

1. Выделить гиматомелановые кислоты из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей различных источников, провести их идентификацию по физико-химическим параметрам.

2. Разработать методы качественного и количественного анализа гима-томелановых кислот пелоидов с целью стандартизации биологически активной субстанции.

3. Исследовать структурно-функциональные свойства гиматомелановых кислот пелоидов с использованием хроматографических, титриметрических методов, капиллярного микроэлектрофореза, ИК-спектра, 'Н-ЯМР - спектра, ЭПР, адсорбции воды на гиматомелановых кислотах.

4. Определить токсичность гиматомелановых кислот пелоидов при введении в организм.

5. Охарактеризовать протекторные свойства гиматомелановых кислот пелоидов при воздействия тяжелых металлов in vitro и in vivo.

6. Определить оптимальную дозу гиматомелановых кислот пелоидов при использовании их в качестве противовоспалительного средства.

7. Охарактеризовать биологическую активность гиматомелановых кислот пелоидов по влиянию на воспалительные процессы различного генеза.

Научная новизна. Изучены структурно-функциональные свойства гиматомелановых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей: элементный состав, термодинамическая устойчивость, кислотно-основные и окислительно-восстановительные свойства.

Впервые установлены молекулярные массы фракций гиматомелановых кислот пелоидов, соотношение гидрофильных и гидрофобных структурных фрагментов компонентов, адсорбционные свойства. Получены новые сведения о структурной организации гиматомелановых кислот пелоидов методами ИК-спектроскопии, ЭПР, 'Н-ЯМР, капиллярного зонного электрофореза.

Впервые методом ЯМР с ИГМП изучен процесс самодиффузии в водных растворах гиматомелановых кислот пелоидов; детализированы парамагнитные центры гиматомелановых кислот пелоидов.

Впервые изучено взаимодействие гиматомелановых кислот пелоидов с ионами металлов, выявлены протекторные свойства в условиях химического стресса, что доказывает участие гиматомелановых кислот в сохранении природного экологического равновесия.

Охарактеризована токсичность гиматомелановых кислот пелоидов, установлена их принадлежность к IV классу токсичности. Впервые установлена полимодальная зависимость противовоспалительного действия гиматомелановых кислот пелоидов.

Выявлена противовоспалительная, иммунокоррегирующая и антиокси-дантная активность гиматомелановых кислот пелоидов.

Получен блок новых данных о позитивном влиянии гиматомелановых кислот пелоидов на динамику воспалительного процесса в эксперименте.

Практическая значимость. Важное значение имеют данные, характеризующие структурные фрагменты гиматомелановых кислот пелоидов, полидисперсность, полифункциональность. Биогеохимическая постмортальная трансформация органических веществ исключает возможность наступления экологических катаклизмов за счет утилизации останков животного и растительного происхождения. Образующиеся вещества служат энергопластическим материалом для микробных и растительных организмов и важную роль в этих процессах играют гиматомелановые кислоты, как наиболее восстановленная составляющая гуминовых веществ. Связывая ионы тяжелых металлов гиматомелановые кислоты пелоидов способствуют сохранению экологического равновесия.

Совокупность полученных сведений о составе, строении, физико-химических и биологических свойствах гиматомелановых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей является фундаментальной основой дальнейших исследований по использованию в медицинской практике как основы для антиоксидантных, противовоспалительных, иммуномодули-рующих средств.

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе:

- кафедры общей, бионеорганической и биоорганической химии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» (акт внедрения от 25.09.2007 г.);

- кафедры химии фармацевтического факультета ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» (акт внедрения от 25.09.2007г.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Обоснование принадлежности гиматомелановых кислот пелоидов к классу гуминовых веществ биосферных объектов по общепринятым идентификационным критериям: элементному составу, ИК-спектру, коэффициенту цветности.

2. Обоснование предлагаемого качественного и количественного анализа как метода стандартизации биологически активной субстанции гиматомелановых кислот пелоидов.

3. Результаты изучения структурно-функциональной организации гиматомелановых кислот пелоидов химическими и физико-химическими методами: термодинамические функции, полидисперсность, амфифильность, полифункциональность, кислотно-основные свойства, адсорбционная способность и способность к диффузии гиматомелановых кислот пелоидов.

4. Совокупность информации об экопротекторных свойствах гиматомелановых кислот пелоидов при действии ионами тяжелых металлов.

5. Обоснование биологической активности гиматомелановых кислот пелоидов по результатам влияния на воспалительные процессы различного ге-неза.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на VIII Всероссийском конгрессе «Актуальные проблемы экологии человека» (г. Самара, 2002), II, V, VI научно-практических конференциях «Медицинская экология» (г. Пенза, 2003, 2006, 2007), Международном экологическом форуме «Сохраним планету Земля» (г. Санкт-Петербург, 2004), V конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (г. Томск, 2004), V научной конференции молодых ученых «Региональная медицинская наука: тенденции и перспективы развития» (г. Самара, 2004), V общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов «Морфологические ведомости» (г. Казань, 2004), X всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (г. Самара, 2005), V научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (г. Астрахань, 2006), VI Всероссийском съезде физиотерапевтов (г. Санкт-Петербург, 2006), Межвузовской конференции молодых ученых «Аспирантские чтения 2006» (г. Самара, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, главы, посвященной материалам и методам исследования, 4 экспериментальных глав, выводов, списка литературы. Библиографический указатель включает 227 источников, в том числе 45 на иностранном языке. Работа изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц, 39 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Катунина, Елена Евгеньевна

выводы

1. Результаты изучения элементного состава, характера ИК-спектра, спектров поглощения свидетельствуют о наличии гиматомелановых кислот в гуминовых веществах низкоминерализованных иловых сульфидных грязей.

2. Выявлено сходство гиматомелановых кислот пелоидов с аналогичной группой гуминовых веществ почв по элементному составу и степени бензоидности, однако данные субстанции отличаются по степени окисленности, что обусловлено различными термодинамическими условиями их формирования.

3. По элементному составу, молекулярно-массовому распределению, 1 Н-ЯМР, ИК-, УФ-спектрам, содержанию функциональных групп, адсорбционной способности, характеру поведения в растворах имеют место закономерные отличительные особенности гиматомелановых кислот от других гуминовых веществ пелоидов.

4. Разработана методика качественного и количественного анализа гиматомелановых кислот, позволяющая стандартизировать биологически активную субстанцию.

5. Установлена принадлежность гиматомелановых кислот пелоидов к IV классу токсичности. В экспериментах на модели каррагенинового воспаления доказана полимодальная дозозависимость противовоспалительной активности гиматомелановых кислот.

6. Установлена протекторная способность гиматомелановых кислот пелоидов по отношению к ионам тяжелых металлов по результатам изучения их коагулирующей способности и влиянию на кинетические параметры рачков Daphnia magna в условиях химического стресса, вызванного этими металлами.

7. Изучено влияние гиматомелановых кислот на основные параметры крови, функции про- и антиоксидантных систем организма, органов иммуногенеза в условиях острого и хронического воспаления.

137

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Катунина, Елена Евгеньевна, Самара

1. Аввакумова, Н.П. Биохимические аспекты терапевтической эффективности гумусовых кислот лечебных грязей / Н.П. Аввакумова. Самара: ГП «Перспектива»; СамГМУ, 2002. - 124 с.

2. Аверкиева, О.М. Использование ферментных препаратов и гуминовых веществ в рационах цыплят-бройлеров: Автореф. дис. . канд. с.-х. наук / О.М. Аверкиева. М., 2001. - 14 с.

3. Агапов, А.И. Специфические органические вещества лечебных грязей как источник пелоидопрепаратов гуминового ряда: Автореф. дис. . докт. биол. наук / А.И. Агапов. Самара, 1999. - 46 с.

4. Адилов, В.Б. Требования к экологическому состоянию месторождений минеральных вод и лечебных грязей / В.Б. Адилов, А.В. Дубовский, В.И. Зотова и др. // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 1996. - №6. - С. 38-43.

5. Александрова, JI.H. Органическое вещество почвы и процессы его трансформации / JI.H. Александрова. М., 1980. - 287 с.

6. Алещукин, JI.B. Инфракрасные спектры гуминовых кислот чернозема и дерново-подзолистой почвы / JI.B. Алещукин, В.В. Добровольский // Гуминовые вещества в биосфере: тезисы III Всероссийской конференции. -СПб.,-2005.-С. 55-56.

7. Аммосова, Я.М. Сравнительная характеристика гумусовых кислот почв и лечебных грязей / Я.М. Аммосова, З.Ф. Косьянова, Д.С. Орлов // Тез. докладов 2-го Всесоюзного совещания по геохимии углерода.-М, 1986.-С.238.

8. Андреева, Д.Б. Гуминовые вещества низинного торфа и бурого угля Забайкалья. Автореф. дис. . канд. биол. наук / Д.Б. Андреева. Улан-Удэ,2002.-21 с.

9. Анисимова, М.А. Детоксицирующая способность почв и выделенных из них гуминовых кислот по отношению к гербицидам: Автореф. дис. канд. биол. наук / М.А. Анисимова. М., 1997. - 23 с.

10. Антонюк, М.В. Эффективность электрофореза гумата натрия при ревматоидном артрите / М.В. Антонюк, Т.Л. Магалиш // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 2005. - №4. - С. 20-22.

11. А.с. 1172559. Способ получения каратиноидов из иловых грязей / A.JL Шинкаренко, И.Ф. Щербак. № 3613440/28-13; Опубл. 15.08.85; Приор. 30.06.83 (СССР).-1с.

12. Бабанин, В.Ф. О природе линий в спектрах ЭПР гумусовых кислот / В.Ф. Бабанин, Н.П. Ильин, Д.С. Орлов и др. // Почвоведение. 1977. - № 1. - С. 65-72.

13. Базелян, B.JL Исследование гумусовых кислот различного происхождения методом ИК-спектроскопии / B.JL Базелян, Г.Ю. Коломейченко, Г.Г. Тка-ченко и др. // Сборник научных трудов ГосНИИ озерного и речного рыбного хозяйства. М., 1988. - №287. - С. 109-114.

14. Баранцева, Л.П. Лабораторно-биохимическое обоснование применения пелоидотерапии в комплексе санаторного лечения больных с патологией сердечно-сосудистой системы: Автореф. дис. . канд. мед. наук. / Л.П. Баранцева. Ростов-на-Дону, 2002. - 22 с.

15. Барнацкий, В.В. Влияние радоно- и пелоидотерапии на функциональное состояние и качество жизни больных серонегативными спондилоартрита-ми / В.В. Барнацкий // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 2005. - №5. - С. 26-30.

16. Баталкин, Г.Г. О природе действующего начала физиологически активных гуминовых кислот / Г.Г. Баталкин // Торф, его свойства и перспективы применения: труды международного симпозиума IV и XI комиссии МТО. -Минск, 1982.- С.45-49.

17. Батуев, Б.Ц. Оценка физиологической активности гуминовых веществокисленных углей / Б.Ц. Батуев, Е.В. Золтоев, Н.В. Бодоев и др. // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. - № 4. - С. 501-505.

18. Бахман, В.И. Методика анализа лечебных грязей (пелоидов) / В.И Басман, К.А. Овсянникова, А.Д. Водковская // ЦНИИКиФ. М., 1965. - 217 с.

19. Баширова, JI.B. Характеристика морфологических реакций нервных элементов кожи при действии постоянного тока и электрофореза 1%-ного раствора сухого экстракта грязи / JI.B. Баширова // Препараты из лечебной грязи и рапы. Томск, 1983. - 25 с.

20. Белоногова, Ю.В. Экологические последствия влияния тяжелых металлов на гидробионты: Автореф. дис. . канд. биол. наук / Ю.В. Белоногова. -Саратов, 1999.-23 с.

21. Беркович, A.M. Лекарства для здоровья: достижения и перспективы ветеринарии / A.M. Беркович, B.C. Бузлама В // Животноводство России. -2005.-№8.-С. 59.

22. Бессарабов, Б.Ф. Соли гуминовых кислот вместо антибиотиков / Б.Ф. Бес-сарабов, Л.А. Гонцова, И.Е. Мельникова // Животноводство России. -2003.-№4.-С. 18.

23. Бессарабов, Б.Ф. Лигногумат источник энергии и иммуномодулятор / Б.Ф. Бессарабов, И.Е. Мельникова // Животноводство России. - 2005. -№1.-С. 11-12.

24. Бокова, Т.И. Влияние различных детоксикантов на остаточное содержание свинца в тканях цыплят / Т.И. Бокова, О.Г. Грачева // Сибирский экологический журнал. 2000. - № 3 - С. 257-261.

25. Боровиков, В.П. STATISTICA: искусство анализа данных на компьютере. Для профессионалов / В.П. Боровиков. СПб.: Питер, 2001. - 656 с.

26. Будников, Г.К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге водных систем / Г.К. Будников // Соросовский образовательный журнал. 1998. -№5.-С. 23-29.

27. Бузлама, B.C. Структура и биологическая активность гуминовых веществ / B.C. Бузлама, С.В. Шабунин // Ветеринария. 2007. -№6. - С. 48-50.

28. Вартапетян, Р.Ш. Механизм адсорбции молекул воды на углеродных адсорбентах / P.1I1. Варапетян, A.M. Волощук // Успехи химии. 1995. -Т.64, вып. 11. - С. 1055-1072.

29. Варшал, Г.М. Геохимическая роль гумусовых кислот в миграции элементов / Г.М. Варшал, Т.К. Велюханова, И.Я. Кощеева // Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993. - С. 97-117.

30. Варшал, Г.М. Сорбция тяжелых металлов и протонных носителей долго-живущих радионуклидов на гуминовых кислотах / Г.М. Варшал, И.Я. Кощеева, Т.К. Велюханова // Геохимия. 1996. - №11.- С. 12-22.

31. Венгеровский, В.Н. О гепатозащитых свойствах липидов иловых грязей / В.Н.Венгеровский, В.Н. Буркова, О.В. Паульс и др. // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 1988. - № 5. - С. 46.

32. Вернадский, В.И. Биосфера / В.И. Вернадский. JL: Науч.-техн. изд-во, 1926.-146 с.

33. Влияние биологически активных препаратов «Гидрогумат» и «Оксигу-мат» на иммунитет и обменные процессы животных / В.П. Бойко, Г.В. Наумова, Т.Ф. Овчинникова и др. // Природопользование. 1998. - вып.4. - С. 82-86.

34. Водяницкий, Ю.Н. Методы расчета ароматичности гумусовых кислот / Ю.Н. Водяницкий // Почвоведение. 2001. - №3. - С. 289-294.

35. Водяницкий, Ю.Н. Использование термодинамических показателей для описания гумусовых кислот почв / Ю.Н. Водяницкий // Почвоведение. -2000.-№1.-С. 50-55.

36. Волощук, А.М. Руководство по капиллярному электрофорезу / Под. ред. А. М. Вологцука, научный совет РАН по хроматографии. М.: Наука,1996.-231 с.

37. Вульфсон, Н.С. Масс-спектрометрия органических соединений / Н.С. Вульфсон, В.Г. Заикин, А.И. Микая. М.: Химия, 1975. - 384 с.

38. Гильмиярова, Ф.Н. Способ получения препарата на основе гиматомелановых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей для физиотерапии / Ф.Н. Гильмиярова, А.И. Агапов, Н.П. Аввакумова // Патент № 2122414 от 27.11.98. -Бюлл. №33. С. 16.

39. Глебова, Г.И. Гиматомелановые кислоты почв и их место в системе гумусовых веществ: Автореф. дис. . канд. биол. наук / Г.И. Глебова. М., 1980.-21с.

40. Глебова, Г.И. Гиматомелановые кислоты почв / Г.И. Глебова. М., 1985. -73 с.

41. Глебова, Г.И. Гиматомелановые кислоты почв сухостепного ряда / Г.И. Глебова, А.А. Ларионова // Вестник МГУ. Серия 17. - 1990. - № 1. - С. 26-30.

42. Глебова, Г.И. Структурные различия гиматомелановых и гуминовых кислот чернозема типичного / Г.И. Глебова, А.А. Ларионова, Д.С. Орлов // Почвоведение. 1985. - № 7. - С. 31-37.

43. Глебова, Г.И. Элементный состав и коэффициент экстинкции гиматомелановых кислот почв / Г.И. Глебова, Д.С. Орлов // Научные доклады высшей школы. Серия: биологические науки. 1980. - № 9. - С. 95-100.

44. Гордиенко, В.Г. Применение лечебной грязи в комплексной терапии заболеваний пародонта: Автореф. дис. канд. мед. наук / В.Г. Гордиенко -М., 1998.-18 с.

45. Грехова, И.В. Тюменский гуминовый препарат / И.В. Грехова, И.Д. Комиссаров // Земледелие. 2005. - №4 - С. 30-32.

46. Гришина, А.В. Агроэкологическая оценка содержания тяжелых металлов в экосистемах Владимирской области: Автореф. дис. . канд. с-х наук / А.В. Гришина. -М., 2001. 21 с.

47. Гришина, JI.A. Трансформация органического вещества и гумусное состояние почв: Дис. докт. биол. наук / J1.A. Гришина. М.: Наука, 1983.- 453 с.

48. Гуминовые сорбенты поливалентных металлов // A.M. Абрамец, В.Г. Крайко, Г.С. Монич, и др. // Физика и химия торфа в решении проблем экологии. Минск, 2002. - С. 79-80.

49. Гумусовые кислоты / Т.В. Гусева, Я.П. Молчанова, Е.А. Заика и др. // В кн: Гидрохимические показатели состояния окружающей среды. М., -2002.-С. 281-282.

50. Гуревич, B.C. Сравнительный анализ двух методов определения активности супероксиддисмутазы / В.С Гуревич, К.Н. Кантирщинова, Н.В. Шаталин // Лабораторное дело. 1990. - № 4 - С. 44-47.

51. Данченко, Н.Н. Функциональный состав гумусовых кислот (определение и взаимосвязь с реакционной способностью): Автореф. дис. . канд. хим. наук / Н.Н. Данченко. М., 1997. - 21 с.

52. Дашицыренова, А.Д. Гумусовые кислоты окисленных углей Республики Бурятии: состав, строение, свойства: Дис. канд. хим. наук / А.Д. Даши-цыринова. М., 2006. - 136 с.

53. Демин, В.В. Современные методы исследования гуминовых веществ почв- проблемы и перспективы / В.В. Демин, Ю.А. Завгородняя, Н.Г. Каршко-ва, О.Н. Бирюкова // Гуминовые вещества в биосфере: тезисы III Всероссийской конференции. СПб., 2005. - С. 58-59.

54. Дергачева, М.И. Гуминовые кислоты как индикатор состояния природной обстановки / М.И. Дергачева // Проблемы взаимодействия природы и человека в Среднем Поволжье (методы, задачи, перспективы). Самара, 1997.-С. 50-54.

55. Дергачева, М.И. Проблемы формирования и функционирования системы гумусовых веществ в свете естественно-исторических взглядов В.В. Докучаева / М.И. Дергачева // Материалы по изучению русских почв. Вып. 1(28).-СПб., 1998.-С. 3-10.

56. Добровольский, В.В. Роль органического вещества почв в миграции тяжелых металлов / В.В. Добровольский // Природа. 2004. - №7. - С. 35-39.

57. Добровольский, В.В. Высокодисперсные частицы почв как фактор массо-переноса тяжелых металлов в биосфере /В.В. Добровольский // Почвоведение. 1999.-№11.-С. 1309-1317.

58. Драгунов, С.С. Химическая природа гумусовых кислот / С.С. Драгунов // Гуминовые удобрения. Теория и практика их применения. Киев, 1962. -11 с.

59. Драгунов, С.С. Биохимическое исследование торфяных гуминовых кислот / С.С. Драгунов, Н.Г. Кабалова // Почвоведение. 1975. - №5. - С. 52-57.

60. Евтушенко, Н.Ю. Особенности накопления тяжелых металлов в тканях рыб Кременчугского водохранилища / Н.Ю. Евтушенко, О.В. Данилко // Гидробиологический журнал. -1996,- Т.32 № 4,- С. 58-66.

61. Жилякова, Т.П. Повышение резистентности организма животных путем применения препарата гумитон: Автореф. дис. . канд. биол. наук / Т.П. Жилякова. Томск, 2006. - 20 с.

62. Заварзина, А.Г. Кислотно-основные свойства гуминовых кислот различного происхождения по данным потенциометрического титрования / А.Г. Заварзина, В.В. Демин // Почвоведение. 1999. - №10. - С. 1246-1254.

63. Завгородняя, Ю.А. Сравнительная характеристика гуминовых кислот и грибных меланинов: Автореф. дис. . канд. биол. наук / Ю.А. Завгородняя. М., 2000. - 23 с.

64. Зинин, И.О. Изучение и применение лечебной грязи озера Молочка на курорте «Сергиевские минеральные воды» / И.О. Зинин // Грязи и их лечебное применение. Киев, 1969. - С. 32-33.

65. Золотарева, Т.А. О роли химического фактора в биологическом действии лечебной грязи / Т.А. Золотарева // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 1988. - № 2. - С. 50-52.

66. Изерская, Л.А. Формы соединений тяжелых металлов в аллювиальных почвах средней области / Л.А. Изерская, Т.Е. Воробьева // Почвоведение. -2000.-№1,-С. 56-62.

67. Ингрэм, Д. Электронный парамагнитный резонанс в биологии / Д. Ин-грэм.-М., 1972.-С. 191-193.

68. Инишева, Л.И. Торфяные почвы: их генезис и классификация / Л.И. Ини-шева // Почвоведение. 2006. - С. 781-786.

69. Инишева, Л.И., Гостищева М.В., Тухватулин Р.Т. Способ определения биологической активности гуминовых кислот торфов. Заявка на изобретение № 200513311/15(037291). Приоритет от 28.10.2005.

70. Иощенко, С.Е. О влиянии гуминовых и фульвокислот сапропеля на НАДН-оксидазную активность митохондрий печени / С.Е. Иощенко // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 1986. -№5.-С. 31-33.

71. Исматова, P.P. Влияние комплекса гуминовых кислот из торфов Сибири на течение аллергической реакции / P.P. Исматова, Х.М. Насыров // В сб: Фармацевтическая наука в решении вопросов лекарственного обеспечения.-М., 1998.-С. 270-275.

72. К вопросу о допустимом содержании радионуклидов в минеральных водах, лечебных грязях, глинах // В.Б. Адилов, И.И. Гусаров, А.В. Дубов-ский и др. // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 2001. - №3. - С. 30-33.

73. Карбышев, А.В. Химико-фармакологическое изучение гумата натрия из сапропеля: Автореф. дис. . канд. фарм. наук / А.В. Карбышев. Томск, 1999.-24 с.

74. Карпухин, А.И. Комплексные соединения органических веществ с ионами металлов: Автореф. дис. докт. биол. наук / А.И. Карпухин. -М.: ТСХА, 1986.-31 с.

75. Карпухин, А.И. Комплексные соединения гумусовых кислот с тяжелыми металлами / А.И. Карпухин // Почвоведение. 1998. - № 7. - С. 840-847.

76. Кеель, Э.И. Факторы действия лечебной грязи и «Гумизоля» / Э.И. Кеель // Труды Эстонского института экспериментальной и клинической медицины АМН СССР. Таллин, 1966. - Вып. 3. - С. 7-14.

77. Кирейчева, JI.B. Сапропели: состав, свойства, применение / JI.B. Кирейче-ва, О.Б. Хохлова. М.: Наука, 1998. - 62 с.

78. Кленов, Б.М. Современные представления об экологической устойчивости почв / Б.М. Кленов, А.Г. Гриценко // Современные проблемы геодезии и оптики: Междунар. научно-практ. конф. Новосибирск, 1998. - С. 262.

79. Ковалевский, Д.В. Исследование структуры гумусовых кислот методами спектроскопии / Д.В. Ковалевский. -М., 1998. 140 с.

80. Колесников, М.П. ЭПР-спектроскопия свободных радикалов почвенных гуминовых кислот / М.П. Колесников, Я.М. Аммосова // Накопление и преобразование седикахитов. М., 1979. - С. 187-194.

81. Колесников, С.П. Агроэкологические аспекты загрязнения почв тяжелыми металлами: Автореф. дис. докт. с.-х. наук / С.П. Колесников. Краснодар, 2001.-43 с.

82. Количественная спектроскопия ЯМР в идентификации гуминовых веществ и прогнозирования их свойств / Г.А.Калабин, А.Д. Дашицыренова, Д.Ф. Кушнарев и др. // Гуминовые вещества в биосфере: тезисы III Всероссийской конференции. СПб., 2005. - С. 62-63.

83. Комиссаров, И.Д. Молекулярная структура и физико-химические свойства гумусовых веществ / И.Д. Комисаров, Л.Ф. Логинов // Тезисы докладов VIII-го Всесоюзного съезда почвоведов. Новосибирск, 1989. - С. 45.

84. Комиссаров, И.Д. Электронный парамагнетизм и строение макромолекул гуминовых кислот / И.Д. Комиссаров // Гуминовые вещества в биосфере: тезисы III Всероссийской конференции. СПб., 2005. - С. 65-66.

85. Кононова, М.М. Органическое вещество почвы, его природа, свойства и методы изучения. / М.М. Кононова. М., 1963. - С. 292.

86. Концевая, С.Ю. Лигфол при интенсивных физических нагрузках лошадей / С.Ю. Концевая // Ветеринария. 2007. - №6. - С. 50-52.

87. Королюк, Н.С. Определение активности каталазы / Н.С. Королюк // Лабораторное дело. -1988. № 1. - С. 16-18.

88. Косьянова, З.Ф. Химическая характеристика и биологическая активность гумусовых кислот некоторых лечебных грязей: Автореф. дис. . канд. биол. наук./ З.Ф. Косьянова. М., 1985. - С. 20.

89. Кречетова, Е.В. Гуминовые кислоты горючих сланцев, их свойства и строение: Автореф. дис. . канд. биол. наук./ Е.В. Кречетова. М.: МГУ, 1995.-20 с.

90. Куклин, Д.Н. Отчет о ревизионной разведке грязевых месторождений Те-пловка и Молочка и детальной разведке оз. Солодовка курорта «Сергиевские минеральные воды» / Д.Н. Куклин. М., 1978. - 56 с.

91. Курорт «Сергиевские минеральные воды» здравница России / Б.Н. Жуков, В.Г. Яковлев, М.Г. Шегуев и др. // Самара, 1994. - 288 с.

92. Кухаренко, Т.А. Гиматомелановые кислоты ископаемых углей / Т.А. Ку-харенко, JI.H. Екатеринина // Почвоведение. 1960. - № 12. - С. 64-70.

93. Кухаренко, Т.А. О молекулярной структуре гуминовых кислот / Т.А. Кухаренко // Гуминовые вещества в биосфере. М.: Наука, 1993.

94. Ладонин, Д.В. Взаимодействие гуминовых кислот с тяжелыми металлами/ Д.В. Ладонин, С.Е. Марголига // Почвоведение. 1997. - №7. - С. 806-811.

95. Левинский, Б.В. Гуминовые препараты нового поколения / В.Б. Левин-ский // Гуминовые вещества в биосфере: тезисы III Всероссийской конференции. СПб., 2005. - С. 172-175.

96. Лещинский, А.Ф Комплексное использование лекарственных средств и физических лечебных факторов при различной патологии / А.Ф. Лещинский, В.С.Улащик. Киев, 1989. - С. 240.

97. Лиштван, И.И. Гуминовые вещества торфа и их практическое использование / И.И. Лишван, Н.Н. Бамбалов // Химия тверд, топл. 1990. - №6. -С. 14-20.

98. Логинов, Л.Ф. Гуминовые кислоты природные окислительно-восстановительные процессы: Автореф. дис. докт. биол. наук / Л.Ф. Логинов. - Тюмень, 1992. - 49 с.

99. Лодыгин, Е.Д. Изучение молекулярной структуры гумусовых кислот под11золистых и болотно-подзолистых почв методом С-ЯМР спектроскопии / Е.Д. Лодыгин, В.А. Безносиков // Почвоведение. 2003. № 9. - С. 10851094.

100. Лодыгин, Е.Д. Изучение молекулярно-массового распределения гумусовых веществ подзолистых почв методом гель-хроматографии / Е.Д. Лодыгин, В.А. Безносиков // Гуминовые вещества в биосфере: тезисы III Всероссийской конференции. СПб., 2005. - С. 73-74.

101. Маргоул, А. Растворимость гуминовых кислот в спиртах / А. Маргоул, П. Конделик // Почвоведение. 1965. - № 3. - С. 96-97.

102. Мартыненко, С.В. Физико-химические свойства, структура и поглотительная способность гуминовых кислот чернозема обыкновенного и луго-во-черноземного солонца: Автореф. дис. канд. с.-х. наук/С.В. Мартыненко. Воронеж, 2003. - 22 с.

103. Ш.Матвеев, Н.М. Экологические основы аккумуляции тяжелых металлов сельскохозяйственными растениями в лесостепном и степном Поволжье / Н.М. Матвеев, В.А. Павловский, Н.В. Прохорова. Самара, 1997. - 215 с.

104. Милановский, Е.Ю.Гумусовые вещества как система гидрофобно-гидро-фильных соединений, Дисс. в виде научного доклада доктора биол. наук / Е.Ю. Милановский. М., 2006. - 90 с.

105. Милановский, Е.Ю. Амфифильные компоненты гумусовых веществ почв / Е.Ю. Милановский // Почвоведение. 2000. - С. 706-715.

106. Милевская, С.Г. Лазеротерапия в сочетании с фонофорезом мази «Пелан» в лечении псориатического артрита / С.Г. Милевская, Т.Ф. Родионова // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 1991 -№2.-С. 52-54.

107. Москвин, В.П. К вопросу о формировании лечебных свойств сульфидных грязей / В.П. Москвин, Т.В. Белоусова, A.M. Опалинская // Лечебное применение пелоидов и препараты на их основе. Томск, 1988. - С. 4450.

108. Навоша, Ю.Ю. Применение количественной ИК-спектрофотометрии в исследованиях гуминовых веществ / Ю.Ю. Навоша // Гуминовые вещества в биосфере: тезисы III Всероссийской конференции. СПб., 2005. -С. 7778.

109. Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований / Г.И. Назаренко, А.А. Кишкун. М.: Медицина, 2000.-540 с.

110. Наумова, Г.В. Связь молекулярной структуры гуминовых кислот и их биологической активности / Г.В. Наумова, В.П. Стригуцкий, Н.А. Жмако-ва и др. // Химия твердого топлива. 2001. - №2. - С. 3-18.

111. Нечипуренко, О.Н. Грязи природные биогенные стимуляторы, механизмы целебного действия / О.Н. Нечипуренко // Провизор. - 1998. - №6. - С. 54-57.

112. Низкодубова, С.В. Экспериментальное обоснование и клиническое применение экстрактов лечебной грязи / С.В. Низкодубова // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 1986. - № 5. - С. 15.

113. Овчаренко, М.М. Тяжелые металлы в системе почва-растение-удобрения: Автореф. дис. докт. с.-х. наук / М.М. Овчаренко. М., 2000. - 27 с.

114. Орлов, Д.С. Возможности гель-хроматографии при оценке молекулярных параметров гумусовых веществ торфов, почв, сапропелей / Д.С.Орлов, Я.М. Аммосова, Е.Ю. Милановский // Торф, его свойства и перспективы применения. Минск, 1982.-С. 100-105.

115. Орлов, Д.С. Гуминовые вещества в биосфере / Д.С. Орлов. М., 1993. -238 с.

116. Орлов, Д.С. Гуминовые вещества в биосфере / Д.С. Орлов // Соросовский образовательный журнал. М., 1997. - № 2. - С. 56-63.

117. Орлов, Д.С. Гуминовые вещества в биосфере, народно-хозяйственноезначение и экологическая роль / Д.С. Орлов, К.Б. Иванушкина // Почвоведение.-1991.-№ 2.-С. 152-156.

118. Орлов, Д.С. Гумусовые кислоты почв / Д.С. Орлов. М., 1974. - 317 с.

119. Орлов, Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации / Д.С.Орлов М., 1990. - 325 с.

120. Орлов, Д.С. Органическое вещество почв Российской Федерации / Д.С. Орлов, О.Н. Бирюкова, Н.И. Суханова М.: Наука, 1996. - 256 с.

121. Орлов, Д.С. Пиролиз и дифференциальный термоанализ гумусовых веществ почвы / Д.С. Орлов, В.Н. Дубинин, Д.М. Елькина // Агрохимия. -1968.-№1.-С. 68-77.

122. Орлов, Д.С. Степень бензоидности гуминовых кислот и способ её определения / Д.С. Орлов, В.А. Барановская, А.А. Околелова // Доклады АН СССР. М., 1987. - Т.293. - №6. - С. 1479.

123. Орлов, Д.С. Фракционный состав гуминовых кислот типичного мощного чернозема / Д.С. Орлов, Г.И. Глебова, Т.И. Мироненко // Вестник МГУ. Серия почвоведение. 1977. - № 1. - С. 41-53.

124. Орлов, Д.С. Химия почв / Д.С. Орлов. М., 1985. - 380 с.

125. Орлов, Д.С. Элементный состав и степень окисленности гуминовых кислот / Д.С. Орлов // Научные доклады высшей школы; Биологические науки.-1970.-№ 1.-С. 5-20.

126. Перминова, И.В. Анализ, классификация и прогноз свойств ГСК. Авто-реф. дис. докт. хим. наук / И.В. Перминова. М., 2000. - 50 с.

127. Попов, А.И. Гуминовые вещества: Свойства, строение, образование / А.И. Попов. Под ред. Е.И. Ермакова. СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2004. -248 с.

128. Попов, А.И. Свойства гуминовых веществ, определяющие их биологическую активность / А.И. Попов // Гуминовые вещества в биосфере: тезисы III Всероссийской конференции. СПб., 2005. - С. 42-43.

129. Попов, B.C. Гуминовые кислоты: теория и практика, поиск и реализация / B.C. Попов, С.И. Борминский // Горный вестник Узбекистана. 2006. -№1. - С.18-22.

130. Родионова, В.Н.Влияние микроэлементов на продуктивность и качество яровой пшеницы и фасоли: Автореф. дис. канд. биол. наук.- М., 2001.

131. Савельева, А.В. Характеристика гуминовых кислот торфов олиготрофных ландшафтов и способности их изменения в процессе гумификации: Автореф. дис. канд. биол. наук / А.В. Савельева. Томск, 2003. - 22 с.

132. Связывание металлов-экотоксикантов гуминовыми препаратами торфа из растворов / В.М. Дударчик, Т.П. Смычник, С.И. Коварик и др. // Физика и химия торфа в решении проблем экологии. Минск, 2002. - с. 105-106.

133. Севостьянова, Н.В. Антимутагенный эффект гумизоля в культурах Т-лимфоцитов крови, подвергнутых воздействию циклофосфана / Н.В. Севостьянова // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 1998. - №4. - С.46-47.

134. Сибагатов, В.А. Влияние кормовой добавки «Гумитон» на продуктивные качества в критические периоды физиологического состояния свиноматок и молодняка свиней на откорме: Автореф. дис. . канд. с.-х. наук / В.А. Сибагатов. Новосибирск, 2005. - 18 с.

135. Сибилева, JI.A. Противовоспалительные свойства сухих стандартизированных грязевых препаратов / JI.A. Сибилева, Т.П. Прищеп, А.И. Венгеровский // Бюлл. Сиб. Отд. АМН СССР. 1986. - №7. - С. 3-6.

136. Синдереева, А.В. Агроэкологическая оценка действия Cd, Ni, Zn в системе почва-растение-животное: Автореф. дис. . канд. с.-х. наук / А.В. Синдереева. Омск, 2001. -16 с.

137. Соколов, М.Ю. Эфферентная терапия в бройлерном птицеводстве / М.Ю. Соколов, Т.И. Бокова // Ветеринария Сибири. Новосибирск, 2002. -№№7-8.-С. 85.

138. Спринчак, Д.В. К вопросу детоксикации рапса гуминовыми препаратами / Д.В. Спринчак, Т. И. Бокова // Пища. Экология. Качество: сборник материалов 2 Международной научно-практической конференции. Новосибирск, 2002.-С. 351-352.

139. Стальная, И.Д. Современные методы в биохимии / И.Д. Стальная // Под редакцией В.И. Ореховича. М., 1977. - С. 63-64.

140. Степанова, Е.А. Химические свойства и строение гуминовых кислот са-пропелей: Автореф. дис. . канд. биол. наук / Е.А. Степанова. М., 1996. -21 с.

141. Степанова, А.А. Особенности строения амфифильных фракций гуминовых кислот чернозема южного / А.А. Степанова // Почвоведение. 2005. -№8.-С. 955-959.

142. Тихова, В.Д. Анализ элементного и фрагментарного состава гуминовых кислот почв Сибири комплексом инструментальных методов: Автореф. дисканд. хим. наук / В.Д. Тихова. Новосибирск, 2003. - 21 с.

143. Трапезникова, Н.К. К вопросу внедрения в практику новых достижений в области лечебного применения грязевых препаратов / Н.К. Трапезникова, Л.П. Орлова // Лечебное применение пелоидов и препаратов на их основе. -Томск, 1988.-С. 28-36.

144. Требухов, Я.А. Требования к изучению месторождений лечебных грязей (1 часть) / Я.А. Требухов // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 2000. - №5. - С. 39-42.

145. Тринус, Ф.П. Нестероидные противовоспалительные средства / Ф.П. Три-нус, Н.А. Мохорт, Б.М. Клебанов. Киев, 1975. - 238 с.

146. Тюрин, И.В. Органическое вещество почв и его роль в почвообразовании и плодородии. М., 1937. - 285 с.

147. Тэнфорд, Ч. Физическая химия полимеров / Ч. Тэнфорд. М.: Химия, 1965.-772 с.

148. Фролов, Ю.П. Современные методы биохимии. / Ю.П. Фролов. Самара: Изд-во Самар. ун-та, 2003. - 412 с.

149. Хриппович, А.А. Новый регулятор роста растений аминогумат на основе торфа и азотсодержащих добавок / А.А. Хриппович, H.J1. Макарова, И.В. Кляузе // Физика и химия торфа в решении проблем экологии. Минск, 2002.-С. 225-227.

150. Царфис, П.Г. Лечебные грязи и другие теплоносители / П.Г. Царфис, И.Б. Киселев. М., 1990. - 126 с.

151. Церская, Л.А. Формы соединений тяжелых металлов в аллювиальных почвах среденей области / Л.А. Церская, Т.Е. Воробьева // Почвоведение. 2000. - № 1. - С.56-62.

152. Цыпленков, В.П. Физико-химические методы изучения и контроля органического вещества почв / В.П. Цыпленков, В.В. Кузнецов, С.Н. Чуков // Бюлл. Почвенного института ВАСХНИЛ. М., 1986. - № 43. - С. 47-49.

153. Чепмен, Дж. Практическая органическая масс спектрометрия: Пер. с англ. Дж. Чепмен. - М.: Мир, 1988. - 216 с.

154. Черепанова, М.Н. Химический состав органического вещества лечебных грязей / М.Н. Черепанова, Т.И. Котова // Грязевые препараты. Томск, 1981.-27 с.

155. Чернух, A.M. Воспаления / A.M. Чернух. М.: Медицина, 1979. - 448 с.

156. Чимитдоржиева, Г.Д. Гуминовые кислоты низинного торфа и бурого угля / Г.Д. Чимитдоржиева, Д.Б. Андреева, В.М. Корсунков // Доклады академии наук, 2002. Том. 384. - № 6. - С. 135-137.

157. Чимитдоржиева, Г.Д. Гуминовые вещества в природных объектах / Г.Д. Чимитдоржиева; отв. ред. JI.JI. Убугунов. Улан-Удэ: Изд-во Бурятского науч. центра СО РАН, 2007. - 189 с.

158. Чуков, С.Н. Гуминовые вещества: результаты и перспективы исследований / С.Н. Чуков // Гуминовые вещества в биосфере: тезисы III Всероссийской конференции. СПб., 2005. - С. 50-51.

159. Чуков, С.Н. О методических аспектах изучения структуры и функций гуминовых веществ./ С.Н. Чуков // Гуминовые вещества в биосфере: труды II международной конференции. М., 2003, - С. 18-23.

160. Чуков, С.Н. Проблема параметрической оценки физиологической активности гуминовых препаратов / С.Н. Чуков, М.С. Голубков // Гуминовые вещества в биосфере: тезисы III Всероссийской конференции. СПб., 2005.-С. 123-125.

161. Шамардина, Ю.А. Агроэкологические аспекты применения биологических препаратов на основе гуминовых кислот при возделывании ячменя в условиях Центрального Черноземья: Дисс. . канд. с.-х. наук / Ю.А. Шамардина. Курск, 2006. - 126 с.

162. Шаяхметов, И.Т. Защитно-стимулирующие и адаптогенные свойства препарата ГУМИ биоактивированной формы гуминовых кислот. Эффективность его использования в сельском хозяйстве / И.Т. Шаяхметов, В.И. Кузнецов, Ш.Я. Гилязетдинов и др. - Уфа, 2000. - 102 с.

163. Шинкарев, А.А. Разделение гумусовых кислот на группы при многократной обработке растворителями / А.А. Шинкарев, Н.Б. Лютахина, С.Г. Гневашов // Почвоведение. 2000. - С. 814-817.

164. Шурухина, С.И. О природе спирторастворимой фракции гуминовых кислот / С.И. Шурухина, А.И. Чабаевский // Почвоведение. 1978. - № 2. -С. 43-48.

165. Шустов, Л.П. Экстракты иловой сульфидной грязи и их лечебное применение / Л.П. Шустов. Томск, 1996. - 81 с.

166. Шустов, Л.П. Экстракты иловой сульфидной грязи и обоснование их применения в клинической практике / Л.П. Шустов // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 1999.- №6. - С. 35-37.

167. Эфендиева, Ф.М. Лечение сопочной грязью больных с длительно текущими трофическими язвами голени / Ф.М. Эфендиева, С.Я. Гасымов // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физкультуры. 2001. -№3. - С.43-44.

168. Юдина, Н.В. Антиоксидантные свойства и биологическая активность гуминовых препаратов / Н.В.Юдина, А.В. Савельева, С.И. Писарева // Гуминовые вещества в биосфере: тезисы III Всероссийской конференции. -СПб., 2005.-С. 125-126.

169. Яшин, И.М. Выделение из почв мобильных форм гумусовых соединений водным раствором нейтральной соли / И.М. Яшин // Актуальные вопросы агрохимии почв. М., 1988. - С. 44-50.

170. Alkaline hydrolysis of humic substantces spectoscopis and chromatographic investions // M.U. Kumke, C.H. Specht, T. Brinkmann et al. // Chemospere. -2001.-V.45. -No 6-7.- P.l023-1031.

171. Bachoon, D.S. Effects of humic substances on fluorometric DNA quantification and DNA hybridization / D.S. Bachoon, E.Otero. R.E. Hodson // J Microbiol. Methods. 2001. - V. 47. - No 1. - P. 73-82.

172. Biester, H. Binding and mobility of mercury in soils contaminated by emissions from chlor-alkali plants / H. Briester, G. Muller, HF Scholer // Sci Total Environ. 2002. - V.284. - No 1-3.-P. 191-203.

173. Bubert, H. Structural and elemental investigations of isolated aquatic humic substances using X-ray photoelectron spectroscopy / H. Bubetrt, J. Lambert, p, Burba // Fresenius J. Anal. Chem. 2000. - V. 368. - No 2-3. - P. 274-280.

174. Dergachova, M. Reflection of natural enironment evolution in humus profil of soils / M. Dergachova, E. Kallas, Т/ Solovjova // 16th World Cogress of Soil Science., Montpellier. 1998. - V.l. - P. 338.

175. Direkt characterization of iodine covalently bound to fulvis acids by electros-pray mass spectrometry // V. Moulin P. Rieller, B. Amekraz et al. //Rapid Commun Mass Spectrom. 2001. - V. 15. - No 24.- P. 2488-2496.

176. Dissolved organic carbon contaminant interaction descriptors found by 3D force field calculations / H.A.Govers, H.B. Rrop, J.R. Parsjns et fl // SAR QSAR Environ Res. - 2002.-V.13 - No 2. - P.271-280.

177. Evangelou, VP Stability of Ca2+-, Cd2+-, and Cu2+-illite complexes / VP Evangelou, V. Varsi. // J. Environ. Sci. Health Part A Tox Hazard Subst. Environ. Eng. 2002. - V.37. - No. 5. - P. 811-828.

178. Fallek, C. Sur les matieres lixivia-ble de deux rankers Pyreneena / C. Fallek, C. Chiglione, R. Negre // C.R. Acad. Sci. Paris. 1973. - T.287. - № II. - P. 987-990.

179. Fava, F. Effects of humic substances on the bioavailability and aerobic biodeg-radation of polychlorinated biphenyls in a model soil. Biotechnol Bioeng / F Fara, A. Piccolo. 2002. - V.20. - No. 77 (2). - P. 204-211.

180. Feoktistov, V.M. The effect of humic substances on the toxicity of copper and zinc for Daphnia magna. / V.M. Feoktistov, A.K. Morozov, I.N. Zalicheva // Doc. H.Sc. Biol. Sci. -1991. No 10. - P. 130-135.

181. Filella, M. Heterogeneity and liability of Pb (II) complexation by humic substances: practical interpretation tools / M. Filella, R.M. Town // Fresenius J. Anal. Chem. 2001. - V.370. - No 4. - P. 413-418.

182. Fuchs, W. Die Chemie der Kohle. Berlin, 1981. - S. 51 -60.

183. Gaffney, J.S. Humic and Fulvic Acids / J.S. Gaffney, N.A. Marley, S.B. Clark // ACS Symposium Series No. American Chemical Society. Washington, DC. - 1996.-651 p.

184. Goecke, C. Medical Impacts of Peat Therapy / C. Goecke, N. Goecke // 10 th International Peat Congress. Volume 2. Stuttgart. 1996. - P. 530-533.

185. Hosse, M. Determination of electrophoretic mobilities and hydrodynamic radii of three humic substances as a function of pH and ionic strength. / M. Hosse, K.J. Wilkinson // Environ. Sci. Technol. 2001. - V. 1. - No 35. - P. 43014306.

186. Klinische Prufung der analgetischen Wirksamkeit von Rheumabadern bei Lumboischialgien / G. Kuban, K.M. Weber, L. Horbach et al. // Therapie-woche. 1985. - Bd.35. - № 17. - P. 2026-2033.

187. Lind, Y. The influence of humic substances on the absorption and distribution of cadmium in mice / Y. Lind, A.W. Glynn // Pharmacol. Toxicol. 1999. - V. 84.-No 6.-P. 267-273.

188. McDowell, R.W. Soil phosphorus fractions in solution: influence of fertiliser and manure, filtration and method of determination / R.W. McDowell, A.N. Sharpley // Chemosphere. 2001. - V. 45. - No 6-7. - P. 737-748.

189. Mutagenic activity of some coal-derived humic compounds evaluated by the Ames test. / F. Bernacchi, I. Ponzanelli, R. Barale et al // Mutat Res. 1996. -V.l0. - No 369 (1-2). - P. 107-112.

190. Nobukawa, T. Effect of bromide ions on genotoxicity of halogenated byproducts from chlorination of humic acid in water / T. Nobukawa, S. Sanukida // Water Res. 2001. - V. 35. - No 18. - P. 4293-4298.

191. Partitioning of mercury onto suspended sediments in estuaries // S.M. Le Roux,

192. G.E. Millward, L. Ebdon et al // Environ. Monit. 2001. -V. 3. - No 1. - P.37-42.

193. Pyroloysis of humic acids from digested fiid cjmposted sewage sludge // V.V. Miikki, K. Hanninen, J. Knuutinen et al // J. Chemosphere. 1999. - V.38.- No 2.-P. 247-253.

194. Pentinen, S. The kinetics of cadmium in Daphnia magna as affected by humic substances and water hardness / S. Pentinen, J. Kukkonen, A. Oikari // Ecotoxi-col. and Environ. Safety. 1995. - V.30. - № 1.- P. 72-76.

195. Quantification of carbohydrate structures in size fractionated aquatis substant-ces by two-dimensional nucear magnetis resonance // S.Haiber, P.Burba, B. Gosciniak et al // Fresenius J. Anal. Chem. 2001.- V. 369. No 5. - P. 457460.

196. Saldan, V.I. Study of Huminat on the Human RH Line Cells / V.I. Saldan // 12th International Peat Congress, Tampere, Finland, Abstracts. 2004. - V.2, -P. 1205-1208.

197. Schnitzer, M. The extraction of organic matter from selected soils and particle size fractions with 0,5 M NaOH, 0,5 M Na4P207 solutions / M. Schnitzer, P. Schuppli // Can. J. Soil. Sci. 1989. - Vol.69. - №2. - P. 253-262.

198. Schulten, H.R. Binding mechanisms of pesticides to soil humic substances /

199. H.R. Schulten, M.V. Schnitzer // Naturwissenschaften. 1993. - V.80. - P. 2930.

200. Schweizer, S. Okosystem und Shadmetalle / S. Schweizer // Karrst und Hohle. -1993.-P. 350-358.

201. Sorption and desorption of Co (II) on alumina: mechanisms and effect of humis substances // X.K. Wang, W.M. Dong, G. Wang et al // Appl. Radiat. Isot. -2002. V.56. - No.6. - P. 765-771.

202. Stepchenko, L.M. Influence of Natural Humic Preparations on the Stage of General Adaptation Syndrome. 12th / L.M. Stepchenko // International Peat Congress, Tampere, Finland. Abstracts. 2004. - V.2, pp. 433-436.

203. Stevenson, F.J. Humus Chemistry, 2nd Ed. Wiley, New York, 1994.

204. Stevenson, F.J. Humus chemistry, genesis, composition, reactions / F.J. Stiven-son // N.Y. Jolm W'iley&Sorvs, 1982. 443 p.

205. Stevenson, F.J. Chemistry of humic acid and related pigments F.J. Stevenson,

206. H.A. Butler // In: Organic geochemistry / Eds. G. Englington, M.T. Murphy. -N.Y.: Springer- Verlag, 1969. P. 534-557.

207. Swift, R.S. Understanding and Managing Organic Matter in Soils, Sediments, and Waters / R.S. Swift, K.M. Spark // International Humic Substances Society, St. Paul, MN, USA, 2001.

208. Swift, R.S. Humic Substances 11 In Search of Structure / R.S. Swift // N.Y.: John Wilev&Sons, 1989. P. 468-495.

209. Tan, K.H. Infrared absortion similarities between hymatomelanic acid and methylated humic acid / K.H. Tan // Soil. Sci. Soc. Amer. J. 1975. - Vol.39. - №1.-P. 70-73.

210. The Role of Humis Substances in the Ecosystems and in Environmental Protection // J. Drozd, S.S. Gonet, N. Senesi et al // PTSH-Poish Society of Humic Subtances, Wroclaw, Poland, 1997.

211. Walther, H. Moorpackungen // Deine Gesundheit. 1989. - № 3.- P. 20-26.

212. Wu, W.W., Effects of thermal treatment on halogenated disinfection byproducts in drinking water / Wu W.W., Benjamin M.M., Korshin G.V. // Water Res.-2001.- V.35.-No 15.-P. 3545-3550.

213. Терапевтични възможносди на нов български торфен препарат "Торфо-сол" при болни с остеоартроза / Костадинов Д., Кръстева Д., Дафинова Я. и др. // Курортология, физиотерапия.- София, 1987.-Т.24.-№14. С. 21-27.

214. Проректор по^чебно-воспитательной ил '•'•; социальной работе ГОУ ВПО /7 ? Й5«Самарский^государственный медицинский ^^(^нйверситет Росздрава»

215. Доктор биологических наук ^

216. Председатель, д.б.н., профессор1. Члены \к.х.н., доцент- i: Гк.б.н., ст.препода^ате^ьzitffi"•"уиирЗрситет Федерального агентства по дда|0О,хра!;ению и, социальному развитию1. Доктор биоло1. Г.Н. Суворова1. И.Ф. Шаталаев

217. С.Х. Шарипова Н.В. Расцветова