Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболические основы действия специфических органических компонентов пелоидов

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболические основы действия специфических органических компонентов пелоидов"

На правах рукописи

Жернов Юрий Владимирович

МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ДЕЙСТВИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ОРГАНИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ ПЕЛОИДОВ

03.01.04 - биохимия

1 2 МДР Ш

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Уфа-2012

005015089

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Аввакумова Надежда Петровна

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Гильмиярова Фрида Насыровна доктор медицинских наук Аглетдинов Эдуард Феликсович

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится </__» марта 2012г. в ^^ часов на заседании диссертационного совета Д 208.006.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 450000 РФ, Республика Башкортостан, г.Уфа, ул. Ленина, д.З

С диссертацией можно ознакомиться в Научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России по адресу: 450000 РФ, Республика Башкортостан, г.Уфа, ул. Пушкина, д.96/98, корп.7

Автореферат разослан «$2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, д.м.н., профессор

Г.Х. Мирсаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Приоритетной задачей медицины является сохранение и укрепление здоровья населения. Ввиду этого является актуальной разработка природных биологически активных отечественных препаратов. В данном аспекте значительный интерес представляют компоненты лечебных грязей.

Грязелечение относится к одному из древних способов терапии различных заболеваний, и, несмотря на это, до настоящего времени находит широкое применение в медицинской практике (Самутин Н.М., Кривобоков Н.Г.,1997; Казьмин, 2001; Пеклина Г.П., 2002; Джабарова Н.К., 2003). Пелоидотерапию успешно используют при патологиях опорно-двигательного аппарата (Киверцева И.А., 1982; Нагиев Ю.К., 1990; Антонюк Н.В., 2005), периферической и центральной нервной системы (Калинин C.B., 2003), желудочно-кишечного тракта (Гордиенко В.Г., 1998; Орехова Л.Ю., Рыжова В.Н., Зильберборд М.Е., 2003), ЛОР-органов (Осина Т.Д., 2001), в гинекологии и андрологии (Гречкина B.C., 2007), при ряде кожных заболеваний (Ке-сиди Е.Г., 2007).

Вместе с тем, санаторно-курортное лечение нативными грязями сопряжено с рядом проблем, среди которых - масштабное истощение запасов пелоидов (Буткова, 1999), деградация грязевых залежей вследствие изменения экологической чистоты (Адилов, Дубовской, Зотова, 1996), высокая стоимость содержания грязелечебниц (Самутин Н.М., Кривобоков Н.Г., 1997). Ещё более значимым ограничивающим фактором является рост числа пациентов, которым нативная пелоидотерапия противопоказана как чрезмерно нагрузочная процедура. Среди них - больные сахарным диабетом (Топурия Д.И., 2004), заболеваниями сердечно-сосудистой системы (Ба-ранцева Л.П., 2002), онкологическими заболеваниями и др.

В связи с этим, перспективным является новый подход в пелоидотерапии -преформирование, то есть выделение из лечебных грязей отдельных компонентов, обладающих биологической активностью, с целью их самостоятельного использования. Такими компонентами выступают специфические органические вещества гу-миновой природы, которые являются ведущим лечебным фактором в низкоминерализованных иловых сульфидных грязях (Агапов А.И., 1999; Аввакумова Н.П., 2002).

Важным, при этом, является всесторонне обосновать с позиции доказательной медицины возможность и объективность преформированной пелоидотерапии, а именно установить метаболические мишени воздействия отдельных фракций гуми-новых веществ пелоидов.

В литературе встречаются многочисленные данные о противовоспалительном (Кривопалова М.А., 2007; Катунина Е.Е., 2007), адаптогенном (Куликов В.Ю., 2001; Бузлама A.B., 2010), антитоксическом (Агапов А.И., Аввакумова Н.П., Меже-валова Н.И., 1998), обезболивающем, противоотёчном (Аввакумова Н.П. с соавт.,

2002), диуретическом (Дубищев A.B., 2010), гипоаллергенном (Гостищева М.В., 2008) действии гуминовых веществ.

При этом в Российской Федерации не зарегистрировано в качестве лекарственного средства ни одного препарата на основе природных специфических органических веществ гуминового ряда (Беркович A.M., 2007), что обусловлено недостаточностью результатов их исследований и противоречивостью сведений о медико-биологических свойствах и механизмах действия.

Отсутствие в информационных источниках сведений о влиянии отдельных фракций гуминовых веществ пелоидов на метаболические процессы, протекающие в организме человека, как в норме, так и при патологии, обуславливает новизну проведённого диссертационного исследования.

Цель исследования. Изучить структурно-функциональные особенности, выявить метаболические эффекты и установить наиболее активную фракцию в ряду гуминовых веществ пелоидов.

Задачи исследования:

1. Выделить и идентифицировать по общепринятым критериям специфические органические компоненты низкоминерализованных иловых сульфидных грязей: фульвовые, гиматомелановые, гуминовые и гумусовые кислоты.

2. Определить структурно-функциональные особенности специфических органических компонентов пелоидов физико-химическими методами: ИК-спектро-скопия и резонансная масс-спектрометрия.

3. Выявить каталитическую активность специфических органических компонентов пелоидов: каталазную, сахаразную, редуктазную и полифенолоксидазную.

4. Изучить влияние специфических органических компонентов пелоидов на показатели клеточного метаболизма в модельных экспериментах in vitro: на активность митохондриальных и цитоплазматических дегидрогеназ, АТФазную активность и цитотоксический эффект.

5. Установить влияние специфических органических компонентов пелоидов на показатели метаболизма in vivo в моделях окислительного стресса, гемолитической анемии и диабета.

Научная новизна исследования. Автором получены новые данные о структурно-функциональной организации специфических органических компонентов пелоидов с использованием ИК-спектроскопии и резонансной масс-спектрометрии. Установлено, что супрамолекулярные комплексы гуминовых веществ пелоидов содержат два основных компонента: хинон-бензольное ядро и жирнокислотную периферическую часть. Анализируемые данные полученных масс-спектров с использованием диаграмм ван Кревелена позволяют сделать вывод о наличии во фракциях гуминовых веществ пелоидов белковых и липидных фрагментов. По совокупности

результатов структурного анализа предложена мицеллярная модель строения гуми-новых веществ.

Впервые установлено влияние специфических органических компонентов пелоидов на показатели клеточного метаболизма. При проведении модельных экспериментов in vitro показано, что фракции гуминовых веществ пелоидов обладают цитопротекторным и пролиферативным эффектами. Впервые выявлены метаболические изменения при введении отдельных фракций гуминовых веществ пелоидов в моделях окислительного стресса, гемолитической анемии, диабета.

Научно-практическая значимость. Получены новые данные, раскрывающие особенности метаболических процессов при действии специфических органических компонентов пелоидов, которые позволяют объяснить на биохимическом уровне терапевтические эффекты практической пелоидотерапии. Совокупность новых сведений о структурно-функциональной организации гуминовых веществ пелоидов является руководящим материалом при выработке рекомендаций по рациональному санаторно-курортному лечению нативными грязями. Использование результатов работы в медицинской и фармацевтической практике позволит создать новый класс лекарственных средств сочетанного действия на основе экологически чистых природных веществ с доступной сырьевой базой.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Обоснование принадлежности специфических органических компонентов, выделенных из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, к классу гуминовых веществ, а именно к фульвовым, гиматомелановым, гуминовым и гумусовым кислотам по международным идентификационным признакам: элементному составу, степени окисленности, коэффициенту цветности и характеристическим полосам ИК-спектров.

2. Результаты изучения структурных компонентов отдельных фракций гуминовых веществ пелоидов физико-химическими методами: ИК-спектроскопии и резонансной масс-спектрометрии.

3. Совокупность результатов изучения каталитической активности фракций гуминовых веществ пелоидов: каталазной, сахаразной, редуктазной и полифе-нолоксидазной.

4. Блок данных о влиянии отдельных фракций гуминовых веществ пелоидов на показатели клеточного метаболизма в модельных экспериментах in vitro: на активность митохондриальных и цитоплазматических дегидрогеназ, на АТФазную активность, цитотоксический эффект.

5. Экспериментальные данные о влиянии отдельных фракций гуминовых веществ пелоидов на метаболические показатели организма в условиях in vivo в модельных системах окислительного стресса, гемолитической анемии, диабета.

Внедрение результатов в практику. Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедры общей, бионеорганической и биоорганической химии и кафедры химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России (акты внедрения от 19.12.2011г). Наряду с этим, результаты диссертационного исследования внедрены в практическую деятельность санитарно-гигиенической лаборатории и отдела целевой экспертизы и экспериментальных токсикологических исследований ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Самарской области» (акт внедрения от 19.12.2011г).

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на первой Международной конференции по гуминовым инновационным технологиям (ГИТ) «Природные и синтетические полифункциональные соединения и наноматериалы в медицине и биомедицинских технологиях» (4-8 ноября 2010 г., МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва); на полуфинале конкурса инновационных проектов «Зворыкинский проект» в номинации «Медицинские и фармацевтические технологии» (25-27 ноября 2010г., Москва); на Всероссийской конференции с международным участием Аспирантские чтения «Молодые учёные медицине» (2010, 2011 гг., СамГМУ, Самара); на Всероссийской научно-практической конференции «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты» (24-26 мая 2011г., СамГМУ, Самара); на XV и XVI Всероссийском Конгрессе «Экология и здоровье человека» (октябрь 2010, 2011 г., Самарский научный центр РАН, Самара); на научной проблемной комиссии «Фундаментальные медицинские и биологические науки» (21 октября 2011 г., СамГМУ, Самара).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них 4 работы в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ. Получено рационализаторское предложение ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России №122 от 01.02.2011г. «Средство природного происхождения для лечения инфицированных ран на основе хелатокомплекса гуминовых кислот пелоидов с ионами серебра» (Жернов Ю.В., Аввакумова Н.П., Жданова A.B.).

Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России (государственная регистрация №01200809998).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 33 таблицы, 50 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (глава 2), трёх глав (глава 3, 4, 5), отражающих результаты собствен-

ных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы, включающего 221 источник, из которых 62 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектом изучения явились фракции специфических органических веществ пелоидов: фульвовые, гиматомелановые, гуминовые и гумусовые кислоты, выделенные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей Федерального государственного учреждения «Санаторий «Сергиевские минеральные воды» Федерального медико-биологического агентства Российской Федерации (Самарская область).

Идентификация специфических органических компонентов пелоидов

Отнесение изучаемых специфических органических компонентов пелоидов к группе гуминовых веществ устанавливалось на основании элементного состава, показателя степени окисленности и коэффициента цветности. Определение элементного состава гуминовых веществ проводили на C-H-N-анализаторе модель 1106 фирмы «Cario Erba ЕА-1108». Элементное определение серы проводили тит-риметрическим методом Шенигера.

На основании полученных данных установлено, что показатели элементного анализа специфических органических компонентов пелоидов находятся в тех же диапазонах концентраций, которые характерны для стандартов гуминовых веществ Международного гуминового общества (IHSS), выделенных из различных природных источников (табл. 1).

Таблица 1 - Физико-химические показатели в ряду гуминовых веществ пелоидов

Определяемый показатель Фракции специфических органических компонентов пелоидов

ФК ГМК гк ГсК

Углерод масс. % 28,58±0,17 59,49+0,19 55,18±1,70 55,78±0,01

мольн. % 19,01+0,15 40,21 ±0,17 42,89+0,20 41,60±0,74

Водород масс. % 6,18+0,19 5,22±0,12 3,56+0,36 4,01+1,30

мольн. % 49,34+1,60 42,33±0,05 33,21±0,24 35,88+1,42

Азот масс. % 2,10±1,84 1,83±1,69 5,16+0,79 4,16±0,91

мольн. % 1,21±0,67 1,06+0,54 3,44±0,14 2,66+0,58

Кислород масс. % 58,90±0,61 31,26±0,14 34,10+0,16 34,97+0,14

мольн. % 29,38±0,14 15,84±0,05 19,88+0,05 19,56±0,07

Сера масс. % 4,24±1,47 2,2±0,17 2,00+0,01 1,08+0,32

мольн. % 1,06+0,16 0,56±0,05 0,58±0,25 0,30±0,46

Н/С 2,59 1,05 0,77 0,86

О/С 1,55 0,39 0,46 0,47

N/0 0,063 0,026 0,080 0,063

Коэффициент цветности 7,50 5,30 2,70 2,60

Степень окисленности +0,50 -0,26 +0,15 +0,08

Молекул, масса | Дальтон 754,72 1454,55 1600,00 2962,96

Брутто-формула ci3h47no28s c72h75n2o28s c74h57n6o34s сізхн, lyn^otos

Выявлено, что в фульвовых кислотах пелоидов преобладают алифатические составляющие, во фракции гуминовых кислот пелоидов - ароматические компоненты. Гиматомелановые и гумусовые кислоты занимают промежуточное положение в генетическом ряду.

Расчёты степени окисленности свидетельствуют о выраженном окисленном характере фульвовых кислот, который достигает значения +0,50. Группа гиматомелановых кислот характеризуется явным преобладанием восстановительных свойств, степень окисленности составляет -0,26. Для гуминовых и гумусовых кислот пелоидов характерно значение степени окисленности близкое к нулю, что свидетельствует о высокой окислительно-восстановительной буферной способности.

Структурный анализ специфических органических компонентов пелоидов

ИК-спектроскопия специфических органических веществ гуминовой природы пелоидов проводилась на спектрофотометре «Perkin-Elmer System - 2000» методом KBr-техники. Спектр регистрировали с использованием дифракционной решётки в диапазоне 400 - 4200 см"1.

Анализ молекулярной структуры показал, что макромолекулы гуминовых веществ состоят из каркасных олефиновых и ароматических фрагментов со значительной долей неокисленных алифатических группировок (рис.1).

80 а) 100 80 б)

-10 И И ¿400 2900 ¿400 ¿900 4400 о {см ") 2 40 й ' I А

0 4а 9С VI 1400 1900 \ 00 9СС И 1400 1900 2400 2900 3400 3900 4400 »{см-Ч

100 80 В) Г)

? \ 1 № Z i' ||

20 0 ivy 1 Mi ч А- ЦТ-— В I \ ч 1 V ) ЧУ

о (см') .00

Рис. 1. ИК-спектры а) фульвовых, б) гиматомелановых, в) гуминовых, г) гумусовых кислот пелоидов

Качественное сравнение относительной интенсивности полос пропускания спектров позволяет утверждать, что в фульвовых кислотах преобладают алифатические цепочки с большим количеством гидроксильных групп, гуминовые кислоты содержат сопряжённые ароматические структуры со значительным содержанием карбоксильных групп. Гиматомелановые кислоты можно отнести к ненасыщенной i фракции, содержащей фрагменты алифатического и ароматического характера.

Масс-спектрометрия фракций специфических органических веществ гумино-( вой природы пелоидов проводилась на масс-анализаторе ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием APEX Qe фирмы Bruker Daltonics с системой APOLLO™ II ESI, оборудованном сверхпроводящим магнитом с напряженностью магнитного поля 12 Тесла. Для подготовки пробы к анализу навеску образца массой 1 мг растворяли в 1 мл дистиллированной воды «Milli-Q». Полученный раствор разбавляли до концентрации 200 мкг/мл абсолютированным метанолом (99,5-99,8 I об.%). Детектирование проводилось в диапазоне значений масс от 150 до 2000 Да.

Установлено, что масс-спектры в ряду фульвовых, гиматомелановых, гуми-новых и гумусовых кислот пелоидов содержат от 8000 до 20000 пиков высокой плотности. При каждой номинальной массе наблюдалось несколько пиков, соответствующих ионизированным молекулам с различным элементным составом. На основании этого, нами подробно исследовалась фракция гиматомелановых кислот пелоидов, как наименее полидисперсная, в то же время, отражающая характер масс-спектров всех фракций специфических органических веществ (рис. 2).

А I Lili iL a) j - 6) 1 ll.il.jl 1

100 200 300 400 500 600 100 200 300 400 500 600

in I iiiLii lili ni в) к i Г)

100 200 300 400 500 600 200 400 600 800 1000

Рис. 2. Масс-спектры гиматомелановых кислот пелоидов: а) молекулы вида I СхНу07, б) CxHyOzSw, в) CxHyOzNw, r)CxHyOzSwNe

Установлено, что общая сумма азот- и серусодержащих молекул, обладающих потенциалом метаболической реакционной способности, составляет порядка 23,8% (р<0,05) в изучаемой фракции специфических органических веществ пелоидов.

На основании полученных данных масс-спектрометрии была построена диаграмма Кендрика, отражающая степень насыщенности молекул фракции гиматоме-

Номинальная масса (Да)

Рис. 3. Диаграмма Кендрика гиматомелановых кислот пелоидов

Построенные на основании данных рисунка 2 диаграммы ван Кревелена выявляют две характеристические области, демонстрирующие структурные компонен-

Рис. 4. Диаграмма ван Кревелена гиматомелановых кислот пелоидов

Нижняя область (б) отражает ароматическую составляющую гуминовых веществ пелоидов, по-видимому, проявляя структурообразующую функцию и являясь ядром супромолекулярных комплексов или молекул. Верхняя область (а) отражает наличие периферической алифатической жирнокислотной части супрамолекуляр-ных комплексов гу миновых частиц.

Масс-спектр гуминовых веществ пелоидов демонстрирует возможное наличие в составе супрамолекулярных комплексов липид- и протеин-подобных участков,

находящихся в периферической части. Таким образом, можно говорить о мицелляр-ной природе строения гуминовых веществ.

Влияние специфических органических компонентов пелоидов на метаболические показатели в клеточных моделях in vitro

Оценку влияния специфических органических компонентов пелоидов на суммарную активность митохондриальных и цитоплазматических дегидрогеназ проводили с помощью микротетразолиевого теста (Niks М., Otto М., 1990). В качестве биологического объекта исследования служили человеческие клетки Т-лим-фомы линии КЕ37.1-ШВ.

МТТ-тест основан на способности дегидрогеназ живых клеток конвертировать и восстанавливать бесцветный водорастворимый 3-(4,5-диметил-тиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид в 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-формазан. Формазан кристаллизуется внутри клетки в виде фиолетово-голубых кристаллов, перевод которых в раствор осуществляется с помощью диметилсульфокси-да. Последующая спектрофотометрия раствора позволяет сопоставить изменение оптической плотности по отношению к контролю с изменением количества жизнеспособных клеток (рис. 5).

160

гоплиДгалии* пролиферация

Фракции гуминоаыж •*щ*ста млоидо*

■ одой* ■ о.оолх • о.ооьо», ■ 0.0100* во.озич ■ о.оьлч o.im о.лоо% о.ьоооч i,oo«».

Рис.5. Влияние фракций гуминовых веществ пелоидов на активность клеток Т-лимфомы человека в микротетразолиевом тесте

Установлено, что фракции гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов стимулируют рост исследуемых клеток и защищают их от гибели. Наибольшим рост-стимулирующим и протективным эффектом обладают фракции гуминовых и гумусовых кислот пелоидов в интервале концентраций от 0,0025% до 0,0312%.

Активность лактатдегидрогеназы при действии специфических органических компонентов пелоидов определяли колориметрическим методом с использованием набора СуШТох 96 фирмы Промега. Принцип метода основан на способности фер-

мента восстанавливать лактат в пируват, превращая при этом НАД в НАДН. При добавлении фермента диафоразы, использующей образовавшийся НАДН, фермент катализирует восстановление жёлтой соли тетразолия INT в красный формазан. Таким образом, по интенсивности окраски можно судить об активности внеклеточной ЛДГ (рис. 6).

\

і

контроль ГК ГМК Гек ФК

фракции гуминовых веществ пелоидов

■ 0.0013% И0,00255* "0,0050% "0,0100% «0,03125* «0.0625% 0,1250% 0,2500% 0.5000» 1,0000%

Рис. 6. Влияние фракций гуминовых веществ пелоидов на выход из клеток Т-лимфомы человека цитозольного фермента лактатдегидрогеназы

Установлено, что фракции гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов не обладают цитотоксическим эффектом и не вызывают нарушения в организации целостности мембран клеток. Фракция фульвовых кислот пелоидов в диапазоне концентраций от 0,0013% до 0,0625% не обладает цитотоксическим эффектом. В более высоких концентрациях фульвовых кислот фиксируется выход ЛДГ из клетки в супернатант. Причем с увеличением концентрации фульвовых кислот пелоидов, увеличивалось содержание во внеклеточной среде цитозольного фермента.

Изучение АТФазной активности при действии специфических органических компонентов пелоидов определяли с помощью тест-набор ATP Determination Kit, Invitrogen. В основе методики лежит реакция взаимодействия люциферина с АТФ, в результате чего образуется люцифериладенилат и пирофосфат. Под действием внесенной в среду рекомбинантной люциферазы, люцифериладенилат переходит в ок-силюцеферин и АМФ, причём реакция идёт с выделением энергии в виде люминесценции, которая и фиксируется ИФА-ридером Tecan Infinite М200. В качестве культуры клеток использовали мононуклеарные клетки человека РВМС CD4 и CD8.

Уровень АТФ строго регулируется в здоровых клетках и резко уменьшается в процессе гибели клеток или их деления. Поэтому определение концентрации АТФ является индикатором цитостатического или пролиферационного воздействия на клетку специфических органических компонентов пелоидов.

13

Установлено, что фракции гиматомелановых и гумусовых кислот пелоидов в интервале изучаемых концентраций не снижают метаболическую активность моно-нуклеарных клеток СЭ4 и СЭ8 крови человека (рис. 7).

Рис. 7. Влияние фракций гуминовых веществ пелоидов на показатель фоновой люминесценции мононуклеарных клеток человека

Фракция фульвовых кислот пелоидов уменьшает АТФазную активность в интервале концентраций от 0,0003% до 0,1 %. Фракция гуминовых кислот пелоидов снижает фоновую люминесценцию по сравнению с контролем, причём наблюдается обратная зависимость от концентрации, что свидетельствует о пролиферационном воздействии.

Анализ цитопротекторного эффекта специфических органических компонентов пелоидов в условиях воздействия катионов тяжёлых металлов проводили на сперматозоидах крупного рогатого скота с использованием прибора «Анализатор токсичности АТ-03».

Установлено что все фракции гуминовых веществ пелоидов обладают высокой протекторной способностью, защищая половые клетки при воздействии катионов металлов (рис. 8).

□ О •ОСЭСОО%ИО.О'ЭСООО'Ч Р0 00Е:ХО0%аС.ЭС25000^и0.001250Э%ОС.ЭС0в25С%И0.С003120та 00 00С - К0% ■ 0.00эс7804 а О 00С 0390% аС, ЭСО019С% О 3,0000097% ВС, ЭС0004€ % ■ 0.С 000024*)

Рис. 8. Влияние фракций гуминовых веществ пелоидов на активность половых клеток в условиях цитотксических катионов металлов

Каталитическая активность специфических органических компонентов пелоидов

Каталитическую активность специфических органических компонентов пелоидов исследовали при помощи стандартных методик: каталазную активность определяли газометрическим методом в модификации Ю.В. Круглова; сахаразную, редуктазную и полифенолоксидазную активность - фотоколориметрическим методом на приборе КФК-3-01-«ЗОМЗ» (Россия) с использованием методики Т.А. Щербаковой, JI.A. Карягиной и H.A. Михайловской. С целью установления неферментативной активности данные методики повторялись, но при этом проводилась инактивация ферментов, содержащихся во фракциях специфических органических веществ пелоидов, путём стерилизации их сухим жаром при температуре 110°С в течение 30 минут (Хазиев Ф.Х., 1990).

Результаты исследования каталитической активности специфических органических компонентов пелоидов демонстрируют суммарную ферментативную и неферментативную активность (рис. 9). Причём установлено, что неферментативная редуктазная, полифенолоксидазная и каталазная активность фракций гуминовых веществ выше ферментативной активности. По-видимому, после термической обработки фракций происходят конформационные и конфигурационные изменения молекул гуминовых веществ и их активация за счёт увеличения площади соприкосновения с субстратом. Также происходит выход катионов металлов железа и марганца, сорбированных в молекуле, ответственных за параметаболические эффекты гуминовых веществ пелоидов.

ф - ферментативная; н/ф - неферментативная ф - ферментативная; н/ф - неферментативная

фермент - полифенолоксидаза фермент - сукцинатдегидрогеназа

ф - ферментативная; н/ф - неферментативная ф - ферментативная; н/ф - неферментативная

фермент - каталаэа фермент - инвертаза

Рис. 9. Каталитическая активность гуминовых веществ пелоидов

Нами установлена прямая зависимость между увеличением молекулярной массы и возрастанием каталитической активности в ряду гуминовых веществ пело-идов, что свидетельствует в пользу теории встраивания ферментов в их супрамоле-кулярные комплексы в процессе гумификации. Установлено, что гуминовые вещества пелоидов обладают выраженной редуктазной и полифенолоксидазной активностью. Менее выражена каталазная активность исследуемых фракций. Сахаразная активность в ряду гуминовых веществ пелоидов низкая. Установлено, что уровень каталитической активности выше у гуминовых и гумусовых кислот по сравнению с другими исследуемыми фракциями. Гиматомелановые кислоты занимают промежуточное положение в ряду.

Влияние специфических органических компонентов пелоидов на метаболические показатели в модели окислительного стресса Влияние специфических органических компонентов пелоидов на метаболические процессы в условиях окислительного стресса изучалось на группах аутбред-ных белых крыс линии (94 особи) обоего пола начальной массой 180 - 200 г, у которых моделировали процесс свободнорадикального окисления путём однократного внутрижелудочного введения смеси полихлорированных дифенилов «Со-вол» в растворе оливкового масла в полулетальной дозе 0,1мг/кг. Оценивалась эффективность действия специфических органических компонентов пелоидов при парентеральном и пероральном введении в дозе 1,0 мг/кг.

Установлено, что для коррекции метаболических нарушений при острой интоксикации ПХД могут быть использованы все фракции гуминовых веществ пелоидов. Выполняя роль антитоксикантов, они на третьи сутки повышают антиокислительную защиту организма экспериментальных животных, снижая интенсивность свободнорадикального окисления.

В ходе эксперимента было установлено, что показатель общей антиокси-дантной активности животных повышался в ряду гуминовых веществ: фульвовые, гуминовые, гумусовые, гиматомелановые кислоты. При использовании фракции фульвовых кислот пелоидов наблюдалась тенденция к повышению ОАА плазмы крови. Гиматомелановые кислоты пелоидов повышали ОАА на 32,33% (р<0,02), гуминовые кислоты повышали ОАА на 15,8% (р<0,005) при парентеральном введении и на 27,47% (р<0,005) при пероральном введении, по сравнению с контролем.

Однократное парентеральное введение компонентов гуминовых веществ пелоидов так же привело к восстановлению значений основных показателей антиокси-дантных ферментов, при этом активность возрастала в ряду: фульвовые, гумусовые, гуминовые и гиматомелановые кислоты (рис. 10). В плазме крови при введении гуминовых веществ пелоидов снизилась концентрация трансаминаз, что свидетельствует об их возможном гепатопротекторном действии.

Рис. 10. Влияние гуминовых веществ пелоидов на активность СОД, ГПО, каталазы и трансаминаз

Активность супероксиддисмутазы

Активность каталазы

я 3 сутки ■ 10 сутки

Активность трансаминаз

Н°Р"» совол „

ГМК

Влияние специфических органических компонентов пелоидов на метаболические показатели в модели гемолитической анемии

Изучение активности специфических органических компонентов пелоидов на метаболические процессы в модельной системе гемолитической анемии проводилось на инбредных мышах линии BALB/c (274 особи) обоего пола начальной массой 50 - 60 г. Гемолитическую анемию вызывали путём внутрибрюшинного введения фенилгидразина гидрохлорида в суточной дозе 30,0 мг/кг в течение двух дней. На 5 день после последней инъекции фиксировался пик анемии (Fisher Sei. Co.). Были сформированы интактные и анемизированные группы экспериментальных животных. Растворы специфических органических веществ пелоидов вводили внутриже-лудочно объемом 0,2 мл с концентрацией вещества 2,0 мг/кг массы животного.

Установлено, что ежедневные внутрижелудочные инъекции физиологического раствора и инъекции компонентов гуминовых веществ пелоидов интактным животным вызывали незначительные изменения в составе их периферической крови, представленные увеличением числа лейкоцитов. Эти изменения, по-видимому, являются неспецифической реакцией мышей на эмоционально-болевой стресс, и носят компенсаторно-приспособительный характер.

Внутрижелудочное введение фракций гуминовых веществ пелоидов определило ход течения экспериментальной анемии в благоприятную сторону. У анемизи-рованных животных к концу 1 недели, после пика анемии, наблюдалась явная динамика улучшения состояния организма, а к концу 30-х суток полная нормализация (р<0,05) гематологических параметров: форменные элементы крови животных были

представлены эритроцитами в количестве 6,38±0,5 * 1012 клеток/л; лейкоцитами в количестве 8,76±0,5 * 109 клеток/л.

Показатель общего билирубина плазмы крови при введении гуминовых, ги-матомелановых и гумусовых кислот пелоидов возвращался к значениям физиологической нормы к 21 суткам эксперимента (р<0,05), и составлял 7,5±0,5 мкмоль/л. При введении фульвовых кислот нормализация параметров общего билирубина пропе-

то билирубина у анемизированных животных

Необходимо отметить, что дополнительная профилактическая доза фракций фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов за 3 дня до моделирования гемолитической анемии создаёт более выраженный терапевтический эффект, повышая устойчивость организма экспериментальных животных к поражениям продуктами метаболизма гидразинов.

Влияние специфических органических компонентов пелоидов на метаболические показатели в модели диабета

Исследование активности специфических органических компонентов пелоидов на метаболические процессы в модельной системе диабета проводилось на ли-| нии аутбредных крыс линии Wistar (159 особей) обоего пола начальной массой 180 - 200 г. Длительность наблюдения за животными составляла 14 суток. Оценка эффективности фракций пелоидов осуществлялась по показателям выживаемости, изменения массы тела, гликемии.

Моделирование диабетического состояния проводилось двумя методами: ал-локсан-индуцированный диабет моделировался путём однократного подкожного введения 140 мг/кг раствора аллоксана; стрептозотоцин-индуцировнный диабет моделировался путём трехкратного внутривенного введения стрептозотоцина в разовой дозе 30 мг/кг с интервалом в 24 часа. Растворы специфических органических

веществ пелоидов вводились в дозе 10 мг/кг однократно внутримышечно в первые сутки от начала диабета.

Установлено, что введение всех фракций гуминовых веществ экспериментальным животным с аллоксан-индуцированным диабетом определило более благо-

козы крови при аллоксан-индуцированном диабете

Наибольшую антитоксическую активность проявили гиматомелановые кислоты. Уровень глюкозы крови при введении данной фракции вернулся к нормальным параметрам уже на 12 сутки (р<0,05). Само развитие диабета, при введении ги-матомелановых кислот, характеризуется затуханием с 7 суток (р<0,02) от начала введения аллоксана, что отражает уровень гликемии крови. Такое высокое антидиабетическое действие гиматомелановых кислот пелоидов может быть связано как с протективным эффектом к инсулоцитам, так и с антитоксическими свойствами.

При введении гуминовых, гумусовых и фульвовых кислот пелоидов экспериментальным животным наблюдалась тенденция к снижению степени гипергликемии относительно контрольных значений, причём разница для фракций гумусовых и фульвовых кислот пелоидов составляла порядка 14-15% (р<0,07), а для фракции гуминовых кислот - 18-20% (р<0,05) на всем периоде смоделированного диабетического состояния.

Введение растворов гуминовых веществ животным со стрептозотоцин-индуцированным диабетом в 1-е сутки не вызвало улучшения состояния в течение недели. Уровень глюкозы крови находился в пределах 18-20 ммоль/л (р<0,05) (рис. 13).

Начиная со второй недели эксперимента, уровень глюкозы крови животных в среднем снижался на 31,3% (р<0,05) от контроля. Это снижение, по-видимому, вы-

звано активацией эндогенных ресурсов организма экспериментальных животных под действием специфических органических веществ пелоидов.

25 20 1

І І 5 10

и

3 Ь / У 11 13 Сутки —•—здоровые животные —»—контроль —л—ГК -ГМК ——ГсК —•—ФК

Рис. 13. Влияние фракций гуминовых веществ пелоидов на показатель глюкозы крови при стрептозотоцин-индуцированном диабете

В основе стрептозотоцин-индуцированного диабета лежит механизм активации фермента полиАДФ-рибозосинтетазы, что приводит к некрозу инсулоцитов. В связи с этим, образование активных форм кислорода и процессы перекисного окисления липидов, протекающие при аллоксан-индуцированном диабете, не характерны для данного вида диабета, и поэтому антиоксидантная активность гуминовых веществ в данной модельной системе не оказывает своего влияния.

По данным показателей модельных диабетических состояний можно заключить, что основными путями антидиабетического действия гуминовых веществ пелоидов является протективная активность в отношении инсулоцитов поджелудочной железы, высокая экзогенная антиоксидантная активность и способность к активации собственных систем эндогенной защиты организма.

***

На основе всей совокупности полученных экспериментальных данных можно утверждать, что гуминовые вещества пелоидов обладают высокой метаболической активностью. Они выполняют уникальную функцию по поддержанию постоянства состава биосистем на организменном, клеточном и субклеточном уровнях, способствуя восстановлению физиологических функций при патологических состояниях и в экстремальных ситуациях.

ВЫВОДЫ:

1. Специфические органические компоненты, выделенные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, по совокупности результатов элементного, фотометрического и спектроскопического анализа относятся к группе гуминовых веществ. По степени окисленности, коэффициенту цветности, элементным отношениям водорода, азота, кислорода к углероду установлено существование генетического ряда гуминовых веществ пелоидов: фульвовые, гиматомелановые, гуминовые и гумусовые кислоты, характеризующегося как общими, так и специфическими свойствами.

2. Компоненты гуминовых веществ пелоидов, на основании ИК- и масс-спектров, состоят из смеси супрамолекулярных комплексов, в структуре которых содержится хинон-бензойное ядро и жирнокислотная периферическая часть с ли-пид- и протеин-подобными участками. Предложенная мицеллярная модель строения гуминовых веществ отражает структурные особенности специфических органических компонентов пелоидов, обладающих биологической активностью.

3. Гуминовые вещества пелоидов обладают выраженной каталитической активностью, что демонстрирует их высокий биохимический потенциал. Каталитическая активность возрастает в ряду фульвовых, гиматомелановых, гумусовых и гуминовых кислот пелоидов. Активность гуминовых веществ пелоидов определяется суммацией ферментативного и неферментативного катализа.

4. Специфические органические вещества пелоидов оказывают влияние на показатели клеточного метаболизма, что установлено в модельных экспериментах in vitro, при этом они защищают плазматические мембраны клеток от действия токсических агентов, выступая как цитопротекторные факторы.

5. Специфические органические вещества пелоидов in vivo обладают метаболической активностью, которая проявляется в виде антитоксического эффекта, направленного на продукты метаболизма полихлорированных дифенилов, гидразинов, аллоксана и стрептозотоцина, тем самым нормализуя смоделированные состояния окислительного стресса, гемолитической анемии и диабета у исследуемых групп животных.

6. Изучение влияния специфических органических компонентов пелоидов на метаболические процессы в условиях in vivo показало, что наиболее активной фракцией в генетическом ряду гуминовых веществ пелоидов являются гиматомела-новые кислоты. Для этой фракции характерна высокая метаболическая активность, проявляющаяся в способности возвращения к физиологическим параметрам катала-зы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, показателя общего билирубина и глюкозы плазмы крови исследуемых групп животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. На основании комплекса полученных данных, целесообразным с медицинской точки зрения является использование преформированной пелоидотерапии в виде препаратов на основе фракций фульвовых, гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот, что позволит сделать лечение дозированным и более доступным для пациентов.

2. При оценке источника получения лечебных грязей рекомендуется включить в нормативно-техническую документацию идентификацию специфических органических компонентов пелоидов масс-спектрометрическим методом.

3. Установленный in vitro цитопротекторный и пролиферативный эффект фракций гиматомелановых, гуминовых и гумусовых кислот пелоидов рекомендуются к дальнейшему исследованию с целью усовершенствования методик клеточной биоинженерии.

4. Выявленное в экспериментах in vivo антитоксическое действие фракций гуминовых веществ пелоидов по отношению к продуктам метаболизма полихлорированных дифенилов, гидразинов, аллоксана и стрептозотоцина рекомендуются к

дальнейшему исследованию в клинике, как метод преформированной пелоидотерапии.

5. Описанная в работе метаболическая активность в ряду гуминовых веществ является основой более глубокого понимания их действия на организм человека, как фактора окружающей среды. Результаты работы рекомендуются к использованию в практической деятельности санитарно-эпидемиологической службы РФ и в учебном процессе, при подготовке специалистов медико-биологического профиля.

Список работ автора, опубликованных по теме диссертации:

1. Аввакумова Н.П. ИК-спектроскопическое изучение гуматов магния и серебра пелоидов / Н.П. Аввакумова, М.А. Кривопалова, Ю.В. Жернов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - Самара, т. 12, №1(8), 2010.-С. 2003-2006

2. Аввакумова Н.П. Симультанный эффект природных гуминовых кислот как фактор их применения в фармакопрофилактике и фармакотерапии отравлений производственными ядами / Н.П. Аввакумова, Ю.В. Жернов // Традиционная медицина. Научно-практический журнал. №5. 2011 - М.: ООО «Фастинфосер-вис», 2011.-С. 321-325

3. Жернов Ю.В. Анализ цитотоксичности гуминовых веществ пелоидов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - Самара, т. 13 (39),№1(8), 2011.-С. 1996-1998

4. Аввакумова Н.П. Влияние гуминовых веществ пелоидов на процессы свобод-норадикального окисления / Н.П. Аввакумова, A.B. Жданова, М.Н. Глубокова, Ю.В. Жернов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - Самара, т. 13 (39),№1(8), 2011.-С. 1960-1963

5. Аввакумова Н.П. Влияние гуминовых кислот пелоидов на Daphnia magna в условиях экологического стресса / Н.П. Аввакумова, М.А. Кривопалова, A.A. Аввакумова, Ю.В. Жернов. М.П. Куплинов // Аллергология и иммунология. -М.: Том 7, №1,2006.-С. 163

6. Жернов Ю.В. Сперматопротекторное действие гуминовых кислот пелоидов при вторичном металлоиндуцированном бесплодии мужчин // Вестник Российского государственного медицинского университета. Периодический медицинский журнал. - М.: ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. - 2008, №2 (61). - С. 26

7. Жернов Ю.В. Пелоидотерапия гуминовыми кислотами при фенилгидразинин-дуцированной гемолитической анемии // Материалы Всероссийской 67-й итоговой студенческой научной конференции им. H.H. Пирогова. / под ред. В.В. Новицкого. - Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2008.-С. 374-376

8. Жернов Ю.В. Влияние гумусовых веществ пелоидов и их хелатных комплексов на рост и развитие грибов Candida albicans // Современная микология в России. Том 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. - М.: Нацирнальная академия микологии, 2008. - С. 291-292

9. Жернов Ю.В. Детоксикационная активность гуминовых веществ низкоминерализованных иловых сульфидных грязей // Украинский Научно-Медицинский Молодёжный Журнал. Научно-практическое издание. - Киев, №3, 2008. - С. 116-117

10. Аввакумова Н.П. Основные аспекты сперматопротекторной пелоидотерапии гуминовыми кислотами в послеоперационном периоде гемикастрации / Н.П. Аввакумова, Ю.В. Жернов // Актуальные вопросы современной хирургии. -Красноярск: ООО «Версо», 2008 - С. 12-14

11. Жернов Ю.В. Изучение антиоксидантного эффекта гуминовых кислот пелоидов при приобретенной гемолитической анемии // Кислород и антиоксиданты. Выпуск 1. - Волгоград, 2009. - С. 73-74

12. Жернов Ю.В. Влияние гуминовых веществ на водные экосистемы: два взгляда на проблему / Ю.В. Жернов, Н.П. Аввакумова, М.А. Кривопалова // Вестник Казахского национального университета. Серия химическая. - Алмата, №4(60), 2010.-С. 39-44

13. Zhernov Y.V. Chemotherapeutic effect of humic substances low mineralized silt sulphide muds on pathogenic and opportunistic microorganisms // Abstracts First International Conference on Humics-based Innovative Technologies «Natural and Synthetic Polyfunctional Compounds and Nanomaterials in Medicine and Biomedical Technologies» - M.:, Lomonosov Moscow State University, 2010 - P. 47

14. Аввакумова Н.П. Перспективы создания «умных лекарств» на основе фармако-форов природных высокомолекулярных органических соединений / Н.П. Аввакумова, Ю.В. Жернов // Всероссийская научно-практическая конференция «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты»: сборник материалов / Под редакцией академика РАМН, профессора Г.П. Котельникова. - Самара: ООО «Офорт»; ГОУ ВПО Миндздравсоцразвития России, 2011.-С. 155-156

15. Avvakumova N.P. Pharmacochemical approach to the medical use of humic substances peloids / N.P. Avvakumova, Y.V. Zhernov // XIX Mendeleev Congress on general and applied chemistry. Four-volumes book. Vol. 1: abstracts. - Volgograd: Publishing house of education-scientific literature of VSTU, 2011. - P. 466

16. Жернов Ю.В. Перспективы разработки химиотерапевтических препаратов на основе гуминовых кислот пелоидов // Инфекционные болезни. Научно-практический журнал Национального научного общества инфекционистов. Материалы II Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням - М., том 8. приложение № 1,2011. - С. 111

17. Жернов Ю.В. Средство природного происхождения для лечения инфицированных ран на основе хелатокомплекса гуминовых кислот пелоидов с ионами серебра / Ю.В. Жернов, Н.П. Аввакумова, А.В. Жданова// Удостоверение на рационализаторское предложение № 122 от 01.02.2011 г. - Самара, ГБОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

AJIAT - аланинаминотрансфераза АМФ - аденозинмонофосфат АСАТ - аспартатаминотрансфераза АТФ - аденозинтрифосфат ПС - гуминовые кислоты ГМК - гиматомелановые кислоты ГПО - глутатионперокидаза ГсК - гумусовые кислоты ЛДГ - лактатдегидрогеназа

МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид НАД - никотинамидадениндинуклеотид

НАДН - восстановленная форма никотинамидадениндинукпеотида

ОАА - общая антиоксидантная активность

ПХД - полихлорированные дифенилы

СОД - супероксидцисмутаза

ФК - фульвовые кислоты

INT - 2-(4-йодофенил)-3-(4-нитрофенол)-5-фенилтетразолия хлорид

Подписано в печать: 30.01.2012 Формат: 60x84 V^. Бумага офсетная 80 гр. Печать оперативная. Объем: 1,0 усл. печ. л. Тираж: 100 экз. Заказ № 652 Отпечатано в ООО «Издательско-полиграфический комплекс «Право» 443080 г. Самара, ул. Санфировой, д. 95