Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика эритроцитарных ротавирусных препаратов, приготовленных на основе иммуноглобулинов различного видового происхождения

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика эритроцитарных ротавирусных препаратов, приготовленных на основе иммуноглобулинов различного видового происхождения"

РОССИЙСКАЯ АВДЕШЯ 1ВДИЦИНСШ НАУК

ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ

РГи I.

- | эддд На правах рукописи

СЕИТНЕВА НАТАЛЬЯ НИКОЛАЕВНА

СРАБНИТЕЛЫАЯ ШЖГШСТИКА ЭИТРОВДГАРШХ РОТАБКРУСШ ПРЕПАРАТОВ, ПРИГОТОВЛЕННЫХ НА ОСНОВЕ ЖШГОГЛОШИЕОВ РАЗЛИЧНОГО БВДОВОГО ПРОЖЖВДЕНИЯ

03.00.06. - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993 г.

Работа выполнена в Екатеринбургском научно-исследовательском институте вирусных инфекций Государственного Комитета по санитарному надзору при президенте России.

Научный руководитель : Кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник С.Ф.Закирова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

В.А.Казанцева

доктор биологических наук профессор

В.В.Г^ненков

Ведущая организация: Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ

Защита диссертации состоится 1993 г.

в 10 час на заседании специализированного совета Д.001.27.01. при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН России . по адресу: 142782, Московская область, Ленинский район, п/о Института полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН.

Автореферат разослан «^£$/€¿¿¿¿¿1. 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

кандидат биологических наук 0.А.Уедведкина

Актуальность проблемы. По данным Всесоюзной организации здравоохранения, в развивающихся странах ротавирусы являются причиной 50-60 % острых кишечных заболеваний, а по материалам, отечественных исследователей (Дроздов с.г. с соавт.,1982; бук-ринская Л.Г. с соавт.,1982) до 80 % случаев детских диарей в период зимнего подъема заболеваемости обусловлены ротавирусами.

В этой связи становится очевидной все более возрастающая роль лабораторных исследований в расшифровке небактериальных гастроэнтеритов и, соответственно, вопросы дальнейшего совершенствования методов диагностики.

Для изучения различных аспектов ро-гавирусных инфекций предложен широкий арсенал средств и методов диагностики, однако, многие из них, в силу ряда причин, не нашли широкого применения з отечественной лабораторной практике. Еакным условием широкого внедрения лабораторных тестов, наряду с экспрессностьто и чувствительностью является доступность метода и обеспеченность его коммерческими препаратами. К числу простых в постановке и экономичных экспресс-методов диагностики монет быть отнесена реакция непрямой гемаггяютинашш (РИГА) (йанекаЬ Т. (.t.oit, 1979; Ok&ci^ к. it.aC.,1984), диагностические возможности которой немногим уступают таким высоко чувствительным методам, как иммуноферментный анализ (ША) и иммунная электронная микроскопия (ИЗМ) (Горбачев E.H. с соавт.,1987; Васильев Е.Я. с соавт.,1587).

Специфичность и чувствительность тест-систем, в том числе и эритроцитарннх, зависит от качества реагентов, составляющих конкретный препарат. Дпя конструирования диагностикумов, необходимым условием является и подбор оптимальных параметров взаимодействия реагентов. Однако, многие теоретические и .прикладные аспекты конструирования эритроцитарннх ротазпрусшх- дяагности-кумоэ остаются еще не изученными. Отсутствуют сведения' о некоторых функциональных свойствах иммуноглобулинов (ИГ) различного видового происхоздения; практически не изучены сорбционнке свойства иммуноглобулинов из желтка яиц кур; недостаточно изучены вопросы, касающиеся гемосенснтивной активности антиротавирусных . ИГ в зависимости от способов их выделения.

Разрешение этих вопросов способствовало бы дальнейшему совершенствованию средств и методов лабораторной диагностики и, в частности, технологии изготовления и внедрения эритроцитарннх диагностикумов.

-Цель а задачи исслеяовякзя. Целью настоящей работа явилось 'изучение условий я особенностей взаимодействия эритроцитов с ИГ различного видового происхождения и, на этой основе, конструирование эритроцитарных ротавирусных Еза/унодвагпостакуков (ИД) с использованием препаратов-ИГ от млекопитающих (крыс, кроликов) к птиц (кур).

Для достижения цели были определены следующие задачи:

1. Получение и оценка ротавирусных имцунных препаратов;

2. Сравнительное изучение качества..!^: и количественных характеристик препаратов Iff, полученных от животных различного вида}

3. Изучение влияния некоторых физико-химических факторов на свойства КГ;

4. Подбор оптамальнах условий сенсибилизации эритроцитов препаратами ИГ различного видового происхождения;

5. Изучение чувствительности и специфичности эрятроцитарннх рбтавирусных препаратов, полученных на основе ИГ кроличьего, куриного и крысиного происхождения;

6. Изучение диагностической ценности эритроцитарных ротавирусных диагностикуыов, приготовленных на основэ ИГ келтка яиц кур.

Основные положения, выносиуне m залитт. - Обосногана возможность использования ИГ класса У из селтка яиц кур в качестве сенситина для приготовления эратроцитарккх ротаБирусных ямыуно-диагностнкумов.

- Определены технологические параметры, конструирования зритроца-тарных диагностнкумов на основе ИГ из желтка яац кур.

- Зритроцитарные препараты, приготовленные из JET класса У желтка яиц кур, не уступают по специфичности юадукодаагкоотикумам, со-дершщш ИГ класса € клекопатавдих (кроликов, хрнс) и превосходят их по чувствительности.

- Высокий процент совпадений положительных к отрицательных результатов с референтными методами (ИМ - 33 %, ИЗ;,; - 85 %) свидетельствуют об эффективности РИГА, как метода зкспресс-диагноа-тики ротаазруоша заболеванкй.

- Диагностикуш для РИГА, приготовленные ка основе 1С1 гелию яиц кур, внедрены в практику здравоохранения.

раучная новизна. Впервые изучена и представлена сравнительная характеристика некоторых функциональных свойств ИГ, полученных от животных различных биологических видов (кроликов, крыс и КУР).

Впервые изучена сенситивные свойства антиротавирусннх ИГ нз желтка яиц иялуяизировакных кур. Показано, что популяция антител (АТ) из желтка шщ яиц кур по признаку сорбции на эритроцитах является более однородной ао сравнению с иммуноглобулинами класса б сыворотки крови кроликов и ишунно* асцитическоЁ жидкости крыс.

Впервые разработаны технологические параметры и сконструированы эритрояатарные ротавирускые даагностикуш с применением ИГ класса У желтка яиц зсур.

Практическая значимость.

1. Разработана, офориена и утверждена нормативно-технологическая документация ка изготовление "Нммунодаагностикума эритроцита рного ротавируснсго сухого для РИГА и РТНГАИ;

- Эксперянентально-проязводственшй регламент № 384-92 (утвержден 22 изоня 1992 г.);

- Вроиекная фарлахопейная статья ВФС 42-3503С-92 (утверждена 30 июня 1992 г.);

- Инструкция по применению "И'ялунодиагностикука эритроцитаркого ротавирусного сухого для РдГА и РТНГА" (утвервдена 22 нюня 1992г.).

2. Изготовлено 136 экспершентаяьяс-произЕсдственных серий "^ммунодяагиостикуш эритропдтарного ротавлрусного сухого для РИГА и РТНГА".

3. Эксперлмектально-производственвде серии "Кмыунодиагкос-тяхума эрлтроцигасного ротавируснсго сухого для РИГА и РТНГА" апробированы в вирусологических лабораториях 27 облаете! Россия, а таккэ в вирусологических лабораториях Украикн, Киргизии, Узбекистана (12 актов внедрения представлено в "Прялскекки'' к диссертационной работе).

4. Разработана и утверждена нормативно- технологическая документация на стандартный образец сыворотки ротавирусноЗ. (ОСО 42-28-195-92 - 1992 г.).

5. Подготовлены, оформлены и отправлены на согласование в Проблешш! центр ЗМВПИЗ (нсх.№ 03/482 от 11.09.1992 г.) Метода-

частив рекоиендадиг "Программа эпгдешологичеежого надзора за ро-тавирусными инфекциями" г.ккатеранбург, 1992 г. / Составители: Бенедиктова Н.Я., Пацух Н.Б., Захарова С.Ф., Сбитнева H.H., Вяо-ва Т.Н., Власова Л.В. и др.). Методические рекомендаций рассмотрены и одобрены Ученым"Советом ЕНИИВИ (протокол Я 7 от 28.08.92г.)

6. В научных исследованиях ЗШШ внедрено 5 рацпредложений (Ш 356,374,375,384,388).

Апгобаыня работы. Основные результата и положения диссертации доложены на 5 конференциях Свердловского научно-исследовательского института вирусных ин$екшй (1987,1988,1989,1990 и 1991 гг.), из наг на 2-х конференциях республиканского уровня; - на конференциях молодых ученых СНКЙШ а Свердловского государственного медицинского института (1986,1987,1988); - на конференции колодах ученых Ленинградского ШИЗУ им Ласт ера (1988 г.); -ка ЭсесоюзноЗ конференции "Проблемы биотехнологии иммунобиологических и трансфузиоишх препаратов" г.Новосибирск (1988 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Обьем и структура работы. Диссертация изложена на 2Q9 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 рисункаш и 26 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания материалов к методов, экспериментальной части (5 глав), Заключения, выводов и списка литературы, содержащего 328 источников (181 отечественных я 147 зарубежных авторов).

СОВСТВЕШЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ риалн и М9Т9ЛР t.

Вирус». Использовали ротавирусы обезьян (штамм 5А-11), телят (шта",«м a'Cov )и знтеровирусн: полиомиелита 1,П,Ш типов; Ког-саки ВЗ; ECHO II, полученные из государственной коллекции вирусов Института вирусологии им.Ивановского и из музея вирусов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАЫЕ.

Клеточные культуры. Использовала клетки почек зеленой мартышки (ШМ), полученные из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН; перевиваемые клетки эпидерлоидной жарпдноыы гортани человека (Нер-2); слетки саркомы яичника крыс (штамм "ОН") использовали для индуцирования асцктическо! жидкости у крыс к

получали из банка клеточках культур Свердловского НШ вирусных инфекций.

Лабораторная жявотвдз, В качества продуцентов АТ использовала: 12 кроликов породы "Еинашла1* весом 2-2,5 кг; 28 белых беспородных крыс весом 180-250 г; 8 кур-несуиех породи "Леггорн" в возрасте 20-22 недель.

йммуназашю жязотшх проводили ротаварусом обезьян (штамм

0 А-11), полученным путей гонцекграрования хультуралъной взруссо-деркащей жидкостй одним из методов: ультрацентрг-фугароваккен; по-лиэтвяенглпколем с м.м. 6000; гель-бентонитом с последующей очжс-txoí Фреоном 113. При всех используемых схемах иммуназапяи, концентрация белка вводимой. варуссодерскащей жидкости не престала

1 иг на 1 яг живого веса.

В работе использовали «коротки крови кроликов, тамуноасги-тическиэ жидкости кркс (1Ш) и -келточнут) массу куриного яйца, полученные до и после цикла иммуннзациа етвотных ротавирусом, а также коммерческие итшунше сыворотки ж полвовяруеам,ЕСН0, вирусам Кокеаси ВЗ.

Эритроциты барака фиксаровата формальдегидом по методу lbfi»éa4 (1958).

Реакции непрямой гевгахтлотинация (РНГА) и реакцию торыохения непрямой гемагглютинащщ (РТКГА) проводили миэсрометодом на панелях набора Такачи по методу 'Затровой С.Ф. я др. (1987).

Для оценки диагностической эффективности РИГА была использованы методы: Электронной микроскопии (препараты готовила мвтодру ^дотации на» свтхах, покрытых $%>ргааровой подложной); КммуннрД электронной микроскопия (по иетодихе Дроздов С,Г. к др. ,19.82; 9 использованием стандартной антиротавирусной сдаорода крои ;>ротг лика); Иммуноферкентного анализа (с использованием идщврце^щ)^ тест-еистемн "Р0ТА-А1ГГ15ГЕН", производства ЩИЗМ ам/Пастара)} Реакции коагглюти?ащи (по методике Белая Ю.А. ,1985)(РКОА),

Для. изучения злектро^оретлчеекой подвихностя е фракционного состава иммунных препаратов использовали вертикальный электрофорез в полаакрялакидном геле (ЗФ ДААГ) по методу £>¿»(.-¿¡>.6.(1964).

Статистическую обработку проведал?, в соответствии с рекомендациям (Ашмарян И.П. ,1962; БеОлг Н. ,1964; Поляков И.В. ,1975; ■ íiauii^cnf/ &., 1984). Результаты изучения диагностической ценное-

. - 7 -

те ШГА. оце.тавала со иетоду ЫЛ O-abt (1956), прикяв за эталонный метода ОМ, ИЭМ и ИФА. О чзьагг-'.?акь:юстк РИГА, по сравнению со стандартными методами судили по числу совпадения полояатедь-нкх результатов из общего числа позитивных находок стандартного метода. Совпадение отрицательных, полученных с помощью РИГА из общего количества негативных результатов стандартного теста, свидетельствовало о специфичности оцениваемого метода. Эффективность РНГА по сравнению с методами ЭМ,ИЭ!Л и ИФА оценивали по количеству положительных результатов из общего числа обследоЕанкых данными метода!®. О диагностической эффективности РИГА судила по суммарное числу лолояительных и отрицательных совпадений с результатами стандартных методов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1» Получение п опенка ротазяруоннх иммунных препаратов. Биа изучена кинетика образования и уровень AT в зависимости от звдакикмунногв сырья'Ч снзорэтка крови, ИАЖ, галточная масса яйца), продуцентами которого служили крысы, кролики ж куры.

В'работе использовали схеш иммунизации, отличающиеся по способу, кратности зводишге животным ротавируса обезьян (штамп SA-il) и интерзалами ыеаду его введениями.

Независимо от способа иммунизация уже на 7 сутки после первого введения ротавйруса курам и кроликам были выявлены антирота-вируенце AT. В дальнейшем,колебания уровня анткротавируокых AT находились в зависимости от схеш иммунизация. Установлено, что увеличение интервалов и езду перш»! и вторыи введением ротавкруса до 2-3 недель оказывает стикулируащее действие на уровень AT, чем частые жгуназ'аторнне раздражения.

Максимальный уровень AT в прпарятах, полученных от крыс не прешла* 10-11 .тогда как в сыворотках крови кроликов,- достигая 14,3 ¿ccjj*

Установлено, что в желтках яиц кур специфические к ротавн-русу AT появлялись на 3-5 дней позке, чей в сыворотках крови, однако уровни их были равны. Б литературе представлены противоречивые сведения о соотношашги специфических АЪ в желтках яиц и сыворотке крови кур. По данным (Lote , содержащие-

ся в желтках явд AT икеюг более высокиЭ уровень, чем в сыворотках крови. Но материалам fyiUMelt e/, ^;(lS70), уровни AT в

желтках яиц составляли от 13 до 100 % от уровня АТ в сыворотках крови.

Установлено, что оптимальной для всех видов животных явилась схема иммунизации, включающая 3-4 краткое введение ротавирусов с интервалами между введениями в 2-3 недели.

Показано, что использование кур е качестве продущентов специфических АТ экономически оправдано, поскольку от одной курицы в течение месяца можно получить количество "иммунного сырья" рав- ' ное сыворотке кровиголуч-сглой при тотальном заборе от 20 кроликов, что сникает затраты на содержание животных , а также получение вируса для ишунпяации.

2.Сравнительная характеристика некоторых свойств иммуноглобулинов различного видового происхождения, Ддя выделения 1Т~были использованы 4 способа: осаждение декстран-сульфатом СГгиле-

А1; 1981); Осаждение сернокислым аммонием (Иммунологические методы, 1987); преципитация полнэтиленгликолем (РсСюп et.pt., 1985); фракционирование этанолом на холоду (Со£м Е.З., 1950).

Для получения препаратов ИГ, сыворотку кровк кроликов, ИА2 . крав и желтки яиц кур (так называемое "иммунное сырье") объединяли в пулы, соответственно виду животного и дс-лили на "аликЕОТы",. Ддя Еыделенкя КГ различишь методами использовали одинаковое количество "иммунного сырья". Осадки, полученные при осаждении ИГ различными способами, растворяли в одинаковом объема 0,9 % раствора хлорида натрия. Каждое выделение проводили не менее, чем в 3-4 повторностях. До я после процедуры выделения ИГ определяли концентрацию белка я уровень специфических АТ в РШГА. По этим показателям и злектрофоретической характеристике выделенных ИГ судили об эффективности способов выделения ИГ.

Сравнение способов выделения показало, что для получения ИГ, независимо от видовой принадлежности "иммунного сырья" пригодны 'методы преципитации полиэт-иленгляколеи, осагденяя сернокислЕм-аммонием или этанольного фракционирования. В наших условиях преципитация ИГ декстран-сульфатом была не эффективной, так как ан-тигенсвязывавдая активность полученных этим способом препаратов ИГ пс сравнению £ "тсунннм сырьем" снижалась на 3-4 , а концентрация белка - в 30- 42 раза.

Электрофоретяческий анализ ИГ, полученных различными методгаа

показал, что препараты ИГ, наделанные этакольнш способом характеризовались больней однородностью белкового состава, тогда как при осазденаи сернокислым аммонием и ПЗГ, наряду с ¡f -глобулинами, в препаратах ЯГ присутствовали <С~ ж р - глобулины,

Установлено, что препараты ИГ, полученные из одного пула "иммунного сырья", независимо от способов выделения,характеризовались оданакоБым уровнем антигонсвязывапцвй активности (различия не превышали 1,0

Результатами опытов по определенна /ровня антягелсвязываю-щей активности на единицу белка - удельная специфическая актив- ' кость препаратов ИГ (УСА), подтвердили нале предположение о том, что концентрация белка не может слукить критерием отбора иммунных препаратов^ рис.1),

Изучение электрофорегических характеристик "иммунного сырья" показало, что белковый состав в препаратах различного видового пронсходцешгя был неодинаковым.

Методом 3& ПЛАТ было показано наличие одинакового количества белковых зон к одинаковую скорость миграция белков в препаратах, принадлежащих одному виду животных (сыворотка крови и ЩИ крыс).

Желточная масса куриного яёца ара ЭФ ПААГ разделялась толь-•ко на_ 4 белковые гоны, в отличие от сывороточных препаратов кур, имеющих 7 белковых фракций. По-видимому, это обусловлено тем, что препараты ИГ из желтка яиц кур содержали неполны® набор Л - ж ^-глобулинов. При этом альбуминовая фракция была ниже, чем в сывороточных препарата*. Поскольку подобных сведений в доступной нам литературе не обнаружено, целесообразно дальнейшее изучение фракционного состава препаратов ИГ из желтка яиц кур.

Установлено, что в процессе очистки иммунных препаратов этанолом специфическая активность в промежуточных продуктах существенно не снижалась. Уровень антпгеисвязывающе® активности фракций </-и ,/в-глобулинов характеризовались низкими показателями специфическая активности.

Гемосеяситивку» активность препаратов ИГ оценивает: со двум показателям: величине титра специфической активности ИД и антЕген-связываадей активности АТ, не связавшихся с эритроцита?.® в процессе сенсибилизации.

Вио показано, что в отличие --от препаратов ИГ-8 сыворотки крови кроликов и ИАЖ врио, препараты ИГ-У из желтка яиц кур в большей степени сорбировались на эритроциты, поскольку не связавшиеся с эритроцитами АТ выявлялись в минимальных титрах, тогда как

Показа-

тель

УСА

14,0 13,0 12,0 11,0

15,0

XX,и

10,0 ¡0,0

10 П

-1

2 .

3

4

"Способ выделения КГ

Вяс.1. Сравнительная характеристика антагенсвязнзакцей активности препаратов ИГ, полученных от животных различного вяда.

(все препараты 1'1Г имели одинаковую концентрацию белка - 0,7 иг/мл).

Условные обозначения: щ - препараты .'Л? из желтка яша кур □ - препараты ИГ из сыворотка крови крс'_:::тов О - препараты ИГ из ЙАЖ крыс.

остаточные после сенсибиллзацяд эритроцитов АТ сыворотка крови кролякоз сохраняли антигенсвязнвакщие свойства.

3. Научные оснота конструирования тотавирусннх эриттопатату-ных иммтнодиагностикумов. Рациональный подбор параметров сенсибилизации относится к числу важных элементов оптимизации технологии производства эритроцитарнкх препаратов, чувствительность к специфичность которых зависит от совокупности физико-химических факторов, влияющих как на сенситин я эритроциты, так и на процесс их взаимодействия.

Выявлена прямая зависимость повышения гемосенситивно^ активности всех видов ИГ от температуркой предобработки (агрегации ИГ) от 37° до 65°С и ее продолжительности от 10 до 120 минут. Установлено, что для повышения активности препаратов ИГ большое значение имеют ионные показатели среды. Оптимум температурного воздействия

находился в узком диапазоне рН среда (от 5,0 до 6,0), однако, дальнейшее прогревание ИГ до 70°С приводило к неспецидлческой аг-

- и -

глготинадЕЕ эритроцитов в РКГА.

С помощью реакции непрямой кммунофяюорзсценпди была показана зависимость размеров агрегатов белковых молекул препаратов КГ от температурного режима кх предобработка. С увеличением температуры и продолжительности обработка препаратов ИГ на поверхности эритроцитов форшроэались крупные агрегаты, которые распределялись в виде крупшх светящихся "гяыбок". Прогревание препаратов ИГ до 70°С лрнводидо к. укрупкешш светящихся конгломератов.

Известно, что повышение сорбционных и специфических свойств подвергнутых термсобработе препаратов ИГ, может быть обеспечено лишь при условия их агрегирования в виде определенных стерическпх форы - "треноги". Поскольку,в процессе прогревания образуются агрегаты различной величины, била предпринята попытка получения агрегатов средней величины с помощью ультразвуковой дезагрегации. Использование г, качестве сенсятина препаратов ИГ, агрегированных к обработанных ультразвуком при частоте 20-22 кГц/сек в течение 2- ьшгут, повышало активность эритроцитарннх диагнсстикумов в 4 раза. Гемосенсатнвше свойства прогретых и обработанных ультразвуком препарагаз ИГ не снижались лрк длительном хранении ях (до 244 суток - срсх наблюдения) при температуре 4°С.

Для подбора условий сенсибилизации эритроцитов препаратами КГ было проведано изучение влияния температуры (от 4°С до 70°С), продолклт5ьностл контакта (от 10 шнут до 18 часов) и рН среда .

Установлено, что повышение активности эрктроцитаранх диаг-ностшсумов нзходется в прямой зависимости от: гемосенситивных свойств ИГ; условий сенсибилизация эритроцитов препаратами ИГ; продолжительности контакта ингредиентов. Показано, что одним из важных факторов, зияющих на процесс сенсибилизации, яеляются ионные параметры среды.

Результаты проведенных исследований позволили включить в технологический процесс производства эратропдтарных ротавкрус-кых диэгностиЕуиов параметры, определяющие: - условия таназащн (обработка д:ико::ровакных зрнтроцитов 0,С5 % раствором таниновой кислоты при температуре 37°С б течение 5 мнут); - агрегирование сенснтина (прогревание препаратов ИГ при температуре 56°С в течение 60 шнут прп значениях рН 5,0 с последующей обработкой ультра звуком при частоте 22 кГц/сеЕ в течение 2 шнут); - рекам сенсибилизации (дккублрование 0,05 % фиксированных танизкрованных эрит роцитов с равным объемом рабочей дозы сенснтина в условиях рН сре

да 6,0 яра температуре 65°С в течение 60 минут).

4. Специфичность к чувствительность эритроштарных дизгнос-Т'Пкуг.тов. приготовлеттотлс на основе иг.апгчо глобулинов различного видового происхождения. Специфическую активность ВД оценивали но Ееяйчгае титов рот&вярускых антигенов САГ) в РНГА. Для этого использовали ротавирусы обезьян (штамм ЗА-11), телят (штамм //С£У ), а также АГ полиовирусоз 1.П.Ш типов; Кокски ВЗ; аденовирусов. Положительные результаты были получены только с АГ ротаЕярусоз обезьян, телят и человека,*сгда как АГ незаряженной клеточкой; культуры к вирусов полиомиелита, адено- я Кожсакк ВЗ не вызывали аг-' глютанацаю сенсибализароБаннях эритроцитов. Это свидетельствует о том, что специфические к ротавирусу обезьян (штат! 5А,-1.1) АТ способны реагировать в ЕКГА с групповым АГ ротавирусов телят и человека^ Табл.1).

Таблица 1

Сравнительная характеристика специфической активности рота-вирусных эритродктарных диагностикуков, приготовленных на

основе иммуноглобулинов различного видового происхождения

Исследуемый АГ Число каблю-дэяий . Титов антигенов (в &>?■> )

ВД из желтка яиц КУР ИД из сыворотки КРОЛИКОВ ИД из 1161 крыс

Ротавирус ж) человека 93 7,4±0Д2 6,7зР,11 6,5+0,24

К 7 л ь т 7 Р а л ь н н й а н т и ■п е н Ротавирус обезьян (шташ £А-11 36 9,0+0,19 8,7+0,20 3,4+0,26

Ротавирус телят (штамм //ш) С и 6,9+1,30 6,9+1,30 .6,5+0,15

Полисвирус 1 типа П типа Я! типа 10 10 10 ООО ООО ООО 1

Аденовирус 8 0 0 0

Кокс&ки 33 25 0 0 0

пзм 75 0 0 0

Нер-2 10 0 0 0

а) Фекальные образцы, в которых были обнаружены ротавирусы методом иммунной электронной микроскопии.

- 13 -

Специфичность эритроцитаршх препаратов была подтверждена в опытах блокирования активности АГ ротавируса обезьян и человека с помэдью иммунных препаратов различного вэдового происхся-дения (Табл.2).- Эти опыта свидетельствуют о взаимодействии в РИГА анти- $ А-И-актигая с антигенными детерминантами ротавиру-ссв человега. Полученные результаты подтвердили обоснованность нашего выбора в качестве производственного вируса - рогавирус обезьян (итамм /ГА-11), который был использован при разработке технологии и изготовления экспериментально-производственных серий ротавирусных вюгунодгагностикумов.

При использовании эратроцятарных диагностикудав, приготовленных на основе ИГ различного видового происхождения в РИГА были выявлены некоторые различия показателей специфической активности ротавирусных ЛГ. Активность АГ ротавирусов человека, при использовании ВД, содержащих ИГ-У аедтка яиц кур, была выше (7,4по сравнении с препарататами, содержащими ИГ-6 сыворотки крови кролика (6,7 и ИГ-6 ИАЖ крыс (6,5

Сравнение диагностических возможностей ротавирусных ЭД, приготовленных на основе ИГ различного видового происхождения, проводили э параллельных опытах исследования фекальных образцов в РНГА а ИФА. Показано, что процент положительных результатов (58 %) а среднее значение тигров ротавирусных АГ (6,9 ), выявляемых в РНГА с помощью ИД, приготовленных на основе ИГ-У нелтка куриного яйца были выше, чем с препаратами, приготовленными из ИГ-6 сыворотка крови кроликов и ИАЛ крыс (4,5-4,7 % и 5,9 соответственно).

Сменка частоты встречаемости высоких и низких титров АГ в РНГА выявила преобладание числа проб с высокими титрами АГ (8~ 9 ), обнаруженных с помощью Щ из ИГ-У желтка яиц кур - 40 %, против 17. % и 21 %, выявленных ВД, содераащима ИГ-£ сыворотки крова кроликов и ИАЕ крыс.

Результаты проведенных опытов показали, что относительно ИФА метод РНГА обладает достаточной чувствительностью (от 75 % до 85 %) в зависимости от вида ишунодиагностикума. Отмечено, что эратрсцятарасе препараты, приготовленные на основе ИГ-У желтка куриного яйца обладают большей чувствительностью, чей ИД крысиного и кроличьего пронсхоздекия.

5. Изучанде диагностической эффективности эштроштатаого ротевируского диагноста етма в сравнении с другими лабораторными •тестам. Диагностические возможности Щ, приготовленных на ос-

Таблица 2.

Определение специфичности шлмунодаагностикумов различного видового происхождения в реакции блокирования ротавирускых антигенов иммуноглобулинами

Видовая Титр ЛГ в рнга (в е^р ИГ—в кроликов иг-е а УН крыс 1ГГ-У " кур Сыворотки -

принадлежность ВД пред-иммуя- нно иммунные я ¿А-11 пред- иммун- шо иммунные к 5А-11 пред- иммун- гаге иммунные к 5А-11 Полио- вир. поливал Кокса-ки ВЗ нею

иг-У из ЗЛ-11 9,3 О 64 О 16 0 64 0 0 0

желтка фек.М. 11,3 О 128 0 16 0 64 0 0 0

яиц кур $ек.№2 11,3 0 128 0 32 0 64 0 0 0

фек.№3 12,3 0 256 0 128 0 . 128 0 0 0

ИГ-£ иэ 5А-11 9,3 0 64 0 64 0 64 0 0 0

сыворотки $ек.№1 11,3 0 64 0 32 0 256 0 0 0

крови $ек.№2 11,3 О 64 0. 64 0 64 0 0 0

кроликов фек.№3 12,3 0 64 0 128 0 64 0 0 0

ИГ-б из за-11 9,3 0 32 0 32 0 64 0 0 0

ИА2 фек.№1 11,3 0 32 0 64 0 128 0 0 0

крыс фек.й2 11,3 0 64 0 128 0 64 0 0 0

фек.ЖЗ 12,3 0 ' 64 0 16 0 128 1 0 0 0

нове IIP из желтка яиц кур оценивали в сравнительных опытах с использованием референтных методов: с коммерческим набором "РОТА-АНТИГЕН", а такке с методана, рекомендованными к внедрению в практику здравоохранения в 1989-1991 гг.( РКСА, РйГА с коммерческим набором "РОТА-ТЕСТ").

При оценке результативности РИГА в сравнения с референтными методами (Таблица 3) было установлено, что чувствительность ШГА относительно метода ЭМ составила 89 %, специфичность - 67 %. Низкий процент специфичности был oâycxc>~ieu те.':, что метод Ш выявляет- вирусные частицы не только ротавирусов группы А. Кроме того, методом 311 не выявляется разрушенные вирусные частицы, тогда как в РЙГА Щ реагируют на ряду с роташрионаш и с их антигенами (€ft««lft¿e e¿.a¿,198d).

При тестировании 250 фекальных проб методом ИЗМ и РИГА, процент- положительных находок был, примерно, на одном уровне (54 % и 53 % соответственно), а показатель чувствительности ШГА в срав-пешч с ИЭ:.' составил 87 %, специфичность - 83 %.

Исследований 91 пробы фекалий методом И®А и ШГА выявдло положительные результаты в Шк в 83 % случаев, против 79 %, обнаруженных методом ШГА. Чувствительность РИГА, относительно WA составила 91 %, а специфичность - 30 %, Полученные данные согласуются с данными литература о том, что чувствительность я специфичность РИГА лкаь нзшюгим уступает методу Й<М (Ье/и-а-Жв. » 1987; Еасальев Б.Я.,1987,1988).

Статистически анализ результативности ЕГГА с ИД из ЯГ г.елткг дац кур в сравнении с референтными методами позволил установить, что процент совпадений сушарных показателей положительных и отрицательных результатов составил для: ЭМ - 81; ИЗМ - 85; Шк - 89. При этом, кеяду метода?.® РИГА и ИЭМ отечен высокий коэффициент сопряженности ( С = 0,7). Зо Есех остальных случаях отот коэффициент имел среднее значение. Показатели критерия "хи-квадрзт" подтвердили статистическую достоверность различив полученных резуль-татоз(р> 0,01).

Сравнение эффективности ИГА и РКОА выявило значительную чугстмтельвость эритрэцнтарнкх препаратов. Показатель чувстзчтел поста РКОА в сравнении с BITA составил всего 55 %. Б 25 % случаев в РКОА наблюдалась неспецифаческая егглвпшацая, которая могла быть обусловлена присутствием антаотафилококковы* AT в фекальных экстрактах.

Таблица 3

Характеристика диагностической ценности РИГА в сравнении с другими лабораторными методами

Метод-сопоставления Кол-во исслед. фек. проб Количество совпадений ! пезультатов РгГГА Суммарный показатель совпадений Показатели стат. обработки

положительных отрицательных

"х:«" с

VI.! 89 50(в9,3*) 22(66,7<£) 72(80,9^) 30,15 0,58

И31-.1 250 115(87, О/с) 98(83,0%) 213(85,2$) 123,5 0,7

и-м 91 69(90,05?) 12(80,0$) 81(89,0/1) 34,29 0,61

РН.ГА "ЮТА- 124 73(96,3$) 27(56,3%) 1.00(80, <$) 43,88 0,59

Диагностическую эффективность РИГА с ¡азработашшмп нами Ш на основе ИГ желтка куриного яйца определяли в сравнении с коммерческим набором "РОТА-ТЕСТ" при исследовании 124 проб фекалий от больных небакгериальнымя гастроэнтеритами. Положительные результаты в РРТА, выявленные "с НД из ТЛГ яелтка яиц кур и набором "РОТА-ТЕСТ" составили 76 % и 61 % соответственно. При этом ти?ры ротавируснпх АГ с ИД из КГ келтка яиц кур были в 4-8 раз воте, чек прг использовании набора "РОТА-ТЕСТ".

Полученные данные указывают на го, что разработанный каш и?мукодиагностякум не только не уступает коммерческому набору для РИГА, но и имеет некоторые преимущества.

Таким образом, полученные наш результаты показали, что использование ИГ из желтка яиц кур позволило создать эритроцитар-ные препараты, чувствительность и специфичность которых в РЕГА лишь немногим уступает таким высоко чувствительным методам, как ША и ИЗ!!.

Б отличие от эритроцитарных препаратов, приготовленных на основе ИГ-З клекопитающих (в том числе и коммерческого'набора "РОТА-ТЕСТ" для РИГА), диагностику!.!, содержащий ИГ-У желтка яиц кур превосходил их по чувствительности и специфичности.

*) Значения коэффициента сопряженности: до - 0,3 - слабая 0,4-0,69 - средняя 0,7-1,0 - сильная

Преимуществом использования препаратов ИГ из желтка яиц кур при конструировании эритроцвтарных тест-систем является их однородность по признаку сорбции на эритроциты. Применение яиц кур в качестве источника специфических АТ снияает затраты на содержание животных и получение препаратов ИГ. В этой связи, становится очевидным, что использование ИГ-У является важным и перспективным направлением б совершенствовании не только ротавирусных, но и других иммунобиологических препаратов, предназначенных для диагностики вирусных дкфзкций.

Вывода.

1. Определены оптимальные схеш иммунизации ротавкрусами кроликов, крнс и кур.

2. Показано, что специфическая антигенсвязываэдая активность антител из сыворотки крови кроликов, кур, из желтка яиц кур существенно не различается к превышает специфическую активность антител как сыворотки крови, так и ЯАЕ кркс.

■ 3. Установлено, что препараты ИГ-У из келтка яиц кур, полученные с использованием стандартных методов выделения, более гомогенны по белковому составу, чем препараты ИГ-6 из сыворотки крови кроликов и асцитической жидкости крыс.

4. Препараты ИГ-У из желтка яиц кур обладают более выраженным*. гемосенситивними свойства;®, чем препараты ИГ-б из сыворотки крови кроликов и ПАЗ крыс.

5. Изучено влияние различных физических и химических факторов (обработка танином, температура, рН среды, ультразвуковая обработка) на эритроциты барана к иммуноглобулины различного еи-дового происхождения.

6. Разработаны технологические параметры конструирования эритроцатарных рогаЕирусных дкагшстикушв с использованием в качестве сенситина итялуноглобулянов из желтка яиц кур, сыворотки крови кроликов и ишунной астатической жидкости крыс.

7. Эритроцитарные диагностику^, приготовленные на основе иммуноглобулинов различного видоеого происхождения обладают высокой специфичностью и чувствительностью (82 % - 91 % и 75 % -85 % соответственно) по сравнению с ИМ.

Наибольшей специфичностью я чувствительностью характеризуются эритроцит арные роташрусше диагностикуш, приготовленные на основе иммуноглобулинов из желтка яиц кур.

- 18 -

8. Использование препаратов ИГ-У из желтка яиц кур снижает затраты на производство эритроцитарных ротавирусных диагностику-мов в 2 - 4 раза по сравнению с ИГ-6 из сыворотки крови кроликов и ИАЕ крыс.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Закирова С.Ф..Сергеев А.Г..Ушлицина Г.А..Сбитнева H.H. Изучение гастроэнтеритов по материалам города Свердловска // Вирусные инфекции. Этиология,эпидемиология, патогенез и диагностика. -Свердловск, 1985.- С.82-86.

2. Закирова С.Ф. .Сергеев А.Т. .Сбитнева H.H. и др. Принципы конструирования и технология изгстоатения эритроцитарных препаратов для антительного варианта РИГА //Эпидемиология и профилактика вирусных инфекций.-Свердловск, 1987.- С. 56-60.

3. Васильев Б.Я..Семенов Н.В.,Закирова С.Ф..Сбитнева E.H. Сравнительная характеристика, диагностической ценности реакции пассивной гемагглютинации и иммуноферлентного анализа для индикации ротавнрусов // Эпидемиол. и профил. вирусных инфекций.- Свердловск, 1987.- С. 69-71.

4. Закирова С.Ф..Сергеев А.Г..Сбитнева H.H. и др. Зритроци-тарные ротавирусные диагностику™ и' их применение //Новое в практике лабораторных исследований.- Горький, 1987.- С. 120-125.

5. Бенедиктова П.Я..Сергеев А.Г..Сбитнева H.H. и др. Эпидемиология и диагностика ротавярусных гастроэнтеритов по материалам Свердловска //Эпидемиол., диагностика и профилактика вирусных инфекций.- Свердловск, 1988.- С. 59-63.

6. Сбитнева H.H. Характеристика диагностической ценности современных методов диагностики ротавирусов //Эпидемиол., диагностика и профилактика вирусных инфекций,- Свердловск, 1988.-С. 69-75.

7. Закирова С.б., Сбитнева H.H..Тарскях Е.А. Сравнительная оценка некоторых методов детекции ротавирусов человека //Актуал. вопросы мед. вирусологии.- СверддоЕск, 1989.- С.100-104.

8. Сбитнева H.H., Закирова С.Ф., Евстафьева O.A. Характеристика антигенсвязывакией активности иммуноглобулинов различного видового происхождения //Актуальные вопр. мед. вирусологии.-Свердловск, 19S9.- С. 104-109.

9. Сбитнева H.H..Закирова С.Ф., Евстафьева O.A. Гемосенси-тивные свойства иммуноглобулинов различного видового происхождения // Вопросы эпидемиол., иммунол., диагностики вирусных инфек-

ций.- Свердловск, 1990.- Ч. 1.- С. 137-140.

10. Сбитнева H.H., Степанова Г.П., Евстафьева O.A. Сравнительное изучение специфичности, чувствительности и диагностической ценности иммунодиагностгосумов, приготовленных на основе иммуноглобулинов различного видового происхождения // Вопросы эш-демиол., икмунол., диагностики вирусных инфекций,- Свердловск, 1990.- Ч.1.- С. 141-145.

11. Закирова С.Ф., Власова Л.В., Бенедиктова H.H., Сбитнева H.H.,Степанова Г.Я. Некоторые вопрос- эпидемиологии и лабораторной диагностики ротавирусных инфекций //Тез. докл. У1 Всерос, съезда микробиол., эдидемиол. и паразитологов.- Москва, 1991.-т.1.- С. 79-80.

12. Власова Л.В..Бенедиктова Н.Я., Закирова С.Ф., Сбитнева H.H..Степанова Г.П. Характеристика ротавирусной инфекции в

г. Свердловске (по материалам 1988-1990 гг.)// Вирусные инфекции. - Свердловск, 1991.- С. 74-79.

Подписано к печати 8.2.93 г. Заказ № 246. Тираж 80 экз.

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН.