Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика биохимических свойств природных изолятов бактерий рода Bаcillus в связи с перспективой их практического использования

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика биохимических свойств природных изолятов бактерий рода Bаcillus в связи с перспективой их практического использования"

с

' НАШОНМЬНА АКАДЕМИЯ НАУК УКРАЙШ ШСТИТУТ ШКРОБЮЛОПГI ПГРУСОЛОПУ La. Д.К.ЗАБ0Л0ТН0Г0

Р Г 5 ОД

Да права« рукоггису

1 Ь МАЙ 1995

РЕВА ОЛЕГ МИКОЛАЙОВИЧ

ПОРГОНЯЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА БЮЛОПЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ПРИРОДНИХ 130ЛЯТШ ВАКТЕРШ РОДУ BACILLUS В ЗВ*ЯЗКУ 3 ПЕРСПЕКТИВОЮ U ВИКОРИСТАННЯ

03.00.07 - л1ира51олое1я

Автореферат ЭисертацИ на здоЙуття наукоЬово ступеня кандидата ШолоеЬших наук

Kuib - 1095 р.

ДиаерТШЦБЮ в рукопио

Робота виконана у в!дцШ антиб1отик1в 1нотитуту м!кро-б1ологП i в1русологП iM. Д.К.Заболотнаго HAH У крайни.

Науковий кер1вник - доктор медичних наук, професор, академ!к HAH Украйни В.В.Смирнов.

О $ 1 ц1 и в i опоненти:

Доктор медичщк наук - Седьн1кова О.Л.

Кандидат б!олог1чних наук - HoriHa Т.М.

Пров1дна уотанова - Укра1нський державний медичний ун1-верситет 1м. 0.0. Богомольца МОЗ Украши.

Захиот вхдбудетьоя "17" травня 1995 р о 10 годти на вас!данн1 опец1ал!зованноЗ вчено'1 ради Д 016.06.01 при 1но-титуг! мшробЮлогП 1в1русолог11 1м. Д.К.Заболотнаго HAH УкраТни (252143, Ки1в-143, вул.Заболотного 154, 1нститут ы1кроб1олог11 i в!русологП HAH УкраХни, вал аао!дань).

З дисертац1ба можна ознайомитись у-б1бл1отец1 шституту м1кробЮлог11 i вгрусологП HAH.УкраХни.

Автореферат розЮлании "_"_1995 р.

Вчений секретар опец1ал1аовано! Ради кандидат б!сшог1чних наук

Л.М.Пур1ш.

» г

ЗАГАЛЪНА ХАРАКТЕРИСТИКА FCEOTIi

Актуальность проблеми. HoBi препарата, що м1стять жив1 куль тури сапрофатних м!кроорган1зм1з, знайшш застосування i чудово себе зарекомендували в медицинi, с1льському госпо-дарств1, рослинництв1, для очищения грунту В1д хЛмгчнкх заб-руднень i paflioisoToniB, в1дновлення родючост! грунту i кого б!оочищення в1д патогенно! м1крофдори та iH. До числа най-б1льш перспективних MiKpoopraHiaMiB сл1д В1днести бактерП роду Bacillus (Смирнов с соавт.,1992; Vanbelle et al. 1990).

Для сапроф1тних бацил б властивим повднання таких оз-нак, як повна безпечн1сть для теплокровних i вищих роолин, значна ферментативна актквшсть, спроможн1сть эд1йснювати б!одеградац1ю складних ххм1чних сполук, зв'язувати юни важ-ких метал!в 1 рад1онукл1д!в (Смирнов с соавт.1993; Adam et al. 1993; Janiyani et al.1993),

Досв3.д практичного використання таких проб1отик1в, як б1оспорин i бактерин-CJI св1дчить про те, що ix заотооувания у ряд1 вштадгав Mas переваги в порхвнянн! з використанняы антиб1отик1в 1 xiMi4HHx npenapaTiB (Вьиницкая с соавт. 1990; Всйчишина о соавт. 1991). Це в1дсутн1сть протипокаэань, по-б1чних i алерг1чних реакц!й; висока активн1сть невеликих доз npenapaTiB, комплексний характер впливу на орган!зм, який побднуе локальну антимжробну д!ю, Шдвищення неспециф1чно1 1 специф1чно! 1мунно'1 в1дпов1д1, антитоксичний ефект, зв'-язування ioHiB важких метал1в 1-рад1онукп1д1в та iH.

Р1д Bacillus в надзвичайно гетерогенним по морфо-ф1з1о-лог1чних ознаках 1 б1олог1чних властивостях (Смирнов с соавт. 1983; chiarini et al.1993). 1дентиф1кац1я бацил до цьога часу викликав певну складн!сть, оск!льки б1льш1сть фенотипо-

- г -

вих ознак не б стаб1льними у межах одного виду (Priest et al.1987). Тому одн1ею з головних проблем 0уло розробити нов! п1дходи i вдосконапити 1снуючи методи 1дентиф1кацП бацил.

Важлива ознака, на як3.й баэуеться скршпнг перспективных культур, це специф1чне, вуаькоспрямоване пригн!чення росту патоген!в, эумовлене синтезом антибЮтичних речовин i ПдролНичних ферментов. Але штаыи бацил, нав!ть у межах одного виду,' сильно р1зняться як по 1нтенсивност1, так i по спрямованност1 антим1кробно! дП. Скршйнг полягав у тому, шр б знайти штами, HKi максимально в!дпов1дають вимогам конструювання конкретного бЮпрепарату, тобто забезпечували б виб1ркове пригн1чення певно'1 групи патогенних культур. Тому було важливим 'створити на п1дстав1 факторного анал1зу м1кробного антагон1аму автоматизовану систему пошуку культур в1дпов!дно до попередньо заданих вимог.

Встановлено, що корисний вплив сапроф1тних бацил на ор-ган1зм эумовлений ун1кальним поеднанням комплексу б!олог1ч-них властивостер. Було зроблено ' припущення про 1снування екологгчно в3.докремлених груп MiKpoopraHiBMiB, як1 отанов-лять екзогенний компонент нормально"! м1крофлори вищих орга-HiaMiB, або ендоф1тну м1крофлору вищих рослин. Вийикла необ-х1дн1сть проведения глибокого i детального анал!зу бЮлог1ч-НИХ оообдивоогей цих груп м1кр00рган13м1в у Лд-

цил корисних ф1з!олог1чних властивостей, оукупн1сть яких обгрунтована тривалою сумЮною еволюцгею мжроорган1зм!в i вищих opraHiaMiB; створення алгоритму пошуку найб1льш до-Ц1льних штамхв.

Мета роботи. Провести пор!вняльну характеристику б1оло-Г1чних властивостей Бактер1й роду Bacillus стосовно перспектив 'ix використання. Розробити алгоритм визначення i аналгзу

корисних властивостей у природних 1аолят1в, створення колек-цП перспектианих культур i проведения швидкого скрийнгу серед культур колекцП штам!в в!дпов1дно до лопередкьо зада^ них вимог.

Заздання дослав.

1. Розробити нов! додатков1 тдходи шидко! i надхино! видово'! диференц1ацП бацил.

2. Провести факторний анал1з антагонхстично! активност! у бактер1й роду Bacillus i розробити класиф!кащю бацил-ан-тагон1от1в ка групи з специф1чнкы напрямком антимикробно! ДП.

3. Розробити алгоритм прогнозування ачтагонЮтично! активное^ i проведения швздкого i надмного скрин!нгу перс-пектиЕНих культур.

4. Вивначити у ETSlilE piBKffit труп ÖaUJU-aHTarOKiCTiB б1олог1чн1 властивост1, як! s вазииЕими для практичного ви-користання даних культур (серед яких: Л1зис юйтин патоген1в i деструкц!я складних хШчнкх речовин-аабруднквачхв грунту).

5. 3 числа. виЕчених штам!в скласти колекщю культур з комп'ютерним програмким аабезпеченням оперувачня баэзю даних, анал!зу бхолшйчних властивостей i пошуку найб1дьш перспективна культур в1дпов1дно до задаяих вкмог.

Наукова новизна робота. Запропанован1 додатков!, прин-ципово нов! пхдходи видовоЗ диференвдацП ЗГ1ДН0 в чутлквЮ-тю до антибЮтгайв i опециф1чним споживанням атнокислот си-воротки Kposi. Наукова ц!нн1сть розроблених метод1в полягаз також у виксристашй к1льк!сних даних, статистика анализу i використання яккх для ц!лей 1дентиф1кацП недсотатньо розви-нута.

Вперше розроблено математичну модель факторного вплкву штам1в-антагон1ст1в на тест-культури, у якхй факторнх коеф1-цхенти незалежно Е1Дтворюють як!сн1 1 к1льк!сн1 характеристики явища м1кробного антагон1зму.

Проведено класкф1кац1ю бацил-антагон1ст1в на групи з характерним для кожно! з них спектром чутливих тест-культур. Доведено, що залропоноваяий розподхл культур на групи в:.доб-ражае еволюд!йно обгрунтоване пркстосування до певнда еколо-г1чних н1ш з специф1чнш мз.кробнкм оточенням.

Розроблено метод • визначення ймс®1рних значень пригн1-чення росту тест-культур штамами-антагошстами. Метод дозволяв швидко 1 з високим р1внем В1рог1дност1 проводити пошук найб1лыл активних антагонхстав в!дносно ваданих тест-культур без виконання прямих екопериментальних. досл!джень.

Запропоновако прикладну комп'ютерну програму, яка доз-воляб швидко 1 ефективно аназИзувати б1олог!ЧН1 властиваст! природних 1золят1в 1 формувати з них колекщ.ю культур, перс-пективних для створення б1опрепарат1Е.

Практичне значения.

Отримат ре гуль тати дозволили значно вдосконалити 1 скоротити терм1н 1 матер1альн! витрати на проведения таких важливих етап!в конструювання б1опрепарайв, як аналхз перспектив викориотання нових 1золят1в, пошук штам1в д. 1х ксмбх-нац1й, як! найб1льше в!дпов1дашъ вонкрбтним вюгогам досл!д-ника.

Створено робочу колеюЦв бацил-антагонхстХв 1 розгляну-то мажливхсгь викориотання штам1в з р1зних труп 1 IX комбхт нащй у медичнш 1 ветеринарии практшц, для захисту рослин в!д грибних 1 бактер1альних 1нфекц1й. 3 р!зних груп бактерий в!д1брано куль тури а унл.кальним поеднанн'ям б1олог1чних влао-

тивостей i аапропоноваШ практшни рекомендаци щодо ix ви-корисгання у складi öionpenapariB, у тому шел! - комбгнова-них.

Апробящя роботи. Годовн! результата допов!далися i буди в1дзначэн1 прекаями на зв1тних наукових конференцгях 1нс-титуту MiKpoöio.iorii i в!русологП HAH Украши за 1992 i 1993 рр. Досл1ди по тем1 дисертацП були п1дтриман1 грантом Нац1онально! АкадемП Наук Укра'1 ни для проведения фундаментальна досл1джень молодими вченими на 1994 р., в1даначен1 особистою отипенд1ен президента Укра'1 ни на 1994 - 1995 рр i золотою медаллзо з прем! ею HAH Укра'1 ни для молодих вчених за крашу роботу 1994 р.

Публ1кацП. По материалах дисертацП опубл1ковано 4 на-уковг роботи i одна праця прийнята до друку.

Структура i o6'sm дисертацП. Дисертац1я складаеться з вступу, огляду л1тератури, експершентально! частини з 6 розд!л1в власних досл1джень i обговорення отриманих результат^, висновыв i списку цитовано! дхтератури. Робота вик-ладена на 130 стор1нках машинопису, хлюстрована SO таблицами, 8 малюнкаш i 10 фотокартками. Б1бл1ограф1чний BKasiBHHK м!стить 1Б0 poöiT, з яких 44 в1тчизняних i 106 1ноэеших ав-

TOpiB.

Положения, що виносяться на зажист.

1. Був розроблений принципово новий додатковий П1дх1д до 1дентиф1кацП бактерхй роду Bacillus по ix чутливост1 до антиб1отик1в i вдосконалений метод анал1зу видоспециф1чного сподивання атнокислот сиворотк1 кров1.

2. Вперше для вивчення явшца бактер!ального антагоизму був використаний метод факторного анализу, в насл1док чого проведено пор1внялышй анал1э антим1кробно1 активности бацил

- е -

по к1льк1сним i якхснод показникам i показана мажливгсть розраховувати з великою доотов1рнЮтю ймов!рн1 значения пригн1чення росту тест-культур виключаючи прям1 експеримен-тальн1 досл!дження.

3. Доказаний дискретний характер м!нливост1 у бацил явища антагон1стично i активноеIi по спрямованоси впливу. Де створюе можлив!сть В1Докремити групи штам1в-антагон1от1в з специф1чним для uiei групи спектром чутливих тест-культур i комплексом 1ншх бЮлоггчних властивостей, як1 еволюц!йно сформувалися эа тривалий чао аснування в певйй еколог1чн1й

Himi.

4. Створено робочу колекцИо бактер!й роду Bacillus, перспективних для використання у склад1 6ionpenapaTiB, В основу формування колекцп покладена система анал!зу i статис-тично! обробки даних, адаптована до використання обчислю-вальног техн1ки, яка дозволяб ефективно i швидко тестувати i привднувати до складу колекцП нов! !ааляти i проводити

. серед колегацйних культур таких BTaMiB, що в1дпов1дають по-передньо задании вимогам.

Б. Эалропоновано комп'ютерну робочу програму, завдяки яко'1 можна швидко i над!йно виконувати анал!з б!олог!чних властивостей природних 1волят1в отосовно перспектив ix по-дальшого використання.

3MICT РОБОТИ

МАТЕР 1АЛИ I МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕНЬ

В робот! використовували 257 штатв роду Bacillus, ви-д!лених s р!эних м1сць хснузання, як! належали до 16 вид1в. Штами вид!ляли з грунту, ризосфери, !нтактних внутргших тканин роолин, KpoBi i шлуяково-кишкового тракту людини i тварин. Видову приналежн!оть штам1в визначали керуючись VI'I виданням визначника Берг! ! зг1дно з "Методическими рекомендациями по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus" (Смирнов с соавт., 1983).

Чутлив!сгь до антибЮтгтав вивчали методом дисков на се-редовищ Гаузе-2. Використовували стандарта! диски э антиб!-отикамй: моном1цином, олеандом1циком, оксацшином, pucTOMi-цином, гентам!цйном, лезом1цетином, амп1цил!ном, еритром1ци-ном, пол1м!ксином, каначИцшом, л!нком1цином, карбейцшп-ном, ?лет!цил1ном, HeoMiipraoM, тетрацтшном, стрептолциком i бензилпен!цил!ном. Культури !нкубували добу при 37°С i за-м1ряли д1аметри зон эатримки росту.

Переважне сяоживання ам!нотаголот з сиворогки кровх виз-начали по методу, залропоноваяому Резн1ком з сШвавт. (1982 р). Використовували сиворотку кров! велико! рогато! худоби, эв!льнену в1д високомолекулярних сполук осадженням сульфоса-л1циловою кислотою. Культури зазвали у npoöiprai з середови-щем ! шкубували на качалц! протягом 18 годш1 при 28°С. Визначали BMiCT окремих амйокислот в контрол! i в доол1д1 на ам1нокислотяому анализатор! Biotronic LC 5001.

Антагонхстичну aKTiBHicTb бацил вивчали методом вхдс-

троченого антагон1зму (Выоницкая, 1988). Як тест-культури викориотовували штами патогенних i умовно патогенних для теплокровних, а також ф1топатогенних бактер1й i гриб1в.

Л1зоцшну активн!сть визначали чашковим методом Hawiger (Выоницкая, 1988). Як тёстову Еикористовували до(5ову культуру Micrococcus luteus 2665. Штами бацил заспвали окремими колон1ямк, вирощували при 37°С на протяз! доби, вбивали парою хлороформу 1 заливали розплавленим МПА ; що мХстив тест-культуру у к1лькост1 105 кл/мл.

Л1тична aKTHBHicTb. Штам-антагон1ст вирощували у про-CipKax з 20 мл редкого середовкца Гаузе-2 (початкова к1ль-кЮть кл1тин Шд чао зайву - 5х105 кл/мл середовица) на качали; i на протяз! 3 д1б. Культуральну р!дину дентрифугували i додавали 0,5 мл супернатанту (у контрол1 - ф1зЮлог1чного розчину) до 2,5 мл суспензп живих кл!тин тест-куль тури (10б кл/мл). ЛЮТшу активн1сть визначали по знженню сптично! щильност! суспензИ при довэшй CBiMOBo'i хвил! 540 нм. Ак-тивнЮть була виражена у одиницях.що розраховувалися за рхв-нянням:

Е = -ln(p/po)/(t-to) де р/ро -в1дношення гандевоХ i початковоХ оптичноХ щильносП суспенвН; t-to - протяг часу.

Вим1ршвали зменшення оптичноХ ш^пьнаст! суспензИ через 45 хв., 90 хв. i 45 хв. Mi» першим i другим вим1рюванням i - визначали середне значения.

ДеструкцХя вуглеводн!в нафти. БактергХ вирошувади на синтетичному середовшц, що м1стило (г/л): нафту сирець -10,0; NH4NO3 - 1,0; MgCl2 - 0,1;. КН2Р0д - 3,0; K2HPQ4 " 7,0; .СаСОз - 1,0; рН середовшца - 7,2. EaraepiajihHi культури ви-

рашували у колбах з об'емок суспензп 100 мл на качалц1 при температур! 30°С.

Оптичну цильн!сть бактер!ально1 суспенз!! визначааи nic-ля триразового в1дмивання б!омаси в1д кивильного середовища i ресуспендування. Эашри проводили на фотоелектрокалоримет-pi ФЕК-Бб М при довжин! св!тлово1 хвил! 640 нм (протяг оп-ТИЧНОГО шляху - 3 мм). Емульгугчу CnpOMOÄHiCTb культурально! р1дини визначали по методу Cooper et al.,1987. Визначення вагальних вуглеводнгв у культуральшй р1дгоп проводили методом !нфрачервоно1 спектрометр!I на анал1затор! нафтопродук-TiB АН-1.

' Статистична обробка даних. Проводили кореляц!йний ана-л!в, кластерний анал!а методом середн!х зв'язкгв, дискрюл-нантний анал!з i факторний ananis по методу головних компонент (Носов 1990, Лакин 1973, Rosswall et al.,1978). Обчис-лювал£и1 роботи проводили на комп'ютер1 IBM 383 SX з вико-ристааням пакет!в прикладник програм QUATRQ PRO i SYSTAT.

РЕЗУЛЬТАТА I IX ОЕГОВОРЕННЯ

У зв'язку з nocTiiiHO зростаючим 1нтересом до викорис-тання у склад! б!опрепарат1в сапроф1тних бактерий-антагон1с-TiB роду Bacillus виникла необх1дн1сть у створенн! ефектив-' Ho'i системи анализу природних 13олят!в стосовно перспектив ix практичного використання. Така система повинна забеэпечу-вати можливЮть проведения швидко! i над1йно1 видово'1 !ден-тиф1кацП, анал1зу б!олог1чних властивостей !золяг!в, скла-дання колекцП перспективних культур i зд1йснення швидкого пошуку серед колекц1йних культур штам1в, що у найбШш1й Mi-pi в!дпов1дають вимогам досл1дника.

- 10 -

Систематика бактер1й роду Bacillus не е досконалою, тому з6ер1гаеться зацхкавленншть у пошуку нових тдход1в до видово! диференщац!! Сацил.

Нами були встановлен1 cyTTEBi м1жвидов1 розб1жност1 у чутливост1 до олеандом1цину, оксацшйну, левомщетину, ампх-цил!ну, карбенгцшЦну, ристом1цину, тетрацшипну i бензилпе-н!цил1ну. 0бл1к к1лькд.сних значень чутливост! i 'ix перетво-рення для гцлей видово! 1дентиф1кацП бацил проводили з ви-користанням методу дискрим1нантного аналхзу. Були розрахова-Hi дв! aiHiäHi дискрим1нангн! функцП, рАшення яких модуть бути представлен! як координати штаму у двовим1рному просто-pi. Результат обчисдень експерименгальних значень, отрима-них для тестованих штамгв найбалыл поширених вид1в бацил, графхчно в1дображен! на Мал. 1. Над1шисть методу хдентифхка-ЦП була перевгрена на культурах а вiдомою видовою приналеж-н1отю (у тому числ! - типових), що були отриман1 а мхжнарод-них калекц1й м!кроорган1зм1в. Ймов1рн1сть. помилки п1д чао 1дентиф1каци для р1зних вид!в бацил не переб1льшуе 5-10%. Запрапонований метод не ол1д розглядати як альтернативу ави-

Перша Ыоь

Uaj.l.Pinieiirw nepoioi i öpyeoi royueuid Оля ппшиюЬ В ипширевш; ЬиШЬ Бецил

чайним метода.',1 1дентиф1кац11 на гпдстав! бЮх1м1чних л мор-фоф1а!олог1чних тест1в, а тхльки як доц1льне доповнення 1 вдосконалення в!дош! практики.

У попер&днIX досл1дах було встановлено (Смирнов э со-авт. 1982), що в певкхй фаз1 росту культури бацил споживають з сиворотки кров1 р1зн1 ам!нокислоти не р1вном1рно, а выдашь перевагу окремим з них. Позитивним враховували'випадок, коли в1дносна концентрац!я 'ашЯокислоти у сиворотц! кров1 зменшувалась п!д час росту культур. Встановлено, що сполу-чення ам1нокислот, як! переважно споживаються, е видоспеци-ф1чною ознакою (Табл.1). Залропонований мэтод 1дентиф1кацП може бути застосовашм як додатковий для уточнения таксоно-м!чного положения штам!в.

Вув запропоновайии кшоч 1дентиф1кацИ бацил, який дозволив скоротиги к1льк1сть необх!дних- тест1в 1 упорядкуаати IX врахування (Тайл.2)., У той же чао,алгоритм в достатньо

ТАБЛЙЦЯ 1.

Спсцшр1апа спсикибаыпя &-«шоииелот сиборотки tcpoûl культурами planux ЬиШЬ SaKmepiù роЭу Bacillus

ВиЗи Число шт. A Л t В О к и с л о m tu 1 i

Thr 5эг Gin Giy Ala Cy» Val Mal Ils leu Туг Ph8 HI» От LU Afjj

ВлиЬШй в + + + - - + - + + - _ _ _ _ + + |

B.lfchsniformte 6 - - + - + + + + - _ _ _ _ - + ?

S.msjsaterium в - + + - - + - + + - - + + + + + 1

S.cereus 4 - + + - - + - - ■f- _ _ _ _ - + f

B.clrcuîans 2 - + + - - - + + - _ _ _ - + 1

B.cecsgulans i - + + - - + - - + + _ _ _ _ - -

Q.macersns 1 - + - - - - - + - + _ _ _ _ - + j

B.sehaericus 1

Ключ: i9es:¡ ТАБЛИЦА 2. эгшфшацп SaKmcpiú роЭу Bacillus

ФековгавсЪ! еру] 1U ЕиЭи €псци<р1чк1сть чугалиЬост: Эо aHmuSionawKlü I 1 II коорЗинагаи Спсциф1чп5 <р«нотиш>Ы оэнаки ДереЬажт | Э*М1 ПО— 1 кислот

1 г 3 4 5

1 ерука — diaA'Tnp спора 1-1 P-4ÍS Фокег-Броскоз eiSpojrb крохяаjna 1—2 Р-ц5я Фойсс—Upoojcaj eiOpo/tií кро Í-3 P-uia Фоге-Ирос::aj eiOpo-iic Kpox^j?.":o TRSJS KG n ера "+" op:. "-" sppSijwnyt B.subtiüs B-suMilis v. nigor D.pv.rrJlus B.megate-rium. B.firmua B.lonto í тоЪпдипу Ьскета И.О - 20.0 X 1.0 - 8.0 14.0 - 20.0 X 10.0 - 13.0 19.0 - 2R.0 X 10.0 - 19.0 14.0 - 19.0 X 10.0 - 13.0 Й.О - 12.0 X 10.0 - 15.0 Даш biSoymni nm")t:oi клгппчпм, апаороЗпив ] реЭукц1я Himpami& - "+" утил1эац1я цитрату — "+" ацетату - "-" "Пж eajtii, що й Эля B.subtSHs; утЬорюють ше^аяцй тклюнт па еер.еЗо&шц! Гаузе-2; пс зБроЭигуяэт.ь валалтояу i лактозу. РеЗукгуя nimpamiS> - "—'" ■ k-ííbiuhu > 3 mí;ra ЕЛСЗули у цишо- ферлсктац1я елткози - "+" РсЗукцк: nirnparnib — "+" кл1типп < 3 mira елс5ул fciScymm ' fpafwaomrxaula sjts>коаи - "+" РеЗукщя Himpami& — "+*' K^imuHU < 3 mirra-влоБули fc-Эгутт £рор,г52птгл!1Т вляжози — "—" lern (-) Ser, G!a Суз. Met, lie, Arg Tin: cn_wi Ser, Met, He, Let,Arg Ser, Gin, Суз, Met, lie, Phe, His, Orn Дал! bi3cymní Дат ЫОсутн!

5*

II

I-*

1 +

¿5- g<5 .

S <5

gp-

•s !»•

1 a §

.63 O 3* B ~

«ja. a tf

H ciA m

lililíI kUkn

o s a i> o a. « Esc. »Í a

I JS>

a-

o ^ - I » o

o o

K

3

<!) t. a o

ra

+ +

o $

IS*

« 3 •fí ) (O

a

¡>

W :

i," US

¿A

Cl

3

1

a £

•3

4

" S-ál 3.2

. w a a 7 w ^ i* § ?¡ d

8§3. g.Sfií&S "s a ^a s

>, o -a o o k £ a.3 3 c.

,. ti5 3 m

fiiíSastf

s e s 5 « g-¿B g-8 a

¿SSou»1

M

«

"í s)

Í2 O

J 'I

t-,

fí

o M o O

G-

i #

<n i

1 1

i i £ í u ? ;

£ 'i 1 ® *

h a tí ta ¡3 S

4 4

"B Ti

í i £ &

"B

£

<S

i

i . i.

<3 +<9

1", 6

!3 1 «

S1* 5"

a g a

'3 «'5

.2 1.2

'B «'3

j> «

Cu « c.

i

<3

S

1 : 1 t 1 : 1 i S j <2 f9 J ¡2 J i £! i Fi i § i S i

1 « 1 re ' rf 1 rj 1 U rt

0 g-0 &3 g-s &3© 8"

S.g 8| S.Í 3-fe |wi«Sw8«Sa«

•5 »-f •»« ^ »»o M.«

CBtfWÍWtfCJffMytf

«ív« BL« s >»

§ i* 3 « 3 3 9 3 O <y

q}&* wC- w a> & ai

I 1 I 1 I 1 1 1 I 1 I 1

o o o o o o

o jfl ¿O ifOv

-Ojifl jia jOjg

sS

CO ^

r-í

¿a

I

I 3 1

ca —d

lei|g

¿.o' r

+ +

s? tí

o

¿i1 ¿

j +

№

O f

II

O ^

fl) *¡>

e-«

II

01

n

J li

Cs

ge ü.

ai

Cli O »

w "i

fS

J ra

-f

¿

a

+

+

гнучким, що дозволяв досл1дникам обирати для 1дентиф1кацИ шляхи 1 ознаки, цо найб!льш в!дпов1даать умовам лабораторП. 1дентиф1кад1я базувться на трьох незалежних Шдходах дифе-ренц1ац1'1 по б1бх!м1чних тестах, чутливоот! до антиб!отик!в 1 на виб1рковому споживанн! ам!нокислот з роэчину.

Наступним еталом анал!эу природних !золят!в було вив-чення 1х антаготстично! активност!, як одного э пров1дних фактор1в позитивного впливу бхолрепарапв з живих культур.

Найб!льша антагон!стична активн!сть була встановлена у представнюив вид1в J3.subfci.lis, В.ритПиз 1 В.ро1утука, цо спхвпадав з д1тературними даяими. Проте, у межах одного виду спостер!гались вначн! розбХжност! як по сил1, так ! по спря-мованост! антюлкробно! дП у р1зних и'гам!в. Встановлено, щр вар!ювання чутливост1 р1зних тест-культур до впливу шта-м!в-антагон!ст!в кореляц!йно пов'язан!. Матрица коеф1ц!ент1в кореляц1й була використована для проведения факторного ана-л!зу по методу головних компонент. В результат! був створе-ний факторний простхр в п'яти незалежних ортогональних фактор! в, як! на 85% визнзчили загальну дисперо1го чутливоотей тест-культур до зивчёних штам!в бацил-антагон1ст1в.

Для опису пригн!чення росту з'-м штамом-антагонЮтом Д-1 тест-культури нами було запропоновано сл1душче р!вняння: _= МдМэС1 + алри + ... + а! кР, к) + е-—

Де Хи -значения пригн!ченна а^ - факторно навантаження рооту 1-1 тест-куль- к-го фактору на !-ю тест-тури о'-м штамом-антагонЮтом; культуру;

Мх - усереднена чутлив1сть р^и - факторне значения к-го

1-1 тест-куль тури; фактору для 3«то штама-анта-

М^ - усереднена активн1сть гон!стз;

З-го штама-антагонЮта; е - помилка методу обчислень;

- 15 -

Фактичне значения пригн1чення рооту тест-культури роз-глядавться як зумовлене впливом врахованих фактор1в специ-ф1чне вдаилення в1д середнього значения, властивого для певно! пари антагон!ста 1 тест-культури. Факторн! значения штама-антагон1ста можуть бути роарахован! зг!дно з вище вка-заним р1внянням по методу найменших квадрат1в по експеримен-тальних значениях пригн1чення росту базових тест-культур з в1домими факторними навантаженнями. I навпаки, фактора! на-вангаження будь-якш тест-культури можна обчислити по ёкспе-риментальних даних пригн1чення П росту базовими штамами-ан-тагон1стами в попередньо визначеними факторними значениями. Отримаш факторн! значения шгам1в-антагон1ст1в виступають зручною базов даних для класиф1кацП культур по трупам эгчд-но а спрямован1стю антагон1стично1 дП по методу кластерного анал1зу, оск1льки, на в1дм1ну в!д експериментальних даних, факторн1 значения повн1отю незалежн1 1 р1вноважн1. . Розпод1л бацил-антагон1ст1в на групи зображено на Мал.2.

вЮстаяь ■>.6

„Число „ 9 тт. Г^Упи ВиЭи

1 а виЫШа ШВ 6047

1 1 а виМШа ШВ 5137 а виЫШа ШВ 5044

1 а тасегапа ШВ &800

10 а П-2 П-1 а ниЫШв т. п%гг 1 а р ит Дна

4 Ш а аиМШз

1 а пиьшя

10 1-1

10 1-3 а виьшв

8 1-2 а виЬШа

1 а виЬШа ШВ 6021

1 а виышз шв 5иа

6 17 а раУутуха

Мал. 2. ЛенЭроераяа ЕаЭтхпет. л1ж врутяи &н1ш1л-атлшч>1гк-.т1й.

- 16 -

Кожна э труп мае свш своергдний спектр • чутливих тест-культур. Так група II спещайзована у напрямку пригн1-чення росту ентеробактер1й i грам-позитивних kokib, III група - ехдносно ф1топатогенних культур род1в Erwinia i Xantho-monas; I група мае широкий спектр чутливих культур, серед яких патогенн! для_ теплокровна i рослин. Ц1 групи складають штами B.subtilis. Група II поряд з штамами B.subtilis Mic-тить штами B.pumllus, що вкааув на под1бн1оть фактор1в анта-roHiBMy обох цих ввд1в. Група IV складавться э. представнига.в виду B.polymyxa. Для штам1в ц1е! групи 6 властивим пригн!-чення широкого спектру тест-культур, серед яких патогенн1 i умовно патогенн! MiKpoopraHiвми теплокровних i рослин.

Ряд штам1в бацил-антагон!ст!в мали настальки овобр1дний спектр чутливих культур, що було неможливим привднати ix до жодно! групи.

Ц1каво, що ус! штами III групи, для яких в властивим пригн!чення росту ф!топатогенних культур, були !зольован1 з BHyTpinraix тканин бавовнику, щр в посереднхм ов!дченням io-

нування особливо! групи ендоф!тних MiKpoopraHiaMiB.

/

Залропонований вище метод опису антагошстичних власти-востей зручний п!д час складання бази даних кодекцП перс-пективних штамхв. Д1йсно, антагон1стичн! властивоот! велико! к1лькоот! штам1в бацил у ц1лому можуть бути охарактеризован! невеликою к1лък!стю факторних коеф!ц!ент1в. В!рог!дне значения пригн!чення росту тест-культури будь-яким штамом э ко-лекц!! може бути розраховане по вище означеному р!внянню, якщр попередньо буди виэначен! для не! факторы! навантажен-ня, Розпод!л розрахункових значень в1ДП0Б1даб експеримен-тальним з р1внем досктрност! 0.01 по х2-критер1ю.

Нами була розробленз i залропонована коып'кте-рна прог-

рама, яка дозволяб проводите вс1 етапи, пов'язан1 з анал1зом б1олог1чно1 активност1 природних 1золят1в, первиниого визна-чення перспектив !х практичного застосування, складання 1 ефективного використання колекцП промислово перспективна культур.

Було дхкавш провести порхвняльний анал1з деяких хнпет б!олог1чнкх властивостей у штачив, як! форкукзть р1зн1 групи бзцил-антагон1Ст1Е. Так, серед факторов антзгок1стичного впливу особлпве значения мае лхтична активнхсть, яка зум злена протеол1тичнюд1 ферментами 1 бактерхальним л13оциу,см (Захарова з соавт.1985).

В Табл.3 показана л1тична 1, як складова 11 частлна, лгзоцимна активностг ряду штам1в бацил. В1дкосно культури М. ^uteL/s 2665 л1тична активн1сть була у середньому взда у штамв II групп (максимальна у штама 1.43 5012 - 3,53 од), н1ж у штам1в 1 групи (максимальна у штама 1МВ 5007 - 2,99

ТАБЛИЦЯ 3. Лшшчна актиЬтсть Баидья р!зних вруп.

[¿шали Лшшина шааиЬгйыаь Ытали лтишнп вкгаи&н1сть

фула (ШВ) кзиштураль^ Ь тому чгисл! Грухт (ШВ) кулыаурйль- 6 тйи«у иисл1

./йэсщшша ¡¡о1 рИгши лЬоцшта

оО. ла ой. лж

В.£иЫШз

5007 2.69 12 5009 г.оз 15

5003 «.03 0 5012 3.53 а

БОЮ 1.93 15 5014 2.53 5

1 5017 г. зг О II 5010 2.58 0

6019 г.зг 0 5038 1.72 0

5052 1.10 0 аригМиг

5110 1.75 4 5801 2.74 0

5602 2.53 0

В.»иЫШз агиышэ

50-13 2.02 0 5029 1.63 7

III 5049 2.49 0 1нш. 5113 3.61 0

6137 ■ 1.86 0 6074 1.7 12

од). Аде найб1льиа активн!сть була визначена у штама IMB 6113 (3,61 од). Лхвоцимна активтсть була визначена у 7 з 20 тестованих штамхв, що належали до р1эних труп. Найбхльш ак-ТИВНИМИ були штамп IMB 5008, 5074 i 5010.

KpiM викориотання б!опрепарат1в э л1кувально-профз.лак-тичною метою i для захисту рослин, певний практичний 1нтерео становить створення препаратгв для поновлення i п!двищення родгочост! грунту. Зокрема, для бЮлог1чнсго очищения грунту В1д патогенних MiKpoopraHiBMiB i xiMi4Hiix зайруднювач!в.

Разом i3 cniBpoûiTHHKaj.fH в1дд1лу технологи б1осинтезу 1нотитуту м1кроб1олог11 i в!русологП HAH Украши нами була вивчена здатн1сть штам1в бацил эд1йснювати деструкцию вугле-воднхв нафти. Було досл!джено 91 штам бацил, як1 належали до р1зних вид1в. Спроможнхсть до деструкцП вуглеводн1в нафти значно варивала м!ж штатами одного виду. Активна, деотрукто-' ри були визначен! серед атамгв В. subtilis, B.licheniformis, B.megaterium i B.pumilus. Але найб1льш активнг деструктори були визначен1 серед культур I i III групп (IMB 5007, 5018, 5045, 5112). Шсля 2 тихнiB iHKyôayiï ступ!нь деструкцИ становив в1д 20 до 75% В1ДН0СН0 до контролю.

Таким чином, отриман! д'анх св1дчать про те, що розпод1л бацил-антагон1ст1в на групи мав об'вктивний характер 1 ви.ч-ликащшпристосуванням м1кроорган1зм!в до !онування вр1знгос екологгчнкх ншах. Кокна а груп характеризувться специф1чним повднанням б!олог1чних властивостей: виб1рково1'антагон1е-тично! активност!, йродугацеа л1тйчних ферменИв, здатнютю до деструкцП складнкх речовин - забруднювач1в грунту та iH. Окрем! найб1льп aKTKBHi штами з р1зних груп, або ïx комб1на-цП, можуть бути залропонован! для використання у склад! тих чи !нших npenapaTiB,*- залежно в!д мети ïx конструювання. У

ТАВЛИПЯ 4. CepeSni зваиепня привншення росту окрелтх тест-культур Эля рЬних вруп Заиил-аптавотс1шЬ.

Групи Ьацил—aHmaeoiiicrniö:

Тест—культур и: (сереЭт зваиепня dieuAempib у лия) I

1-1 1-2 1-3 П-1 П—2 Ш IV

Bacillus cereus 5656 11 20 21 13 11 3 20

Salmonella

equiabortua 202 10 4 7 9 12 0 16

S.typhimurium Ii 1-1 7 10 12 15 1 21

S.nevrporl 5751 21 14 19 7 7 6 14

S.reading 5270 40 24 32 17 19 24 32

S.weslaco 247/49 30 16 23 10 12 14 22

Shigella sonnei 669 14 9 12 12 16 6 24

Proteus vulgaris 72 17 16 17 18 18 17 27

Staphylococcus

aureus 209 17 17 14 27 25 14 26

Klebsiella

pneumoniae 5054 5 4 5 5 7 0 9

Micrococcus

luteus 2665 24 21 21 19 17 11 18

Xanthomonas

malvactarum 210 12 11 15 5 6 9 19

X-campeslris 262 24 23 32 2 3 20 26

X.maltofilia 232 10 8 12 1 2 8 11

Serratia

marcescens 49 5 7 7 11 11 3 14

Pseudomonas

gladioli 8673 7 5 6 4 3 4 6

PJachrimans 7395 18 9 14 7 9 9 18

P.syringae 8511 19 9 14 7 9 9 17

Erwinia

carotovora 218 17 9 14 7 9 8 17

Fusarium

graminis 25781 2 9 8 4 2 4 5

Verticillum

dahliae 25313 i 7 7 4 2 2 5

Cladosporium sp. 1 11 7 8 4 13 4 1

Табл.4. показав cep'eflHi розм1ри зон затримки росту ряду тест-культур, розрахован1 для piamix групп. Був протестова-ний широкий спектр бактер1й i м1кромщет1в патогенних i умовно патогенних для теплокровних i рослин. Так, для приг-н1чення росту бактер1й роду Salmonella найб1льш активних■ан-TaroHioTiB СЛ1Д шукати серед ттамхв груп 1-1 i 1-3; в1дносно бактерш род1в Shigella i Klebsiella - 11-2 i IV; , в!дносно бактер1й роду Xanfchomonas - серед штам1в груп 1-2, 1-3 i III; для пригнгчення росту ф1топатогенних м!кром1цет1В - серед штам1в груп 1-2 i III. KpiM того, сл1д брати до угаги posöiMHOCTi Mix штамами рхэних груп по л1тичн1й активности i деструкцП склэдних оргая1чних сполук, м1зштамовий антаго-HiSM та 1н.

В н с н о в к и

1. Розроблено принципово новий Шдх1д до видово! дифе-решцацП Сацил зг1дно з 'ix чутлив1стю до антиСаотгоив. 0т-риманий алгоритм запропоновано використовувати як додатковий метод 1дентиф1кац11 бацил.

2. Вдосконалено метод 1дентиф1кацП бадил по. переважному споживанню ам1нокислог сиворотки кров!. Встановлений факт, що споживання ам1нокислот р1знши штамами'бацил в ви-доспециф!чним, i цю ознаку .дощльно використовувати для

уточнения в ид обо 1 приналежноси культур.

3. Розроблено ключ над1йно1 i швидко'1 iдeнтифiкaцii ви-д1в бацил, у якому були використан1 запрапонован1 Шдходи видово! диференцхацН.

4. Розроблено факторну модель антагоистично! активнос-т! бацил, яка буда покладена в основу класиф1кац11 бацил-ан-тагон!ст1В на групи з характерним для кожно! э них спектром

- 21 -

найб!льш чутливих тест-культур.

Б. Залропонован метод прогнозування ймовгрнкх значень антагон!стично1 активност! Салил в!дносно конкретних тест-культур, що дозволяе проводити швидкий i ефективний по-иук шта\ав, як! маить заданий виб1рковий спектр чутливих теот-культур.

6. Розроблено комп'ютерну програму, яка дозволив проводити анал!з бЮлоПчних. властивостей iзолятiB, прогнозувати перспективн1сть культур.для практичного використання i проводити пошук штачхв в1дпов1дно до попередньо встансвлених вимг.

7. На основ1 запропонованих метод1в анал!зу створено робочу колекц!ю бацил-антагон!ст1в перспективних. для практичного використання, для яких характерне ун!кальне поеднан-ня виб1рково1 антагсн1стично!, л1тичнс! активностей 1 дест-рукцП складних орган!чних сполук.

СПИСОК ПУБЛ1КАЦ1Й ПО ТЕШ ДИСЕРГАЦ11.

1. Reva O.N.,V.A.Vyunltskaya,S.R.Reznik,I.A.Kozachko, and V.V.Smirnov. Antibiotic susceptibility as a taxonomio characteristic of genus Bacillus // Int. J. Syst. Bacterid., 1995.-45,N2.

2. Смирнов B..B. ,Рева O.H. .Выоницкая В.А. Деление бактерий антагонистов рода Bacillus на кластеры по спектру антагонистической активности // Мккроб иол. журн.-1995.-57, ¡11. -с. 3-13.

3. Смирнов-В.В.,Рева О.Н..Вьюницкая В.А. Создание и практическое применение математической модели антагонистического действия бацилл при.конструировании пробиотиков // Микробиология.-1995. (принята в печать).

- 22 -

4. Рева О.М.,В'юницька В.О. Роапод1л штам!в бактер!й роду ■ Bacillus на групп за особливостями антагонистичного впливу на патогенн! теот-культури // Miкробiол.курн. -1994.-56,N4.-С.80.

5. Василевская H.A.,Рева О.Н. .Сергейчук М.Г. с соавг. Видовая принадлежность спорообразующих бактерий песчаных отложений заповедного острова Круглик и природа продуцируемых ими слизистых веществ // Микробися.журн.-1992. -54,N6. -с. 3-9.

А Н Н О Т А.Ц И Я Рева О.Н. Сравнительная характеристика биохимических свойств природных изолятов бактерий рода Bacillus а связи с перспективой их практического использования.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата био- . логических наук по специальности 03.00.07.- микробиология.

Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотно-го HAH Украины, Киев, 1995.

Защищается рукопись кандидатской диссертации,- которая содержит результату' экспериментальных исследований и их обсуждение в областк 'аналжза биологических свойств природных изолятов в связи о перспективой их использования в составе биопрепаратов. Культуры бацилл-антагонистов были разделены на ряд групп в соответствии-со специфичностью проявлений биг ологических активностей. ■ Был разработан алгоритм, реализованный в компьютерной программе, обеспечивающий анализ биологических свойств свежих изолятов, создание рабочей коллекции перспективных культур и проведение скрининга штаммов по предварительно заданным свойствам. Предложены новые подходы быстрой идентификации видов бацилл.

SUMMARY

Reva O.H. The comparative analysis of the biological properties of bacteria of the Bacillus genus isolated from nature in * relation with perspective of their

The Candidat Thesis for a Philosophy Doctor degree, the speciality 03.00.07 - microbiology. The Institute of Microbiology and Virology nm. D.K.Zabolotny of the NAS of Ukraine, Kiev, 1995.

The biological properties of the isolated from nature bacteria having been under investigation and discussion in relation with, perspective of their application were represented in the Manuscript offered for defending1. It was established, that bacillus-antagonists could be divided into a range of groups owning the specific combination of biological properties. A routine realised as a computer program was proposed for analysis of the biological activities of fresh isolates, creation the work collection of the perspective cultures and carrying out screening the strains according to the preliminary determined demands. New methods of quick identification of the bacillus species were represented.

KjD040Bi слова: бацили-антагоШсти, факторний анал!з, робоча колэкц1я, бЮпрепарати.

further application.